JP2000512486A

JP2000512486A - Ｏｂレセプターイソ型及びそれらをコードする核酸

Info

Publication number: JP2000512486A
Application number: JP09540094A
Authority: JP
Inventors: カスキー，シー・トーマス; ヘス，ジヨン・ダブリユ; ヘイ，パトリシア; フイリツプス，マイケル・エス
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1996-05-06
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 2000-09-26
Also published as: WO1997042340A1; EP0900282A1; EP0900282A4; CA2253832A1

Abstract

(57)【要約】ｏｂレセプターはオールターナティブスプライシングから起る多数のイソ型を有する。ｃ’、ｆ及びｇと命名した３種の新規なイソ型を開示する。これらのイソ型をコードする核酸を教示する。レセプターをコードする核酸を含むベクター、これらの遺伝子で形質転換された宿主細胞、及び遺伝子又はタンパク質のイソ型を用いるアッセイも本発明の一部である。

Description

【発明の詳細な説明】ＯＢレセプターイソ型及びそれらをコードする核酸発明の分野本発明は、ｏｂレセプタータンパク質イソ型、それらをコードするＤＮＡ配列とＲＮＡ配列、及びレセプターイソ型タンパク質を用いるアッセイに関する。発明の背景最近、齧歯類における肥満の発症に関与する幾つかの遺伝子の変異が同定された。特に興味深いのはペプチドホルモン、レプチンで発見された変異であるが、レプチンは体重を調整する新規な信号伝達経路の一成分である（Zhangら,1994,N ature372:425-432；Chenら，1996,Cell 84:491-495）。レプチンは始めはマウスにおける肥満遺伝子ｏｂのポジショナルクローニングによって発見された。２種の異なるｏｂ対立遺伝子が同定された。一つの変異はレプチンペプチドの未成熟終結を引起し、短縮タンパク質が得られ、他の変異は肥満（ｏｂ）遺伝子の転写活性を変化させ、循環するレプチンの量が減少する。生物活性レプチンのレベルの減少とｏｂ／ｏｂマウスで観察される歴然とした肥満表現型の間には関連がある。組換えレプチンはｏｂ／ｏｂマウスで体重減少を誘導するが、糖尿病表現型ｄｂ／ｄｂマウスではそうではないことが示された(Campfieldら,1995，Science 269:546-549；Halaasら,1995，S cience 269:543-546;Pellymounterら,1995,Science 269:540-543；Rentschら,19 95,Biochem.Biophys.Res.Comm．214:131-136；Weigleら，1995,J.Clin.Invest． 96:2065-2070)。レプチン合成は脂肪細胞で行われるが、摂食を減らし、代謝速度を増加させる能力は中枢的に視床下部により媒介されるようである。組換えレプチンを第３脳室に注入すると、レプチンの末梢投与と同様の反応が引起される。更に、レプチンのヒトレセプター、ｏｂ−レセプター（ＯＢ−Ｒ）の最近のクローニングによると、それは視床下部で転写される(Tartagliaら，1995,Cell 83:1263-1271；St ephensら，1995,Nature 377:530-532)。更に、マウスＯＢ−Ｒの長型の未成熟終結が起る変異(これは視床下部で優先的に発現される)は、ｄｂ／ｄｂマウスの肥満表現型の原因であるらしい（Leeら，1996，Nature 379:632-635;Chuaら，1996 ,Science 271:994-996;Chenら，1996，Cell 84:491-495）。野生型（痩身）ラットと脂肪質（fatty）変異を有するラット（ｆａのヘテロ接合体とホモ接合体の両方）からのＯＢ−Ｒが単離され、配列決定された（特許出願第号及び第号，Attorney Docket No.19642PV及び 19642PV2，1996年２月22日及び1996年３月22日出願；両方とも引用により本明細書に含まれるものとする）。ＯＢ−Ｒの種々のイソ型も同定された。これらのイソ型はオールターナティブスプライシングのためである。例えば、マウスでは、ａ型は８８９のリシン後に５個のアミノ酸を有し、ｂ型は８８９のリシン後に２７３個のアミノ酸を有し、Ｃ型は８８９のリシン後に３個のアミノ酸を有し、ｄ型は８８９のリシン後に１１個のアミノ酸を有する。肥満のより良き理解のために種々のイソ型を用いて更に実験することができること；及び新規ｏｂレセプターイソ型をクローニングし産生して、肥満を理解し、その予防と治療に有用なリガンドを同定するアッセイで使用できること；は望ましい。発明の詳細な説明本発明は、実質的に付随する膜タンパク質を含まない、ｃ’、ｆ及びｇと命名した新規ｏｂレセプターイソ型に関する。本発明は、実質的に精製されたｏｂレセプターイソ型ｃ’、ｆ及びｇタンパク質にも関する。これらのイソ型は、ラット、マウス及びヒトを含む種々の種で存在する。本発明のもう一つの面は、ＯＢレセプターイソ型ｃ’、ｆ又はｇをコードする核酸である。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は種々の型のＲＮＡのいずれものような、タンパク質をコードできる任意の核酸でありうる。好ましくは、核酸はｃＤＮＡである。本発明は、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇ遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、及びＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇ遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入し、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇが産生されるような適切な条件下、該宿主細胞を培養する工程を特徴とする実質的に純粋なＯＢ−Ｒイソ型ｃ’ 、ｆ又はｇタンパク質の製造法も包含する。そのように産生されたＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇは、通常の方法で宿主細胞から取得することができる。本発明の更に別の面は、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇを用いるアッセイである。これらのアッセイにおいて、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇリガンドである可能性のある種々の分子をＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇと接触させ、それらの結合を検出する。このようにして、アゴニスト、アンタゴニスト、及びリガンド擬似物質を同定することができる。本発明の更なる面はそのように同定されるリガンドである。図面の簡単な説明図１は野生型ラットＯＢ−Ｒのアミノ酸配列である。図２は野生型ラットＯＢ−ＲのｃＤＮＡ配列である。図３はラットイソ型をコードするｃＤＮＡ配列である。図４はラットイソ型ｃ’に特異的なｃＤＮＡである。明細書と請求の範囲で用いる場合、以下の定義が適用される。 “結合した膜タンパク質を実質的に含まない”ということは、レセプタータンパク質は如何なる膜タンパク質とも物理的接触をしていないことを示す。 “実質的に精製されたＯＢ−Ｒレセプターイソ型ｃ’、ｆ又はｇ”は、タンパク質イソ型は最低９０％、好ましくは最低９５％純粋であることを意味する。 “野生型”は、遺伝子又はタンパク質が、その遺伝子又はタンパク質に関し変異を有しないと考えられる動物で見出されるものと実質的に同一であることを意味する。 “ｆａ”は、遺伝子又はタンパク質が、脂肪質変異に関しラット相同体で見出されるものと実質的に同一であることを意味する。核酸配列又はアミノ酸配列に言及する場合、“実質的に同一”とは、それが参照配列と同一であるか、又は正確に同一でないならば、その生物活性又は機能に影響しない変化を含むということを意味する。驚くべきことに、本発明により、ＯＢ−Ｒには、３種の新規イソ型ｃ’、ｆ又はｇを含む種々のイソ型があるということが知見された。これらのイソ型は全ての種に当てはまるか、便宜上本明細書と請求の範囲では、アミノ酸と核酸の番号付けには、ラット野生型配列（図１及び２）を参照として用いる。しかし、本発明は、ラット野生型タンパク質及び核酸に限定されないで、特にラット（野生型及び脂肪質）、マウス、及びヒトのＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇタンパク質及び核酸を包含することを理解すべきである。ＯＢ−Ｒイソ型ｆは、位置８８９のリシン後（図１のラット配列に関して）、６個のアミノ酸があり、位置８９５のアスパラギン残基で終るという点で野生型とは異なる。ｃＤＮＡにおいては、コドンらの次に終止コドンがくる。ラットイソ型ｆの一つのｃＤＮＡを図３に示す。本発明は特にイソ型ｆタンパク質をコードする全ての種々のｃＤＮＡを包含する。上付き番号はタンパク質の位置番号を指す。 Lys⁸⁸⁹Iso⁸⁹⁰Met⁸⁹¹Pro⁸⁹²Gly⁸⁹³Arg⁸⁹⁴Asn⁸⁹⁵ ヒトイソ型ｆでは、リシン８９１がラットのリシン８８９に対応し、同じ６個のアミノ酸がリシン８８９に続く。本発明の特に好適な実施の形態では、ＯＢ−Ｒイソ型ｆはラット起源である。ＯＢ−Ｒイソ型ｇは、野生型配列よりかなり短いという点で野生型とは異なる。以下の１８個のアミノ酸がタンパク質の始まりにみいだされている。上付き番号はそれらの位置を示す。位置１８のアルギニンは位置１６６のプロリンで始まる野生型分子の大フラグメントにスプライスされている（マウスとヒトの両方）。次いで、このイソ型は野生型分子の残りに及ぶ。 Met¹Phe²Gln³Thr⁴Pro⁵Arg⁶Ile⁷Val⁸Pro⁹Gly¹⁰His¹¹Lys¹²Asp¹³Leu¹⁴Ile¹⁵Se r¹⁶Lys¹⁷Arg¹⁸Pro¹⁶⁶… Ｐｒｏ¹⁶⁶後、タンパク質の残りは野生型と同じでありうるし、又はイソ型ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ又はｆのような別のイソ型変異も含みうる。特に好適な実施の形態はラットイソ型ｇである。ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’はＯＢ−Ｒイソ型Ｃと類似しているが、ＯＢ−Ｒイソ型ｃは以前に報告された（Leeら，Nature 379:632-635）。位置８８９のリシン後、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’は、３個のアミノ酸、Val⁸⁹⁰Thr⁸⁹¹Phe⁸⁹²終止のみを含む。見て分るように、イソ型ｃ’は、最終アミノ酸がイソ型ｃで見出されるバリンよりもむしろフェニルアラニンであるという点で異なる。更に、イソ型ｃ’をコードするＤＮＡには非翻訳配列があり、それはイソ型ｃには存在しないようである。ラットイソ型ｃ’をコードするｃＤＮＡを図４に示す。ヒトでは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅがリシン８９１の後に続く。本発明の一つの面は、ＯＢ−Ｒのこれらの種々のイソ型の分子クローニングである。野生型とｆａレセプタータンパク質は、１個の細胞外ドメインと１個の膜貫通ドメインを含む。ラットにおいて、細胞外ドメインはアミノ酸１〜８３０に及ぶ。膜貫通ドメインは８３９〜８６０である。細胞質ドメインはアミノ酸８６０〜１１６２である。同様のドメインがマウスとヒトタンパク質で同定された。本発明は、１個以上のドメインを欠くイソ型ｃ’、ｆ及びｇも包含する。このような欠失タンパク質は、リガンド同定とそれらの結合活性のアッセイに有用である。ラット野生型タンパク質では、アミノ酸１〜２８はシグナル配列を形成する。即ち、成熟タンパク質はアミノ酸２８〜１１６２に及ぶ。成熟タンパク質イソ型は本発明の更に別の面を形成する。これは、マウスとヒトＯＢ−Ｒで報告された１〜２２のシグナル配列とはやや異なる。成熟マウス、ヒトイソ型は、本発明の更に別の面を形成する。ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇ遺伝子は、公知のベクターを用いて実際にいずれの宿主細胞にも導入できる。好適な宿主細胞には、大腸菌（E.coli）並びに哺乳動物細胞系及び酵母細胞系が含まれる。当業者ならば、所定の宿主細胞に適切な公知のベクターを選択できる。一般的にはプラスミド又はウイルスベクターが好ましい。ＯＢ−Ｒイソ型c’、ｆ又はｇ遺伝子はその天然形態で、ベクターに存在しうるし、又は異種プロモーター、所望ならば１個以上のエンハンサー、もしくは転写か翻訳を制御することが知られている他の配列の制御下にありうる。ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇ遺伝子を含む宿主細胞を培養し、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇ遺伝子を発現させる。適切な時間後、ＯＢ−Ｒｃ’、ｆ又はｇイソ型タンパク質を、通常の分離技術を用いて細胞から取得できる。本発明の更なる面は、アッセイでＯＢ−Ｒｃ’、ｆ又はｇを用いて、ＯＢ−Ｒｃ’、ｆ又はｇイソ型リガンドを同定することである。リガンドはＯＢ−Ｒイソ型レセプターへ結合し、インビボでレセプターの活性化を起こすかもしれないし、起こさないかもしれない。リガンドは、レセプターのアゴニスト（即ち、その活性を刺激する）、アンタゴニスト（その活性を阻害する）でありうるし、又はリガンドは、結合するがレセプター活性に殆どもしくは全く効果を及ぼさないかもしれない。リガンドのアッセイでは、本発明のＯＢ−Ｒイソ型を、リガンドの可能性のあるものに曝し、結合量を測定する。結合量は多数の方法で測定できる。例えば、研究するリガンド又はＯＢ−Ｒイソ型を通常の標識（例えば放射活性標識又は蛍光標識）で標識し、次いで結合条件下、ＯＢ−Ｒイソ型と接触させうる。適切な時間後、非結合リガンドをＯＢ−Ｒイソ型から分離し、結合したリガンド量を測定できる。これは、本発明のＯＢ −Ｒイソ型のいずれでも行うことができる。あるいは、種々のイソ型の結合量を比較できる。競合アッセイでは、リガンドの可能性のあるものと公知のリガンドの両方が存在し、リガンドの可能性のあるものの結合量を公知のリガンドとの結合量と比較する。あるいは、前もって結合した公知のリガンドを置換するリガンドの可能性のあるものの能力（又は逆）を測定できる。更に別の実施の形態では、アッセイは、ＯＢ−Ｒイソ型が表面に結合し、リガンドの可能性のあるものと接触させうることを特徴とする不均一アッセイでありうる。結合の検出は、標識、抗体及び発色団との反応を含む種々の方法でありうる。別のアッセイで、本発明のＯＢ−Ｒイソ型は“トランス”活性化アッセイで使用できる。このようなアッセイは、米国出願第号（Attorney Docket No.19686PV，1996年４月22日出願；引用により本明細書に含まれるものとする）に記載されている。このアッセイでは、本発明のＯＢ−Ｒイソ型を発現する細胞（天然又は組換え法による）を、最小プロモーター、レプチン活性化要素及びレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築体でトランスフェクトする。レポーター遺伝子の転写は、レプチン活性化要素の活性化に依存する。リガンドのレセプターイソ型への結合はレプチン活性化要素を活性化し、次いでそのことにより、レポーター遺伝子の転写が起る。本発明をより良く説明するために、以下の非限定実施例を記載する。実施例１ラット組織からのｍＲＮＡとｃＤＮＡの調製痩身及びｆａ／ｆａ Zuckerラットから組織を集め、液体窒素中で急速凍結した。集めた組織は、視床下部、下垂体、肺、肝臓、腎臓、心臓、副腎腺、平滑筋、骨格筋、及び脂肪組織を含んでいた。イソチオシアン酸グアニジニウムの存在下、Brinkmann Polytronホモジナイザーで、組織をホモジナイズした。メッセンジャーＲＮＡ単離キット（Stratagene，La Jolla,CA）に備えられた指示に従い、ｍＲＮＡを視床下部、肺及び腎臓から調製した。SuperScript^TMチョイスシステム（Gibco/BRL，Gaithersburg,MD）を用い、ｍＲＮＡ約２μｇからｃＤＮＡを調製した。反応当りオリゴ（ｄＴ）_12-18プライマー１μｇとランダムヘキサマー２５ｎｇを用い、第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始させた。第２鎖ｃＤＮＡ合成を製造業者の指示に従い行った。[α−³²Ｐ]ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）約１μＣｉによる第２鎖反応のアリコート（１／１０）の標識によってｃＤＮＡ量を評価した。標識産物をアガロースゲルで分離し、オートラジオグラフィーで検出した。実施例２視床下部ｃＤＮＡライブラリーの調製実施例１に記載したように調製したｃＤＮＡ約３μｇに、リン酸化ＢｓｔｘＩアダプター（Invitrogen，San Diego，CA）約３．６μｇを連結した。次いで連結混合液を希釈し、ｃＤＮＡサイジングカラム（Gibco/BRL Gaithersburg，MD）でサイズ分画した。カラムからの液滴を集め、カラムからの溶出容積を測定した。各分画からのアリコートをアガロースゲルで分析した。１ｋｂ以上のｃＤＮＡを含む分画をプールし、沈殿させた。ＢｓｔｘＩアダプターを有するサイズ分画ｃＤＮＡを、原核細胞ベクターｐｃＤＮＡＩＩ（Invitrogen，San Diego，CA）に連結した。最初に制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＸＩで切断し、線状化ベクターをゲル精製し、次いで製造業者の指示に従いコウシ陽ホスファターゼ（Gibco/ BRL，Gaithersburg,MD）で末端を脱リン酸化することによってベクター（４μｇ）を連結のために調製した。連結体はｃＤＮＡを約１０〜２０ｎｇとベクター約１００ｎｇを含んでいたが、それを１４℃で一晩インキュベートした。連結体で、製造業者の指示に従いＸＬ−２ブルーウルトラコンピテント細胞（St ratagene，La Jolla，CA）１ｍＬを形質転換した。形質転換細胞を１３３ｍｍコロニー／プラークスクリーンフィルター（Dupont/NEN,Boston,MA）上に広げ、１００μｇ／ｍＬアンピシリン（Sigma，St.Louis,MO）を含むルリアブロス寒天プレート上にプレート当り３０，０００〜６０，０００コロニーの密度で播いた。実施例３視床下部ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングフィルター上のコロニーを第２のフィルターセットにレプリカプレートした。陽性ハイブリダイゼーションシグナルを与えるコロニーを含む領域を次に単離するために、マスターフィルターを４℃で保存した。コロニーが肉眼で見えるまで、レプリカフィルターを３７℃で数時間増殖させ、次いで確立された方法(Mania tisら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborator y Publications,Cold Spring Harbor,NY；引用により本明細書に含まれるものとする)により、コロニーのインサイチューハイブリダイゼーションのために処理した。ストラタリンカー（Stratagene，La Jolla，CA）を用い、ＤＮＡをフィルターに架橋した。フィルターを２×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳ中５５℃で２時間洗浄し、細菌残渣を除去した。次いで、８〜１０枚のフィルターを、５０％ホルムアミド含有１×ハイブリダイゼーション溶液(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)１５〜２０ｍＬを含む熱密閉性バッグ(Kapak,Minneapolis,MN)に入れ、４２℃で１時間インキュベートした。５０％ホルムアミド含有１×ハイブリダイゼーション緩衝液（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）中で、下記の放射標識プローブ１，０００，０００ｃｐｍ／ｍＬ超を用い、４２℃でフィルターを１晩ハイブリダイズさせた。Ｏｂ−Ｒの細胞外部分をコードする２．２ｋｂフラグメントであるプローブを、レディープライム（Amersham，Arlington Heights，IL）を用い、［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Amersham，Arlington Heights,IL）によるランダムプライミングで標識した。プロベクアントＧ−５０スピンカラム（Ph armacia Biotech,Piscataway,NJ）を用いて、取込まれなかったヌクレオチドからプローブを精製した。フィルターを、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い２度、６０℃で３０分間洗浄し、オートラジオグラフィーを行った。ハイブリダイゼーション陽性コロニーを含む個々の領域を、ハイブリダイズさせたフィルターのオートラジオグラムで並べた。それらをマスターフィルターから切出し、０．５ｍＬのルリアブロス＋２０％グリセロール中に入れた。陽性の各コロニーを、密度が１００×１５ｍｍのプレート当り約５０〜２００コロニーで再プレートし、上記のようにハイブリダイズさせた。個々の陽性コロニーを拾い、ウィザードキット（Promega，Madison,WI）を用い、一晩培養液からプラスミドＤＮＡを調製した。実施例４痩身ラットＯＢ−レセプターｃＤＮＡのＰＣＲを用いる増幅視床下部ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブを得るために、マウス及びヒトＯＢ−レセプターアミノ酸配列に基づく縮重プライマーを用いるＰＣＲによって、ラットＯＢレセプターを最初に得た。一セットのオリゴヌクレオチドプライマーを、低コドン縮重度の領域に対し設計した。マウスアミノ酸配列ＨＷＥＦＬＹＶとＥＣＷＭＫＧに対応する正方向プライマーＲＯＢＲ２（５’−ＣＡＹＴＧＧＧＡＲＴＴＹＣＴＩＴＡＹＧＴ−３’）とＲＯＢＲ３（５’− ＧＡＲＴＧＹＴＧＧＡＴＧＡＡＹＧＧ−３’）、及びマウスアミノ酸ＧＹＴＭＷＩ、ＶＹＷＳＮＷＳ、ＷＰＭＳＫＶ、ＤＤＧＭＫＷを表す逆方向プライマーＲＯＢＲ６（５’−ＡＴＣＣＡＣＡＴＩＧＴＲＴＡＩＣＣ−３ ’）、ＲＯＢＲ７(５’−ＣＴＣＣＡＲＴＴＲＣＴＣＣＡＲＴＡＩＣＣ−３’)、ＲＯＢＲ８（５’−ＡＣＹＴＴＲＣＴＣＡＴＩＧＧＣＣＡ−３’）、ＲＯＢＲ９（５’−ＣＣＡＹＴＴＣＡＴＩＣＣＲＴＣＲＴＣ−３’）のペア形成により、良好な収率で適切な大きさの産物を得た。問題のフラグメントを、Barnesの方法（1994，Proc.Natl.Acad.Sci．91:2216-2220 ；引用により本明細書に含まれるものとする）を改変して、ロングポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物として増幅させた。必要な長ＰＣＲフラグメントを得るために、Ｔａｑエクステンダー（Stratagene，La Jolla，CA）とエクスパンドロングテンプレートＰＣＲシステム（Boehringer Mannheim，Indianapolis,IN）を組合せて用いた。最終容量２０μＬの標準ＰＣＲ反応混合液は、鋳型（痩身ラットｃＤＮＡ）５ｎｇ、プライマー１００ｎｇ、ｄＮＴＰ５００μＭ、エクスパンドキットからの１×緩衝液３、ＴａｑポリメラーゼとＴａｑエクスパンダー各０．１ μＬを含んでいた。反応物質を薄壁チューブに集めた。増幅プロトコルはパーキン−エルマー（Norwalk,CT）９６００サーマルサイクラーを用いて、９２℃３０秒が１サイクル、次いで、９２℃３０秒、４５℃１分、６８℃３分の３２サイクルであった。この戦略により、一連のＰＣＲ産物を得たが、最大のものは、プライマーＲＯＢＲ２とＲＯＢＲ９から増幅した約２．２Ｋ塩基対のものであった。これらの産物を、下記のようにＤＮＡ配列解析のためにサブクローニングした。挿入体を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩでクローニングベクターから切出し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動によってベクターから分離した。製造業者の指示に従い、プレップ−Ａ−ジーンキット（BioRad，Richmond CA）を用いて、ゲルからフラグメントを溶出し、上記のように放射標識した。実施例５ＰＣＲ産物のサブクローニングアガロースゲル上での分離、バンドの切出し、プレップ−Ａ−ジーン（BioRad ，Richmond，CA）を用いるＤＮＡの抽出によって、適切なサイズのＰＣＲ産物を、サブクローニングのために調製した。製造業者による指示に従い、ＰＣＲ産物をpCR^TMII（Invitrogen，S an Diego，CA）に連結させた。連結体でＩＮＶａＦ’細胞を形質転換し、１００ μｇ／ｍＬアンピシリンとＸ−Ｇａｌ（５０ｍｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌ（Promega ，Madison，WI）を３２μＬ）を含むルリア−ベルタニプレートに培養した。白色コロニーを拾い、ルリア−ベルタニブロス＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン中で一晩増殖させた。ウィザードミニプレッブキット（Promega，Madison，WI）を用い、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル上で制限エンドヌクレアーゼ消化産物を分離して、挿入体を解析した。ウィザードミニプレッププラスミドＤＮＡのエタノール沈殿、及び水に再懸濁して最終ＤＮＡ濃度を１００μｇ／ｍＬにすることによって、プラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列決定のために調製した。AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ，ＦＳによるＡＢＩＰＲＩＳＭ^TMダイターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応キットを用いて、ＤＮＡ配列解析を行った。Ｍ１３正方向と逆方向プライマーによって、最初のＤＮＡ配列解析を行い、次いでラットＯＢ−Ｒ配列に基づくプライマーを用いた。パーキン−エルマー９６００中での増幅後、伸長産物を精製し、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７自動配列決定器（Perkin Elmer,Norwalk,CT）で解析した。ＤＮＡ配列データをSequencherプログラムで解析した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ヘス，ジヨン・ダブリユアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ヘイ，パトリシアアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者フイリツプス，マイケル・エスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に付随するタンパク質を含まないＯｂ−レセプター（ＯＢ−Ｒ）イソ型ｃ’、ｆ又はｇ。２．実質的に純粋であることを特徴とする請求項１に記載のＯＢ−Ｒイソ型。３．ｃ’イソ型であることを特徴とする請求項１に記載のＯＢ−Ｒイソ型。４．ｆイソ型であることを特徴とする請求項１に記載のＯＢ−Ｒイソ型。５．ｇイソ型であることを特徴とする請求項１に記載のＯＢ−Ｒイソ型。６．ラット由来であることを特徴とする請求項１に記載のＯＢ−Ｒイソ型。７．野生型ラット由来であることを特徴とする請求項６に記載のＯＢ−Ｒイソ型。８．脂肪質ラット由来であることを特徴とする請求項６に記載のＯＢ−Ｒイソ型。９．ヒト由来であることを特徴とする請求項３に記載のＯＢ −Ｒイソ型。１０．ヒト由来であることを特徴とする請求項４に記載のＯＢ−Ｒイソ型。１１．ヒト由来であることを特徴とする請求項５に記載のＯＢ−Ｒイソ型。１２．マウス由来であることを特徴とする請求項３に記載のＯＢ−Ｒイソ型。１３．マウス由来であることを特徴とする請求項４に記載のＯＢ−Ｒイソ型。１４．マウス由来であることを特徴とする請求項５に記載のＯＢ−Ｒイソ型。１５．請求項１に記載のＯＢ−Ｒをコードする核酸。１６．ｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１５に記載の核酸。１７．請求項１に記載のＯＢ−Ｒをコードする核酸を含むベクター。１８．プラスミドであることを特徴とする請求項１７に記載のベクター。１９．請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。２０．大腸菌（E.coli）、哺乳動物細胞又は酵母細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の宿主細胞。２１．リガンドの可能性のあるものが、ＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇに結合するかどうかの測定アッセイであって、リガンドの可能性のあるものをＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇと接触させ、結合が起ったかどうかを測定することを特徴とする該アッセイ。２２．リガンドを標識することを特徴とする請求項１７に記載のアッセイ。２３．トランス活性化アッセイであることを特徴とするリガンドの可能性のあるものがＯＢ−Ｒイソ型ｃ’、ｆ又はｇに結合するかどうかの測定アッセイ。