JP2000512979A

JP2000512979A - 自己デコンボリューション法によるコンビナトリアルライブラリー

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Publication number: JP2000512979A
Application number: JP09539622A
Authority: JP
Inventors: マーティンクウィーベル; トニージョンソン; テランスハート
Original assignee: ペプチドセラピュティックスリミテッド
Priority date: 1996-04-24
Filing date: 1997-04-24
Publication date: 2000-10-03
Also published as: US6528275B1; EP0906334A1; EP0906333A2; DE69705838D1; JP2001501170A; CA2252408A1; WO1997040065A3; ATE203545T1; AU2644997A; WO1997042216A1; DE69705838T2; CA2252508A1; AU706855B2; US20030092067A1; ES2162277T3; WO1997040065A2; AU2645097A; JP4215822B2; DK0906333T3; EP0906333B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規活性化合物の発明を促進するような、自己デコンボリューション法によるコンビナトリーライブラリーを用いて、構造／活性相関の迅速な形成を提供する装置及び方法の分野に関する。本発明は、構造／活性相関(SAR)データの迅速な作成、及びその結果いずれかの化合物群の活性モチーフの特徴付けのために使用することができる、装置及び方法を提供する。本発明は、活性部位と相互作用する化合物のライブラリー、及びこのような化合物を同定するための装置及び方法を提供する。これらの活性部位は、酵素、レセプター、抗体などである(しかしこれらに限定されるものではない)。これらの活性部位と該ライブラリー化合物との相互作用は、基質又は阻害剤の酵素との相互作用、リガンドとレセプターの相互作用、抗原又は抗原決定基と抗体との相互作用などである(しかしこれらに限定されるものではない)。

Description

【発明の詳細な説明】自己デコンボリューション法によるコンビナトリアルライブラリー本発明は、新規活性化合物の発明を促進するような、自己デコンボリューションコンビナトリーライブラリーを用いて、構造／活性相関の迅速な形成を提供する装置及び方法の分野に関する。本発明は、構造／活性相関(SAR)データの迅速な作成、及びその結果のいずれかの化合物群の活性モチーフの特徴付けに使用することができる、装置及び方法を提供する。本発明は、活性部位と相互作用する化合物のライブラリー、及びこのような化合物を同定するための装置及び方法を提供する。これらの活性部位は、酵素、レセプター、抗体などである(しかしこれらに限定されるものではない)。これらの活性部位と該ライブラリーの化合物との相互作用は、基質又は阻害剤と酵素との相互作用、リガンドとレセプターの相互作用、抗原又は抗原決定基と抗体との相互作用などである(しかしこれらに限定されるものではない)。下記のリストは、いくつかの酵素のクラス及びサブクラスを説明している：酵素クラス 1.酸化還元酵素 a)脱水素酵素 b)酸化酵素 c)ペルオキシダーゼ d)カタラーゼ 2.加水分解酵素 f)ペプチダーゼ（タンパク質分解酵素） 3.転移酵素 g)アミノトランスフェラーゼ h)キナーゼ i)グルコシルトランスフェラーゼ 4.脱離酵素 j)脱炭酸酵素 k)脱水酵素 5.異性化酵素 l)ラセミ化酵素 m)ムターゼ 6.リガーゼ n)シンテターゼ o)カルボキシラーゼ。興味深いプロテアーゼは、下記を含む(しかしこれらに限定されるものではない)： 1.アスパラチルプロテアーゼ、例えば、レニン、HIV、カテプシンＤ、及びカテプシンＥなど。 2.メタロプロテアーゼ、例えば、ECE、ゲラチナーゼＡ及びＢ、コラゲナーゼ、ストロメライシンなど。 3.システイニルプロテアーゼ、例えば、アポパイン(apopain)、ICI、DerPI、カテプシンＢ、カテプシンＫなど。 4.セリンプロテアーゼ、例えば、トロンビン、VIIa因子、Xa因子、エラスターゼ、トリプシン。 5.トレオニルプロテアーゼ、例えば、プロテアソームS。プロテアーゼ治療において有用な医薬品の多くが、酵素阻害剤として作用する。特に、タンパク質分解酵素阻害剤は、製薬業界において多くの注目を集めているが、その理由は、これらが多くの生物学的システムにおいて様々な役割を果たすからである。これらのタンパク質分解活性は、転移性癌に関連した細胞浸潤から、ある寄生生物において認められるような、免疫応答の回避まで；栄養補給から、ウイルスプロテアーゼ及び真核生物のホルモン−プロセシング酵素の部位特異的なタンパク質分解への細胞間シグナル伝達にまでに及ぶ過程に関連している。しかし、タンパク質分解酵素の阻害剤としてのリード分子を同定するための従来のランダムスクリーニング法は、煩雑で、時間がかかることが多い。従って、創薬過程を加速することができる新規かつ有効な方法が、一般に求められている。我々は、プロテアーゼは、認識ポケット(recognition pocket)¹（S₁及びS₂など）及び（S_1'及びS_2'など）がより良く占拠されるにつれて、より多く活性化され始める傾向を示す活性触媒部位を含むと考える。従って、新規プロテアーゼ阻害剤の設計には、これらのポケットに最も良く適合する阻害剤のこれらの部分(P₁ 及びP₂など)（P_1'及びP_2'など）が、できる限り迅速に同定されることが重要である。従って我々は、アスパラチルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びシステイニルプロテアーゼのような様々なタンパク質分解酵素の阻害剤の合成を大きく促進するであろうこれらの結合モチーフを、迅速に同定するためのコンビナトリアルな方法を、考案した。タンパク質分解酵素の特異性を分析するための蛍光共鳴エネルギートランスファー(FRET)基質の使用は、Carmel²によって最初に発表された。それ以降、酵素阻害測定用の多くの種々の消光された蛍光原基質が、論文に記載されている^4-11 。これらの基質は、Ｐ位置（前記参照）に発蛍光団Ｆを有し、これは、Ｐ_'位置（前記参照）に存在する別の基Ｑによって消光され、かつ分断できる(scissile) 結合によってＦから分離される。これらの残基Ｆ及びＱの位置決定の利点は、ペプチド結合の切断が、これら２個の天然の残基の間で生じ、その結果、C-末端の発色団の切断及び放出よりも、より自然に加水分解事象を示すことである。例えば、Bratovanova及びPetkov¹²は、ペプチド4-ニトロアニリドから蛍光原基質を合成した。ペプチド4-ニトロアニリドのアミノベンゾイル基(ABz)によるN -アシル化は、4-ニトロアニリド残基の存在によって内部消光される基質を生じる。アミノアシル-4-ニトロアニリド結合の加水分解時には、アミノ酸又はペプチドのいずれかに結合された高度に蛍光性のN-ABz基が放出される。基質がポリマー又は生体ポリマー支持担体に結合されているような、固定化されたライブラリーも、プロテアーゼ結合部位のマッピングに使用されている¹³。 Singhらは最近、制御された多孔質ガラスにリンカーを介して結合された38種の選択されたオクタペプチドの酵素基質活性が、溶液中の類似ペプチドの同じ活性の予測に役立つことを報告した。しかしこれらの結果は、特定の例に関する予備的かつ唯一のものである。従って、ポリマーに結合された固定化された基質が、妨害されたプロテアーゼ結合部位のマッピングにおいて、可溶性基質に確実に取って代わることができるかどうか、特に該ポリマーの疎水性又は親油性の性質並びに該ポリマー内の間隙の大きさのために、酵素及びその基質の間の反応に影響を及ぼすように結合できるかどうかは明確ではない。最近になって、消光基Ｑが2,4-ジニトロフェニル(Dnp)であり、かつ分断できる結合のＰ側に結合されている一方で、蛍光原基は、N-メチルアントラニル酸(N am)であり、かつＰ_'側に結合されているような、内部消光された蛍光原基質の混合物も、公表されている¹⁴。生物学的システムに適用されている他の供与体−受容体発色団対の例を、表１に示した。 ANAI、2-アントラセン-N-アセチルイミダゾール；BPE、B-フィコエリスリン(phy coerythrin)；CF、カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル；CPM、7- ドエチルアミノ-3-(4'マレイミジルフェニル)-4-メチルクマリン；CY5、カルボキシメチルインドシアニン-N-ヒドロキシスクシニミジルエステル；diI-C₁₈、1, 1'-ジオクタデシノレ-3,3,3',3'-テトラメチル-インドカルボシアニン；DiO-C₁₄ 、3,3'-ジテトラデシルオキサカルボシアニン；DABM、4-ジメチルアニニフェニルアゾ-フェニル-4'-マレイミド；DACW(7-(ジメチルアミノ)クマリン-4-イル)アセチル；DANZ、ダンシルアジリジン；DDPM，N-(4-ジメチルアミノ-3-5-ジニトロフェニル)マレイミド;DACM、ジ-メチルアミノ-4-マレイミドスチルベン；DMSM、 N-(2,5-ジメトキシスチベン-4-イル)-マレイミド;DNP、2,4-ジニトロフェニル； ε−A、1,N⁶-エテノアデノシン；EIA、5-(イオドアセテタミド)エオシン；EITC 、エオシン-5-イソチオシアネート；ENAI、エオシン-N-アセチルイミダゾール； EM、エオシンマレイミド；ErITC、エリスロシン-5'-イソチオシアネート；ETSC 、エオシンチオセミカルバジド；F₂DPB、1,5-ジフルオロ-2,4'-ジニトロベンゼン；F₂DPS、4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロフェニルスルホン；FITC、フルオレセイン-N-アセチルイミダゾール；FTS、フルオレセインチオセミカルバジド；IA ANS、2-((4'-イオドアセタミド)アニリノ)ナフタレン-6-スルホン酸；IAEDANS、 5- (2((イオドアセチル)アミノ)エチルアミノ)-ナフタレン-1-スルホン酸；IAF、5- イオドアセタミドフルオレセイン；IANBD、N-((2-(イオドアセトキシ)エチル-N- メチル)アミノ-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール；IPM、3(4-イソチオシアナトフェニル)-7-ジエチル-4-メチルクマリン；ISA、4-(イオドアセタミド) サリチル酸；LRH、リサミネルホ(lissaminerho)-2,1,3-ベンズオキサジアゾール -4-イル；NCP、N-シクロヘキシル-N'-(1-ピレニル)カルボジイミド；ODR、オクタデシルローダミン;PM、N-(1-ピレン)マレイミド;SRH、スルフローダミン；TMR 、テトラメチルローダミン；TNP、トリニトロフェニル；TR、テキサスレッド。引用：Wu,P.及びBrand,L.の1994年、Ana.Biochem.、218:1-13頁。可溶性ペプチドライブラリーの特異性が、決定されている^15,16。Bermanらは、HPLC上でのUVモニタリングを可能にするために、Dnp基でN-末端が標識された1 28個のペプチドの６種の混合物を合成するという、HPLC質量分析法を明らかにした¹⁶。この方法の欠点は、蛍光原基質が明らかではないので、各アッセイ混合物を、個々に分析しなければならないこと、及び各単独の成分の有効濃度が、全体の溶解度因子のために、該混合物の大きさによって制限されることである。 Drevinらは、ランタニドイオンをキレートする発色団を用いて酵素活性を測定するための、個別に合成された蛍光原基質の使用を示している¹⁷。Garmann及びP hillipsは、ペプチドが合成された後に、蛍光部位及び消光部位が、チオール又はアミノ官能基を介して結合されているFRET基質の使用を示したが、これは、これらがライブラリーの形状ではないこと、並びにこれらの官能性アミノ基及びチオール基が、ペプチドが合成された後に、選択的に顕現化されることが必要であるという欠点を有する。Wangらは、タンパク質分解酵素の基質を個々に合成するために、EDANS及びDABOYLの発蛍光物質(fluorescore)及び消光物質の対を使用することを示した。特異的プロテアーゼの周囲の活性部位をマッピングするためにFRET技術を使用する前述の方法は、以下の欠点を１種以上持っている： i.これらは、一般に水に不溶性であるため、水溶液中でのハイスループットスクリーニングに適した形状の化合物類の混合物は生成しない； ii.この誘導された化合物類は、固相法を用いるコンビナトリアルライブラリーの形状において、調製することができない； iii.使用された混合物^8,9は、自己−デコード化ができず、かつ該活性分子の同定には、時間のかかるデコンボリューション的な再合成が必要である。キナーゼプロテインキナーゼは、細胞の増殖、分化、及び細胞間連絡において重要な役割を果たす、細胞内酵素である。変種のプロテインキナーゼ活性は、癌のいくつかの形及び重度の複合型免疫欠損症を含む、多くの病態に関連している。セリン／トレオニン及びチロシンのプロテインキナーゼは全て、共通の祖先を持つキナーゼから進化した触媒サブユニットとして公知である、およそ300個のアミノ酸領域を有している(Hunterらの論文、1991年)。いくつかのキナーゼの結晶構造の決定から、これらが全て、共通の二葉状(bi-lobal)の構造を有することがわかった。このサブユニットのアミノ末端部分は、ATPの結合に寄与している小さい葉をコードし、一方カルボキシ末端残基は、タンパク質基質の結合に重要な大きい葉をコードしている。この活性キナーゼの三次元構造において、ATP及びタンパク質基質双方の結合部位は、一緒に、該タンパク質基質上のアミノ酸受容体への、ATPのγ−リン酸基の転移を可能にする。このタンパク質／ペプチド結合の溝は、２本のα-ヘリックス間の大きい葉の表面を横切り、小さい葉の下側へと伸びている。従ってこの溝は、該キナーゼの基質特異性に重要な残基を含んでいる。プロテインキナーゼは、細胞内のキナーゼカスケード中に配列されており、ポスト−シグナル伝達経路におけるシグナル増幅の能力を提供する。この増幅は、その下流のパートナーを特異的に活性化する上流のキナーゼによるものである。こういう理由で、プロテインキナーゼは、様々なキナーゼカスケード間の望ましくないクロストークを妨げるような著しい基質特異性を出現させる。我々は、このような基質特異性を、選択的プロテインキナーゼ阻害剤の設計において活用することができると考える。現存するプロテインキナーゼ阻害剤非ペプチド系の阻害剤最も利用可能なペプチドでないプロテインキナーゼ阻害剤は、その基質結合領域を標的とすることはないが、酵素結合に関してATPと競合する。これらの阻害剤は、従来の医薬化学を用いて設計し、特異的酵素選択性を示すことができる。この戦略のひとつの例は、一般的プロテインキナーゼ阻害剤である真菌の代謝物スタウロスポリンの、選択的プロテインキナーゼC阻害剤であるビス−インドリル−マレイミドRo31-7549及びRo31-8425(図17)への修飾であった(Muidらの論文、1991年)。残念ながら、このATPアンタゴニスト阻害剤の効力は、高レベル（ミリモル）のATPのために、特定の細胞内区画において、劇的に低下され得る。あるストレプトミセス菌によって産生される芳香族化合物エルブスタチン(erb statin)（図18）は、タンパク質のチロシンキナーゼの逆転(reversal)が誘発した細胞の形質転換のスクリーニングにおいて同定された。その後、エルブスタチンは、in vitroにおいてEGFRキナーゼを、k_iが5.58μＭで、かつペプチド基質に対して典型的ラインウィーバーバーク競合的速度論で阻害するが、ATPとは非競合的でありつづけることが示された(Umezawa及びImotoの論文、1991年)。この化合物は、ウシ血清中で容易に不活性化され、かつそのため治療目的の使用に関する重要な候補とはみなされなかった。N-ホルミル基を置換することにより、エルブスタチンの安定性を増し、及びこの分子のあらゆる部分の系統だった修飾を用いて、その阻害を特異的チロシンキナーゼの方向へ偏らせるという両方の試みが成されている。これらの合成エルブスタチン誘導体は、チルホスチンス(tyrphos tins)tyrosine phosphorylation inhibitors)として公知であり、かつ主に酵素／シグナル伝達の研究における道具として使用されるが、疾患の動物モデルにおいて、限定された成功を収めている(Levitzki及びGazitの詳しいレビューを参照のこと、1995年)。偽基質阻害剤プロテインキナーゼの構造及び機能に関する研究は、偽基質阻害として公知の触媒活性を調節する天然の方法を明らかにした。この方法は、触媒部位(プロテインキナーゼC)と同じ分子上、又は活性部位に結合しかつキナーゼ活性を阻害する調節サブユニット分子(環状cAMP-依存性プロテインキナーゼ)上のいずれかの配列を使用する。これらの配列は、リン酸基受容体残基を有さないが、しかしリン酸基受容体に対する単一の特異的残基の修飾は、良好な基質配列の形成をもたらす。これが、この配列が偽基質として知られている理由である。偽基質部分をベースにしたペプチドは、特定のプロテインキナーゼ、例えば、環状cAN−依存性プロテインキナーゼ(PKA)、プロテインキナーゼC(PKC)、ミオシンＬ鎖キナーゼ(MLCK)及びカルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIを阻害するための道具として使用されている(Kempらの論文、1994年)。アミノ酸が20個未満の偽基質ペプチドは、in vitroで、効力の低いナノモル阻害剤であることが、アミノ酸が６個の偽基質をベースにしたペプチドが、1μＭ未満でプロテインキナーゼを阻害することと共に示されている(Kempらの論文、1991年)。活性部位への結合において基質と競合する、分子量が小さいプロテインキナーゼ阻害剤に関する適用範囲があることは明らかである。論理的かつペプチドで実証済みの方法は、触媒部位に特異的に接近することができる基質分子の阻害剤を基にしている。偽基質に焦点を当てると、この方法は更に、リード化合物がランダムスクリーニング法で同定される場合には一般に失われる要素である、“固有の(in-built)”特異性という利点もある。疾患治療におけるプロテインキナーゼ阻害剤現時点で、臨床使用が可能な特異的プロテインキナーゼ阻害剤はない。しかし、いくつかの治療領域、最も注目すべきは腫瘍、自己免疫及び移植の拒絶反応におけるキナーゼ阻害に関する計画を有する主な製薬会社全てにとって、このような化合物の可能性は明らかである。典型的キナーゼ阻害剤化合物は、多くの会社から広範に入手することができ、かつin vitroにおけるシグナル伝達の研究の道具として使用されている。いくつかは、これらの化合物に選択性及び増強された活性の両方をエンジニアリングするために設計された、広範な医薬化学プログラムのための基本となっている。この戦略が、in vitroの細胞アッセイシステム内、及び疾患の動物モデルの両方において活性のある化合物を製造することに一部成功したことを示すいくつかの例が報告されている。スタウロスポリンアナログ(CGP41251及びUCN-01)は、in viv oにおける抗腫瘍活性を示すために使用されていて(Meyerらの論文、1989年；Aki nagakaらの論文、1991年)、及び選択的PKC阻害剤は、急性炎症の動物モデルにおいて作用することが示されている(Bradshawらの論文、1993年)。更にBMNチルホスチンAG490は、動物モデルにおいて、リンパ芽球性白血病増殖を阻害することが示されていて、その阻害能力は、非−レセプター細胞内チロシンキナーゼJAK-2と関連付けられている(Meydanらの論文、1996年)。これらの有望な前臨床試験は、まだ臨床には転用されておらず、これは、おそらく化合物の特異性に関連した、予期しない毒性学的問題が、それらの進行を遅らせている可能性がある。過去数年の間に、キナーゼの構造、機能及び活性に関係する知識は急激に増加した。新たなキナーゼ類も同定され、その中のいくつかは、特異的阻害剤が選択的に作用すると予想することができるような、十分に限定的な細胞分布を示しており、例えばZAP70阻害剤は、Ｔ細胞の活性化を選択的に阻害し、かつNK細胞をより少ない程度に阻害するであろう。と共に、これらの態様は、幅のある病態を治療するためのキナーゼ阻害剤の開発の新規方法が見込まれることを提唱している。プロテインキナーゼ阻害剤の設計法最初の基質情報の作成共通のペプチドキナーゼ基質の情報を提供する方法が、L.Cantleyの研究室で最近開発された(Songyangらの論文、1994年)。第一に、各側の４個の未知のアミノ酸によって変動されたチロシン又はセリン／トレオニンのような、中心のリン酸基受容体を伴うペプチドの、変成したペプチドライブラリーが合成される。次にこのライブラリーは、興味深いプロテインキナーゼによりリン酸化され、かつリン酸化されたペプチドが、DEABセファセル(sephacel)及び鉄キレートクロマトグラフィーにより単離される。このホスホペプチド混合物は、その後配列決定され、かつ-4から+4の位置毎のそれぞれのアミノ酸頻度を評価し、好ましい基質配列を得る。これらの研究は、共通の基質情報をもたらし、かつ隣接する残基の相互作用に関する特定の優位性に関する詳細な分析を可能にすることはない。同様に、この分析は、天然のアミノ酸のみで行われる。繊維状ファージも現在、基質情報の作成に使用されている(マイアミ、バイオテクノロジー会議、1996年)。基質情報は、in vivoにおける該キナーゼの生理的基質の知識からも得ることができる。図面の説明図１から14までは、ライブラリーマトリックスのプレートにおける成分分布を例示している；図15は、化合物番号４:Boc-Val-A1a-Leu-Hの生成の反応経路を詳細に説明している：ここで、ｉは、イソブチルクロロギ酸、N-メチルモルホリン、その後N,O- ジメチルヒドロキシアミン、HCl、THFであり；iiは、HCl、ジオキサンであり；i iiは、イソブチルクロロギ酸、N-メチルモルホリン、その後Boc-Ala-OH、THFであり；ivは、HCl、ジオキサンであり；ｖは、Boc-Val-Osuc、N-メチルモルホリン、DMFであり；viは、LAHである；図16は、Der PIの活性阻害剤の生成の反応経路を、詳細に説明している；図17は、RocheプロテインキナーゼＣ阻害剤の分子構造を示している。A；Ro31 -8425/002、3-[8(RS)-(アミノメチル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリドール[1,2-a] -インドール-10-イル]-4-(1-メチル-3-インドリル)-1H-ピロール-2,5-ジオン塩酸塩。B;Ro 31-7549/001、3-[1-(3-アミノプロピル)-3-インドリル]-4-(1-メチル-3-インドリル)-1H-ピロール-2,5-ジオン塩酸塩である；図18は、ストレプトミセスMH435-hF3から単離された、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤であるエルブスタチンの分子構造を示す。発明の簡単な説明本発明は、新規活性化合物の発明を促進するような、自己デコンボリューション法によるコンビナトリアルライブラリーを用い、構造活性相関の迅速な形成を提供する装置及び方法の分野に関する。我々は、本願明細書において、構造活性相関(SAR)データの迅速な作成、及びその結果のいずれかの化合物群の活性モチーフの特徴づけのために使用することができる装置及び方法を説明する。本発明は、自己デコンボリューション法について二次元で示された、２種の相補的コンビナトリアルライブラリーを提供する、溶液中の化合物類の混合物の２種の直交セットを提供する。二次元で示された混合物の２種の直交セットの一般的概念は、多数の穴の様々な並び替え、プレートレイアウト、混合物毎の多数の並び替えなどに適応することができる。しかし、本発明に従って、数字で示された相関関係が、４種の可変基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを持つ化合物類を含むライブラリーに関して、下記に示したように定義された。一般的デコンボリューションの式 -Bb-Cc-Dd-n(Ee)- (I) 1)一次及び二次のプレートは、同じ穴当たりの化合物数[X]を有することが好ましい：さもなければ、それぞれ、Xp及びXsの２種の値を有する。 2)一次ライブラリーは、[np]個のプレートを含む。 Rp・Cp＝Rs・Csであるならば、二次ライブラリーのプレート数も、[np]個である。そうでない場合は、二次ライブラリー中のプレート数[ns]は： ns＝（Rp・Cp／Rs・Cs）・np 例えば、一次ライブラリーがnp＝4、Rp＝8、Cp＝10であるなら、下記式と等しいプレート数を有するRs＝4、Cs＝5の二次ライブラリーを試みることができる： ns＝（8×10／4×5）×np＝16プレート。穴当たりの化合物数 -Bb-Cc-Dd-np(Ee)- (1) 可能性のある組合せの数[k]は、以下のように得られる： k＝b・c・d・np・e (2) プレート上の穴の数＝[N]、穴当たりの化合物の数＝[X]、及びプレートの数＝[n p]であるならば： k＝X・N・np (3) しかし、穴の数[N]は、列の数[Rp]及び行の数[Cp]によっても定義されるので： N＝Rp・Cp (4) (3)及び(4)を組合せて： k＝X・Rp・Cp・np (5) (2)及び(5)を組合せて： b・c・d・np・e＝X・Rp・Cp・np (6) この式の両辺を[np]で約して： b・c・d・e＝X・Rp・Cp (7) この式の左辺の２個の変数（例えばb、c）は、各々、行の数[Cp]と等しくなければならず、一方左辺の残りの変数（例えばd）は、列の数[Rp]と等しくなければならない。そのため： [Cp]²・Rp・e＝X・Rp・Cp (8) この式の両辺を[Cp]及び[Rp]で約して： Cp・e＝X (9) ここで[e]は、固定された列の変数の数であり；及び Rp＝Cpであるならば、Rp・e＝Xである。例４個のプレート上、10×10×8×8フォーマットについて： np・e＝8＝＞e＝2 10×2＝X X＝20である。当業者は、前述の一般的デコンボリューションの式を理解することで、本発明の自己−デコンボリューション法の有利な結果が、いくつかの様々な配列の穴、プレートレイアウト、及び混合物を用いることによって得られること、並びにここで詳細に説明された好ましい実施態様におけるこのような変形が、本発明の範囲内であることが意図されていることを、容易に理解するであろう。これらの分子は、環式又は脂環式であることができる。これらは、同じ構造で、下記直線状又は環状であることができるか；Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ又はもしくはBCDEは、下記のように中心コア構造(scaffold)（直線状又は環状）の上であることができるか；もしくは、残基の１個が、下記骨格であることができる。ここで印-B-C-D-E-又は-B-C-D-nE-を使用する場合、これらの直線状及び環状の変形は全て、その定義の中に含まれると理解される。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ間の少なくとも１個であるが全てではない結合が、分断できることが必要である。分断できない結合は、スルホンアミド、尿素、アミノメチレンを含むことができる。 “コア構造”分子のいくつかの限定的でない例を、表２に示し、ここで、置換基R₁−R₄は、可能性のある可変基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥに対応している。第一の態様において、本発明は、式A-B-C-D-nE-F[I]で表された新規化合物を提供し、式中；Ａは、Ｆによって内部消光される発蛍光物質を表し；Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、これらの基のいずれか２種の間の分断できる結合が、適当な結合であるような基を表し；Ｆは、発蛍光物質Ａを内部消光することが可能な消光物質を表し；及びｎは、１〜４の整数を表す。いくつかの実施態様において、前述の適当な結合とは、未置換のアミド結合（実施例１参照)であり；別の実施態様においては、この適当な結合は、エステル結合である(実施例２参照)。好ましい実施態様において、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは、アミノ酸又はヒドロキシ酸である。これは、アミン又はヒドロキシ末端及びカルボン酸末端を有する分子である。このアミン／ヒドロキシ基は、同じ炭素原子に位置するか、もしくはいくつかの原子及び原子型により隔てられていることができる。第二の態様において、本発明は、式[I]の化合物類の混合物を含むFRET化合物のコンビナトリアルライブラリーを提供する。第三の態様において、本発明は、タンパク質分解酵素の１個又は複数の基質を検出するために、このようなコンビナトリアルFRET（蛍光共鳴エネルギートランスファー）分子のライブラリーを用いてアッセイを実行することによる、該酵素活性の検出及び測定を含む、構造−活性相関(SAR)相関の迅速な形成をもたらす方法における、コンビナトリアルFRETライブラリーの使用を提供する。この方法に従って、同定された基質は、タンパク質分解酵素の生物学的アッセイにおいて、合成しかつ使用することができる。新規基質は、本発明の範囲に含まれる。第四の態様において、本発明は、前記ライブラリーの化合物に対するタンパク質分解酵素活性の検出及び測定の方法における、このようなコンビナトリアルFR ETライブラリーの使用を提供する。第五の態様において、本発明は、基質として同定されたFRET化合物が、可能性のある阻害剤のパネルに対する個別の酵素との阻害アッセイにおいて使用されるような、１個又は複数の酵素阻害剤の同定を含む方法を提供する。第六の態様において、本発明は、２種の相補的FRET化合物ライブラリーを含む化合物のセットを提供する。このようなセットは、タンパク質分解酵素の基質又は阻害剤を同定するためのスクリーニング又はアッセイ法を可能にするので、以後“装置”と称す。この装置を構成している化合物のセットは、下記のように、自己デコンボリューション法によるコンビナトリアルライブラリーを提供することが可能である。第七の態様において、本発明は、コンビナトリアルFRET(蛍光共鳴エネルギートランスファー)分子のライブラリーを用いるアッセイを実行することによる、タンパク質分解酵素活性の検出及び測定を含むタンパク質分解酵素の阻害剤を同定及び合成の方法、該酵素に関する１個又は複数の基質を発見し、かつ１個又は複数の基質をベースにした阻害剤を合成するための該ライブラリーのデコンボリューション法を提供する。この方法の直接の生成物は、1個以上の新規タンパク質分解酵素阻害剤である。第八の態様において、本発明は、該酵素の基質として同定されている、FRET分子を用いる阻害アッセイを提供するが、ここで該分子は、可能性のある阻害剤のパネルに対して個別に酵素を用いてアッセイされる。第九の態様において、本発明は、下記式の化合物を含むセットを構成している、化合物ライブラリーL1及びL2の相補対を提供する： Aa-Bb-Cc-Dd-n(Ee)-Ff-Gg これは、各ライブラリーにおいてa×b×c×d×e×f×g＝Mn個の化合物をもたらし、各ライブラリーの個々の同定しうる化合物のあらかじめ定められた数（Q1,Q 2）からそれぞれなる混合物のあらかじめ定められた数(P1,P2)があり、ここでL1 及びL2は両方共、同じMn個の化合物を含んでいるが、L1のQ1個の化合物の１種の混合物中に一緒に認められるいずれか２種の化合物が、L2のP2個の混合物のいずれか１種において一緒に認められることはない。第十の態様において、本発明は、前述のライブラリーL1、L2を用いる、酵素活性のスクリーニング法を提供し、ここでL1のP1混合物及びL2のP2混合物は、各々、穴プレートの個々の穴に個別に配置され、これらの穴プレートは、L1の１個の穴及びL2の１個の穴中の活性の存在から独自の活性化合物の式を推測することを可能にするために適用されたフォーマットに配列された穴を有する。本発明の装置は、好ましくは２種の相補的化合物ライブラリーL1及びL2を含み、各々は、A-B_1-10-C_1-10-D_1-8-n(E_1-2)-F-G-[II]型の、本発明の化合物n×1600 個を含み、ここで：Ａは、Ｆにより内部消光された発蛍光物質であり、好ましくは、Ｂにアミド結合によって結合された、未置換又は置換されたアントラニル酸誘導体であり；Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは、適当な結合により互いに結合された天然又は非天然のアミノ酸残基であるが、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、Ｄ-Ｅ間の分断できる結合が未置換の結合であるという条件で、いずれかの基のセットであることができ；Ｆは、発蛍光物質Ａの内部消光が可能な消光物質であり、好ましくは、未置換又は置換された3-ニトロチロシン誘導体であり；Ｇは、任意に存在し、かつ疎水基であり、好ましくはアスパラチルアミド基である。Ｇが存在する場合には、これは、都合が良いことに該ライブラリー中の全ての化合物に、水への溶解度が授けられることを確実にする。更にＧは、酵素のいずれかの型の基質であってはならず；ｎは、１〜４のいずれかの整数である。あるいは、前述の分断できる結合は、Ｂ-Ｃ又はＣ-Ｄの間であることができる。(ここで一般に、Ａ及びＦは、それぞれ、前述の先行技術のＦ部分及びＱ部分であることに注意のこと。）残基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの後ろの添え字で表された数は、これらの残基が選択される可能性の数を意味している。従って、具体的な例として、A-B_1-5-C-D-E_1-2- F-Gは、以下の10種類の化合物の混合物を表している： A-B₁-C-D-E₁-F-G A-B₂-C-D-E₁-F-G A-B₃-C-D-E₁-F-G A-B₄-C-D-E₁-F-G A-B₅-C-D-E₁-F-G A-B₁-C-D-E₂-F-G A-B₂-C-D-E₂-F-G A-B₃-C-D-E₂-F-G A-B₄-C-D-E₂-F-G A-B₅-C-D-E₂-F-G 各ライブラリーの一般的コンビナトリアル式は、以下のように表される： A₁₀-B₁₀-C₁₀-D₈-n(E₂)-F₁-G₁[III] ここで、1×10×10×8×n×2×1×1＝1600種の化合物が提供される。前述の型のL1及びL2の両方の化合物ライブラリーは、各ライブラリーが、個別の同定しうる化合物20個の混合物80n種として、1600n個の化合物を含むように、マルチピン法²⁴を利用する固相法を用いて合成される。これらの20個の成分の混合物は、その後、96穴プレートの80穴の各々に、個別に配置され(残りの２列は、対照実験に使用される。)、その後既知量のプロテアーゼについてスクリーニングされる。従って、L1及びL2の２種のライブラリーに含まれた化合物の数（例えば、好ましい実施態様において：1600n、ここでn＝1〜４のいずれかの整数。）と関係無く、これらのライブラリーそれ自身が、相補的であり、かつ再合成によらないでデコンボリューションに従い易いことは、本発明の重要な部分である。更に、このライブラリーマトリックスが、タンパク質分解酵素の最も重要な部位の対P2及びP1が、再合成によらないで即座に同定することができるように、特にフォーマットされていることも、本発明の重要な部分である。前記プロテアーゼのより良い基質である型A-B-C-D-E-F-Gの化合物は、切断され、かつ発蛍光物質Ａが、容易に定量できる時間依存的方法で、その近傍の消光物質Ｆにより切断されるので、容易に同定される。ＡのＦにより消光される蛍光は、これら２種がすぐ傍、通常30オングストローム単位以内に隣接する場合にのみ生じる。このため、分断できる結合（例えば分断できる結合D-E）の切断は、Ｆを、Ａから更に遠くに移動させ、その結果、正確な波長の光で励起された場合に、Ａを蛍光させる。 1.この方法において、最も活性のある化合物は、更なる再合成及びデコンボリューションの必要なしに、迅速に同定することができる。更に、最も早い蛍光出現を示す穴は、質量分析法によっても分析することができ、当初の混合物との比較により、その２種の成分部分、例えばA-B-C-D及びE-F-Gへの、その消失によって、最も効果的な基質の同定を認めることができる。従って、ライブラリーデコンボリューションの問題点を克服することができ、かつ該酵素に対する最も活性のある基質を、迅速に同定することができる。これに加え、前記ライブラリー混合物L1及びL2によるタンパク質分解酵素の最初の処理後に、各穴内の残留酵素活性を、16×n個の化合物ライブラリーにおいて認められる、該酵素に対する最も強力な蛍光原基質S1の添加により定量することができる。このライブラリーデザインの性質のために、これは迅速に調製及び精製することができる。公知の基質S1による蛍光の増加が見られないないならば、酵素阻害剤の存在を暗示することができ、これは、再合成の必要なしに、再び迅速に同定することができる。前述のライブラリーレイアウトの一般的説明を、ここで、図１から14を参照として説明する。例えば、n＝1であり、かつライブラリーが1600種の化合物を含む場合は、ライブラリ−L1の第一プレート(P1)中の第一列第一行(A1)において（図１）(以後ロケーションA1、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₁及びE₂）がある(図２)。ライブラリーL1の第一プレート(P1)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₁及びE₂ ）がある。ライブラリーL1の第一プレート(P1)中の第八列第十行(H10)において (以後ロケーションH10、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分₈、10 個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₁及びE₂）がある。従って、80穴が各々20成分を含むので、全部で1600成分が、１個のプレートに存在する。第二の相補的ライブラリーは、以下のように合成される(図３)。ライブラリー L2の第一プレート(P1)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P1 、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₁及びD₂)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₁がある。ライブラリーL2の第一プレート(P1)中の第一列第十行 (A10)において(以後ロケーションA10、P1、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₁及びD₂)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₁がある。ライブラリーL 2の第一プレート(P1)中の第二列第一行(B1)において(以後ロケーションB1、P1、 L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₁及びD₂)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₂がある。ライブラリーL2の第一プレート(P1)中の第二列第十行(B10 )において(B10、P1、L2)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₁及びD₂)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₂がある。従って、最初の２列のみを、合計400種の化合物を収容するために使用することができる。ライブラリーL2の第二プレート(P2)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P2、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₃及びD₄)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₁がある(図４)。ライブラリーL2の第二プレート(P 2)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P2、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₃及びD₄)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₁がある。ライブラリーL2の第二プレート(P2)中の第二列第一行(B1)において(以後ロケーションB1、P2、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(Ｄ₃及びD₄)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₂がある。ライブラリーL2の第二プレート(P2) 中の第二列第十行(B10)において(B10、P2、L2)、10個のＣ成分、2個のＤ成分(D₃ 及びD₄)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₂がある。従って、最初の２列のみを、合計400種の化合物を収容するために使用することができる。ライブラリーL2の第三プレート(P3)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P3、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₅及びD₆)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₁がある(図５)。ライブラリーL2の第三プレート(P 3)中の第一列第十行(A10)において（以後ロケーションA10、P3、L2と称す)、10 個のＣ成分、２個のＤ成分(D₅及びD₆)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₁ がある。ライブラリーL2の第三プレート(P3)中の第二列第一行(B1)において(以後ロケーションB1、P3、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₅及びD₆)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₂がある。ライブラリーL2の第三プレート(P3)中の第二列第十行(B10)において(B10、P3、L2)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₅及びD₆)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₂がある。従って、最初の２列のみを、合計400種の化合物を収容するために使用することができる。ライブラリーL2の第四プレート(P4)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P4、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₇及びD₈)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₁がある(図６)。ライブラリーL2の第四プレート(P 4)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P4、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₇及びD₈)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₁がある。ライブラリーL2の第四プレート(P4)中の第二列第一行(B1)において(以後ロケーションB1、P4、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₇及びD₈)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₂がある。ライブラリーL2の第四プレート(P4) 中の第二列第十行(B10)において(B10、P4、L2)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₇ 及びD₈)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₂がある。従って、最初の２列のみを、合計400種の化合物を収容するために使用することができる。このやり方では、２種類の相補的ライブラリーL1及びL2が作成される。ライブラリーL1において、80個の穴の各々は、20種の成分の混合物を含有し、スクリーニング用の化合物1600種を提供する。ライブラリーL2においては、４個のプレートが、最初の２列のみを用いて使用され、20成分／穴／プレートである20穴を提供し、かつライブラリーL1に存在するものと同じ1600種の化合物を提供するが、しかしこれは、２種の化合物がライブラリーL1には認められないが、ライブラリーL2において共に認められるようなフォーマットである。従って、２種のライブラリーL1及びL2の間に含まれる化合物は、それ自身相補的であり、ライブラリーL1の中の同じロケーション（例えばA1P1L1）における20 の成分混合物と一緒に認められたいずれか２種の化合物が、ライブラリーL2のいずれかのロケーションにおける20の成分混合物と一緒に認められないことは、本発明の重要な部分である。従って、例えば図２の一次ライブラリーP1L1、及び図３〜６の二次ライブラリーP1L2、P2L2、P3L2及びP4L2に関して、下記の典型的配列のデコンボリューションが可能である： -B₂-C₃-D₄-E₁- この配列が基質であるならば、C3D4で、P1L1において、蛍光が生じるであろう。これは、基質が下記のものであるという情報を提供する： -?-C₃-D₄-?- この蛍光がB₂E₁で、P2L2において生じるならば、これは基質が下記のものであることを示す： -B₂-?-?-E₁- 下記の基質の確認は： -B₂-C₃-D₄-E₁- 全て、-B₂-C₃-X-E₁-（XはD₄ でない）を含む、P1L2、P3L2及びP4L2の非蛍光によってもたらされるはずである。実際には、１個以上の配列が、基質を生じるように思われる。全ての配列に関して、どの位置B-C-D-E-が、変化に関して感受性があるか(すなわち、特異的な基が必要)、及び非感受性であるか（すなわち、１個以上の基の選択が容認できる）どうかに関する情報は、関連した化合物の模型及び／又はの合成に使用することができる、価値のあるSARデータをもたらす。類似した例において、個別にn＝2、３又は４であるならば、余分のプレートは、ライブラリーL1のフォーマットにおいて、それぞれ、成分対E₃及びE₄(n=2)、E₅ 及びE₆(n=3)、並びにE₇及びE₈(n=4)を収容するように構成される。各々のデコンボリューションライブラリーL2型に関して、プレートP1、P2、P3及びP4の各列は、それぞれ、対の成分D₁及びD₂、D₃及びD₄、D₅及びD₆、並びにD₇及びD₈で徐々に満たされる。例えば、n＝3であり、かつこのライブラリーが4800種の化合物を含有する場合は、ライブラリーL1の第一プレート(P1)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₁及びE₂）がある。ライブラリーL1の第一プレート(P1) 中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₁及びE₂ ）がある。ライブラリーL1の第一プレート(P1)中の第八列第十行(H10)において (以後ロケーションH10、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₈、10 個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₁及びE₂）がある。従って、80穴が各々20成分を含むので、全部で1600成分が、１個のプレートに存在する。ライブラリーL1の第二プレート(P2)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P2、L1と称す)、１個のＣ成分C₁、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₃及びE₄）がある。ライブラリーL1の第二プレート(P2)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P2、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₃及びE₄）がある。ライブラリーL1の第二プレート(P2)中の第八列第十行(H10)において(以後ロケーションH10、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₈、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₃及びE₄）がある。従って、80穴が各々20成分を含むので、全部で1600成分が、１個のプレートに存在する。ライブラリーL1の第三プレート(P3)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P3、L1と称す)、１個のＣ成分C₁、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₅及びE₆）がある。ライブラリーL1の第三プレート(P3)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P3、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₅及びE₆）がある。ライブラリーL1の第三プレート(P3)中の第八列第十行(H10)において(以後ロケーションH10、P3、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＣ成分C₈、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₅及びE₆）がある。従って、80穴が各々20成分を含むので、全部で1600成分が、１個のプレートに存在する。総合的に、これら３種のプレートP1、P2及びP3は、1600化合物／プレートを、合計で4800種の化合物を含む。例えば、n＝4であり、かつこのライブラリーが、6400種の化合物を含む場合は、ライブラリーL1の第一プレート(P1)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₁及びE₂）がある(図７)。ライブラリーL1の第一プレート(P1)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₁ 及びE₂）がある。ライブラリーL1の第一プレート(P1)中の第八列第十行(H10)において（以後ロケーションH10、P1、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₈、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₁及びE₂）がある。従って、80穴が各々20成分を含むので、全部で1600成分が、１個のプレートに存在する。ライブラリーL1の第二プレート(P2)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P2、L1と称す)、１個のＣ成分C₁、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₃及びE₄）がある(図８)。ライブラリーL1の第二プレート (P2)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P2、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₃及びE₄ ）がある。ライブラリーL1の第二プレート(P2)中の第八列第十行(H10)において( 以後ロケーションH10、P2、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₈、10 個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₃及びE₄）がある。ライブラリーL1の第三プレート(P3)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P3、L1と称す)、１個のＣ成分C₁、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₅及びE₆）がある(図９)。ライブラリーL1の第三プレート (P3)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P3、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₅及びE₆ ）がある。ライブラリーL1の第三プレート(P3)中の第八列第十行(H10)において( 以後ロケーションH10、P3、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₈、10 個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₅及びE₆）がある。ライブラリーL1の第四プレート(P4)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P4、L1と称す)、１個のＣ成分C₁、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₇及びE₈）がある(図10)。同様に、ライブラリーL1の第四プレート(P4)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P4、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₁、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（ E₇及びE₈）がある。ライブラリーL1の第四プレート(P4)中の第八列第十行(H10) において(以後ロケーションH10、P4、L1と称す)、１個のＣ成分C₁₀、１個のＤ成分D₈、10個のＢ成分、及び２個のＥ成分（E₇及びE₈）がある。第二の相補的ライブラリーは、以下のように合成する。ライブラリーL2の第一プレート(P1)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P1、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₁及びD₂)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₁がある(図11)。ライブラリーL2の第一プレート(P1)中の第一列第十行(A10 )において(以後ロケーションA10、P1、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分 (D₁及びD₂)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₁がある。ライブラリーL2の第一プレート(P1)中の第八列第一行(H1)において(以後ロケーションH1、P1、L2 と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₁及びD₂)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₈がある。ライブラリーL2の第一プレート(P1)中の第八列第十行(H10) において(H10、P1、L2)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₁及びD₂)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₈がある。従って、全十行及び全八列を含むマトリックスは、合計1600種の化合物を収容するために使用される。ライブラリーL2の第二プレート(P2)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P2、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₃及びD₄)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₁がある(図12)。ライブラリーL2の第二プレート(P 2)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P2、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₃及びD₄)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₁がある。ライブラリーL2の第二プレート(P2)中の第二列第一行(B1)において(以後ロケーションB1、P2、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₃及びD₄)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₂がある。ライブラリーL2の第二プレート(P2) 中の第八列第十行(H10)において(H10、P2、L2)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₃ 及びD₄)、１個のＢ成分B10、及び１個のＥ成分E₈がある。ライブラリーL2の第三プレート(P3)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P3、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₅及びD₆)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₁がある(図13)。ライブラリーL2の第三プレート(P 3)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P3、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₅及びD₆)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₁がある。ライブラリーL2の第三プレート(P3)中の第二列第一行(B1) において(以後ロケーシヨンB1、P3、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₅ 及びD₆)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₂がある。ライブラリーL2の第三プレート(P3)中の第八列第十行(H10)において(H10、P3、L2)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₅及びD₆)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₈がある。ライブラリ−L2の第四プレート(P4)中の第一列第一行(A1)において(以後ロケーションA1、P4、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₇及びD₈)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₁がある(図14)。ライブラリーL2の第四プレート(P 4)中の第一列第十行(A10)において(以後ロケーションA10、P4、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₇及びD₈)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E₁がある。ライブラリーL2の第四プレート(P4)中の第二列第一行(B1)において(以後ロケーションB1、P4、L2と称す)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₇及びD₈)、１個のＢ成分B₁、及び１個のＥ成分E₂がある。ライブラリーL2の第四プレート(P4) 中の第八列第十行(H10)において(H10、P4、L2)、10個のＣ成分、２個のＤ成分(D₇ 及びD₈)、１個のＢ成分B₁₀、及び１個のＥ成分E ₈がある。このFRET戦略は、溶液中の混合物の２種類の直交セットの合成をベースにしている。これらの溶液は、各々、２次元で示されている。従って、例えばプロテアーゼスキャンから得たデータは、デコード化又は再合成を必要とすることなく、最も活性のある化合物を同定する。サブユニット（この場合はアミノ酸）の位置的な優位は、他の変形位置全てに関して同時に最適化される。４種全ての位置の間の相乗関係が認められ、かつ陽性で利益となるデータ及び陰性で不活性化するデータの両方が生じる。このことは、基質ファミリー（亜群）及びそれらのサブユニットの優位に繋がる。このデータは、分子モデルプログラムに供給することができ、望ましい性質を包含し（陽性データから）かつ望ましくない相互作用を指摘する（陰性データセットから）という両方の、ファーマコアの記述子を生じる。一次元スキャンが、“最も活性的”である時点のひとつの位置のみを示し、かつ位置間の相乗関係を探ることができないことに注意すべきである。タンパク質分解酵素基質の同定を目的とする相補的コンビナトリアルFRETライブラリーの使用に関する、先に例示した一般的方法は、別の活性部位と相互作用するライブラリーからの化合物の同定も同様に利用可能である。４種の可変基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを含む化合物のコンビナトリアルライブラリーは、適当なリポーター又はマーカーを用いて検出される活性部位との相互作用を生じることができる。例えば、前記活性部位は、プロテインキナーゼであることができる。プロテインキナーゼは、以下を含む(しかしこれらに限定されるものではない)： ZAP-70、Syk、p56^lac、p59^fyn、Yes、Hck、Src、Btk、Blk、Lyn、Raf、EGFキナーゼ、インスリン受容体キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、Bcl-Abl、1kB- キナーゼC-末端キナーゼ、1kB N-末端キナーゼ、Jakキナーゼ、MAPキナーゼキナーゼ、MAPキナーゼキナーゼキナーゼ、MAPキナーゼ(Erks 1-3、p38及びJunキナーゼ)、STATファミリーC-末端セリン／トレオニンキナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＢ、プロテインキナーゼＣアイソフォーム全てである。プロテインキナーゼとライブラリーの化合物の活性のある相互作用を、例えば、該ライブラリー中の基質の放射標識されたリン酸化により検出することができる。従って、プロテインチロシンキナーゼのペプチド基質を、ライブラリー中に存在する外来ペプチド基質のリン酸化によって同定することが可能である。このアッセイは、キナーゼ活性の測定器として、リジンタグがついたチロシンペプチド基質への、放射標識されたATPからの³³Pの転移を用いる。このペプチドは、負に帯電した膜に結合し、かつ組込まれていない[γ−³³P]-ATPは洗浄除去される。 β線計数装置での蛍光含有シンチラントを用いるβ−エネルギー放出の検出は、ペプチドリン酸化の測定をもたらす。別の例において、前述の活性部位は、グリコシダーゼであることができ、かつ前記ライブラリー中の酵素基質と相互作用するであろう。このような場合、少なくとも１個の基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの間の分断できる結合は、アセチル結合又はグリコシド結合である。これらの基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、フラノシド及びピラノシドから選択することができる。別の例において、活性部位はヌクレアーゼである。このような場合分断できる結合は、ホスホジエステル結合であり、かつ基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥはヌクレオチドである。本発明の一般的な方法は、レセプターのような活性部位、及びこのレセプターのリガンドを含むライブラリー間の相互作用の検出にも適用することができる。レセプター／リガンド相互作用の例を、下記に示したが、これらに限定されるものではない：ケモカインレセプター／ケモカイン、すなわち、CKR3／Eotaxin SH3ドメイン／プロリンアミノ酸配列、すなわち、Grb2／SOSペプチド WWドメイン／プロリンアミノ酸配列、すなわち、Yap（Yes-関連タンパク質）／R SV Gagタンパク質 SH2ドメイン／ホスホペプチド、すなわち、Grb2／LNKホスホペプチドレクチンドメイン／リガンド、すなわち、CD72／CD5である。更に、可能性のある抗原又は抗原決定基のコンビナトリアルライブラリーが、活性抗体部分との相互作用について試験された。レセプター／リガンド及び抗体／抗原ライブラリーの反応を検出するためのリポーター又はマーカーは、同様のものである。例えば適当なリポーターは以下のものである（しかしこれらに限定されるわけではない）： 1.検出のためにストレプタビジン(streptavidin)-HRPを用いる、リガンド上のビオチンタグ 2.アルカリホスファターゼタグ 3.放射性同位体タグここで、本発明を、以下の例について説明する。実施例１：システインプロテアーゼ阻害剤及び基質本実施例において、興味深いタンパク質分解酵素は、Der PIであり、これは、ハウスダストダニの糞の中に発見されている。この例は、適当な結合が、未置換のアミド結合であるような、いくつかのFRET化合物の合成、及び可能性のあるDe r PI基質のスクリーニング用のライブラリーとしてのそれらの使用、及びこの酵素の活性阻害剤の配列の同定及び合成を詳細に説明している。 Der PIの精製粗ダニ抽出物（〜100mg、スミスクライン−ビーチャム社、英国）を、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS;50mMリン酸カリウム；pH7.4、150mM NaClを含有）5ml に溶解した。Der pIは、アフィニティーカラムクロマトグラフィーにより、4C1 抗体（インドアバイオテクノロジー社、ディーサイト、英国）を用いて、精製した。この粗調製物を、〜2mlのアフィニティー樹脂と、２時間、４℃で混合し、その後２〜３倍量のPBSで洗浄した。結合したタンパク質の溶出を、5mMグリシンを含有する50容量％のエチレングリコールを用いて行った。画分（2.2ml）を収集し、0.2Mリン酸ナトリウムバッファー0.8ml、pH7.0で中和した。これらの画分を一緒にし、４リットルPBSに対して一晩透析した後、２リットルのPBSに対して２〜３時間二回目の透析を行った。総タンパク質を、必要であるならば、限外ろ過により濃縮した(MacroSep;フローゲン、英国)。化合物の合成化合物類は、Fmoc-Rinkアミドマクロクラウン（キロン・ミモタイプpty社、11 Duerdin Street，Clayton Victoria 3168,オーストラリア）を7μＭ充填して利用する、マルチピン法^25,26を用いて合成した。各化合物のアミノ酸残基は、適当な形状で、アミド結合により結合した。用いたカップリング化学は、フルオレニルメトキシカルボニルで保護されたアミノ酸及び活性化されたペンタフルオロフェニルエステルに関する文献²⁷に報告されたものと類似していて、ここでは側鎖が、当業者には公知の酸置換活性保護基、例えばBoc-(リジンの-NH₂、アントラニル酸の-NH₂、及びアルギニンのグアニジノ用)、tBu-(セリン、トレオニン及びチロシンの-OH基用)、t-Bu(アスパラギン酸及びグルタミン酸の-COOH基用)、トリチル-(アスパラギン及びグルタミンのアミド用)、及びヒスチジン環のアミン官能性などを用いて保護されている。カップリングした残基のN-α-フルオレニルメトキシカルボニル保護基を、ジメチルホルムアミド(DMF)を溶媒とする20％ピペリジンを用いて、20℃、30分間で切断した。Boc-ABz-OH(Boc-2-アミノ安息香酸)、及びFmoc-(3-ニトロ)チロシン-OHのような遊離酸のカップリング反応は、ジメチルホルムアミド(500μｌ)を溶媒とする遊離酸(leq.)：TBTU(0.98eq.)：HOBt(0.98eq.)：N-メチルモルホリン (1.96eq.)の混合物10当量を用いて、20℃、５時間で達成した。他のアミノ酸は、それらのペンタフルオロフェニルエステル²⁶として、２〜６時間カップリングした。従って、ペンタフルオロフェニルエステルとして誘導されたアミノ酸の混合物の中の各成分をほぼ等しい比でカップリングするために、DMF(500μＬ)を溶媒とするアミノ酸ペンタフルオロフェニルエステル混合物合計0.98当量(該クラウンに充填されたアミノ基に関して):HOBT(1eq.)の溶液を、20℃で、16時間カップリングした。その後、このピンを、DMFで十分に洗浄し、その後同じ混合物を用いて、同じ条件下で、再度カップリングした。DMFを溶媒とし、２時間かけた、10 当量（クラウンに負荷したアミノ基に関して）の第三のカップリングを、１当量よりわずかに少ないアミノ酸の誘導されたペンタフルオロフェニルエステルの等モル混合物による、このカップリング実施計画書を用いて行い、該クラウンに対しほぼ等量のカップリングした生成物を得ることが可能であった。このやり方では、これらのライブラリーは、各クラウンに20化合物が存在するように構成される。これらの化合物は、該クラウンから、望ましい96穴プレートの指定された80 穴へと直接切断される。この切断の実施計画書においては、各クラウンを、トリフルオロ酢酸(95％)、トリエチルシラン（5％）を含む混合物(600μＬ)で、20℃ で、２時間、処理した。その後これらのクラウンを、トリフルオロ酢酸(500μＬ )で洗浄し、かつ次にこれを切断溶液と一緒にした。 Fmoc-Rinkアミドマクロクラウン(キロン・ミモタイプPty社、11Duerdin Stree t,Clayton Victoria 3168，オーストラリア)を、１クラウン当たり7μＭ充填したものを、L-Fmoc-Asp(O-t-Bu)-OH(1eq.)を含む混合物の10倍過剰量と、濃度0.1 4MのDMFを溶媒とするTBTU(0.98eq.)及びN-メチルモルホリン(1.96eq.)を、HOBt( 0.98eq.)の存在下で用いて、カップリングした。Fmoc基を、DMFを溶媒とする20 ％ピペリジンで30分間脱保護し、引き続きDMF、その後メタノールで洗浄した後、Fmoc-(3-ニトロ)チロシン-OHのカップリングを、濃度0.14Mのジメチルホルムアミドを溶媒とするFmoc-(3-ニトロ)チロシン-OH(1eq.)：TBTU(0.98eq.)：HOBt( 0.98eq.)：N-メチルモルホリン(1.96eq.)の混合物10当量を用いて、20℃で、５時間かけて達成した。Fmoc基の除去（前記参照）後に、アミノ酸混合物のカップリングを、概説した比で、記載した条件下（前記参照）で行った。特別な例において、基Ｂを含むアミノ酸は、Ala、Val、Leu、Ser、Asn、Gln、 Glu、Lys、Phe、Proである。基Ｃを含むアミノ酸は、Ala、Val、Leu、Ser、Asn 、Gln、Glu、Lys、Phe、Proである。基Ｄを含むアミノ酸は、Ala、Val、Ile、Le u、Nle、Ser、Glu、Pheである。n=4に関しては、基Ｅを含むアミノ酸は、Ala、V al、Ile、Leu、Nle、Ser、Glu、Pheである。一方これらのアミノ酸からのいずれかの選択を、n=1、２又は３について行うことができる。これらの一緒にした切断溶液を含むプレートを、その後蒸発乾固し、回転遠心分離機(“SPEEDVAC”、サバント・インスツルメンツ社、Farmingdale,NY)を、10^- ² mmHgの減圧下、20℃で、800rpm１時間用いて、成分混合物を得た。その後各成分を、アセトニトリル：水：酢酸の混合物（50％：45％：5％）を用いて、最終的マザープレートに移した。次にこれらのプレートを、10^-2mmHgの減圧下、20℃ で凍結乾燥し、その後-20℃で貯蔵した。このやり方で、図２〜14に示された型のライブラリーを調製した。更に詳細に述べると、用いたマルチピン法は、下記のものである：可能性のあるDer pI基質のマルチピン合成 “キロン”マルチピンキットは、逆向きに“クラウン”が装着された96“ピン軸”を含む、標準８×12ピンホルダーから成る。この“クラウン”は、固相ペプチド合成時にその上に生長するペプチドが固定されるような反応性ポリマー表面を提供している。各クラウン（標準的固相合成におけるペプチド樹脂に相当する）は、工業標準規格96穴プレートの個々の１ml穴において、同時に合成を行うことによって、独立した反応器とみなすことができる。各穴、従って各クラウンに、独自の試薬セットを充填することができ、各クラウンに独自の配列をもたらす。洗浄又はNα保護基の除去のような通常の工程を、付随して行うことができる。合成は、Nα−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)で保護されたアミノ酸の使用を基本にしている。三官能アミノ酸の側鎖は、トリチル又はt-ブチルのような、酸置換活性保護基により保護される。アミノ酸残基の生長するペプチド鎖への付加である、“カップリング”と称される工程は、予備生成されたペンタフルオロフェニル(pfp)エステルの利用又は遊離酸の活性化を通じて進行し、これは、触媒として第３級塩基(NMM)及びHOBtが存在する下で、HBTU又はBOP 試薬を使用する。用いた実験法は、詳細に記載されていて(Maeji,N.J.、Bray,A.M.、Valerio,R. M.及びWang,W.の論文、Peptide Research、8(1):33-38頁(1995年)、及びValerio ,R.M.、Bray,A.M.及びMaeji,N.J.の論文、Int.J.Pept.Prot.Res.、44:158-165頁（1994年）)、かつその主要工程は、簡単に述べると以下のものである。一般的方法マルチピンアッセンブリの調製標準のプラスチック製手袋を着用して、Fmoc-Rinkアミドを誘導したマクロクラウンを、軸上に装着し(簡単なクリップ止め)、かつ合成の所望のパターンの８ ×12軸ホルダーへはめ込んだ。 Nα−Fmoc保護基の除去溶媒250mlが入る浴槽に、20％ピペリジン／DMF溶液200mlを満たした。前述のマルチピンアッセンブリを加え、脱保護を30分間進行させた。その後このアッセンブリを取り出し、かつ過剰な溶媒を、短時間振盪して除去した。次にこのアッセンブリを、DMF（５分）及びMeOH（５分、２分、２分）(各200ml)で、連続的に洗浄し、15分間風乾した。 Fmoc発色団の放出のUV定量測定光路長１cmのUVセルに、20％ピペリジン／DMF溶液1.2mlを満たし、波長290nm で、UV分光計の吸光度をゼロに調節した。その後、20％ピペリジン／DMF溶液3.2 ml中に5.0mg Fmoc-Asp(OBut)-ペプシンKA（0.08mmol/g）を含むUV標準液を調製した。この標準液は、Abs₂₉0＝0.55〜0.65（室温）であった。その後、前述のマルチピン脱保護溶液のアリコートを適当に希釈し、理論的にAbS₂₉₀＝0.6とし、かつこの値を、実際の実験で測定した吸光度と比較し、先のカップリング反応の効率を示した。アミノ酸残基のカップリング前述のマルチピンアッセンブリを乾燥する間に、カップリングの特定の過程に必要な、適当なNα−Fmocアミノ酸pfpエステル（各クラウンの負荷から算出して 10当量）及びHOBt（10当量）を、正確に秤量し適当な容器に入れた。あるいは、適当なNα−Fmocアミノ酸(各クラウンの負荷から算出して10当量)、HBTU のような望ましいカップリング剤(各クラウンの負荷から算出して9.9当量)、NMM （各クラウンの負荷から算出して9.9当量）を、正確に秤量し適当な容器に入れた。次に、保護されかつ活性化されたFmocアミノ酸誘導体を、DMFに溶解した(各マクロクラウンにつき500μｌ、例えば20マクロクラウンでは、20×10eq×7mmol誘導体を、DMF10,000μｌ中に溶解する。)。その後これらの適当な誘導体を、“カップリングサイクル”開始の用意ができた適当な穴に分注した。標準的には、カップリング反応を２〜６時間進行した(カップリングの性質に応じて、例えばAla からAlaは２時間、ValからLeuは６時間)。 Fmocアミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルをカップリングする場合には、各マクロクラウンに、ブロモフェノールブルーの保存液(100μｌ)を入れたDMF(4 00μｌ)を溶媒とする誘導体10eqを用いた。これは、未反応のアミンの存在下でのブロモフェノールブルーの濃い青色から、アシル化完了時の淡黄色への変色により、アシル化反応進行のモニタリングを可能にする。ブロモフェノールブルー保存液の調製ブロモフェノールブルー(20mg)を、DMF(50ml)に溶解し、及びHOBt(10mg)を添加する。カップリング後の洗浄前述のカップリングサイクルの直後に20％ピペリジン／DMF脱保護が続くならば、その後該マルチピンアッセンブリを、短時間振盪し、過剰な溶媒を除去し、 MeOH（５分）及びDMF（５分）(各200ml)で連続して洗浄し、かつ脱保護した(前記参照)。このマルチピンアッセンブリを保存する場合には、その後短い振盪、その後のDMF（５分）及びMeOH（５分、２分、２分）(各200ml)の連続洗浄からなる、十分な洗浄サイクルを行った。ペプチド−ピンアッセンブリの酸溶解が媒介した切断酸が媒介した切断の実施計画書は、換気フードの中で厳密に行う。ポリスチレン製96穴プレート（1ml／穴）にラベルを付け、その後風袋重量をおおよそのmg まで測定する。次に適当な穴に、トリフルオロ酢酸／トリエチルシラン（95:5、 v/v、600μｌ）切断溶液を充填し、マルチピンアッセンブリのパターンに対応するパターンで、切断した。このマルチピンアッセンブリを加え、構成物全体を錫箔で覆い、２時間放置した。このマルチピンアッセンブリをその後、トリフルオロ酢酸／トリエチルシラン（95:5、v/v、600μｌ）切断溶液（前記）を含む別のポリスチレン製96穴プレート（1ml／穴）に、５分間加えた。この切断したアッセンブリを、DMF(200μｌ、５分間)、MeOH（200μｌ、５分間）で洗浄し、使用したクラウンを取り除き廃棄し、その軸を除去し、かつメタノール中で超音波洗浄した(室温で１時間)。切断したペプチドの仕上げその後、一次ポリスチレン製切断プレート（２時間の切断）及び二次ポリスチレン製プレート（５分間洗浄）(前記参照)を、SpeedVacに配置し、かつその溶媒を、90分間かけて除去した(最低の乾燥速度)。二次ポリスチレン製プレート（前記参照）の含有物を、一次プレート上のそれらの対応する穴に、アセトニトリル／水／酢酸（50:45:5、v/v/v）溶液（3×150 μｌ）用いて移し、使用した二次プレートを廃棄した。生成物の分析各穴1.0μｌ（前記参照）を、0.1％TFA水溶液400μｌで希釈し、HPLC-MSにより分析した。カラムVydac C4(214TP52、細孔(narrowbore)、21×250mm)。溶離液：溶媒Ａ＝0.1％トリフルオロ酢酸水溶液、溶媒Ｂ＝アセトニトリル／10％のＡ。勾配：Ａを溶媒とする10〜90％のＢを、27分間かけて、250ml／分、215nm UV 検出。下記に示した個々の基質は、前述の方法で調製し、かつHPLC-MSによって正確な質量で＞95％であることを示した。ペプチドの最終的凍結乾燥前述の一次ポリスチレン製プレート(二次プレートの洗浄液を加えたもの)を、錫箔で覆い、このプレートを輪ゴムで止め、静置した。前述の箔に各穴の真上に、ピンの小穴を開け、このプレートを-80℃で30分間静置した。その後このプレートを、“Heto凍結乾燥機”の上で一晩かけて凍結乾燥した。生物学的スクリーニングの前に、適当であるならば、個々のペプチドを秤量し、DMSOに溶解して、 10mM 保存溶液として。あるいは、20成分混合物を、秤量し、ペプチド／20成分の比を算出した。アミノ酸残基の更なるカップリングを、前述のマルチピン法に従って行った。前記マルチピンアッセンブリを乾燥している間に、適当なNα−Fmocアミノ酸(各クラウンの負荷から計算して10当量)、HATUカップリング剤(各クラウンの負荷から計算して9.9当量)、HOAt触媒（各クラウンの負荷から計算して9.9当量）及びD IPEA（各クラウンの負荷から計算して19.9当量）を、正確に秤量し、適当な容器に入れた。次に、保護されたNα−Fmocアミノ酸及びカップリング剤を、DMF（各マクロクラウンにつき500μｌ）に溶解し、かつDIPEAを添加して活性化した。適当な誘導体を、それらの適当な穴に分注し、標準的には、各マクロクラウンへのカップリングを、２時間進行させた。カップリングが、特にN-メチル、Cα−メチル又は普通でないアミノ酸（そのカップリング効率は不明）のようなアミノ酸残基を妨げた場合は、このカップリング反応を反復し、標準的には、更に２時間行う。 Der pIの基質前述の一般的方法を用いて、下記の化合物を、前述のように精製した、可能性のあるDer pIの基質として調製し、かつアッセイした。 NSは、ペプチドがDer pIによって加水分解されなかったことを示す。 NMは、ペプチドは、Der pIの基質であるが、そのK_mは測定しなかったことを示す。 NM^aは、ペプチドが、Der pIの基質であり、その切断をHPLC-MSによって調べたところ、加水分解が-Nle-Ser-の間に生じていることを示した。切断速度の順に並べると：-Bz＞n-But＞Piv＞Bz(2-カルボキシ)＞Abzである。アミノ酸残基のカップリングは、前述のマルチピン法に従って行った。このマルチピンアッセンブリを乾燥している間に、適当なNα−Fmocアミノ酸(各クラウンの負荷から算出して10当量)、HATUカップリング試薬(各クラウンの負荷から算出して9.9当量)、HOAt触媒（各クラウンの負荷から算出して9.9当量）及びDIPEA （各クラウンの負荷から算出して19.9当量）を、正確に秤量し、適当な容器に入れた。その後保護されたNα−Fmocアミノ酸及びカップリング試薬を、DMF(各マクロクラウンにつき500μｌ)に溶解し、かつDIPEAを添加して活性化した。次に適当な誘導体を、適当な穴に分注し、かつ各マクロクラウンへの標準的カップリングを、２時間進行させた。カップリングが特にN-メチル、Cα-メチル又は普通でないアミノ酸(それらのカップリング効率は不明)のようなアミノ酸残基によって妨げられる場合には、このカップリング反応を、標準的には更に２時間反復した。この方法において合成された配列を以下に示す：NS-基質でない：Der pIによって加水分解されない NM−基質であるが、測定せず：Der pIの基質であるが、測定せず。アッセイ法ここに記した装置のライブラリーの20化合物の混合物の各々を、システイニルプロテアーゼDer pIに対するアッセイにおいて、各化合物につき濃度0.1μＭでスクリーニングした。最も活性のある穴を、試料を320nmで照射した場合の、420 mnにおける蛍光発光速度により識別した。前述の２種の相補的ライブラリーの分析から、該酵素に関する最良の基質が、以下のものであることが示された： Abz-B-C-D-E-Tyr(NO₂)-Asp-NH₂ ここで、B＝バリン＞アラニン、グルタミン、ロイシン、フェニルアラニン C＝アラニン＞＞グルタミン又はリジン D＝ロイシン、ノルロイシン又はアラニン＞セリン E＝セリンである。最良の基質は、以下のものである：［配列番号：１］ Abz-Val-Ala-Nle-Ser-Tyr(NO₂)-Asp-NH₂ その後この化合物を、本願明細書において説明したペプチド合成法を用いて、単成分として再合成した。Der pIアッセイにおける純粋な基質に関するK_cat／K_m の測定値は3.5×10⁴M^-1s^-1であり、かつこれはDer pIの阻害剤の一般的スクリーニングのためのハイスループットアッセイでの使用に適するほど高いとみなされた。ハイスループットアッセイの開発プレートアッセイを、96穴プレートのフォーマットにおいて、各穴中のアッセイ容量100μｌ当たりDer pI 0.1μｇを用い、及び該基質20μＭを用いて行った。全てのアッセイは、アッセイバッファー（AB；50mMリン酸カリウム、pH8.5、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)及び1mMジチオスレイトール(DTT)を含有）中で行った。Der pI酵素は、DTTの添加により予備活性化し、アッセイを開始する前に、これを室温で５分間インキュベートした。スクリーニング法の例として、各穴は、DMSOを溶媒とする20μＭ被験化合物溶液5μｌ、基質２の200μＭ水溶液10 μｌを含んでおり、かつABを溶媒とするDer pI 85μｌを添加して、反応を開始した。酵素活性は、Labsystems Fluroskan Ascent装置を用いて、励起光320nm及び発光波長420nmを用い蛍光でモニタリングした。速度論の測定は、日立のF-450 0蛍光分光光度計を用いて行った。 Der pIの阻害剤の合成前述の最良の基質は、酵素／アッセイ溶液のHPLC-質量分光分析によって、ノルロイシン−セリン間のアミド結合で切断されるごとが示された。一連の誘導体（例えばBoc-、ピバロイル、ベンゾイル、及び2-カルボキシ-ベンゾイル）による、末端のAbz基の置換は、基質活性及びDer pI酵素に対する特異性に影響する。P₁-P_1'切断部位及びP₄-P₃-P₂-P₁モチーフに関する知識によって、化合物Boc-V al-Ala-Leu-H、４は、図15の経路1aに示されたように合成した。このモチーフに対する適当なマイケル受容体、例えばCH=CH-、CO₂Et、及び-CH =CH-SO₂Phなどの付加（図16、経路２）は、該酵素に対する活性のある阻害剤を提供し、その見かけのIC₅₀値は、各々50nM、1000nM及び100nMであった。配列４を基に、活性Der pニ阻害活性を有する一連のアシルオキシメチルケトン化合物を調製した。このシステインプロテアーゼ阻害剤化合物の新規グループの調製及び活性の詳細は、同時係属出願である国際出願公開番号第WO97/04004号に開示している。実施例２：ウイルスプロテアーゼの阻害剤及び基質デプシペプチドの設計本発明の一般式(I)、(II)又は(III)の化合物の別の適当な結合は、エステル結合であり、これはデプシペプチドを生成する。デプシペプチド基質の組込みは、ウイルスのセリンプロテアーゼのような、活性の低いウイルスプロテアーゼに対する基質の同定を補助する。例えば、下記一般式の基質： n[Abz-B_1-10-C_1-10-D_1-8y[COO]-E_1-8-Tyr(NO₂)-Asp-NH₂] を生成した。しかし、ウイルスプロテアーゼの著しい割合は、前述の一般構造によって表されたものよりも大きい基質配列のみを認める。ウイルスプロテアーゼ（機能は、未熟なウイルスタンパク質を、成熟したウイルスパッケージへと切断すること）の作用の本当の性質によって、天然の基質部位に関するデータが自動的に受け取られることはよく知られている。従って、前述の一般構造は、適当な部位への、余分の固定されたアミノ酸の導入によって、延長され得る。論理的延長は、公知のP1-P1'切断部位に、デプシペプチド結合として導入され、引き続き標準フォーマットに従い、前述の４種の異なる位置に導入され、以下を生じる： n[Abz-B_1-10-C_1-10-D_1-8-E_1-8-P1 y[COO]-P1'-Tyr(NO₂)-Asp-NH₂] 更に、これらの基質は再度あまりにも小さいことが証明された場合は、これは公知の基質配列を使用して、別の固定された位置に導入することができる。例えば、肝炎NS3プロテアーゼについては、天然のP6位置が、保存された酸性残基（アスパラギン酸又はグルタミン酸）であることが分かっている。従って、前述の構造は、以下に詳細に示したように拡大することができる： n[AbZ-P6-B_1-10-C_1-10-D_1-8-E_1-8-P1 y[COO]-P1_'-Tyr(NO₂)-ASP-NH₂] ここで説明した新規方法は、治療上有効なタンパク質分解酵素阻害剤の発明を非常に促進し、かつ商業的に開発可能である。これは、タンパク質分解酵素の最良の基質モチーフを迅速に同定することができるためであり、かつ文献において、タンパク質分解酵素、特にアスパラチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ及びシステイニルプロテアーゼの活性部位と反応するモチーフを結合する様々な方法が存在し、酵素阻害剤が容易に合成できるためである。更に、アミド結合の置換又は遷移状態の擬態を、その分子に組込むことができ、これは、アスパラチルプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼの阻害に関して特に有用である。前述の方法は、更に新規プロテアーゼ阻害剤のスクリーニングアッセイの迅速な開発を促進する。ライブラリースクリーニングによって発見された最も強力な蛍光基質は、綿密な調査の下で、引き続き特定のタンパク質分解酵素の阻害剤の検出に使用することができる。説明した化合物ライブラリー中の阻害剤の存在は、最も活性のある蛍光基質を伴うアッセイ混合物の再処理によって、容易に検出され、このことは、残留するタンパク質分解酵素活性の迅速な測定を可能にするであろう。本発明は、自己デコード式のコンビナトリアル蛍光原ライブラリーを提供し、かつこれは、以下の理由により、新規プロテアーゼ阻害剤の設計及び発明を大きく促進するであろう： i．このライブラリーのペプチドは、類似した及び異なる蛍光原基及び消光基を含むペプチドと比較して、水への溶解度が増し得る。 ii．このペプチドは、外来ペプチドの混入に対し安定している。 iii．前述の自己デコンボリューション法は、基質切断速度データの連続解析と組みあわせることによって、該基質ライブラリーに含まれた最も活性のある結合モチーフの迅速な同定が可能になる。 iv．前記方法は、酵素阻害剤として作用する該ライブラリーのいずれかの化合物に関する酵素アッセイ混合物の、迅速な評価を可能にする。実施例３：キナーゼの阻害剤及び基質先に示したように、本発明は、広範に利用可能な方法であり、かつプロテアーゼ阻害剤／基質化合物を検出するためのFRETライブラリーの使用に限定されるものではない。本発明の別の使用例は、相補的コンビナトリアルライブラリーの化合物の放射標識されたリン酸化のモニタリングによる、キナーゼの基質／阻害剤との相互作用の検出である。ZAP-70 チロシンキナーゼ阻害剤の同定 ZAP-70は、Ｔ細胞抗原レセプターに由来したＴ細胞のシグナル伝達に必須の細胞内キナーゼである。非機能的ZAP-70キナーゼを生じる突然変異が、重度の複合型免疫欠損症に罹患した患者において認められている。従って主な製薬会社は、ZAP-70キナーゼ活性の医薬品のダウンモジュレーション(down-modulation) を、抗原に依存した免疫系の発現量の減少(down regulation)の可能性のある方法として認めている。このような医薬品は、移植治療及び自己免疫疾患の治療の両方において使用することができる。ZAP-70 キナーゼ触媒ドメインの形成完全な長さのプロテインZAP-70チロシンキナーゼは、Ｔ細胞抗原レセプター上で、リン酸化されたチロシン残基に対する酵素の収集を可能にするが、プロテインキナーゼの触媒活性は不要であるような、アミノ末端縦列SH2ドメインを有する。このSH2ドメインの除去は、構造的に活性があり、安定したZAP-70キナーゼを生じる。特異的オリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーを用いて、アミノ酸308から619を増幅し、かつ鋳型としてヒトジャーガット細胞のcDNAを用いて、カルボキシ末端にヘキサヒスチジン配列を加えた。このアンプリコンを、バキュロウイルス転移ベクターpACUW51（ファルミンゲン社）へとクローン化し、Sf9昆虫細胞中の相同的組換えによって、組換えバキュロウイルスを製造した。CatZAP(H6) の精製混合されたCatZAP-70バキュロウイルスの低力価の系統(stock)を用いて、Sf9 細胞のやや密集した(sub-confluent)単層に感染した。感染後３日目に細胞を収集し、PBSで洗浄し、かつ即座に浸透圧溶解を行った。CatZAP(H₆)タンパク質の単離を、コバルトカラムキレートクロマトグラフィーを用いて行い、100mMイミダゾールを用いて、分画を溶出し、かつキナーゼ活性を³³Pの転移によって、測定した。ハイスループットプロテインキナーゼスクリーニングアッセイ活性プロテインキナーゼ部分と、コンビナトリアルペプチドライブラリー化合物との相互作用を、測定することができる。 CatZAP(H₆)によってもたらされたペプチド基質のリン酸化量を測定するための迅速かつ高感度のアッセイが開発されている。このペプチドライブラリーは、正に帯電したテトラ−リジンタグを付けて合成した。このプロテインキナーゼ及び放射標識した[³³P−γ]-ATPを微量含有するATPと共に、ペプチドをインキュベーションした後、この反応混合物を、96穴プレート真空マニホルドシステム（ミリポア社）を用い、負に帯電したホスホセルロース膜を通した。正に帯電したペプチドはこの膜に結合するが、組込まれなかった[³³P−γ]-ATPは洗浄された。その後シンチラントをこの膜に施し、穴プレートシンチレーションカウンターを用いて測定したこの膜の放射活性レベルから、リン酸化されたペプチドの量を算出した。この型のアッセイは、他のプロテインキナーゼ系に容易に適用することができる。このスクリーニングアッセイの結果、1種以上のプロテインキナーゼ基質モチーフを同定し、これにより負に帯電したN-末端及びC-末端の保存されたProが共通の性質を有することが明らかになった。他のプロテインチロシンキナーゼに関しても、追加のライブラリーを構築することが必要であろうと予想されるが、現存するライブラリーも若干の情報を提供することができる。Ser／Thrキナーゼについては、リン酸基受容体部分として中央のSer又はThr残基を使用することにより、この技術を、適用することができる。これに加えて、環状ペプチドライブラリー構築を見越している化学部門の技術が、開発されている。これらのライブラリーにおける中央のリン酸基受容体残基の組込みは、キナーゼアッセイにおいて使用するための拘束された分子の原料を提供するであろう。略号本願明細書において使用した略号を以下に示す：アミノ酸の略号及びペプチド構造の用語は、下記の文献において推奨されたものに従った：IUPAC-IUB生化学用語委員会(J.Biol.Chem.、247:997頁(1971年))。キラルアミノ酸は、特に記さない限りは、全てＬ形である。他の略号は、以下を用いた： -Abu、b-アミノ酪酸：Abz、2-アミノベンゾイル：ACH、1-アミノ-1-カルボキシ- シクロヘキサン：ACPN 1-アミノ-1-カルボキシ-シクロプロパン：Bip、ビフェニルアラニン：n-Bu、n-ブトキシカルボニル：Bz、ベンゾイル：Bz(2-カルボキシ) 、2-カルボキシベンゾイル：BU^tGly、タート-ブチルグリシル：BOP、ベンゾトリアゾイル-オキシ-トリス-(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩：Cha、シクロヘキシルアラニン：Chex、1-カルボキシシクロヘキシル：eAHA、ガンマ-アミノヘキサノイル：E3TU、O-ベンゾトリアゾイル-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩：HOBt、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール：Hyp、トランス-4-ヒドロキシプロリニル：hLeu、ホモロイシル：2Nal、2-ナフチルアラニン：NMM、N-メチルモルホリン：Piv、ピボイル:3pyr、3-ピリジルアラニン：Tic、2-カルボキシテトラヒドロキノリル：Tyr(NO₂)、3-ニトロチロシン。 DMF、ジメチルホルムアミド；Fmoc、フルオレニルメトキシカルボニル；HPLC、高速液体クロマトグラフィー；Pfp、ペンタフルオロフェニル；tBoc、タート-ブトキシカルボニル；tBu、タート-ブチル；TFA、トリフルオロ酢酸；Pmc、ペンタメチルクロマン；Pbf、ペンタメチルベンゾフラン；TBTU、2-(1H-ベンズトロトリアゾール-1-イル)-1,1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；Trt、トリチル。 p.Aba、4-アミノベンゾイル；Aib、アミノイソ酪酸；Bip、ビフェニルアラニン；nBu、n-ブチル；Bz、ベンゾイル；Cmpi、カルボキシメチルピペラジン；Deg、ジエチルグリシン；DIPEA、N,N-ジイソプロピル-エチルアミン；HATU、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩；HOAT、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール；Naph、ナフチルアラニン；3.Pyr、3-ピリジイルアラニン；Tyr(NO₂)、3-ニトロ-チロシン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９６２４５８４．０ (32)優先日平成８年11月27日(1996．11．27) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ジョンソントニーイギリスケンブリッジシャーシービー６１ジェイエヌエリーリトルポートブルックサイドグローヴ 10 (72)発明者ハートテランスイギリスケンブリッジシービー３０アールエスクラークマックスウェルロードペリーコート 12

Claims

【特許請求の範囲】 1. 活性部位と相互反応する化合物のライブラリーであって、このライブラリーが、溶液中の化合物類の混合物の２種の直交セットを含み、自己デコンボリューション法のために二次元で表示された相補的コンビナトリアルライブラリー（一次及び二次ライブラリーと称す）を提供し、これによっていずれかの化合物群の活性モチーフを特徴付けることができる、ライブラリー。 2. 下記式の４種の可変基Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを有する化合物類を含むセットを構築する、請求の範囲第１項記載の化合物ライブラリーL1及びL2の相補対： -Bb-Cc-Dd-n(Ee)- これは、各ライブラリーにb×c×d×e＝Mn個の化合物をもたらし、各ライブラリーの個々の同定しうる化合物のあらかじめ定められた数(Q1,Q2)からそれぞれなる混合物のあらかじめ定められた数(P1,P2)があり、ここでL1及びL2は両方共、同じMn個の化合物を含むが、L1のQ1個の化合物の１種の混合物中に一緒に認められるいずれか２種の化合物が、L2のP2個の混合物のいずれか１種において一緒に認めらることはないような、相補対。 3. 穴に加えられた活性部位と、この穴内の混合物の１種以上の化合物との相互作用をスクリーニングする方法であって、請求の範囲第２項記載のライブラリー L1及びL2を用い、ここでL1のP1個の混合物及びL2のP2個の混合物を各々、穴プレートの個々の穴に個別に配置し、この穴プレートが、L1の１個の穴及びL2の１個の穴の中に存在する活性から独自の活性化合物の式を推論することができるように適合されたフォーマットで配列された穴を有する、方法。 4. 前記フォーマットが、下記の一般的デコンボリューションの式を含む、請求の範囲第３項記載の方法： (i)ns＝（Rp・Cp）／（Rs・Cs）・Np (ii)k＝b・c・d・np・e (iii)k＝x・N・np (iv)N＝Rp・Cp (v)K＝X・Rp・Cp・np (vi)b・c・d・e＝X・Rp・Cp (vii)Cp・e＝X (viii)Rp・e＝X（Rp＝Cpの場合）及びここで np＝一次プレートの数 ns＝二次プレートの数 Rp＝一次列の数 Rs＝二次列の数 Cp＝一次行の数 Cs＝二次行の数 K＝化合物の組合せの数 N＝プレート上の穴の数、及び X＝穴当たりの化合物の数。 5. 下記の値の、請求の範囲第４項記載の方法： np＝4 ns＝16 Rp＝8 Rs＝4 Cp＝10 Cs＝5 K＝6400 N＝80 X＝20。 6. 前記活性部位が、酵素、レセプター及び抗体からなる群から選択される、請求の範囲第３項記載の方法。 7. 前記活性部位の、該ライブラリーの化合物との相互作用が、基質又は阻害剤の酵素との相互作用、リガンドとレセプターとの相互作用、及び抗原又は抗原決定基と抗体との相互作用からなる群から選択される、請求の範囲第６項記載の方法。 8. 前記活性部位が、下記の酵素クラスからなる群から選択される、請求の範囲第６項記載の方法： 1.酸化還元酵素 a)脱水素酵素 b)酸化酵素 c)ペルオキシダーゼ d)カタラーゼ 2.加水分解酵素 f)ペプチダーゼ（タンパク質分解酵素） 3.転移酵素 g)アミノトランスフェラーゼ h)キナーゼ i)グルコシルトランスフェラーゼ 4.脱離酵素 j)脱炭酸酵素 k)脱水酵素 5.異性化酵素 l)ラセミ化酵素 m)ムターゼ 6.リガーゼ n)シンテターゼ o)カルボキシラーゼ。 9. 前記活性部位が、下記からなる群から選択されたプロテアーゼである、請求の範囲第８項記載の方法： 1.アスパラチルプロテアーゼ、例えば、レニン、HIV、カテプシンＤ、及びカテプシンＥなど。 2.メタロプロテアーゼ、例えば、ECE、ゲラチナーゼＡ及びＢ、コラゲナーゼ、ストロメライシンなど。 3.システイニルプロテアーゼ、例えば、アポパイン、ICI、DerPI、カテプシンＢ、カテプシンＫなど。 4.セリンプロテアーゼ、例えば、トロンビン、VIIa因子、Xa因子、エラスターゼ、トリプシン。 5.トレオニルプロテアーゼ、例えば、プロテアソームS。 10．前記活性部位が、キナーゼであり、かつ前記相互作用が、キナーゼの基質又は阻害剤との作用である、請求の範囲第３項記載の方法。 11．前記活性部位が、レセプターであり、かつ前記相互作用が、リガンドとの作用である、請求の範囲第３項記載の方法。 12．前記活性部位が、抗体であり、かつ前記相互作用が、抗原又は抗原決定基との作用である、請求の範囲第３項記載の方法。 13．前記一次ライブラリーL1の全ての穴の中の化合物類の混合物が、最初の2種の可変基の全ての変形を含み、かつ各穴が、他の２種の可変基の独自の対を含み；かつここで、前記二次ライブラリーL2の全ての穴の中の化合物類の混合物が、他の２種の可変基の全ての変形を含み、かつ各穴が、最初の２種の可変基の独自の対を含む、請求の範囲第３項記載の方法。 14．前記一次ライブラリーが、可変基Ｂ及びＥの全ての変形、及び可変基Ｃ及びＤの独自の対を含み；かつ前記二次ライブラリーが、可変基Ｃ及びＤの全ての変形、及び可変基Ｂ及びＥの独自の対を含む、請求の範囲第13項記載の方法。 15．請求の範囲第１又は２項に従ってライブラリーを形成する工程、これらのライブラリーを、請求の範囲第３又は４のフォーマットにおいて穴プレートの穴内に配置する工程、これらの穴に活性部位を適用する工程、該活性部位と、一次ライブラリーL1及び二次ライブラリーL2の穴中の混合物の１種以上の化合物との相互作用をスクリーニングする工程、並びにそれぞれのL1及びL2の穴位置から独自の活性化合物の式を推論する工程を含む、請求の範囲第３又は４項記載の方法。