JP2000512484A

JP2000512484A - ヒト・ヒアルロナン・レセプター

Info

Publication number: JP2000512484A
Application number: JP09535705A
Authority: JP
Inventors: ターリー，エヴァ・エイ; エントウィスル，ジョイスリン
Original assignee: ユニヴァーシティ・オヴ・マニトバ; マニトバ・キャンサー・トリートメント・アンド・リサーチ・ファンデイション
Priority date: 1996-04-10
Filing date: 1997-04-10
Publication date: 2000-09-26
Also published as: US20040010812A1; CA2251264A1; WO1997038098A1; EP0894131A1; GB9607441D0; AU2284197A

Abstract

(57)【要約】本発明はヒトＲＨＡＭＭのゲノムおよびcDNA配列ならびにヒトの悪性疾患に対する診断試験法および予後試験法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト・ヒアルロナン・レセプター技術分野本発明は、ヒアルロン酸仲介運動性に関するレセプターまたはＲＨＡＭＭ(Rec eptor for Hyaluronic Acid Mediated Motility)として知られている、ヒト・ヒアルロナン(hyaluronan)・レセプターに関する。より詳しくは、ヒト・ヒアルロナン・レセプターのゲノム性ＤＮＡ配列に関する。背景技術本明細書の説明では、末尾に掲げている引用文献を参照する。ヒアルロナンは、細胞外マトリックスの至る所に存在し、細胞の移動、増殖、トランスフォーメーションにリンクして合成される大きなグリコサミノグリカンである。このグリコサミノグリカンは、その生物効果の多くに介在する特定のタンパク質・レセプターを介して細胞表面と相互作用する。このようなレセプターの一つがＲＨＡＭＭである。ＲＨＡＭＭのｃＤＮＡの起源は、ネズミ３Ｔ３繊維芽細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Hardwick et al.,(1 982)）からクローニングされたものであって、これまでに数種のＲＨＡＭＭイソフォーム(isoform)がネズミ遺伝子内でコードされていることが見出されている( Entwistle et al.,(1995))。ＲＨＡＭＭはrasトランスフォーメーション経路におけるrasの下流で作用する (Hall et al,1995)。ＲＨＡＭＭはネズミの細胞が発現過度となると、焦点接着ターンオーバー（focal adhesion turnove）を制御し、細胞の移動を要求して、トランスフォーメーションする(Hall et al.,1995)。発明の概要本発明の一実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭ１、ヒトＲＨＡＭＭ２、ヒトＲＨＡＭＭ３、ヒトＲＨＡＭＭ４およびヒトＲＨＡＭＭ５からなる群から選ばれるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸である。本発明の他の実施態様は、（a）配列番号３のうちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と、（b）配列番号３のうちの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と、（c）配列番号３のうちの少なくとも２０個の連続したヌクレオチドからなるヌクレオチド配列とからなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸である。本発明のさらに他の実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭタンパク質の結合ドメイン少なくとも一個をコードするヌクレオチドまたはＨＡの結合力を保持するフラグメントまたはその同族体を含んでなる単離された核酸である。本発明のさらに他の実施態様は、表１に掲げるヌクレオチド配列のエキソン少なくとも一個のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸である。本発明のさらに他の実施態様は、配列番号５０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸である。本発明のさらに他の実施態様は、ある動物またはその祖先のゲノムが、（a）ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子のエキソン少なくとも一個のヌクレオチド配列の挿入と、（b）ヒトＲＨＡＭＭタンパク質を少なくとも一個コードするヌクレオチド配列の挿入と、（c）内因性ＲＨＡＭＭ遺伝子の失活とからなる群から選ばれる変更を引き起こす少なくとも一個の組み換え構成体の挿入により変更されている遺伝子導入動物を提供する。本発明のさらに他の実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭ１、ヒトＲＨＡＭＭ２、ヒトＲＨＡＭＭ３、ヒトＲＨＡＭＭ４およびヒトＲＨＡＭＭ５からなる群から選ばれる実質的に純粋なタンパク質を提供する。本発明のさらに他の実施態様は、（a）配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基と、（b）配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基と、（c）配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基とからなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる実質的に純粋なペプチドを提供する。本発明のさらに他の実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭの結合ドメイン少なくとも一個からなる実質的に純粋なペプチドを提供する。本発明のさらに他の実施態様は、配列番号５０のアミノ酸配列を持つ実質的に純粋なペプチドを提供する。本発明のさらに他の実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭタンパク質の抗原決定基と選択的に結合する抗体を提供する。本発明のさらに他の実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭタンパク質少なくとも一個の調製物を用意し、この調製物を候補化合物に接触させ、ＲＨＡＭＭタンパク質とこの候補化合物との結合を検出する各ステップからなる、ヒトＲＨＡＭＭタンパク質と選択的に結合することができる化合物を同定する方法を提供する。本発明のさらに他の実施態様は、腫瘍を持つ哺乳動物の予後を評価する方法において、この哺乳動物からサンプルを採取し、ＲＨＡＭＭタンパク質の発現が高いと予後不良であることを示す腫瘍サンプル中のＲＨＡＭＭタンパク質の発現濃度を測定することからなる方法を提供する。本発明のさらに他の実施態様は、ＲＨＡＭＭ遺伝子の発現過度を特徴とするヒトの障害を予防または治療する医薬組成物ににおいて、（a）ＲＨＡＭＭ遺伝子の優勢なサプレッサー突然変異体と、（b）ヒトＲＨＡＭＭ・ｃＤＮＡに対するアンチセンス配列と、（c）薬学的に許容できる担体に担持してある、ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子のエキソン８に対するアンチセンス配列とからなる群から選ばれるヌクレオチド配列の有効量からなる医薬組成物を提供する。本発明のさらに他の実施態様は、ＲＨＡＭＭ遺伝子の発現過度を特徴とするヒトの障害を予防または治療する方法において、（a）ＲＨＡＭＭ遺伝子の優勢なサプレッサー突然変異体と、（b）ヒトＲＨＡＭＭ・ｃＤＮＡに対するアンチセンス配列と、（c）ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子のエキソン８に対するアンチセンス配列とからなる群から選ばれるヌクレオチド配列の有効量を該哺乳動物に投与することからなる方法を提供する。本発明のさらに他の実施態様は、ヒトにおける細胞移動を抑止する方法において、（a）ヒトＲＨＡＭＭタンパク質と特異的に結合する抗体と、（b）ヒトＲＨＡＭＭのＨＡ結合ドメインからなるペプチドとからなる群から選ばれる薬剤の有効量を該ヒトに投与することからなる方法を提供する。図面の簡単な説明本発明の実施態様の一部については、添付図面を参照しながら説明する。図１はヒトＲＨＡＭＭのｃＤＮＡのクローニング戦略を示す図である。ヒトＲＨＡＭＭのｃＣＮＡのコード付け部は白抜きの矩形で表し、開始コドン（ＡＴＧ）と終始コドン（ＴＡＡ）は、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲと同様に示してある。各クローンとＲＴ-ＰＣＲ産物中でコードされているヌクレオチド部は一本の線で示している。図２はマウス、ラット、ヒトのＲＨＡＭＭのＨＡ結合ドメインのアミノ酸配列を比較する図である。結合ドメインに含まれているアミノ酸配列は特定間隔を開けて、各種ヒアルロナン結合モチーフＸ¹−Ａ_n−Ｘ²の末端に対応している。これをマウス配列中でアミノ酸４０２〜４１２（配列番号１）とアミノ酸４２４〜４３３（配列番号２）としてアンダーラインしてある。数字は発表されているマウスＲＨＡＭＭ２（Hardwick et al.,1992）内のＨＡ結合ドメイン中のアミノ酸の位置を示している。ラットとヒトの結合ドメイン中でマウス配列と同一なアミノ酸は点で表している。図３はＲＨＡＭＭに対する抗体を使って、フォルマリンで固定し、パラフィンで包埋したヒト乳癌組識の免疫組識化学染色を示す図である。これらのサンプル片はメチル・グリーンで対比染色がしてある。腫瘍細胞とストローマの染色強さは同じではない。Ａ，Ｂ，Ｃでは、各細胞（矢印）の腫瘍の染色が最大で、腫瘍全般が染色されている(矢印先端)。ＤはＲＨＡＭＭに対して腫瘍細胞とストローマがはっきりと染色されている。Ｅは腫瘍中核と細胞質がはっきりと染色されている。Ｆでは腫瘍が染色されていない。倍率はＡとＦが４００Ｘ、Ｂ，ＤとＥが２５０Ｘ、Ｃが６５０Ｘである。図５は原発性乳癌患者全般の生存を示すKaplan-Meier生存曲線である。上部二曲線は結節のない患者、下部二曲線は結節のある患者である。白いシンボルは、最大全般ＲＨＡＭＭ染色が１単位未満の腫瘍で、黒いシンボルはこの値が≧１単位の腫瘍である。図６は転移のない原発性乳癌患者の生存を示すKaplan-Meier生存曲線である。上部二曲線は結節のない患者、下部二曲線は結節のある患者である。白いシンボルは、最大全般ＲＨＡＭＭ染色が１単位未満の腫瘍で、黒いシンボルはこの値が ≧１単位の腫瘍である。図７はヒトＲＨＡＭＭイソフォーム１〜５に対するエキソン７および８の有無を示す図である。詳細な発明の説明本発明者らは表１に示すヒトＲＨＡＭＭのゲノム配列を得た。ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子の長さは25.4キロベースで、エキソン１７個からなっている。本発明者らはまた、ＲＨＡＭＭの全長ｃＤＮＡを得て、その配列を決定した。健康なヒト乳房由来のｃＤＮＡは２１７５ヌクレオチドのオープン読み取り枠（配列番号３）を持ち、アミノ酸725個からなるポリペプチド（配列番号４）をコードし、分子量84ｋＤａに対応している。抗体R3、即ちネズミＲＨＡＭＭ aa^425-443に対する抗体をプローブとして用い、健康なヒト乳房細胞系ＭＣＦ−１０Ａをウエスターン法により分析したところ、８４、７０と６０ｋＤａの特定ＲＨＡＭＭタンパク質バンド３個があった。８４ｋＤａのタンパク質をコードする情報を代替的スプライシング（alternative splicing）または翻訳後調節することにより、分子量７０ｋＤａの主要なタンパクを生成することができる。また、第二ＡＴＧコドン（＋３４６、aa １１６）は完全なＫｏｚａｋ構成を持っており、in vivoで好適に用いられて、７０ｋＤａのタンパクを造ることができる。さらにまた、ヒトＲＨＡＭＭ・ｃＤＮＡはマイナーな84kDaのタンパク質種に対応しているかもしれない。この可能性は、非トランスフォメーション細胞では少量のネズミＲＨＡＭＭ４が発現することから示唆されている(Entwistle et al.,1995)。上記の結果と、ヒトＲＨＡＭＭ・ｃＤＮＡおよびＲＴ−ＰＣＲ産物の両方に５’非コード領域に終止コドン、枠内に開始メチオニンが存在することから、ｃＤＮＡは全長であることが分かる。図７に示す通り、これまでにヒトＲＨＡＭＭタンパク質が数種のイソフォームに存在することが見出されている。同様のイソフォームがマウスでも同定されている。完全なｃＤＮＡに対応する最も長いイソフォームはＲＨＡＭＭ５と名付けられている。このタンパク質のうちで、ＲＨＡＭＭ５で見られるシグナル・ペプチドを欠いているより短いものはＲＨＡＭＭ４と名付けられている。ＲＨＡＭＭ４とＲＨＡＭＭ５は両方とも、エキソン７と８を含んでいる。その代わり、スプライシングされたイソフォーム１と３は、各々エキソン７と８を欠いている。最も短いイソフォームであるＲＨＡＭＭ２はエキソン７と８の両方がなく、本明細書の初頭で説明したマウスＲＨＡＭＭに対応している。表２では、全長(full length)のヒトＲＨＡＭＭ・ｃＤＮＡとネズミＲＨＡＭＭ４・ｃＤＮＡ（配列番号５）を比較している。図中、同一のヌクレオチドは垂直の破線で示しており、並び(alignment)を維持するに必要なヌクレオチドの間隙はダッシュで示し、開始および終止コドンは太字で示している。表３では、表２のヌクレオチドによってコードされている、ヒトＲＨＡＭＭアミノ酸配列と、ネズミ・アミノ酸配列（配列番号６）とを比較している。同一のアミノ酸は垂直の破線で示し、保存的変化は＋印で示している。ＨＡ結合ドメイン２個は太字で示し、ネズミＲＨＡＭＭ４のエキソン８にはアンダーラインがしてある。並びを維持するに必要なアミノ酸欠損はダッシュで示し、終止コドンは星印で示している。比較するマウスとヒトＲＨＡＭＭイソフォーム間の相同率は８５％である。（表２と３で二重アンダーラインしてある）ネズミＲＨＡＭＭ・ｃＤＮＡ中にコードされているアミノ酸繰り返し配列５個のうち、１個のみがヒトＲＨＡＭＭ・ｃＤＮＡに存在している。代替的にスプライシングされたエキソン８はネズミ細胞の細胞運動度、増殖、トランスフォーメーションに重要であることがこれまでに証明されている(Entwi stle,1994;Hall,1995)。ヒト組識のＲＨＡＭＭ発現を再吟味することにより、ほとんどの正常組識はヒトＲＨＡＭＭ１イソフォームを含有するが、検出されるようなＲＨＡＭＭ４は含有していないことが証明された。対照的に、腫瘍組識や傷害に応答する正常組識は、ＲＨＡＭＭ４イソフォームの発現を示す。その代わり、スプライシングされたヒトエキソン８（配列番号１６）はアミノ酸配列ＶＳＩＥＫＥＫＩＤＥＫＳＥＴＥＫＬＬＥＹＩＥＥＩＳ（配列番号５０）をコードしている。以前より説明されているように(国際出願ＷＯ93／21312公報)、ネズミＲＨＡＭＭは共通結合モチーフ、Ｘ¹−Ａ_n−Ｘ²，を示している。図中、Ｘ¹とＸ²は塩基性アミノ酸残基であり、Ａ_nは中性または塩基性アミノ酸残基７または８個からなるアミノ酸配列である。このモチーフ数種は、ネズミＲＨＡＭＭ結合ドメイン２個中、ネズミＲＨＡＭＭ２アミノ酸配列のアミノ酸４０２〜４１２と４２４〜４３３で存在している。図２と表３で見られる如く、この結合モチーフはラットとヒトのＲＨＡＭＭ結合ドメインに完全に保存されている。ヒトＲＨＡＭＭでは、結合ドメインはアミノ酸配列ＫＱＫＩＫＨＶＶＫＬＫ（配列番号１）およびＫＬＲＣＱＬＡＫＫＫ（配列番号７）からなっている。核酸本発明の一連の実施態様は、本明細書で開示するヒトＲＨＡＭＭ核酸配列に対応する、またはこれに関する単離された核酸を提供する。本発明の他の一連の実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭ配列のサブセットまたはその補体を含む核酸を単離することを提供する。このような配列はプローブとＰＣＲプライマーとして有用性がある。ＲＨＡＭＭタンパク質の発現本発明のさらに他の実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭタンパク質のコード付け配列が内因性または外因性５’および／または３’制御部に操作上密着している核酸を提供する。例えば、操作上外因性制御部に密着しているヒトＲＨＡＭＭタンパク質の完全なＯＲＦは、ヒトＲＨＡＭＭの全長タンパク質を発現させるのに用いることができる。制御部は、原核細胞または真核細胞の遺伝子、そのウイルスやこれらの組み合せの発現を制御する配列から選ぶことができる。このような制御部には、例えば、lac 系、trp系、tac系やtrc系が含まれるが、但しこれらのみには限定されない。制御体(regulatory elements)は誘発性のものか、抑制性のものを選んで、コード付けしている核酸によってトランスフォーメーションされた細胞中で、ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子が発現するのを制御することができるようにする。その代わりに、コード付け部を操作上制御体に密着させて、組識を選らんでヒトＲＨＡＭＭ遺伝子を組識特異的に発現させても良い。ＲＨＡＭＭイソフォーム、またはその一部選んで、それだけを発現させるためには、適当なコード付けヌクレオチド配列を選択しなければならない。原核または真核発現系を形成して、そのヌクレオチド配列を選んで、プラスミドその他のベクターに組み入れ、さらにこのプラスミドやベクターを生きている細胞に組み入れることによってもタンパク質を発現させることができる。原核および真核発現系によって、タンパク質の各種重要機能ドメインが融合タンパク質を回収することができ、従って、この融合タンパク質を結合、構造や機能の研究に使うことも出来るし、また適当な抗体を形成するために用いることも出来る。典型的な発現ベクターには、遺伝子に対応するｍＲＮＡの大量合成を指示するプロモーターが含有されている。また、これらのベクターには、宿主生物内でベクターが自律的に複製することを可能にする配列、細胞が選択に適するベクターを含有することを可能にする遺伝特質をコードする配列や、ｍＲＮＡ翻訳の効率を向上させる配列が含まれている。一部のベクターには、細胞を選択条件下で増殖することによりこれらの細胞を遊離させることを可能にするネオマイシン耐性のような選択すべきマーカーが含有されている。ベクターをゲノムＤＮＡと一体化させる細胞系を産生することにより、遺伝子産物を連続生産することもできる。真核発現系によって、発現タンパク質の適当な発現と翻訳後調節を行うことができる。このことにより、生物活性の適切な発現と翻訳後調節を決定し、且つ遺伝子の５‘部に所在する制御体とタンパク質発現の組織制御におけるその役割を確認する遺伝子および遺伝子産物の研究が可能となる。さらにまた、タンパク質を大量生産して単離精製すること、タンパク質を発現する細胞をタンパク質に対して生成された抗体の機能分析系として使用すること、薬理製剤の効果の試験またはシグナル形質導入系の成分の試験、および正常な完全タンパク質、その特定部分、天然多型現象や人工産生変異タンパク質の機能研究も可能となる。制限酵素消化、ＤＮＡポリメラーゼの充填(fill-in)、エキソヌクレアーゼ欠損、末端デオキシヌクレオチドの延長(extension)、合成またはクローニングされたＤＮＡ配列の結窄、および特定オリゴヌクレオチドとＰＣＲの併用による部位指示性配列の変更などの方法を用いて、ＤＮＡ配列を変えることができる。ヌクレオチド配列を選んで、これを適当な発現ベクターに含有させ、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥデクストラン・トランスフェクション、エレクロポレーション、微量注射、原形質体の融合やリポソーム仲介トランスフェクションを含むトランスフォーメーション法により適当なＥ.ｃｏｌｉ菌株に組み入れる。適当な宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、シュードモナス、枯草菌その他のＢａｃｉｌｌｕｓ、その他の細菌、イースト、真菌、（発現にバキュロウイルス・ベクターを用いる）昆虫、マウスその他の動物またはヒトの組織細胞、あるいはＣｏｓまたはＣＨＯなどの細胞系を挙げることができるが、これらのみに限定されない。適当なタンパク質の組み換え発現方法は、Sambrook et al.(1989) が説明している。実質的に純粋なタンパク質本発明のさらに他の実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭタンパク質、ヒトＲＨＡＭＭタンパク質のフラグメントおよびヒトＲＨＡＭＭタンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質の実質的に純粋な製剤を提供する。本明細書で説明する如く、タンパク質、フラグメントおよび融合タンパク質はヒトＲＨＡＭＭタンパク質に対する抗体の産生、および本明細書で説明する如く、診断治療方法に有用性がある。本発明は、ヒトＲＨＡＭＮ４タンパク質の完全なアミノ酸配列の部分配列（subsequences）であるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なタンパク質またはペプチドを提供する。本発明は、本明細書で開示するヒトＲＨＡＭＭアミノ酸配列の連続アミノ酸少なくとも４〜５個、好ましくは連続アミノ酸６〜１０個、より好ましくは連続アミノ酸５０〜１００個に対応する配列からなる実質的に純粋なタンパク質またはペプチドを提供する。本発明のタンパク質またはペプチドは、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィまたはＲＨＡＭＭ免疫親和性精製法などの標準的なタンパク質製法によって、単離したり、精製することができる。例えば、グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）でタンパク質を融合タンパク質として発現し、グルタチオン・カラムを用いる親和性精製法によって精製することができる。ヒトＲＨＡＭＭは、例えば、ヨーロッパ特許公報第７２１０１２Ａ２号でのネズミＲＨＡＭＭについての説明と同様にして、発現させ、精製することができる。抗体本発明のさらに他の実施態様は、ヒトＲＨＡＭＭタンパク質またはその一部または抗原決定基を選択的に結合する抗体を提供する。このような抗体は当業者に知られている従来法により調製することができる。抗体産生に使用するヒトＲＨＡＭＭタンパク質またはその一部は、本明細書の他のところに記載されているように、ここに開示するヌクレオチド配列またはその一部を発現させて調製することができる。短いペプチドには、抗原として作用する、担体タンパク質に担持されているペプチドを選び、これからなる融合タンパク質を調製する必要がある。このようにして選択されたＲＨＡＭＭタンパク質またはペプチドまたは融合タンパク質をウサギその他の実験動物に注射してポリクロナール抗体を生成する。週単位の間隔をおいて追加抗原量を注射した後、ウサギその他の実験動物から採血して、血清を単離する。血清は直接使用するか、あるいはポリクロナール抗体を使用前に親和性クロマトグラフィを含む各種の方法で精製する。当業者には理解できるよラに、モノクロナール抗体も産生することができる。ＲＨＡＭＭタンパク質またはペプチドを選び、所望の場合には担体タンパク質に担持させて、これをフロインドアジュバントに溶解した溶液をマウスに注射する。３週間かけて３回注射した後、マウスの脾臓を切除し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁する。脾臓細胞はリンパ球源としての役割を果たすと同時に、その一部は適当な特異性を持つ抗体を産生する。その後、永久増殖する骨髄腫類縁細胞（myeloma partner cell）と融合させ、融合産物をＨＡＴなどの選択能力を持つ薬剤の存在下多数の組織培養ウェル中で平板培養する。その後、ウェルをイライザ(ELISA)でスクリーニングして、結合抗体を生成する細胞を含有するウェルを確認する。その後も平板培養を続け、３週間後再びウェルのスクリーニングを行って、抗体産生細胞を確認する。ウェルの９０％以上がはっきりと抗体を産生する単クローンを含有するようになるまで数種のクローニング法を実施する。この方法により、抗体を産生する安定したクローン系が確立する。その後、プロテインＡ・セファロースを用いるアフィニテイークロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィならびにこれらの方法の変法や組み合せによってモノクロナール抗体を精製する。プラスミドを生成して好適な宿主中で所望のモノクロナール抗体を発現させる組み換え法によって、短くした（truncated version）のモノクロナール抗体も産生することができる。ＲＨＡＭＭまたは一以上のそのＨＡ結合ドメインに対する抗体は、ＨＡ結合を阻害して細胞移動を抑制する。ＲＨＡＭＭ／ＨＡ相互作用は腫瘍遺伝子や成長因子が仲介する細胞移動に関与するので、ＨＡ結合能力を保持している、ヒトＲＨＡＭＭあるいはその変異体またはフラグメントに対する抗体は細胞移動関連疾患を治療的に抑制する手段を提供する。これらの疾患としては、腫瘍の侵襲、出産欠陥、急性および慢性炎症傷害、パーキンソンおよびハンチントン病を含むアルツハイマーその他病態の痴呆、ＡＩＤＳ、糖尿病、自己免疫疾患、角膜形成異常および栄養過多、火傷、外科的創、および癒着、発作と多発性硬化が挙げられる。ＲＨＡＭＭまたはその構成ペプチドを用いて抑制することができる、細胞移動に関連するその他の状況には、ＣＮＳと脊髄の再生、避妊および試験管内受精と胚の成長がある。ＲＨＡＭＭに対する抗体は、これまでに試験管内でヒト精子の運動能をよくせいすること、また試験管内の系でヒト精子によってハムスタ卵子の受精を抑制することが証明されている。抗体生成の好適な方法は、例えば、Antibody Engineering:A Practical Guide ,Borrebaek,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1992)またはAntibody Engi neerihg ,2nd Edition,Borrebaek,Ed.,Oxford University Press,Oxford(1995)で説明されている。トランスフォーメーションされた細胞本発明のさらに他の実施態様は、本発明の核酸でトランスフォーメーションまたはトランスフェクションされた真核あるいは原核いずれかの細胞または細胞系を提供する。このような細胞または細胞系は、本明細書で説明するヒトＲＨＡＭＭタンパク質またはそのフラグメントの調製に有用である。また、診断治療法のモデル系としても有用である。本発明の核酸を含有する適当なベクターを調整する方法、およびこれらのベクターを使って細胞のトランスフォーメーションする方法は、当業者に知られており、例えば、Sambook et al.,(1989)でもそのレビューが掲載されている。乳癌の診断または予後徴候インジケーターさらに他の実施態様は、ＲＨＡＭＭが発現過多であるか、否かを判定することにより悪性が疑われている組織のスクリーニングを行う。この場合、発現過多は悪性であることを示している。本発明のさらに他の実施態様は、乳癌患者の予後の評価方法を提供する。乳房腫瘍の組織検査において、極めて高濃度のＲＨＡＭＭが細胞や細胞中の小さな主患部に存在（最大染色）することが認められた。これらの細胞は一定して存在してはいなかったが、ＲＨＡＭＭの全般染色の増加と相関していた。より重要なことは、これらの異常細胞の存在は治療結果が不良であることを示す予後徴候であった事である(p＝0.02)。最大染色(maximum staining)と全般染色(genera l staining)を合併して新しい統計パラメーター（max-general）として、ＲＨＡＭＭ発現の高さを結節状態と腫瘍サイズの予後徴候値に有意に加えることとした (p=0.016およびp=0.008)。地理的に異なる地域から来院した第二患者群のＲＨＡＭＭｍＲＮＡ濃度を分析して、ＲＨＡＭＭの乳癌への関与をさらに評価した。この第二の研究では、ヒト組織中のＲＨＡＭＭｍＲＮＡ発現は、腫瘍グレードの高さ、ならびに合併パラメーターの低さと有為の関連性があった（高腫瘍グレード、ＥＲは負で、リンパ節は正）(p=0.0357およびp=0.0213)。腫瘍サイズとリンパ節は、Cox比例危険モデル（Cox proportional hazard mod el）により乳癌患者全般の生存を予想するのに有意なパラメーターであることが立証された。一般に腫瘍内でのＲＨＡＭＭ発現と、ＲＨＡＭＭを非常に発現する単細胞または小細胞群の出現との間には関係があるように見えた。両タイプの染色を表す合併点数（combined score）は結節状態と転移のない生存の予後徴候値を上昇させる事になったので、この関係は腫瘍の進行の一因となる。極めて高濃度のＲＨＡＭＭを発現する単細胞は、このＨＡレセプターを高濃度で発現する細胞の背景から発生したと考えられる。免疫組織化学研究により、、全般および最大のＲＨＡＭＭタンパク質発現は合併して、リンパ球結節の状態が示す生存と関速するが、ＥＲ／ＰＲの状態や腫瘍グレードとは無関係である事が証明された。ｍＲＮＡの発現に焦点を当てた第二研究から、予後徴候について同様の結果を得、ＥＲ／ＰＲの状態と腫瘍グレードの高さとの有意の関連性も成立された。この差は第二研究で用いたＲＴ−ＰＣＲによるＲＨＡＭＭの検出方法の感度がより高かったことが原因であるかもしれない。エキソン８ペプチドヒトエキソン８（配列番号１６）によりコードされているペプチド（配列番号５０）とそれに対する抗体は、好ましくはペプチドとＫＬＨなどの他の抗原とを共役させた後に、従来法により合成することができる。当業者が理解するように、共役抗原をマウスに接種することにより、脾臓細胞を得、ハイブリドーマを産生することができる。従来法によるスクリーニングを実施して、エキソン８ペプチドに最大の親和力を有するハイブリドーマ産生モノクロナール抗体を得る。抗体を選んで使用して従来型イライザ(ELISA)を造り、ヒト血清やヒト組織のスクリーニングを行い、エキソン８によってコードされているペプチドを含有する可溶のＲＨＡＭＭを得る。健康患者から得た標準値との比較によって、発現過多や腫瘍の存在を示すことができる。その代わりに、エキソン８に対する抗体を位相ディスプレーライブラリから創り出しても良い。その代わりに、ヒト腫瘍の生検サンプル中のエキソン８発現濃度を組織化学的手段により検査して(パラフィン切片、凍結切片)、考えられる予後徴候のインジケーターとしても良い。組織化学は、例えば、Wang et al.,1992が前報で説明しているように、エキソン８ペプチドに対する抗体をプローブとして用いる従来法によって実施することができる。可溶のネズミＧＳＴ−ＲＨＡＭＭ融合タンパク質は細胞運動能を抑制すると共に、細胞周期Ｇ２Ｍの細胞を阻害することが証明されている。細胞運動能に対する溶解性融合タンパク質の効果は、ヒアルロナン結合ドメインによるもので、これらのヒアルロナン結合ドメインをコードするペプチドによって擬態することができる。しかしながら、細胞周期の阻害に対する溶解性タンパク質の効果は現在のところ分かっていないが、ＲＨＡＭＭ２に含まれていて、従って、繰り返し配列であると思われる。本発明者らによってヒトＲＨＡＭＭイソフォームのｃＤＮＡが提供されたので、上記で説明したように、ＲＨＡＭＭ１、２、３、４や５を含むヒトイソフォームの何れかを従来型発現系で発現する事により溶解性ヒトＲＨＡＭＭタンパク質を産生する手段が与えられる事になった。溶解性ＲＨＡＭＭイソフォームは、細胞関連ＲＨＡＭＭと溶解性ＲＨＡＭＭとの比率を調整することによって、細胞移動と細胞周期を制御するＲＨＡＭＭの細胞表面形態（the cell surface form of RHAMM）に用いるＲＨＡＭＭリガンドの効用を変える手段として使用することができる。ネズミによる結果に基づき、ＲＨＡＭＭ２は細胞運動能と細胞周期に関連する事象を十分に制御できると見込まれている。しかしながら、腫瘍の進行に関わる事象の制御には他のＲＨＡＭＭイソフォームが必要とされるかもしれない。と言うのはこれらの補足的イソフォームは、（腫瘍形成に関連する）エキソン７と８をコードしているからであり、この点でこれらのエキソンをコードしていないＲＨＡＭＭ２とは異なっている。これらの溶解性ヒトＲＨＡＭＭタンパク質は、外傷の治療、火傷、移植後の炎症の整復、腫瘍の増殖と転移の予防に臨床使用することができる。ヒトＲＨＡＭＭイソフォームと、溶解性タンパク質の産生のためにはヒトＲＨＡＭＭｃＤＮＡを使用することが必要なネズミＲＨＡＭＭイソフォームとの間には配列に顕著な差異があって、この差異のため（単一のアミノ酸変化に対して発生する）免疫応答がヒトでは発生せず、融合タンパク質の有益な効果が否定されている。ＲＨＡＭＭ遺伝子導入動物モデル本発明のさらに他の実施態様は、胚形成、増殖、発育の期間中におけるＲＨＡＭＭ遺伝子の役割を確認し、遺伝子が可能な療法のテストに関連しているか、関与している疾患の理解に役立つよう、非ヒト、遺伝子導入動物モデルの製造に関する。本発明において、ＲＨＡＭＭ遺伝子の発現と悪性、特に乳癌との関係を研究するために、遺伝子導入動物を開発することは特に好適である。マウスは飼育が容易、比較的安価で、さらに給餌が容易であるため、遺伝子導入動物に用いられることが多い。遺伝子導入動物は、移植遺伝子を保持し、即ち、遺伝子をクローニングした後、投入して、安定的に組み入れ、この遺伝子を次ぎの世代受け継がせるものである。本発明においては、ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子をクローニングして、動物のゲノムに安定的に組み入れる。この代わりに、悪性発生の原因であると考えられているコード領域であるエキソン８を含まないＲＨＡＭＭ配列といった、遺伝子配列の一部を変えたものを使用しても良い。この様にして、動物が成長し、悪性が始まる期間中に、代替的にスプライシングされている遺伝子産物の特定機能を検討して、治療戦略を開発することができる。ある種のヒト遺伝子配列を保持している遺伝子導入動物を造るには、数種の方法がある。ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子配列に特定の変化を発生させることも、戦略の一つである。in vitroで用いられている各種の酵素法や化学法によって変化を造ることができる。最も広く普及している方法の一つは、特定のオリゴヌクレオチドを突然変異原として用い、ＤＮＡ配列中に正確なデザインの欠損、挿入、点変異を発生させることである。第二には、野生型ヒト遺伝子および／またはヒト化ネズミ遺伝子を,相同性組み換え法により挿入することができる。(単個または複数個の)変化させたヒト遺伝子または変異ヒト遺伝子は、野生型または変異体または人工プロモーター体を使って、ゲノム構成体あるいはミニ遺伝子構成体として挿入することも可能である。より一般的には、相同性組み換え法により内因性遺伝子のフラグメントを人工的に変更したものを挿入することにより内在性ネズミ遺伝子のノックアウト(knock-out)を達成することができる。この方法では、相同性組み換え法により変異対立遺伝子を、胚幹細胞中に投入する。研究されている遺伝子の対立遺伝子中にノックアウト変異体を含有する胚幹細胞は、マウスの初期胚に投入する。その結果、移植ＥＳ細胞と宿主細胞の両方から誘導された組織を含むキメラであるマウスが得られる。キメラマウスは、交配させて変異が生殖系に組み入れられているか、否かを評価する。これらのキメラマウス各々は、ノックアウト突然変異に対しては異型接合であるが、交配すれば同型接合ノックアウトマウスを産出する。遺伝子標的産生遺伝子ノックアウト（gene targeting producing gene knocko ut）により、変化し、正常コピーを置換するために用いられた遺伝子の生体内評価を行うことができる。変更には変異終止コドンの挿入、ＤＮＡ配列の欠損やリコンビナーゼなどの酵素によって認識される組み換え体（lox p部位）の挿入が含まれている。Cre−lox系により、遺伝子を切除したり、または遺伝子配列のある一部を切除することができる。遺伝子を失活させるためには、化学的にあるいはＸ線によりマウス配偶子を転移させた後受精を行う方法を適用することができる。異型接合による子孫はサザンブロッテイングで同定し、薬剤投与により対立遺伝子１個が失われたことや、ＲＦＬＰマーカーを用いて親対立遺伝子１個を継承することができなかったことを証明する。遺伝子導入動物を造るには、卵細胞微量注射標準法またはトランスフェクション標準法を用いて、興味あるヒト遺伝子の変化種をマウスの生殖系に挿入するか、あるいは幹細胞に微量注射する。この代わりに、内因性遺伝子を失活するか、あるいはこれを置換することを所望の場合は、胚幹細胞を用いる相同性組み換え法を、上記と同様にして適用する。卵細胞注射に際しては、正常なヒトＲＨＡＭＭ遺伝し配列または変化したヒトＲＨＡＭＭ遺伝子配列の一以上のコピーを、直前に授精させたマウス卵細胞の前核に挿入することができる。その後、この卵細胞は偽妊娠している育ての親に再移植される。この様にして出産したマウスは、尾部ＤＮＡ中のヒトＦＨＡＭＭ遺伝子配列の存在を分析することにより、組み込み体としてのスクリーニングを行う。移植遺伝子は、ｃＤＮＡが天然プロモーターまたは異種起源のプロモーターのいずれかを持ち、ＹＡＣまたは染色体フラグメントとして注射される完全なゲノム配列であるか、あるいは最も適切な発現に必要なコード領域その他の構成体すべてを含有するミニ遺伝子であるかのいずれかである。変化させた遺伝子挿入のため、初期胚をレトロウイルスで感染させることができる。この方法では、変化させた遺伝子をレトロウイルス・ベクターに挿入し、このレトロウイルス・ベクターを使って成長段階初期のうちにマウスの胚を感染させて、キメラを発生させ、この一部が生殖腺に伝播する。幹細胞を用いる同種組み換えのため、遺伝子接合伝達細胞をスクリーニングして、希な同種組み換え事象を確認することができる。確認が完了すると、これらを使い、マウス胚盤胞を注射してキメラを発生させる。この場合、マウスの出生比率は組み換え系からの生殖系の接合伝達を示している。この遺伝子標的法は、遺伝子の失活を所望の場合に、特に有用である。例えば、選択し得るマーカー側面に密着するエキソン由来の配列を含有するＤＮＡフラグメントをデザインすることにより遺伝子の失活が達成される。同種組み換え法では、マーカー配列をエキソン中央部に挿入して、遺伝子を失活する。その上で、各クローンのＤＮＡ分析を行って、同種組み換え法の事象を認識する。興味がある突然変異を含有するオリゴヌクレオチドを注射し、その結果生ずる細胞をＰＣＲによってスクリーニングすることによっても、マウス生殖系に変異を発生させることができる。本発明のこの実施態様は、乳癌のマウス・モデルとして商業価値が最も顕著に高い。マウスの成長発展段階で、悪性についての組織中の発現と効果を研究することによりＲＨＡＭＭの役割を確認することができる。エキソン８が悪性の原因であることが確認されたので、このエキソンを保持する遺伝子導入マウス、ならびにエキソン８を欠いているＲＨＡＭＭ遺伝子を持つ、またはこのエキソンの付加的なコピーを有する遺伝子導入マウスを悪性腫瘍の研究用に製造し、薬剤による治療、遺伝子標的法、抗体療法を含む、可能性ある治療方法の検討に用いるモデルとして使用することができる。アンチセンス（ＡＳ）療法本発明は、細胞がトランスフォーメーションして悪性表現型となる原因であるとされているエキソン８を含むヒトＲＨＡＭＭ遺伝子配列の発現により、トランスフォーメーションされた表現型を逆にする方法を提供する。アンチセンス系戦略を用いて、遺伝子機能を検討したり、あるいは遺伝子機能を抑制して、治療薬デザインの土台とすることができる。これは、細胞内でｍＲＮＡと相補的アンチセンス種（antisense species）とがハイブリッドを形成すれば、配列に特異性を持ちつつ遺伝子の発現を抑圧することができると言う仮定を原理としている。高度の特異性によってＲＮＡやＤＮＡのセンス鎖と結合できるアンチセンス鎖ヌクレオチドを合成することは可能である。ハイブリッド二重構造のＲＮＡが形成されれば、標的ｍＲＮＡの加工／輸送／翻訳および／または安定性に干渉することができる。アンチセンス効果が出るためには、ハイブリッドが形成されなければならない。アンチセンス効果はこれまで、ＡＳオリゴヌクレオチドの使用、ＡＳ、ＲＮＳ、ＤＮＡの注射、およびＡＳＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを含む各種方法により説明してきた。治療用アンチセンス・ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたは発現されているヌクレオチドとして製造することができる。オリゴヌクレオチドは短い一本鎖ＤＮＡで、長さは通常核酸塩基１５〜２０個である。発現されているヌクレオチドは、アデノウイルス、レトロウイルスやプラスミド・ベクターなどの発現ベクターにより製造される。ベクターを培養中の細胞や、患者に投与すると、その細胞がアンチセンス・ヌクレオチドを造る。発現しているベクターはアンチセンス・ＲＮＡを産生するようにデザインすることができる。アンチセンスＲＮＡの長さは各種あって、塩基数が数ダースのものから、数千のものまである。ＡＳ効果はコントロール（sense）配列によって誘発される場合もある。表現型の変化の程度は各種あって、その差は極めて大きい。ＡＳによって誘発される表現型効果は、生物終末点、タンパク質濃度、タンパク質活性化測定や標的ｍＲＮＡ濃度などの尺度の変化によって計られる。多剤耐性（multidrug resistance）は、ＭＤＲ表現型がp-glycoprotein（a 17 0kDa membrane glycoprotein;ATP-dependent efflux pump）をコードする単遺伝子mdrl（ＭＤＲ遺伝子）の発現によって確立するので、アンチセンス効果による表現型変化に関連する分子事象の研究に有用なモデルである。本発明では、ＲＨＡＭＭｃＤＮＡがトランスフェクションされ、悪性表現型が発現されている哺乳動物の細胞を、アンチセンスＲＨＡＭＭｃＤＮＡでさらにトランスフェクションして、遺伝子の転写を抑制し、悪性表現型を逆転または還元することができる。その代わりに、ＲＨＡＭＭ遺伝子の一部を、悪性表現型の原因であるエキソン８に対して特異的なアンチセンスＲＨＡＭＭ配列の標的としても良い。発現ベクターは、悪性細胞中で発現しているエキソン８を含むＲＨＡＭＭ遺伝子を標的とするアンチセンス療法のモデルとして使用することができる。このようにして、悪性細胞と組織は標的とされる一方、健庫な細胞は生存を続けることができる。これがＲＨＡＭＭに起因する悪性疾患の効果的治療方法であることが立証されている。タンパク質療法翻訳されたタンパク質全体を、エキソン８タンパク質配列を含まないスプライシングされたタンパク質と交換するか、あるいはタンパク質配列全体の機能を調節することにより、エキソン８を含有するヒトＲＨＡＭＭ遺伝子の発現過多に起因する悪性疾患を治療することができる。これまでにＲＨＡＭＭタンパク質の生物経路が完全に理解されているので、生理欠陥を矯正するためにタンパク質が関与している病理生理経路（例えば、シグナル形質導入経路）を調節することが可能である。タンパク質を、スプライシングされているタンパク質あるいは慎重に平衡を保っている突然変異を持つタンパク質と交換するためには、タンパク質を発現できる培養細胞系から純粋なＲＨＡＭＭタンパク質を大量に入手する必要がある。タンパク質を患部組織に輸送するには、適当なパッケージング系や投与系を使えば良い。実施例例証を目的として実施例を説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定することを意図していない。本明細書においては、分子遺伝学、タンパク質とペプチドの生化学、および免疫学の方法を参照するが、系統的な説明は遠慮したい。これらの方法の例はこれまでに科学誌に発表されていて、当業者に周知である。実施例１クローニングおよびＤＮＡ配列決定 lambda qtll中の５'-stretchの正常乳房cDNAライブラリーをClontech(Palo Al to,CA)から入手し、ネズミＲＨＡＭＭ２ｃＤＮＡをプローブとして用いるスクリーニングを行った。正のクローン２個（クローン１＆２、図１）は、λqtllベクター由来の５'および３'挿入スクリーニングアンプリファイアを用いてＰＣＲ増幅を行った。これによって得た1.4kbおよび1.7kbの挿入物を、ＰＣＲ^TMＴＡベクター(Invitrogen,San Diego，CA)中にクローニングし、T⁷Sequencing^TMkit(Ph armacia Bikotech，Uppsal，Sweden)を用いてジデオキシ連鎖反応停止法により配列決定した。これによって得たｃＤＮＡ配列にはアミノ末端部が欠失していた。ヒトｃＤＮＡクローン１のコード付け部から形成したMarathon^TMcDNA Amplifi cation Kit(Clontech)を用い、正常なヒト乳房上皮細胞系ＭＣＦ−１０Ａ(ＡＴＣＣ,Rockville,ＭＤ.)のＲＮＡから1.4kb5'RACEフラグメントを得た。この産物はＰＣＲ^TMＴＡクーニングベクター中にクローニングし、上記と同様にして配列決定した。これら二つの供給源から得た配列は2.8kbのフラグメントで、2175nt. のＯＲＦを含有していた。このcDNAのクローニング戦略は図１に示してある。細胞系および培養条件 MCF-10Aと呼ぶ正常なヒト乳房上皮細胞系は、継代４０のものをＡＴＣＣ(Rock ville,ＭＤ)から入手した。ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ−１２ (1：1）培地）に、５％ウマ血清、0.1μｇ／mlコレラトキシン、10μｇ／mlインシュリン(Gibco BRL,Burlington,ＯＮ)、0.5μｇ／mlハイドロコーチゾン（Sigm a Chemical Co.,St.Louis,ＭＯ）および、0.02μｇ／ml（Collaborative Resear ch,lnc.,Palo Alto,ＣＡ）を添加して、この細胞を３７℃、空気中のＣＯ₂５％の条件で増殖した。細胞からＲＮＡの単離 Micro-Fast Track^TMkitをもちい、メーカーの指示書に従って、正常乳房上皮細胞系ＭＣＦ−１０Ａの９０％周密培養物からｍＲＮＡを抽出した。簡単に説明すると、細胞は先ずRnase／Protein Degraderを含有する界面活性剤系緩衝液中に溶解し、４５℃でインキュベートした後、オリゴ（ｄＴ）セルローズに直接塗布して吸着させた。高塩分緩衝液（結合緩衝液）でＤＮＡ，分解タンパク質、細胞残基から樹脂を洗い落とした。非ポリアデニル化ＲＮＡは低塩分緩衝液で洗い流し、塩分の不在下でポリＡ^*ＲＮＡを溶出させた。ＲＮＡの純度と数量は２６０および280nmで光学密度を観測することにより評価した。逆転写ポリメラーゼ運鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）ライブラリーから得たヒトＲＨＡＭＭ cDNAのＯＲＦが全長(full length)であることを確認するため、ヒト乳房上皮細胞系から単離したＲＮＡを用いて、ＲＴ −ＰＣＲ増幅を行い、続いてＤＮＡ配列決定を行った。また、メーカーの指示にしたがって、正確にfirst-strand cCNA synthesis kit(Clontech)の記載通りにして、逆転写を行った。簡単に説明すると、上記と同様にして抽出した１μｇメッセンジャーＲＮＡを、16-merオリゴｄＴプライマーと１０００ＵＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて４２℃で６０分間にわたって、逆転写した。合計２０μｌの反応物に無菌水８０μｌを加えて、１００μｌに希釈した。熱安定性のあるTaqおよびPwo ＤＮＡポリメラーゼ(Boehringer Mannheim Expand^TMLong Template PCR System)と、TaqStart抗体(Clontech)、ならびにヒトＲＨＡＭＭｃＤＮＡの非コード領域由来のプライマー 5'GGATATCTGCAGAATTCGGCTTACT（配列番号５１）および 5'ACAGCAACATCAATAACAACAAGA（配列番号５２）を用いて、PCR反応５０μ１毎に希釈cDNAテンプレート10μｌを使った。ＰＣＲ周期パラメーターは、９４℃で１分の変性、９４℃で45秒の変性、６０℃で45秒のアニーリング、68℃で２分の延長（extension）であった。３８サイクルを使い、最終延長時間は８分であった。ＰＣＲ産物はＰＣＲ^TMＴＡクローニングベクター中にクローニングし、上記と同様にして配列決定した。ウェスターン分析法ＭＣＦ−１０Ａ細胞を増殖培地で増殖して、採取24時間前に合成培地に移した。氷冷ＰＢＳで洗った後、プロテアーゼ阻止剤ロイペプチン(１μｇ／ml)、フェニルメチルスフォニルフルオリド(ＰＭＳＦ，２ｍＭ)、ペプスタチンＡ(１μｇ／ml)、アプロチニン（0.2ＴＩＵ／ml）および３，４−ジクロロイソクマリン（２００μＭ）を含有する氷冷修飾ＲＩＰＡ溶菌緩衝液（25ｍＭＴｒｉsＨＣｌ, ｐＨ7.2、0.1％のＳＤＳ，１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、0.15ＭのＮａＣｌ、1ｍＭのＥＤＴＡ）で、細胞を溶解した（試薬は全てシグマ社）。溶解液は氷上で２０分間インキュベートした後、１３, ０００ｒｐｍおよび4℃で20分問遠心分離した（Heraeus Biofuge 13,Baxter Dia gnostics Corporation,Mississauga,Ontario)。上澄み液のタンパク質濃度をDC Protein Assay(Bio-Rad Laroratories,Richmond,CA)で測定した。各細胞溶解液由来の全タンパク質５μｇをＳＤＳ還元サンプル緩衝液に溶解した溶液を、予め染色してある分子量標準品（Sigma）と共に、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる電気泳動に装填して、この全タンパク質を単離した。２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、192ｍＭのグリシン、２０％のメタノールを含有し、ｐＨが8.3である緩衝液中のニトロセルローズ膜（Bio-Rad）上にこの全タンパク質を移動させた後、１００Ｖで４℃の電気泳動の接合伝達細胞（transfer cells）を用いて、TBST（10 ｍＭ Tris塩基、150ｍＭ NaCl、pH7.4、0.1％Tween20、Sigma) に溶かした5％脱脂乳により、膜上の余分なタンパク質結合部位を塞いだ。その後、初代RHAMMj抗体R3（1：100、脱脂乳＋ＴＢＳＴ中に１μｇ／ml）またはネズミ融合タンパク質と共に一晩予備インキュベートしたR3.6のいずれかと一緒に、膜を旋回シェーカー上で4℃によりインキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回洗った後、セイヨウワサビペルオキシダーゼと複合しているヤギ抗ウサギlgG（1％脱脂乳＋ＴＢＳＴ中で１：5000に希釈）と共に、膜を室温で１時間インキュベートし、初めはＴＢＳＴ、その後ＴＢＳで洗った。こうして、ウェスターン法のブロットが,メーカーの指示により化学ルミネセンスで目に見えるようになった(Am ersham International Plc.,Amersham,UK)。実施例２方法と材料患者とサンプル第一群は1979〜1982においてマサチューセッツ総合病院で400名の患者から外科的に摘出した一次侵襲乳癌の記録からなる。これらの記録によって、RHAMMタンパク質の発現過度が、これまでに確定している病理要因とどのような関係があるのか、また患者の生存とはどのような関係があるのかを検討した。これらの患者は今でもマサチューセッツ総合病院の受診を続けていた。患者の臨床医学記録から次の情報を得ることができた。診断時の年齢、一次腫瘍の位置、転移の時期、転移の部位、治療の関与、全般的生存期間、およ死因。追跡調査期間は中間値が10.6年、最小が１年、最大が16年で、患者の７５％が10年以上の追跡調査を受けていた。第二群は98名の乳癌患者からなり、標本はNCIC−マニトバ乳癌バンクから受領した。このバンクでは、全ての標本を、外科で摘出後−75℃で急速冷凍している。さらに、このバンクは、各症例の凍結組織の一部を加工して、フォルマリンで固定し、パラフィンに包埋してある組織塊を造っている。パラフィン包埋塊は凍結組織と照合できるよう整理されている。このパラフィン包埋塊の組織から良質の生物切片をとって、病理の解釈や、対応する凍結組織の検討を行うことができる。一方、このバンクには広範な病理グレード（Nottingham System，スコア４〜９、これに対応する低いグレードから高いグレード(Elston,1991)、さらにはエストロゲン・レセプターの状態(リガンド結合検定で測定する)）を表すデータベースがあって、これから腫瘍を選択した。さらに、各症例について、隣接組織領域を評価して凍結組織塊を選択できる数種の基準がある。例えば、正常な小葉や管の上皮成分が最少で、侵襲腫瘍細胞が細胞量の３０％以上を占め、組織が良く保存されていて、壊死がないなどである。腫瘍の大部分は、管の一次侵襲癌である。抗体この研究で使用したポリクロナール抗体である、Ｒ３および抗融合タンパク質抗体はウサキで産生した。Ｒ３は、ヒトＲＨＡＭＭ cDNA（表２）で保存されているネズミＲＨＡＭＭ cDNA（Hardwick,1992）によってコードされている特定のペプチド（aa^425-443）に対するものであり、抗融合タンパク質抗体はグルタチオントランスフェラーゼ(ＧＳＴ)-ＲＨＡＭＭ融合タンパク質（Yang et al.,199 3）に対するものである。ウサギlgGとＲ３はネズミＲＨＡＭＭ融合タンパク質と共に予備インキュベートしてコントロールとして使用した。免疫組織化学フォルマリンで固定し、パラフィンに包埋されている通常の組織を、４ミクロンの小片に切断し、リシンを塗布してあるＲＨＡＭＭ発現評価用のスライドに乗せた。既報されているように、ＣＤ４４染色に関連して説明されているアビジン −ビオチン−ペルオキシダーゼ複合法を使用したが、これは次のように変えた変法であった。スライドは、0.01Ｍ Tris緩衝食塩水（ＴＢＳ）に1.5％ヤギ血清を入れた混液と共に１時間インキュベートして、非特異的結合を阻害した。一次抗体であるR3は1.5％ヤギ血清／ＴＢＳ（1:600）で希釈してスライドの上に乗せて一晩4℃でインキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性は、0.6％Ｈ₂Ｏ₂をメタノールに入れた混液と共にスライドを室温で３０分間インキュベートすることにより失活させることができた (Mallinckrodt)。抗体の希釈は、乳房縮小形成（reduction mammoplasties）について染色が起こらない希釈を決定して選択した。さらに、上記のスライドを、 biotinylatedヤギ抗ウサギlgG（Vectastain ABC peroxidase kit,Vector Labs., Burlingame,CA、1:200の比率で0.01ＭＴＢＳ）と共に、室温で１時問インキュベートし、さらにアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（Vectastain,V ector Labs.,Burlingame,CA、1:200の比率で0.0１ＭＴＢＳ）とともにインキュベートして、結合抗体が目で見えるようにした。スライドは各ステップごとに0. 0IＭＴＢＳで３回づつ洗った。0.05％ＤＡＢ(3,3'-ジアミノベンジジン(3,3'-d iaminobenzidine),Sigma)と0.1％Ｈ₂Ｏ₂と0.05ＭＴＢＳとの溶液にペルオキシダーゼを入れた混液と共にインキュベートすると、ペルオキシダーゼ活性が生じる。スライドにはメチルグリーンで対比染色をおこなった。非免疫血清と、ＲＨＡＭＭ融合タンパク質（組み換え）に予め吸収させた抗体とを負のコントロールとして使用した。二名の独自の観察者に実験条件や臨床結果を何も教えないで、RHAMMに対するヒト乳癌組織の反応性の範囲を対象とするブラインドテストを実施した。任意のスケールで０〜４＋（０＝負、４＋＝強い正）からなる段階を選択して、これに染色強さの実験成績を分類した。四種類の染色強さを試験した。実験前には、これらの種類のうちどれが意味の有るものになるのかは分からなかったし、どのcut-pointがどの種類に有用となるのかも分からなかった。これら四つの種類とは次のようなものである。１）一般的な全体の染色強さ、２）その中に最も強い染色点があって、「最大染色」と呼べる物を含む、病巣や単離された複数の細胞固体のスコアリング、３）腫瘍周囲のストローマの染色、４）核の染色である。「最大スコア」の評価を与えるのは、「最悪」あるいは最もひどく凶兆を示す部位のスライドを見て全般的な診断評価をする外科病理部門の慣習である。ＲＮＡの抽出 Hiller et al（1996）の説明と同様にして、小規模ＲＮＡ抽出プロトコルに従い(Tri-Reagent、Molecular Research Center,Inc.，Cincinnati，OH)、実験試料と組織学的に評価した細胞組成との間に直接の相関関係があるようにして、20 μｍの凍結腫瘍切片1〜3個から全ＲＮＡを抽出した。産物を50μｌマイクロキュベットにいれ、分光計で量を計った。20μｍ切片１個当たりの平均収量は４μｇ／cm²（細胞の変性（variation with cellularity）は＋／−20％）であって、これはconsistent ＯＤ^260/280＞1.8と相関していた。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析: ＲＨＡＭＭの発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価し、続いてアガローズ電気泳動とエチジウムブロミド染色を行ってＰＣＲ産物が目で見えるようにした。アクチンの増幅と、逆転写による増幅の信頼性制御とを平行して行った。その後、バンドの存在と強さ（0、0.5、1.2）を主観的にスコアリングして、ＲＨＡＭＭイソフォームバンドを評価した。全ＲＮＡ 100ngに、１ｍＭ dNTP、Rnase阻止剤１単位、2.5ｍＭオリゴd(T)プライマー、ＭＬＶ逆転写酵素50単位と１ＸＭＭＬＶ緩衝液（Gibco ＢＲＬ）を加えて全量を10μｌとして、37℃で60分問逆転写を行った。続いて５分問90℃でインキュベートし、反応物を40μｌまで希釈し、cDNA １μｌ（インプットされたＲＮＡ2.5ngに等しい）でＰＣＲを行った。 10mM Tris-HCl(pH8.3)、50ｍＭ HCl、1.5ｍＭ MgCl₂、0.2ｍＭ dCTP、0.2ｍＭ dGTP、0.2ｍＭ dTTP、プライマー各々100ng、および2Ｕ Tac ＤＮＡポリメラーゼの存在下、総量50μｌの逆転写混液から1μｌをとって増幅を行った。ＲＨＡＭＭに使用したプライマーは、前進プライマ−5'-GCAAACACTGGATGAGCTTGA-3'と復帰プライマー5'-TGGTCTGCTGATCTAGAAGCA-3'であった。PCR回路（PCR cycling ）パラメーターは、94℃で４分間の変性、94℃で45秒間の変性、60℃で45秒間のアニーリングおよび72℃ で２分間の伸長（exctension）であった。45サイクルを使い、最終伸長時間は８分間であった。PCR産物は、エチジウムブロミド（200ng／ml）を添加した1％アガローズゲルで分析した。416bpバンド、時として266bpバンドがもう一つ観察されたこともあった。これらのバンドを切り離して配列決定を行った。前進プライマー5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3'と復帰プライマー5'- CGTCTACACCTAGTCGTTCGTCCTCATACTGC-3'を用いてＲＨＡＭＭ遺伝子の発現とヒト・アクチンのそれと比較することにより、相対量の発現ＲＨＡＭＭ遺伝情報の半定量分析を行った。これにより838bpフラグメントを得た(Clontech)。ＤＮＡ配列決定メーカーの指示に従ってPrep-A-Gene DNA purification system(Bio-Rad)を用い、エチジウムブロミドで染色してアガローズゲルからＤＮＡを切り取って、ＰＣＲ^TMＴＡベクター(Invitrogen,San Diego,CA)中にクローニングした。これを、T7 Sequencing TM kit(Pharmacia Bioteck,Uppsala,Sweden)を用いるジデオキシ速鎖反応停止法により配列決定した。416bp挿入物はＲＨＡＭＭ4イソフォームの一部に一致し、266bp挿入物はエキソン13を除いたＲＨＡＭＭ4と一致している。統計方法細胞移動とコラーゲンゲル侵襲データに対するRHAMM抗体の効果比較にはstude nt'st-testを用いた。免疫細胞化学の観察結果（scoring measures）各々についてはKaplan-Meier生存曲線にプロットした(Abacus,1994)。観察結果を二分法（c ut-point以下ならば0、以上ならば1）で分類するcut-pointに起因する生存曲線間の差異は、logrank(Mante1-Cox)test(Lee,1995)によって吟味した。生存予想に複数の要因が有る場合には、Cox比例危険モデルを用いてその意味を決定した。統計分析はSurvival Tools for Starview^TMを用いて行った(Abacus)。ＲＨＡＭＭ mRNA発現の差異はＧＲＡＰＨＰＡＤ Prism^TMを使って試験した。ヒト乳癌におけるＲＨＡＭＭの発現ほとんどの細胞が負（−）である結果から、ほとんどの細胞が非常に高い正（ 4＋）である結果に跨る成績を示し(表4、図3)、ヒト乳癌サンプル400個の群では、ＲＨＡＭＭタンパク質の全般的な発現は非常に変動が大きかった。この一次腫瘍中で広く広がっている染色を一般染色と定義する(矢印先端、図3Ａ〜Ｃ；図3 Ｂ〜Ｅとの差異の大きさを参照されたい)。ある腫瘍では、ＲＨＡＭＭは一次腫瘍の小病巣または複数の細胞各々で発現過多であった。これらの細胞では、ＲＨＡＭＭは細胞質と核の両方で強く発現していた。この細胞染色を最大染色と定義する。一般的なパラメーターとして、ＲＨＡＭＭは腫瘍細胞内（図3Ａ〜Ｄ）でも、また例は少ないが、細胞外の環境、即ち腫瘍を囲むストローマでも観察されていて、ネズミの細胞において細胞内と可溶の形態が存在することを報告した前報と一致する。細胞内ＲＨＡＭＭは細胞質にも存在するし、或る場合には、核にも存在すると思われる(図3Ｄ)。腫瘍400個のうち、80％が表４に見られるようにストローマ染色と核染色に対して反応性を持たない(即ち、観察０)。一般腫瘍染色が高濃度であることと、病巣や遊離細胞の最大染色が効能であることとが相関関係にあることに注目するのは興味深い(r＝0.83)。この相関関係は有意である(Ｐ＜ 0.001)。これはＲＨＡＭＭ発現を高濃度で示す細胞の小さい群の出現（図3C）と、ＲＨＡＭＭ染色が増加することとは関連する事象であることを示している(即ち、図３Ａと図３Ｂを比較されたい)。ヒト乳癌において、小細胞群でのＲＨＡＭＭの発現過多は予後に重要である乳癌組織切片の一度量分析の結果、結節の状態（p＜0.001＞および腫瘍のサイズ（p＝0.03）が第一患者群の転移がないことど全般的生存を予測する上（表５）で統計的に有意であることを見出した。この患者群では、どのタイプのＲＨＡＭＭ染色も「標準」予後要因（腫瘍のサイズ、グレード、エストロゲン・レセプターの状態、リンパ結節の状態）（表５）とは相関関係がなかった。しかしながら、単細胞または小細胞群におけるＲＨＡＭＭの発現過多（最大染色）は、予後不良を示す予後要因であった（p＝0.02）(表４)。乳癌における、最大染色（Max）と一般染色（Gen）の二つと標準予後要因との関係を評価するため、Cox比例危険モデル（Abacus,1994;Lee,1995）を用いて、初めに表Ｂのすべての要因を採用し、一時に要因一つづつ捨ててゆき、最後にp ＜0.05の要因が一個だけ残るようにして、リンパ結節を持つ患者と持たない患者を分析した。このモデルは、正のリンパ結節の数、腫瘍のサイズ(３グループに分類、≦2、２−５および＞５cm)、ならびにＲＨＡＭＭの一般と最大染色と合併した数値をふくむものであった。最大ＲＨＡＭＭ染色は負の係数であるため、両者を合併して新しい要因とし、最大一般(Max−Gen)と名付けた。リンパ結節のデータをモデルから除いた後で、Max−Genパラメーターによって生存曲線をp＝0.0 08の有意性を持つ患者全体の生存と(図５)、p＝0.016の有意性を持つ転移がない患者群の生存（図６）の２群に分けることができた。これらの結果は表６に要約している。この表におけるMax−Gen染色の確率は、いずれの群においても、Max −Gen染色の差異が≦１単位で有る場合、再発の可能性はこの差異が＜１単位である場合の1.4倍であることを示している。同様に、図５と６に示すように、差異が≧１の場合の死亡の可能性は、＜１の場合の1.59倍であるヒト乳癌の予後インジケーターとしての、ＲＨＡＭＭメッセンジャーＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析保存用パラフィン包埋サンプルを用いて行ったＲＨＡＭＭタンパク質発現の免疫細胞化学分析の結果、ＲＨＡＭＭ発現過多は生存と関係があるばかりでなく、これまでに確立されているリンパ結節などの予後パラメーターとも有意であるが複雑な関係があることが分かった。この関係をさらに検討するため、新鮮な凍結組織が入手できる98名の患者からなる別の群から組織を得、組織切片からmRNAを抽出した。このmRNAを用いてＲＨＡＭＭ発現をより感度が高い逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。対象患者は特にグレードとＥＲ／ＰＲ状態が一定の範囲になるように選定した。 mRNAはヒト乳癌サンプルで検出されたが、これはネズミＲＨＡＭＭ4のヒト同族体と一致する。常習的なＲＨＡＭＭ発現分析では、エキソン11とエキソン14由来のプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ産物（416bpのcDNA挿入物として表される、方法を参照されたい）がすべての腫瘍から得ることができた(27、31)。エキソン13が欠失している第二のイソフォーム（266bpのcDNA挿入物として表される）が腫瘍の２９％に存在した。これらの結果は、ヒト腫瘍においては、ＲＨＡＭＭは複数のイソフォームとして存在していることを示している。（エキソン13を欠失しているＲＨＡＭＭ4）イソフォームから翻訳されたタンパク質は、免疫細胞化学分析に用いられた抗体によっては認識されないと考えられる。これは、認識がエキソン13にコードされているエキソン13のエピトープに向けられるからである。ＲＨＡＭＭ4、ＲＨＡＭＭ4（−9）イソフォームまたは両イソフォームの組み合せによる高い発現は、腫瘍のより高いグレードと有意の関係があることが証明された（p=0.0466、p=0.0163、p=0.0357）(表７)。予後不良を示す合併パラメーターをもつ小患者群（低いグレード／ＥＲ＋ve／node−ve、n＝15）をさらに分析したところ、予後不良を示すＲＨＡＭＭ発現（p=0.0063、p=0.0085、p=0.02 13）(表８)と同様の有意の関係があることが証明された。実施例３本発明者らはヒトＲＨＡＭＭ5 cDNAを用いて、ヒトpWE15コスミドライブラリー（Clontech）のスクリーニングを行った。クローンにより制限地図を作成し、ヒトＲＨＡＭＭ5 cDNAの制限地図と重ねたところ、一致することが認められた。エキソンの配列決定し、エキソン／イントロンの境界を観察した(表１)。本発明は本明細書で説明した実施態様の特徴に限定されないし、また変法および変更はすべて請求の範囲に含めるものとする。１ ≧対結節なしの確率２ Max−Gen染色≧対≦１の確率３見出された腫瘍サイズ対２cm以下の腫瘍サイズの確率 ^*マンホイットニーテスト ^* 予後不良のパラメーター：グレードが高い／ER−ve／ノード＋ve 予後良のパラメーター：グレードが低い／ER＋ve／ノード−ve^** フッシャー厳密的テスト

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ターリー，エヴァ・エイカナダ国、エム５ジー１エックス８オンタリオ、トロント、ユニヴァーシティ・アヴェニュー 555、マクマスター・ビルディング、ルーム 3014、ザ・ホスピタル・フォー・シック・チルドレン (72)発明者エントウィスル，ジョイスリンカナダ国、アール３ピー２エイチ１マニトバ、ウィニペグ、リンデン・ウッド・ドライヴ・イースト 380

Claims

【特許請求の範囲】 1. ヒトＲＨＡＭＭ１，ヒトＲＨＡＭＭ２，ヒトＲＨＡＭＭ３，ヒトＲＨＡＭＭ４およびヒトＲＨＡＭＭ５からなる群から選ばれるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。 2. 配列番号４のアミノ酸配列をコードする請求項１に記載の単離された核酸。 3. 該ヌクレオチド配列が（イ）ヒトＲＨＡＭＭのゲノム配列と、（ロ）配列番号３のヌクレオチド配列とからなる群から選ばれる請求項２に記載の単離された核酸。 4.（イ）連続した配列として配列番号９〜25のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と、（ロ）連続した配列として配列番号９、１0、11および13のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と、（ハ）連続した配列として配列番号９、１0および12〜25のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列とからなる群から選ばれる請求項１に記載の単離された核酸。 5.（イ）配列番号３からの少なくとも10個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と、（ロ）配列番号３からの少なくとも１５個の速続したヌクレオチドのヌクレオチド配列と、（ロ）配列番号３からの少なくとも２０個の速続したヌクレオチドのヌクレオチド配列とからなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。 6. ＨＡ結合親和性を保持している、ヒトＲＨＡＭＭタンパク質の結合ドメイン少なくとも１個をコードするヌクレオチドまたはそのフラグメントまたは類似体を含んでなる単離された核酸。 7．配列番号１または配列番号７のアミノ酸配列をコードする請求項６に記載の単離された核酸。 8.配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号15 、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21 、配列番号22、配列番号23、配列番号24、および配列番号25からなる群から選ばれるヌクレオチド配列からなる単離された核酸。 9. ヌクレオチド配列が配列番号16である請求項８に記載の単離核酸。 10．配列番号50のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。 11．配列番号26〜49からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸 12．請求項１〜11のいずれかに記載の単離された核酸からなる組み替え発現ベクター。 13．請求項12に記載の組み替え発現ベクターによってトランスフォーメーションされた宿主細胞。 14．動物またはその祖先のゲノムに、（イ）ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子のエキソン少なくとも１個のヌクレオチド配列の挿入と、（ロ）ヒトＲＨＡＭＭタンパク質を少なくとも１個コードするヌクレオチド配列の挿入と、（ハ）内因性ＲＨＡＭＭ遺伝子の失活とからなる群から選ばれる変更を引き起こす組み替え構成体少なくとも１個が挿入されることによって変更されている遺伝子導入動物。 15．ヒトＨＲＡＭＭ１，ヒトＨＲＡＭＭ２，ヒトＨＲＡＭＭ３，ヒトＨＲＡＭＭ４およびヒトＨＲＡＭＭ５からなる群から選ばれる実質的に純粋なタンパク質。 16．ヒアルロナンに結合することができる配列番号４のアミノ酸配列またはそのフラグメントまたは類似体を含んでなる請求項15に記載のタンパク質。 17.（イ）配列番号４のアミノ酸配列からの少なくとも５個の連続したアミノ酸残基と、（ロ）配列番号４のアミノ酸配列からの少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基と、（ハ）配列番号４のアミノ酸配列からの少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基とからなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなる実質的に純枠なペプチド。 18．ヒトＲＨＡＭＭの結合ドメイン少なくとも１個からなる実質的に純粋なペプチド。 19．配列番号１および配列番号17からなる群から選ばれる請求項１８に記載のペプチド。 20．配列番号50のアミノ酸配列を持つ実質的に純粋なペプチド。 21．ヒトＲＨＡＭＭタンパク質の抗原決定基に選択的に結合する抗体。 22．請求項20のペプチドの抗原決定基に選択的に結合する抗体。 23．請求項21または22に記載の抗体を産生する細胞系。 24．ヒトＲＨＡＭＭタンパク質少なくとも１個からなる調製物を用意するステップと、該調製物を候補化合物と接触させるステップと、ＲＨＡＭＭタンパク質が候補化合物と結合しているのを検出するステップとを含んでなるヒトＲＨＡＭＭタンパク質と選択的に結合する化合物の同定方法。 25．ＲＨＡＭＭタンパク質の結合をアフィニテイクロマトグラフィ、イースト２ハイブリッド系およびファージ・ディスプレー・ライブラリからなる群から選ばれる方法によって検出する請求項24に記載の方法。 26．哺乳動物の腫瘍サンプルを採取し、腫瘍サンプル中のＲＨＡＭＭタンパク質発現濃度を測定し、ＲＨＡＭＭタンパク質発現濃度が高い場合を予後不良と判定する、腫瘍を持つ哺乳動物の予後評価方法。 27．組織化学方法、生検サンプル中のＲＨＡＭＭｍＲＮＡ濃度測定を含んでなる方法、生検サンプル中のヒトＲＨＡＭＭエキソン８の発現測定を含んでなる方法からなる群から選ばれる方法によってＲＨＡＭＭ発現を測定する請求項26に記載の方法。 28．哺乳動物がヒトであり、、腫瘍が乳房腫瘍である請求項２６または２７に記載の方法。 29．ＲＨＡＭＭ遺伝子の発現過多を特徴とするヒトの疾患を予防または治療する医薬組成物において、（イ）ＲＨＡＭＭ遺伝子に対する優勢なサプレッサー変異体と、（ロ）ヒトＲＨＡＭＭ cDNAに対するアンチセンス配列と、（ハ）薬学的に許容できる担体に担持されている、ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子のエキソン８に対するアンチセンス配列とからなる群から選ばれるヌクレオチド配列の有効量を含んでなる医薬組成物。 30．ＲＨＡＭＭ遺伝子の発現過多を特徴とするヒトの傷害を予防または治療する方法において、（イ）ＲＨＡＭＭ遺伝子に対する優勢なサプレッサー変異体と、（ロ）ヒトＲＨＡＭＭ cDNAに対するアンチセンス配列と、（ハ）ヒトＲＨＡＭＭ遺伝子のエキソン８に対するアンチセンス配列とからなる群から選ばれるヌクレオチド配列の有効量を哺乳動物に投与することからなる方法。 31．該疾患が癌である請求項30に記載の方法。 32．ヒトにおける細胞移動を抑制する方法であって、（イ）ヒトＲＨＡＭＭタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体と、（ロ）ヒトＲＨＡＭＭのＨＡ結合ドメインを含んでなるペプチドとからなる群から選ばれる薬剤をヒトに投与することからなる方法。