JP2000512666A

JP2000512666A - 細胞培養および移植用の多糖スポンジ

Info

Publication number: JP2000512666A
Application number: JP09541956A
Authority: JP
Inventors: シャピロ，リリア; グリクリス，ラチェル; コーヘン，スマダー
Original assignee: ベン―グリオンユニバーシティーオブザネゲブ
Priority date: 1996-05-22
Filing date: 1997-05-21
Publication date: 2000-09-26
Also published as: US6793675B2; ATE249251T1; DE69724780T2; AU714647B2; DK0901384T3; US20030078672A1; US6334968B1; US6425918B1; CA2256327C; ES2206707T3; EP0901384B1; PT901384E; IL118376A0; EP0901384A1; CA2256327A1; DE69724780D1; AU2711797A; WO1997044070A1

Abstract

(57)【要約】 (ｉ)平均細孔径が約10μｍ〜約300μｍの範囲であり、(ii)細孔の壁厚である細孔間の平均距離が約５μｍ〜約270μｍの範囲であり、そして(iii)多糖スポンジの剛性の尺度であるＥ-弾性率が約50kPa〜約500kPaの範囲であることを特徴とする多糖スポンジ。

Description

【発明の詳細な説明】細胞培養および移植用の多糖スポンジ発明の利用分野本発明は、新規な生物再吸収性の多糖スポンジ、その製造方法、および哺乳動物細胞のin vitro培養のためのその使用、ならびに損傷を受けたまたは切除された組織を置換するために患者に埋め込むためのマトリックス、支持体または足場としてのその使用に関する。多糖スポンジインプラントは、周囲の宿主組織がそれに侵入し、その上で増殖し、最終的に埋め込みが行われた組織または器官の活動的な部分を形成するための基体、マトリックスもしくは足場として役立つか、または該インプラントは周囲の宿主組織からの血管新生のための初期基体として役立ち、いったん新生血管が形成されたら、in vitroで増殖させたまたは宿主から採取した所定の細胞を血管新生インプラントに注入して急速な細胞の環境順化および増殖を可能にすることができ、その後該細胞は損傷を受けたまたは切除された組織の活動的な器官置換物を形成するだろう。また、多糖スポンジは、最初にその上で増殖させた細胞を患者に移植して、損傷を受けた、切除されたまたは機能不全の組織を置換するための基体、マトリックスまたは足場として使用することもできる。発明の背景および従来技術天然および合成ポリマーから作られた多孔質の吸収性マトリックス（例えば、 Yannas 1990; Natsumiら，1993; Grande，1989; Vacanti，1990; Mikosら，1993 a; Mikosら，1993b;Mikosら，1993c;およびLanger & Vacanti，1993）が、疾病、外傷、再建手術により生じた欠陥組織の再生を促進するインプラントとして最近使用され、また研究されている。これらのマトリックスは単独で使用されているか、または細胞および組織の移植目的で細胞を播種されている(Langer & Vaca nti，1993)。細胞移植は肝臓や膵臓のような衰弱または機能不全臓器のための全臓器移植に取って代わる治療法を提供し得る。多くの分離細胞集団を細胞培養技術を用いてin vitroで増やすことができるので、適切な移植片を製造するのにほんの少数のドナー細胞が必要になるだけである。その結果、このような細胞を生きているドナーから採取するとき、該ドナーは臓器全体を犠牲にする必要がない。さらに、遺伝子治療のためには、さまざまなタイプの細胞、例えば肝細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、筋芽細胞などに遺伝子移入ベクターが導入され、その後これらの細胞はタンパク質や他の治療薬の産生および局所放出のために宿主に移植される。多孔質マトリックスのもう一つの用途は、三次元枠組みでの細胞の挙動をin v itroで研究するための足場としての用途である(Jainら，1990; Doane & Birk，1 991)。いくつかの用途において、これらの多孔質マトリックスは、遊走、有糸分裂、マトリックス合成などの足場依存的プロセスを可能にする細胞付着に適した基体を提供するために、細胞外マトリックスの類似物として役立つようにデザインされる(Folkman & Moscona，1978)。これに関連して、このような細胞外マトリックスの類似物は、天然の細胞外マトリックスが細胞挙動を調節するのと類似したやり方で細胞挙動を調節しうると考えられ(Madri & Basson，1992参照)、また、これらの類似物の化学、および多孔度パーセント、細孔の大きさ、配向などのそれらの細孔特性は、マトリックス内の細胞の密度および分布に影響を与え、それにより、類似物を移植に使用するときは再生過程に影響を及ぼしうると考えられる。生物再吸収性スポンジはまた、移植細胞の一時的な足場を提供することができ、その結果、細胞がそれら自身の細胞外マトリックスを分泌できるようになり、長期にわたる完全かつ天然の組織置換が可能となる。これらのスポンジの巨大分子構造は、それらが完全に分解可能で、新たに移植された細胞の初期の人工支持体を提供するという機能が達成されたら排除されるように選択される。これらのスポンジが細胞移植において有用であるためには、それらは大多数の細胞を収容するために高度に多孔質で、大きな表面／体積比をもつ必要があり、また、それらは生物適合性、すなわち、それらが担持する細胞およびそれらが移植される宿主組織に対して無毒性でなければならず、また、それらは細胞接着を促進し、付着細胞の分化した機能を保持できなければならない。しかしながら、これまでに開発されたほとんどの多孔質マトリックスでは、成功裏に製造されてインプラントまたは移植片として使用されているものは、非常に薄い細胞層を担持するものに限られており、主として皮膚の代用物または置換物として使用されるものである（例えば、Yannas，1990を参照）。この限られた用途ゆえに、開発されたマトリックスは、多孔度とその細孔の大きさがマトリックス内への薄い細胞層の分散を可能にするのにほぼ十分であるようなタイプのものであった。しかし、このようなマトリックスを、例えば細胞の集合体として増殖し、かつこれら初期のマトリックスが支持するようにデザインされている厚み以上の厚みを有する肝細胞のような細胞とともに使用する場合、マトリックス内部の細胞への酸素および栄養素の十分な拡散に関して重大な問題が生起し、通常は内部または下層の細胞が死滅するという結果を招く。したがって、これら初期のマトリックスは皮膚等価物を製造するのに有用であるかもしれないが、多層細胞集合体から構成される機能性の臓器等価物をin vitroで製造し、その後in viv o移植に使用するのに有用であるとはとても言えない。これまでに開発された多孔質マトリックスは大部分が、上述したとおり、コラーゲンのような天然ポリマーまたは乳酸／グリコール酸ファミリーからの合成ポリマーに基づくものである。コラーゲンを主体としたマトリックスは、比較的速い速度で分解され、多くが埋め込み後４週間ほどで消失することを含めて、いくつかの欠点を有する（例えば、Olde Daminkら，1995;Ben-Yishayら，1995を参照）。コラーゲンマトリックスの分解速度はグルタルアルデヒドで架橋することにより遅らせることができるが、得られた架橋マトリックスは長期間埋め込まれたとき免疫原性、カルシウム沈着および線維搬痕形成を示した（例えば、Timpleら，1980参照）。さらに、コラーゲンマトリックスはコラーゲン足場の顕著な収縮（インキュベーションの約１週間後に起こる）のため細胞の長期in vitro培養にも適さず、このことが移植マトリックスとしての使用を意図したときにこのコラーゲン足場を外科的に取り扱いづらくしている（Ben-Yishay，1995）。ポリ（D,L-乳酸-コ-グリコール酸）をベースとした他の生物分解性合成フォームが上述したように組織工学のための足場として開発されているが、これらのフォーム上に細胞懸濁液または培地を載置したり、それらの内部に注入したりするとき、これらのポリマーは疎水性であるので、大部分の細孔は空のままで、フォーム体積が十分に利用されない。さらに、これらの生物分解性フォームの分解は酸性産物の著しい蓄積をもたらし、フォーム内部のｐＨを3.0以下に低下させ( Park Lu & Crotts，1995参照)、この酸性は増殖中の細胞にとって非常に有害である。アルギン酸塩も細胞移植の目的で以前に使用された。アルギン酸塩は天然の多糖ポリマーで、「アルギン酸塩」(alginate)という用語はカッソウ類に由来するポリアニオン性の多糖コポリマーのファミリーをさし、さまざまな比率で1,4-結合したβ-D-マンヌロン酸(M)とα-L-グルロン酸(G)から成る。アルギン酸塩は水性溶液中に室温で可溶であり、特にカルシウム、バリウム、ストロンチウムなどのある種の２価カチオンの存在下で、安定したゲルを形成することができる。アルギン酸塩のこのユニークな性質は、その生物適合性（Sennerbyら，1987および Cohenら，1991）、その比較的安いコスト、広範な入手可能性と相まって、アルギン酸塩を医学および薬学分野において重要なポリマーとしてきた。例えば、アルギン酸塩は傷用包帯や歯科用印象材料として使用されている。さらに、アルギン酸塩は傷用包帯およびヒトの食品添加物として許容できるものであると、種々の取締り機関によって承認されている。その上、欧州および米国(USA)の医薬品取締り機関が定める品質と安全性をすべて満たす医薬品級のアルギン酸塩がいくつかの製造業者から簡単に入手可能である。こうして、アルギン酸塩は細胞移植のために使用されてきたが、これらの以前の努力は一般に、細胞を宿主の免疫系から保護するために必要であると考えられたので、半透性膜が開発された系に集中していた（例えば、Kingら，1987およびSunら，1987を参照のこと）。これらの半透性膜は、アルギン酸塩溶液中に懸濁した細胞の混合物を、塩化カルシウムを含む第２溶液中に滴下することで調製された。これにより、細胞をカプセル化したアルギン酸塩ビーズまたはマイクロカプセルが得られた。マイクロカプセルは通常第２工程にかけられ、この第２工程ではビーズの表面へのポリカチオン（例えば、ポリリシン）の吸着によりアルギン酸塩ビーズの回りに半透性膜が形成される。しかしながら、このコーティングは栄養素に対するマイクロカプセルの透過性を大いに低減させ、カプセル化された細胞の死を招いた。従来技術の上記欠点を考慮して、本発明の目的は、例えば、アルギン酸塩、ゲラン(gellan)、ゲランガム、キサンタンキトサン、寒天、カラゲナン（ポリアニオン性の多糖ポリマー）、またはキトサン（ポリカチオン性の多糖ポリマー）のような適当な多糖ポリマーから製造された多糖ポリマー足場を提供することであり、前記足場はin vitroのみならずin vivoでも生存しかつ機能する十分な細胞塊の付着および増殖に適した部位を提供するものであり、前記多糖ポリマーの足場、基体またはマトリックスはまた、細胞が該マトリックス内でその数を増やすときマトリックス表面に近接する細胞のみの生存および増殖に限定せず、むしろ細胞集合体のような厚みのある細胞層を支持するように働いて、宿主組織への埋め込み／移植の前後の細胞を活性機能状態で維持することができ、移植時には、この多糖マトリックスはまた周囲の組織からの血管新生（血管形成）を受けやすいだろう。本発明のもう一つの目的は、生物分解性であるが、in vivoでゆっくり分解し、それにより担持細胞を樹立させかつそれら自身の組織マトリックスをそれらがもはや多糖マトリックスを必要としない程度に移植部位に形成させる多糖マトリックスを提供することである。あるいは、該マトリックスを単独でインプラントとして使用する場合は、周囲の組織が該マトリックスに侵入し、侵入細胞が樹立してそれら自身の組織マトリックスを形成する程度に該マトリックス上で増殖し、それにより、もとの欠陥組織を置換するのに十分な時間にわたり該マトリックスは安定であるべきである。あるいは、該マトリックスをインプラントの第１段階として単独で使用する場合は、血管の侵入により周囲の組織から該インプラントへの血管新生を起こさせ、そして第２段階を可能にするのに十分な時間にわたり該マトリックスは安定であるべきである。第２段階では、血管新生マトリックスに所定の細胞が注入され、続いてこれらの細胞が樹立して、それら自身の組織マトリックスを形成し、それによりもとの欠陥組織または損傷を受けた組織を、少なくとも機能的に、置換する程度に、前記細胞が該マトリックス上で増殖する。本発明の別の目的は、血管および／または細胞が容易に侵入でき、続いて、このような移植細胞の成長、増殖および生物学的機能を、in vitroで、その後移植片またはインプラントとして使用した場合はin vivoで、十分に支援できる高度に多孔質の多糖スポンジを提供することである。この種の多糖スポンジはその内部体積を最適に利用できるような形態のものであり、さらに埋め込みまたは移植のためにどのような形の外部コーティング（または同等物）も必要としないものである。それゆえ、該スポンジは細胞のカプセル化のための単なるビヒクルではなく、それらが担持する細胞のマトリックスまたは足場として役立ち、細胞への酸素と栄養素の自由輸送を可能にし、in vivoでは栄養供給のための細胞の血管新生とその後のこれら移植細胞からの組織再生を提供するだろう。かくして、本発明の多糖スポンジは、細胞の単なるカプセル化デバイスとしてではなく、上述したように、組織修復のための埋め込みおよび移植において最適に使用しうる効果的なマトリックス、支持体または足場として役立つようにデザインされる。本発明のさらに別の目的は、本発明の多糖スポンジの製造方法を提供することである。本発明のその他の目的は、in vitro哺乳動物細胞培養、損傷を受けた組織または疾患のある組織の修復のための埋め込みおよび移植において使用するための多糖スポンジを提供すること、ならびにin vitro細胞培養、埋め込みおよび移植のための多糖スポンジの使用である。本発明の他の目的および側面は以下の本発明の説明から容易に理解され、また、かかる説明から明確になるだろう。発明の概要本発明は、生物分解性の三次元多孔質スポンジの新規な製造方法および該方法により製造された該スポンジに基づくものであり、該スポンジは、例えば、アルギン酸塩、ゲラン、ゲランガム、キサンタンキトサン、寒天、カラゲナンを含むポリアニオン性の多糖ポリマー、およびキトサンを含むポリカチオン性の多糖ポリマーのような適当な多糖から製造される。本発明の多糖スポンジは多数の用途、特に医療面での用途を有し、例えば、それらはin vitroで種々の哺乳動物細胞を増殖させるための細胞マトリックス、基体または足場として使用することができ、こうした条件下では細胞増殖の活動期にある哺乳動物細胞または分化の時期にあってこれらの時期の細胞に関連した生物学的活性を示す哺乳動物細胞をin v itroで提供できるだろう。このような細胞の成長、活性化および／または分化および／または増殖はその基体、マトリックスまたは足場（その上または内部で細胞が増殖する）の性質に大きく依存する。この点で、本発明の新規なアルギン酸塩スポンジは繊維芽細胞や肝細胞などの哺乳動物細胞の増殖にとって特に有利であることがわかった。さらに、本発明による多糖スポンジの上または内部で増殖させた哺乳動物細胞は、損傷を受けた臓器または組織（例えば、皮膚、肝臓、その他多数）を置換するための自家移植および同種移植において使用することができる。同様に、本発明の多糖スポンジはまた、損傷を受けたまたは切除された組織を置換するために患者に挿入されるインプラントとして特に有用であり、かかるインプラントは、損傷を受けたまたは切除された組織によって形成された空間を満たし、周囲の組織がインプラントに侵入することを可能にし、最終的にインプラントを細胞材料で満たして、もとの損傷を受けたまたは切除された組織を回復させることを目的としている。このようなインプラントはまた２段階法においても使用することができ、この場合、第１段階では完全にまたは部分的に切除された組織または臓器を置換するためにインプラントを患者に挿入する。次に、周囲の組織から血管がインプラントに侵入して、インプラントの血管新生が生じ、これは埋め込み後すぐに起こる。いったんインプラントに血管が形成されたら、もとの組織／臓器を置換するための所定の細胞をインプラントの中に注入することで第２段階を行う。これらの細胞は前もってin vitroで培養していたものであるか、または患者もしくは適当なドナーから新たに採取されたものである。注入後、細胞は第１段階でインプラント中に形成された血管ネットワークのために急速に環境順化することが可能である。その結果、注入された細胞は急激に増殖してインプラントを満たし、続いてさまざまな時期へと分化し、最後にはもとの損傷を受けたまたは切除された組織／臓器の活動的な置換物を提供することができる。本発明の多糖スポンジの性質は前記した埋め込みまたは移植の用途において特に有用であるが、それは、選択した多糖類の免疫原性が非常に低く、しかも多糖類が比較的長期間にわたり安定しており、さらに該スポンジが生物分解性であるので、比較的長期間後にはそれらは有害な副作用を起こすことなく体内で分解されるからである。本発明の多糖スポンジの多孔度およびスポンジ形態は本発明の方法において変化しうるさまざまな処方および加エパラメーターに依存しており、それゆえ、細胞培養および血管新生に適した種々の巨大多孔質スポンジを作ることが可能である。種々のスポンジが良好な機械的性質を有し、したがって、上述したとおり、繊維芽細胞や肝細胞のような各種哺乳動物細胞の成長および増殖を支援するのに適している。こうして、細胞を播いた本発明のスポンジは、例えば皮膚（真皮繊維芽細胞）や肝臓（肝細胞）組織を置換するために移植したとき、かかる細胞の少なくとも一時的な支持体を提供することができる。この一時的支持体は細胞を植え込んだスポンジが患者の体内で生物分解されるまでの期間のためのものであり、その時期までにはもとの損傷を受けたまたは切除された組織が移植片によってそれ自体を修復できていると予想される。本発明の新規方法は、ゲル化工程（架橋剤の存在下で多糖溶液をゲル化する）と、これに続く凍結工程と、最後の凍結乾燥による乾燥工程とを含む、多孔質スポンジを得るための３工程法に基づいている。各工程での条件、特に多糖の濃度、架橋剤の有無およびその濃度、ゲル化工程を行う容器の形状、および凍結工程の迅速性を変えることによって、さまざまな細孔の大きさおよび分布を有し、それゆえにさまざまな機械的性質を有する各種形状の多糖スポンジを得ることが可能である。以下の意味の種々の用語が本明細書全体を通して用いられる。細孔径(pore size)−多糖スポンジ中の細孔の細孔径は、以下の方程式を用いて求められる。［式中、ｌおよびｈはそれぞれ平均の細孔の長さおよび幅であり、各種スポンジの顕微鏡法分析により測定したものである(実施例２を参照)］細孔の壁厚(wall thickness)−このパラメーターは、スポンジ中の細孔間の距離を特性付けるものであり、したがって、そのスポンジの微細構造の指標であり、これもまた、各種スポンジの顕微鏡レベルでの測定により求められる(実施例２を参照)。Ｅ-弾性率(E-modulus of elasticity)−これは多糖スポンジの相対剛性の尺度であり、スポンジを圧縮しそれらの変形率をモニタリングした場合にはkPaの単位で測定される。Ｅ-弾性率が高くなるに従ってスポンジの相対剛性は高くなる。多糖溶液−これには２種類の溶液の意味がある。その第１の溶液とは、水に溶解させた多糖の初期溶液であり、ホモジナイズする条件下で溶解させることにより調製されるものであり、多糖を水に溶解させた状態で市販されており、通常は多糖の塩の溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）である。この初期溶液は、次いで、本発明のスポンジ製造プロセスの第１工程としてのゲル化に供される。ゲル化された溶液は最終多糖溶液と呼ばれ、多くの場合、初期多糖溶液がさらに希釈された形態である。したがって、本明細書全体を通して多糖の濃度が示される場合、それらは通常、最終溶液（これは本プロセスの最初の段階のゲル化工程に供されたものであり、そこから多糖スポンジが得られる）の中の多糖の濃度を意味する。以下の実施例において、所定の多糖（つまり、様々なアルギン酸塩）の１つから製造された各種のスポンジが例示されている。したがって、上記に従えば、アルギン酸塩粉末を水に溶解することによって得られる第１の形態のアルギン酸塩水溶液を示すのには「初期（originalまたはinitial）アルギン酸塩溶液」が用いられ、ゲル化並びに後続の凍結および乾燥に供される溶解したアルギン酸塩の溶液を示すのには「最終(final)アルギン酸塩溶液」が用いられる。埋め込み(implantation)−この用語は、通常は、本発明の多糖スポンジを患者に挿入することを意味する。このため、インプラント(implant)は、損傷または切除組織を、マトリックス、基体または足場(scaffold)として役立つ該インプラントによって（完全にまたは部分的に）置換するのに役立る。このインプラントに湿潤(invade)したり増殖したりすることができる組織が該インプラントを包囲し、最終的には、該組織が該スポンジ中で十分増殖した後で、該スポンジが時間を経て生分解されると、該損傷または切除組織が効率的に置きかえられるようになる。この意味での埋め込みはまた、上記の２段階操作も意味する。この２段階操作では、第１段階として、インプラントを患者の体内に入れ、周囲の組織からの血管の湿潤により該インプラントに新生血管が形成される。すなわち、通常は埋め込みの後で急速に起こるプロセスである。新生血管が形成されると、次に該インプラントは第２段階にアクセスできるようになる。この第２段階は、血管新生形成インプラントへの、前もってin vitro増殖させておいた、または患者もしくは適切なドナーから得た所定の細胞の注入である。このような細胞は、インプラント中に前もって形成されている血管ネットワークにより急速に環境順化でき、したがって、急速に増殖し、続いて機能分化して、損傷または切除組織との置き換えをもたらすことができる。実際、切除されている組織／臓器（例えば、皮膚または肝臓の区域または部分）を完全に置き換えることが必要とされる場合には、上記の２段階操作を適用することが必要となる。このようにして、機能細胞（例えば、繊維芽細胞または肝細胞）が、既に新生血管が形成されているインプラントに注入される。埋め込みのもう１つの態様はまた、多糖スポンジを、治療薬を患者の特定の部位に輸送するためのビヒクル（媒体）として使用することを意味するものである。この輸送は、通常は、該多糖スポンジに担持された細胞により行われ、この細胞とは、所望の治療用タンパク質やホルモン等の分泌能を有するか、または様々な調節タンパク質（これは、次に、該インプラントが挿入されている組織内で、そのような必要とされる治療薬の発現を内因的に指令することができる）を分泌するものである。この態様には、多糖スポンジへの被包化（カプセル化）した治療剤（例えば、増殖因子、血管形成誘導因子、等）の導入も含まれ、これは、インプラント内での細胞のさらに急速な増殖、またはインプラントのさらに急速な新生血管形成を促進するのに有利である。そのような因子は、通常は、該スポンジ内に有効に保持されるにはあまりに小さすぎるので、それらの効果を付与するためには緩慢放出型(slow-release)または制御放出型(controled-rel ease)マイクロカプセルの形態で該スポンジに導入される。移植(transplantation)−移植は、同種(allo)移植または自家(auto)移植という２種類のものであり得る。双方の場合とも、移植される細胞はまず最初に、所望の細胞活動状態に達するまでアルギン酸塩スポンジの上または内部でin vitro 増殖させ、必要であれば分化増殖させる。この時点で、このような接種細胞を含むアルギン酸塩スポンジは、臓器または組織の修復または置換の目的で、患者の所望の部位に移植される。上記したように、移植には、細胞以外にも、細胞や新生血管形成のための、または宿主のための治療薬を含有するマイクロカプセルも含まれ得る。したがって、本発明は、（ｉ）平均細孔径が約10μｍ〜約300μｍの範囲であり、（ii）細孔の壁厚である細孔間の平均距離が約５μｍ〜約270μｍの範囲であり、かつ（iii）スポンジの剛性の尺度であるＥ-弾性率が約50kPa〜約500kPa の範囲であることを特徴とする多糖スポンジを提供する。本発明のスポンジの態様は、ポリアニオン性多糖であるアルギン酸塩、ゲラン、ゲランガム、キサンタンキトサン、寒天、カラゲナンおよびポリカチオン性多糖であるキトサンからなる群から選択される多糖を含んでなるスポンジである。本発明の多糖スポンジの別の態様は、（ｉ）マンヌロン酸（Ｍ）残基含量が全残基の約25％〜約65％の範囲であり、（ii）グルロン酸（Ｇ）残基含量が全残基の約35％〜約75％の範囲であり、（iii）Ｍ／Ｇ比が約１／３〜約1.86／ｌであり、そして（iv）スポンジが得られる１％w/vのアルギン酸塩を含む最終アルギン酸塩溶液の粘度が約50cP〜約800cPの範囲であることを特徴とするアルギン酸塩からなる群から選択されるアルギン酸塩を含んでなるスポンジである。本発明の好ましい多糖スポンジには、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Protanal^TMLF 120(LF 120)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Protan al^TMLF 20/60(LF20/60)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩MVG^TM(MVG) 、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TMHF 120(HF 120)、 Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TM SF 120(SF 120)、Laminar ia hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TM SF 120 RB(LF 120 RB)、Laminari a hyperborea由来のアルギン酸塩PronatalTM LF 200 RB(LF 200 RB)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Manugel^TM DMB(DMB)、Macrocystis pyrifera由来のKeltone^TM HVCR(HVCR)、およびMacrocystis pyrifera由来のKeltone^TM LV（ LV）からなる群から選択される褐藻由来のアルギン酸塩を含んでなるスポンジが含まれる。上記の本発明のアルギン酸塩スポンジは、好ましくは、該アルギン酸塩が、該スポンジが得られる最終溶液中に約0.1〜約２％w/vのアルギン酸塩濃度を与えるように、約１〜約３％w/vのアルギン酸塩濃度を有するアルギン酸ナトリウム溶液の形態で用いられるように処方される。本発明のさらに別の態様によれば、多糖スポンジはまた、カルシウム、銅、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、スズ、亜鉛、クロム、有機カチオン、ポリ(アミノ酸)、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ（アリルアミン）および多糖の塩類からなる群から選択される架橋剤を含み得る。本発明のスポンジの製造に用いるための最も好ましい架橋剤は、塩化カルシウム(CaCl₂)、塩化ストロンチウム（SrCl₂）およびグルコン酸カルシウム（Ca-Gl ）からなる群から選択されるものである。好ましくは、上記架橋剤は、スポンジが得られる最終溶液中に約0.1〜約0.3％ w/vの架橋剤濃度を与えるのに十分な濃度の架橋剤を含む架橋剤溶液の形態で用いられる。本発明の好ましい多糖スポンジは、架橋剤を添加したまたは添加していない多糖溶液から製造されるものである。これらの本発明の好ましいスポンジの態様には、架橋剤を添加したまたは添加していないアルギン酸塩溶液から製造されるアルギン酸塩スポンジであって、架橋剤を添加したまたは添加しない該最終アルギン酸塩溶液（この溶液から該スポンジが得られる）が、次のアルギン酸塩またはアルギン酸塩と架橋剤の濃度：(i)LF 120アルギン酸塩１％w/v、架橋剤なし；(i i)LF 120アルギン酸塩１％w/v、Ca-Gl 0.1％w/v；(iii)LF 120アルギン酸塩１％ w/v、Ca-Gl 0.2％w/v；(iv)LF 120アルギン酸塩１％w/v、SrCl₂ 0.15％w/v；(ｖ )LF 120アルギン酸塩１％w/v、CaCl₂ 0.1％w/v；(vi)LF 120アルギン酸塩0.5％w /v、Ca-Gl 0.2％w/v；(vii)LF 20/60アルギン酸塩１％w/v、Ca-Gl 0.2％w/v；（ viii）HVCRアルギン酸塩0.5％w/v、Ca-Gl 0.2％w/v；および（ix）HVCRアルギン酸塩１％w/v、Ca-Gl 0.2％w/v、を有する最終溶液からなる群から選択される上記アルギン酸塩スポンジが含まれる。他のかかる態様には、LF 120アルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl架橋剤0.2％w/v の最終溶液から得られるスポンジ；およびHVCRアルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl 架橋剤0.2％w/vの最終溶液から得られるスポンジが含まれる。本発明はまた、本発明の多糖スポンジの製造方法であって、（ａ）水中に約１〜約３％w/vの多糖を含有する多糖溶液を調製し、（ｂ）約0.5〜約２％w/vの多糖を含有する最終溶液を得たい場合には、該多糖溶液を追加の水で希釈し、そして該（ａ）の溶液をゲル化させて多糖ゲルとなし、（ｃ）(ｂ)のゲルを凍結し、そして（ｄ）(ｃ)の凍結ゲルを乾燥して多糖スポンジを得る、ことを含んでなる上記方法も提供する。上記の本発明の方法の態様は、ゲル化工程（ｂ）を行っている間に上記（ａ）の多糖溶液に架橋剤を添加することをさらに含み、該架橋剤が、ゲル化させる最終溶液中の架橋剤の濃度を約0.1〜約0.3％w/vとする量で添加される方法である。本発明の方法のゲル化工程（ｂ）の好ましい態様では、ゲル化は、多糖溶液をホモジナイザー中で約31800RPMで約３分間激しく攪拌することによって行い、その際、架橋剤を該溶液に添加する場合には、該架橋剤は、多糖溶液を激しく攪拌している間に非常にゆっくりと添加する。本発明の方法の好ましい態様では、多糖が、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Protanal^TM LF 120(LF 120)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Protanal^TM LF 20/60(LF 20/60)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩M VG^TM(MVG)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TM HF 120(HF120 )、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TM SF 120(SF 120)、Lami naria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TMSF 120 RB(LF 120 RB)、 Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TM LF 200 RB(LF 200 RB)、L aminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Manugel^TM DMB(DMB)、Macrocystis pyr ifera由来のKeltone^TM HVCR(HVCR)、およびMacrocystis pyrifera由来のKeltone^TM LV（LV）からなる群から選択される褐藻由来のアルギン酸塩からなる群から選ばれるアルギン酸塩である方法が提供される。本発明の方法の上記の好ましい態様において、多糖がアルギン酸塩である場合、架橋剤が添加されたまたは添加されていないアルギン酸塩を含有する好ましい最終溶液（この溶液がゲル化工程（ｂ）に供される）は、（j）LF 120アルギン酸塩１％w/v、架橋剤なし；(ii)LF 120アルギン酸塩１％w/v、Ca-Gl 0.1％w/v； (iii)LF 120アルギン酸塩１％w/v、Ca-Gl 0.2%w/v；(iv)LF 120アルギン酸塩１％w/v、SrCl₂ 0.15％w/v；(ｖ)LF 120アルギン酸塩１％w/v、CaCl₂ 0.1％w/v；( vi)LF 120アルギン酸塩0.5％w/v、Ca-Gl 0.2％w/v；(vii)LF 20/60アルギン酸塩ｌ％w/v、Ca-Gl 0.2％w/v；(viii)HVCRアルギン酸塩0.5％w/v、Ca-Gl 0.2％w/v ；および(ix)HVCRアルギン酸塩１％w/v、Ca-Gl 0.2％w/vである。本発明の方法の凍結工程（ｃ）は、約−80℃の液体窒素浴中で約15分間急速凍結することによるものであってもよいし、または約−18℃のフリーザー中で約８〜24時間ゆっくりと（緩慢に）凍結することによるものであってもよい。凍結の最も好ましい手段は、上記のような液体窒素浴中での急速凍結によるものである。乾燥工程（ｄ）は、好ましくは、圧力約0.007mmHgおよび約−60℃の条件下で凍結乾燥することによるものである。種々の形状および大きさ（例えば、弾丸形、キューブ形、円筒形など）(図２参照)の本発明の多糖スポンジを製造するためには、初期多糖溶液を所望の形状を有する適切な造形容器に注ぎ、ゲル化および後続の本方法の工程をこの造形容器内で行うことによって本発明の方法を行うことが好ましい。本発明はまた、陣乳動物細胞のin vitro増殖のためのマトリックス、基体(sub strate)または足場(scaffold)として使用するための、上記のような本発明の多糖スポンジ（特にアルギン酸塩スポンジ）も提供する。本発明の多糖スポンジの別の好ましい使用は、患者に埋め込んで切除されているまたは損傷を受けている組織を置換または修復するためのマトリックス、基体または足場としての使用であり、そこにおいて、埋め込まれるスポンジは、周囲の組織が該スポンジに侵入し、該スポンジ上で増殖し、切除もしくは損傷組織と置き換わるための基体、マトリックスまたは足場であるか、または、インプラントは、周囲の宿主組織による新生血管形成のための初期基体であり、その新生血管形成したインプラントは次に、宿主からのまたはin vitro増殖させた所定の注入細胞を受容するための基体として役立つ。この注入細胞は、新生血管が形成されたスポンジ上で環境順化し増殖して損傷または切除組織と急速に置き換わることができるものである。本発明の多糖スポンジのさらに別の好ましい使用は、治療薬を所望の組織に送達するための埋込み支持体としての使用である。この薬剤送達は、該スポンジに担持されている、該治療薬を発現する遺伝子操作細胞または天然細胞の作用によるものであり、該細胞は、該組織中で、該薬剤を発現するか、または該薬剤の産生を指令する調節タンパク質を内因的に発現する。この好ましい使用において、該スポンジの上または内部に担持された細胞によって発現される治療薬は治療用のタンパク質であり、この場合、該細胞は、該スポンジが埋め込まれている組織中で、該タンパク質を発現するか、または該タンパク質の産生を指令する調節タンパク質を内因的に発現する。本発明による多糖スポンジの使用の他の好ましい態様としては、該スポンジの、植物細胞および藻類のin vitro培養のためのマトリックス、基体または足場としての使用；組織または臓器のための治療薬をコードするまたは含有する遺伝子操作されたウイルスベクター、非ウイルスベクター、ポリマー微小球およびリポソームを該組織または臓器に送達するためのマトリックス、基体または足場としての使用；哺乳動物の卵母細胞を体外受精させるためのマトリックス、基体または足場としての使用；哺乳動物の受精卵母細胞またはin vitro培養された他の哺乳動物の細胞を貯蔵するためのマトリックス、基体または足場としての使用；in vitro培養された植物細胞および藻類を貯蔵するためのマトリックス、基体または足場としての使用；および該スポンジの上または内部で増殖させた細胞を、組織の損傷、切除または機能不全のため該細胞を必要とする患者の組織に移植するためのマトリックス、基体または足場としての使用が含まれる。上記のような本発明の多糖スポンジの好ましい使用にはまた、繊維芽細胞のin vitro増殖および肝細胞のin vitro増殖のための該スポンジの使用も含まれる。これらの好ましい使用によれば、本発明の多糖スポンジは、繊維芽細胞を移植して損傷または切除皮膚組織を置換するため、または肝細胞を移植して損傷または切除肝臓組織を置換するための移植デバイスとして用い得る。したがって、本発明はまた人工臓器等価物を提供するものであり、この人工臓器等価物は、該人工臓器等価物によって完全にまたは部分的に置換される臓器、またはその機能を拡大するように該人工臓器等価物が設計される臓器の必須機能を付与するのに役立つ。したがって、本発明の人工臓器等価物は、上記のような本発明の多糖スポンジと該臓器の代表的な細胞とを含んでなるものである。この代表的な細胞とは、該スポンジの上または内部で、それらが十分に活動的(activ e)でありかつ該臓器の活動細胞と同等である段階にまでin vitro増殖させてあるものなので、該人工臓器は、臓器の損傷、切除または機能不全の後でその移植または埋込みを必要とする患者に、上記で詳述したようなあらゆる種々の方法により移植または埋め込むのに適する。本発明の人工臓器等価物の好ましい態様は、本発明の多糖スポンジと皮膚繊維芽細胞とを含んでなる人工皮膚、ならびに本発明の多糖スポンジと肝細胞とを含んでなる人工肝臓等価物である。図面および図面の凡例の簡単な説明図１は、本発明によるアルギン酸塩スポンジを製造するための一般的操作の該略図である(実施例１に詳述)。図中の番号は次のものを表わす：１、架橋剤溶液；２、混合装置；３、アルギン酸塩溶液；４、ゲル化；５、凍結；６、凍結乾燥；７、アルギン酸塩スポンジ。図２は、本発明により製造できる各種の形状および大きさのアルギン酸塩スポンジを説明する写真の複製である(実施例２に詳述)。図３（ａ）〜（ｋ）は、本発明により製造できる各種のアルギン酸塩スポンジの形態を示す走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）の顕微鏡写真の複製である(実施例２に詳述)。LF 120およびHVCRは表３のアルギン酸塩であり、w/vは体積当たりの重量であり、Ca-Glはグルコン酸カルシウムであり、SrCl₂は塩化ストロンチウムである。使用条件は（特に他に記載がない限り）以下のとおりとした(但し、ゲルは液体窒素で凍結した)。ａ）LF 120、１％（w/v）(架橋剤なし) ｂ）LF 120、１％（w/v）＋0.1％(w/v)Ca-Gl ｃ）LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ｄ）LF 120、１％（w/v）＋0.15％(w/v)SrCl₂ ｅ）LF 120、１％（w/v）＋0.1％(w/v)CaCl₂ ｆ）LF 20/60、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ｇ）LF 120、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ｈ）HVCR、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ｉ）HVCR、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ｊ）LF 120、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、フリーザーｋ）LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、フリーザー図４（ａ）〜（ｄ）は、アルギン酸塩スポンジの製造方法の各種パラメーターを様々に変化させたことの、得られる本発明のアルギン酸塩スポンジの微細構造のパラメーターに及ぼす影響を示す結果の棒グラフによるグラフである(実施例２に詳述)。白い棒は細孔径の測定値を表わし、斜線の入った棒は壁厚の測定値を表わす。縦軸の値はミクロメーター（μ）の単位である。CaCl₂は塩化カルシウムであり、Ca-Glは塩化グルコン酸であり、SrCl₂は塩化ストロンチウムである。特に他に記載がない限り、ゲルは液体窒素で凍結した。４ａ）１、LF 120、１％（w/v）(架橋剤なし) ２、LF 120、１％（w/v）＋0.1％(w/v)Ca-Gl ３、LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ４ｂ）１、LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ２、LF 120、１％（w/v）＋0.1％(w/v)CaCl₂ ３、LF 120、１％（w/v）＋0.15％(w/v)SrCl₂ ４、LF 20/60、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ４ｃ）１、LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl（フリーザー）２、LF 120、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl（フリーザー）３、LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ４、LF 120、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ４ｄ）１、LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ２、LF 120、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ３、HVCR、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl ４、HVCR、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl 図５は、機械的特性、特にスポンジにかかった荷重対スポンジの圧縮の測定に用いた装置の該略図であり、これにより、スポンジの剛性を測定するための手段が提供される(実施例３で詳述)。図中の番号は次のものを表わす：１、荷重セル；２、変形セル；３、圧子、４、サンプル；５、並進(translation)台。図６は、架橋剤塩化グルコン酸(Ca-Gl)の濃度の変化の、アルギン酸塩スポンジの圧縮性に及ぼす影響を示す結果をグラフで表わしたものである(実施例３で詳述)。縦軸（Ｉ）：応力[kPa]；横軸(II)：歪み。Ｎという文字はゲルを液体窒素で凍結したことを示す。ａ）(三角)：LF 120 １％（w/v）、架橋剤なし、Ｎｂ）(四角、点線)：LF 120 １％（w/v）＋0.1％(w/v)Ca-Gl、Ｎｃ）(四角、実線)：LF 120 １％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-G1、Ｎ図７は、アルギン酸塩中のグルロン酸（Ｇ）残基の相対量およびアルギン酸塩溶液の粘度の、それから得られるアルギン酸塩スポンジの圧縮性に及ぼす影響を示す結果をグラフで表わしたものである(実施例３で詳述)。縦軸(Ｉ)：応力[k Pa]；横軸(II)：歪み。以下において、Ｎという文字はゲルを液体窒素で凍結したことを示す。ａ）(三角)：LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎｂ）(四角、点線)：LF 20/60、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎｃ）(四角、実線)：HVCR、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎ図８は、アルギン酸塩スポンジの製造で用いられる種々の架橋剤の、それを用いて得られるアルギン酸塩スポンジの圧縮性に及ぼす影響を示す結果をグラフで表わしたものである(実施例３で詳述)。縦軸(Ｉ)：応力[kPa]；横軸（II）：歪み。ａ）(三角)：LF 120、１％（w/v）＋0.01Ｍ Ca-Gl、Ｎｂ）(四角、点線)：LF 120、１％（w/v）＋0.01M CaCl₂、Ｎｃ）(四角、実線)：LF 120、１％（w/v）＋0.01M SrCl₂、Ｎ図９は、アルギン酸塩の濃度の、それを用いて得られるアルギン酸塩スポンジの圧縮性に及ぼす影響を示す結果をグラフで表わしたものである(実施例３で詳述)。縦軸(Ｉ)：応力[kPa]；横軸(II)：歪み。ａ）(四角、実線)：LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎｂ）(四角、点線)：LF 120、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎｃ）(三角、実線)：HVCR、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎｄ）(三角、点線)：HVCR、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎ図１０は、アルギン酸塩スポンジを製造する際の凍結速度の、そのようにして製造したアルギン酸塩スポンジの圧縮性に及ぼす影響を示す結果をグラフで表わしたものである(実施例３で詳述)。縦軸（Ｉ）：応力[kPa]；横軸(II)：歪み。ＦおよびＮという文字はそれぞれゲルをフリーザーおよび液体窒素で凍結したことを示す。ａ）(四角、実線)：LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎｂ）(四角、点線)：LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｆｃ）(三角、実線)：LF 120、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎｄ）(三角、点線)：LF 120、0.5％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｆ図11は、アルギン酸塩スポンジのガス滅菌の、そのようにして滅菌したアルギン酸塩スポンジの圧縮性に及ぼす影響を示す結果をグラフで表わしたものである (実施例３で詳述)。縦軸(Ｉ)：応力[kPa]；横軸(II)：歪み。ｂ）中の「ガス」とは、アルギン酸塩生成物をガスにより滅菌したことを示す。ａ）(四角、実線)：LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎｂ）(四角、点線)：LF 120、１％（w/v）＋0.2％(w/v)Ca-Gl、Ｎ、ガス図12は、繊維芽細胞を接種し、37℃で長期間（１ヶ月）培養したスポンジの光学顕微鏡写真の複製であり、このスポンジの長期培養に対する安定性を示すものである(実施例４で詳述)。図13は、スポンジを細胞と共に５日間培養した後での、該スポンジの光学顕微鏡写真（倍率100×）の２枚の複製であり、該スポンジの表面の上面（上の顕微鏡写真）と該スポンジ内部の断面（下の顕微鏡写真）である(実施例５で詳述) 。図14は、長期培養（３週間）させたアルギン酸塩スポンジに接種した肝細胞の増殖を示す結果をグラフで表わしたものである(実施例５で詳述)。縦軸(Ｉ)：細胞密度[10⁶個／ml]；横軸(II)：時間[日]。図15は、アルギン酸塩スポンジに接種した肝細胞からのアルブミン分泌の速度と、コラーゲンＩ型ゲルで10日間in vitro増殖させた肝細胞からのアルブミン分泌の速度とを示す比較結果をグラフで表わしたものである(実施例５で詳述)。縦軸：抗体のμｇ／(日^*10⁶細胞)；横軸(II)：時間[日]。丸印はコラーゲンＩ型で得られた結果を表わし、三角印は本発明のスポンジで得られた結果を表わす。図16は、高倍率（上の顕微鏡写真）および低倍率（下の顕微鏡写真）でのＳＥＭの顕微鏡写真の複製であり、そこにおいて、繊維芽細胞が、in vitroで５日間培養した後の繊維芽細胞接種スポンジ中で活動的に増殖しているのが観察できる (実施例６に詳述)。図17は、高倍率（上の顕微鏡写真）および低倍率（下の顕微鏡写真）でのＳＥＭの顕微鏡写真の複製であり、そこにおいて、アルギン酸塩スポンジの細孔中にタンパク質含有微小球が観察できる(実施例７に詳述)。発明の詳細な説明上記のように、そして以下に詳述するように、本発明は、主にその形態および機械的特性ならびに長期培養におけるその安定性によって特徴付けられる新規多糖スポンジ、ならびにこれらの多糖スポンジの新規製造方法に関する。本発明の多糖スポンジは、特に、in vitroで種々の哺乳類動物細胞を増殖させるのに有用であり、そして組織損傷、切除または機能不全後の埋め込みや移植を必要とする患者への上で詳述したようないくつかの様々な方法での埋め込みおよび移植における使用に有用である。例えば、本発明のアルギン酸塩スポンジは、本発明にしたがって、肝細胞の成長、増殖および生物機能を支援することが可能であることがわかったので、そのような肝細胞を接種したスポンジは、肝細胞移植片に使用し得るものであり、同様に、このスポンジは繊維芽細胞の成長、増殖および生物機能も支援することも可能であるので、皮膚移植片にも使用し得るものである。上記のように、種々の天然および合成ポリマーから製造され、疾患、外傷または再建手術処置後に必要な場合に組織の再生を促進するためにインプラント用の支持体またはマトリックスとして使用するためのものである従来公知の多孔質吸収性マトリックスは、上記の医学用途に大規模にそれらのマトリックスを使用することを妨げるいくつかの欠点を有する。これらの欠点としては下記のことが挙げられる：従来のポリマーマトリックスの多くは、薄層の細胞の増殖のみを可能にするものであるので、例えば、皮膚細胞に対する薄層の繊維芽細胞の増殖などの用途に限定され、これらのマトリックスは、例えば、肝細胞の増殖などのより厚い層の細胞または細胞の凝集体の増殖を支援するには不十分であるので、そのような型の細胞の移植に対して効果的に使用することができない。さらに、インプラントまたは移植片のための基体として使用するために設計された、以前に開発された多孔質マトリックスの多くは、したがつて、それらが生分解性であるように設計されているが、例えば、コラーゲンを基材とするマトリックスは比較的急速に分解するので、移植細胞の支持体として使用する場合、それらは、移植細胞がin vivoで確立されて所望の新規組織マトリックスを形成するのに必要な時間が経過する前に分解することが多いということが確認された。長期存続性マトリックスの場合でさえ、それらの多くはin vitroで望ましくない副作用を生じることが認められた。例えば、多くは免疫原性であり、多くは縮んだり硬くなったりするので外科手術的取り扱いへの適合性が低くなり、多くはそれらが生分解した場合に望ましくない分解産物を生じる。そしてかなり多くの場合、これらのマトリックスの形態では、マトリックス内に保持された細胞に長期間の増殖を支援するのに必要な栄養素が十分に供給することができない。というのは、これらのマトリックスの多孔性は、マトリックスの内外における自由な栄養素の流れを限定または制限するか、あるいはマトリックスが埋め込まれた周囲組織からそのマトリックスへの血管新生を支援しないからである。本発明の多糖スポンジは、従来公知の多孔質マトリックスの上記欠点の全てに対処し、克服するものである。上記のように、本発明の多糖スポンジは、例えば、アルギン酸塩、ゲラン(gellan)、ゲランガム(gellan gum)、キサンタンキトサン、寒天、カラギーナンなどのポリアニオン性多糖、およびキトサンなどのポリカチオン性多糖などの多くの異なる種類の多糖を含み得るものである。これらの多糖の中で好ましいものは、上記のアルギン酸塩であり、種々の形態で機能する。したがって、本発明の好ましいスポンジは、アルギン酸塩から構成され、アルギン酸塩は、1,4-架橋β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）およびα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）残基を種々の割合で含む褐藻類(brown sea algae)から誘導されたポリアニオン性コポリマーのファミリーである。アルギン酸塩は、室温で水溶液に可溶であり、カルシウム、バリウム、ストロンチウムなどのある特定の２価カチオンのが存在する場合、ならびにかかるカチオンが存在しない場合であって、例えば、低ｐＨまたは本明細書に詳述したような特別な加工条件などのある一定の条件下で安定なゲルを形成する。さらに、その生体適合性を兼ね備えたアルギン酸塩の特有の性質（Sennerbyら，1997およびCohenら，1991を参照されたい）と比較的低コストであることにより、アルギン酸塩は医薬および薬学用途（例えば、傷用包帯および歯科用印象材料）において重要なポリマーになった。その上、アルギン酸塩は、すでに、許容できる傷用包帯および食品添加物として多数の規制管轄局(r egulatory authorities)によって承認されている。さらに、アルギン酸塩は、ヨーロッパおよび合衆国薬局方(薬事規制団体(phar maceutical regulatory bodies))によって定められたきびしい薬事要求にしたがってアルギン酸塩を製造しているいくつかの製造元から市販されている(表１参照)。本発明にしたがって種々のタイプのアルギン酸塩を使用して本発明の種々のスポンジを製造することによりスポンジの幅が広がり、それぞれは、凝集体または厚い層の状態で成長する、肝細胞などの細胞を含む広範な細胞の成長、増殖および生物機能を支援する高度に多孔質のマトリックスである。これらの多孔質スポンジは、該スポンジ内の細胞の増殖のために十分な栄養素を確実に供給することも可能であり、そして血管の侵襲に適用でき、すなわち、in vivoで埋め込まれたり移植された場合、それらのスポンジは血管新生に適用できる。さらに、アルギン酸塩は親水性ポリマーであるという事実に鑑みると、本発明のアルギン酸塩スポンジは容易に湿潤され、接種中、細胞はマトリックスにより効率的に侵入することが可能である。細胞移植にアルギン酸塩を使用するために行われた以前の取り組みにおいては、アルギン酸塩からなる半透膜の開発が、宿主免疫系からこの膜に入る細胞を保護する目的で第一に行われたということに気づくであろう( 例えば、Kingら，1987およびSunら，1987を参照されたい)。したがって、このアプローチにより、例えば、アルギン酸塩ビーズにポリリシンなどのポリカチオンを吸収させることによって半透膜で被覆されたアルギン酸塩ビーズが本質的に得られた。しかしながら、これにより、ビーズまたはマイクロカプセルの栄養素の透過性が多いに低減され、その後これらのアルギン酸塩ビーズまたはマイクロカプセル内に封入された細胞が細胞死に至るという結果になった。対照的に、上記のように、本発明のアルギン酸塩スポンジは、スポンジマトリックス内への栄養素の流れに十分に適用でき、また、in vivoの血管新生にも適用できる。下記の実施例で詳述するように、本発明の多糖、例えばアルギン酸塩のスポンジの多孔度およびスポンジ形態（細孔径および分布）は、種々の処方および加工パラメーターに依存し、本発明の方法において容易に調節され得るものであり、細胞培養および埋め込みに適した広範な巨大多孔質スポンジを得ることができる。これらのスポンジは全て良好な機械的特性を有し、種々の哺乳類動物細胞、例えば繊維芽細胞および肝細胞などの成長および増殖を支援するのに適しており、したがって、例えば、皮膚または肝臓組織を置換するための移植に使用する場合、これらの細胞を少なくとも一時的に支援するのに適用可能である。上記のように、本発明のスポンジは非常に広範な用途を有しており、例えば、それらは、植物細胞および藻類細胞、特に微小藻類のin vitro培養；哺乳類卵母細胞の体外受精のためのこれらの卵母細胞のin vitro支持のために使用され得るものであり、したがって、これらの植物細胞、藻類、および受精卵母細胞の貯蔵のためにも、本発明の多糖スポンジ、特にアルギン酸塩スポンジが、約−１８℃ （液体窒素）で非常に効率的に凍結され得るものであり、解凍した場合、このスポンジはかかる貯蔵細胞の保護および増殖再開に非常に適したマトリックスを提供するという事実に鑑みれば使用され得るものである。さらに、上記のように、本発明のスポンジは、所望の産物または薬剤を細胞内で産生し、それらをスポンジが埋め込まれた部位から宿主へと放出される遺伝子操作細胞または天然細胞を有することによって、あるいは移植片を取り囲む組織の細胞内に所望の細胞産物の産生を誘導する１種以上の調節タンパク質を産生し、周囲組織に放出することができる細胞を有することによって薬剤送達用ビヒクルとしても使用され得るものである。同様に、本発明のスポンジは、移植片が配置された宿主組織または臓器に投与することが望ましい特定の治療学上の産物または薬剤をコードするか含有する種々のウイルスベクター、非ウイルスベクター、ポリマー微小球(実施例７参照)、リポソームを送達することにも用いられ得る。これらのウイルスベクター、非ウイルスベクター、ポリマー微小球およびリポソームの全ては、当技術分野で十分に報告されているようにして広範な所望の治療剤、例えば種々の酵素、ホルモンなどをコードまたは含有するように製造し得るものであり、スポンジの製造と同時に、またはスポンジの製造後に挿入され得るものである。例えば、実施例７に詳述したように、本発明の方法にしたがってアルギン酸塩溶液のゲル化段階で架橋剤を加える時にタンパク質含有微小球をアルギン酸塩溶液に添加することによりアルギン酸塩スポンジ内に該微小球を加えることによって、アルギン酸塩スポンジ内に該微小球を封入することができる。次いで、生じた該微小球を含有する得られたアルギン酸塩ゲルを、本発明の方法の凍結工程および凍結乾燥工程によって該微小球を含有するスポンジに加工する。よって、本発明のスポンジは、スポンジ内に保持可能である形状、例えば微小球の形態で薬剤を導入することにより、そのような多孔質材料には通常は不適である薬剤の送達にも非常に有用であり、微小球内の治療剤を緩慢放出または制御放出させることができる。本発明を、下記の非限定的な実施例および添付の図面においてより詳細に説明する。実施例１：アルギン酸塩スポンジの製造上記のように、アルギン酸塩は、褐藻類由来のポリアニオン性コポリマーのフアミリーに属し、1,4-架橋β−Δ−マンヌロン酸（Ｍ）およびα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）残基を種々の割合で含む。アルギン酸塩は、室温で水溶液に可溶であり、例えば、カルシウム、バリウム、ストロンチウムなどのある特定の２価カチオンの存在下で安定なゲルを形成する。種々のコモノマー比、すなわち、種々の含量のマンヌロン酸（Ｍ）とグルロン酸（Ｇ）を有し、種々の粘度を有するアルギン酸塩を、本発明のアルギン酸塩スポンジの製造に使用した。これらのアルギン酸塩の主な特性を表１にまとめる。表１：本発明に用いられるアルギン酸塩の特性：＊Pronova Biopolymer（Drammen、ノルウェイ）＊Kelco，Division of Merck（サンディエゴ、カリフォルニア州）¹ ＭおよびＧ−それぞれ、製造元の仕様にしたがったマンヌロン酸残基およびグルロン酸残基含量下記の実施例および添付の図面では、アルギン酸塩の上記の最初の３つのタイプから製造されたアルギン酸塩スポンジおよびそれらの種々の特性に関してのみ言及されているということに気づくであろう。表１に掲げた残りのタイプのアルギン酸塩は全て具体的に説明されていないが、本発明にしたがってアルギン酸塩スポンジの製造に使用されており、全て所望の特徴および特性を有するスポンジが得られる(結果は示していない)。本発明の種々のアルギン酸塩スポンジの製造のために、種々の架橋剤を種々の濃度の架橋剤溶液に用いた。これらを表２にまとめる。表２：本発明にしたがって使用される種々の架橋剤および架橋剤溶液濃度＊これらの濃度は１０ｍＭに等しく、同様に、表２には、種々の架橋剤の、製造された各架橋剤溶液中の濃度ｍＭを示す。多くのその他の架橋剤もアルギン酸塩スポンジの製造に適しており、上記の表２に掲げた３種類はまさに具体例であるということに気づくであろう。カルシウム、銅、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、スズ、亜鉛、クロム、有機カチオン、ポリ（アミノ酸）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）および多糖の塩などの広範な種類の架橋剤は、全て本発明のスポンジの製造に適しているということがわかった。したがって、下記の実施例および添付の図面においては上記の表２に示した特定の架橋剤を用いて製造されたスポンジのみが例示されているが、その他の上記の架橋剤もうまく使用された（結果は示していない）。１〜３％(w/v)の濃度のアルギン酸塩ナトリウムのストック溶液を、二回蒸留した水にそのポリマー粉末を溶解し、ディスペンサーツール１０Ｇ（Heidolph E lektro Kelheim、ドイツ）を備えたホモジナイザーを用いて25,000ＲＰＭで室温にて３０分間混合することによって製造した。本発明によれば、３工程：（i）アルギン酸塩溶液をゲル化して架橋ヒドロゲルを形成させる工程；（ii）凍結する工程；および（iii）凍結乾燥によって乾燥する工程に基づくスポンジ製造方法が開発された。スポンジ製造のスキームを図１に示す。図１には、アルギン酸塩スポンジ製造のための一般的な手順を概略的に示す。手短に言うと、２％w/vのアルギン酸塩ストック溶液０．５〜１ｍｌを２４ウェルプレート（ウェルサイズ：直径ｌ６ｍｍ、高さ２０ｍｍ）のウェルに注ぎ、所望の最終濃度になるまで二回蒸留した水で希釈し、次いでホモジナイザー（デイスペンサーツール６Ｇ、速度31,800ＲＰＭ）を用いて３分間激しく攪拌しながら架橋剤溶液をきわめてゆっくりと添加することによって架橋させてゲルを形成させた。次に、上記のアルギン酸塩ゲルを凍結する。２つの条件、すなわち１）プレートを−１８℃〜−２０℃のフリーザー内の棚に一晩置くこと；および２）プレートを液体窒素浴中に１５分間置くこと、を用いてスポンジの形態および機械的特性における凍結速度の効果を調べた。凍結ゲルを０．００７ｍｍＨｇで、凍結乾燥温度−６０℃にて凍結乾燥した（凍結乾燥システムＬＡＢＣＯＮＣＯ社、カンザスシティ）。組織培養のために、このスポンジを、標準エチレンオキシド滅菌装置を用いてエチレンオキシドガス処理によって滅菌した。手短に言うと、このサンプルを相対湿度７０％、５５℃で１００％酸化エチレン雰囲気に３．５時間曝した。次いで、サンプルを大気圧の暖かい空気流に少なくとも４８時間曝すことによりアルギン酸塩スポンジから残留エチレンオキシドを除去した。このようにして滅菌されたスポンジは使用するまでラミネート袋内に室温で保存した。上記のような３つの異なる工程を含むアルギン酸塩スポンジ製造の技術は、これらの工程のそれぞれが得られるマトリックスの形態、微細構造および機械的特性に影響を及ぼし得るような性質を有する。よって、下記の実施例に詳述するように、これらの工程に変更を加えることの効果を、細胞および組織移植に最も適したアルギン酸塩スポンジを得ることを目的として試験した。したがって、上記の方法諭はアルギン酸塩スポンジ製造についての一般的な方法論であり、より具体的な方法諭は以下に詳述する。実施例２：アルギン酸塩スポンジの形態アルギン酸塩スポンジの形態を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＪＥＯＬＪＳＭ-35 ＣＦ）によって調べた。種々のアルギン酸塩スポンジのサンプルをアルミニウムスタブ上に置いて、PolaronＥ5100コーティング装置中で超薄層（１００Å）の金で被覆した。スポンジの微細構造のパラメーターを、ＳＥＭ−顕微鏡写真上の幾何学的測定値によって調査した。細孔の長さ、幅および壁厚（すなわち、隣り合った細孔の間の平均距離）は、光学マイクロメーターを備えた立体顕微鏡（Ba usch＆Lomb）によって測定した。細孔の有効な大きさは、方程式：（式中、１、ｈは、それぞれ、細孔の平均長さおよび幅である。）を用いて計算した。壁厚測定を行ったのは、このパラメーターが細孔間の距離の特性を表すものであり、よってスポンジの微細構造の特性を表すものであるからである。最初に、スポンジの形状はスポンジの加工を行った皿によって決まった。したがって、種々の形状、例えば、弾頭形、チューブ形および円筒形、ならびに多くのその他の形状のスポンジは、単にスポンジを製造し加工するための適当な容器を選択することによって容易に構築された。異なる形状の種々のスポンジの例を図２に示す。図２は、弾頭形、チューブ形および円筒形のスポンジを示す写真の複製である。図２には、種々のスポンジの大きさ（長さ、幅）の指標をセンチメートル／インチで示すための定規も示す。図２に図示したように、本発明の種々の好ましいスポンジは、丸い縁を有するスポンジである。これは、望ましくない鋭い角または縁を有する従来公知の移植マトリックスと比較した場合、そのような形状の移植片が非常に大きな炎症応答を誘発し得るということが分かっていることに鑑みると(例えば、Matlagaら，1976を参照されたい)、好ましい形状である。本発明のアルギン酸塩スポンジの製造のための上記の方法論を用いることにより、ポリマー材料の典型的な組織(organization)を有する高度に多孔質の十分に連続した(well inconnected)スポンジが得られた。アルギン酸塩スポンジの形態は、細孔の大きさ、数および分布、ならびに細孔間の距離、すなわち壁厚に関して、本発明にしたがっており、スポンジの製造に用いられる架橋剤の濃度およびタイプならびにアルギン酸塩溶液の初期濃度に高度に依存するということがわかった。立方ｃｍ（ｃｍ³）当たりの細孔の数が最小で壁厚が最大である最も密な構造は、加工中に架橋剤を添加しない凍結乾燥工程によって製造されたスポンジにおいて得られた。種々の種類のアルギン酸塩を、種々の濃度で、種々の架橋剤を添加することによりまたは添加しないことにより種々の凍結条件下で用いて製造した種々のスポンジのＳＥＭによる表面形態を、図３（ａ）〜（ｋ）に示す。図（ａ）〜（ｋ）のそれぞれは、ＳＥＭ顕微鏡写真の複製であり、それぞれの下には、使用されたアルギン酸塩のタイプ（表１参照）、スポンジ溶液中のその最終比率(％w/v)、使用された架橋剤の量およびタイプ、ならびに使用された凍結のタイプ（すなわち「フリーザー」と表示されている場合、緩慢な凍結方法が用いられており（−２０℃、２４時間）、「フリーザー」と表示されていない場合、急速凍結、すなわち液体窒素中での凍結が用いられている。（図３（ａ）〜（ｉ）参照)）を表示する。上記のように、上記方程式によってＳＥＭ顕微鏡写真から細孔径および壁厚の実際の値を計算することが可能であり、これは各顕微鏡写真上に印刷されたバーによるものであり、各バーは１００μｍを示し、細孔径および壁厚の値を測定するための高精度の手段を提供するものである。これらの実測値を図４（ａ）〜（ｄ）にグラフで示す。これらの図は、上記のように、架橋剤を添加した場合と添加しない場合で、種々のスポンジの製造において「フリーザー」を用いた場合と用いない場合の種々のタイプのアルギン酸塩から得られた細孔径（白い棒）および壁厚（黒い棒）を示すものである。したがって、架橋しておらず、急速凍結乾燥法を用いた場合の代表的なスポンジのＳＥＭによる表面形態を図３（ａ）に示し、かかるスポンジの細孔径と壁厚の実測値を図４（ａ）の左側の２本の棒（ＬＦ１）によって示す。このスポンジは、おそらく架橋網状構造が存在しないことにより、収縮の程度が非常に大きいということもわかった。しかしながら、スポンジが架橋剤を用いて製造された場合、すなわち、架橋ヒドロゲルから製造された場合、スポンジは高度に多孔質であり、多孔度および細孔径はイオン性架橋剤のタイプおよび濃度に依存する。架橋剤としてグルコン酸カルシウム（Ｃａ−Ｇｌ）を用いることにより、図３（ｂ）および３（ｃ）に図示したように、細孔分布および大きさの両方に関して均一な微細構造を有するスポンジが生成した。この場合の平均細孔径および壁厚は、０．１％(w/v)Ｃａ− Ｇｌを用いた場合、それぞれ、１００および５０μｍであり、図３（ｂ）および４（ａ）（図４（ａ）の真ん中の棒参照）に示されているように、平均細孔径および壁厚はＣａ−Ｇｌの濃度が増大するにつれて減少する（図３（ｃ）および４（ａ）（右側の棒）参照）。架橋剤として塩化カルシウムまたは塩化ストロンチウムを用いて製造されたスポンジは、平均してより大きい細孔を有していた(図３（ｃ）、図３（ｄ）および３（ｅ）を比較した場合。ここで、図３（ｃ）のスポンジは、Ｃａ−Ｇｌを用いて製造されており、図３（ｄ）のスポンジはＳｒＣｌを用いて製造されており、図３（ｅ）のスポンジはＣａＣｌを用いて製造された)。架橋剤としてＣａＣｌまたはＳｒＣｌを使用した場合、図４（ｂ）に示したように同様の濃度（モル基準）のイオン性架橋剤を用いたところ、細孔の平均径はそれぞれ１５０μｍおよび２００μｍであった。アルギン酸塩溶液の粘度およびアルギン酸塩のタイプ、すなわちグルロン酸（Ｇ）残基とマンヌロン酸（Ｍ）残基のコモノマー比も、スポンジの微細構造に有意な効果を有していた。ＬＦ１２０と同様のＧ対Ｍ比を有するＬＦ 20/60ポリマーを用いた場合、１％(w/v)ポリマー溶液で低粘稠溶液を生じるが(表１参照) 、均一性の低い微細構造を有するスポンジが生成することになる(すなわち、均一性の低い細孔分布。図３（ｆ）と図３（ｃ）を比較した場合にわかるように、いずれの場合においても、示されたスポンジは同一の架橋剤（Ｃａ−Ｇｌ）を用いて同一の方法で製造されたが、使用されたアルギン酸塩のタイプが異なっており、すなわちＬＦ 120対ＬＦ 20/60であった。)。さらに、細孔径は、ＬＦ 120アルギン酸塩から得られたスポンジよりもＬＦ 20/60アルギン酸塩から製造されたスポンジの方がわずかに小さかった。そして、ＬＦ 20/60アルギン酸塩スポンジの壁厚は、図４（ｂ）に示されたように、ＬＦ 120アルギン酸塩スポンジのものよりも大きかった(この図の左側の棒と右側の棒を比較)。所与のアルギン酸塩タイプについて、初期アルギン酸塩溶液の濃度はスポンジの微細構造に有意に影響を及ぼすので、ポリマー濃度を低くすると、細孔径が大きく、壁厚が小さいスポンジが製造されることになる(図３（ｇ）対３（ｃ）および図４（ｃ）を参照されたい。ここで、図３（ｃ）に示されたスポンジと図３（ｇ）に示されたスポンジとの唯一の相違点は、用いられたアルギン酸塩溶液の量であり、図３（ｇ）のスポンジは、図３（ｃ）に示されたスポンジの製造に使用した濃度の半分の濃度w/vのアルギン酸塩溶液から製造された。)。ＨＶＣＲタイプのアルギン酸塩は、ＬＦ 120の粘度と同様の粘度の溶液を得ることができるが、グルロン酸含量が低く(表１参照)、ＬＦ 120アルギン酸塩の細孔径よりも小さい細孔径のスポンジが製造される(図３（ｈ）および３(ｉ)、対図３（ｇ）および３（ｃ）を参照されたい。ここで、図３（ｈ）および３（ｉ）のスポンジは、図３（ｇ）および（ｃ）にそれぞれ示されたＬＦ 120アルギン酸塩から製造されたスポンジと同一の架橋剤ならびに同一の濃度のアルギン酸塩溶液および架橋剤溶液を用いてＨＶＣＲアルギン酸塩から製造されたものである。 )。ＨＶＣＲを用いて製造したスポンジ対ＬＦ 120アルギン酸塩から製造したスポンジの細孔径および壁厚の実測値を図４（ｄ）に示す。すなわち、かかる図の左側の２本の棒と右側の２本の棒を比較した。この結果は、イオン性架橋によるアルギン酸塩のゲル化理論に一致しており、ゲル生成能およびゲル細孔径がポリマーのポリ−Ｇ含量と相関している。Grantら(1973)の卵箱モデルによれば、２価カチオンはアルギン酸塩上の負に荷電したグルロン酸残基を架橋しており、マンヌロン酸残基はゲル骨格において従属的な役割を果たすのみである。したがって、Ｇ含量が増大すると、一般的に、細孔径が増大することになる(Martinsenら，1989を参照されたい)。スポンジの微細構造における凍結プロセスの効果、すなわち、そのタイプおよび持続時間の効果も試験したところ、液体窒素を用いる急速凍結操作によれば、緩慢凍結プロセス、すなわち−２０℃で２４時間フリーザー内で凍結させるプロセスを用いて得られるスポンジよりも細孔径が小さく、機械的特性が良好な（下記参照）スポンジが得られるということがわかった。これらの相違は、図３（ｃ）および３（ｇ）を図３（ｊ）および３（ｋ）と比較することにより明らかに説明され、前者においては液体窒素凍結工程が用いられており、後者においては緩慢凍結プロセスが用いられた。スポンジ成分の残りおよび分取方法は全ての場合において同一であり、すなわち、全ての場合においてＬＦ 120アルギン酸塩は２種の濃度で用いられ、架橋剤としてＣａ−Ｇｌが用いられた。急速凍結または緩慢凍結によって製造された上記スポンジについて得られた細孔径および壁厚の実測値の比較を図４（ｃ）に示す。この図において、左側の２本の棒は緩慢凍結によって製造されたスポンジを示すものであり、右側の２本の棒は急速凍結によって製造されたスポンジを示すものである。異なる凍結方法によって製造されたスポンジの細孔径間の相違は、凍結プロセス中の伝熱速度の相違を反映するものであるということが示唆される。温度が低い場合、液体状態にある水は、その凝固点より十分に低い温度まで過冷される。この段階で、氷晶が生成し始め、結晶化の熱が放出され、水の温度をその融点まで上昇させ、氷と水の混合物が生じる。結果として、緩慢凍結工程を通じて厚い壁を有する大きな細孔が生じる。しかしながら、冷却の速度が十分に速い場合、すなわち液体窒素中での急速凍結の場合、結晶化の熱が抽出され、大きな氷晶の生成が妨げられるものと考えられる。さらに、スポンジ材の凍結後、凍結したスポンジ材を低温で減圧乾燥することにより氷晶が昇華する。したがって、スポンジの多孔度は、凍結プロセス中に生成した結晶の大きさによって制御される。すなわち、低凍結速度、例えば−１８〜−２０℃のフリーザー内で２４時間凍結させると大きな氷晶が生成し、減圧乾燥工程、すなわち凍結乾燥後に脆い微細構造を有し、壁が破断されたスポンジが形成される。対照的に、液体窒素を用いる高速冷却工程では好ましい配向を有する多数の小さい氷晶が生じ、よって均一な微細構造と改良された機械的特性（下記参照）を有するスポンジが生成される。また、本発明によるアルギン酸塩スポンジの上記の微細構造は、アルギン酸塩ヒドロゲルを製造するための公知の方法によって得られたものとも著しく相違している。これらの公知の方法（Martinsenら，1989参照）においては、アルギン酸塩ヒドロゲルは凍結および凍結乾燥することなく製造されており、５０〜１５００Åの細孔径を有する細孔の網状構造を有している。アルギン酸塩ヒドロゲルの細孔径は、おそらく、主にマトリックス架橋の密度によって制御されている。この基本微細構造は、アルギン酸塩スポンジの製造中の凍結プロセスによって実質的な変形を生じる。この凍結プロセス中、氷晶の成長により架橋が破壊され新しい微細構造が生じ得る。よって、凍結ゲル構造は内部結合(intrinsic bonds) の生成および破壊の結果である。したがって、ゲルの組成（例えば、アルギン酸塩のタイプならびに架橋剤の有無およびその相対濃度）ならびにスポンジ製造工程中に用いられた凍結速度は、最終スポンジ製品に形成される細孔の大きさおよび構造に非常に大きな影響を及ぼすものであり、これは、以前に製造されたアルギン酸塩ヒドロゲル（このヒドロゲルは、凍結および／または凍結乾燥を行うことなく製造される）の微細構造に通常影響を及ぼしているパラメーターとは異なっている。本発明のスポンジの形態に関する上記の結果は、アルギン酸塩スポンジ微細構造、特に細孔の大きさおよび分布が、アルギン酸塩組成および濃度、イオン性架橋剤のタイプおよび濃度、ならびに凍結加工および凍結速度を変えることによって容易に制御され、操作され得るものであるということを明確に示すものである。本発明による、可変微細構造を有するかなり広範な種々のタイプのアルギン酸塩スポンジを製造する能力は、細胞移植に適したインプラント基体の開発に非常に重要であり、かかる能力によってそのようなインプラントの最適化が可能になり、例えば種々の形態、例えば種々の微細構造のスポンジを、インプラントが配置されることになる組織の型、または移植することが望ましい細胞の型に依存して、種々のタイプの埋め込みまたは移植に使用し得る。スポンジおよびそれに含まれる移植細胞と、かかるスポンジが挿入される宿主組織との相互作用はアルギン酸塩スポンジの細孔構造によって決まる。細孔構造は、スポンジ内の個々の細孔の大きさ、大きさの分布、および連続性によって決定される。多孔質材料は、典型的には、微小多孔質(孔径＜２ｎｍ)、中間多孔質（２ｎｍ＜ｄ＜５０ｎｍ）または巨大多孔質（ｄ＞５０ｎｍ）として規定される。小さい分子、例えば種々の気体のみが、微小多孔質材料を透過することができる。中間多孔質材料は、大きい分子を自由に輸送することができ、細孔が十分に大きい場合(ｄ＞１０⁴ｎｍ)、細胞はそのような材料の細孔を通って移行することができる。したがって、スポンジを注意深く設計することにより、例えば血清中の糖濃度の上昇などの所望の細胞外シグナルを、細孔を通過させてスポンジ内に保持された移植細胞内に至らしめ、同時に大きな細胞外分子または細胞シグナル、例えば、移植細胞の拒絶を引き起こすように作用する免疫グロブリン分子を排除させ得るスポンジを製造することができる。本発明によるスポンジは、巨大多孔質材料に属し、よってそれらはマトリックスの血管新生を可能にする。この血管新生は、細胞生存率の維持およびマトリックス内に保持された移植細胞の機能に非常に重要である(例えば、Milosら，1993 を参照されたい)。また、本発明によるスポンジの上記製造方法により、単峰形の細孔径分布または連続細孔構造を有するアルギン酸塩スポンジを製造することも可能である。かかるスポンジは、分子または細胞を、細孔構造内に制限（「ボトルネック(bottlenecks)」）することなくスポンジマトリックスを通して輸送することができる。最後に、上記のような本発明によるスポンジの製造方法の詳細な説明から明らかなように、本発明は、実施が簡単で、再現性が高く、かかるスポンジの商業生産のためにスケールアップすることに容易に適用できるアルギン酸塩スポンジの製造方法を提供する。実施例３アルギン酸塩スポンジの機械的特性および細孔の圧縮性サンプルのアルギン酸塩スポンジを２２℃（室温）にて標準試験装置を用いて２ｍｍ／分の一定の変形速度で圧縮することにより、アルギン酸塩スポンジの機械的特性を測定した。この装置を図５に概略的に図示する。この装置は、過重セル、変形セル、および圧子、ならびに台を含む。サンプルスポンジを圧子と台の間に置き、テーブルがその別の端面に接続されている測定装置によって測定される荷重に供する(「並進(translation)」)。そのような装置を用いて、荷重１ｇおよび変形０．０５ｍｍ未満の高い精度で荷重および変形をモニターした。この装置において、圧子の直径（７ｍｍ）は、通常、サンプルの直径よりも小さいか(サンプルスポンジは通常約１５ｍｍである)、または圧縮する場合には大きいので、試験結果に対するサンプルの直径変動の影響は最小化された。本発明のアルギン酸塩スポンジの機械的特性および細孔圧縮性についてのこれらの試験は、移植または埋め込みに使用されることになるスポンジは優れた機械的特性を有する必要があり、頻繁な培地交換を含むin vitro培養段階、そして最終的に移植の段階における外科手術的処置を通じてその形状を維持する必要があるという事実に鑑みれば、非常に重要である。本発明にしたがって製造された種々のアルギン酸塩スポンジの機械的特性、特に圧縮性についての分析結果を図６〜１１に示す。これらの図は、種々のタイプのアルギン酸塩、種々のタイプの架橋剤、ならびに種々の濃度のアルギン酸塩および架橋剤、および種々の凍結条件を用いて製造された種々のスポンジの応力（kPa）対歪をグラフにして示したものである。したがって、図６〜１１は、本発明にしたがって製造された種々のタイプのアルギン酸塩スポンジについての応力−歪座標面上の一連の変形曲線を示すものである。図６〜１１に図示した各曲線は、７〜１２試験の平均の結果を示す。これらの試験において、変動率は最小変形下では２３〜４１％であり、最大変形条件下では７〜１２％であった。また、図６〜１１に示された曲線から得られた全結果も表３にもまとめた。表３：種々の処方および加エパラメーターの関数としてのアルギン酸塩スポンジの機械的特性および多孔度液体Ｎ−即時凍結フリーザー、−２０℃、加工時間図６〜１１に図示し、表３にまとめた上記の結果から、アルギン酸塩スポンジの応力−歪挙動は、弾性率が歪とともに増大する多孔質材料の挙動に特徴的なものであることは明白である。図６には、種々の濃度のグルコン酸カルシウム溶液を使用する、架橋がある場合とない場合の１％(w/v)アルギン酸塩ＬＦ 120溶液から製造されたスポンジの変形曲線の比較を示す。架橋がない場合（黒三角で図示した曲線）および架橋はあるが０．１重量％以下の少量のグルコン酸カルシウム（ＣａＧｌ）を使用する場合(黒四角を有する点線の曲線)、スポンジは非常に剛性が低く、すなわち、比較的低荷重で変形した。架橋剤濃度を０．２重量％まで増大すると(黒四角を有する実線曲線)、スポンジの剛性の急激な増大が観察された。対照的に、スポンジ中のアルギン酸塩のグルコン酸（Ｇ）含量は、図７の曲線から明らかなように、スポンジの機械的特性に有意な影響を及ぼさなかった。ＬＦ 120アルギン酸塩（図７の黒三角を有する曲線）およびＨＶＣＲアルギン酸塩（図７の黒四角を有する実線曲線）の１％(w/v)溶液（これらは同様の粘度値（１５０cP）を有するが、Ｇ含量が異なる(ＬＦ 120は６５〜７５％のＧを有し、ＨＶＣＲは３９％のＧを有する。表１参照。)。）から製造されたアルギン酸塩スポンジの弾性率は、表３にもまとめているように、非常に似ている。しかしながら、注目すべきことであるが、この挙動は、従来公知のアルギン酸塩ヒドロゲル(その機械的特性はＧ残基の含量に非常に依存しており、Ｇ含量が増大するとより強力なヒドロゲルが生成する（SmidsrodおよびHaug，1972を参照されたい）について観察されたものとは異なる。よって、上記の結果は、本発明のスポンジと従来公知のアルギン酸塩のヒドロゲル様式との間の構造上ならびに挙動上の相違を強調するものである。図７においては、溶液粘度が所与のＧ含量の所与のアルギン酸塩についてのスポンジ剛性に非常に影響を及ぼしたということも示されている。これは、スポンジを形成するＬＦ 20/60アルギン酸塩スポンジ(図７の黒四角を有する点線曲線) が、ＬＦ 120アルギン酸塩溶液から形成されたスポンジ（図７の黒三角を有する曲線）よりも剛性が低いということからわかり、ＬＦ 20/60アルギン酸塩とＬＦ 120アルギン酸塩の粘度の相違は、ＬＦ 20/60が粘度値１００cPという低粘度の溶液を形成するのに対してＬＦ 120が１５０cPの溶液を形成するということにおいて有意である。よって、溶液粘度がスポンジの剛性に大きな影響を及ぼしているということは明白である。本発明にしたがって製造されたアルギン酸塩スポンジの機械的特性に非常に大きな影響を及ぼす別のパラメーターとしては、使用される架橋剤のタイプが挙げられる。図８に示したように、塩化カルシウムおよび塩化ストロンチウムを用いて製造されたスポンジは、同様の剛性を有しており(それぞれ、図８の黒四角を有する点線曲線と黒四角を有する実線曲線を参照されたい。)、それにもかかわらず、剛性は架橋剤としてグルコン酸カルシウムを用いた場合に得られたもの( 図８の黒三角を有する曲線を参照されたい。)よりも有意に低かった。上記のように、スポンジの形態に関して、架橋剤としてグルコン酸カルシウムを用いて製造されたスポンジは小さい細孔を有しており、これは、それらスポンジの高い剛性を説明し得るものである。また、スポンジの製造に使用されるアルギン酸塩の濃度も、スポンジの剛性に有意な影響を及ぼした。図９に図示し、表３にまとめたように、低Ｇ含量（ＨＶＣＲ）と高Ｇ含量（ＬＦ 120）の両方について初期アルギン酸塩濃度を０．５％ (w/v)から１％(w/v)に上昇させることにより、剛性の大きいスポンジが製造された（図９において、黒三角および黒四角を有する実線曲線と、黒三角および黒四角を有する点線曲線とを比較せよ。この図において、実線曲線は高濃度のアルギン酸塩を表すものであり、点線曲線は低濃度で用いられたアルギン酸塩を表すものである。)。したがって、アルギン酸塩濃度が上昇すると、それから製造されるスポンジを変形させるために必要な荷重が大きくなる。さらに、上記のように、種々のアルギン酸塩濃度で製造されたスポンジの形態に関しては、図９に示された結果も、剛性が非常に大きいスポンジは細孔径が非常に小さいスポンジであるということも示すものである。スポンジの剛性に著しい影響を及ぼすさらに別のパラメーターは、スポンジが製造され、加工される方法、特にスポンジ製造のプロセス中のアルギン酸塩溶液の凍結速度に関するものであった。これに関して、液体窒素を用いる高速凍結により、良好な機械的特性、特に大きい剛性を有するスポンジが得られるということが観察されたので、このようにして製造されたスポンジは、スポンジの変形を生じさせるためにはより高荷重にかけられる必要があった。これらの結果を図１０に図示する。この図は、上記のように、液体窒素中での高速凍結によって製造されたスポンジをフリーザー内での緩慢凍結によって製造されたスポンジと比較するものである。したがって、１％(w/v)の高濃度のＬＦ 120アルギン酸塩および０．２重量％の架橋剤ＣａＧｌから製造されたスポンジに関しては、液体窒素中で急速に凍結されたスポンジ（図１０の黒四角を有する実線曲線）により、同一アルギン酸塩および同一濃度の架橋剤であるが緩慢凍結の条件下で製造されたスポンジ（図１０の黒四角を有する点線曲線）よりも有意に剛性が大きいスポンジが得られるということは明白である。この分析において、いずれにしても高濃度のアルギン酸塩から製造されたスポンジよりも剛性が低いことが示された（図９参照）低濃度のアルギン酸塩から製造されたスポンジについては、その製造の際の異なる凍結方法による効果は区別不能であり、すなわち、いずれの場合においても、非常に剛性が低いスポンジが製造された（図１０の黒三角を有する実線と点線の２本の曲線を参照されたい。）ということも興味深い。スポンジの剛性に対する効果について別のパラメーターを検討した。そのパラメーターはスポンジの滅菌の効果である(滅菌は、これらのスポンジを、細胞培養、ならびに後続の埋め込みおよび移植の目的で使用する前に必要である。)。この分析の結果から、図１１に図示したように、スポンジの滅菌はそれらの機械的特性を変化させないということがわかった。高濃度のＬＦ 120アルギン酸塩および架橋剤ＣａＧｌから製造され、液体窒素中で急速凍結されたスポンジは、ガス滅菌された場合、その剛性について何ら有意な変化はないとうことが観察された (図１１中のガス滅菌されていない対照スポンジを示す黒四角を有する実線曲線と、同一スポンジであるがガス滅菌されたスポンジを示す黒四角を有する点線曲線とを比較せよ)。この知見、すなわちスポンジのガス滅菌がどのような観察手段においても機械的特性に影響を及ぼさないということは、目的とする医学用途に鑑みて、本発明のスポンジでは最も重要なことである。さらに、この知見は、本発明のスポンジをその他の材料から製造されたスポンジ（その他のスポンジは、滅菌された場合、有意に影響されるということが知られている。）とさらに区別するものである。以上のことをまとめると、本発明にしたがって製造された種々のスポンジの形態および機械的特性に関する上記の結果から、最も好ましいアルギン酸塩スポンジは、ＬＦ 120から初期アルギン酸塩溶液濃度１％ w/vで製造され、０．２％w/ vのグルコン酸カルシウムで架橋され、製造のプロセス中、液体窒素中で急速凍結された後、凍結乾燥されたスポンジであるということがわかる。上記構成の１種以上を変更し、本発明による製造の様式を用いて製造された種々のその他のスポンジも、これらのスポンジの意図される目的、すなわち、細胞培養および埋め込みまたは移植の用途に対して大いに有用である。したがって、本発明によれば、種々の形態および機械的特性を有する広範な種類のスポンジを製造することが可能であり、これらのスポンジはすべて有用であり、最も有用なスポンジは、剛性が最も高くより均一な細孔分布を有する上記のスポンジである。実施例４アルギン酸塩スポンジのin vitro分解：一定期間を経過した本発明のアルギン酸塩スポンジの分解を確認するために、スポンジを完全培養培地中でインキュベートし、熱量測定アッセイにより可溶性アルギン酸塩の濃度を検定するためにサンプルを種々の間隔で回収した。このアッセイは、染料1,9-ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）に結合しているアルギン酸塩によって誘導される異染変化(chromatic change)に基づくものである(Hal leら，1993を参照されたい)。このアッセイにおいて、アルギン酸塩スポンジは、繊維芽細胞および肝細胞などの細胞の培養に通常使用されている標準完全培地である標準培養培地中で、３７℃にて培養した。培養スポンジは、細胞を接種したスポンジと、細胞を接種しなかったスポンジの２種類であった。このアッセイの結果から、細胞を接種した場合も接種しなかった場合も、培養培地中、３７℃で培養されたアルギン酸塩スポンジは、長期間その物理的安定性を保持するということがわかる。細胞を接種し、または接種せずに１ヶ月間インキュベートした後、アルギン酸塩スポンジの分解の指標となる培地中の可溶性アルギン酸塩を測定したところ、培養培地中の可溶性アルギン酸塩濃度は有意なものではなかった（１％ w/v未満)。この分析の代表的な結果を図１２に示す。この図は、繊維芽細胞を接種し、培養培地中、３７℃で１ヶ月培養した後に写真を撮り、検定したスポンジの光学顕微鏡写真の複製である。この場合、スポンジは、ＬＦ 120アルギン酸塩、１％ w/v初期アルギン酸塩溶液および０．２％ w/v架橋剤グルコン酸カルシウムから製造され、この製造には、上記のように、液体窒素中での急速凍結工程が含まれている。図１２に示された上記の代表的な結果から、アルギン酸塩スポンジは、長期インキュベーションの間その物理的安定性を維持することは明白であり、このことは、長期細胞培養ならびに埋め込みおよび移植用途に対するかかるスポンジの有用性のさらなる指標となる。実施例５アルギン酸塩スポンジ内の肝細胞細胞２００〜２５０ｇの雄Sprague Dawleyラットから、BerryおよびFried(1969)の３段法の改良法を用いて、肝細胞を単離した。肝臓に、まず、９％ w/vグルコースを５分間、次いで１００ｍＬの５ｍＭＥＧＴＡを含む、カルシウムを含まない濯流緩衝液（１４３ｍＭＮａＣｌ、１５０ｍＭＫＣｌ、１５４ｍＭＮａＨＣＯ₃、ｐＨ７．４）を逆行性方向に灌流し、最後に、同一の灌流緩衝液であるが５ｍＭＣａＣｌ₂および６０単位／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼを含む緩衝液を２０分間を灌流した。崩壊肝臓を、化学的に規定された血清を含まない培養培地（１０ｎｇ／ｍＬＥＧＦ、２０ｍＵ／ｍＬインシュリン、５ｎＭデキサメタゾン、２０ｍＭピルベート、２ｍＭＬ-グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンおよび０．２ｍＭゲンタマイシンを含むWilliam'sＥ）中に分散させた。この培地は、本明細書においては「完全培地」という。分散後の肝細胞の細胞生存度をトリパンブルー排除アッセイによって測定したところ８０〜９０％であった。死細胞および細胞破片を等密度パーコール溶液中で遠心分離することによって除去し(Kreamerら，1986を参照されたい)、次いで、得られた細胞ペレットを完全培地で３回洗浄した。このようにして製造された細胞のプレーティングでの生存度は８８〜８９％であった。ルーチン培養のために、細胞を完全培地中で、培養表面積１ｃｍ²当たり３× １０⁴生細胞の濃度、または５０ｍｍの対照皿に対して６×１０⁵細胞−皿の濃度にてプレーティングした。対照皿をコラーゲンＩ型で処理して（１μｇ／ｃｍ² の濃度のコラーゲン被覆）肝細胞増殖を支援した。アルギン酸塩スポンジ内での細胞培養のために、下記の寸法の本発明のスポンジを使用した：１５×１０ｍｍ（直径×高さ）および体積１．７ｃｍ³、ＬＦ 12 0から製造されたもの(アルギン酸塩溶液およびグルコン酸カルシウムの初期濃度は、それぞれ、１および０．２％ w/v)。スポンジを２４−ウェルポリスチレンプレートのウェル内に入れた。肝細胞を、下記のようにして１×１０⁶細胞／ｍＬの濃度で接種した：２００μＬの完全培地に懸濁した２×１０⁵細胞を乾燥スポンジの上面に重層した。それらは親水性であることから、スポンジは培地によって即座に湿潤し(細孔内の空気が液体で置換された)、よってスポンジの細孔内に毛管力によって細胞が引き込まれた。これによりスポンジ内の細胞の分布がより均一になる。接種されたスポンジを追加の培地を加えずに５％ＣＯ₂インキュベーター中で、３７℃、湿度９９％にて１時間インキュベートし、次いで完全培地１ｍＬを加えた。３〜５時間付着させた後(全アルギン酸塩ゲルへの最大付着は３時間以内に生じた)、培地を換えて付着していない細胞を除去し、次に細胞を完全培地中に毎日培地を換えながら維持した。細胞培養中の様々な時間に、対照皿（コラーゲン被覆）と試験用皿（アルギン酸塩スポンジ）内の細胞の数を、細胞の層またはスポンジをＰＢＳで２回洗浄した後、下記に詳述するような直接計数または生化学的アッセイによって測定した。各測定につき、３個の皿またはスポンジを用いた。直接計数および生化学的アッセイは下記のようにして行った：（ａ）直接計数：直接計数のために、細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて対照皿から除去し；アルギン酸塩スポンジを１ｍＬのクエン酸緩衝液４％(w/v)、ｐＨ７．４を用いて溶解させた後、そのスポンジから細胞を放出させた。細胞の数は、血球計算盤にて直接計数することによって測定した。（ｂ）ＬＤＨ試験によるもの：乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性をSigma キット（ＬＤＨ／ＬＤ No.ＤＧ1340-ＵＶ）を用いて測定した。細胞数は、凍結 −解凍（−２０℃−３７℃）を３サイクル行うことにより細胞を溶解させた後、酵素活性を測定することにより測定した。標準較正曲線は保存細胞培養液をさまざまに希釈したものを用いて作成した。ＬＤＨ活性と細胞数との一次関係を３× １０⁶細胞／ｍｌ以下の細胞濃度で観察した。（ｃ）ＭＴＴによるもの：ＭＴＴアッセイは、生細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素が可溶性黄色ＭＴＴ塩（3(4,5-ジメチル−チアゾール-2-イル)-2 ,5-ジフェニル−テトラゾリウムブロミド）を不溶性紫色ホルマザン塩に転化する能力に基づくものである。ＭＴＴ（Sigma）は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した保存溶液として製造した。溶解していない残留物を滅菌濾過によって除去した。保存溶液は暗所で４℃にて保存し、製造後３週間以内に使用した。６０μｌのＭＴＴ保存溶液を、スポンジを加えた１ｍＬ培養培地を含む２４−ウェルポリスチレンプレートのウェルに添加した。３７℃ で５時間インキュベートした後、ＭＴＴ含有培地を減圧吸引することによりウェルから除去することによってＭＴＴ転化を停止させた。得られた不溶性ホルマザン産物をイソプロパノール−０．０４ＮＨＣｌ溶液（２５０：１、体積比）１００ｍｌに溶解した。溶液の吸光度をイソプロパノール−ＨＣｌをブランクとして測定したところ、５６０ｎｍであった。（ｄ）ＤＮＡによるもの：全ＤＮＡ含量をBrunkら，(1979)の方法にしたがって測定した。この方法によれば、粗細胞ホモジェネートのＤＮＡ濃度を、ＤＮＡと結合した4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(ＤＡＰＩ)の蛍光増大を用いてナノグラムレンジで精度よく検出することができる。手短に言うと、細胞を接種したスポンジをクエン酸緩衝液で処理してスポンジを溶解させ、細胞を放出させた。細胞を、凍結−解凍（−２０℃−３７℃）を２サイクル行うことによって溶解し、その後２５ｍｌの１ＭＮａＯＨ中に分散し、その混合物を３０分間煮沸した。ＨＣｌを用いて中和した後、室温まで冷却して、蛍光染料ＤＡＰＩをトリス緩衝液ｐＨ７．０に１００ｎｇ／１００ｍＬで溶かしたものを加えた。サンプルを２８６ｎｍで励起したところ５４０ｎｍの蛍光放出が測定された。細胞の数を公知の濃度の細胞を用いて作成した較正曲線から推定した。（ｅ）アルブミン分泌の測定培養培地へのアルブミン分泌をラットアルブミンに特異的な抗体を用いてサンドイッチ型酵素結合イムノソルベントアッセイ（Schwererら，1987）によって定量した。手短に言うと、ヒツジ抗（ラットアルブミン）をコーティング炭酸塩緩衝液ｐＨ９．０に２μｇ／ｍＬで加えた溶液１００μＬを用いて４℃で一晩かけて９６−ウェルポリスチレンプレート（Nunc Immunoプレート）を被覆した。プレートを０．０５％v/v Tween20を含有するＰＢＳ(ＰＢＳ−Tween)で洗浄した後、プレートを１％(w/v)ゼラチン１００μＬを加えることによってブロックし、非特異的結合を低減させた。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ−Tweenで３回洗浄し、適正な希釈培地サンプル１００μＬをウェルに加えた。室温で２時間インキュベートした後、ウェルを上記のようにして洗浄し、その後ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗（ラットアルブミン）を加えたＰＢＳ（保存溶液を１：４０００希釈）１００μＬを室温で加えた。２時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ−Tweenで洗浄し、基質2,2'-アジノ-ジ-(3-エチルベンズチアゾリンスルホネート)（ＡＢＴＳ）(１ｍｇ／ｍＬ０．０１％(v/v)Ｈ₂Ｏ₂ を含む７７ｍＭリン酸ナトリウム／６１ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ４．０に加えたもの）１００μＬを各ウェルに加えて３７℃で１時間インキュベートした。０．３２％(w/v)フッ化ナトリウムを加えることにより酵素反応を停止させて、色の変化をＥＬＩＳＡリーダー（Denley、ＷＳ050 WellScan）を用いて分光光学的に監視したところ、４９０ｎｍの基準に対して４０５ｎｍであった。標準曲線の作成には純粋なラットアルブミン（Cappel）を用いた。アルギン酸塩スポンジ内で培養した肝細胞の上記分析の結果は下記のとおりである：最初に、アルギン酸塩スポンジ中で培養した細胞の全体の形態および性質を評価するために培養肝細胞を光学顕微鏡下で観察した。種々のインキュベーション継続時間で撮った光学顕微鏡写真の代表的な複製を図１３に示す。この図において上方の顕微鏡写真は接種時（インキュベーション１日目）における細胞を示すものであり、下方の顕微鏡写真は１０日間培養後の細胞を示すものであり、両顕微鏡写真の倍率は同じである。図１３に示した光学顕微鏡写真から、コラーゲン処理皿における通常の培養と比較していくつかの固有の特徴が観察された：１）肝細胞は主にアルギン酸塩スポンジの細孔内に固定されており；２）肝細胞の形態は培養全体を通して単層培養において通常見られる平らな伸張した形状というよりはむしろ球形で、この球形形態はin vivoで観察されるものと類似しており；そして３）スポンジのいくつかの部分に、肝細胞の回転楕円体が観察され得る(特に、図１３の上方の顕微鏡写真を参照されたい。)。さらに、図１３の両方の顕微鏡写真から、１０日間の培養においては(上方の顕微鏡写真と下方の顕微鏡写真を比較されたい)、大量の細胞増殖が生じるということが明白である。アルギン酸塩スポンジ内の肝細胞の数を分析するために、マトリックスをクエン酸緩衝液を用いて溶解させてマトリックスから肝細胞を放出させた。種々のインキュベーション時間における細胞の数を上記のようなＬＤＨおよびＤＮＡ含量によって検定した。その結果を図１４に示す。図１４は細胞の数を時間（インキュベーション日数）の関数としてグラフにして示したものである。これらの結果から、細胞がスポンジ内で増殖したことがわかる(主にＤＮＡ合成の増大からわかる)。アルギン酸塩スポンジ内でＤＮＡ合成を行う細胞による分化機能(differ entiated function)のパターンは、再生肝臓において報告されている肝細胞の挙動と同様である(Friedman，1984を参照されたい)。アルギン酸塩スポンジ内で肝細胞がどのように機能するかを調べるために、これらの細胞のアルブミン分泌能を調べた。その結果を図１５に示す。図１５は細胞によって分泌されたアルブミンの量（μｇ／日／１０⁶細胞）を時間（インキュベーション日数）の関数としてグラフにして示したものである。これらの結果から、アルギン酸塩スポンジ内で増殖した肝細胞からのアルブミンの分泌は、培養を１０日間以上行っても安定であるということがわかる(図１５の黒三角で示された結果を参照されたい)。対照的に、通常の培養（コラーゲン処理皿）においては、アルブミンの分泌は培養時間の経過とともに減少し、５日間の培養後はほとんどなくなった。実施例６スポンジ内での繊維芽細胞培養２４ウェルポリスチレンプレートのウェル内の平均サイズ１５×１０ｍｍ(直径×高さ)、約１．７ｃｍ³の体積のスポンジに、１０％ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ−ＦＣＳ）２００μＬに懸濁した、ヒト包皮から得られた２×１０⁵正常皮膚繊維芽細胞を接種した。接種されたスポンジを、追加の培地を加えずに５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃、湿度９９％にて１時間インキュベートし、次いでＤＭＥＭ−ＦＣＳを１ｍＬ加えた。培地は、３日毎に交換した。次いで、アルギン酸塩スポンジ内に接種した繊維芽細胞を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で分析した。かかる目的のために、インキュベーション中の接種スポンジからサンプルを採取し、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）用に固定した。手短に言うと、スポンジをＰＢＳで洗浄し、次に２％グルタルアルデヒド（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳ緩衝液中に室温で１時間、その後４℃で２４時間固定した。ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、スポンジを、それぞれ１０分間の段階的エタノール浸漬(g raded series of ethanol soaks)（１０〜９９．８％、１０％ずつ増大させる）により脱水した。サンプルを臨界点で乾燥し、上記のような超薄層（１００Å）の金で被覆した。通常、上記のＳＥＭによるアッセイは、繊維芽細胞接種アルギン酸塩スポンジの培養開始の５日後に行った。肝細胞の場合（上記参照）のように、繊維芽細胞はアルギン酸塩スポンジの細孔を選好した（図１６）。このことは、図１６に示したＳＥＭ顕微鏡写真において容易に観察できる。この図は、いくつかのそのような繊維芽細胞接種スポンジサンプルから作成された多数の類似の顕微鏡写真の代表例である。図１６の顕微鏡写真には、高倍率のもの（上方の顕微鏡写真）と低倍率のもの（下方の顕微鏡写真）の２種類の倍率のものを示すが、これらの写真から、繊維芽細胞はスポンジの細孔内で増殖するということは明白である。図１６において、両方の顕微鏡写真に細胞、細孔、細孔壁厚などの実際の大きさを測定するための目盛りを提供する印刷されたバーも含まれていることに気づくであろう。上方の顕微鏡写真中のバーは、１０μｍを表し、下方の顕微鏡写真中のバーは、１００μｍを表す。さらに、培養時間の経過に伴う細胞の付着およびその増殖はスポンジに有意な影響を及ぼさず、その最初の形状が維持されていた(結果は示していない)。このことは、アルギン酸塩スポンジ材がコラーゲンスポンジにまさるさらに別の利点を有するということを示すものである。以前の研究では、コラーゲン上で増殖した繊維芽細胞はその繊維芽細胞が増殖している新たに合成されたコラーゲン層を収縮させるので、細胞単層の「巻き上げ(roll-up)」を引き起こすということが示された(Rivardら，1995を参照されたい)。同様の様式で、接種されたコラーゲン気泡も５週間の培養後にその初期体積の約４０％まで収縮するので(Rivardら，1995) 、大量の細胞の移植に対して不適である。実施例７アルギン酸塩スポンジ内へのタンパク質含有微小球の封入細胞のin vivo増殖のためのスポンジの血管新生を増大させるために、血管新生因子をスポンジ内に挿入することができる。しかしながら、アルギン酸塩またはその他の多糖スポンジは、タンパク質またはペプチドを効果的に封入するには多孔質すぎるので、これらの分子はマトリックスから急速にもれることになる。それらのスポンジからの送達を長くするために、まず、これらの因子を、ポリ（乳酸／グリコール酸）などの小さい生分解性制御放出微小球内に封入し、次いでそれをスポンジ内に閉じ込めることができる。したがって、繊維芽細胞増殖因子またはその他の血管新生因子を含むポリ（乳酸／グリコール酸）微小球を、ダブルエマルション(double emulsion)に基づく溶媒蒸発法によって製造した(Cohenら，1991)。得られた微小球は、５〜２０μ ｍの直径を有しており、これを、アルギン酸塩溶液に本発明の方法を用いて激しく攪拌しながら架橋溶液を加えた後すぐに加えた(詳細については、実施例１を参照されたい)。次いで、アルギン酸塩ゲルを実施例１のようにして凍結し、凍結乾燥することにより、上記因子を含有せしめた微小球を含むスポンジが得られた。図１７は得られたスポンジのＳＥＭの複製である。上方の顕微鏡写真は低倍率のもので、下方の顕微鏡写真は高倍率のものであり、微小球がスポンジの細孔内にあることを示すものである。両方の顕微鏡写真におけるバーは、スポンジの細孔径および細孔壁厚ならびにスポンジ内の微小球の大きさの実際の大きさのパラメーターを測定するための目盛りを示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者コーヘン，スマダーイスラエル国 49581 ペタッチ―チクヴァ，ツフゾスイスラエルストリート 12

Claims

【特許請求の範囲】１．(i) 平均細孔径が約10μｍ〜約300μｍの範囲であり、(ii)細孔の壁厚である細孔間の平均距離が約５μｍ〜約270μｍの範囲であり、そして(iii)多糖スポンジの剛性の尺度であるＥ-弾性率が約50kPa〜約500kPaの範囲であることを特徴とする多糖スポンジ。２．前記スポンジがポリアニオン性多糖であるアルギン酸塩、ゲラン、ゲランガム、キサンタンキトサン、寒天、カラゲナンおよびポリカチオン性多糖であるキトサンから選択される多糖から成る、請求項１に記載の多糖スポンジ。３．前記スポンジは、（i）マンヌロン酸(M)残基含量が全残基の約25％〜約65％の範囲であり、(ii)グルロン酸(G)残基含量が全残基の約35％〜約75％の範囲であり、（iii）M/G比が約1/3〜約1.86/lであり、そして(iv)該スポンジが得られる１％w/vのアルギン酸塩を含む最終アルギン酸塩溶液の粘度が約50cP〜約800cPの範囲であることを特徴とするアルギン酸塩類の群から選択されるアルギン酸塩から成る、請求項１または２に記載の多糖スポンジ。４．前記スポンジが、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Protanal^TM LF 120(LF 120)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Protanal^TM LF 20/60(LF 20/60)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩MVG^TM (MVG)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TM HF 120(HF 120)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TM SF 120(SF 120)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TM SF 120 RB(SF 120 RB)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Pronatal^TM LF 200 RB (LF 200 RB)、Laminaria hyperborea由来のアルギン酸塩Manugel^TM DMB (DMB)、Macrocystis pyrifera由来のKeltone^TM HVCR(HVCR)、および Macrocystis pyrifera由来のKeltone^TM LV(LV)よりなる群から選択される褐藻由来のアルギン酸塩から成る、請求項３に記載の多糖スポンジ。５．前記スポンジが前記LF 120、LF 20/60およびHVCRよりなる群から選択されるアルギン酸塩から成る、請求項４に記載の多糖スポンジ。６．前記アルギン酸塩は、前記スポンジが得られる最終溶液中に約0.1％〜約２％w/vのアルギン酸塩濃度を与えるように、約１％〜約３％w/vのアルギン酸塩濃度を有するアルギン酸ナトリウム溶液の形で用いられる、請求項３〜５のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。７．前記スポンジがカルシウム、銅、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、スズ、亜鉛、クロム、有機カチオン、ポリ（アミノ酸）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（アリルアミン）、および多糖の塩類よりなる群から選択される架橋剤をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。８．前記スポンジが塩化カルシウム(CaCl₂)、塩化ストロンチウム(SrCl₂)およびグルコン酸カルシウム(Ca-Gl)よりなる群から選択される架橋剤をさらに含む、請求項７に記載の多糖スポンジ。９．前記架橋剤は、前記スポンジが得られる最終溶液中に約0.1％〜約0.3％ w/vの架橋剤濃度を与えるのに十分な濃度の架橋剤を含む架橋剤溶液の形で用いられる、請求項７または８に記載の多糖スポンジ。 10．前記スポンジが架橋剤を添加したまたは添加してない多糖溶液から製造されたものである、請求項１〜９のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。 11．前記スポンジが架橋剤を添加したまたは添加してないアルギン酸塩溶液から製造されたアルギン酸塩スポンジであり、前記架橋剤を添加したまたは添加してない最終アルギン酸塩溶液（この溶液から前記スポンジが得られる）が次のアルギン酸塩またはアルギン酸塩と架橋剤の濃度：(i)LF 120アルギン酸塩１％W/V、架橋剤なし；(ii)LF 120アルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl 0.1％ w/v；(iii)LF 120アルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl 0.2％w/v；(iv)LF 120アルギン酸塩１％w/vおよびSrCl₂ 0.15％w/v；(v)LF 120アルギン酸塩１％w/vおよびCaCl₂ 0.1％w/v；(vi)LF 120アルギン酸塩0.5％w/vおよびCa-Gl 0.2％w/v；(vii)LF 20/60アルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl 0.2 ％w/v；(viii)HVCRアルギン酸塩0.5％w/vおよびCa-Gl 0.2％w/v；ならびに(ix)HVCRアルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl 0.2％w/vを有する最終溶液の群から選択される、請求項10に記載の多糖スポンジ。 12．前記スポンジがLF 120アルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl架橋剤0.2％w/v の最終溶液から得られたものである、請求項11に記載の多糖スポンジ。 13．前記スポンジがHVCRアルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl架橋剤0.2％w/vの最終溶液から得られたものである、請求項11に記載の多糖スポンジ。 14．哺乳動物細胞をin vitroで増殖させるためのマトリックス、基体または足場として使用する、請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。 15．前記スポンジは切除されたまたは損傷を受けた組織を置換もしくは修復すべく患者に埋め込むためのマトリックス、基体または足場として用いられ、その際、前記埋め込まれたスポンジは周囲の組織が該スポンジに侵入し、その上で増殖し、損傷を受けたまたは切除された組織を置換するための基体、マトリックスまたは足場となるか、または前記埋め込まれたスポンジは周囲の宿主組織による血管新生のための初期基体となり、その後血管新生スポンジが宿主から選択したまたはin vitroで増殖させた注入細胞を受け取るための基体として役立ち、前記注入された細胞は血管新生スポンジ上で迅速に環境順化および増殖して、損傷を受けたまたは切除された組織を速やかに置換することができる、請求項1〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。 16．前記スポンジは目的の組織に治療薬を送達するための埋め込み支持体として用いられ、前記治療薬の送達は前記スポンジにより担持された治療薬を発現する遺伝子操作細胞または天然の細胞の働きによるものであり、前記細胞が治療薬を発現するか、または前記組織において治療薬を内因的に産生させる調節タンパク質を発現する、請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。 17．前記スポンジ中に担持された前記細胞により発現される治療薬が治療タンパク質であり、ここで前記細胞は前記タンパク質を発現するか、または前記スポンジが埋め込まれる組織において前記タンパク質を内因的に産生させる調節タンパク質を発現する、請求項16に記載の多糖スポンジ。 18．植物細胞および藻類のin vitro培養のためのマトリックス、基体または足場として用いられる、請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。 19．組織または臓器に、該組織または臓器用の治療薬をコードするまたは含有する遺伝子操作ウイルスベクター、非ウイルスベクター、ポリマー微小球およびリポソームを送達するためのマトリックス、基体または足場として用いられる、請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。 20．哺乳動物の卵母細胞の体外受精のためのマトリックス、基体または足場として用いられる、請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。 21．受精した哺乳動物卵母細胞またはin vitroで培養した他の哺乳動物細胞を保存するためのマトリックス、基体または足場として用いられる、請求項１〜13 のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。 22．前記スポンジの上または内部で増殖させた細胞を、組織の損傷、切除または機能不全のために前記細胞を必要としている患者の組織に移植するためのマトリックス、基体または足場として用いられる、請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジ。 23．請求項１〜22のいずれか１つに記載の多糖スポンジの製造方法であって、（a）水中に約１％〜約３％w/vの多糖を含有する多糖溶液を調製し、（b）約0.5％〜約２％w/vの多糖を含有する最終溶液を得たい場合は、前記多糖溶液を追加の水で希釈し、そして(a)の前記溶液をゲル化させて多糖ゲルとなし、（c）(b)のゲルを凍結し、そして（d）(c)の凍結ゲルを乾燥して多糖スポンジを得る、ことを含んでなる方法。 24．ゲル化工程(b)の間に(a)の前記多糖溶液に架橋剤を添加することをさらに含み、前記架橋剤がゲル化される最終溶液中の架橋剤の濃度を約0.1％〜約 0.3％w/vとする量で添加される、請求項23に記載の方法。 25．粉末状の多糖を二回蒸留した水に、溶液中の多糖の濃度を約１％〜約３％ w/vとする量で溶解することにより(a)の多糖溶液を調製し、前記多糖溶液をホモジナイザー中約25000 rpm、室温で約30分混合する、請求項23または24に記載の方法。 26．多糖溶液をホモジナイザー中約31800 rpmで約３分間激しく攪拌することによりゲル化工程(b)を行い、その際、架橋剤を前記溶液に添加する場合は、多糖溶液を激しく攪拌している間に架橋剤をゆっくりと添加する、請求項23〜25 のいずれか１つに記載の方法。 27．前記多糖が請求項４に記載のアルギン酸塩である、請求項23〜26のいずれか１つに記載の方法。 28．前記方法において、工程(b)でゲル化される最終溶液が、（i）LF 120アルギン酸塩１％W/V、架橋剤なし；(ii)LF 120アルギン酸塩１％w/vおよびCa- Gl 0.1％w/v；(iii)LF 120アルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl 0.2％ w/v；(iv)LF 120アルギン酸塩１％w/vおよびSrCl₂ 0.15％w/v；(v)LF 120アルギン酸塩１％w/vおよびCaCl₂ 0.1％w/v；(vi)LF 120アルギン酸塩0.5％w/vおよびCa-Gl 0.2％w/v；(vii)LF 20/60アルギン酸塩１％w/v およびCa-Gl 0.2％w/v；(viii)HVCRアルギン酸塩0.5％w/vおよびCa-Gl 0.2％w/v；ならびに(ix)HVCRアルギン酸塩１％w/vおよびCa-Gl 0.2％ w/vよりなる群から選択される、請求項27に記載の方法。 29．前記凍結工程(c)を、約-80℃の液体窒素浴中で約15分急速凍結することにより行う、請求項23〜28のいずれか１つに記載の方法。 30．前記凍結工程(c)を、約-18℃のフリーザー中で約８〜24時間ゆっくり凍結することにより行う、請求項23〜28のいずれか１つに記載の方法。 31．前記乾燥工程(d)を、圧力約0.007mmHgおよび約-60℃の条件下で凍結乾燥することにより行う、請求項23〜30のいずれか１つに記載の方法。 32．ゲル化工程(b)の激しい攪拌を開始する前に、架橋剤を添加したまたは添加してない最終多糖溶液を所望の形状の容器に注入し、前記容器が多糖スポンジの形状にとって望ましい形状をしている、請求項23〜31のいずれか１つに記載の方法。 33．哺乳動物細胞、植物細胞、藻類のin vitro増殖のための、または哺乳動物卵母細胞の体外受精のためのマトリックス、基体または足場としての請求項１〜 13のいずれか１つに記載の多糖スポンジの使用。 34．繊維芽細胞のin vitro増殖のための請求項33に記載の多糖スポンジの使用。 35．肝細胞のin vitro増殖のための請求項３３に記載の多糖スポンジの使用。 36．請求項15〜17のいずれか１つに記載される患者への埋め込みのためのマトリックス、基体または足場としての請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジの使用。 37．多糖スポンジ上でin vitro増殖させた細胞を、組織の損傷、切除または機能不全のために前記細胞を必要としている患者の組織に移植するためのマトリックス、基体または足場としての請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジの使用。 38．請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジ、および前記スポンジ上でin vitro増殖させた皮膚繊維芽細胞を含んでなる人工皮膚であって、前記細胞は人工皮膚を必要としている患者への移植に適した活動増殖期まで増殖させたものである、人工皮膚。 39．請求項１〜13のいずれか１つに記載の多糖スポンジ、および前記スポンジ上でin vitro増殖させた臓器の代表的細胞を含んでなる人工臓器等価物であって、前記細胞は十分に活動的で、前記臓器の活動的な細胞と等しくなる時期まで増殖させたものであり、前記人工臓器は臓器の損傷、切除または機能不全のためにそれを必要としている患者に移植するかまたは埋め込むのに適している、人工臓器等価物。 40．前記スポンジ上で増殖させた細胞が肝細胞である人工肝臓等価物であり、前記肝細胞は活動的で、体内の肝細胞と同様に機能する時期にあり、肝臓の機能不全、損傷または少なくとも部分的な切除を有する患者に移植するかまたは埋め込むのに適している、請求項39に記載の人工臓器等価物。