JP2000512842A

JP2000512842A - エンドグルカナーゼ

Info

Publication number: JP2000512842A
Application number: JP09542781A
Authority: JP
Inventors: ラム，デイビッド，イー．; メイサー，エリック，ジェイ．
Original assignee: ディベルサコーポレーション
Priority date: 1996-05-22
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2000-10-03
Also published as: EP0923608A1; US6074867A; IL127100A0; US6001984A; US5789228A; US6329187B1; CA2256302A1; WO1997044361A1; AU719444B2; AU3285297A; EP0923608A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、古細菌ＡＥＰIIｌａから得られる精製された熱安定性酵素を提供する。この酵素は、約６０．９キロダルトンの分子量とセルラーゼ活性（配列番号２）を有する。この酵素は、未変性のまたは組換え宿主細胞から生産することができ、所望の場合はセルロースの消化を助けるのに使用することができる。また配列番号２に対して相同性を有する他のエンドグルカナーゼも包含される。

Description

【発明の詳細な説明】エンドグルカナーゼ発明の分野本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産と単離に関する。さらに詳しくは、本発明のポリペプチドは、エンドグルカナーゼ、および特にカルボキシメチルセルラーゼ活性を有する酵素として同定されている。背景繊維状の強靭な水不溶性物質であるセルロースは、植物、特に茎、幹、樹幹の細胞壁、および植物組織のあらゆる木質部分に存在する。セルロースは量的に木の大部分を構成するが、綿はほとんど純粋なセルロースである。セルロースは、線状で分岐していない１０，０００〜１５，０００のＤ−グルコース単位のホモ多糖であるため、アミロースやグリコーゲンの主鎖に似ている。しかし非常に重要な違いがあり、セルロースではグルコース残基はベータ構造であるが、一方アミロース、アミロペクチンおよびグリコーゲンでは、グルコースはアルファ構造である。セルロース中のグルコース残基は、（ベータ１→４）グリコシド結合で連結している。この違いにより、セルロースとアミロースとでは、その３次元構造と物理的性質が非常に相違している。セルロースの（ベータ１→４）結合はアルファ−アミラーゼにより加水分解されないため、ほとんどの動物はセルロースを保存燃料源として利用できない。シロアリ（Termites）はセルロースを容易に消化するが、これは、シロアリは、腸管に共生微生物であるトリコニンファ（trichonympha）を有し、これがグルコース単位間の（ベータ１→４）結合を加水分解する酵素であるセルラーゼを分泌するためである。セルロースを食料として利用できる唯一の脊椎動物は、ウシやその他の反芻動物（ヒツジ、ヤギ、ラクダおよびキリン）である。これらの動物の別の胃である「ルーメン」は、セルラーゼを分泌する細菌や原生動物と協力するのである。セルロースの酵素的加水分解には、エンドグルカナーゼ（１，４−ベータ−Ｄ −グルカングルカノヒドロラーゼ）とエキソグルカナーゼ（１，４−ベータ−Ｄ −グルカンセロビオヒドロラーゼ）の両方の作用が必要であると考えられている。結晶性セルロースの完全な加水分解には、これらの酵素の相乗的な相互作用が必要である（Caughlin，M.P.，Genet．Eng．Rev.，3:39−109(1985)）。セルロースの完全な分解（セルロースからグルコースへ）には、「エキソ」酵素がグルコースを放出しない場合は、β−グルコシダーゼが必要となる。１，４−β−Ｄ −グルカングルコヒドロラーゼは、別の種類の「エキソ」セルラーゼである。好熱性細菌は、活性が強くかつ熱安定性のセルロース分解性およびキシラン分解性酵素の供給源として非常に注目されてきている（Bronneomeier，K．and Sta udenbauer，W.L.，D.R．Woods(Ed.)，The Clostridia and Biotechnology，Butt erworth Publishers，Stoneham，MA(1993)）。最近、現在知られているなかで最も好熱性の有機栄養性真正細菌が単離され、特性づけされた。サーモトガ（ther motoga）属に属するこれらの細菌は、種々の炭水化物を代謝する発酵性微生物である（Huber，R．and Stetter，K.O.，in Ballows，et al.，(Ed.)，The Procar yotes，2nd Ed.，Springer-Verlaz，New York，pgs.3809-3819(1992)）。 Huber et al.，1986，Arch．Microbiol．144:324-333では、細菌サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）の単離が記載されている。サーモトガ・マリチマ（T．maritima）は、絶対嫌気性の桿状の発酵性、高好熱性の真正細菌であり、５５℃〜９０℃の間で増殖し、最適増殖温度は約８０℃である。この真正細菌は、イタリアとアゾレス島の地熱で暖められた海底から単離された。サーモトガ・マリチマ（T．maritima）細胞は、鞘状構造と一鞭毛性鞭毛を有する。サーモトガ・マリチマ（T．maritima）は、ムレインと脂肪酸含有脂質、ジフテリア毒素耐性エロンゲーションファクター２、ＲＮＡポリメラーゼサブユニットパターン、および抗生物質への感受性を有することから、真正細菌界に分類される。現在のところ、古細菌のドメイン（domain）から同定された多くの生物は好熱性細菌または高好熱性細菌であるため、古細菌もまた、好熱性酵素の豊富な供給源であると考えられている。発明の概要本発明は、ポリヌクレオチド、およびこのポリヌクレオチドによりコードされる、カルボキシメチルセルラーゼ活性（ＣＭＣ）を有するエンドグルカナーゼ酵素として同定されているポリペプチドを提供する。本発明の１つの態様において、新規酵素、ならびにその活性断片、類似体および誘導体が提供される。本発明の別の態様において、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む、本発明の酵素をコードする単離された核酸分子、ならびにこのような酵素の活性類似体および断片が提供される。本発明の別の態様において、ＡＴＣＣ寄託番号９７５１６に含有されるＤＮＡにより発現される成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子が提供される。本発明のさらに別の態様において、本発明の酵素をコードする核酸配列を含有する組換え原核および／または真核宿主細胞を、該酵素の発現を促進する条件下で培養し、次いで該酵素を回収することを含む、組換え法によるこのようなポリペプチドの製造方法が提供される。本発明のさらに別の態様において、植物のバイオマスを燃料や化学物質に変換するための、界面活性剤として、繊維業界で、動物の餌として、廃液処理において、およびジュースの清澄化と抽出のためのフルーツジュース／醸造業界において使用するための、セルロースの分解のための上記酵素および上記酵素をコードするポリヌクレオチドの使用法が提供される。本発明のさらに別の態様において、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズする、充分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。本発明のさらに別の態様において、科学的研究、例えば他の生物からの同様の酵素をコードするかも知れない同様の配列を同定するためのプローブの作製に関連する、in vitro目的の、上記酵素、または上記酵素をコードするポリヌクレオチドの使用法が提供される。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書に記載の教示から当業者には明らかであろう。図面の簡単な説明以下の図面は、本発明の具体例を例示するためのものであり、請求の範囲に包含される本発明の範囲を限定するものではない。図１Ａ〜１Ｘは、本発明の酵素のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。配列決定は、３７８自動ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems ，Inc.）を使用して行なった。発明の詳細な説明「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生産に関与するＤＮＡのセグメントを意味する；これは、コード領域の前および後ろの領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに各コードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を単一のｍＲＮＡに転写し、次いでこれが、両方のコード配列由来のアミノ酸を有する単一のポリペプチドに翻訳される時、１つのコード配列はもう１つのコード配列に「機能的に連結」している。発現される配列が最終的に処理されて所望のタンパク質を生産するなら、コード配列は、互いに隣接している必要はない。「組換え」酵素とは、組換えＤＮＡ技術により生産される酵素；すなわち、所望の酵素をコードする外因性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から生産される酵素を意味する。「合成」酵素は、化学合成により製造される酵素である。特定の酵素のＤＮＡ「コード配列」または特定の酵素を「コードするヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたときに、転写され翻訳されて酵素を生成するＤＮＡ配列である。「プロモーター配列」とは、細胞内においてＲＮＡポリメラーゼを結合することができ、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、ＤＮＡ配列の一部である。この配列領域は、３’末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグランドより高い検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な成分である、最小限の数の塩基を含む。しかし、ＲＮＡポリメラーゼがこの配列に結合し、そして開始コドン（プロモーターを有する３’末端）で転写が開始された後に、転写は３’方向である下流に進む。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１によるマッピングにより定義すると便利である）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。本発明は、セルロース中のベータ１，４グリコシド結合の加水分解を触媒してセルロースを分解する、精製された熱安定性酵素を提供する。精製された酵素の例は、最適温度が非常に高い好熱性古細菌である、本明細書において「ＡＥＰII １ａ」と呼ぶ生物から得られるエンドグルカナーゼである。この生物は、絶対嫌気性であり、桿状で発酵性であり、５５℃〜９０℃（８５℃が最適）の間で増殖する。ＡＥＰII１ａは、イタリアのVulcanoの浅い海の熱水地域から発見された。この生物は、単一のまたは対になった球菌細胞を有する。ＡＥＰII１ａは、基質としてのセルロースとガス相の窒素を有する海水媒体中で、温度８５℃、ｐＨ６．５で最適に増殖する。この酵素の例を、図１Ａ、配列番号２に示す。配列番号２をコードするポリヌクレオチドは、もともと後述のＡＥＰII１ａから得られるゲノム遺伝子ライブラリーから回収された。これは、５５３アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する。ある実施態様において、本発明の配列番号２のエンドグルカナーゼ酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で測定されかつ遺伝子のヌクレオチド配列から推定される、分子量約６０．９キロダルトンを有する。この精製された酵素は、必要な場合は、セルロースの酵素的分解を触媒するのに使用することができる。本発明のエンドグルカナーゼ酵素は、非常に高い熱安定性を有し、キサントモナス・キャンペストリス（Xanthomonas campestris）由来のエンド−１，４−ベーターグルカナーゼと最も相同性が高く、アミノ酸レベルで５０％の同一性と７１％の類似性を有する。本発明の１つの態様において、図１Ａ〜Ｘの推定アミノ酸配列を有する成熟酵素をコードする、単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）が提供される。図１に開示のエンドグルカナーゼ酵素をコードする単離された核酸分子（配列番号１）以外に、本発明は、実質的に同様の配列も提供する。単離された核酸配列は：（ｉ）後述のストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズできるか；または（ii）配列番号１と縮重性のＤＮＡ配列をコードするなら、実質的に同様である。縮重ＤＮＡ配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードするが、ヌクレオチドコード配列中に変異を有する。本明細書において「実質的に同様」とは、本発明の配列と同様の同一性を有する配列をいう。実質的に同様のヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーションまたは配列比較により同定することができる。実質的に同様の酵素配列は、以下の１つまたはそれ以上の方法により同定することができる：タンパク質分解性消化、ゲル電気泳動、および／または微量配列決定。エンドグルカナーゼ酵素をコードする核酸分子を単離するための１つの方法は、当業者に公知の方法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology，Au subel F.M．et al．(EDS.)Green publishing Company Assoc．and John Wiley I nterscience，New York，1989，1992を参照）を使用して、天然のまたは人工的に設計したプローブを用いてゲノム遺伝子ライブラリーから釣りあげることである。配列番号１またはその断片（少なくとも１５の連続的ヌクレオチドを含む）は特に有用なプローブであることを、当業者は理解するであろう。この目的のための他の特に有用なプローブは、配列番号１とハイブリダイズ可能な断片である（すなわち、少なくとも１５の連続的ヌクレオチドを含む）。本明細書に開示の特定の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列に関して、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェンシーの低下した条件または中程度のもしくはより強いストリンジェントな条件下で行われる。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの例として、固定化された変性核酸を含有するポリマー膜を、まず０．９ＭＮａＣｌ、５０mM ＮａＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ７．０）、５．０mMＮａ₂ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１０Ｘデンハルツ、および０．５mg/mlポリリボアデニル酸からなる溶液中で、４５℃で３０分プレハイブリダイズする。次にこの溶液に、約２×１０⁷cpm（比活性４〜９×１０²cpm/μｇ）の³²Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを加える。１２〜１６時間のインキュベート後、０．５％ＳＤＳを含有する１×ＳＥＴ（１５０mM ＮａＣｌ、２０mMトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１mM Ｎａ₂ＥＤＴＡ）中で膜を室温で３０分洗浄し、次にオリゴ −ヌクレオチドプローブのＴｍ−１０℃で新鮮な１×ＳＥＴ中で３０分洗浄する。次にハイブリダイゼーションシグナルの検出のために、膜をオートラジオグラフィーフィルムに露光させる。ストリンジェントな条件とは、配列の間に少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起きることを意味する。J．Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd Ed.，1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)（これは参考のためにその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本明細書において「同一性」という用語は、参照ポリヌクレオチド（配列番号１）と同じ塩基をある百分率で含むポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、参照ポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一のポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドを構成する塩基の９０％と同一であるポリヌクレオチド塩基を有し、このポリヌクレオチド配列を構成する塩基の１０％と異なる塩基を有してもよい。本発明はまた、変化はサイレントな変化であり、例えば、その変化によりポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列が変化しないような、参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、参照ポリヌクレオチド（配列番号１）によりコードされる酵素のアミノ酸置換、付加、欠失、融合およびトランケーションを引き起こすヌクレオチドの変化に関する。本発明の好適な態様において、これらの酵素は、参照ポリヌクレオチドによりコードされる酵素と同じ生物学的作用を保持する。このようなプローブは、プローブの同定を促進するために、分析的に検出できる試薬で標識することができ、かつ標識することが好ましい。有用な試薬には、放射能、蛍光色素、または検出可能な生成物の生成を触媒することができる酵素があるが、これらに限定されない。すなわちプローブは、他の動物種からＤＮＡの相補的なコピーを単離するのに、または関連する配列についてそのような供給源をスクリーニングするのに有用である。本発明は、実質的に純粋なエンドグルカナーゼ酵素を提供する。「実質的に純粋な」という用語は本明細書において、他のタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、およびそれが天然において結合している他の生物学的物質を実質的に含まない分子、例えばポリペプチド（例えば、エンドグルカナーゼポリペプチド、またはその断片）を説明するのに使用される。例えば、実質的に純粋な分子（例えば、ポリペプチド）は、乾燥重量で少なくとも６０重量％の目的の分子である。ポリペプチドの純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、カラムクロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、およびアミノ末端アミノ酸配列解析を含む、標準的方法を使用して測定することができる。本発明に含まれるエンドグルカナーゼポリペプチドは、図１Ａ〜１Ｘに記載のエンドグルカナーゼのアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８）の１つ、例えばＡＥＰII１ａのアミノ酸配列（配列番号２）を有することができる。ＡＥＰII１ａから単離されるようなエンドグルカナーゼポリペプチドは、セルロース中のベータ１，４グリコシド結合の加水分解を触媒することにより特性づけられる。また本発明には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８の１つ、例えば配列番号２のような、エンドグルカナーゼポリペプチドの配列に「実質的に同一の」配列を有するポリペプチドも包含される。「実質的に同一の」アミノ酸配列は、参照配列と保存的アミノ酸置換によってのみ異なる配列であり、例えば、１つのアミノ酸を同じクラスの別のアミノ酸で置換（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような１つの疎水性アミノ酸を別の１つで置換、または１つの極性アミノ酸を別の１つで置換、例えばアルギニンをリジンで、グルタミン酸をアスパラギン酸で、またはグルタミンをアスパラギンで置換）、または１つまたはそれ以上の非保存的置換、欠失、または挿入があるが、このポリペプチドは、少なくとも１つのエンドグルカナーゼ特異的活性またはエンドグルカナーゼ特異的エピトープを保持する。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸がエンドグルカナーゼポリペプチドから欠失され、ポリペプチドの構造が改変されるが、その生物活性が大きく変化することはない。例えば、エンドグルカナーゼ生物活性に必要でないアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸は、除去することができる。このような改変により、より小さい活性なエンドグルカナーゼポリペプチドを開発することができる。本発明に包含される他のエンドグルカナーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８のエンドグルカナーゼの１つ、例えば配列番号２のような、エンドグルカナーゼポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。アミノ酸配列相同性を決定するための比較の長さは、例えば少なくとも１５アミノ酸、例えば少なくとも２０、２５、または３５アミノ酸である。相同性は、標準的配列解析ソフトウェア（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（1710 University Avenue，Madison，WI 53705）のGenetics Comp uter GroupのSequence Analysis Software Package；また前述のAusubelらも参照）を使用して測定することができる。本発明はまた、少なくとも１つのエンドグルカナーゼ特異的活性またはエピトープを保持するエンドグルカナーゼポリペプチドの断片を包含する。エンドグルカナーゼ活性は、セルロース中のベータ１，４グリコシド結合の触媒を調べることにより測定することができる。例えば、少なくとも８〜１０アミノ酸を含有するエンドグルカナーゼポリペプチド断片は、エンドグルカナーゼ特異的抗体の生産における免疫原として使用できる。この断片は例えば、エンドグルカナーゼで保存されているアミノ酸配列を含有することができ、そしてこのアミノ酸配列は、エンドグルカナーゼで保存されているアミノ酸を含有することができる。このような断片は、図１Ａ〜１Ｘ中のエンドグルカナーゼの配列を比較することにより容易に同定することができる。ペプチド免疫原として使用する以外に、上記エンドグルカナーゼ断片は、試料中のエンドグルカナーゼ特異的抗体の存在を検出するための免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）で使用することができる。本発明のエンドグルカナーゼポリペプチドは、いくつかの標準的方法のうちの任意の方法を使用して得ることができる。例えば、エンドグルカナーゼポリペプチドは、標準的組換え発現系（後述）、化学的合成（このアプローチは小さいエンドグルカナーゼペプチド断片に限定される）で生産されるか、または天然において発現している生物から精製することができる。本発明はまた、前述のエンドグルカナーゼポリペプチドをコードする単離された核酸分子、ならびにその断片を提供する。例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８のいずれかをコードする核酸は、本発明に包含される。これらの核酸は、天然に存在するヌクレオチド配列、またはエンドグルカナーゼをコードする天然に存在する核酸の配列とは異なるが遺伝コードの縮重のために同じアミノ酸をコードする配列も含む。本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド、またはこれらの組合せもしくは修飾物を含有することができる。本発明の核酸の例を、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７に示す。「単離された核酸」とは、この核酸の起源生物の天然に存在するゲノム中に存在する時は通常は直接隣接して存在する５’および３’フランキング配列に直接隣接していない核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。従ってこの用語は、例えばベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）中に取り込まれた核酸；異種細胞のゲノム（または同種細胞のゲノムであるが、天然に存在する部位とは異なる部位）に取り込まれた核酸；および別の分子として存在する核酸、例えば、ＰＣＲ増幅もしくは制限酵素消化により生産されるＤＮＡ断片、またはin vitro転写により生産されるＲＮＡ分子、を意味する。この用語はまた、例えば融合タンパク質の生産に使用できる追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を構成する組換え核酸を意味する。本発明の核酸分子は、エンドグルカナーゼ遺伝子産物（例えば、エンドグルカナーゼＲＮＡおよびエンドグルカナーゼポリペプチド）の生産のための標準的方法における鋳型として使用することができる。さらに、エンドグルカナーゼポリペプチド（およびその断片）および関連する核酸をコードする核酸分子、例えば（１）エンドグルカナーゼポリペプチドをコードする核酸と相補的な、またはこれとハイブリダイズする配列を含有する核酸、またはその断片（例えば、少なくとも１２、１５、２０または２５ヌクレオチドを含有する断片）；および（２）エンドグルカナーゼポリペプチドをコードする核酸に相補的な配列にハイブリダイズする配列を含有する核酸、またはその断片（例えば、少なくとも１２、１５、２０または２５ヌクレオチドを含有する断片）は、そのハイブリダイゼーション特性に注目する方法で使用することができる。例えば、後に詳述されるように、そのような核酸分子は以下の方法で使用できる：エンドグルカナーゼ核酸を合成するためのＰＣＲ法、試料中のエンドグルカナーゼ核酸の存在を検出するための方法、新しいエンドグルカナーゼファミリーメンバーをコードする核酸を同定するためのスクリーニング方法。本発明はまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８に加えて、エンドグルカナーゼポリペプチドファミリーのメンバーをコードする核酸分子を同定するための方法を包含する。これらの方法において、エンドグルカナーゼポリペプチドをコードする核酸を含有する試料（例えば、ｃＤＮＡライブラリーのような核酸ライブラリー）は、エンドグルカナーゼ特異的プローブ（例えば、エンドグルカナーゼ特異的核酸プローブ）でスクリーニングされる。エンドグルカナーゼ特異的核酸プローブは、エンドグルカナーゼポリペプチドをコードする核酸、またはその相補的な配列に、特異的にハイブリダイズする核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含有する分子、またはこれらの組合せもしくは修飾物を含有する分子）である。本発明の方法において「エンドグルカナーゼ特異的プローブ」という用語は、他の酵素をコードする核酸またはその相補的な配列に結合する程度より大きな程度に、検出可能に、エンドグルカナーゼポリペプチドをコードする核酸、またはその相補的な配列に結合するプローブを意味する。本発明は、エンドグルカナーゼ特異的核酸プローブの生産を促進する。このようなプローブを得るための方法は、図１に記載のアミノ酸配列に基づいて設計することができる。少なくとも１２（例えば、少なくとも１５、２５、３５、５０、１００、または１５０）ヌクレオチドを含有するプローブは、いくつかの標準的方法（例えば、前述のAusubelらを参照）の任意の方法を使用して作製することができる。例えば、好ましくは、ＰＣＲ増幅法を使用してプローブが作製される。これらの方法において、エンドグルカナーゼ保存配列（図１を参照）（これは、エンドグルカナーゼ特異的アミノ酸を含むことができる）に対応するようにプライマーが設計され、得られるＰＣＲ産物は、核酸ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡライブラリー）をスクリーニングするためのプローブとして使用される。本発明の別の態様において、生物学的材料の寄託のための適切な寄託機関に寄託されている、本発明の酵素の例（配列番号１）をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。寄託物は、図１ＡのＤＮＡを含むｐＱＥＴ（Qiagen， Inc.）プラスミドである。寄託は、１９９６年４月２２日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，U SA）に対して行われ、ＡＴＣＣ寄託番号９７５１６を割り当てられた。寄託は、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って行われた。特許の発行に伴い該菌株は、撤回されることなく無制限かつ無条件に公衆に解放されるであろう。寄託は当業者のための便宜を図ってなされるものであり、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション１１２で寄託が必要であることを承認するものではない。本明細書の配列の記載と何らかの矛盾が生じた場合は、寄託物中に含有されるポリヌクレオチドの配列、ならびにこれにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が支配的である。寄託物を作製、使用または販売するには許諾が必要であるが、ここではこのような許諾は認められない。本発明のエンドグルカナーゼ酵素のコード配列は、例えばＡＥＰII１ａゲノムＤＮＡライブラリーを調製し、エンドグルカナーゼ活性を有するクローンについてライブラリーをスクリーニングすることにより同定した。ゲノム遺伝子ライブラリーを構築するこのような方法は、当該分野で公知である。例えば１つの手段は、物理的破壊によりＡＥＰII１ａから単離されたＤＮＡを剪断することである。剪断された少量のＤＮＡをアガロースゲルでチェックして、大部分のＤＮＡが所望のサイズ範囲（約３〜６kb）にあることを証明する。次にＤＮＡを、Mung B ean Nucleaseを使用して平滑末端とし、３７℃でインキュベートし、フェノール／クロロホルムで抽出する。次にＥｃｏＲＩメチラーゼを使用して該ＤＮＡをメチル化する。次にＴ４ＤＮＡリガーゼを使用し、４℃でインキュベートして、ＥｃｏＲＩリンカーを平滑末端に連結する。次に連結反応を停止させ、ＥｃｏＲＩ制限酵素でＤＮＡを切断する。次に例えば、Maniatis，T.，et al.，Molecula r Cloning，Cold Spring Harbor Press，New York，1982（これは参考のためその全体が本明細書に組み込まれる）のような、当該分野で公知の方法に従って、スクロース濃度勾配でＤＮＡをサイズ分画する。次にプレートアッセイを行って、ＤＮＡのおよその濃度を求める。次に連結反応を行い、１μｌの連結反応物をパッケージングしてライブラリーを構築する。パッケージングは、例えば、ＥｃｏＲＩで切断した精製されたλｇｔ１１ファージアームと、ＥｃｏＲＩリンカーを結合した後にＥｃｏＲＩで切断したＤＮＡを使用して、行うことができる。該ＤＮＡとλｇｔ１１は、ＤＮＡリガーゼで連結される。次に、連結したＤＮＡを感染性ファージ粒子にパッケージングする。パッケージングされたファージは大腸菌（E．coli）培養物に感染させるのに使用され、感染細胞を寒天プレートに広げ、何千もの別個のファージプラークを有するプレートを得る。次にこのライブラリーを増幅する。好適な実施態様において、本発明の酵素は、以下の方法によりＡＥＰII１ａライブラリーから単離された：１．１mMのＩＰＴＧを上層アガロースとして含有するＬＢアガロースで、大腸菌（E．coli）Ｙ１０９０宿主中で、λｇｔ１１ＡＥＰII１ａライブラリーを、６つのＬＢ／Ｇｅ１Ｒｉｔｅ／０．１％ＣＭＣ／ＮＺＹ寒天プレート（〜４，８００プラーク形成単位／プレート）に広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。２．プレートを４℃で１時間冷却した。３．室温で１時間、プレートにDuralon膜（Stratagene）を重層し、膜の向きを修正し、プレートから取り上げて４℃で保存した。４．上層のアガロースを取り、プレートを７２℃で〜３時間インキュベートした。５．プレート表面をＮａＣｌでリンスした。６．プレートを、０．１％コンゴーレッドで１５分間染色した。７．プレートを、１ＭＮａＣｌで脱色した。８．プレート上で同定された陽性推定物をDuralon膜から単離した（陽性は、クローンの周りの清澄なゾーンにより同定される）。５００μｌのＳＭ＋２５μ ｌのＣＨＣｌ₃中でインキュベートして溶出させて、膜からファージを溶出させた。９．インサートＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）クローニングベクター（Stratagene）中にサブクローニングし、ＣＭＣａｓｅ活性について以下のプロトコールを使用してサブクローンを再度アッセイした：ｉ）クローンの１mlの一晩ミニプレップを、最高速度で３分間遠心分離する。 ii）上清をデカントし、これを用いて、ＬＢ／ＧｅｌＲｉｔｅ／０．１％ＣＭＣプレート中で作製した「ウェル」を満たした。 iii）７２℃で２時間インキュベートする。 iv）０．１％コンゴーレッドで15分間染色する。ｖ）１ＭＮａＣｌで１５分間脱色する。 vi）クローンの周りの清澄なゾーンにより陽性物を同定する。本発明の完全長遺伝子の断片は、完全長ＤＮＡを単離するために、および遺伝子と高度の配列類似性または同様の生物活性を有する他のＤＮＡを単離するために、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。この種のプローブは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてさらに好ましくは少なくとも３０塩基を有し、例えば少なくとも５０またはそれ以上の塩基を含有してもよい。プローブはまた、完全長転写物に対応するＤＮＡクローン、およびゲノムクローン、または制御領域およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全な遺伝子を含有するクローンを同定するために使用してもよい。次いで、単離された核酸配列および他の酵素は、例えば酵素的エンドグルカナーゼ活性を検出するためのアッセイにより、本発明の酵素に特徴的な生物活性の保持について測定される。このような酵素は、エンドグルカナーゼをトランケーションした型、および欠失変異体や挿入変異体のような変異体を含む。このようなアッセイの例としては、コンゴーレッドのような直接色素と多糖との特異的相互作用に基づく、エンドグルカナーゼ活性の検出のためのアッセイがある。この発色物質は、ベータ１，４グルカンと反応して色の赤方向へのシフトを引き起こす（Wood，P.J.，Carbohydr．Res.，85:271（1980）およびWood，P.J .，Carbohydr．Res.，94:cl9(1981)）。この試験の好適な基質はカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）であり、これは異なる供給源から得られる（Hercules Inc.，Wilmington，DE，Type 4M6FまたはSigmaChemical Company(セントルイス、ミズーリ州)、Medium Viscosity）。ＣＭＣは、最小寒天培地中に０．１〜１．０％の量で主炭素源として取り込まれる。これらのプレート上で微生物を直接スクリーニングすることが可能であるが、活性の視覚化には試薬を連続的に注ぐ必要があり、これが活性コロニーの再単離を困難にするため、マスタープレートからのレプリカプレート法が好ましい。コンゴーレッドの０．１％水溶液１０ml をプレートに注いで、適当なインキュベーション時間（増殖に依存して１〜３日間）後、このようなエンドグルカナーゼ生産コロニーが検出される。２０分後に色素を振り切り、プレートに１０mlの５ＭＮａＣｌ溶液（市販の塩が使用される）を注ぐことにより、発色を停止させる。さらに２０分後、塩溶液を捨てると、活性のある微生物の周りに薄いオレンジ色のゾーンによりエンドグルカナーゼ活性が現れる。ある場合には、プレートを１Ｎ酢酸で処理して、色素の色を青色に変化させることにより、これらのゾーンを増強することができる。培養ろ液中または酵素精製工程中のエンドグルカナーゼ活性の測定のための高感度のカップ−プレート拡散アッセイとして、同じ方法を使用することができる（Carger，J.H.，Anal．Biochem.，153：75(1986)）。総説については、セルラーゼ活性の測定法（Methods for Measuring Cellulase Activities）、Methods in Enzymology，Vol．160，pgs．87-116を参照。前述のハローがコロニーの周りに現れるため、本発明の酵素は、ＣＭＣ中のベータ１，４グリコシド結合の加水分解に関して酵素活性を有する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（これは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む）の型でもよい。ＤＮＡは２本鎖または１本鎖でもよく、１本鎖の場合は、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖でもよい。成熟酵素をコードするコード配列は、図１のコード配列および／または寄託されたクローンのコード配列（配列番号１）と同一でもよく、または遺伝コードの重複または縮重のために図１のＤＮＡ（例えば、配列番号１）と同じ成熟酵素をコードする異なるコード配列でもよい。図１の成熟酵素（例えば、配列番号２）をコードするポリヌクレオチドは：成熟酵素のコード配列のみ；成熟酵素のコード配列と、リーダー配列またはプロタンパク質配列のような追加のコード配列；成熟酵素のコード配列（および任意の追加のコード配列）および非コード配列、例えば成熟酵素のコード配列のイントロンまたは非コード配列５’および／または３’を含有してもよいが、これらに限定されない。「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」という用語は、酵素のコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列（例えば、配列番号２）を有する酵素の断片、類似体および誘導体をコードする、前述のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレレ変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体でもよい。すなわち本発明は、図１に示すものと同じ成熟酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびに図１の酵素の断片、誘導体または類似体をコードする変異体である上記ポリヌクレオチドの変異体を包含する。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体および付加変異体または挿入変異体を含む。前述したように、ポリヌクレオチドは図１に示すコード配列の天然に存在するアレレ変異体であるコード配列を有してもよい。当該分野で公知のように、アレレ変異体とは、コードされる酵素の機能を実質的に変化させない、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有するポリヌクレオチド配列の別の型である。本発明はまた、成熟酵素のコード配列は、宿主細胞の酵素の発現と分泌を助けるポリヌクレオチド配列（例えば、細胞からの酵素の輸送を制御するように機能するリーダー配列）と、同じ読みとり枠中で融合される、ポリヌクレオチドを含む。リーダー配列を有する酵素はプレタンパク質であり、酵素の成熟型を生成するために宿主細胞から切断されるリーダー配列を有することがある。このポリペプチドはまた、成熟タンパク質＋追加の５’アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードしてもよい。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、タンパク質の不活性型である。プロ配列がいったん切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。すなわち例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟酵素、またはプロ配列を有する酵素、またはプロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方を有する酵素をコードしてもよい。本発明はさらに、配列の間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するなら、前記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書において「ストリンジェントな条件」という用語は、配列の間に少なくとも９５％の同一性および好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合のみハイブリダイゼーションが起きることを意味する。好適な実施態様において前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のＤＮＡによりコードされる成熟酵素と実質的に同じ生物学的機能または生物活性を保持する酵素をコードする。あるいはこのポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、前述のようにこれと同一性を有し、かつ活性を保持するかまたは保持しない、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、およびより好ましくは少なくとも５０塩基を有してもよい。例えば、このようなポリヌクレオチドは、例えばポリヌクレオチドの回収のためまたはＰＣＲプライマーとして、配列番号１のポリヌクレオチドのプローブとして使用してもよい。すなわち本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８の酵素をコードするポリヌクレオチドと、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、およびより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびに少なくとも３０塩基および好ましくは少なくとも５０塩基を有するその断片、およびこのようなポリヌクレオチドにコードされる酵素に関する。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有する酵素、このような酵素の断片、類似体および誘導体に関する。「断片」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、図１の酵素について言及する時は、このような酵素と本質的に同じ生物学的機能または生物活性を保持する酵素を意味する。すなわち、類似体は、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟酵素を生産することができるプロタンパク質を含む。本発明の酵素は、組換え酵素、天然の酵素または合成酵素でもよいが、好ましくは組換え酵素である。図１の酵素の断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）により置換され、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるかまたはコードされないもの、または（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（iii）成熟酵素が、別の化合物例えば酵素の半減期を増加させるもの（例えば、ポリエチレングリコール）と融合したもの、または（iv）追加のアミノ酸（例えば、リーダー配列または分泌配列、または成熟酵素もしくはプロタンパク質配列の精製のために使用される配列）が成熟酵素に融合したもの、でもよい。このような断片、誘導体および類似体は、本明細書に記載の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。本発明の酵素およびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された型、および好ましくは均一に精製された型で提供される。「単離された」という用語は、物質がそのもともとの環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から離れていることを意味する。例えば、生きている動物中の天然に存在するポリヌクレオチドまたは酵素は単離されないが、天然の系の中の共存する物質の一部またはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたは酵素は単離される。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部でもよく、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたは酵素は組成物の一部でもよく、このようなベクターまたは組成物は天然の環境の一部ではないようにさらに単離される。本発明の酵素は、図１Ａ〜１Ｘの酵素（特に、成熟酵素）ならびに図１Ａ〜１Ｘの酵素と少なくとも７０％の類似性（好ましくは少なくとも７０％の同一性）を有する、およびより好ましくは図１Ａ〜１Ｘの酵素と少なくとも９０％の類似性（好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有する、およびより好ましくは図１Ａ〜１Ｘの酵素と少なくとも９５％の類似性（より好ましくは少なくとも９５％の同一性）を有する酵素を含有し、およびその酵素の一部が一般的に少なくとも３０アミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含有する酵素の一部を含有する。当該分野で公知のように２つの酵素の「類似性」は、１つの酵素と２つ目の酵素のアミノ酸残基およびその保存されたアミノ酸置換基を比較することにより決定される。類似性は、当該分野で公知の方法、例えばＢＬＡＳＴプログラム（Ba sic Local Alignment Search Tool at the National Cneter for Biological In formation）により決定される。変異体、すなわち「断片」、「類似体」、または「誘導体」酵素、および参照酵素は、アミノ酸配列が１つまたはそれ以上の置換、付加、欠失、融合、およびトランケーション（これらは任意の組合せで存在してもよい）により異なってもよい。好適な変異体は、保存的アミノ酸置換により参照と異なるものである。そのような置換は、ポリペプチド中のあるアミノ酸を同様の特徴を有する別のアミノ酸により置換するものである。保存的置換として典型的にみられるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の互いの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの交換、および芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。最も好ましいものは、それが異なる参照ポリペプチドと同じ生物学的機能と生物活性を保持する変異体である。本発明の酵素の断片または部分は、ペプチド合成により対応する完全長酵素を生産するのに使用できる；すなわち、断片は完全長酵素を生産するための中間体として使用される。本発明のポリヌクレオチドの断片または部分は、本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成するのに使用できる。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞に関し、組換え法による本発明の酵素の生産に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターで遺伝子操作される（形質導入または形質転換またはトランスフェクション）。このようなベクターは、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターでもよい。ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形でもよい。作製された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または本発明の遺伝子の増幅のために、適宜改変された通常の栄養培地中で培養される。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のための選択された宿主細胞ですでに使用されたものであり、当業者には明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、組換え法により酵素を生産するのに使用される。すなわち例えば、ポリヌクレオチドは、酵素を発現する種々の発現ベクターの任意のものに含有される。このようなベクターには、染色体性、非染色体性、および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）との組合せ由来のベクター、がある。しかし、宿主中で複製可能であり生存する限りは、他の任意のベクターが使用できる。適当なＤＮＡ配列が、種々の方法によりベクター中に挿入される。一般にＤＮＡ配列は、当該分野で公知の方法により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入される。このような方法および他の方法は、当業者の範囲内にある。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令するために適切な発現制御配列（プロモーター）に機能的に連結している。このようなプロモーターの代表的な例として：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（E．coli）ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核生物または真核生物細胞またはこれらのウイルス中で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターがある。発現ベクターはまた、翻訳開始および転写停止のためのリボゾーム結合部位を含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有してもよい。さらに発現ベクターは好ましくは、ジヒドロ葉酸レダクターゼまたは真核生物細胞培養のためのネオマイシン耐性、または大腸菌（E．coli）中のテトラサイクリンもしくアンピシリン耐性のような、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための１つまたはそれ以上の選択性マーカー遺伝子を含有する前述の適切なＤＮＡ配列を含有するベクター、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列は、適切な宿主を形質転換してタンパク質を発現させるのに使用される。適切な宿主の代表的な例として：細菌細胞、例えば大腸菌（E．coli）、ストペプトミセス（Streptomyces）、枯草菌（Bacillus subtilis）；真菌細胞、例えば酵母；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたはBowes黒色腫；アデノウイルス；植物細胞、などがある。適切な宿主の選択は、本明細書に記載の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。さらに詳しくは、本発明はまた、広く前述した１つまたはそれ以上の配列を含む組換え構築物を含む。この構築物は、フォワードまたはリバース方向で本発明の配列が挿入されたベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含む。この実施態様の好適な面において、構築物はさらに、例えば配列に機能的に連結したプロモーターを含む制御配列を含む。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。以下のベクターは例として記載される：細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Qiagen）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（Stratagene）；ｐＴＲＣ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Pharmacia）；真核細胞：ｐＸＴｌ、ｐＳＧ５（Strat agene）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Pharmacia）。しかし、宿主中で複製可能であり生存する限りは、他の任意のプラスミドまたはベクターが使用できる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択性マーカーを有する他のベクターを使用して、所望の遺伝子から選択することができる。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８とｐＣＭ７である。具体的な細菌性プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐがある。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ前早期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、早期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスからのＬＴＲｓプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。適切なベクターやプロモーターの選択は、当業者の技術のレベル内である。さらなる実施態様において、本発明は、前記構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、または酵母細胞のような下等真核生物細胞）でもよく、または宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）でもよい。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸塩カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、または電気穿孔法により行われる（Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Mo lecular Biology，(1986)）。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産するために従来法で使用することができる。あるいは本発明の酵素は、従来法のペプチド合成機により合成法で生産することができる。成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現することができる。細胞を含まない翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを使用して、そのようなタンパク質を生産するのに使用することができる。原核生物および真核生物宿主とともに使用するための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrook et al. ，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Har bor N.Y.，(1989)（その開示内容は参考のため本明細書に組み込まれる）に記載されている。高等真核生物による本発明の酵素をコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより上昇する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を上昇させる、通常約１０〜３００塩基対のＤＮＡのｃｉｓ作用性成分である。例としては、複製開始点１００〜２７０塩基対の後ろの方のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後ろの方のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。一般に組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製開始点と選択性マーカー（例えば大腸菌（E．coli）およびサッカロミセス・セレビッシエ（S．cerevisiae）ＴＲＰ１遺伝子のアンピシリン耐性遺伝子）、および下流の構造配列の転写を指令するための高度に発現された遺伝子から得られるプロモーターを含む。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などの解糖系酵素をコードするオペロンから得ることができる。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳停止配列、および好ましくは翻訳された酵素の分泌を指令することができるリーダー配列とともに適当な相に集合される。異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡単な精製）を付与するＮ−末端識別ペプチドを含む融合酵素を随時コードすることができる。機能性プロモーターとともに機能的な読みとり相で適当な翻訳開始シグナルおよび翻訳停止シグナルを有する所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより、細菌で使用するための有用な発現ベクターが構築される。このベクターは、ベクターの維持を確保するための、かつ所望であれば宿主内の増幅を提供するための、１つまたはそれ以上の表現型選択性マーカーと複製開始点を含むであろう。形質転換のための適当な原核生物宿主には、大腸菌（E．col i）、枯草菌（Baciilus subtilis）、サルモネラ菌（Salmonella typhimurium）、およびシュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトミセス（Streptomyces ）属、ブドウ球菌（Staphylococcus）属の種々の種があるが、他のものも選択して使用することができる。代表的なしかし非限定的な例として、細菌で使用するための有用な発現ベクターは、公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子成分を含む市販のプラスミド由来の、選択性マーカーと細菌の複製開始点を含む。このようなベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemica ls，Uppsala，Sweden）およびＧＥＭ１（Promega Biotec，Madison，WI，USA）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」セクションは、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と組合される。適当な宿主株の形質転換と宿主株を適当な細胞密度まで増殖後、選択されたプロモーターは、適当な手段（例えば、温度シフトまたば化学的誘導）により誘導され、細胞はさらなる期間培養される。細胞を典型的には、遠心分離により集め、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物をさらに精製するために保持する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、任意の便利な方法（凍結乾燥サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を含む）により破砕され、このような方法は当業者に公知である。組換えタンパク質を発現するのに、種々の哺乳動物細胞培養系も使用できる。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23:175(1981)が記載したサル腎繊維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性のあるベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株がある。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、および任意の必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写停止配列、および５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０スプライスから得られるＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝子成分を提供するのに使用される。この酵素は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む方法により、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。成熟タンパク質の立体配置を完了させるために、タンパク質再折り畳み工程を必要に応じて使用することができる。最後に、最終精製工程として高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。本発明の酵素は、天然の精製された生成物、または化学合成法の生成物でもよくあるいは原核生物または真核生物宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞培養物）から組換え法により生産してもよい。組換え生産法で使用される宿主に依存して、本発明の酵素はグリコシル化されるかまたはグリコシル化されていなくてもよい。本発明の酵素は、開始メチオニンアミノ酸残基を含有しても含有しなくてもよい。本発明の酵素は、このような酵素活性が必要であるかまたは所望である目的に使用される。好適な実施態様においてこの酵素は、セルロースの加水分解を触媒するために使用される。セルロースの分解は、植物バイオマスを燃料や化学物質に変換するのに使用してもよい。本発明の酵素はまた、界面活性剤および繊維業界、動物の飼料の生産、廃棄物処理、およびジュースの清澄化と抽出のためのフルーツジュース／醸造業界で使用される。好適な実施態様において、本発明の酵素は、熱に対して安定で耐熱性のある熱安定性酵素であり、セルロースの酵素的加水分解を触媒し、すなわち酵素は復元することができ、短時間（すなわち、５〜３０秒）または長時間（例えば、数分〜数時間）８０℃〜１０５℃の温度に暴露することにより活性を回復することができ、最適温度は６０℃以上である。この酵素、その断片または他の誘導体または類似体、またはこれらを発現する細胞は、これらに対する抗体を生産するための免疫原として使用することができる。これらの抗体は例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でもよい。本発明はまた、キメラ、１本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦab断片、またはＦab発現ライブラリーの生成物を含む。このような抗体および断片の生産のために、当業者に公知の種々の方法が使用される。本発明の配列に対応する酵素に対して生産される抗体は、動物に酵素を直接注入するかまたは動物（好ましくは、ヒトではない）に酵素を投与することにより得られる。こうして得られた抗体は次に、酵素自身に結合する。こうして酵素の断片のみをコードする配列を、全未変性酵素を結合する抗体を作製するのに使用することができる。次にこのような抗体は、酵素を発現する細胞から酵素を単離するのに使用することができる。モノクローナル抗体の製造のために、連続的な細胞株培養物により生産される抗体を提供する任意の方法を使用することができる。例としては、ハイブリドーマ法（Kohler and Milsteln，1975，Nature，256:495-497）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.，1983，Immunology Today4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Co le，et al.，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss ，Inc.，pp．77-96中）がある。１本鎖抗体の生産について記載された方法（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明の免疫原性酵素産物に対する１本鎖抗体を生産するように適合させることができる。また本発明の免疫原性酵素産物に対するヒト化抗体を発現するために、トランスジェニックマウスを使用することができる。本発明の酵素に対して作製された抗体は、他の生物や試料から同様の酵素についてスクリーニングするのに使用してもよい。そのようなスクリーニング法は当該分野で公知であり、例えばそのような１つのスクリーニング測定法は、「セルラーゼ活性の測定法」(Methods for Measuring Cellulase Activitles）、Metho ds in Enzymology，Vol 160，pp.87-116（これは参考のためその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。抗体はまた、この生物または他の生物から作製される遺伝子ライブラリーをスクリーニングして、このまたは交差反応活性を同定するためのプローブとして使用することができる。前記した系で生産されるポリペプチドの単離と精製は、具体的な系に適した従来法を使用して行われる。例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を用いる分取用クロマトグラフィーおよび免疫学的分離が使用できる。本明細書において「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン分子、ならびにエンドグルカナーゼポリペプチドのエピトープに結合することができる免疫グロブリン分子の断片、例えばＦab、Fab'、(Fab')₂、ＦｖおよびＳＣＡ断片を意味する。これらが得られる抗体の抗原（例えば、エンドグルカナーゼ抗原）に選択的に結合するある程度の能力を保持するこれらの抗体断片は、当該分野で公知の方法（例えば、Harlow and Lane、前述）および後述される方法を使用して作製することができる。（１）Ｆab断片は、抗体分子の１価の抗原結合断片からなり、酵素パパインで全抗体分子を消化して生産することができ、完全な軽鎖と重鎖の一部から構成される断片を与える。（２）抗体分子のＦab'断片は、全抗体分子をペプシンで処理し、次に還元して得ることができ、完全な軽鎖と重鎖の一部から構成される分子を与える。こうして処理した抗体１分子あたり２つのＦab'断片が得られる。（３）抗体の（Ｆab'）₂断片は、全抗体分子を酵素ペプシンで処理し、次に還元することなく得られる。（Ｆab'）₂断片は、２つのジスルフィド結合で結合している２つのＦab'断片のダイマーである。（４）Ｆｖ断片は、２つの鎖として発現された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作で作製した断片であると定義される。（５）１本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、適当な可動性を有するポリペプチドリンカーにより連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作で作製した１本鎖分子である。本発明において「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープ（例えば、エンドグルカナーゼ特異的抗体）に結合する、抗原上の抗原性決定基（例えば、エンドグルカナーゼポリペプチド）を意味する。抗原決定基は通常、分子の化学活性のある表面群（例えば、アミノ酸または糖鎖）から構成され、特異的３次元構造ならびに特異的電荷特性を有する。前述のように、エンドグルカナーゼ特異的抗体の生産に使用できる抗原には、エンドグルカナーゼポリペプチド（例えば、図１Ａ〜１Ｘのポリペプチド断片に示すエンドグルカナーゼのいずれか）を含む。動物を免疫するのに使用されるポリペプチドまたはペプチドは、標準的組換え、化学合成、または精製法で得られる。当該分野で公知のように、免疫原性を上昇させるために、抗原を担体タンパク質に結合することができる。一般的に使用される担体には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風毒素がある。結合したペプチドは次に、動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫するのに使用される。このような担体以外に、公知のアジュバントを抗原とともに投与して、強い免疫応答の誘導を促進することができる。エンドグルカナーゼ特異的ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、例えばエンドグルカナーゼポリペプチド（例えば、抗体が作製されるエンドグルカナーゼポリペプチド（またはその断片））を含有するマトリックスに結合し、そこから溶出することにより精製することができる。抗体精製と濃縮のための追加の方法は当該分野で公知であり、本発明のエンドグルカナーゼ特異的抗体を用いて実施することができる（例えば、C-oligan et al.，Unit 9，Current Proto cols in Immunology，Wiley Interscience，1994を参照のこと）。エンドグルカナーゼ特異的抗原に対応する抗イディオタイプ抗体もまた、本発明に包含され、標準的方法を使用して作製される。これらの抗体はエンドグルカナーゼ特異的抗体に対して作製され、従ってエンドグルカナーゼ特異的エピトープを模倣する。一対（例えば、抗体−抗原対、または核酸対）の分子のメンバーは、他の非特異的分子に結合するより強い親和性で互いに結合するなら、「特異的に結合」すると言われる。例えば、非特異的タンパク質への結合より効率的に結合する抗原に対して作製された抗体は、抗原に特異的に結合すると説明される。（同様に、核酸プローブは、塩基対合相互作用（前述）により標的と特異的２重らせんを形成するなら、核酸標的に特異的に結合すると説明することができる）。本発明をさらに、以下の例に関して説明する：しかし、本発明はこのような例により決して限定されるものではない。すべての部または量は、特に明記しない場合は、重量で記載される。本発明の１つの面において、図１Ａ〜１Ｘに示すようなエンドグルカナーゼ酵素の作製方法が提供される。この方法では、酵素をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、または４７）を含有する宿主細胞を、核酸の発現を可能にする条件下で増殖させ、この核酸によりコードされる酵素を単離する。宿主細胞の培養法は、実施例に記載されており、また当業者に公知である。好適な実施態様において本発明は、カルボキシメチルセルロースの分解方法を提供する。この方法では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または４８に示す酵素のような、本発明の酵素の分解的に有効な量にカルボキシメチルセルロースを接触させる。「分解的に有効な」量という用語は、酵素に接触しないカルボキシメチルセルロースに比較して、少なくとも５０％のカルボキシメチルセルロースを分解するのに必要な酵素の量を意味する。好ましくは、少なくとも８０％のカルボキシメチルセルロースが分解される。別の実施態様において本発明は、セルロース中のベータ１，４グリコシド結合を加水分解する方法を提供し、この方法では、本発明の酵素（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、または４８）の有効量をセルロースに与えて、グリコシド結合を加水分解する。「有効」量とは、酵素に接触しないカルボキシメチルセルロースに比較して、少なくとも５０％のグリコシド結合を分解するのに必要な酵素の量を意味する。好ましくは少なくとも８０％のグリコシド結合が加水分解される。以下の例の理解を促進するために、いくつかの頻繁に現れる方法および／または用語を説明する。「プラスミド」は、小文字のｐが先行し、および／または大文字および／または数字が続く。本明細書において出発プラスミドは、市販されているか、制限されることなく公に入手できるか、または入手できるプラスミドから公表された方法に従って作製することができる。さらに、記載のものと同等のプラスミドが当該分野で公知であり、当業者に公知であろう。ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中のある配列のみに作用する制限酵素でＤＮＡを触媒的に切断することを意味する。本明細書の種々の制限酵素は市販されており、その反応条件、補助因子および他の必要条件は、当業者に公知のように使用される。分析目的に、典型的には１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を、約２０μｌの緩衝溶液中で約２単位の酵素とともに使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的のために、典型的には５〜５０μｇのＤＮＡを、大量の２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素についての適切な緩衝液や基質のおよその量は、製造業者により特定されている。通常３７℃で約１時間のインキュベーション時間が使用されるが、供給元の指示に従って変えてもよい。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望の断片を単離する。切断した断片のサイズ分離は、一般的に、例えばGoeddel，D．et al.，Nuclei c Acids Res.，8:4057(1980)に記載の８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合成される１本鎖ポリヌクレオチドまたは２つの相補的なポリヌクレオチド鎖を意味する。このような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有しても有していなくてもよい。これを有していないものは、キナーゼの存在下でＡＴＰでリン酸を付加することなく、別のオリゴヌクレオチドに連結する。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片に連結するであろう。「連結」とは、２つの２重らせん核酸断片の間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味する（Maniatis，T.，et al.，前述、p.146）。特に明記しない場合は、連結は、連結されるＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０．５μｇあたり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）で、公知の緩衝液および条件を使用して行われる。特に明記しない場合は、形質転換はSambrook，Fritsch and Maniatus，1989の方法に記載のように行われる。以下の例は本発明を例示するものであり、決して本発明を限定するものではない。この例に記載の方法は、本発明のいくつかの面を実施するために使用される典型的なものであり、当業者に公知の他の方法を使用することもできる。以下の材料と方法は、例に記載の実験を実施するために使用された。実施例１エンドグルカナーゼの細菌での発現と精製ＡＥＰIIｌａゲノムライブラリーを、ラムダｇｔ１１クロ−ニングベクター（ Stratagene Cloning Systems）中で構築した。このライブラリーは、エンドグルカナーゼ活性についてＹ１０９０大腸菌（E．coli）細胞（Stratagene）中でスクリーニングし、陽性クローンを同定し単離した。このクローンのＤＮＡを、以下のプライマー配列を使用して１００μｌのＰＣＴ反応物中の鋳型として使用した：５’プライマー：AATAGCGGCCGCAAGCTTATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTG（配列番号４９）、３’プライマー：AATAGCGGCCGCGGATCCAGACCAACTGGTAATGGTAGCGAC（配列番号５０）。ＰＣＲ反応産物を精製し、ＮｏｔＩ制限酵素で消化した。消化産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫクローニングベクター（Stratagene）中にサブクローニングし、配列決定した。プライマー配列の作製に配列情報を使用し、次にこれを使用してエンドグルカナーゼをコードする標的遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマー配列は以下の通りである：５’プライマー：TTTATTCAATTGATTAAAGAGGAGAAAT TAACTATGATAAACGTTGCAACGGGAGAGGAG（配列番号５１）および、３’プライマー： TTTATTGGATCCTACTTTGTGTCAACGAAGTATCC（配列番号５２）。増幅産物を制限酵素ＭｆｅＩとＢａｍＨＩで消化した。次に消化産物を、ＭｆｅＩと適合性のあるＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩであらかじめ消化したｐＱＥベクター（Qiagen，Inc.）の修飾型であるｐＱＥＴクローニングベクターに連結した。ｐＱＥベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐ^r）、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能なプロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓ標識および制限酵素部位をコードする。増幅した配列を、ＲＢＳをコードする配列のフレーム内に挿入した。次に連結混合物を使用して、電気穿孔法により大腸菌（E．coli）Ｍ１５／ｐＲＥＰ４株（Qiagen，Inc.）を形質転換した。Ｍ１５／ｐＲＥＰ４は、プラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含有し、ｌａｃＩレプレッサーを発現し、カナマイシン耐性（Ｋａｎ^r）を付与する。陽性の組換え形質転換体を、前述の測定法により熱安定性ＣＭＣａｓｅ／エンドグルカナーゼ活性を有するものとして同定した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により確認した。所望の構築物を有するクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ/ml）とＫａｎ（２５μｇ/ml）を補充したＬＢ培地中で液体培養により一晩増殖させた（Ｏ／Ｎ）。Ｏ／Ｎ培養物を使用して、１：１００〜１：２５０の比で大きな培養物に接種する。細胞を光学密度６００（Ｏ．Ｄ．⁶⁰⁰）が０．４〜０．６になるまで増殖させた。次にＩＰＴＧ（「イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を、最終濃度１mMになるように加えた。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩレプレッサーを不活性化することによりＰ／Ｏを開き、遺伝子発現を増加させる。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次に遠心分離により細胞を採取した。上記のプライマー配列はまた、寄託された材料から上記のハイブリダイゼーション法により標的遺伝子を単離するのに使用することができる。添付の請求の範囲内で、上記の教示から本発明の多くの修飾および変更が可能であり、本発明を上記で具体的に説明した以外の方法で実施してもよい。上記の詳細な説明に関して本発明を説明したが、前記説明は本発明を例示するものであって、決して本発明の範囲を限定するものではない。本発明の他の面、利点、および修飾は、以下の請求の範囲内にある。本明細書に記載のすべての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、参考のためその全体が本明細書に組み込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、実質的に純粋なエンドグルカナーゼ。２．請求項１のエンドグルカナーゼをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。３．以下よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド：ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７；ｂ）ＴはＵでもよい、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、および４７；ｃ）ａ）およびｂ）に相補的な核酸配列；およびｄ）少なくとも１５塩基の長さであり、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズする、ａ）、ｂ）、またはｃ）の断片。４．ポリヌクレオチドは原核生物から単離される、請求項２のポリヌクレオチド。５．請求項２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。６．ベクターはプラスミドである、請求項５のベクター。７．ベクターはウイルス由来である、請求項５のベクター。８．請求項５のベクターで形質転換した宿主細胞。９．細胞は原核生物である、請求項８の宿主細胞。１０．請求項１のポリペプチドに結合する抗体。１１．抗体はポリクローナルである、請求項１０の抗体。１２．抗体はモノクローナルである、請求項１０の抗体。１３．以下よりなる群から選択されるメンバーを含む酵素：ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む酵素；およびｂ）ａ）の酵素に対して少なくとも３０アミノ酸残基を含む酵素。１４．核酸の発現を可能にする条件下で請求項８に記載の宿主細胞を増殖させ、この核酸によりコードされる酵素を単離する、ことからなる酵素の製造方法。１５．カルボキシメチルセルロースを請求項１の分解的に有効な量の酵素に接触させることからなる、カルボキシメチルセルロースの分解方法。１６．請求項１の有効量の酵素をセルロースに接触させて、グリコシド結合を加水分解することからなる、セルロース中のベータ１，４グリコシド結合の加水分解方法。