JP2000512496A

JP2000512496A - ヒトｄｎアーゼｉ過反応性変異体

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Publication number: JP2000512496A
Application number: JP10501606A
Authority: JP
Inventors: エイラザルス，ロバート; クンパン，クラーク
Original assignee: ジェネンテックインコーポレーテッド
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2000-09-26
Anticipated expiration: 2017-06-09
Also published as: US20080293121A1; ES2301180T3; US20020173025A1; EP0910647A1; AU737618B2; JP3468778B2; CA2257133C; WO1997047751A1; DE69738581D1; US20050170365A1; ATE389724T1; DK0910647T3; PT910647E; US6391607B1; EP0910647B1; CA2257133A1; NZ333128A; DE69738581T2; AU3368497A; US7407785B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、増大したDNA加水分解活性を有するヒトDNアーゼＩのアミノ酸配列変異体に関する。本発明は、上記過反応性変異体をコードする核酸配列を提供し、それによって臨床上の使用のために十分な量でこれらの変異体を生産することが可能である。本発明はまた、ヒトDNアーゼＩ過反応性変異体の製薬学的組成物及びその治療上の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトDNアーゼＩ過反応性変異体発明の分野本発明は、ポリデオキシリボ核酸を加水分解できるホスホジエステラーゼである、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ（DNアーゼＩ）についての研究から得られた結果に関する。本発明は一般的に、増大したDNA加水分解活性を有するヒトDN アーゼＩの修飾（変異体）形態、及び組換えDNA法によるその調製、その有用性が臨床的に用いられ得る製薬学的組成物、及びこれらのDNアーゼＩ変異体とその組成物の使用方法に関する。発明の背景 DNアーゼＩは、ポリデオキシリボ核酸を加水分解できるホスホジエステラーゼである。DNアーゼＩは様々な種から様々な品質で生成されている。ウシDNアーゼＩは、生化学的に詳細に研究されている。例えば、Moore,The En zymes(Boyer,P.D.,編),pp.281-296,Academic press,New York(1981)参照。ウシD NアーゼＩの完全なアミノ酸配列は周知である(Liao,等,J.Biol.Chem.248:1489-1 495(1973);Oefner,等,J.Mol.Biol.192:605-632(1986);Lahm,等,J.Mol.Biol.221: 645-667(1991))、及びウシDNアーゼＩをコードするDNAはクローン化され発現されている(Worrall,等,J.Biol.Chem 265:21889-21895(1990))。ウシDNアーゼＩの構造はＸ線結晶解析により決定されている。Suck,等,EMBOJ.3:2423-2430(1984); Suck,等,Nature 321:620-625(1986);Oefner,等,J.Mol.Biol.192:605-632(1986); Weston,等,J.Mol.Biol.226:1237-1256(1992)。ヒトDNアーゼＩをコードするDNAは単離され配列決定されており、そのDNAは組換え細胞で発現されており、それにより商業的に有用な量でヒトDNアーゼＩの生産が可能である。Shak,等,Proc.Natl.Acad.Sci.87:9188-9192(1990)。 DNアーゼＩは数多くの周知の有用性を有し、治療上の目的で用いられている。その主要な治療上の使用は、肺炎及び嚢胞性線維症(CF)のような疾患において肺分泌物（粘液）の粘弾性を減少することであり、それにより気管の浄化を目的とすることである。例えば、Lourenco,等,Arch.Intern.Med.142:2299-2308(1982); Shak,等,Proc.Natl.Acad.Sci.87:9188-9192(1990);Hubbard,等,New Engl.J.Med. 326:812-815(1992);Fuchs,等,New Engl.J.Med.331:637-642(1994):Bryson,等,Dr ugs 48:894-906(1994)。粘液はまた、慢性気管支炎、喘息性気管支炎、気管支拡張症、気腫、急性及び慢性静脈洞炎、及びさらに一般的な風邪の罹患に寄与する。上記疾患を有するヒトの肺分泌物は複雑な物質であり、それは粘液糖タンパク質、ムコ多糖、プロテアーゼ、アクチン、及びDNAを含む。肺分泌物における物質のいくつかは、微生物（例えばPseudomonas,Pneumococcus,またはStaphylocac cus細菌の株）または他の刺激源（例えば、タバコの煙、花粉）の存在に応答して、肺組織に侵入する白血球（好中球）から放出される。上記細菌または刺激源との反応の過程において、白血球は分解しその内容物を放出し、それが肺分泌物の粘弾性に寄与する。肺分泌物の粘弾性を減少するDNアーゼＩの能力は、好中球によって放出される大量のDNAの酵素的分解物に起因している。Shak,等,Proc.Natl.Acad.Sci.87:918 8-9192(1990);Aitken,等,J.Am.Med.Assoc.267:1947-1951(1992)。本発明は、ヒトDNアーゼＩの酵素的活性を調べるための本発明者らによる研究に一部基づく。この研究は、様々なヒトDNアーゼＩ変異体のデザイン及び合成を含み、in vitroでDNAを加水分解するその能力を評価するためのこれらの変異体のアッセイを含む。本発明者らは、過反応性変異体と呼ばれるヒトDNアーゼＩ変異体のクラスを初めて同定し、該変異体は、天然のヒトDNアーゼＩと比較して、増大したDNA−加水分解活性を有し、塩化ナトリウムによる阻害に対してより感受性ではない。その増大したDNA−加水分解活性のために、過反応性変異体はまた増大した粘液溶解活性を有し、一般的にDNAを分解する（切断する）場合に天然のヒトDNアーゼＩよりも効果的である。それらは塩化ナトリウムによる阻害により感受性ではないため、過反応性変異体は、肺分泌物及び他の生物学的液体で生じるような生理学的塩水条件の下で、天然のヒトDNアーゼＩよりも効果的である。したがって、ヒトDNアーゼＩの変異体は、比較的大量のDNAを含む肺分泌物を有する患者を治療する場合に特に有用であるはずである。それ故、本発明の一つの目的は、天然のヒトDNアーゼＩよりも優れたDNA−加水分解活性を有するヒトDNアーゼＩ変異体を提供することである。本発明のもう一つの目的は、ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体をコードする核酸、上記核酸を含む組換えベクター、上記核酸またはベクターを用いてトランスフォームされた組換えホスト細胞、及び組換えDNA法によってヒトDNアーゼＩ変異体を生産する工程を提供することである。本発明は、in vivoまたはex vivoの遺伝子治療に対する上記核酸及びベクターの使用を含む。本発明はまた、適宜に製薬学的に許容しうる賦形剤と共に、ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体、同様に上記過反応性変異体に結合可能である実質的に精製された抗体を含む、製薬学的な組成物に向けられる。本発明はまた、過反応性変異体の使用方法に向けられる。それには、患者に対してヒトDNアーゼＩの過反応性変異体の治療上の有効量を投与することを含む、患者におけるDNA含有物質の粘弾性または粘着粘度を減少するための方法、及び患者におけるDNA含有免疫複合体の形成を妨げるための方法が含まれる。本発明は特に、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、肺炎、気管支拡張症、気腫、喘息、または全身性紅斑性狼瘡ような疾患を有する患者を治療する方法に向けられ、該方法には該患者にヒトDNアーゼＩの過反応性変異体の治療上の有効量を投与することが含まれる。本発明のこれら及び他の目的は、本明細書を全体として考慮して当業者に明白であろう。図面の簡単な説明図１はヒト成熟DNアーゼＩ（配列番号１）のアミノ酸配列を示す。数字は配列内のアミノ酸残基の連続的な位置を表す。図２−４は以下の変異体に対するデータを示す： Q9R（配列番号２）、E13K（配列番号３）、E13R（配列番号４）、T14K（配列番号５）、T14R（配列番号６）、H44K（配列番号７）、H44R（配列番号８）、N74K （配列番号９）、N74R（配列番号１０）、S75K（配列番号１１）、T205K（配列番号１２）、T205R（配列番号１３）、E13R:N74K（配列番号１４）、Q9R:E13R:N74 K（配列番号１５）、E13R:N74K:T205K（配列番号１６）、Q9R:E13R:N74K:T205K （配列番号１７）。図２は実施例３に記載されている、スーパーコイル状DNA切断アッセイ及び直線状DNA切断アッセイにおいて測定されたヒトDNアーゼＩの過反応性変異体の活性を示す。図３は実施例３に記載されている、DNAクロマチン増加アッセイにおいて測定されたヒトDNアーゼＩの過反応性変異体の活性を示す。図４は実施例３に記載されている、直線状DNA切断アッセイにおける塩化ナトリウムの様々な濃度の存在下で測定される、天然のヒトDNアーゼＩ及びヒトDNアーゼＩの過反応性変異体の活性％を示す。活性％値は、添加される塩化ナトリウムの不存在下で各DNアーゼＩ（天然のまたは変異体）の活性に相対的なものとして表される。詳細な説明ここで用いられる、「ヒトDNアーゼＩ」、「天然のヒトDNアーゼＩ」及び「野生型DNアーゼＩ」なる語は、図１に示されるヒト成熟DNアーゼＩのアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ヒトDNアーゼＩの「変異体」または「アミノ酸配列変異体」とは、天然のヒト DNアーゼＩのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。一般的に変異体は、天然のヒトDNアーゼＩと少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも98％の配列同一性を有するであろう。配列同一性％は、最大のホモロジーを提供するように配列を並べて、例えば、Fitch,等,Pro c.Natl.Acad.Sci.USA 80:1382-1386(1983)によって、Needleman,等,J.Mol.Biol. 48:443-453(1970)によって記載されたアルゴリズムのバージョンで測定される。「過反応性変異体」、「ヒトDNアーゼＩ過反応性変異体」及び「ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体」なる語は、天然のヒトDNアーゼＩと比較して増大したDNA 加水分解活性を有する天然のヒトDNアーゼＩの変異体をいう。「DNA加水分解活性」とは、5'-ホスホリル化オリゴヌクレオチド末端産物を産するように基質DNAを加水分解する場合の、天然のヒトDNアーゼＩまたはヒトDN アーゼＩの変異体の酵素的活性をいう。DNA加水分解活性は、分析的ポリアクリルアミド及びアガロースゲル電気泳動、クロマチン増加アッセイ(Kunitz,J.Gen. Physiol.33:349-362(1950);Kunitz,J.Gen.Physiol.33:363-377(1950))、またはメチルグリーンアッセイ(Kurnick,Arch.Biochem.29:41-53(1950);Sinicropi,等, Ana1.Biochem.222:351-358(1994))を含む、本分野で周知のいくつかの異なる方法のいずれかにより容易に測定される。「増大したDNA加水分解活性」を有するヒトDNアーゼＩ変異体とは、匹敵する条件下で測定した場合に天然のヒトDNアーゼＩ以上にDNAを加水分解するものである。例えば、もし実施例３に記載の直線状DNA切断アッセイをDNA加水分解活性を測定するために用いたならば、その場合増大したDNA加水分解活性を有するヒトD NアーゼＩ変異体は、匹敵する条件の下で測定したならば該アッセイにおいて天然のヒトDNアーゼＩよりも大きい活性を有するものであろう。該アッセイにおいては、ヒトDNアーゼＩの過反応変異体は典型的には、天然のヒトDNアーゼＩよりも少なくとも50％より大きいDNA加水分解活性を有するが、特に天然のヒトDNアーゼＩアミノ酸配列の複数のアミノ酸残基を改変することによって、天然のヒト DNアーゼＩよりも10倍より大きいDNA加水分解活性を有する過反応性変異体もまた容易に生産される（例えば図２参照）。「粘液溶解活性」とは、例えば天然のヒトDNアーゼＩまたはヒトDNアーゼＩの過反応性変異体を用いた物質の処理において観察されるような、喀痰または他の生物学的物質の粘弾性（粘着性）の減少をいう。粘液溶解活性は、喀痰圧縮アッセイ（1994年5月11日に印刷されたPCT特許出願No.WO94/10567）、回転振子を用いたアッセイ(Jammey,J.Biochem.Biophys.Methods 22:41-53(1991))、または他のレオロジー学的研究方法を含む、本分野で周知のいくつかの異なる方法のいずれかによって容易に測定される。「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」とは一般的に、例えば米国特許第4,6 83,195号に記載されているように、望ましい核酸配列をin vitroで増幅するための方法をいう。一般的に、PCR法には、テンプレート核酸に対して好ましくハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、プライマー伸張合成の反復サイクルが含まれる。「細胞」、「ホスト細胞」「細胞系」及び「細胞カルチャー」は、ここで互換的に用いられ、全ての上記語は細胞の成長または培養から引き起こされる子孫を含むように理解されるべきである。「トランスフォーメーション」及び「トランスフェクション」は、細胞内にDNAを導入する工程をいうために互換的に用いられる。「実施可能にリンクした」とは、配列の通常の機能が実行され得るようなお互いの相対的な配置で、酵素的なライゲーションまたは他の方法によって、２以上のDNA配列を共有結合で接合することをいう。例えば、プレ配列または分泌リーダーに対するDNAは、もしポリペプチドが該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、該ポリペプチドに対するDNAに実施可能にリンクしている；プロモーターまたはエンハンサーは、もしそれが配列の転写に作用しているのであれば、コード配列に実施可能にリンクしている；またはリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするように位置しているのであれば、コード配列に実施可能にリンクしている。一般的に「実施可能にリンクした」とは、リンクされているDNAが隣接している、分泌リーダーの場合にはリーディングフレーム中で隣接していることを意味する。リンクさせることは、簡便な制限部位で達成される。もし上記部位が存在しないのであれば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、標準的な組換えDNA法に従って用いる。アミノ酸は以下のような三文字または一文字表示でここで示される： Asp Dアスパラギン酸 Ile Iイソロイシン Thr Tトレオニン Leu Lロイシン Ser Sセリン Tyr Yチロシン Glu Eグルタミン酸 Phe Fフェニルアラニン Pro Pプロリン His Hヒスチジン Gly Gグリシン Lys Kリシン Ala Aアラニン Arg Rアルギニン Cys Cシステイン Trp Wトリプトファン Val Vバリン Gln Qグルタミン Met Mメチオニン Asn Nアスパラギン本発明は、ヒトDNアーゼＩのアミノ酸配列変異体の構造、、DNA加水分解活性、及び粘液溶解活性の研究に基づく。本発明の過反応性変異体は、天然のヒトDN アーゼＩと比較して増大したDNA加水分解活性を有する。増大したDNA加水分解活性は好ましくは、DNAの結合に作用すると思われる天然のヒトDNアーゼＩ内のアミノ酸残基で及び／またはその周辺でのミューテーションを作製することによって成し遂げられる。特に有用なミューテーションは、DNアーゼＩ内の一つ以上の位置で塩基性アミノ酸残基（例えばリシン、アルギニン、またはヒスチジン）を導入したものであり、その場合該アミノ酸側鎖は、例えば天然のヒトDNアーゼＩのGln9,Glu13,Thr14,His44,Asn74,Ser75及びThr205（三文字アミノ酸表示に引き続く数字は図１の配列内のアミノ酸残基の特異的な位置を示す）のアミノ酸残基の位置で関与する結合DNA基質の負に電荷したリン酸バックボーンに非常に近接している。ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体を作成しうる方法には様々なものがある。本発明の一つの実施態様として、過反応性変異体はDNA結合に影響する天然のヒトD NアーゼＩのアミノ酸残基でまたはその近傍で（即ちその残基の約５アミノ酸残基以内で）単一のまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失のそれぞれを導入することにより調製される。上記ミューテーションのある説明的な例としては以下のものがある：Q9R,E13K,E13R,T14K,T14R,H44K,H44R,N74K,N74R,S7 5K,T205K,T205R,E13R:N74K,Q9R:E13R:N74K,E13R:N74K:T205K,Q9R:E13R:N74K:T20 5K（図２及び３参照）。本発明のさらなる実施態様として、サイトディレクトミュータジェネシスがDN A結合に関与する天然のヒトDNアーゼＩのアミノ酸残基でまたはその近傍で（即ちその残基の約５アミノ酸残基以内で）アミノ酸残基に導入するために用いられ、導入された残基は生物学的または化学的のいずれかの翻訳後修飾に適している（以下参照）。Means,等,Chemical Modification of Proteins（Holden-Day,197 1);Glazer,等,ChemicalModificationofProteins:SelestedMethodsandAnalytical Procedures(Elsevier,1975);Creighton,Proteins,pp.70-78(W.H.Freem an,1984);Lundblad,Chemicial Reagents for Protein Modification(CRC Press, 1991)。例えば、ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体は、DNA結合に関与する天然のヒトDNアーゼＩのアミノ酸残基でまたはその近傍で（即ちその残基の約５アミノ酸残基以内で）純な正の電荷を増大する翻訳後修飾を作製するために生産される。例えば、システイン残基が、DNA結合に関与する天然のヒトDNアーゼＩの残基でまたはその近傍で導入される。それから該システイン残基の遊離チオールが、例えばS-アミノエチルシステインの形成を引き起こすエルチレンイミンのようなチオール特異的アルキル化試薬を用いて修飾され、その修飾は中性pHで正の電荷を有する。上記ミューテーションの説明的な例はH44Cである。簡便には、天然のヒトDNアーゼＩのアミノ酸配列における置換、挿入、及び／または欠失は、例えばサイトディレクトミュータジェネシスによって、天然のヒトDNアーゼＩをコードするDNAの相当する核酸配列内にミューテーションを導入することによって通常作製される。それからミューテートされたDNAの発現は、望ましい（非天然の）アミノ酸配列を有する変異体ヒトDNアーゼＩの生産を引き起こす。例えばSambrook,等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版(Cold Sp ring arbor aboratory Press,New York(1989))に開示されているような、本分野で周知のいかなる方法もサイトディレクトミュータジェネシスを実施するために用いられ得る一方で、オリゴヌクレオチドディレクトミュータジェネシスは、本発明のヒトDNアーゼＩ変異体を調製するための好ましい方法である。本分野で周知のこの方法は(Zoller,等,Meth.Enz.100:4668-500(1983);Zoller,等,Heth.Enz. 154:329-350(1987);Carter,Meth.Enz.154:382-403(1987);Kunkel,等,Meth.Enzym ol.154:367-382(1987);Horwitz,等,Meth.Enz.185:599-611(1990))、簡便に欠失及び挿入変異体を調製するためにも用いられているが、置換変異体を作製するのに特に適している。サイトディレクトミュータジェネシス法は典型的には、一本鎖及び二本鎖形態の両者で存在するファージベクターを用いる。サイトディレクトミュータジェネシスで有用な典型的にベクターには、M13ファージのようなベクター、及び複製の一本鎖ファージオリジンを含むプラスミドベクター(Messing,等,Heth.Enzymol .1 01:20-78(1983);Veira等Meth.Enzymol.153:3-11(1987):Short,等,Nuc.Acids.Res .16:7583-7600(1988))が含まれる。適切なホスト細胞におけるこれらのベクターの複製は、サイトディレクトミュータジェネシスのために用いられる一本鎖DNA の合成を引き起こす。略記すると、天然のヒトDNアーゼＩ（またはその変異体）をコードするDNAのサイトディレクトミュータジェネシスを実施する場合、最初に該DNAの一本鎖に望ましいミューテーションをコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって該DNAを改変する。ハイブリダイゼーション後、プライマーとしてハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを用い、そしてテンプレートとして該DNAの一本鎖を用いて、完全な第二の鎖を合成するために、DNAポリメラーゼを用いる。それ故、望ましいミューテーションをコードするオリゴヌクレオチドは、生成二本鎖DNAに取り込まれる。ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、天然に生ずるDNAの精製、またはin vitroでの合成によるようないかなる適切な方法によっても調製される。例えば、オリゴヌクレオチドは、Narang,等,Meth.Enzymol.68:90-98(1979);Brown,等,Heth.Enzymol.68:109-151 (1979);Caruthers,等,Meth.Enzymol.154:287-323(1985)に記載されているような有機化学における様々な方法を用いて容易に合成される。適切なハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーを選択するための一般的なアプローチは、よく知られている。Keller,等,DNA Probes,pp.11-18(Stockton Press,1989)。典型的には、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーは、10-25またはそれ以上の核酸を含み、該オリゴヌクレオチドが一本鎖DNAテンプレート分子に対して望ましい位置で好ましくハイブリダイゼーションするであろうことを確実にするために、望ましいミューテーションをコードする配列の片側の少なくとも５核酸を含むであろう。もちろん、サイトディレクトミュータジェネシスは、スタートDNA内に複数の置換、挿入、または欠失ミューテーションを導入するために用いられる。もしミューテートされる部位が共に近接して位置していたならば、該ミューテーションは、望ましいミューテーションの全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを用いて同時に導入される。しかしながら、もしミューテートされる部位がお互いにある距離で位置していたならば（約10ヌクレオチド以上離れていれば）、望ましい変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを生産することはより困難である。その場合、2の代わりの方法の一つが用いられる。第一の方法は、別々のオリゴヌクレオチドを各望ましいミューテーションに対して生産する。それから該オリゴヌクレオチドを、一本鎖テンプレートDNAに同時にアニリングし、該テンプレートから合成される第二のDNAの鎖は、望ましいアミノ酸置換の全てをコードするであろう。代わりの方法には、望ましい変異体を生産するための２周以上のミュータジェネシスが含まれる。第一周は単一のミューテーションに対して記載されたものである。第二周のミュータジェネシスは、テンプレートとして第一周のミュータジェネシスで生産されたミューテートされたDNAを用いる。それ故このテンプレートは、既に一つ以上のミユーテーションを含んでいる。それから、さらなる望ましいアミノ酸置換（類）をコードするオリゴヌクレオチドをこのテンプレートにアニリングし、生成したDNAの鎖は第一周と第二周のミュータジェネシスの両者由来のミューテーションをコードする。この生成DNAを、第三周以降のミュータジェネシスでテンプレートとして用い得る。 PCRミュータジェネシス(Higuchi,inPCR Protocols,pp.177-183(Academic Pres s,1990);Vallette,等,Nuc.Acids Res.17:723-733(1989))もまた、ヒトDNアーゼＩの変異体を作製するのに適している。略記すると、少量のテンプレートDNAがP CRにおけるスタート物質として用いられる場合、テンプレートDNAにおける相当する領域由来の配列とわずかに異なるプライマーを、該プライマーが該テンプレートと異なる位置でのみテンプレート配列とは異なる比較的大量の特異的DNA断片を作製するために用いる。プラスミドDNA内にミューテーションを導入するために、例えばプライマーの一つの配列には望ましいミューテーションが含まれ、該ミューテーションの位置でプラスミドDNAの一つの鎖にハイブリダイズするようにデザインされる；他のプライマーの配列は、該プラスミドDNAの反対側の鎖内の核酸配列に等しくなければならないが、この配列はプラスミドDNAに沿っていかなる場所にも位置しうる。しかしながら、最終的にプライマーによって結合されるDNAの完全に増幅される領域が容易に配列決定され得るように、第二のプライマーの配列は第一のものから200ヌクレオチド内に位置することが好ましい。今記載されたようなプライマーペアを用いたPCR増幅は、プライマーによって特異化されるミューテーションの位置で異なるDNA断片の集団を引き起こし、可能性としては他の位置でテンプレートコピーによりいくらかのエラーの傾向が存在する。Wagner ,等,in PCR Topivs,pp.69-71(Springer-Verlag,1991)。もし増幅されるDNA産物に対するテンプレートの割合が極端に低いのであれば、産物DNA断片の大部分は望ましいミューテーション（類）を取り込む。産物DNA は、標準的な組換えDNA法を用いて、PCRテンプレートとして機能するプラスミド内の相当する領域を置換するために用いられる。別々の位置でのミューテーションは、ミュータント代にプライマーを用いるか、または異なるミュータントプライマーを用いて第二のPCRを実施し３（またはそれ以上）の部分のライゲーションでプラスミド断片に同時に２の生成PCR断片をライゲートするかのいずれかによって同時に導入されうる。変異体を調製するためのもう一つの方法であるカセットミュータジェネシスは、Wells等,Gene,34:315-323(1985)によって記載された方法に基づく。スタート物質はミューテートされるDNA配列を含むプラスミド（または他のベクター）である。ミューテートされるスタートDNAにおけるコドン（類）が同定される。もし上記制限部位が存在しないのであれば、該部位を該DNAにおける適切な位置に導入するために上記記載のオリゴヌクレオチド介在性ミュータジェネシスを用いて該部位を生産する。プラスミドDNAを直線化するためにこれらの部位で切断する。制限部位の間に存在するが望ましいミューテーション（類）を含むDNAの配列をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを、標準的な方法を用いて合成し、その場合オリゴヌクレオチドの2の鎖は別々に合成し、それから標準的な方法を用いて共にハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットという。このカセットを、それがプラスミドに直接ライゲート可能なように、直線化プラスミドの末端と適合的な5'及び3'末端を有するようデザインする。生成プラスミドはミューテートされたDNA配列を含む。 DNAにおけるミューテーション（類）の存在は、制限マッピング及び／またはD NAシークエンシングを含む本分野でよく知られた方法によって決定される。DNA シークエンシングの好ましい方法は、Sanger,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:39 18-3921(1979)のディデオキシ鎖ターミネーション法である。ヒトDNアーゼＩ変異体をコードするDNAを、さらなるクローニングまたは発現のための複製可能ベクター内に挿入する。「ベクター」とは、ホスト細胞内で複製が可能であるプラスミドまたは他のDNAであり、そして上記のように適合的なホスト細胞と結びつけて2の機能を実施するために有用である（ベクター−ホスト系）。一つの機能は、ヒトDNアーゼＩ変異体をコードする核酸のクローニングを容易にすること、即ち核酸の使用可能な量を生産することである。他の機能は、ヒトDNアーゼＩ変異体の発現に向けることである。これらの機能の一つまたは両者が、クローニングまたは発現に対して用いられる特定のホスト細胞において該ベクターによって実施される。該ベクターは、それらが実施する機能に依存して異なる構成要素を含むであろう。ヒトDNアーゼＩ変異体を生産するために、発現ベクターは、プロモーター及びリボソーム結合部位に実施可能にリンクした上記記載の該変異体をコードするDN Aを含むであろう。それから該変異体を直接、または異種ポリペプチドとの融合物として組換えカルチャーにおいて発現させるが、該融合物は好ましくは、該異種ポリペプチドと該ヒトDNアーゼＩ変異体の間の結合部に、特異的な制限部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドを有する。原核生物（例えば大腸菌及び他の細菌）は、本発明の最初のクローニング工程のための好ましいホスト細胞である。それらは大量のDNAの急速な生産のため、サイトディレクトミュータジェネシスに用いられる一本鎖DNAテンプレートの生産のため、及び生成された変異体のDNAシークエンシングのために特に有用である。原核生物細胞はまた、ヒトDNアーゼＩ変異体をコードするDNAの発現のためにも用いられる。原核生物細胞において生産されるポリペプチドは、典型的にはグリコシル化されていないであろう。さらに、本発明のヒトDNアーゼＩ変異体は、真核生物の微生物（例えば酵母）または動物や他の多細胞生物由来の細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞及び他の哺乳哺乳動物細胞）、あるいは生きた動物（例えばウシ、ヤギ、ヒツジ）内で発現される。クローニング及び発現方法体系は本分野でよく知られている。本発明のヒトDN アーゼＩ変異体の生産に用いるのに適した原核生物及び真核生物ホスト細胞、及び発現ベクターの例としては、例えばShak,PCT特許出願No.WO 90/07572（1990年 7月12日に印刷）に開示されたものがある。原核生物細胞または実質的な細胞壁構造を有する細胞をホストとして用いた場合、DNAを用いて該細胞をトランスフェクションする好ましい方法は、Cohen等,P roc.Natl.Acad.Sci.69:2110-2114(1972)に記載されたカルシウム処理法、または Chung等,Nuc.Acids.Res.16:3580(1988)のポリエチレングリコール法である。酵母をホストとして用いた場合、トランスフェクションは、Hinnen,Proc.Natl.Aca d.Sci.U.S.A.,75:1929-1933(1978)に教示されるポリエチレングリコールを用いて一般的に成し遂げられる。哺乳動物細胞をホストとして用いた場合、トランスフェクションは一般的に、Graham,等,Virology 52:546(1978),Gorman,等,DNA an d Protein Eng.Tech.2:3-10(1990)のリン酸カルシウム沈殿法によって実施される。しかしながら、核への注入、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合のような、原核生物及び真核生物細胞内へDNAを導入するための他の周知の方法もまた、本発明の使用に適している。本発明において特に有用な発現ベクターは、ヒトDNアーゼＩ変異体をコードするDNAの哺乳動物細胞における一過的発現を提供するものである。一般的に、一過的発現には、ホスト細胞が多くのコピーの発現ベクターを蓄積し、引き続き該発現ベクターによってコードされる望ましいポリペプチドの高レベルの合成をなすような、ホスト細胞において効率的に複製が可能な発現ベクターの使用が含まれる。適切な発現ベクター及びホスト細胞を含む一過的発現系により、クローン化DNAによってコードされるポリペプチドの簡便なポジティブな同定、同様に望ましい生物学的または生理学的な性質に対する上記ポリペプチドの急速なスクリーニングが可能である。Wong,等,Scie nce 228:810-815(1985);Lee,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4360-4364(1985);Y ang,等,Cell 47:3-10(1986)。それ故、一過的発現系は、増大した加水分解活性を有する変異体を同定するためのアッセイと結びつけて、天然のヒトDNアーゼＩのアミノ酸配列変異体をコードするDNAを発現するために簡便に用いられる。ヒトDNアーゼＩ変異体は好ましくは、それを発現するホスト細胞から分泌され、その場合該変異体は、ホスト細胞が成育する培養培地から回収される。その場合、培地中に血清タンパク質及び他の血清構成成分が不存在であれば、該変異体の精製が容易になるため、該細胞を血清フリー培養培地で成育させることが望ましい。それが分泌されない場合は、ヒトDNアーゼＩ変異体をホスト細胞の溶解物から回収する。該変異体がヒト起源のもの以外のホスト細胞で発現された場合は、該変異体はヒト起源のタンパク質から完全にフリーであろう。いかなる場合でも、ヒトDNアーゼＩの実質的に均質な調製物を得るために、組換え細胞タンパク質から該変異体を精製することが必要であろう。治療上の使用のためには、該精製変異体は好ましくは、99%より大きい純度を有すべきであろう（即ち、いかなる他のタンパク質も精製組成物中に全タンパク質の1%より少量のみが含まれるであろう）。一般的に、ヒトDNアーゼＩ変異体の精製は、それが関連する混合物と比較して、該変異体の異なる物理化学的性質を利用することによって達成される。例えば、第一の工程として、培養培地またはホスト細胞溶解物を特定の細胞破片を除去するために遠心分離する。その後ヒトDNアーゼＩ変異体を、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、ゲル濾過（分子量排除クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー（例えばSepharoseに結合した抗ヒトDNアーゼＩ抗体を含むカラムを用いる）、触手状カチオン交換クロマトグラフィー（1993年12月23日に印刷されたFrenz,等,PCT特許出願No.WO 93/25670）、逆相HPLC、及び／またはゲル電気泳動によって、混合した可溶性タンパク質及びポリペプチドから精製する。もちろん、天然のヒトDNアーゼＩに対して用いられる精製法には、天然のタンパク質と変異体タンパク質の間の構造的及び他の差異を説明するために、ヒトDN アーゼＩ変異体を精製する場合に有用であるいくつかの修飾が必要であろうことは、当業者に明白であろう。例えば、あるホスト細胞（特に細菌ホスト細胞）では、ヒトDNアーゼＩ変異体は最初に不溶性の凝集した形態（本分野では「レフラクティルボディー」または「インクルージョンボディー」という）で発現され、その場合精製の過程においてヒトDNアーゼＩ変異体を可溶化し再生することが必要であろう。組換えタンパク質レフラクティルボディーを可溶化及び再生する方法は、本分野で周知である（例えば、Builder,等,米国特許第4,511,502号参照）。本発明のもう一つの実施態様においては、タンパク質のDNA加水分解活性を増大するため、またはタンパク質のさらなる性質に作用するため（例えば安定性、生物学的半減期、免疫原性）天然のまたは変異体ヒトDNアーゼＩタンパク質に共有結合修飾がなされる。上記共有結合修飾は、上記記載のアミノ酸配列置換、挿入、及び欠失の代わりに、またはそれらに加えてなされうる。共有結合修飾は、選択されたアミノ酸側鎖あるいはNまたはC末端残基と反応可能な有機誘導化試薬を用いて、天然のまたは変異体ヒトDNアーゼＩのターゲットアミノ酸残基と反応することによって導入される。適切な誘導化試薬及び方法は、本分野で周知である。例えば、システイニル残基は、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与えるために、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα−ハロ酢酸塩（及び相当するアミン）を用いて、最も一般的に反応される。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、p- クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールを用いた反応によって誘導化される。ヒスチジル残基は、pH5.5-7.0でジエチルピロカルボネートを用いた反応によって誘導化され、それはこの試薬がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的なためである。パラ−ブロモフェナシルブロマイドもまた有用である；該反応はpH6.0 で0.1Mソディウムカコジレートで好ましくは実施される。リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボキシル酸無水物を用いて反応される。これらの試薬を用いた誘導化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導化するための他の適した試薬には、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；ピリドキサルホスフェート；ピリドキサル；クロロブロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼ触媒性反応が含まれる。アルギニル残基は、一つ以上の伝統的な試薬を用いた反応によって修飾され、その中にはフェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導化は、該反応かグアニジン官能基の高pKaのためにアルカリ条件で実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、アルギニンイプシロン−アミノ基と同様にリシンの基とも反応するであろう。カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル −３−（２−モルフォリニル−４−エチル）カルボジイミド、または１−エチル −３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドのようなカルボジイミド(R'-N=C=N-R'；ここでRとR'は異なるアルキル基である)を用いた反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンを用いた反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。天然のまたは変異体ヒトDNアーゼＩタンパク質のアミノ酸残基へのグリコシドの共有結合は、特にDNA結合に関与する残基でまたはその近傍で、炭水化物置換基の数及びプロフィールを修飾または増大するために用いられる。用いられる結合形態に依存して、糖（類）は、(ａ)アルギニン及びヒスチジン、(ｂ)遊離カルボキシル基、(ｃ)システインのもののような遊離スルフィドリル基、(ｄ)セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのもののような遊離ヒドロキシル基、 (ｅ)フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのもののような芳香族残基、または(ｆ)グルタミンのアミド基に付着される。適切な方法は、例えばPC T特許出願No．WO 87/05330（1987年9月11日に印刷された）、及びAplin,等,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)に記載されている。ヒトDNアーゼＩ変異体に対するポリエチレングリコール(PEG)またはヒト血清アルブミンのような試薬の共有結合付着は、他のタンパク質で観察されているように、該変異体の免疫原性及び／または毒性を減少し、及び／またはその半減期を増大する。Abuchowski,等,J.Biol.Chem.252:3582-3586(1977);Poznansky,等,F EBS Letters 239:18-22(1988);Goodson,等,Biotechnology 8:343-346(1990);Kar te, J.Immunol.144:209-213(1990);Harris,Polyethylene Glycol Chemistry(Plenum Press,1992)。本発明のさらなる実施態様において、ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体には、該変異体のアクチンに対する結合アフィニティーの減少を引き起こす、一つ以上の付加的なアミノ酸配列ミューテーションまたは他の共有結合修飾が含まれるであろう。アクチン結合を減少させる上記ミューテーション及び共有結合修飾の例は、PCT特許出願WO 96/26279に記載されている。過反応性変異体にはまた、喀痰及び他の生物学的物質に存在するプロテアーゼ（例えば好中球エラスターゼ）による分解に対する該変異体の感受性を減少する、アミノ酸配列ミューテーションまたは他の共有結合修飾が含まれる。上記記載のように調製されるヒトDNアーゼＩ変異体のDNA加水分解活性は、本分野で周知の及びここに記載されるようなアッセイ及び方法を用いて容易に測定される。増大したDNA加水分解活性（ここに定義されるような）を有するいかなる上記変異体も、本発明の範囲内にある過反応性変異体である。ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体に対する抗体は、場合により免疫原性ポリペプチドと結びつけて過反応性変異体またはその断片を用いて動物を免疫化し、その後免疫化動物の血清から抗体を回収することにより生産される。代わりに、モノクローナル抗体を、簡便な方法で免疫化動物の細胞から調製する。該抗体はまた、本分野で周知の方法を用いて、キメラ（例えばヒト化）または単一鎖抗体あるいはFab断片の形態で作製されうる。好ましくは、該抗体は過反応性変異体に結合するが、他のDNアーゼＩタンパク質（天然のヒト及びウシDNアーゼＩのような）には実質的に結合しないであろう（即ち交差反応しないであろう）。該抗体は例えば、組織または臨床上のサンプルにおけるレベルを検出及び測定するために、過反応性変異体の局在及び活性に関する方法において用いられ得る。固定化抗体は、診断目的のための臨床上のサンプルにおける過反応性変異体の検出、及び例えば組み換え細胞カルチャーからの過反応性変異体の精製において特に有用である。本発明によって提供されるヒトDNアーゼＩの過反応性変異体は、喀痰、粘液、または他の肺分泌物を含むDNA含有物質の粘弾性を減少するために用いられる。上記変異体は、異常な粘性または濃厚な分泌物を有する肺疾患を有する患者、及び感染性肺炎、気管支炎または気管気管支炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、喘息、結核、及び菌類感染を含む急性または慢性気管支肺疾患のような病気を有する患者の治療において特に有用である。上記治療のために、過反応性変異体の溶液または均質に分割された乾燥調製物が、例えばエーロゾル化によって患者の気管（例えば気管支）または肺内に伝統的な方法でしみ込まされる。過反応性変異体はまた、蓄膿症、髄膜炎、膿瘍、腹膜炎、静脈洞炎、耳炎、歯周病、心膜炎、胆石症、心内膜炎及び敗血性関節炎のような病気における膿瘍またはひどい密な場所の感染の補助的治療のために有用であり、同様に皮膚及び／または粘膜の感染した病変、術後の傷、潰瘍性病変及びやけどのような様々な炎症性及び感染性病変における局所的治療において有用である。過反応性変異体は、上記感染の治療において用いられる抗生物質の効力を改良するであろう（例えばゲンタマイシン活性は完全なDNAに対する可逆的な結合によって著しく減少される）。ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体は、多様化した自己抗体の生産によって特徴付けられる生命を脅かす自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス(SLE)の治療においても有用であろう。DNAは免疫複合体の主要な抗原性構成成分である。この例では、過反応性ヒトDNアーゼＩ（天然または変異体）は、作用される患者に対して静脈内、皮下、動脈内、または筋肉内の投与によって、全身に与えられる。ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体はまた、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、喘息、肺炎、または他の肺疾患を有する患者、またはその呼吸が換気装置または他の機械的装置の補助を受けている患者、または例えば術後患者といった呼吸器感染を形成する危険のある患者において生じ得るような、呼吸器感染の新たな形成及び／または悪化を子防するのに有用であろう。本発明の過反応性変異体は、治療上有用な組成物を調製する周知の方法に従って処方されうる。好ましい治療上の組成物は、緩衝されたまたは非緩衝の水性溶液における過反応性変異体の溶液であり、好ましくはpH7で1.0mM塩化カルシウムを含有する150mM塩化ナトリウムのような等張性塩溶液である。これらの溶液は、作用される患者の気管または肺内に直接投与するために有用なジェットネブライザー及び超音波ネブライザーを含む商業的に入手可能なネブライザーにおける使用に対して特に適用的である。もう一つの実施態様において、治療上の組成物には、特にPCT特許出願WO 95/2 3613に記載されているような、該変異体の溶液のスプレー乾燥によって好ましくは調製された、過反応性変異体の乾燥パウダーが含まれる。さらなる実施態様において、治療上の組成物には、ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体を活発に生産する細胞が含まれる。上記細胞は患者の組織内に直接導入され、または多孔性の膜内にカプセル化され、それから患者内に移植されるが、いずれの場合も増大したDNA加水分解活性の必要のある患者の体内の領域内に過反応性変異体の輸送という条件が付される。例えば、該患者自身の細胞を、ヒトDN アーゼＩの過反応性変異体をコードするDNAを用いて、in vivoまたはex vivoのいずれかでトランスフォームし、それから患者内に直接変異体DNアーゼＩを生産するために用いる。後者の方法は遺伝子治療と一般的にいわれている。ヒトDNアーゼＩの過反応性変異体の治療上の有効量は、例えば治療される物質におけるDNAの量、治療目的、投与経路、及び患者の病気に依存するであろう。したがって、医者は最適な治療上の効果を得るために必要とされる投与の量を滴定する及び投与経路を修飾することが必要であろう。増大したDNA加水分解活性の観点では、治療上の効果を達成するために必要とされる過反応性変異体の量は、同じ病気の下で同じ効果を達成するために必要とされる天然のヒトDNアーゼＩの量より少ないであろう。一般的に、過反応性変異体の治療上の有効量は、患者の体重のkg当たり約0.1μｇから約５mgの該変異体の投与量であり、それはここに記載されるような製薬学的組成物内に投与される。過反応性ヒトDNアーゼＩ変異体は場合により、抗生物質、気管支拡張薬、抗炎症試薬、粘液溶解薬（例えばn-アセチル-システイン）、アクチン結合タンパク質またはアクチン補助タンパク質(例えばゲルソリン；Matsudaira等,Cell 54:13 9-140(1988);Stossel,等,PCT特許出願No.WO 94/22465(1994年10月13日に印刷された))、プロテアーゼインヒビター、遺伝子治療産物（例えば嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CETR)遺伝子、Riordan,等,Science 245:1066- 1073(1989))、グルココルチコイド、または細胞毒性試薬のような、上記記載の病気を治療するために用いられる一つ以上の他の薬理学的試薬と組み合わせてまたはそれらと同時に投与される。以下の実施例は説明の目的のみを有し、いかなる方法においても本発明を限定することを企図しない。ここに引用される全ての特許及び参照文献は明白に取り込まれる。実施例１ヒトDNアーゼＩのミュータジェネシス大腸菌CJ236株(BioRad Laboratories,Richmond,California USA)を、Chung等( Nuc.Acids.Res.16:3580(1988)の方法を用いてプラスミドpRK.DNase.3でトランスフォームした。本発明をなすために用いたプラスミドpRK.DNase.3は、成熟ヒトD NアーゼＩをコードする核酸配列がShak,等,Proc.Natl.Acad.Sci.87:9188-9192(1 990)の図１Ａに示されていることを除いて、PCT特許出願No.WO 90-17572（1990 年7月12日に印刷された）に記載されているものである。トランスフォーメーションされた細胞は、50μｇ/mlカルベニシリンを含有するLBアガープレート上にまかれ、37℃でオーバーナイトで成育させた。50μｇ/mlのカルベニシリン及び1 0μｌ VCSM13ヘルパーファージ(Stratagene,La Jolla,California USA)を含有する2YTブロース(5ml)を、アガープレートから個々のコロニーを用いてイノキュレートし、37℃でオーバーナイトで振とう培養した。単一鎖DNAをこのカルチャーから単離し、引き続くミュータジェネシスのためのテンプレートとして用いた。サイトディレクトミュータジェネシスは、Kunkel,等(Meth.Enzymol.154:367-3 82(1987)の方法にしたがって合成オリゴヌクレオチドを用いて成し遂げられた。ミュータジェネシスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチコドンに対して12の正確なベースマッチ5'、及びミスマッチコドンに対して12の正確なベースマッチ3'を有する27マーであった。ミュータジェネシスに引き続き、個々のクローン由来の単一鎖DNAをディデオキシシークエンシングに受けさせた(Sanger,等,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 74:5463-5467(1977))。それから変異体核酸配列を有するDNAを、大腸菌XL1 Blue MRF'(Stratagene)株内に上記記載のようにトランスフォームした。前述のような接種及び単一コロニー単離の後、個々のコロニーを50μｇ/m1 のカルベニシリンを含有する0.51のLBブロースにイノキュレートするために用いた。37 ℃でオーバーナイトの振とう培養の後、該細胞を遠心分離によって回収し、変異体DNA（発現ベクター内）をQiagen tip-500カラム(Qiagen Inc.,Chatsworth,Cal ifornia USA)を用いて精製した。図２及び３は作製された異なるヒトDNアーゼＩ変異体を示す。該図及び明細書を通じて、DNアーゼＩ変異体に存在するアミノ酸置換ミューテーション（類）の記載は、第一のアルファベット文字、数字、第二のアルファベット文字によって省略される。第一のアルファベット文字は、天然の（野生型）ヒト成熟DNアーゼＩにおけるアミノ酸残基の一文字省略形であり、数字は天然のヒト成熟DNアーゼＩ（図１に示されるように数字が打たれる）におけるその残基の位置を示し、第二のアルファベット文字は、変異体DNアーゼＩにおけるその位置のアミノ酸残基の一文字省略形である。例えば、E13Rミューテーションを有するDNアーゼＩ変異体においては、天然のヒト成熟DNアーゼＩにおいて13位のグルタミン酸(E)残基が、アルギニン(R)残基によって置換されている。単一の変異体における複数のミューテーションは、該変異体において存在する異なるミューテーションのそれぞれを分けるコロン(：)を用いて、同時に記載されている。例えば、E13R:N74K の記号は、該変異体がE13RミューテーションとN74Kミューテーションを有することを示す。実施例２ヒトDNアーゼＩ変異体の発現ヒト胚腎293細胞(ATCC CRL 1573,American Type Culture Collection,Rockvil le,Haryland USA)を、150mmのプラスチックペトリ皿に血清含有培地において成育させた。対数増殖期の細胞を、リン酸カルシウム沈降法(Gorman,等,DNA and P rotein Eng.Tech.2:3-10(1990))を用いて、22.5μｇの精製変異体DNA（上記記載のように調製された）及び17μｇのアデノウイルスDNAと共に一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、該細胞を15mlのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、該培地を血清フリー培地に変換した。細胞カルチャー培地を血清フリー培地への変換に引き続く約96時間で各プレートから回収した。DNアーゼＩ変異体を含有する細胞カルチャー上清のおよそ25mlの全てをこの方法で得た。各プレート由来のカルチャー上清のプールを、Centriprep 10濃縮器を用いて約10倍に濃縮した。濃縮物におけるDNアーゼＩタンパク質の濃度を、PCT特許出願WO 96 /26279に記載されているようにDNアーゼＩタンパク質ELISAを用いて測定した。天然のヒトDNアーゼＩを含有するカルチャー上清を、293細胞をプラスミドpRK .DNase.3を用いて一過的にトランスフェクトすることを除いて、上記記載のものと同様な方法によって調製した。実施例３ヒトDNアーゼＩ変異体の生化学的活性Ｉ．プラスミドDNA切断アッセイヒトDNアーゼＩ変異体のDNA加水分解活性を測定するために、2の異なるプラスミド切断アッセイを用いた。第一のアッセイ（「スーパーコイル状DNA切断アッセイ」）により、二本鎖pBR322プラスミドDNAの緩んだ（ニックの入った）、直線状、及び分解形態への変換が測定された。第二のアッセイ（「直線状DNA切断アッセイ」）により、直線状二本鎖pBR322DNAの分解形態への変換が測定された。特異的に、カルチャー上清（上記記載のように調製され、使用前におよそ1:10 00に希釈された）を、25mM HEPES,pH7.0,100μｇ/mlウシ血清アルブミン,1mM Mg Cｌ₂,2.5mM CaCl₂,150mM NaCl内にスーパーコイル状pBR322DNAまたはEcoRI-切断直線状pBR322DNAのそれぞれの25μｇ/mlを含む160μｌの溶液に加え、該サンプルを室温でインキュベートした。様々な時間で、該反応混合物の等量を取り出し、キシレンシアノール、ブロモフェノールブルー及びグリセロールを共に用いて 25mM EDTAの添加によってクエンチングした。クエンチングされたサンプルにおけるpBR322DNAの完全な状態を、0.8%重量／容量のアガロースゲル上で該サンプルの電気泳動によって分析した。電気泳動後、該ゲルをエチジウムブロマイドの溶液を用いて染色し、ゲル中のDNAを紫外線光によって顕視化した。pBR322DNAのスーパーコイル状、緩み状、及び直線状形態の相対的な量を、Molecular Dynani cs Hodel575 FluorImagerを用いた該ゲルのスキャニング、及びそれらの異なる形態に相当する該ゲルのバンド内のDNAの量の定量によって測定した。これらのアッセイの結果が図２に示されている。スーパーコイル状DNA切断アッセイにおいては、ヒトDNアーゼＩ変異体の全体の活性は、天然のヒトDNアーゼＩで観察される割合と相対的に標準化された（「相対的ニック化活性」）、スーパーコイル状DNAの消失（スーパーコイル状DNAの緩み状（ニックが入った）、直線状、または分解されたDNAへの変換の結果として）の最初の割合として測定された。pBR322DNAの緩み状形態に対する直線状形態の割合もまた、天然のヒトDNアーゼＩで観察されるものと相対して測定した（「L/R比」）。直線状DNA切断アッセイにおいては、ヒトDNアーゼＩ変異体の活性を、天然のヒトDNアーゼＩで観察される割合と相対的に標準化された（「相対的直線状DNA切断活性」）、直線状D NAの消失（直線状DNAの分解形態への変換の結果として）の最初の割合として測定した。スーパーコイル状DNA切断アッセイにおいては、天然のヒトDNアーゼＩば1200±43mgDNA／分／mgDNアーゼＩ(n=2)のスーパーコイル状DNAニック化活性を有し、0.010の緩み状産物に対する直線状産物の割合を与えた。直線状DNA切断活性においては、天然のヒトDNアーゼＩは23±3mgDNA／分mgDNアーゼＩ(n=6)の直線状DNアーゼＩ切断活性を有した。 II．クロマチン増加アッセイヒトDNアーゼＩ変異体のDNA加水分解活性を、DNAの変性及び脱重合に対する26 0nmでの吸光度の増大に基づくクロマチン増加アッセイを用いても測定した(Kumi tz,J.Gen.Physiol.33:349-362(1950);Kunitz,J.Gen.Physiol.33:363-377(1950)) 。クロマチン増加アッセイにおいては、カルチャー上清（上記記載のように調製され、使用前におよそ1:2から1:50に希釈された）を、25mM HEPES,pH7.1,1mM Mg Cl₂,2.5mM CaCl₂,150mM NaCl内に10μｇ/mlから600μｇ/mlのウシ胸腺DNAを含有する150μｌの溶液に加え、260nmの吸光度の増加を6分間の分光光度計(Molecula r Devices Spectra Max 250)を用いてモニターした。DNA濃度に対する活性のプロットを強調して示し、該データをK_m及びV_max速度論値を求めるためにMichae1i s-Menton方程式にフィットした。図３は、天然のヒトDNアーゼＩのものと相対的に標準化されたヒトDNアーゼＩ変異体に対して計算された1/K_m,V_max及びV_max/K_m 値を示す。このアッセイにおいては、天然のヒトDNアーゼＩは229±33μｇ/mlDN A(n=6)のK_m及び168±18 A260ユニット／分／mgDNアーゼＩ(n=6)のV_maxを有した。 III．DNA加水分解活性に対する塩化ナトリウムの効果いくつかのヒトDNアーゼＩ変異体のDNA加水分解活性に対する塩化ナトリウムの効果を、塩化ナトリウムを20mMから400mMの最終濃度で反応混合物に加える点を除いて、上記記載のように本質的に直線状DNA切断アッセイを用いて測定した。図４は、添加した塩化ナトリウムの不存在下での相当する活性に対して相対的な、様々な濃度の塩化ナトリウムでの過反応性変異体及び天然のヒトDNアーゼＩの活性％を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】 1．ヒトDNアーゼＩ過反応性変異体。 2．直線状DNA切断アッセイにおいて測定すると天然のヒトDNアーゼＩのものより少なくとも50％大きいDNA加水分解活性を有する請求項１の変異体。 3．直線状DNA切断アッセイにおいて測定すると天然のヒトDNアーゼＩのものより少なくとも２倍大きいDNA加水分解活性を有する請求項１の変異体。 4．図１に示された天然のヒトDNアーゼＩのアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１の変異体。 5．図１に示された天然のヒトDNアーゼＩのアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１の変異体。 6．図１の配列内で単一の位置でのみの一アミノ酸からもう一つのアミノ酸への置換によって、図１に示されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するヒトDNアーゼＩ過反応性変異体。 7．アミノ酸置換が、図１の配列内で以下の位置：Gln9,Glu13,Thr14,His44,Asn7 4,Ser75及びThr205の一つである請求項６の変異体。 8．図１の配列内で二つ以上の位置での一アミノ酸からもう一つのアミノ酸への置換によって、図１に示されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するヒトDNアーゼＩ過反応性変異体。 9．少なくとも一つのアミノ酸置換が、図１の配列内で以下の位置：Gln9,Glu13, Thr14,His44,Asn74,Ser75及びThr205の一つでなされる請求項８の変異体。 10．ヒトDNアーゼＩ過反応性変異体をコードする単離された核酸。 11．図１に示された天然のヒトDNアーゼＩのアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項１０の核酸。 12．図１に示された天然のヒトDNアーゼＩのアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項１０の核酸。 13．図１の配列内で単一の位置でのみの一つのアミノ酸からもう一つのアミノ酸への置換によって、図１に示されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項１０の核酸。 14．図１の配列内で二つ以上の位置での一つのアミノ酸からもう一つのアミノ酸への置換によつて、図１に示されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項１０の核酸。 15．ヒトDNアーゼＩ過反応性変異体の治療上の有効量を患者に投与することを含む、肺疾患または肺病を有する患者の治療方法。 16．該疾患または病気が嚢胞性線維症である請求項１５の方法。 17．ヒトDNアーゼＩ過反応性変異体の治療上の有効量を患者に投与することを含む、全身性エリテマトーデスを有する患者の治療方法。 18．ヒトDNアーゼＩ過反応性変異体及び場合により製薬学的に許容可能な賦形剤を含む製薬学的組成物。 19．該組成物が液体形態で存在する請求項18の組成物。 20．該組成物がパウダー形態で存在する請求項18の組成物。