JP2000512845A

JP2000512845A - 開花の遺伝子制御

Info

Publication number: JP2000512845A
Application number: JP10502530A
Authority: JP
Inventors: マイケルクープランド，ジョージ; ジェームズシャッファー，ロバート
Original assignee: プラントバイオサイエンスリミティド
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 2000-10-03
Also published as: AU3183997A; US6265637B1; GB9613132D0; EP0935658A1; CA2257905A1; DE69735484D1; ATE320492T1; WO1997049811A1; DE69735484T2; ES2260795T3; EP0935658B1; PT935658E

Abstract

(57)【要約】植物の開花特性、特に開花の時期は、アラビドプシス・タリアナの後期伸長胚軸(LHY)遺伝子又はその突然変異体、変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは相同体の発現により制御される。過剰発現は、トランスジェニック植物において開花を遅らせるのに用いることができる。その遺伝子のプロモーターは、概日周期に従って転写を制御し、そしてその産物が１日の特定の時間においてのみ必要とされ又は要求される遺伝子の発現を制御するのに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】開花の遺伝子制御本発明は、植物の開花の遺伝子制御並びにそれに関連する遺伝子のクローニング及び発現に関する。より詳しくは、本発明はアラビドプシス・タリアナ（Arab idopsis thaliana ）の後期伸長胚軸（Late Elongated Hypocotyl）(LHY)遺伝子及び他の種からの相同体のクローニング及び発現、並びに植物におけるその遺伝子の操作及び使用に関する。植物における有効な開花は、特に意図する産物がそれから生産される花又は種子である場合に重要である。この一態様は開花の時期であり：開花の始まりを進展させ又は遅らせることは、農業家及び種子生産者らに役立ち得る。開花に影響を与える遺伝子メカニズムの理解は、標的植物の開花特性を変えるための手段を供する。開花が作物生産に重要である種は多数の種子から成長する全ての作物であるが、重要な例は、おそらくより暖かい気候域において最も農業経済学的に重要である穀類、コメ及びトウモロコシ、並びにより温暖な気候においてコムギ、オオムギ、エンバク及びライムギである。重要な種子産物は、脂肪種子ナタネ及びカノーラ（Canola）、テンサイ、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ及びモロコシ属植物である。それらの根又は葉について収集される多くの作物は、もちろん、種子から一年で成長し、いずれの種類の種子の生産も、植物が開花し、授粉し、及び種子をつける能力に極めて依存する。開花も遅らせることは、根又は葉がそれから収集される植物の収量を増加させるのに重要である。園芸において、開花の時期の制御は重要である。その開花を制御することができる園芸植物は、レタス、エンダイブ、ホウレンソウ及びアブラナ属野菜類、例えばキャベツ、ブロッコリー及びカリフラワー、並びにカーネーション及びゼラニウムを含む。アラビドプシス・タリアナは、長日下で早く開花し、短日下で遅く開花する条件的長日植物である。それは小さく、十分にキャラクタライズされたゲノムを有し、比較的容易に形質転換され、再生され、そして迅速な成長サイクルを有するので、アラビドプシスは開花及びその制御を研究するために理想的なモデル植物である。我々は、光周期に対するこの応答について要求される遺伝子の１つは、後期伸長胚軸又はLHY遺伝子であることを発見した。我々は、本明細書に供されるLHY遺伝子を、現在クローン化し、配列決定し、そしてその変異がその遺伝子を野生型遺伝子より高いレベルで転写されるようにすることを証明した。このことは、LH Yの発現の増加が長日下で開花を遅らせることを示唆する。本発明の第１の態様によれば、LHY機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を供する。当業者は、“LHY機能”が、アラビドプシス・タリアナのLHY遺伝子様の表現型で開花する時期（この時期は、春化により実質的に影響を受けない）に影響を与える能力をいうのに用いられ得る。LH Y変異体は、長日下で開花を遅らせ、ここでその開花の時期は春化により影響を受けない。また、LHY機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子の５’非コード化領域を含むヌクレオチド配列であって、好ましくはその遺伝子の全体のプロモーター領域を実質的に含むヌクレオチド配列も供する。ここでその遺伝子は、アラビドプシス・タリアナのLHY遺伝子の配列を有し得る。プロモーター領域に基づく更なる態様を以下に記載する。しかしながら、（例えば変異体等を作り、細胞及び植物等を形質転換するための）LHY遺伝子産物をコードする本発明による核酸の変異及び操作の議論は、必要な変更を加えて、本発明によるプロモーター核酸に適用する。本発明による核酸は、コーディング及び／又は非コーディング領域を含むアラビドプシス・タリアナのLHY遺伝子の配列を有し得、又は供される配列の突然変異体、変異体、誘導体又は対立遺伝子であり得る。好ましい突然変異体、変異体、誘導体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的特徴、例えば本明細書に議論されるように、他の遺伝子の制御により特に開花を抑制し又は遅らせる能力を保持するタンパク質をコードするものである。本発明による突然変異体、変異体、誘導体又は対立遺伝子は、植物の物理的な特徴、特に開花特性に影響を与える能力を有し得る。種々の実施形態において、突然変異体、変異体、誘導体又は対立遺伝子は、植物における発現において野生型と比べて、例えば図１のポリペプチドをコードする遺伝子配列を用いて得られる効果と比べて、開花を抑制する。開花の“抑制”は、それを遅らせ、妨害し、阻害し又はゆっくりさせる。他の実施形態において、突然変異体、変異体、誘導体又は対立遺伝子は、植物の発現において野生型と比べて、例えば図１のポリペプチドをコードする遺伝子配列を用いて得られる効果と比べて、開花を促進する。開始の“促進”は、それを進展させ、加速し、又はその時期をはやめる。開花又は他の特徴への効果の比較は、アラビドプシス・タリアナにおいて行うことができ、但し、本発明による核酸は、広範囲の種々の植物の生産において及びその特徴に影響を与えるために用いることができる。以下に更に議論されるように、本発明による核酸の過剰発現は、開花を促進することができ、他方でトランスジェニック植物において開花を促進することができる。突然変異体、変異体又は誘導体を生産するための配列への変化は、コードされたポリペプチドにおける１又は複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失又は置換を導く核酸における１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の付加、挿入、欠失又は置換によるものであり得る。もちろん、コードされたアミノ酸配列に差を生じさせない核酸への変化は、プロモーターのような非コード化領域へ、又は遺伝子発現の制御に影響を与える因子のための結合部位への変化を含めて、含まれる。 LHY遺伝子のための好ましい核酸配列は、LHY機能を有するポリペプチドの予測されるアミノ酸配列と共に図１に示す。本発明による好ましい核酸は、図１に示すヌクレオチドの配列によりコードされるアミノ酸配列をコードする。本発明による突然変異体、対立遺伝子、変異体又は誘導体のアミノ酸配列は、図１に示す配列において、図１に示す配列に関して１つのアミノ酸変化、又は２，３，４，５，６，７，８、もしくは９の変化、約10，15，20，30，40又は50の変化、又は約50，60，70，80又は90を超える変化を含む。図１に示すアミノ酸配列内の１又は複数の変化に加えて、変異体、対立遺伝子又は誘導体アミノ酸配列は、Ｃ末端及び／又はＮ末端に更なるアミノ酸を含み得る。本明細書に特に開示される配列に関する配列はその配列と相同性を分けあう。相同性は、ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列レベルであり得る。好ましくは、その核酸配列及び／又はアミノ酸配列は、図１のコーディング配列又はヌクレオチド配列によりコードされる配列と相同性を分けあう。それは、好ましくは、少くとも約50％，60％，70％、又は80％の相同性であり、最も好ましくは、少くとも約90％，95％，96，97％，98％又は99％の相同性である。十分に理解されるように、アミノ酸レベルでの相同性は、一般に、アミノ酸類似性又は同一性の表現で呼ばれる。類似性は、“保存性変異”、即ち１つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの他のものへの置換、又は１つの極性残基の他のものへの置換、例えばアルギニンからリシン、グルタミン酸からアスパラギン酸、もしくはグルタミンからアスパラギンへの置換を許容する。類似性は、当該技術で普通に用いられるAltschulら（1990）J．M ol．Biol．215：403-10のTBLASTINプログラム、並びにこれが好ましいが、Wisco nsin Package，Version 8，September 1994（Genetics Computer Group，575 Sc ience Drive，Madison，Wisconsin，USA，Wisconsin 53711）の一部である標準的プログラムBest Fitにより定義され、決定され得る。Best Fitは、２つの配列間の類似性の最も優れたセグメントの最適なアラインメントを作り出す。最適なアラインメントは、Smith及びWatermanの局所的相同性アルゴリズムを用いて適合の数を最大にするために、ギャップを挿入することにより見い出される。相同性は、本明細書に示される関連する配列の全長にわたっても、又は場合により関連するアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列と比較して、約20，25，30 ，33，40，50，67，133，167，200，233，267，300，333，400，450，500，550 ，600又はそれらより多いアミノ酸又はコドンの連続配列にわたってもよい。本発明の更に他の態様は、本明細書に供されるいずれかのコーディング配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチドの配列を含み、又はそれらから本質的になる核酸を供する。これを調べる他の方法は、その態様による核酸が本明細書に供されるいずれかのコーデンィグ配列と相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができることであろう。もちろん、DNAは、一般に、二本鎖であり、サザンハイブリダイゼーションのようなブロッティング技術は、ハイブリダイズする鎖間に区別を設けることなく鎖の分離の後にしばしば行われる。好ましくは、ハイブリダイズできる核酸又はその相補体は、植物の物理的特性、特に開花特性、例えば開花の時期に影響を与えることができる産物をコードする。ハイブリダイゼーションのための好ましい条件は、当業者に周知であるが、一般には、他の配列を排除して関心の配列間のポジティブなハイブリダイゼーションを行うのに十分なストリンジェント条件である。例えばゲノム又はcDNAとして図１のアミノ酸配列をコードするDNAを含み得る核酸は、組換え体及び好ましくは複製可能なベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ又はアグロバクテリウム(Agrobacterium)バイナリーベクターの形態であり得る。その核酸は、宿主細胞、例えば微生物、例えば細菌、又は植物細胞における発現のための適切なプロモーター又は他の調節要素の制御下にあり得る。ゲノムDNAの場合、これはそれ自体のプロモーター又は他の調節要素を含み得、そしてcDNAの場合、これは宿主細胞内での発現のための適切なプロモーター又は他の調節要素の制御下にあり得る。本発明による核酸を含むベクターは、特にベクターを、ゲノム内への組換えのために核酸を細胞内に導入するのに用いる場合は、プロモーター又は他の調節配列を含む必要はない。当業者は、十分にベクターを作製し、組換え遺伝子発現のためのプロトコルをデザインすることができる。適切な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の適切な配列を含む適切なベクターを選択し又は作製することができる。更なる詳細については、例えばMolecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition，S ambrook 5，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。例えば核酸構成物の調製、配列決定、細胞へのDNAの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における核酸の操作のための多くの周知の技術及びプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology，Second Edition，Ausbelらeds.，Jo hn Wiley & Sons，1992に詳細に記載される。Sambrookら及びAusubelらの開示は、引用により本明細書に組み込まれる。植物に広く成功して以前に用いられる特定の手順及びベクターは、Bevan（Nucl．Acids Res．12，8711-8721(1984)）並びにGuerineau及びMullineaux（1993）（Plant transformation and expression vectors．In：Plant Molecular Biology Labfax（Croy RRD ed）Oxford，BIOS Scientific Publishers，pp 121-148）により記載される。選択可能な表現型、例えば抗生物質、例えばカナマイシン、ヒグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゼンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリホサーテに対する耐性を供するキメラ遺伝子からなる選択遺伝子マーカーを用いることができる。本発明による核酸分子及びベクターは、実質的に純粋なもしくは均一な形態で、又は要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の関心の種又は起源の核酸もしくは遺伝子がないもしくは実質的にない自然の環境から単離され、及び／又は精製されて供され得る。本発明による核酸は、cDNA，RNA、ゲノムDNAを含み得、そして全体的に又は部分的に合成であり得る、用語“単離”とは、全てのこれらの可能性を包含する。DNAを特定する場合、例えば図面を引用する場合、文脈が要求しないなら、ＶをＴに置換するRNA等価物が含まれる。本発明は、開示される核酸配列のいずれかの発現産物、並びに適切な宿主細胞内であり得る適切な条件下でコーディング核酸からの発現により前記発現産物を作る方法も含む。発現の後、その産物は発現システムから単離することができ、必要に応じて、例えば少くとも１の更なる構成物を含む組成物の調剤に用いることができる。例えばコーティング核酸からの発現により組換え生産される精製されたLHYタンパク質、又はそのフラグメント、突然変異体、誘導体もしくは変異体は、当該技術で標準である技術を用いて抗体を作るのに用いることができる。抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含むポリペプチドは、更に以下に議論されるように、他の種からの相同体を同定するのに用いることができる。抗体を生産する方法は、タンパク質又はそのフラグメントで哺乳動物（例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ又はサル）を免疫化することを含む。抗体は、当該技術で周知の種々の技術のいずれかを用いて、免疫化された動物から得ることができ、好ましくは、関心の抗原への抗体の結合を用いてスクリーニングすることができる。例えば、ウエスタンブロッティング技術又は免疫沈降を用いることができる（Armitageら、1992，Nature 357：80-82）。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。哺乳動物を免疫化するかわりとして又はその補助として、適切な結合特異性を有する抗体は、例えばその表面上に機能的なイムノグロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージを用いて、発現されたイムノグロブリン可変ドメインの組換え生産されたライブラリーから得ることができる。例えばＷＯ 92／01047を参照のこと。ポリペプチド又はペプチドに対して生じた抗体は、相同なポリペプチド及び次にそのコーディング遺伝子を同定及び／又は単離するのに用いることができる。これにより、本発明は、（本明細書に開示される実施形態により） LHY機能を有するポリペプチドを同定又は単離する方法であって、LHYポリペプチド又はそのフラグメント、変異体もしくは誘導体に結合することができ、又は好ましくは該ポリペプチドについての結合特異性を有する抗体の抗原結合ドメイン（例えば完全な抗体又はそのフラグメント）を含むポリペプチドで候補ポリペプチドをスクリーニングすることを含む方法を提供する。LHYポリペプチド又はその突然変異体、変異体もしくは誘導体に結合し及び好ましくは特異的である抗体の抗原結合ドメインを含む特異的に結合するメンバー、例えば抗体及びポリペプチドは、それらの使用及びそれらを用いる方法と同様、本発明の態様を構成する。スクリーニングのための候補ポリペプチドは、例えば、関心の植物由来の核酸を用いて作られた発現ライブラリーの産物であり得、又は天然のソースからの精製過程の産物であり得る。抗体に結合することが見い出されたペプチドを単離し、次にアミノ酸配列決定にかけることができる、全体的に又は部分的に（例えばポリペプチドのフラグメントを配列決定することができる）ポリペプチドを配列決定するのにいずれかの適切な技術を用いることができる。例えば、以下に更に議論されるように、候補核酸へのハイブリダイゼーションにおけるプローブもしくはプライマーとして用いるための１もしくは複数のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドの縮重したプール）をデザインすることにより、又はコンピューター配列データベースを調査することにより、ポリペプチドをコードする核酸を得るのに、アミノ酸配列情報を用いることができる。本発明の更なる態様は、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）以外の植物種からLHY相同体を同定及びクローニングする方法であって、該方法が、図１に示される配列由来のヌクレオチド配列を用いることを特徴とする方法を提供する。これら由来の配列は、それら自体、他の配列を同定し、クローニングするのに用いることができる。本明細書に供されるヌクレオチド配列情報、又はそのいずれか一部、特にmybドメインに関するものは、開花特性に影響を与える能力についてその発現産物をテストすることができる相同な配列を見い出すためにデータベースサーチにおいて用いることができる。これらは、LHY機能又は（特に長日下で）開花を抑制する能力を有し得、ここで好ましくは開花の時期は、本明細書に開示されるように、春化により実質的に影響を受けない。あるいは、核酸ライブラリーは、当業者に公知の技術を用いてスクリーニングすることができ、それにより相同な配列を同定し、次にテストすることができる。これにより、その発現が植物の開花特性に影響を与えることができる核酸を得る方法であって、オリゴヌクレオチド又は該オリゴヌクレオチドを含む核酸分子の、標的／候補核酸へのハイブリダイゼーションを含む方法を供する。標的又は候補核酸は、例えば、該核酸を含むことが知られており又は含むと予想される生物から得ることができるゲノム又はcDNAライブラリーを含む。ハイブリダイゼーションの成功を同定することができ、更なる研究及び／又は使用のために標的／候補核酸を単離することができる。ハイブリダイゼーションは、核酸をプロービングし、（周知の技術に従って）適切なストリンジェント条件下での陽性のハイブリダイゼーションを同定し、及び／又はPCRのような核酸増幅の方法におけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用に関連し得る。プロービングのために、好ましい条件は、更に研究することができる陽性として同定された小数のハイブリダイゼーションでの単純なパターンであるのに十分なストリンジェントであるものである。少しの陽性クローンのみが残るまで、次第にハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させることは当該技術で公知である。プロービングのかわりとして、なお核酸ハイブリダイゼーションを用いるが、 DNA配列を増幅するようデザインされたオリゴヌクレオチドを、PCR反応又は慣用的な手順を用いる核酸の増幅に関する他の方法に用いることができる。例えば、 “PCRプロトコル；A Guide to Method and Applications”，Eds−Innisら、199 0，Academic Press，New York）を参照のこと。プローブ又はPCRプライマーのデザインに用いるのに適した好ましいアミノ酸配列は、開花特性、例えば開花の時期に影響を与えることができる少くともこの LHYポリペプチド間に（完全に、実質的に又は部分的に）保存された配列である。他の好ましいプライマーは、myb領域を含む領域を増幅するようデザインされる。アミノ酸配列情報に基づいて、遺伝子コードの縮重を考慮に入れて、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーをデザインすることができ、そして適切なら、候補核酸からの生物のコドン用法が得られる。好ましくは、例えば核酸増幅のための、本発明によるオリゴヌクレオチドは、約10又はそれ未満（例えば６，７又は８）のコドンを有し、即ち約30又はそれ未満のヌクレオチド長（例えば18，21又は24)である。LHY野生型又は変異体遺伝子を増幅するための可能なプライマーは、5'-ATGGATACTAATACATCT-3′及び5'-CTAG ATTTAAAGATATTA-3'を含む。プライマーを増幅するため、プライマーLPl及びLP２を用いることができる（以下を参照のこと）。 PCR産物が開花の制御に関する遺伝子に対応するか否かの評価は、種々の方法において行われ得る。このような反応からのPCRバンドは、産物の複合混合物を含み得る。個々の産物はクローン化することができ、各々１つを個々にスクリーニングすることができる。それらは、関心の植物への導入に基づく機能を評価するために形質転換により分析することができる。本発明は、図１に示される配列由来のヌクレオチド配列を用いて得られるLHY 相同体をコードする核酸、及びその使用にも広げられる。未知の機能のExpresse d Sequence Tags(ESTs)を除いて、公共のデータベースにおいて同定されたLHYと大きな相同性を示す遺伝子はない。しかしながら、（アミノ酸18と78との間の） LHYの領域は、MYBドメイン（Framptonら、1989）を含むいくつかのDNA結合タンパク質に対して弱い相同性を示し、LHYの配列のこの部分の注意深い分析は、これがおそらくMYBドメインを含むであろうことを示した。特に、実施例１に議論されるように、３つのα−ヘリックスを含むことが予想される（図８）。ほとんどのMYBタンパク質と違い、LHYは単一のMYB反復を含む。但し、単一のMYB反復を含む他のタンパク質は以前に報告されている（Baranwskiら、1994）。アラビドプシス・タリアナのLHY遺伝子についての配列情報の供給は、他の植物種からの相同配列の獲得を可能にする。特に、当業者は、アラビドプシスから単離された他の開花時期遺伝子について行われるように、関連する市販の重要なアブラナ種（例えばブラシカ・ニグラ（Brassican igra）、ブラシカ・ナプス（Brassica napus ）及びブラシカ・オレラセアエ(Brassica oleraceae)）からLHY アナログを単離することができる(例えばCO；WO 96/14414)。これにより、アラビドプシス・タリアナのLHYの相同体であるアミノ酸配列をコードする核酸分子は本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、核酸又はアミノ酸配列は、図１の配列と相同性を有し、それは、好ましくは少くとも約50％、少くとも約60％、少くとも約70％、又は少くとも約80％の相同性を有し、最も好ましくはアラビドプシス・タリアナ以外の種から少くとも約90％の相同性を有する。そしてそのコードされたポリペプチドは、アラビドプシス・タリアナLHY遺伝子と、表現型、好ましくは開花の時期に影響を与える能力を共にする。これらは、アラビドプシス・タリアナLHYと比べて開花を促進し又は遅らせることができ、突然変異体、変異体又は対立遺伝子は野生型と比べて開花を促進し又は遅らせることができる。“相同性”は、同一性をいうのに用いられ得る。 LHY遺伝子相同体は、コメ及びトウモロコシのような経済的に重要な単子葉の作物からも同定することができる。単子葉及び双子葉植物における同じタンパク質をコードする遺伝子はヌクレオチドレベルでは比較的少い相同性しかないが、アミノ酸配列は保存される。公共の配列データベースにおいて、我々は、現在、ランダム配列を決定プログラムにおいて得られ、その活性について重要であることが知られているタンパク質の領域内でLHYと相同性を分けあういくつかのアラビドプシスcDNAクローン配列を同定した。同様に、LHYと強い相同性を示すランダムに配列決定されたコメcDNAは、相同性により同定され、経済的に重要な穀類の植物においてLHY遺伝子へのアクセスを供するはずである。これらのクローンの各々を配列決定し、それらの発現パターンを研究し、そしてそれらの発現を変える効果を検査することにより、開花時期を制御することにおいてLHYと同様の機能を行う遺伝子を得ることができる。もちろん、これらの配列の突然変異体、変異体、誘導体及び対立遺伝子は、LHY遺伝子について上述されるのと同じ用語で本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明による核酸は、既に先に議論された用語において（例えば長さについて）図１に示されるアミノ酸配列の全部又は一部と相同性を有するポリペプチドをコードする。ここで、その相同性は、図１のアミノ酸配列の各々の部分及び図に示されるようなEST配列の間の相同性より、関連する部分（即ちフラグメント）の長さにわたってより大きく、約５％超、より好ましくは約10％超、より好ましくは約20％超、及びより好ましくは約30 ％超である。これにより、一実施形態を引用して例示するため、図１に示されるアミノ酸のアミノ酸突然変異体、変異体又は誘導体をコードする核酸であって、そのコードされるアミノ酸配列は、図９に示されるようなEST配列内の100アミノ酸のいずれの連続配列よりも、図１のアミノ酸配列内の100アミノ酸の連続配列とより大きな相同性、好ましくは約５％超等の相同性を有する約100アミノ酸の連続配列を含む核酸が供され得る。同様に、本発明の特定の実施形態による核酸は、既に先に議論された用語において（例えば長さについて）図１に示されるヌクレオチド配列の全部又は一部と相同性を有する。ここで、その相同性は、図１ヌクレオチド配列の各々の部分及び図９に示されるようなEST配列についてのコーディングヌクレオチド配列（以下に供される受託番号）の間の相同性より、関連する部分（即ちフラグメント）の長さにわたってより大きく、約５％超、より好ましくは約10％超、より好ましくは約20％超、及びより好ましくは約30％超であり得る。これにより、一実施形態を引用して例示するため、ヌクレオチド配列が、図９に示されるようなEST配列（以下に示される受託番号）についてのコーディングヌクレオチド配列内の10 0ヌクレオチドのいずれの連続配列よりも、図１のヌクレオチド配列内の300ヌクレオチドの連続配列とより大きな相同性、好ましくは約５％超等の相同性を有する約300ヌクレオチドの連続配列を含む核酸が供され得る。本発明による核酸は、（例えば高レベルで）発現された時に開花を遅らせるポリペプチドをコードする核酸を含み得る。ここでその開花の時期に春化により実質的に影響を受けない。その遅らされた開花は、長日下にあり得る。LHYにより引きおこされる開花の遅延は、遺伝子の活性な過剰発現の結果であり、それゆえ、その機能の喪失が開花を遅らせるCO及びLDについて以前に記載されるものから区別される。CaMV35SプロモーターからのLHY遺伝子産物の発現は開花を遅らせ、他方、後期開花変異体において同定される他の遺伝子、例えばCOの産物の過剰発現は早期の開花を引きおこす。LHY遺伝子の発現の効果は、長日下での開花を活性的に抑制し、又は概日時計の破壊のように、早期開花のために要求される過程の機能を破壊する産物から生じ得る。春化は、通常、数週間又は数ケ月間、おそらく約30日間〜60日間の間の期間の植物（実生）又は種子の低温（例えば約−１℃〜約６℃、通常０℃のちょうど上）処理である。それは、いくつかの植物種により、それらが芽や花を散らすであろう前に要求される、冬の寒さをまねる処理である。また、本発明によれば、発現の制御のための調節配列の機能的な制御下で、本発明により供されるヌクレオチドの異種配列がそのゲノム内に組み込まれた植物細胞を供する。本発明の更なる態様は、ヌクレオチドの配列を含むベクターを植物細胞内に導入し、そしてベクターと植物細胞との間の組換えを引きおこし又はそれを許容してヌクレオチドの配列をゲノム内に導入することに関する前記植物を作る方法を提供する。植物は、１又は複数の形質転換された植物細胞から再生することができる。選択された遺伝子構成物を細胞内に導入する場合、当業者に十分に知られているように、特定の考慮が払われなければならない。挿入される核酸は、転写をドライブするであろう有効な調節要素を含む構成物内にアセンブルされるべきである。その構成物を細胞内に運ぶ方法が利用できなけれぱならない。構成物が細胞膜内にある時、内在性の染色体材料への組込みはおこるかおこらないかのいずれかであろう。最後に、植物が考慮される限り、標的細胞型は、細胞が完全な植物に再生することができるようでなければならない。その配列を含むDNAセグメントで形質転換された細胞は、植物の遺伝子操作のために既に知られている普通の技術によって生産され得る。いずれかの適切な技術、例えばその天然の遺伝子転移能を活用するアグロバクテリウム(Agrobacteri um)が有するジスアームド（disarmed）Ti−プラスミドベクター（EP-A-270355， EP-A-0116718，NAR 12（22）8711-872151984）、パーティクルもしくはマイクロプロジェクティルボンバードメント（US 5100792，EP-A-444882，EP-A-434616）マイクロインジェクション（WO 92/09696，WO 94/00583，EP 331083，EP 175966 ，Greenら．（1987）Plant Tissue and Cell Culture，Academic Press）、エレクトロポレーション（EP 290395，WO 8706614 Gelvin Debeyser-添付物を参照のこと）直接のDNA取込みの他の形態（DE 4005152，WO 9012096，US 4684611）、リポソーム媒介DNA取込み（例えば、Freemanら．Plant Cell Physiol．29：1353 (1984)）、又はボルテキシング方（例えば、Kindle，PNAS U.S.A．87：1228（19 90d）Physical methods for the transformation of plant cells are reviewed in Oard，1991，Biotech．Adv．９：1-11)を用いてDNAを植物細胞内に形質転換することができる。アグロバクテリウム形質転換は、双子葉植物種を形質転換するのに当業者に広く用いられる。現在、ほとんど全ての経済的に関連性のある単子葉植物における、安定な豊富なトランスジェニック植物のルーチン生産実質的な進展がある（Toriyama，ら（1988）Bio/Technology 6，1072-1074；Z hang,ら（1988）Plant Cell Rep．7，379-384；Zhang，ら（1988）Theor Appl G enet 76，835-840；Shimamoto，ら（1989）Nature 338，274-276；Datta,ら（19 90）Bio/Technology 8，736-740；Christou，ら（1991）Bio/Technology 9，957 -962；Peng，ら（1991）International Rice Research Institute，Manila，Phi lippines 563-574；Cao，ら（1992）Plant Cell Rep．11，585-591；Li，ら（19 93）Plant Cell Rep．12，250-255；Rathore,ら（1993）Plant Molecular Biolo gy 21，871-884；Fromm,ら（1990）Bio/Technology 8，833-839；Gordon-Kamm, ら（1990）Plant Cell 2，603-618；D'Halluin,ら（1992）Plant Cell 4，1495- 1505；Walters,ら（1992）Plant Molecular Biology 18，189-200；Koziel，ら（1993）Biotechnology 11，194-200；Vasil，I．K．（1994）Plant Molecular Biology 25，925-937；Weeks,ら（1993）Plant Physiology 102，1077-1084；So mers，ら（1992）Bio/Technology 10，1589-1594；WO 92/14828）。特に、アグロバクテリウム媒介形質転換は、単子葉植物における極めて有効なかわりの形質転換体としても、現在、浮かび上がっている(Hieiら（1994）The Plant Jownal 6，271-282)。豊富なトランスジェニック植物の形成は、穀類、コメ、トウモロコシ、コムギ、エンバク及びオオムギにおいて達成されている（Shimamoto，K．（1994）Curr ent Opinion in Biotechnology 5，158-162．；Vasil,ら(1992)Bio/Technology 10，667-674；Vainら1995，Biotechnology Advances 13(4)：653-671；Vasil，1 996，Nature Biotechnology 14 page 702に報告される）。マイクロプロジェクティルボンバードメント、エレクトロポレーション及び直接のDNA取込みは、アグロバクテリウムが効能又は効果がない場合に好ましい。あるいは、形質転換法の効能を増強するために、異なる技術の組合せ、例えばアグロバクテリウムとの同時培養前に創傷を導くためにアグロバクテリウムでコートされた微粒子(EP-A-486234)又はマイクロプロジェクティルを伴うボンバードメントを用いることができる(EP-A-486233)。形質転換の後、植物は、当該技術で標準的であるように、例えば単一細胞、カルス組織又は葉（leaf discs）から、再生することができる。ほとんどいずれの植物も、植物の細胞、組織及び器官から完全に再生することができる。利用できる技術は、Vasilら(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Vol I，II及びIII，Laboratory Procedures and Their Applications，Academic Pre ss，1984)並びにWeissbach及びWeissbach（Methods for Plant Molecular Biolo gy，Academic Press，1989）に報告される。形質転換技術の特定の選択は、特定の植物種を形質転換するその効能並びに選択された特定の方法で本発明を実施する人の経験及び能力により決定されよう。植物細胞に核酸を導入するための形質転換システムの特定の選択は、本発明に本質的でなく又は本発明を限定するものでなく、また植物再生のための技術の選択もそうである。種相同体を含む、LHY遺伝子及びその改良型（その対立遺伝子、突然変異体、変異体又は誘導体）、並びに本明細書に供される他の核酸は、植物における物理的特性、例えば開花の時期を含み得る開花特性に影響を与えるのに用いることができる。この目的のため、本明細書に記載されるベクターのような核酸は、トランスジェニック植物の生産のために用いることができる。このような植物は、野生型（即ち、LHY又はその関連する相同体について野生型である植物）と比べて、特に開花の時期に関して、変化した開花表現型を有し得る。本発明は、更に、本発明による核酸又はベクターで形質転換された宿主細胞、特に植物又は微生物細胞を包含する。これにより、本発明による異種核酸を含む宿主細胞、例えば植物細胞が供される。細胞内で、核酸は、染色体内に組み込まれ得る。半数体ゲノム当り１を超える異種ヌクレオチド配列が存在し得る。また、本発明によれば、発現の制御のための調節配列の機能的制御下で、本発明により供される核酸、特に異種核酸をそのゲノム内に組み込んだ植物細胞が供される。そのコーディング配列は、その発現のための遺伝子と天然では関連していないような、遺伝子に対して異種又は外来性であり得る１又は複数の調節配列に作用可能に連結され得る。本発明による核酸は、発現を使用者の制御下におくために、外部から誘導できる遺伝子プロモーターの制御下におくことができる。適切な誘導可能なプロモーターは、成長中の植物に適用することができる特定の化学化合物により誘導されることが示されているGST-11-27遺伝子プロモーターである。そのプロモーターは、単子葉植物と双子葉植物との両方において機能的である。それゆえそれは、畑の作物、例えばカノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、ワタ；穀類、例えばコムギ、オオムギ、コメ、トウモロコシ、モロコシ属植物；果実、例えばトマト、マンゴー、モモ、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、バナナ、及びメロン；並びに野菜、例えばニンジン、レタス、キャベツ及びタマネギを含む種子の遺伝子改良された植物において遺伝子発現を制御するのに用いることができる。他の適切なプロモーターは、本質的に全ての植物組織内で高レベルで発現されるカリフラワーモザイクウイルス35Ｓ(CaMV35S)遺伝子プロモーター(Benfeyら、1990a及び1990b)；生長する頂端分裂組織並びに植物の胴体内のいくつかの十分に局在化した位置、例えば篩部内、花の原基、根及び苗条における分枝点において発現されるカリフラワーmeri５プロモーター（Medf ord，1992；Medfordら、1991）並びに花の発達において極めて早期に発現されるアラビドプシス・タリアナLEAFYプロモーター（Weigelら、1992）を含む。本発明による核酸、例えばLHY遺伝子又は相同体を、外部から誘導可能な遺伝子プロモーターの制御下におき、これにより開花の時期を使用者の制御下におくことは、例えば、花の生産及び次の出来事、例えば種子形成が、例えば切り取った花又は装飾用の花を形成する鉢植え植物において、市場の要求と合致する時機に合わせることができる点で有利である。鉢植え植物において開花を遅らせることは、生産者からのその産物の輸送のために利用できる期間を、販売の時点に伸ばすことにおいて有利であり、開花期間を長くすることは、購入者にとって明らかに有利である。更なる態様において、本発明は、本発明により供されるヌクレオチド配列、例えばアラビドプシス・タリアナのLHY遺伝子、他の植物種、例えばブラシカ（Bra ssica ）、例えばブラシカ・ナプス（Brassica napus）からの相同体、そのいずれかの突然変異体、変異体又は対立遺伝子に作用可能に連結した誘導可能なプロモーターを含む遺伝子構成物を供する。議論されるように、これは遺伝子の発現の制御を可能にする。本発明は、前記遺伝子構成物で形質転換された植物、並びに該構成物の植物細胞への導入及び／又は適切な刺激、有効な外来インデューサーの適用による植物細胞内での構成物の発現の誘導を含む方法も提供する。プロモーターに適用される用語“誘導可能”は、当業者により十分に理解される。本質において誘導可能なプロモーターの制御下での発現は、適用された刺激に応答して“スイッチ・オン”又は増加される。刺激の性質はプロモーター間で種々である。いくつかの誘導可能なプロモーターは、適切な刺激がなければ少しだけの又は検出できないレベルの発現（又は全く発現がない）を引きおこす。他の誘導可能なプロモーターは、刺激なしでも検出可能な構成的発現を引きおこす。発現のレベルが刺激の欠如下でいくらであっても、いずれの誘導可能なプロモーターからの発現も正確な刺激の存在下で増加する。好ましい状態は、表現型の特徴を変えるのに有効な量による関連する刺激の適用に基づき発現のレベルが増加する場合である。これにより、刺激の欠如下で、基底レベルの発現を引きおこし、そのレベルは低すぎて要求される表現型をもたらすことができない（及び実際、０であり得る）誘導可能な（又は“スイッチ可能な）プロモーターを用いることができる。用語“異種”は、問題のヌクレオチドの遺伝子／配列が、遺伝子操作を用いて、即ちヒトの介入により、前記植物の細胞又はその祖先に導入されていることを示すのに用いられ得る。トランスジェニック植物細胞、即ち問題の核酸についてトランスジェニックであるものが供され得る。そのトランスジーンは、ゲノム外ベクター上にあってもゲノム内に、好ましくは安定に、組み込まれていてもよい。異種遺伝子は、内在性の等価を遺伝子、即ち同じ又は似た機能を通常行うものに置きかえても、又は挿入された配列が、内在性の遺伝子又は他の配列に付加されてもよい。異種遺伝子の導入の利点は、優位性に従って発現に影響を与えることができるように、選択されたプロモーターの制御下に、配列の発現をおく能力である。更に、例えば野生型より高い又は低い活性を有する、野生型遺伝子の突然変異体、変異体又は誘導体は、内在性遺伝子のかわりに用いることができる。相同な、又は植物細胞に対して外因性もしくは外来の核酸は、この型、品種又は種の細胞内で自然に発生しないものであり得る。これにより、核酸は、異なる型又は種もしくは品種の植物の植物細胞の文脈内におかれた特定の型の植物細胞又は植物の種もしくは品種のコーディング配列又はそれから得られるコーディング配列を含み得る。更なる可能性は、核酸配列が、それ又は相同体が天然で見い出されるが、その核酸配列が、発現の制御のための、プロモーター配列のような１又は複数の調節配列に作用可能に連結されるように、細胞、又は特定の型の細胞又は植物の種もしくは品種内で自然に発生しない核酸に連結し及び／又は隣接している細胞内におかれることである。植物又は他の宿主細胞内の配列は、異種、外因性又は外来性で同定可能であり得る。本発明による植物細胞を含む植物は、そのいずれか一部もしくは零余子、種子、自殖もしくは雑種子孫及び後代と一緒にも供される。本発明による植物は、１又は複数の特性において真に育種しないものであり得る。植物品種、特に植物育種者の権利（Plant Breeders’Rights）に従う登録可能な植物品種は排除され得る。植物は、単にそれが植物又はその祖先の細胞内に導入されたトランスジーンをそのゲノム内に安定に含むことによるので、“植物品種”と考える必要はないことに注意すべきである。植物に加えて、本発明は、これら植物、種子、自殖もしくは雑種子孫及び後代のいずれかのクローン、並びにこれらのいずれかのいずれか一部、例えば挿穂、種子を供する。本発明は、挿穂、種子等を含む、再生又は繁殖、有性又は無性生殖に用いることができるいずれかの部分であるいずれかの植物零余子を供する。これらの植物の有性もしくは無性繁殖された子孫、クローンもしくは後代である植物、又は該植物、子孫、クローンもしくは後代のいずれかの部分もしくは零余子も含む。本発明は、更に、物理的な、例えば開花の特徴、例えば植物の開花の時期に影響を与える方法であって、植物細胞内で、上述の異種核酸の発現を引きおこし又は許容することを含む方法を提供する。本発明は、更に、植物の細胞又はその子孫への核酸の導入のステップの後の、植物の細胞内での、図１のアミノ酸配列をコードする核酸、又はその配列の突然変異体、変異体、対立遺伝子又は誘導体からの発現（それによりコードされたポリペプチドを生産する）を含む方法を供する。この方法は、植物の開花特性、例えば開花の時期に影響を与え得る。これは、いずれかの他の遺伝子、例えば開花もしくは他の表現型特性又は要求される特性に関連するトランスジーンと組み合わせて用いることができる。本発明を用いて変えることができる主な開花特性は開花の時期である。（植物の他の物理的特徴は、本発明による核酸からの発現により影響を受け得る。）LH Y遺伝子の遺伝子産物の過剰発現は、（LHY突然変異体表現型により示されるように）特に長日下で、開花を遅らせ；下降発現は早熟の開花を導き得る。この制御の程度は、例えば、雑種生産における雄性及び雌性の親系の同時の開花を確実にするのに役立つ。他の使用は、成長シーズンを広げ又はせばめるように、気候の命令に従って開花を進展させ又は遅らせることである。これは、アンチセンス又はセンス制御の使用に関する。本発明において、過剰発現は、センス方向でのヌクレオチド配列の導入により達成することができる。これにより、本発明は、植物の開花特性に影響を与える方法であって、植物の細胞内で、前記核酸からの本発明による核酸のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの発現を引きおこし又は許容することを含む方法を供する。遺伝子産物ポリペプチドの下降発現は、アンチセンス技術又は“ センス制御”（“同時抑制”）を用いて達成することができる。遺伝子発現を下降制御するためにアンチセンス遺伝子又は部分的遺伝子配列を用いることにおいて、ヌクレオチド配列は、転写が、標的遺伝子の“センス”鎖から転写された正常なmRNAに相補的であるRNAを作り出すように、“逆方向”においてプロモーターの制御下におかれる。例えば、Rothsteinら、1987；Smithら、（1988）Nature 334，724-726；Zhangら、（1992）The Plant Cell 4，1575-1 588，Englishら、（1996）The Plant Cell 8，179-188を参照のこと。アンチセンス技術は、Bourque，(1995)，Plant Science 105，125-149，and Flavell，（ 1994）PNAS USA 91，3490-3496にも報告される。代わりは、同時抑制により標的遺伝子の発現の減少を達成するために、センス、即ち標的遺伝子と同じ方向で挿入された標的遺伝子の全部又は一部の複製を用いることである。例えばvan der Krolら、（1990）The Plant Cell 2，291-299 ；Napoliら、（1990）The Plant Cell 2，279-289；Zhangら、（1992）The Plan t Cell 4，1575-1588、及びUS-A-5,231,020を参照のこと。（アンチセンスのための逆方向における）コーディング配列に相当する完全な配列は用いる必要はない。例えば、十分な長さのフラグメントを用いることができる。コーディング配列の種々の部分から種々の大きさのフラグメントをスクリーニングしてアンチセンス阻害のレベルを最適化することは当業者にとって慣用的なことである。開始メチオニンATGコドン、及び該開始コドンの上流の１又は複数のヌクレオチドを含むことが有利であり得る。更なる可能性は、遺伝子の保存された配列、例えば１又は複数の遺伝子の特徴的な配列、例えば調節配列を標的にすることである。用いる配列は、約500ヌクレオチド又はそれ未満、おそらく約40 ０ヌクレオチド、約300ヌクレオチド、約200ヌクレオチド、又は約100ヌクレオチドであり得る。かなり短い長さのオリゴヌクレオチド、14〜23ヌクレオチドを用いることが可能であり得るが、より長いフラグメント、一般に約500超のヌクレオチドが好ましく、可能なら、例えば約600ヌクレオチド超、約700ヌクレオチド超、約800ヌクレオチド超、約1000ヌクレオチド超、又はそれ超が好ましい。配列の相補性又は類似性は本質でないが標的配列の発現の下降制御のために用いられる配列、及び標的配列において完全な配列同一性があることが好ましい。１又は複数のヌクレオチドが、標的遺伝子から用いられる配列において異なり得る。これにより、本発明により遺伝子発現の下降制御に用いられる配列は、利用できるものから選択された野生型配列（例えば遺伝子）又は、この配列の１又は複数のヌクレオチドの挿入、付加、欠失又は置換による突然変異体、誘導体、変異体又は対立遺伝子であり得る。その配列は、オープイン読み枠を含む必要も、翻訳可能であろうRNAも特定する必要もない。各々のアンチセンス及びセンスRNA 分子がハイブリダイズするために十分な相同性があることが好ましい。用いる配列と標的遺伝子との間に約５％，10％，15％もしくは20％又はそれ超の不適正がある場合でさえ遺伝子発現の下降制御があり得る。一般に、転写された核酸は、図１に示されるヌクレオチド配列又はその相補体を含むようなLHY遺伝子のフラグメントを示しても、LHYコーディング配列に対して行われた変化及びその変化された配列の相同性に関して上述されるのと同様の用語において、その突然変異体、誘導体、変異体又は対立遺伝子であってもよい。その相同性は、ハイブリダイゼーションがおこるか否かにかかわりなく、要求される効果が遺伝子発現の下降制御であるが、転写されたアンチセンスRNAが植物の細胞内で核酸とハイブリダイズするのに十分であり得る。これにより、本発明は、植物の開花特性に影響を与える方法であって、植物の細胞内で、本発明による異種核酸からのアンチセンス転写を引きおこし又は許容することを含む方法も提供する。本発明は、更に、遺伝子発現の下降制御、特に、LHY遺伝子又はその相同体の発現の下降制御のため、好ましくは植物の物理的特徴、特に、開花特性、特に開花の時期に影響を与えるための、図１のヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、突然変異体、誘導体、対立遺伝子、変異体もしくは相同体の使用を提供する。アンチセンス制御は、それ自体、適切な構成物中で誘導可能なプロモーターを用いることにより制御することができる。標的遺伝子の更なる複製が、センスにおいて、即ち標的遺伝子と同じ方向において挿入される場合、過剰発現がおこる個体、及び標的遺伝子からのタンパク質の下降発現がおこるいくつか個体を含む特定範囲の表現型が作られる。挿入された遺伝子が外因性遺伝子の一部のみである場合、トランスジェニック集団中の下降発現する個体の数は増加する。センス制御、特に下降制御がおこるメカニズムは十分に理解されていない。しかしながら、この技術は、科学及び特許文献において十分に報告されており、遺伝子制御のために慣用的に用いられる。例えば、 van der Krol，1990；Napoliら、1990；Zhangら、1992を参照のこと。また、フラグメント、突然変異体等は、アンチセンス制御に用いるために上述されるのと同様の用語で用いられ得る。これにより、本発明は、植物の開花特性に影響を与える方法であって、植物の細胞内で、本発明による核酸からの発現を引きおこし又は許容することを含む方法も提供する。これは、開花特性に影響を与える能力を有するポリペプチドの活性を抑制するのに用いることができる。ここで、ポリペプチドの活性は、好ましくは、植物細胞内での下降発現の結果として抑制される。 LHY 遺伝子の発現の増加により引きおこされる開花の遅れ実施例１に記載されるように、lhy変異は、誘導した長日条件下で開花を遅らせ、Dsトランスポゾンが有するCaMV35Sプロモーターからの遺伝子の発現の増加が原因である。それゆえこれは、プロモーターとLHY遺伝子との間の転位により生体内で形成された転写的融合として考慮することができる。CaMV35Sこの現象は、異なる遺伝子について以前に報告されている（Wilsonら、1996）。LHY遺伝子が過剰発現されるようなCaMV35SプロモーターとLHY遺伝子との間の試験管内で作製された融合体は、同じ効果を有すると予想されよう。実施例２は、CaMV35S プロモーターとLHYとの間の生体内融合体の、野生型植物への導入が長日下で開花を遅らせることを示す。これは、外来プロモーターとLHY遺伝子との間の融合が、開花を遅らせるのに用いることができることを示唆する。 LHY の活性を削減することによる開花の早期化 LHY遺伝子の発現の増加が開花を遅らせるという観察結果は、LHYの正常な機能が開花を遅らせ得ること、及びその遺伝子の発現の増加がこの効果を更に増強することを示唆する。この場合において、LHY遺伝子を不活性化することは、開花を早めることが予想され得る。これは、伝統的な化学もしくは放射線変異誘発により、LHY mRNAのアンチセンス複製を発現する構成物を導入することにより、同時抑制のようなセンス鎖不活性化により又はLHYタンパク質の改良型を発現することにより行うことができる。その配列が図10に供されるLHYプロモーターは、いくつかの方法において、特に異種の、外因性の又は外来のトランスジーン又はそのフラグメントに作用可能に連結された時に用いることができる。本質的にも、プロモーターは、その有用性が概日変動様式でのその制御から生ずる関心のいずれかの配列の発現を制御するのに用いることができる。例えば、プロモーター（並びにその１又は複数のヌクレオチドの付加、挿入、置換及び／又は欠失によるいずれかの適切な突然変異体、変異体、対立遺伝子又は誘導体）は、制御、特に遺伝子の発現の下降制御のために、アンチセンス又はセンスのいずれかで、コーディング配列又は配列の発現を制御するのに用いることができる。これにより、遺伝子は、朝早くに発現、又は下降制御され得るが、場合によりそれら又はそれらの下降制御が必要とされない昼の時間にはそうでないものであり得る。これは、トランスジェニック植物のエネルギーリザーバーが保存されるのを許容する。更に、それは、遺伝子又は下降制御が構成物であるなら効果が生じ得るトランスジェニック植物への逆の副次的効果を避けることができる様式での遺伝子の発現又は下降制御を許容する。この例は、Mlo遺伝子の下降制御のための配列の転写をドライブするために本発明によるプロモーターを用いることである(Buschagesら、1997，CELL，88，69 5〜705)。このオオムギ遺伝子又はその他の種の等価相同体の下降制御は、広範囲のウドンコ病耐性を供する。しかしながら、mloのいくつかの対立遺伝子は、それらが高レベルの局在化した壊死応答を有するので、植物の能力への悪影響に関連し得る。変動様式での下降制御は、不要な副作用なく要求される病原耐性を供する。本発明によりプロモーターを用いて概日の周期的様式で有利に発現され得る他の遺伝子は、代謝の資源を、シンク貯蔵経路、例えば適切には昼又は夜の間にオン又はオフされる必要があるデンプン、油又は他の貯蔵タンパク質合成に向ける原因である遺伝子、日昼の間は必要とされない夜の時間の光吸収活性のための遺伝子、夜の間は必要とされない昼の間の光合成を改良するのに用いられる遺伝子、光阻害条件、典型的にはしばしば夜明けにおこる高光レベル及び低温から植物を保護するための遺伝子、並びに着色パターン（例えばすじのある装飾物）への美的に価値のある変化を達成するために、着色、例えばクロロフィル、アントシアニンを改良するための遺伝子を含む。これにより、更なる態様によれば、本発明は、LHY遺伝子プロモーターをコードする核酸分子を供する。更なる態様において、本発明は、プロモーターをコードする核酸分子を供する。ここで該プロモーターは、図10に示されるヌクレオチドのプロモーター配列を含む。全長のプロモーター配列のかわりに、概日周期様式で植物において遺伝子発現を促進するのに十分な図10に示される配列の１又は複数のフラグメントを用いることができる。そのプロモーターは、アラビドプシス・タリアナ染色体中のLHY 遺伝子のコーディング配列に対して５’の約１７４０ヌクレオチドまでの配列又は他の種における等価配列を含み、又はそれから本質的になり得る。注記すると、これのフラグメント、例えば約1700ヌクレオチド、1600ヌクレオチド、15 00ヌクレオチド、1400ヌクレオチド、1300ヌクレオチド、1200ヌクレオチド、11 00ヌクレオチド、1000ヌクレオチド、900ヌクレオチド、800ヌクレオチド、700 ヌクレオチド、600ヌクレオチド又は500ヌクレオチド、特に図10におけるヌクレオチド1059から上流の配列内のフラグメントを用いることができる。図10内のヌクレオチド1059〜1735における非翻訳リーダー配列は省かれ得る。もちろん、議論されるように、本発明に従って、突然変異体、対立遺伝子、変異体、誘導体及び相同体を用いることができる。本発明によるコーディング配列について図に開示される配列のいずれかを、（相同体を含む）ゲノムLHY遺伝子を含むゲノムライブラリーからのプロモーターの同定及び単離に用いるためのプローブを作製するのに用いることができる。このようなプロービングのための技術及び条件は当該技術で公知であり、本明細書で他所で議論される。一時的な制御の原因である最小要素又はモチーフを見い出すために、制限酵素又はヌクレアーゼを用いて核酸分子を消化し、次に（例えはルシフェラーゼのようなリポーター遺伝子を用いて）適切なアッセイを行い要求される配列を決定することができる。本発明の好ましい実施形態は、概日リズムプロモーター活性のために要求される図10に示される最小のヌクレオチド配列を有する核酸単離物を供する。注目すべきは、プロモーターは、発現の概日周期調節制御を与える１又は複数の配列モチーフ又は要素を含み得る。他の調節配列、例えば適切な発現システムにおける突然変異もしくは消化アッセイにより又は例えばオンラインデータベースをサーチするためにコンピューターを用いて、利用できる情報との配列比較により同定されるものが含まれ得る。 “プロモーター”とは、それからの転写が、下流（即ち二本鎖DNAのセンス鎖の３’方向）に作用可能に速結したDNAから開始され得るヌクレオチドの配列を意味する。 “作用可能に連結”とは、転写がプロモーターから開始されるために適した位置及び方向で同じ核酸分子の一部として連結されることを意味する。プロモーターに作用可能に連結したDNAは、プロモーターの“転写開始制御下”にある。本発明は、本明細書に供されるプロモーター配列のヌクレオチド付加、挿入、置換又は欠失により、対立遺伝子、突然変異体、変異体又は誘導体であるヌクレオチド配列を有するプロモーターに広げられる。供される配列との配列相同性の好ましいレベルは、本発明によるコーディング核酸及びポリペプチドについて上述されるものと同様であり得る。ヌクレオチド配列に変化を与えるための核酸の系統的又はランダム変異誘発は、当業者に周知のいずれかの技術を用いて行うことができる。本発明によるプロモーター配列への１又は複数の変化は、プロモーター活性を増加もしくは減少させ、又はプロモーター活性を調節することができる物質の効果の大きさを増加もしくは減少させることができる。 “プロモーター活性”は、転写を開始する能力をいうのに用いられる。プロモーター活性のレベルは、例えばプロモーターからの転写により生産されるmRNAの量の評価により、又はプロモーターからの転写により生産されるmRNAの翻訳により生産されるタンパク質産物の量の評価により定量可能である。発現システム中に存在する特定のmRNAの量は、例えば、mRNAとハイブリダイズすることができかつ標識された特定のオリゴヌクレオチド又は特定の増幅反応、例えばポリメラーゼ鎖反応に用いることができる特定のオリゴヌクレオチドを用いて決定することができる。リポーター遺伝子の使用は、タンパク質生産を表示することによりプロモーター活性の決定を容易にする。本発明は、更に、異種遺伝子、例えばコーディング配列に作用可能に連結した、転写を促進することができる、供されるプロモーター領域、又はそのフラグメント、突然変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体を含む核酸構成物を供する。“異種”又は“外因性”遺伝子に、一般に、LHYの改良形態ではない。その遺伝子は、発現後に、検出され及び好ましくは定量され得るペプチド又はポリペプチド産物に転写れ得るmRNAに転写され得る。発現後にそのコードされた産物をアッセイすることができる遺伝子は、“リポーター遺伝子”、即ちプロモーター活性について“報告する”遺伝子と呼ばれる。リポーター遺伝子は、好ましくは、色のついた産物のような検出可能なシグナル、好ましくは視覚的に検出できるシグナルを生産する反応を触媒する酵素をコードする。リポーター遺伝子からの発現から生ずる遺伝子産物の存在及び／又は量は、その産物に結合することができる分子、例えば抗体又はそのフラグメントを用いて決定することができる。その結合する分子は、いずれかの標準的技術を用いて直接又は間接に標識することができる。当業者は、可能なリポーター遺伝子の大きさ及び遺伝子活性を決定するのに用いることができるアッセイ技術を十分に知っている。植物に一般に用いられるリポーター遺伝子の例は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子(Millarら、1992，The Pla nt Cell 4，1075-1087)及び大腸菌uidA遺伝子（Jeffersonら、1987，EMBO J．6 ，3901-3907）。いずれかの適切なリポーター／アッセイを用いることができ、そして特定の選択が本発明に本質的であることはなく又は特定の選択は本発明の限定とはならないことが認められるはずである。プロモーター構成物は、例えばゲノム内に一体化した構成物を含む安定な細胞系を生産するため又は一時的な発現のため、先に記載されるいずれかの技術を用いて細胞内に導入することができる。プロモーター又は構成物を含む細胞及び植物等並びに本発明に従う前記プロモーター又は構成物に関する他の方法及び使用は、本発明に従って他の核酸について先に議論されるのと同じ用語において本発明の態様として供される。本発明の態様及び実施形態は、添付の図面を引用して、実施例により詳述されるであろう。更なる態様及び実施形態は当業者に明らかであろう。本明細書に言及される全ての文献は、引用により本明細書に組み込まれる。図面において：図１は、本発明の一実施形態によるヌクレオチド配列を示す。この配列は、該ヌクレオチド配列のコーディング領域下に示される予想されるアミノ酸配列を伴う、アラビドプシス・タリアナから得られるLHY ORFの配列である。下線の領域は、lhy突然変異体において削除されている配列を示す。その挿入の位置は、三角形で示す。図２：異なる昼の長さにおいて土壌上へ成長したlhy突然変異体の実生（２〜４の葉）及び野生型の胚軸の長さを示すグラフ。胚軸の長さ（mm）は、暗所で並びに10，16及び24時間の長さの光の１日下で成長した実生について示される。陰の棒はlhy突然変異体実生についてであり；陰のない棒は野生型についてである。図３：lhy突然変異体におけるDsに隣接するIPCRフラグメントの配列。図３Ａ：Dsの３’端由来のIPCRフラグメント。図３Ｂ：Dsの５’端由来のIPCRフラグメント。図４：野生型LHYゲノム座及びlhy突然変異体中に存在する欠失の制限酵素地図。図５：相補性実験に用いた、LHY遺伝子周囲の領域からのゲノムDNAを含むT-DN A構成物図６Ａ：ペプチドTEC1及びTEF1のTEAドメインにおける最初のαヘリックスに対するLHYの最初の80アミノ酸の相同性図６Ｂ：YCS3及びBAS1におけるmybドメインに対するLHYの相同性図７：対応するLHY配列下部を伴うFramptonら（1989）に記載されるmybドメインについての共通配列。ハシュ記号は疎水性残基を示し、ドル記号は荷電したアミノ酸を示す。図８：LHYにおける潜在的なmybドメインの予測されるαヘリックス。Ｈは、その残基がαヘリックスの一部であると思われる残基を示し、そしてＬはその残基がループの一部であると思われる残基を示す。αヘリックスを形成する確率を下に示す（確率Ｈ：０＝極めて低い確率；９＝極めて高い確率）。ソフトウエアPr edict Proteinを用いて構造を予測した（70％超の精度であると評価）(Roseら、 (1996))。図９：LHY遺伝子と相同性を有するデータベース内で同定された２つのEST 図10は、LHY遺伝子のプロモーター及び非翻訳リーダーのゲノム配列を示す。L HYオープン読み枠のATG開始コドン(塩基1736-1738)を下線で示す。得られた最も長いLHY cDNAは位置1059において始まり（ボールド及び二重下線）、このことは、最初の1059塩基はプロモーター配列を含み、他方1059からATG開始コドンは非翻訳リーダーをコードすることを示す。mRNAからスプライシングされるイントロンである、翻訳されたいリーダーのゲノム配列中に存在し、cDNAから欠ける配列がある。これらのイントロンの可能性のある配列を図10にイタリックで示す（12 28〜1398；1434〜1592）。配列GGATCC(16-21)はプロモーターをクローン化するのに用いるBamHＩ部位を示す。図11は、EST162I3T7、受託番号R30439のヌクレオチド配列を示す。実施例１−LHY遺伝子Lambda及びcDNAライブラリーのクローニング及び分析アラビドプシスゲノムDNAを含むラムダgtライブラリーを、N．Harberd博士から得た（Whitelamら、1993）。植物形質転換可能ベクター(T-DNAベクター04541)中に、アラビドプシスタリアナゲノムフラグメントを含むコスミドライブラリーを、C．Lister博士から得た。３つのcDNAライブラリーを、Kolnのアラビドプシスストックセンターから得た。トランスポゾン変異誘発スクリーンにおけるlhyの同定 lhy突然変異体を、Longら（1993）により記載されるように、２つの構成物Ac ／Dsトランスポゾン変異誘発スクリーンにおいて同定した。それは、CaMV35Sプロモーターでドライブされるトランスポサーゼ遺伝子を含む改良された安定なAc 因子を組み込んでいた。この安定なAcを用いて改良されたDs因子を起動させた。その改良されたDsは、Dsを含む植物の容易な同定、及び５’端におけるトランスポゾンのCaMV35Sプロモーターを読み出しを許容する。Ds因子のネイティブ遺伝子の近傍への挿入は、CaMV35Sプロモーターとネイティブ遺伝子との間の遺伝子融合物の生産によりその遺伝子の過剰発現を引きおこし得る（Wilsonら、1996）。変異誘発ストラテシンは次のように要約することができる：（ヒグロマイシン耐性によりマークした）Dsについてホモ接合の植物を、（β−グルコロニダーゼ遺伝子によりマークした）トランスポサーゼソースを含む安定なAcについてホモ接合の植物と交配した。次にＦ１ヘテロ接合植物を自家受粉させた。この世代において、Dsは、Acにおけるトランスポサーゼソースの存在によりT-DNAにおけるストレプトマイシン遺伝子から切り出すことができる。時折、それはゲノム内のどこかに再挿入されてネイティブ遺伝子を破壊するであろう。Ｆ２植物を、ヒグロマイシン及びストレプトマイシン耐性実生を選択することにより、切り出し、再挿入した、即ち転置されたDsを含む実生について選択した。これらの植物を自殖してそのＦ３植物を突然変異についてスクリーニングした。これは、Ds及びAc を含む植物の分離する集団である。Dsを遺伝子内に挿入したなら、その子孫は突然変異表現型でも分離するであろう。 Ihy突然変異体を、後期開花植物としてＦ３世代において同定した。lhy 突然変異表現型の記載 lhy突然変異体を長日下で成長させた時、それらは野生型より遅く開花する。開花の遅延と同様に、lhy突然変異体は、他の多面発現性効果を示し；それらの成長速度は野生型と比べて低く、lhy実生は全体が黄化した外観を有し、そして３日間、暗所で成長させた場合、（エチレン過剰発現変異体、例えばetol van d er Straetenら、1993に似た）肥大した先端フック(apical hook)を有する。長日下で成長させた時、lhy変異体は、表１に示すように、より生長力のある葉を伴って、野生型より遅く開花する。これは、ホモ接合植物と正確に同じ葉の数及び同じ時期に開花するヘテロ接合植物で、完全に優性の効果である。短日条件下において、lhyは野生型より少し早く開花し、それは他の昼中立開花時期変異体、例えばCo（Koorneefら、1991）のそれに似た応答を形成する。しかしながら、lhyは、長日及び短日の両方の下で野生型より遅い速度で葉を作り出すので、開花する日数に関して、lhy変異体は長日下で野生型よりかなり遅く開花し、短日下で野生型と同様に開花する（表１）。lhy変異体を連続光下で成長させた場合、それは野生型より遅く開花した。 lhy及び野生型を４℃で８週間、春化処理し、次に長日条件に移してlhyの開花時期が野生型のそれにもどるか否かを決定した。lhyは平均9.96の葉を有して開花し、このことは、開花は春化処理していない植物より早くおこるが、その変異体の効果は春化処理により動かされないことを示す（野生型植物は平均6.52の葉を伴って開花する）。 lhy変異体及び野生型の葉の発達の速度を長日及び短日の長さ下で測定した。葉の計数を毎３日間に行い、長さ３mmを超える葉の数を記録した。野生型植物の葉の発達の速度は長日及び短日下で一定であったが、lhy変異体のそれは両方の条件下で野生型よりかなりおそかった（表２）。しかしながら、植物を連続光下で成長させた時、lhy変異体における葉の発達の速度は野生型のそれまで増加した。異なる光条件において土壌上で成長したlhy及びwt植物の胚軸長を、植物が２〜４の葉の段階にある時に測定した。これらを、最小MS培地上で暗所で成長させた植物と比較した（図２）、野生型において、植物を光に露出した場合に、胚軸の長さは顕著に減少した。lhyでは、暗所条件下で、胚軸は野生型ほど伸長しないが、lhyを短日下で成長させた場合、それは野生型と比べて伸長した胚軸を有する。この伸長は、実生が受ける光の量に依存するようである。なぜなら連続光下で、その変異体の胚軸長は野生型のそれと同様だからである。 lhy変異体は、内因性の概日時計により制御される過程の欠損のある制御を示す。アラビドプシスにおいて、周期的な葉の活動及びAB２又はCCR2遺伝子の周期的な発現は、しばしば概日時計の機能をモニターするのに用いられる。我々は、 lhy変異体において、葉の活動並びにCAB2及びCCR2遺伝子の発現は規則的でなく、このことはlhy変異体において、概日時計の機能化が破壊されていることを示唆する。長日下でのlhy変異体の遅い開花は、時計機能の破壊の結果でもあり得る。 lhy 遺伝子のクローニング lhy遺伝子を単離するために、Dsに隣接したDNAのフラグメントを、Inverse PCR(IPCR)を用いて得た。Dsの末端における配列に特異的であるプライマーを、PCRによりフラグメントを増幅するのに用いた。Ds配列及び隣接するゲノム配列の小さな領域を含むDNAの断片を単離した。次に、正確なフラグメントが増幅されたことをチェックするために、PCR産物とアニーリングすると予想される第２のセットのプライマーで２回目のPCRを行った。700bp長であると予想されるフラグメントを、変異ゲノムDNAを消化するためのBstY1並びに最初の増幅のためのプライマーD74及びＢ34を用いて、Dsに対して５’側を単離した。プライマーＦ４及びＤ73を２回目のために用いた。200bp長のフラグメントを、Sau 3AでゲノムDNAを消化し、最初のPCRのためにプライマーＢ39及びＢ38並びに次に２回目のためにプライマーＤ71及びＤ24を用いることによりDsに対して３’側を単離した。次にIPCRフラグメントを図３に見られるように配列決定し、それは予測されるDs配列を含むことが示された。 Ds の近傍でのDNAのより大きなフラグメントの単離野生型ゲノムDNAから作られたラムダファージgtライブラリーを、Dsの５’のI PCRフラグメントを用いてプロービングした。Dsの５’フラグメントに強くハイブリダイズする11kbの挿入物を含むラムダクローンを単離した。しかしながら、 Dsの３’のIPCRフラグメントをプローブとして用いた時、ハイブリダイゼーションはおこらなかった。このこと、並びに変異及び野生型DNAのサザン分析から、D sに隣接して７〜８kbの欠失がおこっていると結論づけられた。この欠失を貫くゲノムクローンを、野生型DNAのコスミドライブラリーから単離し、その欠失を貫く領域を制限酵素でマッピングした（図４）。 Ds 周囲の領域における遺伝子の同定３つのcDNAを、Ds及び欠失の領域とハイブリダイズするものとして同定した。その変異体において、それらの１つをコードするDNAは全体的に削除されており、第２のものの３’端は欠失されて、そして第３の５’端の小さな領域は欠失されていた。第３のcDNAはLHY遺伝子のための最も確からしい候補であると結論づけた。なぜなら、その変異体においてその小さな領域のみが欠失されており、Ds要素は、トランスポゾン内のCaMV35Sプロモーターがその遺伝子を転写することができるような方向でその遺伝子の５’端に位置していたからである。遺伝子が表現型の原因であるかを同定するために、３つの構成物を野生型植物に、１つをlhy変異体に導入してその候補遺伝子のいずれかlhy変異の原因であるかを決定することにより行った。構成物Ａは、その欠失を貫く野生型植物からの DNAを含み、コスミドライブラリーから得られた。他の３つの構成物は、lhy変異体からのDNAから得た。構成物ＢはDs及び挿入物の５’領域を含み、構成物ＣはD s及び挿入物の３’領域を含み、そして構成物ＤはDs及びその因子の両側の領域を貫いていた（図５を参照のこと）。構成物Ｂ及びＤを野生型植物に導入した場合、lhy変異体表現型が再び形成された。実施例２を参照のこと。遺伝子構造形質転換の結果は隣接するDs要素と一緒のDsの５’の約４kbのゲノム領域がlh y 変異表現型を引きおこすのに十分であることを示した。これは、Dsの５’フラグメントにハイブリダイズしたこの領域によりコードされたcDNAがlhy遺伝子をコードすることを示した。また、その変異が優性であるので、それは、lhy遺伝子が、Dsの５’端に位置したCaMV35Sプロモーターからその変異体内で過剰発現され得ることを示した。候補cDNAを配列決定し、予測される645アミノ酸タンパク質を同定した（図１）。その予想されるLHYタンパク質を、fasta相同性サーチによりSwissprotデータベースにおいて周知のタンパク質配列と比較した時、その最初の80アミノ酸は、最初のαヘリックスの領域周囲のTEC1及びTEF1のTEAドメインの第１のαヘリックスとの相同性並びにいくつかのmyb DNA結合タンパク質との弱い相同性を示した（図６）。イーストmybタンパク質YCS3（受託番号P25357）は、LHYにおけるmy bドメインと14／41の同一性及び24／41の類似性を示し、BAS1中の第１のmybドメイン（受託番号P22035）は、LHY中のmybドメインと12／38の同一性及び21／38の類似性を示した。伝統的なmybドメインは、３つのmyb反復からなり、ここで各々のmyb反復は、均等に配置されたトリプトファン残基により規定される３つのαヘリックスを含む。最初のヘリックスはタンパク質−タンパク質相互作用に関連すると考えられ、第２及び第３のヘリックスはヘリックス−ターン−ヘリックスDNA結合モチーフを示す。全てのmybタンパク質がこの伝統的な構造を有するわけではなく、いくつかが１又は２のmyb反復を有するだけである。また、第３のαヘリックス中の３番目のトリプトファンはいつも保存されているとはかぎらない。アミノ酸レベルにおいて、mybドメインはそれほど保存されておらず、それは重要である配列の全体の性質であり（Framptonら、1989）、それらは正確に配置された疎水性アミノ酸及び３つのαヘリックスを有するはずである。予測されるLHYタンパク質は（Framptonら、1989からの）図７に見ることができるように正確な配置で最初の２つのトリプトファン残基を有する単一のmyb反復（アミノ酸残基18〜78）を含むだけで３番目のトリプトファンは欠如している。この予測されるmybドメイン内のアミノ酸配列を、EMB-Heidelbergウェブサイトにおいてインターネットで利用できる構造予測パッケージ（タンパク質予測）で分析した。これらの60アミノ酸について、３つのαヘリックスの最も高い予測があり（図８）、このことは、LHY中の１つのmybドメインの存在を示唆する。my bドメインの存在は、LHYがDNAへの結合により機能し、それゆえ他の遺伝子の発現を調節し得ることを示唆する。データベースにおける他の配列に対するlhyの比較 LHY遺伝子によりコードされる予測されるタンパク質を、Wisconsinソフトウェアーパッケージ上で利用できるTfastaソフトウェアーを用いてGen-bank Express ed Sequence Tags(EST)データベースにおいて他の配列と比較した。このプログラムはデータベース内の全ての配列を（全部で６つのオープンリーディングフレームを用いて）可能性あるタンパク質に翻訳し、それらを問題の配列と比較する。１つのESTはLHY転写物の３’端と100％の相同性を示した（ESTクローン162I3T 7、受託番号R30439）。これはおそらく、LHY遺伝子のトランスケートされたcDNA である。その配列を図11に示す。それは447bpだけである。２番目のものは、lhy における予測されるmyb DNA結合領域（EST157C23T7、受託番号T88489）と大きな相同性（54％同一性、93％類似性）を示した。この２番目のESTの完全な配列はまだ解明されていないので、遺伝子の他の部分におけるLHYと相同性を有するか否かは未知である。 LHYは、コメESTとの相同性も示した（34％同一性、93％相同性）。EST OSS154 42A(受託番号D48887)は、遺伝子の３’端と大きな相同性である２つの領域を示し、このことはそれがトランケートされたcDNAであり得ることを示す（図９Ｂ）。 lhy 遺伝子の発現 lhy及び野生型植物からのRNAをニトロセルロース上にブロットし、LHY遺伝子プロービングした。lhyにおける転写物のレベルは、野生型よりかなり高いレベルであった。この発現が遺伝子とCaMV35Sプロモーターとの間の遺伝子融合によるものであるか否かをテストするため、Dsの５’端及びLHY転写物に特異的なプライマーを用いてlhyからのRNAのサンプルでRT-PCR を行った。cDNA配列に相当するDNAのフラグメントを作った。これは、プローブとしてLHY遺伝子を用いてサザン分析により確認した。ネイティブLHY発現 lhy変異体は、光周期不感受性表現型を示し、それゆえ光周期によりLHY発現が制御される可能性がある。RNAを、長日（16時間の光）及び短日（10時間の光）下で成長させた植物から抽出し、24時間の光期間の始めから毎２時間に収集し、次にその植物を更に48時間、全体が暗い所においた。この分析は、LHY転写が概日周期で制御され、光をあびて次にゆっくりと減少する時に、夜においてピークまで増加するようであることを示した。この周期は、光の欠如下でも続き、このことはその遺伝子が概日周期制御されることを示す。転写レベルを長日及び短日で成長した植物について比較し、長日下より短日条件下で、より高くより長い間続くことが見い出された。しかしながら、野生型における転写レベルは決してlhyのそれのレベルに達しなかった。そのことは、lhy における開花の遅れがより高いLHYの発現のためであるかより長い期間存在する転写物を有するためであるかをテストするべきことを残した。 LHYが発達上で発現される時期を決定するために、LD条件下でMS最小培地にまき、８日間、１日１回、光をあてた後２時間に収集した。種子を発芽させて２日後に転写物を検出することができたことは、それは実生発達において初期に最初に発現されることを示す。種子の３つのバッチを２週間、全て暗所においても発芽させ、そして１つ目は直ちに収集し、２つ目は２時間の光の後に、そして３つ目は長日サイクルの24時間の後に収集した。最初の２つのサンプルにおいては転写物は検出されず、３番目のサンプルにおいてかなりの発現が検出されたことは、光の存在が転写をオンにスイッチするのに必要とされることを示す。ゲノム内のLHYの位置 LHYの位置を、CAPSマーカー(Konieczny及びAusubel，1993)PVV4及びNCC1がその変異に遺伝的に関連していることを示すことにより証明した。LHYはマーカーP VV4から1.8cMにマッピングされた。以前にこの位置にマッピングされた開花に影響を与える変異はなかった。方法成長条件及び開花時期の測定開花時期を、20℃においてSanyo Gallenkamp Controlled Environment室内で植物を生長させることにより所定条件下で測定した。短日は、100ワットのタングステンハロゲンランプを補充した400ワットのハロゲン化金属パワースターランプで10時間の光の光期間を含む。これは、113.7μモル光子ｍ^-2ｓ^-1の光合成活性放射(PAR)のレベル及び2.41の赤：赤外光比を供した。長日についても同様のキャビネット及びランプを用いた。その光期間は短日に用いたのと同じ条件下で10時間、及びハロゲン化タングステンランプのみを用いて更に８時間、伸ばした。このキャビネットにおいて、10時間の期間のために用いたランプの組合せは、92.9μモル光子ｍ^-2ｓ^-1のPAR及び1.49の赤：赤外比を供した。８時間の延長は、14.27μモルｍ^-2ｓ^-1のPAR及び0.66の赤：赤外比を作り出した。植物の大集団の開花時期を温室において測定した。要約するに、植物を単に太陽光の下で成長させた。冬には、最小の光周期が16時間となるように補充の光を供した。開花時期を測定するために、休眠状態を破るために種子を４日間、湿ったろ紙の上におき、次に土にまいた。発芽中の種子を、通常、脱水を防ぐために最初の１〜２週間、クリングフィルム又は繁殖物リド（lids）で覆った。開花時期は、花芽が見えた時に、ロゼット内の子葉を除く葉の数を数えることにより測定した。葉の数は、95％の信頼範囲の標準誤差で示される。まいてから花芽が出現するまでの日数も記録したがここでは示さない。植物材料用いた標準の野生型遺伝子型はアラビドプシスタリアナ（Arabid opsis thali ana ）Landsberg erectaであった。植物ゲノムDNAの単離植物ゲノムDNAを、組織を液体窒素中で粉砕し、RNaseステップを省いた他は、本質的にTai及びTanksleyにより記載されるように、温室で成長させた植物から単離した。大規模(2.5〜５ｇの葉)及びミニプレップ（３〜４の葉）DNAをこの方法を用いて調製した。ゲルブロッティング及びハイブリダイゼーション条件ゲルをHybond-Nに移し、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、DNAをUV St ratalinker処理（1200μＪ×100；Strategene）によりフィルターに固化し、及び／又は80℃で２時間、ベーキングしたことを除いて製造元の説明に従った。放射能標識したDNAを、ランダムヘキサマーラベリングにより調製した。逆ポリメラーゼ鎖反応（IPCR） Dsに隣接したDNAを単離するためにIPCRを用いた。lhy変異体からのDNAを５’ 端について制限酵素BstY1及び３’端についてSau3Aを用いて開裂して、次にLong ら（1993）に記載されるように処理した。Dsの５’端においてDNAを増幅するのに用いるプライマーは、Wilsonら（1996）に記載されるものであった（１回目についてＤ74及びＢ34並びに２回目についてＥ４及びＤ73）。３’端について、プライマーＢ38(５’-GA TATACCGGTAACGAAAACGAACGG)及びB39(５’-TTCGTTTCCGTCCCGCAAGTTAAATA)を１回目に用い、そしてプライマーD71（５’-CGTTACCGACCGTTTTTCATCCCTA）及びD75( ５’-ACGAACGGGATAAATACGGTAATC)を２回目に用いた。 RNA 抽出 Stiekmaら（1988）により記載される方法の改良型である方法を用いてRNAを抽出した。液体窒素中で凍結させた組織物５ｇをコーヒー粉砕機で粉砕し、15mlのフェノール及び15mlの抽出緩衝液（50mM Tris pH8，1mM EDTA，1％SDS）の混合物で抽出した。その混合物を振とし、遠心し、そして25mlの水性層を回収した。次にこれを、0.7mlの４Ｍ塩化ナトリウム、10mlのフェノール及び10mlのクロロホルムの混合物と共に激しく振とうした。遠心後にその水性層を回収し、25mlのクロロホルムで抽出した。次にそのRNAを２mlの10Ｍ LiClを加えることによりその水性層25mlから沈殿させ、その沈殿を遠心により回収した。そのペレットを２mlのDEPC水に溶かし、そしてそのRNAを0.2mlの４Ｍ塩化ナトリウム及び４mlのエタノールを加えることにより沈殿させた。遠心後、そのペレットを0.5mlのDEP C水に溶かし、そのRNA濃度を決定した。DNA 抽出アラビドプシスRNAは、Deanら（1992）により記載されるCTAB抽出液により行った。 RT-PCR によるcDNAの単離全RNAを、温室中で長日下で成長する２〜３の葉の段階における完全な実生から単離した。最初の鎖cDNA合成のために、１０μｌの容量中10μｇのRNAを３分間、65℃に熱し、そして次に氷上で迅速に冷やした。１μｌのRNAsin、１μｌの標準dT₁₇-アダプタープライマー（１μｇ／μｌ：Frohmanら、1988）、４μｌの５×逆転写酵素緩衝液(250mM Tris HCl p H8.3，375mM KCl，15mM MgCl₂)、２μｌのDTT（100mM）、１μｌのdNTP（20mM）、１μｌの逆転写酵素(200ユニット、M-MCV Gibco)を含む10μｌの反応混合物を作った。次にこの反応混合物をRNAに加えて最終容量20μｌにした。その混合物を２時間、42℃でインキュベートし、次に水で200mlに希釈した。その希釈した第１の鎖合成反応物10μｌを、４μｌの2.5mM dNTP，10μｌの10 ×PCR緩衝液（Boehringer plus Mg）、プライマーの１μｌの100ng／μｌ溶液、 73.7μｌの水及び0.3μｌの５ユニット／μｌ Taqポリメラーゼ（Boehringer又はCetus Amplitaq）を含むPCR混合物90μｌに加えた。プライマーは、D73(５’- GTTAGTTTTATCCCGATCGATTTCGA)及びCaRIC7F（5’-ACCGCTTTGATTGAGAAGCTG）を用いた。１分間94℃で、次に１分間55℃及び２分間72℃の34サイクル、そして最後に10分間、72℃で反応を行った。その反応物20μｌをアガロースゲルを通して分離し、そして予想される大きさのフラグメントの存在を、臭化エチジウムで染色した後に証明した。そのDNAをフィルターに移し、そして関心のフラグメントはLHY遺伝子由来の短いDNAフラグメントとハイブリダイズすることが示された。 DNA 配列決定 Bluescriptプラスミドベクター内に挿入された関心のフラグメントを配列決定するのにSanger法を用いた。Sequenseキット(United States Biochemical Corpo ration)を用いて反応を行った。ファージ及びコスミドライブラリーのスクリーニングコスミドライブラリー(Olszewski及びAusubel，1988)のライゼートを、大腸菌DH5αに感染させるのに用い、そして２万のコロニーを、本明細書に記載されるプローブでスクリーニングした。COcDNAを同定するために３つの cDNAライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングされたプラークの数は、“空気の部分（aerial parts”ライブラリー（EC Arabidopsis Stock Center ，MPI，Cologhne）から５×10⁵、滅菌ビーカー内で成長させた植物から作られたライブラリー(EC Arabidopsis Stock Center)で３×10⁵プラーク、及びCD4-71-P RL2ライブラリー（Arabidopsis Biological Resource Center(Ohio State Unive rsity)）で１×10⁶プラークであった。アラビドプシスの形質転換 LHYの近傍からのDNAを含むコスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1に移し、そしてそのT-DNAを、Valvenken sら（1988）により記載されるようにアラビドプシス植物に導入した。試験管内で成長させた植物の根を単離し、カルス誘導培地（Valvekensら、1988）上で２日間、成長させた。次にその根を短いセグメントに切断し、そして関心のプラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスと同時培養した。根の外植体をブロッティング紙上で乾燥させ、２〜３日間、カルス誘導培地上においた。そのアグロバクテリウムを洗い落とし、その根を乾燥させて、アグロバクテリウムを殺すためのバンコマイシン及び形質転換された植物細胞について選択するためのカナマイシンを含む苗条誘導培地においた。約６週間後に、根上のカルスは苗条を作りはじめる。これらを取り除いて、発芽培地（Valvekensら、1988）を含むペトリ皿又はマジェンタポットにおく。これらの植物は、マジェンタポット内で種子を作る。次にこれらをトランスジーンを含む形質転換された実生を同定するためにカナマイシンを含む発芽培地にまく（Valvekensら、1988）。実施例２ CaMV35Sプロモーターに融合したLHY遺伝子の複製を導入することによる野生型植物の開花の遅れ実施例１に記載されるように、野生型植物への構成物Ｂ又はＤ（図５）の導入は、lhy変異表現型を引きおこすのに十分であった。これは、LHY遺伝子を同定するのに用いた。なぜなら、それは、その遺伝子が２つのコスミド間のオーバーラップの領域に位置しなければならないことを示したからである。配列及び転写物分析は、LHYがこの間隔に位置した唯一の遺伝子であること、及びそれは変異体内で過剰発現されたことを示した。LHY遺伝子へのCaMV35Sプロモーターの融合物の、野生型植物への導入は、それゆえ、開花を遅らせるのに十分であり、この融合は、野生型遺伝子の２つの複製の存在下でさえ変異表現型を引きおこす。 lhy変異は、植物の成長及び発達への他の効果を有し、開花時期を遅らせる。例えば、それはクロロフィル成分を減少させ、胚軸を伸長させる。LHYの過剰発現をドライブするためのCaMV35Sプロモーター以外のプロモーター、又はLHYmAY の過剰発現の時期の制御の使用は、他の多面発現効果からの開花の抑制の分離を許容する。例えば、meriら（Medfordら、1991）又は苗条分裂組織のない(Shootm eristemless)（Longら、1996）プロモーターは、苗条分裂組織における特異的な LHY発現を誘発するのに用いることができる。LHYが転写因子をコードすると仮定すると、LHY遺伝子とステロイド結合部位、例えばラットグルココルチユイドレセプターのもの（Lloydら、1994）との間のタンパク質融合、及びその融合物のC aMV35Sプロモーターからの発現は、LHY活性を制御するであろう。これは、発達の特定の時期において活性化されるべき遺伝子の過剰発現を許容し、それにより、発達中で開花の抑制が始まるのが遅れるであろう。これは、例えば、胚軸伸長への変異の効果なしに開花を遅らせることを可能にする。プロモーター及びLHY遺伝子の非翻訳リーダーのゲノム配列を図10に示す。 LHYオープン読み枠のATG開始コドン（塩基1740〜1742）を下線で示す。得られた最も長いLHY cDNAは位置1079において始まり（ボールド及び下線）；最初の10 79塩基はおそらくプロモーター配列をコードし、1079からATG開始コドンまでのものは翻訳されないリーダーをコードすることを示す。位置1225〜1370のイタリックで示される領域は、ゲノム配列内に存在するがcDNAではなく、翻訳されないリーダー配列内のイントロンを示す。プロモーター及び非翻訳リーダーを、LHY遺伝子のより大きいフラグメントを有するプラスミドからの領域を増幅するためにPCRを用いることによりクローン化した。増幅の間の誤差率を減少させるために、プルーフリーディングポリメラーゼを用いた。用いたプライマーは、図10に示す配列内の塩基５〜30からのプロモーター領域の５’端においてアニーリングするLP1(CATCAACGTAGGGATCCGTGAAAT AT)であった。下線の塩基(16-21)は、次に増幅されたフラグメントをクローン化するのに用いられるBamHＩ部位を示し、二重下線の塩基は、BamHＩ部位を導入するためにLP1プライマー内に導入された誤差であった。用いた第２のプライマーは、ATGのすぐ上流とアニーリングしてSpeＩ部位を導入するLP2（GGACTAGTAACAG GACCGGTTGCAGCTATTC）であった。予想される大きさのフラグメントをこれらのプライマーで増幅し、SpeＩ及びBamHＩで開裂したBluescriptベクターに挿入した。次にそのクローン化したフラグメントのDNA配列を決定し、予想通りであることを見い出した。そのプロモーターは、LHY遺伝子により示されるものと同様の概日制御様式で発現を誘発するのに用いることができる。例えば、それは、ホタルルシフェラーゼの発現を誘発するのに用いることができる。以前にAndersonら（1994）並びに Anderson及びKey(1995)により記載されたベクターVIP11ome FFLucをこのために用いることができる。そのベクターは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にBamHＩ及びHindIII部位を含む。上述のLHYプロモーターフラグメントを有するBluescribt プラスミドをSpeＩで開裂し、Klenowポリメラーゼで部分的にフィル・インして、それを部分的にフィル・インされたHindIII部位と適合させた。次にそのプラスミドをBamHＩで開裂した。そのベクターをHindIIIで開裂し、部分的にフィル・インして、そしてBamHＩで開裂した。これは、それがルシフェラーゼ発現を誘導するようにベクター内にLHYプロモーターフラグメントを挿入することを可能にする。この構成物をアグロバクテリウムに導入し、そしてこれらのバクテリアを、カナマイシン耐性の選択によりアラビドプシスにT-DNAを導入するのに用いた。トランスジェニック植物において、ルシフェラーゼの発現は、アラビドプシスのCAB2遺伝子のプロモーターについて以前に示されているように、概日周期制御遺伝子発現を誘発するプロモーターフラグメントを示すのに用いることができる（Millarら、1992）。そのプロモーターは、この方法において他の遺伝子産物をドライブするのに用いることができる。これは、関心の遺伝子産物が夜明けあたりに発現されるのを可能にする。これは、それが一定に発現される時に、植物成長及び発達がその遺伝子により破壊される場合に有利である。それは例えば、光又は暗所への長い露出は細胞に有害だからである。それは、その遺伝子産物が、概日サイクルの間に同時に存在する遺伝子産物と相互作用し、そしてそのサイクルの間の異なる時期に存在するものとは相互作用しないことも可能にする。表 lhy変異体及び野生型植物の開花時期及び成長率。開花時期は、開花時の葉の数として示され、これは２回の独立の実験において測定した。実験２を記述する表は、その変異が優性であることを示し；lhy変異についてヘテロ接合の植物はその変異についてホモ接合のものと同じ時期に開花することを示す。成長率は、各々の日に形成された葉の数として示し、短日下で成長した野生型植物についてのものよりlhyについてかなりゆっくりである。表１．長日及び短日下でのlhy変異体の開花時期Ａ．長日及び短日下でlhy変異体により形成されたロゼット及び茎性の葉の数Ｂ．lhy変異体の開花時期表２．lhy 及び野生型の葉の形成の速度

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年７月２０日（１９９８．７．２０）【補正内容】請求の範囲 17．前記作用可能に連結されたヌクレオチド配列が、関心の遺伝子の発現のアンチセンス制御のための、該遺伝子のコーディング又は非コーディング配列と相補的であることを特徴とする請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド。 18．先の請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞の形質転換のために適した核酸ベクター。 19．前記宿主細胞が微生物細胞であることを特徴とする請求項18に記載の核酸ベクター。 20．前記宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項18に記載の核酸ベクター。 21．先の請求項のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチド又は核酸ベクターを含む宿主細胞。 22．微生物である請求項21に記載の細胞。 23．植物細胞である請求項21に記載の細胞。 24．ゲノム内に組み込まれた前記異種ポリヌクレオチドを有する請求項23に記載の細胞。 25．半数体ゲノム当り１を超える前記ポリヌクレオチドを有する請求項24に記載の細胞。 26．植物内に含まれる請求項23〜25のいずれかに記載の細胞。 27．請求項23〜25のいずれかに記載の細胞を含む植物。 28．請求項23〜25のいずれかに記載の細胞を含む、請求項27に記載の植物の有性もしくは無性的に繁殖された子孫、クローンもしくは後代である植物、又は該植物、子孫、クローンもしくは後代のいずれか一部もしくは零余子。 29．請求項23〜25のいずれかに記載の細胞を含む、請求項28に記載の植物の一部又は零余子。 30．本当に育種されない請求項27に記載の植物。 31．植物を生産する方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチドを植物細胞内に組み込み、そして該植物細胞から植物を再生することを含む方法。 32．植物を生産する方法であって、請求項10〜12のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチドを植物細胞内に組み込み、そして該植物細胞から植物を再生することを含む方法。 33．植物を生産する方法であって、請求項13〜17のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチドを植物細胞内に組み込み、そして該植物細胞から植物を再生することを含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者シャッファー，ロバートジェームズイギリス国，ノーウィッチエヌアール４７ユーエイチ，コルニーレーン，ノーウィッチリサーチパーク，ジョンイネスセンター

Claims

【特許請求の範囲】 1. 図１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。 2. 前記コーディング配列が図１に示されるコーディング配列であることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。 3. 前記コーディング配列が、１又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は挿入による、図１に示されるコーディング配列の突然変異体、対立遺伝子、変異体又は誘導体であることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。 4. トランスジェニック植物における発現に基づいて該植物の開花特性に影響を与える単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、図１に示されるアラビドプシス・タリアナLHY配列の突然変異体、対立遺伝子、変異体もしくは誘導体であるか、又は他の種の相同体もしくはその突然変異体、対立遺伝子、変異体もしくは誘導体であるアミノ酸を含むポリペプチドをコードし、該アミノ酸の配列が、１又は複数のアミノ酸の付加、置換、欠失及び／又は挿入により図１に示される配列と異なり、そして図１の配列と60％の相同性を有することを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。 5. 前記開花特性が、開花の時期であることを特徴とする請求項４に記載のポリヌクレオチド。 6. 前記突然変異体、対立遺伝子、変異体又は誘導体が、植物において開花を進展させる能力を有することを特徴とする請求項５に記載のポリヌクレオチド。 7. 前記突然変異体、対立遺伝子、変異体又は誘導体が、植物において開花を遅らせる能力を有することを特徴とする請求項５に記載のポリヌクレオチド。 8. 単一のmybドメインを含み、トランスジェニック植物における発現に基づいて開花時期に影響を与えるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。 9. 発現のための調節配列に作用可能に連結された先の請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。 10．請求項１〜８のいずれかに記載の配列の少くとも約300ヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド。 11．前記コーディング配列と相補的な前記ヌクレオチド配列の転写のための調節配列に作用可能に連結された請求項10に記載のポリヌクレオチド。 12．前記調節配列が、誘導可能なプロモーターを含むことを特徴とする請求項 11に記載のポリヌクレオチド。 13．植物内のヌクレオチド配列に作用可能に連結された時に、概日周期の制御下で、前記作用可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を調節するプロモーターをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該プロモーターが、図10 に示されるプロモーター配列又はそのフラグメントを含むことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。 14．植物内のヌクレオチド配列に作用可能に連結された時に、概日周期の制御下で、前記作用可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を調節するプロモーターをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該プロモーターが、図10 に示されるアラビドプシス・タリアナLHYプロモーター配列の突然変異体、対立遺伝子、変異体もしくは誘導体であるか、又は他の種の相同体もしくはその突然変異体、対立遺伝子、変異体もしくは誘導体であるヌクレオチド配列を含み、該プロモーターのヌクレオチド配列が、１又は複数のヌクレオチドの付加、置換、欠失及び／又は挿入により図10に示される配列と異なり、そして図 10の配列及びそのヌクレオチド1059から上流以内の約500ヌクレオチドの配列と6 0％の相同性を有することを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。 15．前記プロモーターが、その転写のためのヌクレオチド配列に作用可能に連結されることを特徴とする請求項13又は14に記載の単離されたポリヌクレオチド。 16．前記作用可能に連結されたヌクレオチドの配列が、ペプチド又はポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項15記載の単離されたポリヌクレオチド。 17．前記作用可能に連結されたヌクレオチド配列が、関心の遺伝子の発現のアンチセンス制御のための、該遺伝子のコーディング又は非コーディング配列と相補的であることを特徴とする請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチド。 18．先の請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞の形質転換のために適した核酸ベクター。 19．前記宿主細胞が微生物細胞であることを特徴とする請求項18に記載の核酸ベクター。 20．前記宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項18に記載の核酸ベクター。 21．先の請求項のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチド又は核酸ベクターを含む宿主細胞。 22．微生物である請求項21に記載の細胞。 23．植物細胞である請求項22に記載の細胞。 24．ゲノム内に組み込まれた前記異種ポリヌクレオチドを有する請求項23に記載の細胞。 25．半数体ゲノム当り１を超える前記ポリヌクレオチドを有する請求項24に記載の細胞。 26．植物内に含まれる請求項23〜25のいずれかに記載の細胞。 27．請求項23〜25のいずれかに記載の細胞を含む植物。 28．請求項27に記載の植物の有性もしくは無性的に繁殖された子孫、クローンもしくは後代である植物、又は該植物、子孫、クローンもしくは後代のいずれか一部もしくは零余子。 29．請求項28に記載の植物の一部又は零余子。 30．本当に育種されない請求項27に記載の植物。 31．植物を生産する方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチドを植物細胞内に組み込み、そして該植物細胞から植物を再生することを含む方法。 32．植物を生産する方法であって、請求項10〜12のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチドを植物細胞内に組み込み、そして該植物細胞から植物を再生することを含む方法。 33．植物を生産する方法であって、請求項13〜17のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチドを植物細胞内に組み込み、そして該植物細胞から植物を再生することを含む方法。 34．前記植物の子孫又は後代を、有性もしくは無性的に繁殖させ、又は成長させることを含む請求項31〜33のいずれかに記載の方法。 35．植物の開花特性に影響を与える方法であって、植物の細胞内で、請求項１〜９のいずれかに記載の異種ポリヌクレオチドによりコードされる産物の発現を引きおこし、又は許容することを含むことを特徴とする方法。 36．植物の開花特性に影響を与える方法であって、植物の細胞内で、請求項10 〜12のいずれかに記載のポリヌクレオチドからの発現を引きおこし、又は許容することを含むことを特徴とする方法。 37．植物の開花特性に影響を与える方法であって、植物の細胞内で、請求項13 〜17のいずれかに記載のポリヌクレオチドからの発現を引きおこし、又は許容することを含むことを特徴とする方法。 38．植物の開花特性に影響を与えるための請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。 39．植物の開花特性に影響を与えるための請求項10〜12のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。 40．請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドをコードする遺伝子の発現の下降制御のための請求項10〜12のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。 41．植物内で作用可能に連結された配列の転写を制御するための請求項13又は 14に記載のポリヌクレオチドの使用。 42．トランスジェニック植物の生産における請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。 43．トランスジェニック植物の生産における請求項10〜12のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。 44．トランスジェニック植物の生産における請求項13〜17のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。