JP2000512844A - ベクターとして鳥類の感染性喉頭気管炎ウイルスを用いた鳥類用組換え生ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 配列NO.5のヌクレオチド1624〜3606に規定された挿入部位に挿入される非相同な塩基配列を少なくとも１つ有し且つ発現するILTVウイルスをベクターとして有する鳥類用組換え生ワクチン。このワクチンは特に、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、感染性滑液嚢炎ウイルス(IBDV)、マレック病ウイルス(MDV)、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、ニワトリの貧血症ウイルス(CAV)、ニワトリの肺炎ウイルスより成る群の中から選択される鳥類の病原物質の抗原をコード化する塩基配列を、好ましくは強い真核生物のプロモータの制御下で、含むことができる。多価ワクチン製剤も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 ベクターとして鳥類の感染性喉頭気管炎ウイルスを用いた 鳥類用組換え生ワクチン ベースとした鳥類用の組換え生ワクチンに関するものである。この生ワクチンは ワクチンを接種した動物が病原物質から効果的に保護される免疫を獲得するよう な条件で鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコードし且つ発現する少なくとも １つの非相同な塩基配列を遺伝子組み換えによって挿入したものである。 感染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)は、ニワトリ(L.E．HansonおよびT.J．Bagus t，Diseases of Poultry 9th edn 1991．pp 485-495．Ames，Iowa State Univer sity Press)の主な呼吸症状(感染性喉頭気管炎またはILT)を引き起こすαヘルプ スウイルス(B．Roizman，Arch．Virol．1992．123．425-449)である。この条件 に対して現在入手可能なワクチンは、飲料水およびエアロゾル(L.E．Hanson and T.J.Bagust，Diseases of Poultry 9th Edition 1991．pp485-495.Ames，Iowa State University Press)によって鼻腔内、結膜および総排出腔経路を含む各種 経路によって投与することができる弱毒化株を有する。 ILTVウイルスの分子生物学的研究によって、ウイルスゲノム(M.A.Johnson et al .，Arch.Virol.1991.119.181-198)を特徴付けし且ついくつかのウイルス遺伝子( A.M.Griffin，J.Gen.Vrol．1989.70.3085-3089)を同定することができる。これ らのウイルス遺伝子は下記をコード化する遺伝子を含む： チミジンキナーゼ（UL23）（A.M．Griffin,and M.E.G.Boursnell，J.Gen.Virol. 1990.71.841-850;C.L.Keeler et al.,Avian Dis.1991.35.920-929）と、糖蛋白 質gB（UL27）（A.M．Griffin，J.Gen.Virol.1991.72.393-398;K.Kongsuwan et a l.,Virology 1991.184.404-410；D.J.Poulsen et al.,Virus Genes 1991．5.335 -347）と、糖蛋白質gC（UL44）(D.H.Kingsley et al.,Virology 1994.203.336-3 43)と、キャプシド蛋白質p40(UL26)(A.M．Griffin,Nucl．Acids Res.1990.18.36 64)と、単純ヘルプス（HSV-1）のICP4蛋白質と相同な蛋白質 （M.A.Johnson et al.,Virus Research 1995.35.193-204）と、蛋白質ICP27(UL5 4)と相同な蛋白質と、HSV-1の糖蛋白質gK(UL53)およびＤＮＡヘリカーゼ（UL52 ）（M.A.Johnson et al.,Arch Virol 1995.140.623-634）と、リボヌクレオチド 還元酵素（A.M．Griffin，J.Gen.Virol.1989.70.3085-3089，WO-A-90/02802号） と、ゲノム独特の短配列(Us)に存在する遺伝子(M.A.Johnson et al.,DNASequenc e-The Journal of Sequencing and Mapping 1995.Vol.5.pp 191-194;K.Kongsuwa n et al.,Arch Virol 1995.140.27-39；K.Kongsuwan et al.,Virus Resear ch 1993.29.125-140；K.Kongsuwan et al.,Virus Gene 1993．7.297-303;WO-A- 92/03554号、WO-A-95/08622号)。 本発明の目的は、ワクチンを接種した宿主の免疫を良好な安全性を維持しながら 複製且つ誘導することができる、非相同な遺伝子を発現する組換えILTVウイルス をベースとする鳥類のワクチンを開発することにある。 本発明の他の目的は、さらに感染性喉頭気管炎(ILT)に対して特に効果的である ワクチンを提供することにある。 本発明の他の目的は、粘膜経路、例えばエアロゾル経路または飲料水による大量 の予防接種で使用することができ、粘膜レベルでウイルスを複製することによっ て粘膜および全身の免疫を誘導することができるワクチンを提供することにある 。このような粘膜の免疫は呼吸器疾患並びに病原物質が粘膜経路で侵入する他の 疾患と戦うのに特に効果的である。 本発明の他の目的は、動物の子にも成体にも使用することができるワクチンを提 供することにある。 特殊な目的は、動物の子、例えば生後１日のヒナへの粘膜経路による大量の予防 接種で使用することができるワクチンを提供することにある。 本発明の他の目的は、親株と同じ大きな効力を有し且つ非相同な遺伝子を挿入・ 発現することさえできる抗ILTワクチンを提供することにある。 ILTVウイルスの研究中に、本発明者は非相同な遺伝子を挿入するための部位とし て完全に適したゲノム領域を発見した。これによって、ILTVベクターをベースと する組換え生ワクチンを開発することができた。このILTVベクターには、ニュー カッスル病ウイルス(NDV)の鳥類の免疫原、特にHNおよびＦ蛋白質、および／ま たはマレック病ウイルス(MDV)の糖蛋白質gB、および／または感染性滑液嚢炎ウ イルス(IBDV)のVP2蛋白質、および／または、感染性気管支炎ウイルス(IBV)のＳ およびＭ蛋白質をコード化する少なくとも１つの配列が挿入されている。NDV、M DVおよびIBV蛋白質をコード化する配列を組み込んだワクチンは動物をニューカ ッスル病、マレック病、感染性滑液嚢炎、感染性気管支炎からそれぞれ十分に守 ることができる。 本発明の対象は、特異的なILTV株において配列NO.5のヌクレオチド1624〜3606に 規定された挿入部位に挿入された、特に鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコ ード化且つ発現する非相同な塩基配列を少なくとも１つ含むILTVウイルスをベク ターとして有する鳥類用組換え生ワクチンにある。 非相同な配列とは、挿入部位に由来しない配列、すなわちILTVウイルス由来の配 列およびこのウイルスの他のゲノム領域に由来の配列の両者を意味する。 挿入領域への挿入とは、特に単純に行う挿入または完全または部分的に欠失させ て行う挿入を意味する。 この挿入領域には配列NO.5のヌクレオチド1713〜2897に出現するオープンリーデ イングフレーム（ORF B）および、ORF B−ORF Cの遺伝子間領域（ヌクレオチド2 898〜3606）が決定されている。従って、両者をORF Bまたは遺伝子間領域に挿入 し、これら２つの領域をオーバーラップすることができる。１つまたは複数の発 現カセットを挿入することができ、それぞれ発現すべき少なくとも１つの配列を 有する。 挿入される配列を発現するために、強い真核生物プロモータ、例えばCMV即時初 期プロモータ(IE)、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモータおよびSV40ウイル ス初期プロモータを使用するのが好ましい。 CMV即時初期プロモータ(IE)とは、例に挙げた断片およびそれと同じプロモータ 活性を保持するサブ断片を意味する。 CMV IEプロモータはヒトのプロモータ(HCMV IE)またはネズミのプロモータ(MCMV IE)あるいは由来の異なるCMV IEプロモータ、例えばサル、ラット、モルモット またはブタ由来のプロモータにすることができる。 ILTVベクターに挿入され、発現される塩基配列は鳥類の病原物質の抗原ポリペプ チドすなわち本発明の提供する好適な条件のもとで発現された時に、予防接種を した動物が病原物質から効果的に防御されるような免疫を獲得できるようなポリ ペプチドをコード化する任意の配列にすることができる。従って、所定の病気の 対象となる抗原をコード化する塩基配列を本発明の条件下で挿入することができ る。 ILTVベクターに挿入される塩基配列は免疫調節性ボリペプチド、特にサイトカイ ンをコード化することもできる。 驚くべきことに、本発明の組換え体は卵の状態での予防接種や生後１日目のヒナ の予防接種、さらに大きなヒナや成鳥の予防接種で使用することができる。各種 投与経路：非経口経路、または口鼻などの粘膜経路（飲料水、エアロゾル）、結 膜（点眼）または総排出腔経路を用いることができる。粘膜による大量の予防接 種（飲料水、エアロゾル）が可能な経路が好ましい。 本発明は、病原物質の自然な侵入経路の遮断によって呼吸症状および全身症状の 両者に対して防御するのに特に有用であることがわかった。 本発明は特にNDVウイルスの抗原蛋白質、特にHN糖蛋白質またはＦ糖蛋白質を適 切にコード化する塩基配列の挿入に使用することができる。これによって得られ る組換え生ワクチンは感染性喉頭気管炎に対する防御に加えてニューカッスル病 に対して完全に防御できる。 ニューカッスル病に対する組換えワクチンは１回の投与量当り10〜104PFUの濃度 で与えるのが好ましい。 本発明の他の好ましいケースは、他の鳥類の病原物質の抗原をコード化する塩基 配列、特に下記のものを挿入したものであるが、下記に限定されるものではない ：マレック病のウイルスの抗原をコード化する塩基配列、特にgB、gDおよびgH+g L遺伝子（ＰＣＴ特許公開第90/02803号）、感染性滑液嚢炎ウイルスの抗原をコ ード化する塩基配列、特にVP2遺伝子、感染性気管支炎ウイルス(IBV)の抗原をコ ード化する塩基配列、特にＳおよびＭ遺伝子(M.Binns et al.，J.Gen.Virol.198 5.66.719-726;M.Boursnell et al.,Virus Research 1984.1.303-313)、ニワ トリの貧血症ウイルス(CAV)の抗原をコード化する塩基配列、特にVP1(52kDa)+VP 2(24kDa)(N.H.M.Noteborn et al.,J.Virol.1991.65.3131-3139)、ILTVウイルスの抗原をコード化する塩基配列 、特にgB(A.M.Griffin，J.Gen.Vrol．1991.72.393-398)またはgD(M.A.Johnson e t al.,DNA Sequence-The Journal of Sequenclng and Mapping 1995.Vol.5.pp 1 91-194．Harwood Academic Publishers GmbH)、またはgp60(K.K.Kongsuwan et a l.,Virus Genes 1993．7.297-303)に関してコードする遺伝子、感染性「頭部腫 大症候群」ウイルス（またはニワトリの肺炎症ウイルスまたは七面鳥の鼻気管炎 ウイルス(TRTV);肺炎）の抗原をコード化する塩基配列、特に融合糖蛋白質F(Q.Y u et al.,J.Gen.Virol.1991.72.75-81)、または付着糖蛋白質Ｇ(R.Ling et al., J.Gen.Virol.1992.73.1709-1715;K.juhasz and J.Easton.J.Gen.Virol.1994.7 5.2873-2880)。投与量はニューカッスルワクチンで確認されたものと同じにする のが好ましい。 本発明の枠内では、同じILTVウイルス、特にこの部位に２種以上の非相同な配列 を挿入することは当然可能である。特に、同じILTVウイルスにこの同じウイルス または異なるウイルスに由来の配列を挿入することができ、さらにILTVおよび他 の鳥類のウイルスの配列が挿入されている。同じILTVウイルスと免疫調節物質、 特にサイトカインをコード化する配列とを連結することもできる。 例えば、CMV IEプロモータを別のプロモータにこれらの末端5'が隣接する（転写 が反対方向に起こる）ように連結し、２つの塩基配列は一方はCMV IEのプロモー タの制御下に挿入し、もう一方は該プロモータに連結されたプロモータの制御下 に挿入できるようにする。この構成はCNV IEプロモータ、特にそのエンハンサー 部分によって連結されたプロモータによって誘導される転写が活性化されるとい う点で特筆すべきものである。連結されるプロモータは特にILTVウイルスあるい はMDVまたはHVTウイルスの遺伝子のプロモータにすることができる。 本発明の典型的なケースは、NDV HNをコード化する塩基配列を含み且つNDV Fま たは他の鳥類疾患の抗原、特に上記のものをコード化する塩基配列を含み、遺伝 子の一方はCMV IEプロモータの制御下にあり、もう一方は連結されるプロモータ の制御下にあるワクチンである。 由来の異なる２種のCMV IEプロモータをこれらの末端5'が隣接するように並べる ことも可能である。 当然、非相同な配列およびこれらの連結されるプロモータは挿入部位に、標準的 に直列に、すなわち転写と同じ方向に従って挿入することができる。 挿入部位に挿入される複数の非相同な遺伝子は特に下記のウイルスから得られた 「IRES」（内部リボソーム侵入部位）とよばれる配列の挿入によっても発現する ことができる： ピコルナウイルス、例えばブタの小嚢病ウイルス(SVDV;B.-F．Chen et al.，J.V irology,1993,67,2142-2148)、脳心筋炎ウイルス（EMCV;R.J.Kaufman et al.,Nu cleic Acids Research，1991,19,4485-4490）、手足口病ウイルス(FMDV;N.Luzan d E.Beck,J.Virology,1991,65,6486-6494)、または他に由来のウイルス。これら ３つの論文の内容は参考として本明細書の一部を成す。従って、２つの遺伝子を 発現するためのカセットはプロモーター遺伝子１-IRES-遺伝子２−ポリアデニレ ーションシグナルの最小構造を有する。本発明の組換え生ワクチンは従ってプロ モータと、IRESによって対で分離された２つまたはそれ以上の遺伝子と、ポリア デニレーションシグナルとを連続して含む発現カセットを、挿入部位に挿入され た状態で有する。 本発明の部位への挿入に加えて、ゲノム内の他の部位で１つまたは複数の他の挿 入、１つまたは複数の変異、または１つまたは複数の欠失を行うことができる。 すなわち、親株が毒性である場合は、チミジンキナーゼ遺伝子、リボヌクレオチ ド還元酵素遺伝子、gE遺伝子などの毒性に関与する遺伝子を例えば（欠失、挿入 または変異によって）不活性化することができる。いかなる場合でも、本発明に 記載の部位以外の部位に挿入することによって他の遺伝子を発現することができ る。 本発明の対象はさらに、主なILTV免疫原をコード化する遺伝子、好ましくはgB（ A.M.Griffin，J.Gen.Vrol．1991.72.393-398）またはgD(M.A.Johnson et al.，D NASequence-The Journal of Sequencing and Mapping 1995.Vol.5.pp 191-194． Harwood Academic Publishers GmbH)、またはgp60(K.K.Kongsuwan et al.,Virus Genes 1993．7.297-303)に関してコードする遺伝子、外来プロモータ、特に上 記の強いプロモータの上流に挿入した、組換えILTVウイルスを有する、ILTに対 するワクチンにある。これによって、１つまたは複数のこれら遺伝子の発現 のレベルを上げることができ、従ってワクチンのILTに対する有効性が増大する 。当然、この構成と、挿入部位への非相同な配列の挿入を有する上記の構成とを 組合せることができる。 本発明の対象はさらに、異なる病原体に由来する異なる配列を挿入された上記定 義の組換え生ワクチンと他のワクチン、特に他の鳥類用組換え生ワクチンとを含 む混合物または混合用の多価ワクチン製剤にある。 本発明の対象はさらに、上記説明から明らかなように、本発明のワクチンの調製 方法にある。 本発明は、さらに、上記定義の組換え生ワクチンまたは多価ワクチン製剤を投与 する鳥類の予防接種法に関するものである。本発明は特に卵の状態での予防接種 、生後１日またはそれ以上のヒナおよび成鳥の予防接種を行うための方法を対象 にする。ワクチンの各種投与経路（上記参照）を用いることができ、粘膜による 大量の予防接種（エアロゾル、飲料水）が可能な経路が好ましく、ワクチンの投 与量は動物１個体当り101〜104で選択するのが好ましい。 本発明の対象はさらに、上記の挿入部位に挿入された、少なくとも１つの非相同 な上記の塩基配列を有するILTVウイルスにある。 本発明の対象はさらに、配列NO.5のヌクレオチド１〜3841の完全または部分的な 配列から成るＤＮＡ断片にある。 以下、図を参照して非限定的な実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。 図１： 制限地図、クローン化断片の位置およびORFsの位置 図２： 3841 bpの配列およびORFs A，BおよびCの翻訳 図３： プラスミドpMB 035の製造模式図 図４： プラスミドpMB 039の製造模式図 図５： プラスミドpMB 042の製造模式図 図６： プラスミドpEL 024の製造模式図 図７： プラスミドpEL 027の製造模式図 図８： プラスミドpMB 043の図 図９： プラスミドpCD 009の製造模式図 図10： プラスミドpEL 070の製造模式図 図11： プラスミドpMB 044の図 図12： プラスミドpMB 045の図 図13： プラスミドpMB 046の図 図14： NDV HN 遺伝子の配列 図15： プラスミドpEL 030の製造模式図 図16： プラスミドpMB 047の図 図17： プラスミドpEL 033の図 図18： プラスミドpMB 048の図 図19： 二重発現カセットの図 図20： プラスミドpCD 011の図 図21： プラスミドpMB 049の図 配列リスト： 配列 NO.1 オリゴヌクレオチドEL207 配列 NO.2 オリゴヌクレオチドEL208 配列 NO.3 オリゴヌクレオチドLPO18 配列 NO.4 オリゴヌクレオチドLPO20 配列 NO.5 配列決定されたSalI-BamHI断片の配列（3841 bp;図２参照） 配列 NO.6 オリゴヌクレオチドMB088 配列 NO.7 オリゴヌクレオチドMB089 配列 NO.8 オリゴヌクレオチドMB090 配列 NO.9 オリゴヌクレオチドMB091 配列 NO.10 オリゴヌクレオチドMB092 配列 NO.11 オリゴヌクレオチドMB093 配列 NO.12 オリゴヌクレオチドMB070 配列 NO.13 オリゴヌクレオチドMB071 配列 NO.14 NDV HN 遺伝子の配列（図14参照） 配列 NO.15 オリゴヌクレオチドEL071 配列 NO.16 オリゴヌクレオチドEL073 配列 NO.17 オリゴヌクレオチドEL074 配列 NO.18 オリゴヌクレオチドEL075 配列 NO.19 オリゴヌクレオチドEL076 配列 NO.20 オリゴヌクレオチドEL077 配列 NO.21 オリゴヌクレオチドCD001 配列 NO.22 オリゴヌクレオチドCD002 配列 NO.23 オリゴヌクレオチドCD003 配列 NO.24 オリゴヌクレオチドCD004 実施例 全てのプラスミドの作製はサムブルック(Sambrook)達のMolecular Cloning：A L aboratory Manual.第２版、Cold Spring Harbor Laboratory．Cold Spring Harb or New York.1989)に記載の分子生物学の標準的手法で行った。本発明で使用し た全ての制限酵素断片はジェネクリーン(Geneclean)キット(BIO 101 Inc.La Jol la，CA)を用いて単離した。 親ウイルスとして使用したウイルスはJ.R.Andreasen達の（Avian Diseases.1990 .34.646-656）に記載のワクチンの株またはSelect labpratories 10026 Main St reet P.O.Box ６ Berlin，Maryland 21811,USAで得られたT-2012-8-66株よりな る群の中から選択することができる。さらに、毒性の株、例えばN-71851株(ATCC VR-783)またはUSDAの83-2株を使用することもでき、これらは公知の方法、例え ばWO-A-95/08622号に記載の方法によって弱毒化することができる。 実施例１：ILTVウイルスの培養： ILTVウイルスはニワトリの腎臓の初代細胞(CKC)上で培養する。この細胞は75ｃ ｍ²の培養フラスコ（２×１０５細胞／ｃｍ²）内に３％の牛胎児血清(FCS)を添 加したMEM培地で１日または２日培養し、その後接種する。 接種日には、1000投与量の凍結乾燥したワクチンを入れたフラスコを、１％のFC Sを添加したMEM培地10mlに再懸濁する；次いで、この溶液約0.5ｍｌをCKC培 地に沈着させる。翌日、この培地が変化し、翌々日、細胞変性効果(CPE)が汎化 したとき、培養フラスコを-70℃で凍結させる。 ILTVウイルスの培養は不死化したニワトリの肝細胞、特にLMH系統（W.M.Schnitz lein et al，Avian Diseases.1994.38.211-217）で行うこともできる。 実施例２：ILTVのゲノムＤＮＡの調製： ２回の凍結／融解サイクルの後、ILTV培養物（75ｃｍ²の２つのフラスコ）を回 収し、低速（20ロータ、Beckman JA 21遠心分離機で5000回転／分）で５分間遠 心分離して大きな細胞片を除去する。次いで、上澄みを超遠心分離する（TLA100 .3ロータ、Beckman TL 100遠心分離機で100,000回転／分で１時間）。このペレ ットを1.6ｍｌのTEN-SDS(10mM Tris pH8.0;1mM EDTA；0.5M NaCl;0.5％の硫酸ド デシルナトリウム)に取り、35μｌの20ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液を添加 する。この溶液を37℃の水浴で３〜４時間インキュベートし、次いでＤＮＡをフ ェノール／クロロホルムを用いて３回、クロロホルムを用いて１回抽出し、これ を-20℃でエタノール沈殿させる。遠心分離後、ペレットを70％エタノールを用 いて洗浄し、乾燥させて200μ１のTE(10mM Tris pH 8.O;1mM EDTA)に再懸濁する 。次いでヌクレイン酸濃度を分光光度計(OD360)で測定する。このＤＮＡ溶液は ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験に対して直接鋳型の役目をすることができ る。また、組換えウイルスを得るためのトランスフェクション試験に用いること もできる。 実施例３：組換えILTVウイルスの単離および精製： 挿入部位の２つのフランキング領域の間に挿入されたポリペプチドを発現するた めのカセットよりなるドナープラスミドを制限酵素で処理し、プラスミドを直線 化することができ、これをフェノール／クロロホルム混合物を用いて抽出し、無 水エタノール溶液沈殿させ、滅菌水に取る。24時間培養した初代CKC細胞を0.2〜 1μｇの直鎖状ドナープラスミド＋２〜５μgのILTVのウイルスＤＮＡを300μｌ のOptiMEM培地（ギブコBRLカタログ番号041-01985H）に入れたものと、 100μｇのLipofectAMINEを300μｌの培地に希釈したものとの混合物（混合物の 最終量は600μ１)を用いて感染させた。この600μｌを３ｍｌ（最終量）の培地 に希釈して５×106CKC上に播く。混合物を細胞に接触させた状態で５時間保ち、 その後取り除いて５ｍｌの培養培地で置き換える。その後細胞を37℃で３〜８日 間培養し、細胞変性効果が見られたとき、-70℃で細胞を凍結する。融解後、必 要に応じてさらに超音波処理し、このウイルス群を限定的な希釈でマイクロプレ ート（96ウエル）にクローニングし、相同性組換えウイルス群を単離する。この プレートを１〜３日間培養し、上澄みを空の96ウエルプレートに回収し、この上 澄みを含むプレートを４℃または-70℃に置く。次いで、他のプレートに残って いる細胞を95％のアセトン中で-20℃で20〜30分間、または室温で５分間固定す る。発現されたボリペプチドに直接対するモノクロナル抗体を用いて間接蛍光抗 体(IIF)反応を行い、このポリペプチドを発現するプラークを調べる。再び同じ 方法で（96-ウエルプレートにおける限定的な希釈で）、４℃または-70℃に置か れたプレートのウエルで、IIFによって陽性プラークを有するウエルに対応する ウエル内に存在する上澄みからクローニングを行う。一般に、連続４回の単離サ イクル（限定的な希釈、上澄みの回収、IIFによる細胞のモニタリング、上澄み からの限定的な希釈等）を行うことによって子孫全てが特異的な蛍光を示す組換 えウイルスを得ることができる。この組換えウイルスのゲノムＤＮＡについて適 当なオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプローブを用いた標準的なＰＣＲおよびサ ザンブロット法によって分子レベルでの特徴付けを行う。 組換えウイルスの単離は挿入された発現カセットに特異的なプローブとのハイブ リダイゼーションによって行うこともできる。そのために、トランスフェクショ ン後に回収されたウイルス群を希釈してＣＫＣ細胞（ペトリ皿で培養）上に沈着 させて単離したプラークを得る。37℃で１時間接触させた後、感染培地を取り除 いて１％のアガロースを含む５ｍｌのMEM培地で置き換え、42℃で灌流状態を維 持する。アガロースが凝固したとき、皿を37℃で48〜72時間CO2インキュベータ 内で、プラークが現れるまでインキュベートする。その後アガロース層を除去し 、ウイルスプラークを培養物用のペトリ皿と同じ径を有する無菌のニトロセルロ ース膜上に移す。この膜自体は他のニトロセルロース膜上に移し、第１番目の トランスファーの逆「コピー」を得る。後者のコピー上に移されたプラークを当 業者に周知の標準的な方法に従って発現カセットのジゴキシゲニン標識ＤＮＡ断 片（ＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム，カタログ番号1175033 ）とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、洗浄し、現れた基質と接 触させ、このニトロセルロース膜をオートラジオグラフィーのフィルムと接触状 態に置く。この膜上の陽性ハイブリダイゼーションのイメージはプラークが発現 カセットを挿入した組換えILTVウイルスを含むことを示している。この陽性プラ ークに対応するプラークを第１のニトロセルロース膜から無菌状態で切断し、0. 5ｍｌのMEM培地を入れたエッペンドルフ管に入れ、超音波処理し、この膜からビ リオンを放出する。エッペンドルフ管に入れた培地をMEM培地に希釈し、こうし て得られた希釈溶液はCKC細胞の新しい培養物を感染する役目をする。 実施例４：ILTVのゲノム領域の増幅： オリゴヌクレオチドEL207(配列NO.1)およびEL208(配列NO.2)はポリメラーゼ連鎖 反応(PCR)による第１の増幅のためのプライマーの役目をする。 非特異的な増幅を制限するために、１回目のＰＣＲはオリゴヌクレオチドEL207 およびEL208と、ＰＣＲバッファーと、dNTPと、ILTVＤＮＡと、Taqポリメラーゼ と、抗Taq抗体（TaqStartTM Antibody，Clontech Lab.,Palo Alto,CA，USA）と の存在下で行った。35回のサイクル（94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で８分）を 行った。反応生成物の一定分量を電気泳動ゲル上に置き、約７ｋｂの増幅したＤ ＮＡ帯を検出することができた。 ２回目のＰＣＲをオリゴヌクレオチドLP018(配列NO.3)(配列NO.5の2677〜2696の 位置)およびLP020(配列NO.4)を用いて行い、1190bpの断片を増幅することができ た。 実施例５：ILTVのゲノム領域のクローニングおよび特徴付け： １回目の遺伝子増幅反応の生成物をフェノール／クロロホルム抽出によって精製 し、次いで制限酵素EcoRIとSacIで37℃で２時間処理した。次いで管を65℃で20 分間加熱して制限酵素を不活性化した。この処理で得られる断片をEcoRIとSacI で処理したプラスミドpBlueScriptII SK+(pBS SK+;Stratagene)に導入し（14℃ で一晩）、E.coli DH5αバクテリアの形質転換およびアンピシリンを添加した培 地の皿での培養後に得られたクローンを分析し、３つの異なるプラスミド内に存 在する寸法の異なる３つのEcoRI・SacI挿入断片、すなわち約0.6kbの断片(プラス ミドpLP001)と、2.8kbの断片(プラスミドpLP002)と、1.8kbの断片(プラスミドpL P003)を同定することができた。 ２回目のＰＣＲ反応の増幅生成物を前回と同様に精製し、酵素EcoRIとBamHIで処 理し、予めEcoRIとBamHIで処理したプラスミドpBS SK+にクローニングしてクロ ーンpLP011を得た。 pLP002に存在する挿入断片の部分的な配列（図１のSalI部位の右側）およびpLP0 03とpLP011に存在する挿入断片の完全な配列によって２個の完全なオープンリー ディングフレーム(ORFs)(ORF AおよびORF B)および他のＯＲＦ(ORF C)のN-末端 部を同定することができた。このクローン化ゲノム領域および配列決定された領 域の制限地図、並びにクローンpLP001、LP002、pLP003およびpLP011の挿入断片 のこの地図上での位置は図１に示されている。3841pbの配列(配列NO5)は図２に 示されている。ORFsＡ，ＢおよびＣの位置およびアミノ酸配列も図１および図２ にそれぞれ示されている。 ORF A（配列NO5の位置1624)のSTOPコドンと、ORF C(配列N05の位置3606)のATGコ ドンとの間の配列であって、特にORF Bを有し、その後にORFs ＢとＣとの間の遺 伝子間領域が続くものはポリペプチドを発現するためのカセットをILTVゲノムに 挿入するのに使用することができる。この配列は挿入部位とよばれる。この挿入 の実施はORF B（実施例６参照）または遺伝子間領域（実施例７参 照）における欠失を伴っても伴わなくてもよく、この欠失はORF Bを完全または 部分的に且つ遺伝子間領域を完全または部分的にカバーすることもできる（実施 例８参照）。 実施例６：ORF Bに挿入するためのドナープラスミドpMB035の作製 プラスミドpLP003(4665bp)を酵素EcoRIとXhoIで処理し、この処理したプラスミ ドをdNTPの存在下でＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）で処理し、ブラントエ ンドを作り、E.coliバクテリアの連結および形質転換後、クローンpMB034(4636b p)を得た。このクローニング段階によってプラスミドpLP003のEcoRIとXhoIとの 間のクローニング部位を欠失することができた。 次いで、プラスミドpMB034を酵素HindIIIとSphIで処理し、4.0kpb断片を溶離し 、予めハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドMB088(配列NO.6)およびMB089(配 列NO.7)に導入する。このようにして、E.coliバクテリアの形質転換後、プラス ミドpMB035(3990bp)を得た（図３のpMB035の製造模式図参照）。 従って、プラスミドpMB035は：（１）ORF Bの５’における相同な配列、（２） 独特なEcoRI、SmaI、HindIIIおよびSalI部位を含む、挿入された塩基配列、（３ ）ORF Bの３’における相同配列を含んでいる。このプラスミドは従って２つの フランキング領域（１）と（３）の間に配置された（２）に見られる独特な部位 に発現カセットを導入することができる。得られた組換えILTVウイルスはORF B （HindIIIとSphI部位との間；欠失したORF Bのアミノ酸56〜279)で欠失している 。 実施例７：ORFs BとＣとの間の遺伝子間領域に挿入するためのドナープラスミド pMB039の作製 プラスミドpLP011(3883bp)を酵素EcoRIとHindIIIで処理し、プラスミドpLP003 (4665bp)を酵素EcoRIとHindIIIで処理して得られた1021bpの制限断片に導入する 。こうして得られたプラスミド(pMB036)の寸法は4892bpである。このプラスミド pMB036を酵素HindIIIとApaIで処理し、この処理したプラスミドをdNTPの存在下 でＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）で処理し、ブラントエンドを作り、E.co liバクテリアの連結および形質転換後、クローンpMB037(4862bp)を得た。このク ローニング段階によってプラスミドpMB036のHindIIIとApaIとの間のクローニン グ部位を欠失することができた。 このプラスミドpMB037を酵素NotIとBamHIで処理し、処理したプラスミドをdNTP の存在下でＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）で処理し、ブラントエンドを作 り、E.coliバクテリアの連結および形質転換後、クローンpMB038を得た。このク ローニング段階によってプラスミドpMB037のNotIとBamHIとの間のクローニング 部位を欠失することができた。 このプラスミドpMB038を酵素BglIIとEcoRIで処理し、4.5kpb断片を溶離し、予め ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドpMB090(配列NO.8)およびpMB091(配列NO. 9)に導入する。このようにして、E.coliバクテリアの形質転換後、プラスミドpM B039(bp)を得た（図４のpMB039の製造模式図参照）。 従って、プラスミドpMB039は：（１）ORF Bの５’における相同配列、（２）独 特なEcoRI、SmaI、HindIIIおよびSalI部位を含む、挿入された塩基配列、（３） ORFs ＢとＣとの間の遺伝子間領域の３’における相同な配列を含んでいる。こ のプラスミドは従って２つのフランキング領域（１）と（３）の間に配置された （２）に見られる独特な部位に発現カセットを導入することができる。得られた 組換えILTVウイルスはORFs ＢとＣとの間の遺伝子間領域（EcoRIとBglII部位と の間）で344bpが欠失している。 実施例８：ORF Bをオーバーラップするゲノム領域およびORFs ＢとＣとの間の遺 伝子間領域に挿入するためのドナープラスミドpMB042の作製 プラスミドpLP011(3883bp)を酵素BamHIとEcoRIで処理して得られた940bpの断片 と、プラスミドpLP003(4665bp)を酵素EcoRIとSacIで処理して得られた1754bpの 断片とを酵素BamHIとSacIで処理したプラスミドpBSSK+に導入する。こうして得 られたプラスミド(pMB040)の寸法は5623bpである。プラスミドpMB039を酵素BamH IとXholで処理し、この処理したプラスミドをdNTPの存在下でＤＮＡポリメラー ゼ（クレノウ断片）で処理し、ブラントエンドを作り、E.coliバクテリアの連結 および形質転換後、クローンpMB041(5576bp)を得た。このクローニング段階によ ってプラスミドpMB040のBamHIとXholとの間のクローニング部位を欠失すること ができた。 このプラスミドpMB041を酵素HindIIIとBglIIで処理し、4.2kpb断片を溶離し、予 めハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドMB092(配列NO.10)およびMB093(配列NO .11)に導入する。このようにして、E.coliバクテリアの形質転換後、プラスミド pMB042(4234bp)を得た（図５のpMB042の製造模式図参照）。 従って、プラスミドpMB042は：（１）ORF Bの５’における相同な配列、（２） 独特なEcoRI、SmaI、HindIIIおよびSalI部位を含む、挿入された塩基配列、（３ ）ORFs ＢとＣとの間の遺伝子間領域の３’における相同な配列を含んでいる。 このプラスミドは従って２つのフランキング領域（１）と（３）の間に配置され た（２）に見られる独特な部位に発現カセットを導入することができる。得られ た組換えILTVウイルスはORF BのＣ末端部（ORF Bの339Ｃ末端アミノ酸）とORFs ＢとＣとの間の遺伝子間領域の５’部（図１に示すHindIIIとBglII部位との間） とをカバーする1366bpが欠失している。 実施例９：IBDV VP2遺伝子を発現するカセットをHCMV-IEプロモータの制御下でO RF B部位に挿入するためのドナープラスミドpMB043の作製とvILTV １の単離 9.1 感染性滑液嚢炎ウイルス(IBDV)のVP2遺伝子のクローニングおよびHCMV-IE プロモータの制御下でのVP2発現カセットの作製 BamHI-HindIIIカセット状のIBDV VP2遺伝子を含むプラスミドpEL004（図６参照 ；＝フランス国特許第92/13109号に記載のプラスミドpGH004に等しい）を、BamH IとXbaIとで処理して1104bpのBamHI-XbaI断片（切り出されたVP2遺伝子）を単離 した。この断片を予めXbaIおよびBamHIで処理したベクターpBS SK+にクローニン グして4052bpのプラスミドpEL022（図６）を得た。このベクターpBS SK+をEcoRV とXbaIで処理し、次いでそれをつないでpBS-SK*（変性されたもの）を得た。プ ラスミドpEL004を、KpnIとHindIIIで処理して、完全なIBDV VP2遺伝子を含有す る1387bpのKpnI-HindIII断片を単離した。この断片を予めKpnIとHindIIIで処理 したベクターpBS-SK*にクローニングして4292bpのプラスミドpEL023（図６）を 得た。プラスミドpEL022をBamHIおよびNotIで処理して1122bpのBamHI-NotI断片 （断片Ａ）を単離した。このプラスミドpEL023をBamHIとNotIで処理して333bpの BamHI-NotI断片（断片Ｂ）を単離した。断片Ａと断片Ｂとを予めNotIで処理して アルカリホスファターゼで処理したプラスミドpBS-SK+に導入して4369bpのプラ スミドpEL024（図６）を得た。 プラスミドpEL024をNotIで処理して1445bpのNotI-NotI断片を単離した。この断 片を予めNotIで処理したプラスミドpCMVβ（クロンテックカタログ番号6177-１、 図７）に導入して5095bpのプラスミドpEL026（図７）を得た。プラスミドpEL026 をEcoRI、SalIおよびXmnIで処理して2428bpのEcoRI-SalI断片を単離した。この 断片を予めEcoRIとSalIで処理したベクターpBS SK+に導入して5379bpのプラスミ ドpEL027（図７）を得た。 9.2 ドナープラスミドpMB043の作製 プラスミドpEL027をEcoRI、SalIおよびXmnIで処理して2428bpのEcoRI-SalI断片 を単離した。この断片を予めEcoRIとSalIで処理したプラスミドpMB035(実施例６ 、図３参照)に導入して6414bpのプラスミドpMB043（図8）を得た。 9.3 組換えvILTV1ウイルスの単離と精製 実施例３の方法で、予め酵素KpnIを用いて直線化したプラスミドpMB036のＤＮＡ と、そのウイルスＤＮＡとの同時形質転換(cotransfection)を行ってvILTV1ウイ ルスの単離・精製をした。この組換え体は一部欠失したILTVウイルスのORF B（ 実施例５、実施例６参照）内にHCMV-IE/IBDV VP2カセットを含んでいる。 実施例10：IBDV VP2遺伝子を発現するカセットをMCMV IEプロモータの制御下でO RF B部位に挿入するためのドナープラスミドpMB044の作製とvILTV２の単離10.1 MCMV(マウスのサイトメガロウイルス)即時初期(IE)プロモータの制御下でIBDV V P2遺伝子を発現するカセットを含むpEL070の作製 プラスミドpCMVβ（クロンテックカタログ番号6177-1、図９）をSalIとSmaIで処 理してlacZ遺伝子並びにSV40ウイルスの後期遺伝子のポリアデニレーションシグ ナルを含む3679bpのSalI-SmaI断片を単離した。この断片を予めSalIとEcoRVとで 処理したベクターpBS SK+に挿入して6625bpのプラスミドpCD002（図９）を得た 。このプラスミドはlacZレポータ遺伝子を含むが、この遺伝子の上流に位置する プロモータはない。 MCMVウイルスのSmith株は米国タイプカルチャーコレクション(Type Culture Col lection，Rockville，Maryland,USA)から入手した(ATCC No.VR-194)。このウイ ルスをBalb/Cマウスの胎児細胞上で培養し、このウイルスのウイルスＤＮＡをエ ベリング達(EbelingA.et al.,J.Virol.1983.47.421-433)の方法で調製した。 このウイルスのゲノムＤＮＡをPstIで処理して2285bpのPstI-PstI断片を単離し た。この断片を予めPstIで処理してアルカリホスファターゼで処理したベクター pBS SK+にクローニングしてプラスミドpCD004(図９)を得た。プラスミドpCD004 をHpaIとPstIで処理して1389bpのHpaI-PstI断片を得た。この断片はネズミのサ イトメガロウイルスの即時初期遺伝子のプロモータ／アクチベータ領域を含む( ネズミのサイトメガロウイルス＝MCMV)(Dorsch-Hasler K.et al.,Proc.Natl.Aca d.Sci.1985.82.8325-8329、WO-A-87/03905号)。この断片を予めPstIとSmaIとで 処理したプラスミドpCD002にクローニングして8007bpのプラスミドpCD009（図９ ）を得た。 下記２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行って２本鎖のオリ ゴヌクレオチドを作製した： この２本鎖オリゴヌクレオチドを予めKpnIとSacIとで処理したベクターpBS-SK+ に導入してプラスミドpEL067を得た(図10)。プラスミドpCD009をPstIとSpeIで処 理して1396bpのPstI-SpeI断片を単離した。この断片を予めPstIとSpeIとで処理 したプラスミドpEL067に導入して4297bpのプラスミドpEL068(図10)を得た。プラ スミドpEL024（実施例９、段落9.1、図６参照、）をHindIIIおよびNotIで処理し て1390bpのHindIII-NotI断片（断片Ａ）を単離した。プラスミドpEL027（実施例 ９、段落9.1、図７参照、）をHindIIIおよびSalIで処理して235bpのHindIII-Sal I断片（断片Ｂ）を単離した。断片ＡとＢを同時に予めNotIとSalIで処理したプ ラスミドpEL068に導入して5908bpのプラスミドpEL070（図10）を得た。このプラ スミドは従って、MCMV IEプロモータと、VP2遺伝子と、SV40ポリＡシグナルとよ りなる発現カセットを含んでいる。 10.2 ドナープラスミドpMB044の作製 プラスミドpEL070をEcoRI、SalI、およびXmnIで処理して3035bpのEcoRI-SalI断 片を単離した。この断片を予めEcoRIとSalIで処理したプラスミドpMB035(実施例 ６、図３参照)に導入して7009bpのプラスミドpMB044（図11）を得た。このプラ スミドによってILTVウイルスの一部欠失したORF BにMCMV-IE/IBDV-VP2発現カセ ットを挿入することが可能となる。 10.3 組換えvILTV2ウイルスの単離と精製 実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpMB044のＤＮ Ａと、そのウイルスＤＮＡとの同時形質転換を行ってvILTV2ウイルスの単離・精 製をした。この組換え体はILTVウイルスの一部欠失したORF B（実施例５、実施 例６参照）内にMCMV-IE/IBDV VP2カセットを含んでいる。 実施例11：IBDV VP2遺伝子を発現するカセットをMCMV IEプロモータの制御下 でORFsＢとＣとの間の遺伝子間部位に挿入するためのドナープラスミドpMB045の 作製とvILTV３の単離： プラスミドpEL070(実施例10、図10参照)をEcoRI、SalIおよびXmnIで処理して303 5bpのEcoRI-SalI断片を単離した。この断片を予めEcoRIとSalIで処理したプラス ミドpMB039（実施例７、図４参照）に導入して7540bpのプラスミドpMB045（図12 ）を得た。このプラスミドによってILTVウイルスのORFs ＢとＣとの間の一部欠 失した遺伝子間領域にMCMV-IE/IBDV-VP2発現カセットを挿入することが可能とな る。 実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpMB045のＤＮ Ａと、そのウイルスＤＮＡとの同時形質転換を行ってvILTV3ウイルスの単離・精 製をした。この組換え体はILTVウイルスのORFs ＢとＣとの間の一部欠失した遺 伝子間領域（実施例５、実施例７参照）内に挿入されたHCMV-IE/IBDV VP2カセッ トを含んでいる。 実施例12：IBDV VP2遺伝子を発現するカセットをMCMV IEプロモータの制御下で 、ORF Ｂをオーバーラップするゲノム領域およびORFs ＢとＣとの間の遺伝子間 部位に挿入するためのドナープラスミドpMB046の作製とILTV４の単離： プラスミドpEL070(実施例10、図10参照)をEcoRI、SalIおよびXmnIで処理して303 5bpのEcoRI-SalI断片を単離した。この断片を予めEcoRIとSalIで処理したプラス ミドpMB042（実施例８、図５参照）に導入して7253bpのプラスミドpMB046（図13 ）を得た。このプラスミドによってILTVウイルスのORFＢをオーバーラップする ゲノム領域およびORFs ＢとＣとの間の遺伝子間ゲノム領域にMCMV-IE/IBDV-VP2 発現カセットを挿入することが可能となる。 実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpMB046のＤＮ Ａと、そのウイルスＤＮＡとの同時形質転換を行ってvILTV4ウイルスの単離・精 製をした。この組換え体はILTVウイルスのORF Ｂをオーバーラップするゲノム領 域およびORFs ＢとＣとの間の遺伝子間ゲノム領域（実施例５、実施例８参 照）内に挿入されたMCMV-IE/IBDV VP2カセットを含んでいる。 実施例13：NDV HN遺伝子を発現するカセットをORF Bに挿入するためのドナープ ラスミドpMB047の作製とvILTV５の単離： 13.1 ニューカッスル病ウイルス(NDV)HN遺伝子のクローニング テイラー達の方法(Taylor J.et al.，J.Virol.1990.64.1441-1450)に従ってニ ューカッスル病ウイルス(NDV)テキサス株のゲノムに対して相補的なＤＮＡライ ブラリーを作製した。融合遺伝子(F)の末端、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（H N）遺伝子の全体およびポリメラーゼ用の遺伝子の開始点を含むpBR322クローン をpHNO1として同定した。このクローン内に存在するNDV HN遺伝子の配列を図14( 配列NO.14)に示す。プラスミドpHNO1をSphIおよびXbaIで処理して2520bpのSphI- XbaI断片を単離した。この断片を予めSpaIとXbaIで処理したベクターpUC19に導 入して5192bpのプラスミドpHNO2を得た。プラスミドpHNO2をClaIとPstIで処理し て700bpのClaI-PstI断片（断片Ａ）を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳 型pHNO2を用いて270bpのＰＣＲ断片を作製した： この断片をHindIIIとPstIで処理して220bpのHindIII-PstI断片（断片Ｂ）を単離 した。断片Ａと断片Ｂを同時に予めClaIとHindIIIで処理したベクターpBS-SK+に 導入して3872bpのプラスミドpELO28(図15)を得た。プラスミドpHNO2をBsphIとCl aIで処理して425bpのBsphI-ClaI断片（断片Ｃ）を単離した。下記のオリゴヌク レオチドと鋳型pHNO2を用いて465bpのＰＣＲ断片を作製した： この断片をBsphIとNotIで処理して390bpのBsphI-NotI断片（断片Ｄ）を単離 した。断片Ｃと断片Ｄを同時に予めClaIとNotIで処理したベクターpBS-SK+に導 入して3727bpのプラスミドpEL029bis（図15）を得た。プラスミドpEL028をClaI とSacIIで処理して960bpのClaI-SacII断片（断片Ｅ）を単離した。プラスミドpE L029bisをClaIとNotIで処理して820bpのClaI-NotI断片（断片Ｆ）を単離した。 断片Ｅと断片Ｆを同時に予めNotIとSacIIで処理したベクターpBS-SK+に導入して 4745bpのプラスミドpEL030（図15）を得た。 13.2 ORF B内にNDV HNを発現するカセットを含むプラスミドpMB047の作製 プラスミドpEL030をNotIで処理して1780bpのNotI-NotI断片（NDV HN遺伝子の全 体）を単離した。この断片を、IBDV VP2の蛋白質をコード化する遺伝子を含む14 05bpのNotI-NotI断片の代わりに、プラスミドpMB044（実施例10、図11参照）のN otI部位に挿入した。このクローニングによって7385bpのプラスミドpMB047（図1 6）を単離することができた。このプラスミドによってILTVウイルスの一部欠失 したORF BにMCMV-IE/NDV-HN発現カセットを挿入することが可能となる。 13.3 vILTV5組換えウイルスの単離と精製 実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpMB047のＤＮ Ａと、そのウイルスＤＮＡとの同時形質転換を行ってvILTV5ウイルスの単離・精 製をした。この組換え体はILTVウイルスの一部欠失したORF B（実施例５、実施 例６参照）内にMCMV-IE/NDV-HNカセットを含んでいる。 実施例14：NDVウイルスHN遺伝子を発現する他の組換えILTVウイルスの単離：実 施例13（段落13.2、13.3）と同様な方法で、NotI部位によってフランキングされ たHN遺伝子（pEL030から単離、図15）をプラスミドpMB045（図12）およびpMB046 （図13）内でVP2遺伝子の代わりに用いることができ、ORFsＢとＣとの間の遺伝 子間部位内またはORF BおよびORFsＢとＣとの間の遺伝子間部位にオーバーラッ プしてNDV HNを発現するカセットを有する組換えウイルスの単離を可能にするプ ラスミドを得る。 実施例15：NDV F遺伝子を発現するカセットをORF Bに挿入するためのドナープラ スミドpMB048の作製とvILTV６の単離 15.1 ニューカッスル病ウイルス(NDV)F遺伝子のクローニング ニューカッスル病ウイルスのゲノム（実施例13、段落13.1）に対して相補的なＤ ＮＡライブラリーで得られた、融合(F)遺伝子全体を含むクローンをpNDV81とよ ぶ。このプラスミドは既に記載しており、このクローン内に存在するNDV F遺伝 子の配列は開示されている（Taylor J.et al.,J.Virol.1990.64.1441-1450）。 プラスミドpNDV81をNorIおよびPstIで処理して1870bpのNorI-PstI断片（断片Ａ ）を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pNDV81を用いて160bpのＰＣＲ 断片を作製した： この断片をPstIとSalIで処理して130bpのPstI-SalI断片（断片Ｂ）を単離した。 断片Ａと断片Ｂを同時に予めClaIとSalIで処理したベクターpBS-SK+に導入して4 846bpのプラスミドpEL033（図17）を得た。 15.2 ORF B内にNDV Fを発現するカセットを含むプラスミドpMB048の作製 プラスミドpEL033をNotIで処理して1935bpのNotI-NotI断片（Ｆ遺伝子全体）を 単離した。この断片を、IBDVVP2の蛋白質をコード化する遺伝子を含む1405bpのN otI-NotI断片の代わりに、プラスミドpMB044（実施例10、図11）のNotI部位に挿 入した。このクローニングによって7538bpのプラスミドpMB048（図18）を単離す ることができた。このプラスミドによってILTVウイルスの一部欠失したORF BにM CMV-TE/NDV-F発現カセットを挿入することが可能となる。 15.3 vILTV6組換えウイルスの単離と精製 実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpMB048のＤＮ Ａと、そのウイルスＤＮＡとの同時形質転換を行ってvILTV6ウイルスの単離・ 精製をした。この組換え体はILTVウイルスの一部欠失したORF B（実施例５、実 施例６参照）内にMCMV-IE/NDV-Fカセットを含んでいる。 実施例16：NDV HNおよびＦ遺伝子を発現する二重カセットをORF B部位に挿入す るためのドナープラスミドの作製と組換えILTVウイルスの単離 ２つの遺伝子、例えばNDVウイルスのHNおよびＦ遺伝子を発現する二重カセット を作製することができる。この構造は図19に概念的に示されている。この構造で は、２つのプロモータの末端５'は隣接しており、２つの遺伝子の転写が反対方 向に起こるようになっている。２つのプロモータののうちの一方がCMV IEプロモ ータで、他方のプロモータ（組み合せて使用されるプロモータとよぶ）がウイル ス（特にヘルプスウイルス）または他に由来の、真核細胞内で活性である任意の プロモータであるのが好ましい。この構造では、組み合せて使用されるプロモー タはCMV IEプロモータのアクチベーション領域によって活性化される。この二重 発現カセットは上記の３つのドナープラスミド（それぞれ図３，図４、図５に示 された実施例６，７，８に記載のpMB035、pMB039、pMB042）の１つに挿入するこ とができる。組換えウイルスの単離は上記と同じ方法（実施例３参照）で行う。 実施例17：MDV gB遺伝子を発現するカセットをORF Bに挿入するためのドナープ ラスミドpMB049の作製とvILTV７の単離 17.1 マレック病ウイルスgB遺伝子のクローニング MDV gB遺伝子を含むMDVウイルスRBlB株のゲノムＤＮＡの3.9kbpのEcoRI-SalI断 片〔この配列はロス(Ross.N)達が開示している（J.Gen.Virol.1989.70.1789-180 4）〕を予めEcoRIと-SalIで処理したベクターpUC13に導入して6543bpのプラスミ ドpCD007（図20）を得た。このプラスミドをSacIおよびXbaIで処理して2260bpの SacI-XbaI断片（gB遺伝子の中央部位＝断片Ａ）を単離した。下記のオリゴヌク レオチドと鋳型pCD007を用いて222bpのＰＣＲ断片を作製した： この断片をKpnIとXbaIで処理して190bpのKpnI-XbaI断片（gB遺伝子の５'末端＝ 断片Ｂ）を単離した。下記のオリゴヌクレオチドと鋳型pCD007を用いて195bpの ＰＣＲ断片を作製した： この断片をSacIとSacIIで処理して162bpのSacI-SacII断片（gB遺伝子の３’末端 ＝断片Ｃ）を単離した。断片Ａ、ＢおよびＣを同時に予めKpnIとSacIで処理した ベクターpBS-SK+に導入して5485bpのプラスミドpCD011（図20）を得た。 17.2 ORF B内にMDV gB遺伝子を発現するカセットを含むプラスミドpMB049の作 製 プラスミドpCD011をNotIで処理して2608bpのNotI-NotI断片（MDVgB遺伝子全体） を単離した。この断片を、IBDV VP2の蛋白質をコード化する遺伝子を含む1405bp のNotI-NotI断片の代わりに、プラスミドpMBO44（実施例10、図11）のNotI部位 に挿入した。このクローニングによって8213bpのプラスミドpMB049（図21）を単 離することができた。このプラスミドによってILTVウイルスの一部欠失したORF BにMCMV-IE/MDV-gB発現カセットを挿入することが可能となる。 17.3 組換えvILTV7ウイルスの単離と精製 実施例３の方法で、予め酵素BssHIIを用いて直線化したプラスミドpMB049のＤＮ Ａと、そのウイルスＤＮＡとの同時形質転換を行ってvILTV7ウイルスの単離・精 製をした。この組換え体はILTVウイルスの一部欠失したORF B（実施例５、実施 例６参照）内にMCMV-IE/MDV-gBカセットを含んでいる。 実施例18：IBV遺伝子（１つまたは複数）を発現するカセットをORF Bに挿入する ためのドナープラスミドの作製とILTV組換えウイルスの単離 上記の３箇所の部位（実施例６、７および８）への単一のカセットの挿入（実施 例９、10、11、12、13、14、15および17）または二重カセットの挿入（実施例 18）に関する上記の戦略と同様な戦略に従って、膜（Ｍ）またはスパイク（Ｓ） の蛋白質、または鳥類の感染性気管支炎ウイルス(IBV)のヌクレオカプシド（Ｎ ）を高レベルで発現する組換えILTVウイルスを調製することができる。特に、二 重発現カセットはCMV IEプロモータの制御下でＳ遺伝子を用いて、且つ組み合せ て使用されるプロモータの制御下でＭ遺伝子を用いて調製した。 実施例19：他の鳥類の病原物質または免疫調節性ペプチドの遺伝子（１つまたは 複数）を発現するカセットを３箇所の上記の部位に挿入するためのドナープラス ミドの作製とILTV組換えウイルスの単離 上記の３箇所の部位（実施例６、７および８）への単一のカセットの挿入（実施 例９、10、11、12、13、14、15および１７）または二重カセットの挿入（実施例 18）に関する上記の戦略と同様な戦略に従って、CAVの免疫源（特に、VP1および VP2をコード化する遺伝子を発現するための二重カセット）、ニワトリの肺炎ウ イルスまたは他の鳥類の病原物質、あるいは免疫調節性ペプチド、特にサイトカ インを高レベルで発現する組換えILTVウイルスを調製することができる。 実施例20：ワクチンの製造： 本発明に従って得られた組換えウイルスは孵化鶏卵で製造する。回収したウイル ス溶液を凍結乾燥安定剤に希釈し、1000ワクチン投与量の割合でバイヤルに分配 して最後に凍結乾燥する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/295 Ａ６１Ｋ 39/295 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 リヴィエール，ミシェル フランス国 69130 エキュリ シュマン デュ シャンスリエ 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．特異的なILTV株において配列NO.5のヌクレオチド1624〜3606に規定された挿 入部位に挿入された非相同な塩基配列を少なくとも１つ含み且つ発現するILTVウ イルスをベクターとして有する鳥類用組換え生ワクチン。 ２．塩基配列が単純な挿入によって挿入されるか、挿入部位の完全または部分的 欠失の後に挿入される請求項１に記載の組換え生ワクチン。 ３．塩基配列が配列NO.5のヌクレオチド1713〜2897に出現するORF Bに挿入され る請求項１または２に記載の組換え生ワクチン。 ４．塩基配列が配列NO.5のヌクレオチド2898〜3606に規定された遺伝子間領域に 挿入される請求項１または２に記載の組換え生ワクチン。 ５．挿入される塩基配列を発現するために、ベクターが強い真核生物プロモータ を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え生ワクチン。 ６．強いプロモータがCMV即時初期プロモータ、好ましくはネズミまたはヒトのC MV即時初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモータ、ＳＶ40ウイ ルス初期プロモータからなる群の中から選択される請求項５に記載の組換え生ワ クチン。 ７．異なる真核生物のプロモータの制御下で挿入部位に挿入される塩基配列を少 なくとも２つ含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え生ワクチン。 ８．真核生物のプロモータが由来の異なる動物のCMV即時初期プロモータである 請求項７に記載の組換え生ワクチン。 ９．CMV即時初期プロモータと、制御下に他の塩基配列を有する他のプロモータ と組み合された第１の塩基配列を有し、これら２つのプロモータの5'末端が隣接 するように配置される請求項７に記載の組換え生ワクチン。 10．鳥類の病原物質の抗原ポリペプチドをコード化する塩基配列を有し、この配 列が挿入部位に挿入される請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え生ワクチ ン。 11．ニューカッスル病ウイルス(NDV)、感染性滑液嚢炎ウイルス(IBDV)、マレッ ク病ウイルス(MDV)、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、ニワトリの貧血症ウイルス (CAV)、ニワトリの肺炎ウイルスより成る群の中から選択される鳥類の病原物質 の抗原をコード化する塩基配列を有する請求項10に記載の組換え生ワクチン。 12．NDVウイルスのＦおよびHNポリペプチドをコード化する塩基配列から選択さ れる、塩基配列を有する請求項11に記載の組換え生ワクチン。 13．MDVウイルスのポリペプチドgB,gD.gH+gLをコード化する塩基配列から選択さ れる、塩基配列を有する請求項11に記載の組換え生ワクチン。 14．IBDV VP2抗原、Ｓ抗原、またはIBVウイルスのＳ,ＭおよびＮの部位、CAV VP IおよびCAV VP2抗原、ニワトリの肺炎ウイルスＧおよびＦ抗原に対応する配列よ り成る群の中から選択される塩基配列を少なくとも１つ有する請求項11に記載の 組換え生ワクチン。 15．免疫調節性ボリペプチドをコード化する塩基配列を有し、この配列が挿入部 位に挿入される請求項１〜14に記載の組換え生ワクチン。 16．この塩基配列がサイトカインをコード化する群の中から選択される請求項15 に記載の組換え生ワクチン。 17．プロモータと、IRESによって対で分離された２つまたはそれ以上の遺伝子と 、ポリアデニレーションシグナルとを連続して含む発現カセットを、挿入部位に 挿入された状態で有する請求項１〜16のいずれか一項に記載の組換え生ワクチン 。 18．異なる配列が挿入された請求項１〜17のいずれか一項に記載の組換え生ワク チンを少なくとも２種含む混合物または混合用の多価ワクチン製剤。 19．配列NO.5の１〜3841の位置によって規定された配列の完全または部分的な配 列を有するＤＮＡ断片。 20．配列NO.5のヌクレオチド1624〜3606に規定された挿入部位に挿入される非相 同な塩基配列を少なくとも１つ有するILTVウイルス。