JP2000512508A - 多数の微生物ファミリーを同定するためのユニバーサルテストシステムおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は広く分岐した微生物の少なくとも二つの群の間である微生物を同定するためのユニバーサルテストシステムおよびその使用方法に関する。ユニバーサルテストシステムは少なくとも一つの酵素のための基質を含む非冗長生化学テストのあらかじめ定めた組合わせを含み、もし酵素が作用すれば該基質は検出可能な産物の生成をもたらす。生化学テストの組合わせからの検出可能な産物は次に微生物を同定するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 多数の微生物ファミリーを同定するためのユニバーサルテストシステムおよび その使用本発明の分野 本発明は、多数の分岐微生物群のどれか一つ、例えば分岐ファミリーまたは群 の中の嫌気性菌、イースト、偏好性菌、腸内菌、ブトウ状菌、連鎖球菌および腸 内球菌に属し得る微生物の同定を決定するユニバーサルテストシステムおよびそ の使用方法に関する。本発明のテストシステムは一つの微生物の科または群、属 および／または種に独特な酵素の存在を検出する、あらかじめ定めたテストの単 一のバッテリーよりなる。本発明の背景 細菌を分類もしくは同定するための方法の開発は、微生物学の修業のごく始め から微生物学社会の進行中のゴールであった。初期の分類方法は、微生物の顕微 鏡検査およびその後のそれらの細胞形態の種類、すなわち球形細胞、杆形細胞（ バチルス）、杆球形細胞、出芽イーストおよびｓｐｈｉｒｏｃｈｙｔｅｓに基づ いていた。微生物学者はまた、微生物のカテゴリー化の追加の手段として、微生 物細胞の配列の彼等の顕微鏡観察を、例えば連鎖球菌は真珠首輪に似た球形細胞 の鎖をいい、ブドウ球菌はブトウのふさに似た球形細胞のふさをいう等のように 記載した。後に、顕微鏡の区別化能力へ追加するため染色が開発された。これら の最も重要なものはグラム染色であり、これは微生物を二つのグループ、すなわ ちピンクない し赤に染色するグラム陰性菌、および明るい青ないし青に染色するグラム陽性菌 に分割する。後に、ヒトの病気を引き起こす微生物の中で、大部分のグラム陰性 菌は杆形であり、そして大部分のグラム陽性菌は球形であることが観察された。 他の初期の細菌を区別する手段は、酸素の存在下または不存在下生育する微生物 の能力を決定することであった。酸素の存在下生育する微生物は好気性菌と呼ば れ、酸素の不存在下生育する微生物は嫌気性菌と呼ばれる。 診断微生物学における最も重要な初期の発見の一つは、液体または固体細菌生 育培地の用いる、試験管またはペトリ皿中で細菌が生育する能力であった。微生 物学者は後に、生育または生育阻害テスト、例えばＮａＣｌ ６．５％はブドウ 球菌の生育を阻止するがしかし腸内球菌を阻止しない等、または生化学テスト、 例えば腸内細菌はグルコースを発酵して酸最終生成物を生産するが非発酵細菌は これをしない等のような、微生物を区別するさらなる手段を開発するため生育培 地へ種々の化学品を加え始めた。細菌を分類するため微生物学者が利用し得るテ ストのバッテリーへ上述の形態学的、生育／阻害、および生化学的テストを組合 わせることが、すべての生物を分類するために使用される科、属、種の慣例的な 分類学的クラスに細菌を分類する手段の開発へ導いた。微生物学者のアプローチ は、歴史的に微生物のたった一つの群または科へだけ適用可能な分類テストのバ ッテリーを開発することであった。例えばビリダンス連鎖球菌を同定するための Ｆａｃｋｌａｍのスキーム（文献３），コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を同定する ためのＫｌｏｏｓおよびＳｃｈｌｅｉｆｅｒのスキーム（文献２），グラム陰性 腸内菌を同定するためのＥｄｗａｒｄｓおよびＥｗｉｎｇのスキーム（文献１） 等。これらスキームのどれもスキームが目指す微生物の科の代謝および生育特徴 のために特別に設計されたテスト処方を使用する。このようにブドウ球菌のため のグルコース発酵テストは連鎖球菌および腸内微生物のためのグルコース発酵と は異なって処方される。事実、調製された細菌学的培地の商業的サプライヤーは 商業ベースで上のファミリー特異性処方物を提供する。Ｒｅｍｅｌ社（１２０７ ６ Ｓａｎｔａ Ｆｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ ６６２１５ −３５９４）カタログＮｏ．１０３（１９９４年１月）は、上で参照した同定ス キームを実施するための多種類の慣用のチューブ入り生化学的処方物を微生物学 者へ提供する。Ｒｅｍｅｌ社カタログは微生物の７つの異なるファミリーによる 炭水化物発酵を検出するための８種の異なる培地の処方を提供する。それらは以 下のとおりである。パープルブロスは腸内菌のテストのために使用され（４０− ４１頁を見よ）、フェノールブロスはブドウ球菌のテストのために使用され（３ ８−３９頁を見よ）、Ｐ．Ｒ．Ａ．Ｓ．培地およびＣＨＯ培地は嫌気性菌をテス トするために使用され（２９−３０頁および４０頁を見よ）、ＯＦ培地は非発酵 グラム陰性細菌および腸内菌のテストのために使用され（３７−３８頁を見よ） 、そしてイースト発酵ブロスはイーストをテストするために使用される（４７− ４８頁を見よ）。 文献 １９６０年後半の始め、腸内細菌のためのＥｎｔｅｒｏｔｕｂｅ同定システム のＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社（１４４７Ｙｏｒｋ Ｃｏｕｒｔ，Ｂｕ ｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ ２７２１５ ）による導入、およびその直後ＡＰＩ社 （５９５ Ａｎｇｌｕｍ Ｄｒｉｖｅ，Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，ＭＯ ６３０４２ −２３９５）による２ＯＥ エンテリック同定システムの発表に伴って、診断薬 会社は商業的細菌同定キットの開発および製造のためこの同じ原理を採用し始め た。Ｖｉｔｅｋ，Ｍｉｃｒｏ Ｓｃａｎ，ＩＤＳ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２７９７ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｐｌａｃｅ ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ ３００７１），およびＡＰＩはそれぞれ細菌の各フ ァミリーまたは群を同定するためのファミリー特異性製品を提供している（下の 表Ｉを見よ）。 歴史は微生物学者に、細菌の分岐ファミリーへ属する微生物の臨床的単離的ま たは株の同定は異なる慣用の試験管生化学スキームまたは異なる商業的製品の使 用を必要とすることを教えている。すべての伝統的生化学テストは細胞の数を増 幅しそしてある種の酵素を誘起する手段として生育に依存する。細菌の個々の科 の生育特性に対してテスト処方を最適化する必要はファミリー特異性テスト（伝 統的試験管生化学または商業的キット）の歴史的焦点の基礎である。例えば慣用 の生化学テストの上の議論において、微生物の７種の異なるファミリーと特異的 に反応的であるように処方されたグルコース発酵のために８種の異なる処方が存 在する。慣用の生化学テス トは大部分生育依存性であるため、各グルコース発酵反応は微生物の特定のファ ミリーの生育のため、および微生物のそのファミリーによるグルコース発酵の検 出のため最適化されている。この実施方法は微生物の異なるファミリーもしくは 群毎に異なる生化学的同定産物（上のリストを見よ）が存在するように商業的同 定システムによって発展された。群特異性産物クラスの開発は、ファミリーもし くは群特異性生育特性を支持する処方を開発すること、および微生物の各ファミ リーもしくは群の代謝のための基質反応性を最適化することの必要性を現れであ る。診断薬会社が測色法もしくは蛍光分析で検出されるクロモゲン、フルオロゲ ンまたは急速慣用テストを使用した急速同定テストの開発を始めた時、生育依存 は大きく減ったとしてもファミリー特異性生育フォーマットは続いた。これら新 しい急速ＩＤシステムは生育依存性よりも生育非依存性であった。これらは生育 に基づくシステムに使用されるよりももっと濃い細菌の懸濁液中に存在するあら かじめつくった酵素をアッセイする。 従って、生化学テストの単一のバッテリーを使用することにより、そのため各 テストバッテリーまたは組み合わせが微生物の特定の群もしくはファミリーに対 し仕立てられている多数のテストバッテリーまたは商業的テストキットの使用を 避けることによるような、微生物の多数の分岐群の任意の数のうちの一つへ属す る微生物を分類しおよび／または同定するユニバーサルシステムを持つことが望 ましいであろう。本発明の概要 本発明は、各自普遍的処方を有する、生化学テストの単一のバッテリーを使用 する、微生物の広く分岐した群の任意の一つへ属する 微生物を同定する能力を始めて創出する。この万能なフォーマットは、１５分程 の短いインキュベーション時間、または８時間（１回作業出番）までに同定結果 を提供する万能生化学システムを提供する。このテストは性質がクロモゲン／測 色法、またはフルオロゲン／蛍光分析でよく、そして内眼的にまたは自動的に読 み取ることができる。微生物を分類しそして同定するために使用するデーターベ ース（確率行列）は、同定すべきすべてのファミリーのメンバーを含む単一のデ ーターベースが、または各ファミリーに特異的なサブデーターベースのシリーズ からなる。この確率行列は、以後時折りあらかじめ定めた標準と呼ばれる。ユー ザーへこのシステムの一つの利益は、彼等は彼等の微生物同定需要の大部分のた めに、単一のテスト方法をどのように使用するかを学ぶことのみを要することで ある。第２に、ユーザーは彼等の微生物同定需要の大部分のために、多数の製品 の在庫を管理するのではなく、一つの診断テストを注文しそして在庫することを 要するのみである。 本発明は、生化学テストの単一（ユニバーサル）バッテリー、すなわち微生物 の広く分岐した多数の群のどれか一つに属する一つの微生物を同定するためのテ ストシステムに関する。これらの広く分岐した群の一つの特定の微生物の分類は それら特定の微生物のための生育要求に大きく基づいている。例えば、ブトウ球 菌、連鎖球菌および腸内球菌は腸内菌および非発酵菌と同様な生育要求を持って いる。過去においては、微生物の分岐群はめいめいのファミリーもしくは群に対 して特異的に仕立てた良く知られた処方上の生育を観察することによって検出さ れていた（例えば、イースト、嫌気性細菌または偏好性細菌等のための特異性培 地）。微生物の広く分岐し た群またはファミリーの例は（ｉ）イーストおよび嫌気性細菌、（ii）イースト およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，および／またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（iii）イーストお よび腸内細菌、（iv）イースト、嫌気性細菌および偏好性細菌、（ｖ）偏好性細 菌およびイースト，および（vi）嫌気性細菌および偏好性細菌よりなる。微生物 の非分岐群またはファミリーの例は、例えば（ｉ）腸内細菌および非発酵菌、（ ii）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，および（iii）ＮｅｉｓｓｅｒｉａおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓよ りなる。 これら広く分岐した群の各自へ属する微生物の例は、以下の表IIないしＶに見 るこができる。微生物は時々そのような群へ追加およびそれから削除され、また 一つの群から他の群へスイッチされ、または新しい名前が与えられる。本発明の テストシステムはすべてのそのような群へ適用可能である。 本発明の方法は、微生物を同定するために、ある微生物科、属および／または 種に独特の代謝経路中の少なくとも１種の酵素および／または酵素群の存在を検 出するためサンプルをあらかじめ定めた生化学テストの単一バッテリーへかける ことよりなる。テストのバッテリーは、以後時によりテストの組合わせまたはテ ストシステムと呼ばれる。ここで使用されるサンプルは、選択的もしくは非選択 的培地上で生育したコロニーから得られた微生物のサスペンジョン、もっとも好 ましくは実質上純粋な培養物のサスペンジョンを含む。 本発明のテストシステムは、前記生化学テストを実施するための反応チャンバ ーを含み、各反応チャンバーは少なくとも１種の酵素のための基質を含み、該基 質はもし酵素によって作用されれば反応チャンバー内に検出し得る生産物の生成 をもたらし、そしてテストの組合わせにおけるこの検出し得る生産物はサンプル 中の微生物の同定に関連している。 好ましい具体例においては、反応チャンバーはここでは“パネル”と呼ぶ単一 ハウジング、すなわちマイクロタイタープレート内に配置される。パネル中の反 応チャンバーの数は特定の使用に応じて変わり得る。反応チャンバーは所望によ り開放またはカバーされる。 このように一面において、本発明は微生物の広く分岐した多数の群のどれかの 一つへ属するある微生物を同定するためのあらかじめ定めた生化学テストの単一 のバッテリーを提供する、ユニバーサルテストシステムおよび該テストシステム の使用方法を提供する。微生物は好ましくは別々の属およびもっと好ましくは別 々の種に分類 される。 好ましくは一具体例において、ユニバーサルテストシステムは、少なくとも１ 種の酵素のための基質およびそのテストのための他の成分を収容している複数の 反応チャンバー、例えばウエルをその中に配置した少なくとも一つのパネルを含 む。好ましい一具体例においては、あらかじめ定めた生化学テストの単一の組合 わせは、最大約６０まで、もっと好ましくは約３６ないし４８の反応チャンバー を含んでいる単一ユニバーサルテストパネルの使用によって実施される。特に好 ましい具体例においては、ウエルは好ましい半もしくは全自動サンプリング、可 視化およびデータ処理方法の使用を容易化するように直線列に配置される。 一般に、本発明のユニバーサルテストシステムに使用するのに適した生化学テ ストのバッテリーは、微生物の所望の多数のファミリーを同定することができる テストのバッテリーを同定する既知の統計学的手法を使用することによって選択 される。異なるデータベースが次に構成される。データベースの異なるセットが よく知られた統計学的手法を使用して次に評価される。そのような統計学手法の 一つが後で実施例３に記載される。微生物を同定するために使用されるデータベ ース（確率行列）もしくはあらかじめ定めた標準は、同定すべきすべての群のメ ンバーか、または各群に特異的なサブデータベースのシリーズよりなる。以前に 述べたように、ユーザーに対するこのシステムの主要な利益は、彼等の微生物同 定需要の大部分のための単一のテスト方法をどのように使用するかのみを学び、 そして彼等の微生物同定需要の大部分のために、多数の製品の在庫を管理するか わりに、単一の診断テストを注文し、在庫することの みを要することである。 上に記載した具体例においては、単一データベースもしくはサブデータベース のシリーズ、すなわち確率行列は、微生物を同定するためサンプルのテストシス テム（パネル）の結果がそれに対して比較されるあらかじめ定めた標準として使 用される。実施例３を見よ。好ましくは、あらかじめ定めた標準は分光もしくは 蛍光分析技術を使用して得られたデータからつくられる。しかしながらあらかじ め定めた標準は比色テストの肉眼検査によって得られたデータを用いて開発する こともできる。 微生物酵素の同定のための種々の生化学テストがこの分野において知られてい る。そのようなテストの大部分が本発明のユニバーサルテストシステムにおける 使用のため適応化されることができる。 本発明のユニバーサルテストシステムは蛍光に基づくテストまたは比色定量に 基づくテストまたはそれらの組合わせを含む。例えば、より大きい感度およびス ピードのため、本発明のユニバーサルテストにおいてあるテストのためには比色 定量（クロモジェニック）系テストよりも蛍光系テストの方が好ましい。しかし ながらユニバーサルテストの他のテストにおいては、肉眼テスト解釈のようなよ り大きい便利性のため比色系テストが好ましい。 このように、本発明の好ましい一具体例においては、ユニバーサルテストシス テムは、テストの大部分が蛍光系フォーマットであるあらかじめ定めた生化学テ ストの単一バッテリーを使用することにより、微生物の多数のグループからある 微生物を同定することが可能である。この具体例においては、経路中の酵素およ び／または酵 素群の存在が検出可能な蛍光産物の存在を測定することによって検出される。あ る場合には、蛍光産物の生成は酵素と基質の反応によって生じたｐＨ変化の結果 である（蛍光定量テスト）。他の場合には、蛍光産物の生成は増加した蛍光を通 常示す検出可能な誘導体発蛍光団を生成するように、フルオロゲン基質の分裂（ 例えば加水分解）を伴う（フルオロジェニックテスト）。なお他の場合には、蛍 光指示薬を消光するクロモゲン産物が生成される。 あらかじめ定めたテトスのバッテリーからの結果は、サンプル中の微生物を同 定する目的で、例えば少なくとも一つのあらかじめ定めた標準と比較される種々 の統計学的手法へかけられる。実施例３を見よ。 好ましくは一具体例においては、検出可能な蛍光産物は増加した蛍光を有する 誘導体発蛍光団を生成するように少なくとも一つのフルオロゲン基質を分裂する （例えば加水分解により）ことにより、テストのあらかじめ定めたバッテリーの 一つ以上に生成される。ユニバーサルテストシステムの特に好ましい具体例にお いては、エステラーゼおよびグリコシダーゼテストがフルオロゲンフォーマット において好ましく実施される。 他の好ましい一具体例においては、一つ以上の生化学テストにおいて検出可能 な蛍光産物は酵素反応の存在下蛍光定量指示薬によって生成される。一般に蛍光 定量指示薬は蛍光の変化を発揮することができるｐＨ応答性化合物である。特に 、蛍光定量指示薬はｐＨの増加（アルカリ性化）または減少（酸性化）の存在下 蛍光の増加を受ける。ユニバーサルシステムの特に好ましい具体例においては、 糖発酵酵素、ウレアーゼ、デカルボキシラーゼ、および炭素利用酵 素テストが蛍光フォーマットにおいて実施される。 本発明はまた、蛍光定量フォーマットにおいて炭素利用酵素テストを始めて提 供する。この具体例においては、この酵素テストは炭素利用酵素の少なくとも一 つの培地と、そして少なくとも一つの蛍光定量指示薬を含む。炭素利用酵素は、 もし存在すれば基質に作用し、蛍光定量指示薬から蛍光産物を生成するｐＨ変化 を生成する。 ある具体例においては、本発明のユニバーサルテストシステムは少なくとも一 つの比色定量系生化学テストを含む。比色定量テストは蛍光フォーマットで実施 されるテストに追加または代替することができる。いつくかの場合には、クロモ ゲン産物の生成は酵素の基質との反応によって生じたｐＨ変化の結果である（比 色定量テスト）。一般に比色定量指示薬は色の変化を示すことができるｐＨ応答 性化合物である。特に、クロモゲン指示薬はｐＨの増加（アルカリ性化）または 減少（酸性化）の存在下色の変化を受ける。他の場合には、クロモゲン産物の生 成は検出可能な誘導体発色団を生成するようにクロモゲン基質の分裂（例えば加 水分解により）を伴う。 本発明の特に好ましい具体例においては、ユニバーサルテストシステムはペプ チターゼおよびグリコシダーゼの各々を検出するための少なくとも一つのテスト を含む。他の好ましい具体例においては、テストシステムは糖発酵酵素テストを さらに含む。なお他の好ましい具体例においては、テストシステムはウレアーゼ 、デカルボキシラーゼ、エステラーゼ、トリプトファナーゼ（インドールテスト ）または炭素利用酵素のための少なくとも一つのテストをさらに含む。パネルフ ォーマット具体例においては、ユニバーサルテストパ ネル上のあらかじめ定めた数のウエルは、各自その中に配置された各酵素のため の少なくとも一つの基質とそしてそのテストのために必要な他の成分を有する。 使用において、サンプルが各ウエルへ加えられ、もしサンプル中に存在すれば酵 素または酵素群は基質に作用し、検出し得る産物を生成する。テストの各自中の 酵素または酵素群の存在は、もし存在すれば、各ウエル中の検出可能な産物を同 定することによって測定され、そしてテストの組合わせからの検出可能な産物が あらかじめ定めた標準との比較によってサンプル中の微生物の存在に関係づけら れる。 他の好ましい具体例においては、追加テストはフォスファーゼテストを含む。 追加の酵素のためのテストは所望によりクロモゲンまたはフルオロゲンフォーマ ットにおいて実施される。 特に好ましい具体例においては、ユニバーサルテストパネルはペプチターゼ、 グリコシダーゼ、糖発酵酵素、エステラーゼおよび炭素利用酵素の各自のための 蛍光テストと、そしてウレアーゼ、フォスファターゼ、トリプトファナーゼおよ びデカルボキシラーゼのための少なくとも一つの比色定量テストよりなる、あら かじめ定めた生化学テストの単一のバッテリーを含む。 本発明の特に好ましい具体例においては、ユニバーサルテストシステムは約１ ０分ないし約８時間、好ましくは約１０分ないし約２時間半で終了する、あらか じめ定めた生化学テストの単一バッテリーを含む。本方法による大部分の生化学 テストは約２時間以内に実施することができるが、ある場合にはテスト時間を３ 時間以上そして約８時間まで延長することが望ましい。例えば、ある場合には２ 時間より長いテスト時間は遅い触媒速度を示す酵素の低レベルの増 加検出に対して使用される。他の場合には、２時間より短いテスト時間が高い触 媒速度を有する多く存在する酵素を検出するために使用される。 なお他の面において、本発明は病気を引き起こすイースト（例えばキャンディ ダ）のような各種のイーストをすばやく検出同定するために有用な蛍光系テスト を提供する。 なお他の面において、本発明は蛍光系炭素利用酵素テストを提供する。本発明の詳細な説明 本発明のユニバーサルテストシステムはあらかじめ定めた数のチャンバーもし くはウエルを有するパネルとして便利に構成される。そのような形態が本発明の テストシステムを例証するために使用されるであろう。意図する用途に合致する ように多種類のフォーマットに構成できるので、これはユニバーサルテストシス テムを限定することを意図しない。 本発明のテストシステムは微生物の多数のそして広く分岐した群の一つからの サンプル中のある微生物を同定することが可能である。好ましい一具体例におい て、テストシステムはあらかじめ定めた数の反応チャンバー内に配置された非冗 長生化学テストのあらかじめ定めたバッテリーを含み、各生化学テストは酵素ま たは酵素群のための基質を含み、そしてさらに該基質はもし酵素または酵素群が 作用すれば、反応チャンバー内に検出可能な産物の生成をもたらし、そしてテス トの組合わせからの検出可能な産物がサンプル中の微生物を同定するために使用 される。 本発明のユニバーサルテストシステムに関してここで使用される 非冗長とは、あらかじめ定めた生化学テストの単一バッテリーは、先行技術にお いて知られているように、各ファミリーおよび／または群のためにファミリー特 異性または群特異性処方に基づかないことを意味する。むしろ本発明の各生化学 テストはファミリーおよび群非依存的である。好ましくは、一つの基質は一つの パネル上で１回より多く使用されない。しかしながらある場合には、同じ基質が 何回も、例えば異なる緩衝システム中に含まれることが望ましいことがある。 多数の広い分岐群のどれか一つからの微生物を含有し得る、例えば臨床サンプ ル中の微生物を同定するために群特異性処方を必要としないとの発見は、本発明 のテストシステムおよび方法をもたらした大きな飛躍前進である。 ここで使用する検出可能産物の生成は、好ましくは蛍光産物またはクロモゲン 産物の生成、または反応チャンバー中の色もしくは蛍光の変化を含む。例えば放 射またはルミネセンスの変化により検出し得る他の検出可能産物も本発明の実施 において使用することができる。 本発明のユニバーサルテストパネル上に配置されるテストの数は、多数の広く 分岐した群のどれか一つに属するサンプル中の単一の微生物を同定するのに十分 である。例えば、もし以下の群、腸内、非発酵、嫌気性および偏好性細菌のどれ か一つからの微生物を同定することができるユニバーサルテストパネルを作るこ とを望むならば、適切なテストの組合わせは例えば実施例３に述べた操作を追従 することによって容易に決定される。もしそのバッテリーが挑戦に失敗したなら ば、そのテストのバッテリーは修飾され、例えば異な る基質濃度を選定することができ、あるテストを追加もしくは削除することがで き、再び実験されそして再挑戦される。属レベルでなく種へ同定するため、テス トの数は一般に大きくなるであろう。特定の使用のためのテストの最小および／ または最適数はここの教示に従った既知の統計学的技法を使用して容易に決定す ることができる。そのような技法の一例は後の実施例３に見られる。 好ましい具体例において、本発明のテストシステムはペプチダーゼ、グルコキ シダーゼ、糖発酵酵素、ウレアーゼ、デカルボキシラーゼ、エステラーゼ、炭素 利用酵素、フォスファターゼまたはトリプトファナーゼを検出するための少なく とも一つのテストを含む。他の好ましい具体例においては、そのようなテストは 少なくとも一つのペプチダーゼおよび少なくとも一つのグリコシダーゼのための テストを含む。 そのようなテストシステムは、少なくとも一つの糖発酵酵素、少なくとも一つ のウレアーゼ、少なくとも一つのデカルボキシラーゼのためのテスト、少なくと も一つのエステラーゼおよび少なくとも一つの炭素同化酵素のためのテスト、お よびその種々の組合わせをさらに含むことができる。本発明に従った他の好まし い具体例においては、非冗長生化学テストのあらかじめ定めた組合わせは、腸内 細菌、非発酵細菌、嫌気性細菌、イースト、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓ ｐ．，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ ．，および偏好性細菌の少なくとも二つの中で微生物を同定することが可能であ る。他の好ましいテストシステムは、Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｃ ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｉａ ｓｐ．，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，Ｐ ｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ａｌ ｌｏｉｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，Ｋｌｕｙｖｅｒ ａ ｓｐ．，Ｌｕｍｉｎｏｒｅｌｌａ ｓｐ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ ｓ ｐ．，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．，Ｍａｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．，Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ ｓｐ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｓｐ．，およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．の少なくとも一つの中で微生物を同定することが可能である。 本発明のなお他の好ましい具体例においては、非冗長生化学テストのあらかじ め定めた組合わせは、嫌気性菌、イーストまたは偏好性細菌の少なくとも一つの 中で、嫌気性菌およびイーストまたは偏好性細菌の中で、またはイーストおよび 偏好性細菌の中で微生物を同定することが可能である。 他の好ましい具体例においては、本発明のテストシステムはＳｔｔａｐｈｙｌ ｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕ ｓの少なくとも一つとそして嫌気性菌、イースト、腸内菌、非発酵菌または偏好 性細菌の少なくとも一つ、あるいはそれらの組合わせの中で、Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの 中で、またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔ ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，嫌気性菌、イーストおよび偏好性細菌の中で微生物を 同定することが可能である。 テストシステムの使用によりサンプル中に存在し得る広く分岐した微生物の少 なくとも二つの群の中からサンプル中のある微生物を 同定するための本発明の方法は、 ａ）サンプルを一つの基質を含んでいる各反応チャンバーへサンプルを加え、 ｂ）もし存在すれば酵素が基質を反応することを許容し、 ｃ）テスト中の検出し得る産物を検出することによってサンプル中の酵素の存 在を決定し、 ｄ）あらかじめ定めたテストの結果をあらかじめ定めた少なくとも一つの標準 と比較し、サンプル中の微生物を同定することよりなる。 本発明によって、微生物による炭素源利用を検出するためのテストも提供され 、そのテストは少なくとも一つの炭素源とそして少なくとも一つの蛍光定量指示 薬を含み、微生物は指示薬の蛍光の変化を発生するｐＨ変化を生ずるように炭素 源に作用し、蛍光の変化は微生物による炭素源利用の指標となる。 特に好ましい具体例においては、ユニバーサルテストパネルは（ｉ）ｅｎｔｅ ｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ，ｅｎｔｅｒｏｃ ｏｃｃｉおよびｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ科、および嫌気性菌、イーストおよび 偏好性細菌群のどれか一つからある微生物を所望の同定レベル、例えば属および ／または種まで同定することが可能である。 典型的には、反応チャンバーの容積は便利性およびコスト有効性について選ば れる。 そのようなパネルの製作に使用のために適当な材料は酵素テストの成分と実質 上非反応性でなければならず、そしてポリスチレン、ＰＶＣ等のようなプラスチ ックを含む。 一具体例において、本発明のユニバーサルテストパネルは多数の微生物群のど れか一つに属するある微生物を同定するために使用される。この微生物は別々の 属および／または種へ、好ましくは種レベルへ同定される。 本発明のユニバーサルテストパネルは、細菌およびイースト、例えば腸内菌お よび非発酵菌、嫌気性菌、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉおよびｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｉおよびｅｎｔｅｒｃｏｓｓｉ，および偏好性細菌のような広い分岐群か ら細菌を同定するように構成することができる。 一具体例において、ユニバーサルテストパネルは異なる生化学テストを有する 多数のウエルを含む。しかしながら他の具体例では、ユニバーサルテストパネル は同じ基質であるがしかしＴＲＩＳ，ＨＥＰＥＳ，ＭＯＰＳ，ＰＩＰＥＳ，ヒス チジン、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩または炭酸塩のような異なるバッファー 中の基質を有する別々のウエルにおいて実施される。例えば、本発明のユニバー サルテストパネルの一具体例は、一つのウエル中のＴｒｉｓおよび他のウエル中 のＨｅｐｅｓ中の基質（例えばグリシル−グリシン７−ＡＷＣ）を使用するペプ チダーゼテストを含む。 一般に、ユニバーサルテストパネルの各ウエルのｐＨは約５ないし約９であろ う。例えばペプチダーゼおよびグルコシダーゼテストは典型的にはそれぞれ約ｐ Ｈ７〜９および約ｐＨ７〜８において実施され、糖発酵酵素テストは約ｐＨ７〜 ８において、そして炭素利用酵素テストは典型的には約ｐＨ５．０〜６．０にお いて実施される。 他の場合には、ユニバーサルテストパネルは酵素基質の異性体を 有する別のウエル中でテストが実施される少なくとも一つの生化学テストを含む 。この具体例においては、異性体は例えばエナンチオマー、ジアステレオマー、 またはシス−トランスジアスアテレオマーであることかできる。代わりに、基質 は異性体の混合物であることができる。例えばガラクトースのα−およびβ−異 性体は糖発酵酵素テストに使用のための適当な異性体である。表VIを見よ。 ユニバーサルテストパネル上でテストすべきサンプルは微生物の実質上純粋な 単離物から得た微生物サスペンジョンである。 実質上純粋な単離物はいくつかのよく知られた方法によって得られる。例えば 一方法において、サンプルは所望の微生物群の生育を支持することができる液体 、固体または半固体培地で前培養される。もっと詳しくは、サンプルは実質上純 粋な微生物の単離物がそれから得られるコロニーを得るため、選択的固形または 半固形培地上で前培養することができる。もし望むならば、実質上純粋な単離物 は所望の微生物の数を増やすためさらに選択されることができる。どちらの場合 も単離物はユニバーサルテストパネルに使用して適したサスペンジョンを形成す るため界面活性剤溶液中に懸濁される。典型的にはサスペンジョンは約０．１〜 ５マックファーランド単位、好ましくは約０．５マックファーランド単位の密度 を有する。この範囲内の高いサスペンジョン密度がユニバーサルテストパネル上 でより速い結果を得るためにある場合には好ましい。微生物のサンプルの前培養 はよく知られている。 本発明のユニバーサルテストシステムのためのテストの選定において、これら テストのバッテリーが選択され、適切なパネルに配置され、そして微生物の分岐 群のどれか一つに属する微生物を同定す るために使用のためのあらかじめ定めた標準（確率行列）へ到達するために後で 記載するようにテストされる。 上で論じたように、広範囲の蛍光（例えばフルオロゲン，蛍光定量）、比色定 量および蛍光消光テストを本発明のユニバーサルテストシステムに使用すること ができる。 さらに、これらテストの各自に使用するため種々の基質が適している。例えば 、本発明の好ましい具体例においては、フルオスゲンおよび／または蛍光定量テ ストがユニバーサルテストシステムに使用のため選ばれる。これら具体例におい ては、フルオロゲンテストは少なくとも一つのフルオロゲン基質、好ましくは検 出可能な蛍光産物を生成するように酵素的に分裂される一つのフルオロゲン基質 を含む。特に異なる具体例では、フルオロゲン基質は典型的にフルオロゲンへ接 合した基質よりなる。蛍光定量テストは、少なくとも一つの基質、好ましくは蛍 光定量指示薬によって検出されるｐＨ変化を得るようにサンプル中の少なくとも 一つの酵素と反応する一つの基質を含む。種々の適切なフルオロゲンおよび蛍光 定量指示薬が記載されている。後の表VI、およびＨａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．Ｈ ａｒｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｓｉｘｔｈ Ｅｄ．（１９９６）ｂｙ Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ；Ｂａｓｃｏｍｂ，Ｓ．（１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９，１０６；Ｍａｎａｆｉ，Ｍ ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．３３５ を見よ。 本発明のユニバーサルテストシステムに使用のための例示的基質 は下の表VIにリストされている。基質１ないし２５はペプチターゼテストのため のフルオロゲン基質である。基質２６ないし３４はグリコシダーゼテストのため のフルオロゲン基質である。基質３５，および３７ないし５４は４−メチルウン ベリフェロン蛍光定量指示薬を使用する糖発酵テストのための基質である。基質 ５５ないし６０は炭素同化基質である。基質６１−６２，６４−６５，７３−７ ８，８８−８９および９２は糖発酵テストのための基質である。基質６３はウレ アーゼテストのための基質である。基質６６−７０，７９−８０および９０−９ １はグリコシダーゼテストのための基質である。基質７２および８４はフォスフ ァターゼテストのための基質である。基質８５−８７はデカルボキシラーゼテス トのための基質である。基質９６はインドールテストのための基質である。 表 VI １．Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルギニン７−ＡＭＣ ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ） ２．Ｌ−シトルリン７−ＡＭＣ ＨＢｒ（Ｔｒｉｓ） ３．グリシン７−ＡＭＣ ＨＢｒ（Ｔｒｉｓ） ４．グリシル−グリシン７−ＡＭＣ ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ） ５．グリシル−Ｌ−プロリン７−ＡＭＣ ＨＢｒ（Ｔｒｉｓ） ６．Ｌ−ヒスチジン７−ＡＭＣ（Ｔｒｉｓ） ７．Ｌ−ヒドロキシプロリン７−ＡＭＣ（Ｔｒｉｓ） ８．Ｌ−イソロイシン７−ＡＭＣ ＴＦＡ（Ｔｒｉｓ） ９．Ｌ−ロイシン７−ＡＭＣ ＡｃＯＨ（Ｔｒｉｓ） １０．Ｌ−リジン７−ＡＭＣ ＡｃＯＨ（Ｔｒｉｓ） １１．Ｌ−メチオニン７−ＡＭＣ ＡｃＯＨ（Ｔｒｉｓ） １２．Ｌ−セリン７−ＡＭＣ ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ） １３．Ｌ−トリプトファン７−ＡＭＣ（Ｔｒｉｓ） １４．Ｌ−アルギニル−Ｌ−アルギニン７−ＡＭＣ ＨＣｌ（Ｈｅｐｅｓ） １５．Ｌ−アラニン７−ＡＭＣ ＴＦＡ（Ｈｅｐｅｓ） １６．グリシル−グリシン７−ＡＭＣ ＨＣｌ（Ｈｅｐｅｓ） １７．グリシル−Ｌ−プロリン７−ＡＭＣ ＨＢｒ（Ｈｅｐｅｓ） １８．Ｌ−ヒスチジン７−ＡＭＣ（Ｈｅｐｅｓ） １９．Ｌ−ヒドロキシプロリン７−ＡＭＣ（Ｈｅｐｅｓ） ２０．Ｌ−イソロイシン７−ＡＭＣ ＴＦＡ（Ｈｅｐｅｓ） ２１．Ｌ−ロイシン７−ＡＭＣ ＨＣｌ（Ｈｅｐｅｓ） ２２．Ｌ−メチオニン７−ＡＭＣ ＡｃＯＨ（Ｈｅｐｅｓ） ２３．Ｌ−フェニルアラニン７−ＡＭＣ ＴＦＡ（Ｈｅｐｅｓ） ２４．Ｌ−セリン７−ＡＭＣ ＨＣｌ（Ｈｅｐｅｓ） ２５．Ｌ−トリプトファン７−ＡＭＣ（Ｈｅｐｅｓ） ２６．４−ＭｅＵα−Ｌ−フコシド ２７．４−ＭｅＵα−Ｌ−アラビノピラノシド ２８．４−ＭｅＵα−Ｄ−マンノピラノシド ２９．４−ＭｅＵα−Ｌ−ラムノピラノシド ３０．４−ＭｅＵβ−Ｄ−フコシド ３１．４−ＭｅＵβ−Ｌ−フコシド ３２．４−ＭｅＵβ−Ｄ−ラクトシド ３３．４−ＭｅＵβ−Ｄ−セロビオシド ３４．４−ＭｅＵＮ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド ３５．アルブチン（酸生産） ３６．ＬＯＣＡＴＯＲ（ＡＭＣ） ３７．セロビオース（酸生産） ３８．ヅルシトール（酸生産） ３９．エリスリトール（酸生産） ４０．フラクトース（酸生産） ４１．ガラクトース（酸生産） ４２．グリセロール（酸生産） ４３．イヌリン（酸生産） ４４．ラクトース（酸生産） ４５．マルトース（酸生産） ４６．メレジトース（酸生産） ４７．ムチン酸（酸生産） ４８．ラムノース（酸生産） ４９．リボース（酸生産） ５０．デンプン（酸生産） ５１．トレハロース（酸生産） ５２．ツラノース（酸生産） ５３．キシロース（酸生産） ５４．パラチノース（酸生産） ５５．アセタミド（アルカリ性化） ５６．安息香酸（アルカリ性化） ５７．ギ酸（アルカリ性化） ５８．マレイン酸（アルカリ性化） ５９．ピルレート酸（アルカリ性化） ６０．マロン酸（アルカリ性化） ６１．アルビトール（酸生産） ６２．グルクロン酸（酸生産） ６３．尿素（アルカリ性化） ６４．マンニトール（酸生産） ６５．ラフィノース（酸生産） ６６．４−ＭｅＵ−β−Ｄ−キシロシド ６７．４−ＭｅＵ−β−Ｄ−グリコシド ６８．４−ＭｅＵ−β−Ｄ−マンノピラノシド ６９．４−ＭｅＵ−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ−ジアセチルチトビオシド ７０．４−ＭｅＵ−β−ガラクトシド ７１．ピログルタミン酸（ＡＭＣ） ７２．４−ＭｅＵ−フォスフェート（ｐＨ７−８） ７３．アドニトール（酸生産） ７４．アラビノース（酸生産） ７５．イノシトール（酸生産） ７６．マンノース（酸生産） ７７．シュクロース（酸生産） ７８．サラシン（酸生産） ７９．４−ＭｅＵ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド ８０．４−ＭｅＵ−β−Ｄ−グルクロナイド ８１．アルギニン（ＡＭＣ） ８２．グルタリル−グリシル−アルギニン（ＡＭＣ） ８３．プロリン（ＡＭＣ） ８４．４−ＭｅＵ−フォスフェート（ｐＨ６−７） ８５．デカルボキシラーゼバッファー ８６．Ｌ−リジン（アルカリ性化） ８７．Ｌ−オルニチン（アルカリ性化） ８８．メリビオース（酸生産） ８９．ソルビトール（酸生産） ９０．４−ＭｅＵ−α−ｄ−ガラクトシド ９１．４−ＭｅＵ−β−グルコシキド ９２．グルコース（酸生産） ９３．α−グルタミン酸（ＡＭＣ） ９４．γ−グルタミン酸（ＡＭＣ） ９５．チロシン（ＡＭＣ） ９６．Ｌ−トリプトファン（消光テスト） 本発明の実施に有用なペプチドのための例示的フルオロゲン基質はフルオロゲ ンへ接合したアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドである。適当なフルオロゲ ンの例は下の表VIIに示されており、そして特にβ−ナフチルアミンおよび７− アミノメチルクマリン（７−ＡＭＣ）を含む。ペプチターゼテストに使用するた め特に好ましいフルオロゲンは７−ＡＭＣである。フルオロゲン基質の製造およ び使用方法はこの分野では既知である。（例えば英国特許Ｎｏ．１，５４７，７ ４７およびＥＰＯ特許Ｎｏ．０，０００，０６３を見よ。） ペプチターゼアッセイに使用するのに適したペプチドおよびポリペプチドは長 さ約２ないし２０アミノ酸の間であり、そして１本鎖、分岐鎖または環状鎖形に 配置している。適当なアミノ酸は２０の普通のアミノ酸、すなわちアラニン、シ スティン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒス チジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリ ン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンお よびチロシンを含む。他の適当なアミノ酸は４−ヒドロキシプロリン、５−ヒド ロキシリジン、ε−Ｎ−メチルリジン、３−メチルヒスチジン、デスモシン、イ ソデスモシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ホモシステイン、ホモセリン、 カナバニン、ｄｊｅｎｋｏｌｉｃ ａｃｉｄおよびβ−シアノアラニンのような 繊維状タンパクおよびある種のカビおよび植物トキシンに発見されるような希も しくは非タンパクアミノ酸を含む。アミノ酸は所望に よりＤまたはＬ形でよい。ペプチドアッセイに使用するための基質の例は上の表 VIに示されている。 他の好ましい具体例において、本発明のユニバーサルテストパネルは好ましく はフルオロゲン法で実施される少なくとも一つのグリコシダーゼテストを含んで いる。この具体例においては、グリコシダーゼテストは少なくとも一つのフルオ ロゲン基質、好ましくはサンプル中のグリコシダーゼの存在下分裂されるフルオ ロゲン基質を含む。グリコシダーゼテストに使用のため適当なフルオロゲン基質 は、炭水化物、典型的には糖と適当なフルオロゲンの間の接合体である。適当な フルオロゲンの例は上の表VIIに記載した。特に好ましいフルオロゲンは４−Ｍ ｅＵである。グリコシダーゼテストに使用に適当な糖な約３ないし８個の炭素（ 例えば四炭糖、五炭糖、六炭糖または七炭糖）と、そして共有結合した糖単位約 ２ないし２０を含みそして分子量約３５０ないし４０００ダルトンのサッカライ ドおよびジサッカライドを含む。グリコシダーゼアッセイに使用のため適当な例 示的フルオロゲン基質は上の表VIに示されている。 他の具体例において、本発明のユニバーサルテストパネルは蛍光定量法で実施 される少なくとも一つの糖発酵テストを含む。この具体例においては、糖発酵テ ストはグリコシダーゼテストのための上に記載したような少なくとも一つの糖ま たはサッカライドと、そして少なくとも一つの蛍光定量指示薬を含む。適当な蛍 光定量基質の例は上の表VIに示されており、そして４−ＭｅＵを含む。好ましく は蛍光定量指示薬は約６ないし８のｐＨ範囲で蛍光を発することができる。特に 好ましくは蛍光定量指示薬は４−ＭｅＵである。このテストに使用するための追 加の基質は約１０⁴ないし１０⁶の間の 分子量を有するデンプンおよびグリコーゲンのようなポリサッカライドである。 糖発酵酵素テストに使用するための例示的基質は上の表VIに示されている。 他の具体例において、ユニバーサルテストパネルは蛍光定量法で実施される少 なくとも炭素利用テストを含む。この具体例においては、炭素利用テストは少な くとも一つの炭素源、好ましくは少なくとも一つの炭素源と少なくとも一つの適 当な蛍光定量指示薬、好ましくは一つの蛍光定量指示薬を含む。使用に適当な蛍 光定量指示薬は上の表VIIに示されてあり、そして４−ＭｅＵおよび他の化合物 を含む。特に好ましい蛍光指示薬は約５ないし７の範囲内のｐＨで蛍光を発する ことができるβ−メチルエスクレチンである。 炭素利用テストに使用に適当な炭素源はアルケン、アルキン、アルコール、エ ーテル、エステル、ニトリル、サルファイド、スルホン、チオール、ケトン、ス ルフォキシド、アルデヒドアミド、アミン、カルボキシル酸または安息香酸を含 む。炭素源は一般に約４ないし１５００の分子量を有する、直鎖、分岐もしくは 環状形の約２ないし１０炭素原子を含んでいる。好ましい炭素源は水溶液（例え ば生理食塩水またはＴｒｉｓおよびＨｅｐｅｓを含む緩衝溶液）に混和性であり 、そして非揮発性である。上の表VIは適当な炭素源の例を提供する。 本発明の好ましい具体例においては、テストシステムの基質はリジン（ＡＭＣ ），ロイシン（ＡＭＣ），メチオニン（ＡＭＣ），グリシルプロリン（ＡＭＣ） ，イソロイシン（ＡＭＣ），トレハロース，マルトース，Ｌ−トリプトファン（ ７−ＡＭＣ），４−ＭｅＵ−フォスフェート，β−Ｄ−キシロシド−４ＭｅＵ， ヒドロキシプ ロリン−ＡＭＣ，β−Ｄ−グルクロニド−４ＭｅＵ，チロシン（ＡＭＣ），４− ＭｅＵ−β−Ｄ−ガラクトシド，マンノース，スクロースおよびプロリン（ＡＭ Ｃ）を含んでいる。他の好ましい具体例においては、基質はフラクトース，グリ セロール，Ｌ−ヒスチジン７−ＡＭＣ，ピログルタミン酸（ＡＭＣ）および４− ＭｅＵ−β−Ｄ−グルコシドをさらに含む。なお他の好ましい具体例においては 、基質はＬ−セリン７−ＡＭＣ，セロビオース，アルギニン（ＡＭＣ）および４ −ＭｅＵ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドを含む。 上に記載した蛍光テストは、テスト中の蛍光産物を定量するための慣用の非破 壊的機器蛍光定量または蛍光計法によって検出される産物を生成する。例えば特 に好ましい自動機器はＤａｄｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｃａｎ Ｉｎｃ．から商業的に 入手し得るＭｉｃｒｏ Ｓｃａｎ Ｗａｌｋａｗａｙシステムである。しかしな がら本発明のユニバーサルテストシステムは他の商業的に入手し得る機器に使用 するために適応化できよう。 本発明の一具体例においては、ユニバーサルテストパネルは比色定量（クロモ ゲン）法で実施される少なくとも一つのテストを含んでいる。例えば、ここで記 載したペプチターゼ、グリコシダーゼ、糖発酵酵素または炭素利用酵素テストは 比色定量法（クロモゲン）法によって実施することができる。ピログルタミルア ミノペプチターゼ、Ｌ−アラニンアミノペプチターゼ、アリールペプチターゼ、 アリールアミダーゼのようなペプチターゼおよびβ−Ｄ−グルクロニダーゼ、β −Ｄ−ガラクトシダーゼ、−６−フォスフォ−Ｂ−Ｄ−ガラクトシド６−フォス フォガラクトヒドロラーゼ、α−Ｄ−ガ ラクトシダーゼ、ニューロアミニンダーゼ、α−アミラーゼ、α−グルコシダー ゼのようなグルコシダーゼ、およびＮ−アセチル（３−Ｄ−グリコサミニダーゼ 、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルサミニダーゼ、α−Ｄ−アラビノシダーゼ、β− Ｄ−フコシダーゼおよびβ−Ｄ−キシロシダーゼを検出するための多種類の比色 定量テストが知られている。さらに糖発酵酵素を検出するための比色定量テスト は良く知られており、そして本発明のテストシステムにおいて使用することがで きる。ユニバーサルテストパネルの使用に適した他の比色定量テストは、例えば ウレアーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、ヒドロラーゼ、ヒドロゲナーゼ、エ ステラーゼ、フォスフォターゼ、トリプトファナーゼ、キモトリプシンのような プロテアーゼ、オルニチンおよびリジンデカルボキシラーゼのようなデカルボキ シラーゼ、およびクエン酸サイクル中間体を同化することができる酵素を検出す るための既知のテストを含む。上に記載したように、そのようなテストは本発明 のユニバーサルテストシステムに使用するため適応化され、そして確率解析を使 用してテストされることができる。 本方法に使用するに適した比色定量テストは種々の検出法で実施することがで きる。例えば、ある場合にはクロモゲンを含む基質は直接検出法において使用れ さる。この場合、クロモゲン基質は、例えばｏ−ニトフェノール、ｍ−ニトロフ ェノールもしくはｐ−ニトロフェノールのエステル、インドシキルもしくは５− ブロモ−４−クロロ−３−インドリルのエステル、またはｐ−ニトロアニリノア リールペプチド誘導体を含むことができる。クロモゲンの遊離が比色定量ステト で直接検出される。しかしながら他の場合には、比色 定量テストは適当な試薬を介する間接検出法で実施するのが望ましい。そのよう なテストの例は、無機酸素反応産物（例えば硝酸塩）とスルファニル酸のような 無機酸およびα−ナフチルアミンとの化学反応を含む。他の場合には、比色定量 テストはテスト中のｐＨ変化を検出するｐＨ依存性指示薬分子を使用する間接法 で実施するのが望ましい。そのような分子の例はブロモチモールブルーおよびフ ェノールレッドを含む。他の適当な比色定量テストは例えばクロモゲンペプチダ ーゼテストにおいてβ−ナフチルアミドを含んでいるクロモゲン基質からβナフ チルアミンの遊離を検出するためｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドを使用 する。なお他の場合には、適当な比色定量テストはアッセイ感度を高めるためジ アゾ化合物とのｐ−ニトロアニリン誘導体の反応を含むことができる。 特に、Ｐｒｏｔｈｅｃａ，およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌ ｕｓ ｓｐ．， Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓおよびＧａ ｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓのようなイーストおよびイースト様微 生物の検出および同定のためのいくつかの比色定量テストが開示されている。 下の表VIIIは比色定量テストに使用するため適当なクロモゲンの例を提供する 。 従って本発明の好ましい一具体例においては、ユニバーサルテストパネルは、 好ましくは蛍光法で実施されるペプチダーゼ、グリコシダーゼ、糖発酵酵素およ び炭素利用テストの各自を検出するための少なくとも一つのテストと、そしてウ レアーゼ、デカルボキシラーゼ好ましくはオルニチンデカルボキシラーゼおよび リジンデカルボキラーゼ、エステラーゼおよびトリプトファナーゼの各自を検出 するための少なくとも一つの比色定量テストをさらに含んでいる生化学テストを 含んでいる。これらのテストはテストシステムの意図した用途に応じて種々の態 様に組合わせることができる。 本発明の一つの好ましいテストシステムは、少なくとも一つのペプチターゼお よび少なくとも一つのグリコシダーゼのためのテストを含む。他の好ましいテス トシステムは少なくとも一つの糖発酵酵素のためのテストをさらに含む。なお他 の好ましいシステムはウレアーゼ、デカルボキシラーゼ、エステラーゼまたは炭 素利用酵素またはそれらの組合わせのための少なくとも一つのテストをさらに含 む。 本発明の他の一具体例においては、ユニバーサルテストパネルはカタラーゼ、 グルタミン酸もしくはアルギニンデカルボキシラーゼのようなデカルボキシラー ゼ、アルギニンデアミダーゼのようなアミノ酸デアミダーゼ、リピダーゼ、ピロ フォスフェートジエステラーゼ、ＤＮＡアーゼ、オキシダーゼ、アリールスルフ ァターゼ、またはアセトイン／ジアセチル産生酵素を検出するための少なくとも 一つのテストを含んでいる生化学テストを含む。この具体例においては、テスト は所望により比色定量または蛍光検出法によって実施される。 ここで使用する“あらかじめ定めた”なる用語は、ある生化学反応がＤＦＡま たは線状回帰のような既知の統計学的手法に従って選定されていることを意味す る。好ましい統計学的手法の例は実施例３に提供されている。従って、ここで使 用する“あらかじめ定めた生化学テストのバッテリー”は、適切な統計学的手法 によって選定された生化学テストの群である。 以下の非限定的実施例は本発明の例証である。 実施例１ ユニバーサルテストシステム 本発明に使用する基質は種々の方法で調製することができる。一般に、基質処 方は５ないし９のｐＨ範囲の便利なバッファー例えばＴｒｉｓまたはＨｅｐｅｓ 中に使用のために設計される。基質およびバッファーシステムの特定の量および 濃度は特定の生化学テストのＶｍａｘを最適化するように選定される。 さらに詳しくは、ペプチターゼテスト基質は約０．０１ないし１．０ｍＭの最 終濃度を持つように選定される。約０．１ないし１．０ＭのＴｒｉｓ濃度におい てＴｒｉｓ（例えばＴｒｉｓリン酸塩）のような適当なバッファーにおいて、好 ましくはペプチターゼテストに対し、ｐＨ範囲は約７．５ないし８．５である。 基質は必要に応じ水、バッファーまたはＤＭＳＯのような許容し得る溶液中に溶 解される。グリコシダーゼテストのための基質処方は、基質濃度が一般に約０． １ないし３．０ｍＭであり、そしてｐＨが約７ないし８であることを除いて同様 なやり方で設計される。炭素利用およびデカルボキシラーゼテストに対しては、 テストをデカルボキシラーゼバッファー中で実施することが好ましいが、もし望 むならぼ、ＴｒｉｓまたはＨｅｐｅｓバッファーのような他のバッファーを使用 することができる。デカルボキラーゼバッファーは、イーストエキス（約０．１ ないし１０％ｗ／ｖ），ペプトン（約０．１ないし１．０％ｗ／ｖ），ピリドキ シル−５−ＰＯ₄（約０．０１ないし０．１ｍＭ），１０％ｗ／ｖグリセロール ストック（約０．５ないし２％ｗ／ｖ），０．０２Ｍ４−β−メチルエスクレチ ン（約０．１ないし１ｍＭ），フタル酸（約１．０ないし１０．０ｍＭ），ｐＨ ５ないし６を組合わせることによって処方され、アミノ酸または炭素源は約０． ５ないし５％ｗ／ｖである。 糖（酸生産）テストは典型的にはｐＨ約７ないし８においてＨｅｐｅｓバッフ ァーまたは他の適当なバッファー（約０．５ないし２．５ｍＭ）中において実施 される。テストの他の成分は１リットルの蒸留脱イオン水中、４−ＭｅＵ（約０ ．０１ないし０．２５ｍＭ），ペプトン（約０．０１ないし０．５％ｗ／ｖ）， 糖（約０．０５ないし２％ｗ／ｖ）を含む。 表VIはユニバーサルテストシステムに使用のため例示的基質をリストする。以 下のセクション（Ａ〜Ｄ）は本発明の特に好ましい基質の処方を記載する。 一具体例において、基質はウエル（反応チャンバー）が例えば直線列に配列さ れたマイクロタイタートレーのようなテストパネル内に配置される。 基質の各自は蛍光または比色定量法で実施された一つの生化学テストに使用さ れた。各テストの結果は標準的統計学的手法に従って処理され、標準微生物培養 技術を使用して、微生物の多数の群を同定するためデータベースと比較された。 一般に、使用したデータベースは、例えばサンプル中の同定すべき微生物のすべ ての群または ファミリーのメンバーを含む単一のデータベースとして構成した確率行列であっ た。代わりに（または追加して）、データベースはサンプル中の微生物の特定の 群またはファミリーに特異的てサブデータベースのシリーズとして構成した確率 行列である。本発明に従って使用のため良く知られた標準的統計学的方法がデー タベースの構築に使用された（例えば以下の実施例３を見よ）。 一般に、ユニバーサルテストパネルのウエルに分配するための基質処方は適当 な最終体積へテストパネルの各ウエル中に調製され、その後溶液は環境温度にお いてウエル中で乾燥された。テスト処方中の成分を希釈もしくは濃縮することに より、分配体積を比例的に減少または増加することができる。最も多くの場合、 処方は分配前濾過滅菌され、そして冷蔵された。 Ａ．フルオロゲンペプチターゼテスト ペプチターゼＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）が調製された。溶液はｐＨ７ 〜９へ調節された。 上の表VIの基質１〜１３については、約０．１〜０．３ｍＭ溶液としてジメチ ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に以下の溶液がつくられた。基質はＳｉｇｍａま たはＢｉｏｓｙｎｔｈから得た。各溶液の約５ｍｌを分配チューブ中に入れた。 溶液をペプチターゼＴｒｉｓバッファーで５００ｍｌへもたらした。基質９５に ついては、ＴＹＲ濃縮物を約０．０１〜０．０２ｇのチロシン（ＡＭＣ）をＤＭ ＳＯ ５ｍｌ中に混合することによってつくった。基質８３については、約８〜 １０ｍｇのプロリン（ＡＭＣ）を約５ｍｌのＤＭＳＯへ加えた。各分配チューブ は栓をし、数回反転し、次に棚に収めた。 上の表VIの基質１４〜２５は、基質をペプチダーゼＨｅｐｅｓバッファー（ｐ Ｈ８．０）中に希釈したことを除き、実質上基質１〜１３と同じに調製した。バ ッファー成分を溶解した後、溶液はｐＨ約７〜９に調節された。 Ｂ．フルオロゲングリコシダーゼテスト 上の表の基質２６〜３４は、ＤＭＳＯ中約０．９ｍＭないし約１．８ｍＭ溶液 として調節された。これら基質の各自はＳｉｇｍａから得た。 各基質溶液約５ｍｌをグリコシドバッファー（下を見よ）と共に分配チューブ へ加えた。グリコシダーゼリン酸カリウムバッファーは脱イオン水へＴｒｉｚｍ ａ塩基および一塩基性リン酸カリウムを加えることによって調製された。溶液を 混合し、そしてｐＨ約７〜７．８へ調節した。濃縮物約５ｍｌはこのバッファー で約５００ｍｌへ希釈された。 基質７０については、ＢＧＡＬ濃縮物はＤＭＳＯ約５ｍｌへ約０．３ないし０ ．５ｇのＭｅＵ−β−ガラクトンドを加えることによって調製された。基質７０ については、この溶液約２〜３ｍｌが加えられ、そしてグリコシダーゼバッファ ーで最終体積約５００ｍｌへもたらされた。基質７６および７７については、糖 ストック溶液は水約１リットル中約３〜５ｇのマンノースまたはスクロースを加 えることによって調製された。 Ｃ．蛍光定量糖発酵酵素テスト 上の表VIの基質３５については、２Ｘアルブチンストック溶液は脱イオン水４ ０ｍｌ中約１〜２ｇのアルブチン（Ｓｉｇｍａ）を混合することによって調製さ れた（ＡＲＢストック）。ＡＲＢストッ ク約２０ｍｌを分配チューブへ入れ、それへ糖バッファー約１２．５ｍｌを４− ＭｅＵストック溶液２ｍｌと共に加えた。溶液は水蒸気滅菌した脱イオン水で約 ５００ｍｌの最終体積へもたらされた。糖バッファーは脱イオン水１リットルへ 一塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、ペプトン水を混合すること により調製された。成分が混合され、約７〜８のｐＨへもたらされた。ペプトン 水溶液は約１０ｍｌの脱イオン水中ペプトン水１ｇを混合することによって調製 された。ＭｅＵストックは脱イオン水２０ｍｌ中メチルウンベリフェロン−４ナ トリウム約０．１ｇを混合することによってつくられた。基質３６はＡＭＣ対照 レーンである。 上の表VIの基質３７〜５４については、以下の２Ｘ糖ストック溶液は脱イオン 水約４０ｍｌ中以下の糖約１〜２ｇを個々に混合することによりつくられた。ズ ルシトール、エリスリトール、フラクトース、ガラクトース、グリセロール、イ ヌリン、マルトース、ラクトース、マレジトース、ラムノース、リボース、トレ ハロース、ツラノース、キシロースまたはパラチノース。糖の各自はＳｉｇｍａ から得た。 上の表VIの基質４７は、脱イオン水約４００ｍｌと５Ｎ ＮａＯＨ約２ｍｌ中 ムチン酸約１〜２ｇを混合することによってつくった。基質５０については、２ Ｘデンプン（ＳＴＡ）ストックは水約４４５ｍｌ中Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ−１０ ４（１０％溶液）とデンプン（Ｂａｋｅｒ）約０．５〜１ｇを混合することによ って調製された。 上の表VIの基質４７〜５０を除いて、各２Ｘ糖ストック溶液約２０ｍｌを分配 チューブへ加え、次に糖ベースストック約１２．５ｍ ｌと、次に蒸留脱イオン水中ＭｅＵストック２ｍｌを加え約５００ｍｌとした。 基質４７については、ＭＵＣストック溶液約４００ｍｌを分配チューブへ加え、 次に糖バッファーストック約１２．５ｍｌとＭｅＵストック２ｍｌを加えた。溶 液は水蒸気滅菌した蒸留水で約５００ｍｌへもたらされた。基質５０については 、ＳＴＡストック約４２５ｍｌを分配チューブへ加え、次に糖バッファー溶液約 １２．５ｍｌおよびＭｅＵストック約２ｍｌを加えた。溶液は水蒸気滅菌した蒸 留水で約５００ｍｌへもたらされた。 Ｃ．蛍光定量炭素利用テスト 上の表VIの基質５５〜６０は適切な炭素源のストック溶液をつくることによっ て調製された。各ストック溶液はデカルボキシラーゼベースバッファー約６００ ｍｌ中に以下の炭素源の約１２ｇを加えることによって調製された：アセタミド 、安息香酸、ギ酸、マレイン酸、ピルビン酸およびマロン酸。炭素源の各自はＳ ｉｇｍａから得た。デカルボキシラーゼベース溶液は脱イオン水約２７００ｍｌ 中イーストエキス約９〜１０ｇ，β−メチルエスクレチン２Ｘストック溶液約７ ０ｍｌ，プロテアーゼペプトン−３の約１０〜２０ｇ，１０％グリセロール約３ ００ｍｌ，およびフタル酸（カリウム塩）約２〜４ｇを混合したストック溶液を つくることによって調製された。２Ｘβ−メチルエスクリンストック溶液は２− メトキシエタノール約４００ｍｌおよび脱イオン水約６００ｍｌ中４−メチルエ スクリン約３〜４ｇを混合することによって調製された。成分を溶解し、ｐＨ５ 〜６へ調節した。基質５５〜６０については、適切な溶液５００ｍｌを分配チュ ーブへ加え、そして分配した。 Ｅ．追加テスト 多種類の生化学テストが報告されている（例えば前出Ｂａｓｃｏｍｂ，ｓおよ び前出Ｍａｎａｆｉ，ｅｔ ａｌ．を見よ）。本発明に従った使用に適当なテス トはここに記載した方法を実施することによって選択される。実施例３を見よ。 好ましい具体例において、追加のテストは以下のテストを含む。 ｉ）ウレアーゼ：ｐＨ変化およびアンモニア産出を含む、ウレアーゼを検出する ための多種類の方法が報告されている。例えばＧｏｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，（ １９８１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３，４８３；および前出Ｂ ａｓｃｏｍｂ．ｓ．を見よ。 ii）トリプトファナーゼ（インドールテスト）：比色定量テストおよび蛍光消光 に基づくテストを含む、トリプトファナーゼを検出するためのいくつかの方法が 報告されている。例えば、好ましくはトリプトファナーゼテストは以前に記載さ れている。例えばＭｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，ここに全体を参照として取入れ る米国特許Ｎｏ．５，１７３，４３４を見よ。また前出Ｂａｓｃｏｍｂ，ｓ．を 見よ。 iii）エステラーゼおよびデカルボキシラーゼ：エステラーゼテストは蛍光テス トを含むいくつかの方法で実施することができる（例えば前出Ｍａｎａｆｉ，ｅ ｔ ａｌ．を見よ）。デカルボキラーゼのための多種類のテストが記載されてい る（例えば前出Ｂａｓｃｏｍｂ，ｓ．を見よ）。好ましい具体例においては、オ ルニチンおよびリジンデカルボキシラーゼテストがｐＨを増加する塩基性アミン の生成をアッセイすることによって実施され、そして４−メチルエスクレチンの ような蛍光定量ｐＨ指示薬によって検出される。他の具 体例においては、デカルボキシラーゼテストは良く知られてた比色定量法におい て実施される（例えばＭａｃＦａｄｄｉｎ，Ｊ．Ｆ．（１９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄ ｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗ ｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎを見よ）。 使用において、ユニバーサルテストパネルはテストすべきサンプルの約１０⁴ ないし１０⁸ＣＦＵ／ｍｌで接種され、そして３５℃においてＷａｌｋａｗａｙ （Ｗ／Ａ）機器に入れられる。サンプルデータは４０分（ベースライン），１２ ０分および１４０分の読み時間でＷＡＤＥＶ研究ソフトウエアを用いて収集され る。接種濃度はパネル上のウエルをＲＥＮＯＫ^TMハイドレーター／イノキュレー ターで接種した後０．０８±０．０１Ａｒｔｅｌ読みに調節される。各酵素テス トの結果はサンプル中の微生物を検出しそして同定するため統計的手法を用いて ＩＤ行列を通じて処理される。好ましい統計学的手法はＢａｙｅｓｉａｎ確率解 析である。以下の実施例において、サンプルの検出および同定は選択されたイー ストおよび細菌種の純粋培養物を用いる前もってつくったデータベースに基付い ている。 Ｆ．品質管理 ユニバーサルテストの品質管理試験は毎週そしてある場合には毎日実施した。 データベース単離物のためのすべてのサブカルチャーは純度について厳しくチェ ックされ、そして汚染されているプレートはどれも再培養された。テストの間、 粗データは厳しく検討され、問題ある結果、例えばウエルの蛍光の欠除、試薬無 添加、特定の 株が同じ種の他のすべてと劇的に相違することはデータベースの含める前にくり 返されるかまたは確認するように、データベース品質を確実するためのあらゆる 努力がなされた。 ユニバーサルテストパネルは、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ ＲＮＩＤ２，ＲＰＩＤ， ＨＮＩＤ，Ｒａｐｉｄａｎａｅｒｏｂｅおよびイーストテストパネルを含む多種 類のＱＣ単離物でテストされる。下表IXはユニバーサルテストパネルに使用する ための適当なＱＣ微生物の例をリストする。適当なＱＣ微生物の追加の例はＫ． ｏｘｙｔｏｃａ；Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉ；Ｓｈ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ；Ｅ ．ｃｏｌｉ；Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ；Ｐ．ｖａｌｇａｒｉｓ；Ｐｓ．ｆｌ ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ；Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含む。典型的には食塩水が ユニバーサルテストパネル上にテスト結果を評価するベースラインを確立するた め含められる。 実施例２ データベースの構築 このユニバーサルテストに使用のため適当なデータベースを構築するためイー ストおよび細菌のような多種類の微生物を使用することができる。例えば以下の 微生物の群が適当なデータベースを構築するために使用された。 この特定のデータベースの内訳は以下のとおりである。ＡＮＡＥＲＯＢＥ（５ ４種），偏好菌（２１種），ＥＮＴＥＲＯＣＯＣＣＩ（１０種），ＳＴＡＰＨＹ ＯＣＯＣＣＩ（２８種），ＳＴＲＥＰＴＯＣＯＣＣＩ（１４種），イースト（４ ２種） イーストおよび細菌の上で述べた種を使用してデータベースを構築するため、 各種からの約３０の単離物（〜３３８単離物）は実施例３に開示されているよう な良く知られた統計学的手法によって同定された生化学テストのバッテリーでテ ストされる。テストの結果は次に、同定すべきすべてのファミリーのメンバーを 含む単一データベースか、または各ファミリーに特異的なサブデータベースのシ リーズよりなるデータベース（確率行列）にフォーマット化される。 実施例３ ユニバーサルテストパネルのためのテストの組合わせを選定するため の例示的方法 表VIの９６の非冗長基質が以下記載のように確率行列を発生させるために使用 された。 ａ）細菌単離物および調製物：慣用のＩＤＳを有する細菌がＭｉｃｒｏＳｃａ ｎストック培養物からテストされた。 ストック株はテスト前に純度および生存性を確かめるため２回サブカルチャー された。テストされた単離物の大部分は生育選択性寒天プレート（例えばグラム 陰性細菌に特異性のＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天）上で生育され、３５℃で約１８〜 ２４時間インキュベートされた。生育選択性寒天の一つのタイプ上で生育しなか つた単離物は他の培地で生育された（例えばグラム陰性細菌に対して５％ヒツジ 血液を補給したトリプチカーゼ大豆寒天プレート上で３５℃におい て非ＣＯ₂インキュベート中１８〜２４時間）。 細菌サスペンジョンはＰｌｕｒｏｎｉｃ添加０．４％食塩水６．５ｍｌを収容 する個々のチューブ中にＭｉｃｒｏＳｃａｎ濁度計を使用して０．５ＭａｃＦａ ｒｌａｎｄ標準に相当する密度に調製された。同じ単離物を収容する４本の別々 のチューブが単一のＲｅｎｏｋ^TMトレーにプールされ、そしてＭｉｃｒｏＳｃａ ｎ Ｒｅｎｏｋ^TM Ｒｅｈｙｄｒａｔｏｒ接種装置を使用して接種された。パネ ルへ接種物の分配後、鉱油３滴が選択されたテストへ添加された。パネルは次に 当初の接種からチューブ中へ３５℃において３０分以内のインキュベーションの ためＷａｌｋｗａｙシステムに入れられた。 ｂ）データ収集および解析：二つのＭｉｃｒｏＳｃａｎ^TM ＷａｌｋＡｗａｙ Ｃｌａｓｓｉｃシステム、四つのＷａｌｋＡｗａｙ^TM９６システム、および一 つのＷａｌｋＡｗａｙ^TM４０がすべての４回のテストにおいてこれらパネルをイ ンキュベートし、そして読むために使用された。データはＭｉｃｒｏＳｃａｎ研 究データ取得ソフトウエアを使用して集められ、これはＷａｌｋＡｗａｙに見ら れるデータ管理システム（ＤＭＳ）より多いデータポイント、すなわち０分，４ ０分，１２０分および１４０分を収集することを許容する。各機器はＭｉｃｒｏ Ｓｃａｎ較正パネルを使用して毎週２〜３回較正された。研究ソフトウエアにお いて人工蛍光単位（ＡＦＵ）として集められた粗データは、次に慣用のフロッピ ーディスクを用いてＡＳＣＩファイルフォーマットにおいて統計学的解析ソフト ウエア（ＳＡＳ）へ移された。 前に記載した生化学テストが標準的Ｂａｙｅｓｉａｎ確率解析に 従って正確な，完全なそして信頼性あるデータベースを発生させるために使用さ れた。 ｃ）確立行列の構築：同定一致はもし酵素テストの組合わせが種レベル（また は組合わせた種で＞８５％（好ましくは９０％または９５％）の正常化した確率 で正しく同定し、そしてこの同定が参照同定と一致したならば発生する。これは “種一致高確率”と考える 確率で得られなかったが、しかし低い確率で可能性ある同定（２〜５分類群の一 つであるとして正しい種が見えるならば、それは“種一致低確率”と考え、そし て種同定を確認する追加のテストが必要になる。この場合には、追加の酵素テス トはテストする種をさらに完全に区別するために実施される。 “不正確同定”はこれらの基準を満たさなかった。“非常にまれな生物型”は 、もし６１ないし９６のテストの組合わせがもっとそれらしい分類群について期 待される結果から過剰な偏差を示すならおいて種レベルの同定を与えないが、しかし同じ属／群のメンバーについての確 率の和が＞８５％であったならば得られる。 すべてのデータはＳＡＳソフトウエアを用いて処理され、解析された。データ ベーステストの間集められた粗データは、以下の式を用いてインドールおよびデ カルボキシラーゼテストを除くすべてのテストのための率値に換算される。 率＝（最終蛍光−初期蛍光）／時間×１００ デカルボキシラーゼテストについては、同じ式が初期率を計算するために使用 される。しかしながらオルニチンまたはリジンについ ての最終率を計算するためにデカルボキシラーゼベースについての率が減算され る。インドールテストについては、ジメチルシンナムアルデヒト（ＤＭＣＡ）が インドールテストウエルおよび蛍光対照ウエルの両方へ２時間時点で加えられ、 そして読みは２時間２０分の時点で取られた。率は以下の式を用いてこのテスト のために与えられた。 インドール率＝蛍光対照ウエル−インドールウエルの蛍光 すべての粗および反応率はエラー、例えば二重エントリ、タイプエラーまたは 微生物汚染を示唆する誤結果について再検討された。 エラーが発生した時、反復または確認テストがデータベースへ含める前に実施さ れた。 個々の反応率は次にデータベース中の各単離物について評価された。これら定 量的率は単離物間および単離物内変動のインパクトを減らすため定性的データに 変換された。一般に、反応率プロフィルは特異性テストについては二モードまた は三モードである。すなわちある分類群は皆無のまたは低い反応率を持っている が、他の分類群は中程度または高い反応率値を持っている。多数の統計学的技術 およびＳＡＳプログラミンク言語を使用し、個々のテストについて反応率が評価 され、そして数値率値（区切点）が正および負の結果を区別するため与えられた 。各テストについて、異なる区切点値において“分離図”（Ｇｙｌｌｅｎｂｅｒ ｇ，１９６３；Ｒｙｐｋａ ｅｔ ａｌ．，１９６７；Ｌａｐａｇｅ ＆ Ｂａ ｓｃｏｍｂ，１９６８；Ｌａ ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９７０）がデータベ ース分類群全体またはその一部を考える時に、そして食塩水接種パネルについて 観察された率が区切点の選定のために考慮された。二 モードテスト結果については、もし単離物の反応率がこの値を上まわれば、テス トは正とスコアされ、またはもし反応率がこの値より下であれば、テストは負と スコアされる。 個々のテストについて区切点を与えた後、グラム陰性菌に対するテストの組合 わせからの結果は定量的から定性的な正または負の値へ変換された。テストの異 なる組合わせを用いて、確率行列の異なるセット（Ｂａｓｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ ．，１９７３）が次に構築される。確率行列の異なるセットは、テストされたす べての単離物を正確に同定する能力について、そして各確率行列内の個々のテス トが分離能力、すなわち種を区別する能力にどのように貢献するかについて、Ｂ ａｙｅｓｉａｎ確率同定モデル（Ｗｉｌｉｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９７３）を 用いて評価された。さらに、テストは製造容易性、長い貯蔵寿命、パネル準備に おける許容できる変動、および油オーバーレイの排除についても評価された。こ れらの基準の全部を使用し、上に述べた一致スコアを満足する３６テストが選択 された（例えば表VIの６１〜９６を見よ）。 次に組合わせテストの精度が評価された。全体として、同定合格（高確率同定 ）のための８５％正規化確率カットオフを用い、システムは２時間２０分におい て９８．８％の組合わせ精度（種に対して９３．９％正確、属に対して１．２％ 正確、および追加テストで種に対し３．６％正確）を持っている。８５％の代わ りに９０％正規化確率カットオフを用いるこれら同じテータの検査は種レベルへ 同定された少数の単離物（３０単離物，０．９％）と、同時に追加のテストを必 要とする種レベルへ正確に同定された単離物の増加（３３単離物，１．１％）を もたらしたが、しかし正確でない同定の 数を有意に減少しなかった（４単離物，０．１％）。この理由のため、８５％正 規確率が同定合格のためのカットオフ値として選定された。 臨床的に有意義な単離物（２４の頻繁に発生する種を含む）については、組合 わせ酵素テスト６１〜９６は組合わせ精度９９．４％（すなわち追加テストなし で種に対し９７．５％正確、属に対して１．０％正確、および追加テストありで ０．９％正確）を持っている。 さらにこのテストの組合わせでテストしたすべてのグラム陰性発酵種について のデータベース結果は組合わせ精度９８．８％（追加テストなしで種に対し９６ ．５％正確、属に対し１．１％正確、追加テストありで種に対し１．２％正確） を示した。全体としてこのシステムは９８．１％の組合わせ精度（種に対して８ ６．５％正確、属レベルに対して１．４％正確、そして追加テストありで種に対 して１０．２％正確）を持っていた。 このテストの組合わせは２時２０分で２４の臨床的に有意義な種を含む、１１ ９の分類群（発酵種８５および非発酵種３４）を同定する。さらに、すべての臨 床的に有意義な分類群のたった０．１％（臨床検査室で普通に遭遇する１００単 離物の１以下）と、データベース中のすべての単離物の３．７％が最終の現在の 同定に対する追加テストを必要とする。 本発明の原理、好ましい具体例および作業形態を以上の明細書に記載した。し かしながら保護されることを意図する本発明は開示された特定の形へ制限される と解すべきではない。これらは制限ではなく例証と考えるべきであるからである 。当業者は本発明の精神か ら逸脱することなく変更を加えることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプル中に存在し得る広く分岐した微生物の少なくとも二つの群の中か らある微生物を同定することができる、サンプル中の微生物を同定するためのシ ステムであって、 あらかじめ定めた数の反応チャンバー中に配置された非冗長生化学テストのあ らかじめ定めた組合わせを含み、めいめいの生化学テストはある酵素または酵素 群のための基質を含み、該基質はもしその酵素または酵素群が作用すれば反応チ ャンバー中に検出可能な産物の生成をもたらし、そして 生化学テストの組合わせからの検出可能な産物がサンプル中の微生物を同定す るために使用される ことを特徴とする前記テストシステム。 ２．微生物の同定は微生物の属または種またはその両方へ分類する請求項１の テストシステム。 ３．非冗長テストのあらかじめ定めた組合わせは蛍光テスト、比色定量テスト またはその組合わせを含む請求項１のテストシステム。 ４．蛍光テストはフルオロゲン法または蛍光定量法で実施される請求項３のテ ストシステム。 ５．非冗長テストのあらかじめ定めた組合わせは約１５分ないし約８時間内で 実施される請求項３のテストシステム。 ６．非冗長テストのあらかじめ定めた組合わせは約２５ないし約３７℃の温度 において実施される請求項１のテストシステム。 ７．比色定量テストは内眼によりまたは比色計によって読取られ る請求項６のテストシステム。 ８．蛍光テストは蛍光計を使用して読取られる請求項４のテストシステム。 ９．ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、糖発酵酵素、ウレアーゼ、デカルボキシ ラーゼ、エステラーゼ、炭素利用酵素、フォスファターゼまたはトリプトファナ ーゼを検出するための少なくとも一つのテストを含んでいる請求項１のテストシ ステム。 １０．少なくとも一つのペプチターゼおよび少なくとも一つグリコシダーゼの ためのテストを含んでいる請求項９のテストシステム。 １１．少なくとも一つの炭素発酵酵素のためのテストをさらに含んでいる請求 項１０のテストシステム。 １２．少なくとも一つのウレアーゼのためのテストをさらに含んでいる請求項 １１のテストシステム。 １３．少なくとも一つのデカルボキシラーゼのためのテストをさらに含んでい る請求項１２のテストシステム。 １４．少なくとも一つのエステラーゼのためのテストをさらに含んでいる請求 項１３のテストシステム。 １５．少なくとも一つの炭素同化酵素のためのテストをさらに含んでいる請求 項１４のテストシステム。 １６．非冗長生化学テストのあらかじめ定めた組合わせは、腸内細菌および非 発酵細菌；嫌気性細菌，イースト；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．また はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ ；および偏好性細菌の少なくとも二つの間で微生物を同定することが可能である 請求項１のテ ストシステム。 １７．非冗長生化学テストのあらかじめ定めた組合わせは、Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．とそしてＥｎｔｅ ｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｕａ ｓｐ．；Ｌａｃｔｏ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．；Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；Ｌｅｕｃｏｎｏ ｓｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；Ａｌｌｏｉｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；Ｖａｇｏｃｏ ｃｃｕｓ ｓｐ．；Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｓｐ．；Ｌｅｍｉｎｏｒｅｌｌａ ｓｐ ．；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．；Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｓｐ．；およびＬｉｓｔｅ ｒｉａ ｓｐ．の少なくとも一つの間で微生物を同定することが可能である請求 項１のテストシステム。 １８．非冗長生化学テストのあらかじめ定めた組合わせは、嫌気性菌、イース トまたは偏好性細菌の間で微生物を同定することが可能である請求項１のテスト システム。 １９．非冗長生化学テストのあらかじめ定めた組合わせは、嫌気性菌およびイ ースト、または偏好性細菌の間で微生物を同定することが可能である請求項１の テストシステム。 ２０．非冗長生化学テストのあらかじめ定めた組合わせは、イーストおよび偏 好性細菌の間で微生物を同定することが可能である請求項１のテストシステム。 ２１．非冗長生化学テストのあらかじめ定めた組合わせは、Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの 少なくとも一つ、および嫌気性菌、イー ストおよび非発酵菌または偏好性細菌またはそれらの組合わせの少なくとも一つ の間で微生物を同定することが可能である請求項１のテストシステム。 ２２．テストシステムはイースト、嫌気性細菌および偏好性細菌の間で同定す ることが可能である請求項１のテストシステム。 ２３．テストシステムはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ ｃｕｓ，またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；嫌気性細菌；イースト；および偏 好性細菌を同定することが可能である請求項１のテストシステム。 ２４．基質はリジン（ＡＭＣ），ロイシン（ＡＭＣ），メチオニン（ＡＭＣ） ，グリシルプロリン（ＡＭＣ），イソロイシン（ＡＭＣ），トレハロース，マル トース，Ｌ−トリプトファン（７−ＡＭＣ），４−ＭｅＵ−フォスフェート，β −Ｄ−キシロシド−４ＭｅＵ，ヒドロキシプロリン−ＡＭＣ，β−Ｄ−グルクロ ニド−４ＭｅＵ，チロシン（ＡＭＣ），４−ＭｅＵ−β−Ｄ−ガラクトシド，マ ンノース，スクロース，およびプロリン（ＡＭＣ）を含んでいる請求項１のテス トシステム。 ２５．基質はフラクトース，グリセロース，Ｌ−ヒスチジン７−ＡＭＣ，ピロ グルタミン酸（ＡＭＣ）および４−ＭｅＵ−β−Ｄ−グルコシドをさらに含んで いる請求項２４のテストシステム。 ２６．基質はＬ−セリン７−ＡＭＣ，セロビオース，アルギニン（ＡＭＣ）お よび４−ＭｅＵ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドをさらに含んでいる 請求項２５のテストシステム。 ２７．請求項１のテストシステムの使用により、サンプル中に存在し得る広く 分岐した微生物の少なくとも二つの群の中からある微 生物を同定する方法であって、 ａ）ある基質を含んでいる各反応チャンバーへサンプルを加え、 ｂ）もし存在すれば酵素が該基質と反応することを許容し、 ｃ）テスト中の検出可能な産物を検出することによってサンプル中の酵素の存 在を測定し、 ｄ）あらかじめ定めたテストの組合わせの結果を少なくとも一つのあらかじめ 定めた標準と比較し、サンプル中の微生物を同定することを含む前記方法。 ２８．微生物による炭素源利用を検出するためのテストであって、少なくとも一 つの炭素源および少なくとも一つ蛍光定量指示薬を含み、微生物は指示薬の蛍光 の変化を生ずるｐＨ変化を発生するように炭素源に作用し、蛍光変化は微生物の 炭素源利用の指標である前記テスト。