JP2000513223A

JP2000513223A - 真菌中で発現される異種遺伝子中の陰性スプライス部位の変更

Info

Publication number: JP2000513223A
Application number: JP10503329A
Authority: JP
Inventors: アントンプソン，シェリル
Original assignee: ノボノルディスクバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1996-06-27
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2000-10-10
Also published as: AU3403197A; EP0912748A1; ATE336585T1; DE69736520T2; WO1997049821A1; DE69736520D1; EP0912748B1; DK0912748T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸配列中の少なくとも１つの陰性スプライス部位が変更されている異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る真菌宿主細胞を獲得する方法に関する。本発明は、変更された陰性スプライス部位を有する核酸配列、前記核酸配列を含んで成る核酸構成物、ベクターおよび宿主細胞にも関する。本発明は更に、前記核酸配列によりコードされるポリペプチドの組換え生産方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】真菌中で発現される異種遺伝子中の陰性スプライス部位の変更発明の背景発明の分野本発明は、異種タンパク質（非相同タンパク質）をコードする核酸配列であってその中の少なくとも１つの陰性スプライス部位が変更されている核酸配列を含んで成る組換え真菌宿主細胞を獲得する方法に関する。本発明は、変更された１または複数の陰性スプライス部位を有する単離された核酸配列、並びに前記核酸配列を含んで成る核酸構成物、ベクターおよび組換え宿主細胞にも関する。本発明は更に、前記核酸配列によりコードされるポリペプチドの組換え生産方法にも関する。関連技術の記載真核遺伝子は、機能的なｍＲＮＡを産生するために前駆転写物中で変更されなければならない介在配列（イントロン）によって中断されていることがある。このイントロン除去過程はプレｍＲＮＡスプライシングとして知られている。一般に、ループの形成を経たイントロンスプライシングにはイントロンの分枝点配列が必要である。スプライシングシグナルはイントロンスプライス部位の境界のところにある。イントロンスプライス部位の境界には、それらの５’末端と３’末端にそれぞれ共通イントロン配列ＧＴおよびＡＧがある。ＡＧ以外の３’スプライス部位は１つも報告されていないが、５’ＧＴスプライス部位には幾つかの例外の報告がある。例えば、５’境界にＧＴの代わりにＣＴまたはＧＣが存在するという先例がある。ＧＴに続くものとしてヌクレオチド塩基ＡＮＧＴ（ここでＮはＡ，Ｃ，ＧまたはＴであり、サッカロミセス種では主としてＡまたはＴである）が強く優先されるが、ＧＴスプライス部位の前にくるものとしていずれかの特定のヌクレオチドが著しく優先されるわけではない。３’スプライス部位ＡＧの前には主にピリミジンヌクレオチド塩基（Ｐｙ）、即ちＣまたはＴがある。真菌遺伝子を中断し得るイントロンの数は１から１２個またはそれ以上のイントロンにまで及ぶ（RymondおよびRosbash，1992，E.W．Jones，J.R．Pringle & J.R．Broach編、The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharom yces, 143-192頁、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New Yor k；Gurr他，1987，Kinghorn，J.R.編、Gene Structure in Eukaryotic Microbes ，93-139頁，IRL Press，Oxford）。それらは遺伝子の全体に分散していることもありまたは５’もしくは３’末端のほうに偏っていることもある。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、主に遺伝子の５’末端にイントロンが存在する。イントロンは通常サイズが１kb未満であり、酵母では通常400bp未満であり糸状菌では100bp未満である。サッカロミセス・セレビシェのイントロン分枝点配列５’−ＴＡＣＴＡＡＣ− ３’は、糸状菌イントロン中にそのまま存在するのはまれである（Gurr他，1987 ，前掲）。糸状菌イントロン中の同等の場所に、ＴＡＣＴＡＡＣに非常に良くまたは大まかに似ている、一般的共通配列ＮＲＣＴＲＡＣ（ここでＮはＡ，Ｃ，ＧまたはＴであり、そしてＲはＡまたはＧである）を有する連続配列が見られる。例えば、４番目のＴはニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）およびアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）の両推定共通配列中で不変である。更に、３，６および７番目の位置は80％以上でそれぞれヌクレオチドＧ，ＡおよびＣが優勢である。しかし、アスペルギルス・ニデュランスの第７位はより自由であり、65％のＣしか存在しない。しかしながら、ニューロスポラ・クラッサとアスペルギルス・ニデュランスの両方とも１，２，５および８番目の位置のヌクレオチドはあまり厳密でない。その他の糸状菌もそれらのイントロン中の同等の位置に類似した分枝点配列を有するが、試料抽出（サンプリング）が少なすぎて何らかの明確な傾向を知ることができない。真菌宿主株中での或るポリペプチドをコードする遺伝子の異種発現は、該遺伝子のコード配列の中の一領域を介在配列またはイントロンとして誤って認識する宿主株を生成することがある。例えば、糸状菌のイントロン含有遺伝子がサッカロミセス・セレビシェ中では不正確にスプライシングされることがわかった（Gu rr他，1987，Kinghorn，J.R.編，Gene Structure in Eukaryotic Microbes, 93- 139頁，IRL Press，Oxford）。該領域はその遺伝子を入手した親株によりイントロンとして認識されないことから、該イントロンは陰性イントロンと呼ばれる。この誤認識はｍＲＮＡ前駆体分子の異常スプライシングを引き起こし、ひいては生物学的に活性なポリペプチドを全く生産しないかまたは異なる生物活性を有するポリペプチド生成物の複数集団を生産することがある。本発明の目的は、ｍＲＮＡ前駆体の誤ったスプライシングを防ぐために遺伝子のコード配列内の陰性スプライス部位を取り除く方法を提供することである。発明の要約本発明は、組換え真菌宿主細胞を獲得する方法であって、異種ポリペプチドをコードする核酸配列であって該配列中の少なくとも１つの陰性スプライス部位が変更されている核酸配列を真菌宿主細胞に導入することを含んで成る方法に関する。一態様では、少なくとも１つの陰性共通配列を非共通配列で置き換えることにより、１または複数の陰性スプライス部位が変更される。別の態様では、少なくとも１つの陰性イントロンまたはその部分を含んで成る第一の領域を、約40％〜約70％の範囲内のＧ＋Ｃ含量を有する第二の領域で置き換えることにより、１または複数の陰性スプライス部位が変更される。更に別の好ましい態様では、１または複数の陰性共通配列を非共有配列で置き換え、且つ少なくとも１つの陰性イントロンまたはその部分を含んで成る第一の領域を約40％〜約70％の範囲内のＧ＋Ｃ含量を有する第二の領域で置き換えることにより、１または複数の陰性スプライス部位が変更される。本発明は、少なくとも１つの変更された陰性スプライス部位を有する核酸配列、並びに前記核酸配列を含んで成る核酸構成物、ベクターおよび宿主細胞にも関する。本発明は更に、前記核酸配列によりコードされるポリペプチドの組換え生産方法にも関する。定義「イントロン」は、本明細書中では、或る遺伝子のコード配列を中断しておりそして一次ｍＲＮＡ転写物から切除される非翻訳介在核酸配列として定義される。「エキソン」は、本明細書中では、転写されそしてポリペプチドに翻訳される遺伝子のセグメントとして定義される。「一次ｍＲＮＡ転写物」は、本明細書中では、転写により生産される一遺伝子のｍＲＮＡ前駆体生成物として定義される。「ＲＮＡスプライシング」は、本明細書中では、一次ｍＲＮＡ転写物から転写された１または複数のイントロン配列が切除され、続いて残ったエキソンが連結されてｍＲＮＡ生成物を生成することを意味する。「陰性イントロン」とは、本明細書中では、一次ｍＲＮＡ転写物から切除されるイントロンと誤って認識されるコード配列として定義される。陰性イントロンは好ましくは10〜1500ヌクレオチド、より好ましくは20〜1000ヌクレオチド、更に好ましくは30〜300ヌクレオチド、最も好ましくは30〜100ヌクレオチドを有する。「共通配列」は、本明細書中では、イントロンスプライス部位を含む５’または３’エキソン−イントロン境界のところに通常見つかる核酸配列として定義される。「陰性スプライス部位」は、本明細書中では、異常スプライシングが起こる陰性イントロンの５’または３’境界のいずれかの部位として定義される。「陰性共通配列」は、本明細書中では、陰性スプライス部位を含む陰性イントロンの５’または３’境界のいずれかにおいて通常見つかる核酸配列として定義される。陰性共通配列は好ましくは多くて10個、より好ましくは多くて６個、更に好ましくは３個、最も好ましくは２個のヌクレオチドを有する。「異常スプライシング」は、本明細書中では、一次ｍＲＮＡ転写物から転写された配列の一領域の不正切除として定義され、前記領域は介在核酸配列として誤って認識される。「アミノ酸ゆらぎ位置」は、本明細書中では、真菌宿主細胞の遺伝暗号の縮重のために、別のヌクレオチドによって置き換えることができるヌクレオチド残基として定義される。「組換え真菌宿主細胞」は、本明細書中では、異種核酸配列を含んで成る真菌宿主細胞として定義される。図面の簡単な説明図１はpUC19-GFPの制限地図を示す。図２はpShTh34の作製を示す。図３は、断片Ａ〜Ｄと称する陰性イントロン領域を有するGFP cDNA配列（配列番号２０）を示す。図４はpShTh49の作製を示す。図５はpShTh58.1の作製を示す。図６は形質転換体ShTh581.1により生産されるGFPの蛍光スペクトルを示す。図７はpShTh58.2の制限地図を示す。図８は形質転換体ShTh582.1により生産されるGFPの蛍光スペクトルを示す。発明の詳細な説明本発明は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列であって該核酸配列中の少なくとも１つの陰性スプライス部位が変更されている核酸配列を真菌宿主細胞中に導入することを含んで成る、組換え真菌宿主細胞を獲得する方法に関する。前記核酸配列はゲノム配列並びに対応するｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列であることができる。核酸配列は好ましくはｃＤＮＡ配列である。陰性スプライス部位は、組換え真菌宿主細胞中で生産される異種ポリペプチドをコードする異種ｍＲＮＡ、または前記ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを、親細胞から得られたｍＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡと比較することにより、同定することができる。親細胞は異種ｍＲＮＡの起源である。あるいは、陰性スプライス部位は、親細胞の核酸配列およびそれの推定アミノ酸配列と比較することにより、真菌宿主細胞中で該核酸配列によりコードされる異種ポリペプチドのアミノ酸配列から同定することができる。陰性スプライス部位は真正の真菌イントロンスプライス部位の共通イントロン配列または境界部についての知識を使って同定することもできる（Rymond & Rosbash，1992，前掲；Gurr他， 1987，前掲）。陰性スプライス部位は、１もしくは複数の陰性共通配列を非共通配列で置き換え、そして／または、１もしくは複数の陰性イントロンもしくはその一部分を含む第一の領域を、約40〜約70％、好ましくは約40〜約60％、より好ましくは約40〜約50％の範囲のＧ＋Ｃ含量を有する第二の領域で置き換えることにより、変更することができる。５’および３’陰性共通配列は当業界で周知の方法によって非共通配列により置き換えることができる。そのような方法としては、オリゴヌクレオチド指令変異誘発、相同組換え、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ変異誘発および化学合成が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい態様では、５’陰性共通配列はＧＴ，ＧＣまたはＣＴであり、そして３’陰性共通配列はＡＧである。より好ましい態様では、５’陰性共通配列はＧＴＡＮＧＴ，ＧＣＡＮＧＴまたはＣＴＡＮＧＴである（ここでＮはＡ，Ｃ，ＧまたはＴである）。別のより好ましい態様では、３’陰性共通配列がＣＡＧ，ＴＡＧまたはＡＡＧである。複数の合成断片があれば、当業界で既知の方法を使ってそれらの断片を一緒にアニールして１つの断片にすることができる。次いで、合成断片を取り囲む核酸配列の残りの５’および３’部分を、該遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使って増幅せしめることにより、完全なコード配列を再構成することができる。陰性共通配列のヌクレオチドを置換するためのヌクレオチドの選択は、好ましくは、真菌宿主細胞であるアスペルギルスについて次頁に示される表１のようなコドン用法表に基づく。陰性共通配列は、好ましくは、アミノ酸ゆらぎ位置に相当するヌクレオチドが同一アミノ酸を与える別のヌクレオチドで置き換えられている非共通配列によって置換される。陰性イントロンまたはその一部分を含む第一の領域を第二の領域で置き換える方法は、陰性共通配列を非陰性配列で置き換えることについて上述したのと同じ方法を使って達成することができる。一態様では、第二領域が第一領域と同じ数のヌクレオチドを有する。好ましい態様では、第一および第二の領域が、陰性イントロンの５’および／または３’境界に隣接する10〜500ヌクレオチド、より好ましくは10〜200ヌクレオチド、最も好ましくは10〜100ヌクレオチドを有する。陰性イントロンには、分枝点配列は存在してもしなくてもよい。好ましい態様では、陰性イントロン配列は少なくとも７ヌクレオチドの分枝点配列ａ−ｂ−ｃ −ｄ−ｅ−ｇ−ｆ（ここでａはＡ，Ｃ，ＧまたはＴであり；ｂはＡまたはＧであり；ｃはＣであり；ｄはＴであり；ｅはＡまたはＴであり；ｆはＡであり；そしてｇはＣである）を含んで成る。より好ましい態様では、分枝点配列は少なくとも７ヌクレオチドａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ（ここでａはＡ，Ｃ，ＧまたはＴであり；ｂはＡであり；ｃはＣであり；ｄはＴであり；ｅはＡであり；ｆはＡであり；そしてｇはＣである）を含む。好ましい態様では、真菌宿主細胞により生産される異種ポリペプチドのアミノ酸配列が、野性型ポリペプチドのアミノ酸配列と同一である。別の好ましい態様では、真菌宿主細胞により生産される異種ポリペプチドのアミノ酸残基数が、野性型ポリペプチドのアミノ酸残基数と同一である。別の好ましい態様では、１または複数の非共通配列が１または複数の陰性共通配列と同じヌクレオチド数を有する。組換え真菌宿主細胞により生産される異種ポリペプチドのアミノ酸配列は、１もしくは複数のアミノ酸残基の挿入もしくは削除および／または別のアミノ酸残基による１もしくは複数のアミノ酸残基の置換により、野性型ポリペプチドのアミノ酸配列と異なってもよい。好ましくは、アミノ酸変更が重要でない性質のもの、すなわちタンパク質の折り畳みまたは活性に有意な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換；小規模の欠失、典型的には１〜約30アミノ酸の欠失；小規模のアミノ末端もしくはカルボキシル末端伸長、例えば１つのアミノ末端メチオニン残基の付加、約20〜25残基までの小型リンカーペプチドの付加、または精製を容易にする小規模の伸長、例えばポリヒスチジン領域、抗原性エピトープもしくは結合ドメインの付加である。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）および小型アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）のグループ内である。「異種ポリペプチド」という用語は、コードされる生成物の特定の長さを指して言う意味ではなく、従ってペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を包含する。更に、「異種ポリペプチド」という語は一緒になって生成物を構成する２以上のポリペプチドを包含することができる。異種ポリペプチドは原核生物起源（例えば、バシラス種由来のヒドロラーゼ、すなわちα−アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼなど）、真核生物起源（例えば、ヒトインスリン、ヒト成長ホルモン、ウシキモシン、第VIII因子、緑蛍光タンパク質など）、および前記真菌宿主以外の真菌起源〔例えばミセリオフトラ（Myceliophthora）ラッカーゼ、ポリポラス（Polyporus）ラッカーゼ、コプリナス（Coprinus）ペルオキシダーゼ、フミコラ（Humicola）リパーゼ、アスペルギルス（Aspergillus）アミラーゼなど〕から得ることができる。異種ポリペプチドは、少なくとも１つが真菌宿主にとって異種である少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られた部分または完全ポリペプチド配列の組合せを含んで成る、「ハイブリッド」ポリペプチドも包含することができる〔例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼのシグナルペプチドおよびプロペプチドをコードする核酸配列に融合せしめたミセリオフトラ（Myceliophthora）ラッカーゼをコードする核酸配列〕。異種ポリペプチドは更に、上述したポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体および遺伝子操作された変異体を包含することができる。好ましくは、異種ポリペプチドはホルモン、酵素、レセプターまたはレポーターである。より好ましい態様では、異種ポリペプチドはオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼである。更に好ましい態様では、異種ポリペプチドはアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼまたはキシラナーゼである。別の更に好ましい態様では、異種ポリペプチドがエクオレア・ビクトリア（Ae quorea victoria ；クラゲ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰは、エシェリキア・コリ（Escherichia coli；大腸菌）、酵母、植物細胞、蠕虫、ハエおよび哺乳動物をはじめとする広域の生物スペクトルにおいて、生体内での遺伝子発現やタンパク質限局化を目で見えるようにする万能レポーターとして多数の望ましい特性を有する（Chalfie他，1994，Science 263:802-805；Delagrave他，1995，Bio/Technol ogy 13:151-154；Heim他，1995，Nature 373:663-664；Sheen他，1995，Plant J ournal 8:777-784；Prasher，1995，TIG 8:320-323；Haseloff & Amos，1995 ，TIG 8:328-329）。糸状菌における遺伝子発現のレポーターとしてのＧＦＰの使用は今までに報告されていない。本発明は、本発明の方法により作製された、１または複数の変更された陰性スプライス部位を有する１または複数の単離された核酸配列にも関する。１または複数の変更された陰性スプライス部位を有する１または複数の単離された核酸配列は、ゲノム配列だけでなく対応するｃＤＮＡ配列とＲＮＡ配列も更に包含するので、本明細書中で用いる「核酸配列」という語句は、合成ＤＮＡを含むそのような変形を全て包含するものと解釈されるだろう。本発明はまた、前記１または複数の核酸配列を含んで成る核酸構成物にも関する。「核酸構成物」は一般に、天然の遺伝子から単離されるか、または、天然に存在しないはずの形で組み合わされそして連結された核酸のセグメントを含むように変更されている、一本鎖か二本鎖のいずれかの核酸分子を意味すると解釈すべきである。本発明の核酸構成物中、核酸配列はゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のものであることができる。本発明は更に、本発明の核酸構成物を含んで成る組換え発現ベクターにも関する。組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ操作に上手くかけることができ且つ少なくとも１つの変更された陰性スプライス部位を有する核酸配列の発現を引き起こすことができる任意のベクターである。ベクターの選択は典型的にはベクターを導入しようとする真菌宿主細胞とベクターとの適合性によるだろう。ベクターは直鎖状または閉環状プラスミドであることができる。ベクター系は、単一のベクターであるか、または真菌宿主のゲノム中に導入すべき全ＤＮＡを共同して含有する２以上のベクターもしくはプラスミドであることができる。該ベクターは自己複製ベクター、即ちその複製が染色体複製から独立している染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソームまたは人工クロモソームであることができる。ベクターは自己複製を保証するための任意の手段を含んでもよい。あるいは、ベクターは真菌細胞に導入されるとそのゲノムに組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。ベクターの組み込みは、少なくとも１つの変更された陰性スプライス部位を有する核酸配列、または相同もしくは非相同組換えによるゲノム中への該ベクターの安定な組み込みのための該ベクターの別のいずれかの要素によることができる。あるいは、ベクターは、真菌宿主のゲノム中への相同組換えによる組み込みを指令する追加の核酸配列を含んでもよい。この追加の核酸配列は、ベクターが染色体中の的確な位置で宿主細胞ゲノムに組み込まれるようにする。的確な位置での組み込みの公算を高めるためには、好ましくは個々が十分な核酸数、好ましくは400bp〜1500bp、より好ましくは800bp〜10 00bpを含有し、且つ相同組換えの確率を高めるために対応する標的配列と高度に相同である、２つの核酸配列が存在すべきである。それらの核酸配列は、真菌宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であることができ、更に、非コード配列またはコード配列であることができる。自己複製のために、ベクターは問題の宿主細胞中で該ベクターを自律的に複製できるようにする複製開始点を更に含んでもよい。酵母宿主細胞中で用いられる複製開始点の例は、２ミクロン複製開始点、およびＣＥＮ３とＡＲＳ１の組合せである。選択された真菌宿主細胞に適合する任意の複製開始点を用いることができる。本発明のベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の選択を容易にする１または複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、抗生物質耐性もしくはウイルス耐性、重金属に対する耐性、原栄養体から独立栄養体への変換などに備える生成物をコードする遺伝子である。選択マーカーは、amdS（アセトアミダーゼ）、argB（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、bar （ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、hygB（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、niaD（硝酸レダクターゼ）、pyrG（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、sC（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびtrpC（アントラニル酸シンターゼ）を非限定的に含んで成る群より選ぶことができる。アスペルギルス細胞中での使用には、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus ni dulans ）またはアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のamdSおよびpy rG マーカー並びにストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygro scopicus ）のbar マーカーが好ましい。更に、選択マーカーが別個のベクター上に存在する場合には例えばWO 91/17243に記載された通りに、同時形質転換によって選択を行うことができる。ベクター中、少なくとも１つの変更されたスプライス部位を含んで成る核酸配列は、該核酸配列のコード配列の発現に必要である調節配列に作用可能に連結される。「調節配列」という語は、その存在が核酸配列のコード配列の発現に必要または有益である全ての成分を包含するものである。調節配列は異種ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来であってもよく、または外来起源から得てもよい。そのような調節配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列および転写ターミネーターが挙げられるが、それらに限定されない。最小限、調節配列はプロモーター並びに転写および翻訳終止シグナルを含む。調節配列の支配下での発現のためには、本発明に従って使用する予定の遺伝子が、調節配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような形で該調節配列に作用可能に連結される。「コード配列」という用語は、上述の調節配列の調節下に置かれた時にｍＲＮＡに転写されそして異種ポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’末端側は翻訳開始コドンにより決定されそして３’末端側は翻訳終止コドンにより決定される。コード配列としては、非限定的に、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換え核酸配列が挙げられる。上述したように、本発明の核酸配列は適当なプロモーター配列に作用可能に連結せしめることができる。プロモーター配列は、核酸配列の発現用の真菌宿主細胞により認識される核酸配列を含む。プロモーター配列は異種ポリペプチドの発現を媒介する転写および翻訳調節配列を含む。プロモーターは着目の真菌宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、宿主細胞にとって相同または非相同（異種）であるポリペプチドをコードする遺伝子から誘導することができる。糸状菌宿主細胞中での本発明の核酸構成物の転写を指令するのに適当なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）TAKA アミラーゼ、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）酸安定性α− アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）もしくはアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）グルコアミラーゼ（glaA）、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae ）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Aspe rgillus oryzae ）トリオースリン酸イソメラーゼ、またはアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーター、およびそれらのハイブリッドである。酵母宿主の場合、有用なプロモーターはサッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（eno- ｌ）プロモーターである。特に好ましいプロモーターはTAKAアミラーゼ、NA2-tpi（アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターとアスペルギルス・オリゼのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターとのハイブリッド）、およびgl aA プロモーターである。本発明の核酸配列は、その３’末端のところでターミネーター配列に作用可能に連結されてもよい。ターミネーター配列は異種ポリペプチドをコードする核酸配列にとって生来であってもよく、または外来起源より得てもよい。所望の真菌宿主細胞中で機能的である任意のターミネーターを本発明において使用することができるが、特に好ましいターミネーターはアスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼ、およびサッカロミセス・セレビシェのエノラーゼをコードする遺伝子から得られる。本発明の核酸配列は適当なリーダー配列に作用可能に連結されてもよい。リーダー配列は真菌宿主による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は異種ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作用可能に連結される。リーダー配列は異種ポリペプチドをコードする核酸配列にとって生来であってもよく、または外来起源より得てもよい。真菌宿主細胞中で機能的である任意のリーダー配列を本発明において使用することができるけれども、特に好ましいリーダーはアスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼ、およびアスペルギルス・オリゼのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子から得られる。ポリアデニル化配列を本発明の核酸配列の３’末端に作用可能に連結させることもできる。ポリアデニル化配列は、転写されると真菌宿主により認識されて、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加する配列である。ポリアデニル化配列は異種ポリペプチドをコードする核酸配列にとって生来であってもよく、または外来起源より得てもよい。特定の真菌宿主細胞中で機能的である任意のポリアデニル化配列を本発明において使用することができるけれども、特に好ましいポリアデニル化配列はアスペルギルス・オリゼのTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアントラニル酸シンターゼ、およびアスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。異種発現されるポリペプチドを獲得するため細胞を破壊する必要性を無くすために、そして細胞内で発現された該ペプチドの起こりうる分解の量を最少にするために、ポリペプチド遺伝子の発現が細胞の外側に分泌される生成物を生じることが好ましい。このために、本発明の異種ポリペプチドを、該ポリペプチドのアミノ末端に結合された形でシグナルペプチドに連結せしめることができる。シグナルペプチドは、真菌宿主から培地中への異種ポリペプチドの分泌を可能にするアミノ酸配列である。シグナルペプチドは本発明の異種ポリペプチドにとって生来のものであるか、または外来起源より得ることができる。本発明の核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌型異種ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み枠内に生来連結されているシグナルペプチドコード領域を含むことができる。あるいは、コード配列の５’末端は、分泌型異種ポリペプチドをコードするコード配列の当該部分に対して外来である、シグナルペプチドコード領域を含んでもよい。外来シグナルペプチドは、コード配列がシグナルペプチドコード領域を通常含まない場合に必要とされることがある。あるいは、外来シグナルペプチドは、所望の異種ポリペプチドの分泌を増強するために生来のシグナルペプチドと単純に置き換えてもよい。外来シグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス種由来のグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）由来のリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のα因子遺伝子または子牛プレプロキモシン遺伝子から得ることができる。真菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドは、アスペルギルス・オリゼ（Aspergil lus oryzae ）TAKAアミラーゼシグナル、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）中性アミラーゼシグナル、リゾムーコル・ミーヘイ（Rhizomucor mie hei ）アスパラギン酸プロテイナーゼシグナル、フミコラ・ラヌギノザス（Humic ola lanuginosus ）セルラーゼシグナル、またはリゾムーコル・ミーヘイ（Rhizo mucor miehei ）リパーゼシグナルである。しかしながら、特定の真菌宿主において異種ポリペプチドを分泌させることができるどんなシグナルペプチドでも、本発明において使用することができる。本発明の核酸配列はプロポリペプチドコード領域に連結せしめることもできる。プロペプチドはアプロポリペプチドまたはプロ酵素のアミノ末端に見つかるアミノ酸配列である。プロポリペプチドからのプロペプチドの開裂が生化学的に活性である成熟ポリペプチドを生産する。前記連結の結果得られるポリペプチドはプロポリペプチドまたはプロ酵素（ある場合にはチモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは通常不活性であり、プロポリペプチドまたはプロ酵素からのプロペプチドの触媒的または自己触媒的開裂によってはじめて活性な成熟ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は異種ポリペプチドにとって生来のものであるかまたは外来起源より得ることができる。外来プロペプチドコード領域は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）α−因子遺伝子からまたはミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceli ophthora thermophila ）ラッカーゼ遺伝子から得ることができる（WO 95/33836 ）。上述した各要素を連結せしめて本発明の組換え発現ベクターを作製するのに使う方法は、当業者に周知である（例えば、Sambrook他，Molecular Cloning ，A L aboratory Manual ，第２版，Cold Spring Harbor，New York，1989を参照のこと）。本発明はまた、本発明の組換えベクターと共に用いるのに有利である、本発明の方法により生産される組換え真菌宿主細胞にも関する。好ましくは、本発明の核酸配列を含んで成るベクターを用いて真菌宿主細胞が形質転換せしめられ、次いで該ベクターが宿主染色体中に組み込まれる。「形質転換」とは、少なくとも１つの変更された陰性スプライス部位を有する核酸配列を含んで成るベクターを、該ベクターが宿主組み込み型ベクターとしてまたは自己複製性染色体外ベクターとして維持されるように、真菌宿主細胞に導入することを意味する。たぶん核酸配列が細胞内で安定に維持されるだろうから、組み込みが一般に有利であると考えられる。宿主染色体中へのベクターの組み込みは、上述したような相同または非相同組換えにより起こってもよい。真菌宿主細胞の選択は、異種ポリペプチドをコードする遺伝子およびそれの起源に大方依存するだろう。真菌宿主細胞は酵母細胞または糸状菌細胞であることができる。本明細書中で用いる「酵母」は、子嚢胞子性酵母（エンドミセス目Endomyceta les）、担子胞子性酵母、および不完全菌類に属する酵母（ブラストミセス綱）を包含する。子嚢胞子性酵母はスペルモフトラ科とサッカロミセス科に分かれる。後者は４つの亜科、すなわちシゾサッカロミセス亜科（例えばシゾサッカロミセス属）、ナドソニア亜科、リポマイセス亜科およびサッカロミセス亜科（例えばピヒア属、クルイベロミセス属およびサッカロミセス属）から構成される。担子胞子性酵母は、ロイコスポリジウム属、ロドスポリジウム属、スポリジオボラス属、フィロバシジウム属およびフィロバシディエラ属を包含する。不完全菌類に属する酵母は２つの科、すなわちスポロボロミセス科（例えばスポロボロミセス属およびブレラ属）およびクリプトコッカス科（例えばカンジダ属）に分けられる。酵母の分類は将来変わる可能性があるので、本発明の目的上、酵母はBiol ogy and Activities of Yeast （SKinner，F.A.，Passmore，S.M.およびDavenpor t，R.R，編、Soc．App．Bacteriol．Symposium Series No．9，1980）に記載のごとく定義される。酵母の生物学および酵母遺伝子の操作は当業界で周知である（例えば、Biochemistry and Genetics of Yeast，Bacil，M.，Horecker，B.J．およびStopani，A.O.M．編、第２版，1987；The Yeasts，Rose，A．H.およびHar rison，J.S.編、第２版，1987；The Molecular Biology of the Yeast Saccharo myces ，Strathern他編、1981を参照のこと）。本明細書中で用いる「真菌」は、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門および接合菌門（Hawksworth他、Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 第８版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UKにより定義されている）並びに卵菌門（Hawksworth他，1995，前掲中に記載）および全ての有糸分裂性真菌（Hawksworth他，1995，前掲）を包含する。子嚢菌門の代表的な属としては、例えば、ニューロスポラ、ユーペニシリウム（＝ペニシリウム）、エメリセラ（＝アスペルギルス）、ユーロチウム（＝アスペルギルス）および上述した真正酵母菌が挙げられる。担子菌門の例としては、キノコ類、サビ菌類および黒穂病菌類が挙げられる。ツボカビ門の代表的群としては、例えば、アロミセス類、ブラストクラジエラ（厚壁嚢菌）類、コエロミセス（分生子果不完全菌）類、および水生菌類が挙げられる。卵菌門の代表的群としては、例えば、ミズカビ鋼の水生菌類（ミズカビ）、例えばワタカビ（Achlya）が挙げられる。有糸分裂性真菌類の例としては、アスペルギルス、ペニシリウム、カンジダおよびアルテルナリアが挙げられる。接合菌門の代表的群としてはリゾプスおよびムーコルが挙げられる。「糸状菌」は、真菌亜門および卵菌亜門（Hawksworth他，1995，前掲により定義された通り）の全ての繊維状形態を包含する。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複合多糖類から構成される栄養菌糸によって特徴づけられる。栄養増殖は菌糸の伸長により起こるのであり、炭素異化作用は偏性好気的である。対照的に、サッカロミセス・セレビシエのような酵母による栄養増殖は単細胞葉状体の出芽によるのであり、炭素異化作用は醗酵的であることができる。一態様では、真菌宿主細胞は酵母細胞である。より好ましい態様では、酵母宿主細胞がカンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyveromyces ）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharom yces ）、ピヒア（Pichia）、およびヤロウィア（Yarrowia）種の細胞である。最も好ましい態様では、酵母宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomy ces cerevisiae ）細胞、サッカロミセス・カールスバーゲンシス（Saccharomyc es carlsbergensis ）細胞、サッカロミセス・ジアスタティクス（Saccharomyces diastaticus ）細胞、サッカロミセス・ドウグラッシイ（Saccharomyces doug lasii ）細胞、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）細胞、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）細胞またはサッカロミセス・オビフォルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。別の好ましい態様では、酵母宿主細胞がクルイベロミセス・ラクテイス（Kluyveromyces lactis ）細胞である。別の最も好ましい態様では、酵母宿主細胞がヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）である。別の態様では、真菌宿主細胞が糸状菌細胞である。好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、フザリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、ミセリオフトラ（Myceliopht hora ）、ムーコル（Mucor）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリウム（P enicillium ）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、およびトリコデルマ（Trichoderma）種の細胞である。更に好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がアスペルギルス細胞である。別の更に好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がアクレモニウム細胞である。別の更に好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がフザリウム細胞である。別の更に好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がフミコラ細胞である。別の更に好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がミセリオフトラ細胞である。更に別のより好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がムーコル細胞である。更に別の好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がニューロスポラ細胞である。別の好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がペニシリウム細胞である。別の好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がチエラビア細胞である。別の好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がトリポクラジウム細胞である。別の好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がトリコデルマ細胞である。最も好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）細胞、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）細胞、アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetidus ）細胞またはアスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillu s japonicus ）細胞である。別の最も好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）細胞またはフザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）細胞である。別の最も好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）細胞またはフミコラ・ラヌギノザス（Humicola lanuginosus）細胞である。別の最も好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora the rmophila ）細胞である。別の最も好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がムーコル・ミーヘイ（Mucor miehei）細胞である。別の最も好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）細胞である。別の最も好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がペニシリウム・プルプロゲナム（Penici llium purpurogenum ）細胞である。別の最も好ましい態様では、糸状菌宿主細胞がチエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）細胞である。別の最も好ましい態様では、トリコデルマ細胞がトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）細胞、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）細胞、トリコデルマ・ハージアナム（Tr ichoderma harzianum ）細胞、またはトリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii ）細胞である。本発明の組換え真菌宿主細胞は、異種ポリペプチドの発現に有利である１または複数の因子、例えば活性化因子（例えばトランス作用性因子）、カペロンおよびプロセシングプロテアーゼ、をコードする１または複数の配列を更に含んでもよい。１または複数のこれらの因子をコードする核酸は、好ましくは、異種ポリペプチドをコードする核酸に作用可能に連結されない。活性化因子は、あるポリペプチドをコードする核酸配列の転写を活性化するタンパク質である（Kudla他，1990，EMBO Journal 9:1355-1364；JaraiおよびBuxton，1994，Current Genet ics 26:2238-244；Verdier，1990，Yeast 6:271-297）。活性化因子をコードする核酸配列は、サッカロミセス・セレビシエのヘム活性化因子タンパク質１（ha p1 ）、サッカロミセス・セレビシエのガラクトース代謝タンパク質４（ga14）およびアスペルギルス・ニデュランスのアンモニア調節タンパク質（areA）をコードする遺伝子から得ることができる。他の例については、Verdier,1990，前掲と、MacKenzie他，1993，Journal of General Microbiology 139:2295-2307を参照のこと。カペロン（chaperone）は、別のポリペプチドが正しく折り畳むのを助けるタンパク質である（Hartl他，1994，TIBS 19:20-25；Bergeron他，1994，TI BS 19:124-128；Demolder他，1994，Journal of Biotechnology 32:179-189;Cra ig，1993，Science 260:1902-1903；Gething & Sambrook，1992，Nature 355:33 -45；Puig & Gilbert， 1994，Journal of Biological Chemistry 269:7764-7771；Wang & Tsou，1993 ，The FASEB Journal 7:1515-11157；Robinson他，1994，Bio/Technology 1:381 -384）。カペロンをコードする核酸配列は、アスペルギルス・オリゼのプロテインジスルフィドイソメラーゼ、サッカロミセス・セレビシエのカルネキシン、サッカロミセス・セレビシエのBiP/GRP78、およびサッカロミセス・セレビシエのH sp70をコードする遺伝子から得ることができる。その他の例については、Gethin g & Sambrook，1992，前掲と、Hartl他，1994，前掲を参照のこと。プロセシングプロテアーゼは、プロペプチドを開裂せしめて生化学的に活性な成熟ポリペプチドを生成するプロテアーゼである（Enderlin & Ogrydziak，1994，Yeast 10:6 7-79；Fuller他，1989，Proceedings of the National Academy of Sciences US A 86:1434-1438；Julius他，1984，Cell 37:1075-1089；Julius他，1983，Cell 32:839-852）。プロセシングプロテアーゼをコードする核酸配列は、アスペルギルス・ニガーのKex2、サッカロミセス・セレビシエのジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロミセス・セレビシエのKex2、およびヤロウィア・リポリティカの二塩基性プロセシングエンドプロテアーゼ（xpr6）をコードする遺伝子から得ることができる。選択した真菌宿主細胞中で機能的であるどんな因子でも本発明において用いることができる。真菌細胞は、それ自体既知の方法でのプロトプラスト形成、該プロトプラストの形質転換および細胞壁の再生を含んで成る方法により形質転換せしめることができる。アスペルギルス宿主細胞の適当な形質転換方法はEP 238 023およびYelt on他，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470- 1474に記載されている。フザリウム種の適当な形質転換方法は、Malardier他，1 989，Gene 78:147-156または同時係属米国出願第08／269,449号明細書中に記載されている。酵母は、BeckerおよびGuarente，Abelson，J.N & S imon，M.I.編，“Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology”，Methods in Enzymology 第194巻，182-187頁，Academic Press，Inc.，New York；Ito他，1983，Journal of Bacteriology 153:163；Hinnen他，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920により記載された手法を使って形質転換せしめることができる。本発明はまた、異種ポリペプチドの生産方法であって、前記異種ポリペプチドの発現を誘導する条件下で組換え真菌宿主細胞を培養することを含んで成る方法に関する。本発明の真菌細胞を、当業界で既知の方法を使って前記異種ポリペプチドの生産に適当な栄養培地中で培養する。例えば、異種ポリペプチドを発現および／または単離可能にする条件下で且つ適当な培地中で行われる、振盪フラスコ培養、小規模または大規模醗酵（連続培養、バッチ培養、フェドバッチ培養、または固相培養を含む）により、実験用または工業用醗酵槽中で該細胞を培養することができる。培養は、当業界で既知の方法を使って、炭素源および窒素源並びに無機塩類を含んで成る適当な栄養培地中で行われる（例えば、Bennett，J.W ．& LaSure，L.編，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA， 1991を参照のこと）。適当な培地は販売業者から入手可能であるかまたは発表された培地組成に従って（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）のカタログに記載されるような）調製することができる。異種ポリペプチドが栄養培地中に分泌されるならば、該ポリペプチドは培地から直接回収することができる。もし異種ポリペプチドが分泌されないならば、それは細胞溶解物から回収される。発現された異種ポリペプチドは、特定のポリペプチドに対して特異的である周知の方法を使って検出することができる。これらの検出方法としては、特異抗体の使用、酵素生成物の形成、または酵素基質の消失を挙げることができる。例えば、異種ポリペプチドが酵素活性を有する場合には、エンザイムアッセイを使用できる。あるいは、異種ポリペプチドに対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体が入手可能であれば、該ポリペプチドに対する抗体を使ったイムノアッセイを使用することができる。エンザイムアッセイやイムノアッセイの技術は当業者に公知である。得られた異種ポリペプチドは周知の方法により回収することができる。例えば、該ポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈澱をはじめとする常用手順により、栄養培地から回収することができる。回収されたポリペプチドは、次いで種々のクロマトグラフィー技術、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により更に精製することができる。実施例実施例１：オリゴヌクレオチドプライマー製造業者の指示に従ってApplied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成装置（Ap plied Biosystems，Inc.，Foster City，CA）を使って、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを合成する。実施例２：ＤＮＡ配列決定ヌクレオチド配列は、Applied Biosystems Model 373A自動ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA）を使用して、M13逆(-48)プライマーとM13正(-20)プライマー（New England Biol abs，Beverly，MA）並びに配列決定しようとするＤＮＡに特異的であるプライマーを用い、蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを使ったTaqポリメラーゼサイクル配列決定法により（Giesecke他，1992，Journal of Virol ．Methods 38:47-60）、両方の鎖について決定する。実施例３：クラゲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の分析ＧＦＰの生成はPerkin-Elmer Cetus LS50B蛍光計（Perkin-Elmer Corp.，Norw alk，CT）を使って測定する。具体的には、100μｌのタンパク質抽出液を、Perk in-Elmer Cetus LS50Bプレートリーダー中に置いた96ウエルのマイクロタイタープレートに入れる。抽出液を395nmの光に暴露し、発光スペクトルを400nm〜600n mで読み取る。ＧＦＰフィルターセット（Chroma Technology Corp.，Brattle-boro，VT）を装備したZeiss Axioplan顕微鏡（Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY）を使って菌糸をＧＦＰ蛍光について観察する。実施例４：発現ベクターpShTh34の作製 TAKAアミラーゼプロモーター、シグナル配列およびターミネーターの調節下にＧＦＰ構造遺伝子を配置するために、糸状菌発現ベクターpShTh34を作製する。標準手順（Sambrook他，1989，前掲）によりクラゲ（Aequorea victoria）から単離した全ＲＮＡを、製造業者が推奨する通りに、ＡＭＶ逆転写酵素（Promeg a，Madison，WI）を使ってｃＤＮＡに変換する。次いで以前に発表されたＧＦＰ配列（Prasher他，1992，Gene 111:229-233；GenBank受入れ番号M62653）に基づいてデザインしたＰＣＲプライマーと共にUlTma（商標）ポリメラーゼ（Perkin Elmer，Foster City，CA）を使って、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅せしめる。それらのプライマーの配列は配列番号18と19として上記に示したものである。微変更したpUC19プライマー中へのＰＣＲ増幅済GFP cDNAのクローニングを容易にするために、５’（HindIII部位）プライマーと３’（EcoRI部位とBamHI部位）プライマーに制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入する。この構成物の詳細は、LacZ Shine-Dalgarno AGGAの直後に５’HindIII部位と余分のＴそしてGFPのAT Gコドンが続き、つまりはLacZプロモーター−ＧＦＰの融合点のところに次のＤＮＡ配列：PLacZ−AGGAAAGCTTTATG−GFPを有する。図１に示される通り、GFP cD NAの３’末端側では、発表されたGFP配列中のヌクレオチド770に相当する塩基対が、ＰＣＲ生成BamHI，EcoRIリンカー領域を経由してpUC19多重クローニング部位(MCS)のEcoRI部位に融合せしめられる。実施例１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー95-448と95-449を用いて、鋳型としてpUC19-GFPを使用してＧＦＰ構造遺伝子をＰＣＲ増幅せしめる。増幅反応液は次の成分を含む：dATP，dCTP，dGTPおよびdTTP各々200マイクロモル、鋳型50ng、プライマー各30ピコモル、１×Taqポリメラーゼ緩衝液、およびTaqポリメラーゼ0.5単位（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA）。該反応液を次のようにプログラムされたEricomp Thermal Cycler中でインキュベートする： 94℃で５分を１サイクル；94℃で１分、60℃で１分および74℃で１分を30サイクル；そして74℃で15分を１サイクル。これらのプライマーの使用により、ATG開始コドンのすぐ上流にSfiI制限部位が付加され、そしてGFPの終止コドンのすぐ下流にNsiI部位が付加される。生じた断片を標準アガロース電気泳動法を使って単離する。得られた断片をpMWR1中にサブクローニングして、図２に示されるようなpShTh34を得る。実施例５：pShTh34による糸状菌形質転換 pShTh34をpPyrG（Fungal Genetics Stock Center，Kansas City，KS）と共にアスペルギルス・オリゼHowB104pyrGプロトプラスト中に同時形質転換せしめる。形質転換は、１mlあたりプロトプラスト２×10⁷個の密度のプロトプラストを使って実施する。100μｌのプロトプラストを10μｇ DNAと共に氷上に30分間置いておく。次いで１mlのSPTC（40％PEG4000，0.8Mソルビトール，0.05M Tris pH 8.0，0.05M CaCl₂）を加え、プロトプラストを34℃で20分間インキュベートする。該プロトプラストを最少培地（１ｌにつき、６ｇのNaNO₃，0.52ｇのKCl，1.52 ｇのKH₂PO₄，１mlの微量金属溶液，１ｇのグルコース，500mgのMgSO₄-7H₂O，342 .3ｇのショ糖および20gのノーブル寒天、pH6.5）の入ったプレート上に直接置く。微量金属溶液（1000×）は、１ｌにつき22gのZnSO₄-7H₂O，11gのH₃BO₃，５gの MnCl₂-4H₂O，５ｇのFeSO₃-7H₂O，1.6ｇのCOCl₂-5H₂O，1.6ｇの(NH₄)₆Mo₇O₂₄および50ｇのNa₄EDTAを含んで成る。プレートを37℃で５〜７日間インキュベートする。形質転換体をショ糖を含まない同一培地のプレートに移し、37℃で３〜５日間インキュベートする。同一条件下で同じプレートを使って胞子を画線培養しそして単離されたコロニーを摘み取ることにより、形質転換体を精製する。得られた形質転換体をアスペルギルス・オリゼShTh340と命名する。実施例６：ＧＦＰの抽出実施例５に記載のアスペルギルス・オリゼShTh340形質転換体を、実施例３に記載の蛍光分析によりGFP発現の存否についてスクリーニングする。10個のアスペルギルス・オリゼShTh340-19形質転換体を、１ｌあたり次の成分：50gのマルトース，２ｇのMgSO₄-7H₂O，10ｇのKH₂PO₄，２ｇのK₂SO₄，２ｇのクエン酸，10 ｇの酵母エキス， 0.5mlの実施例５に記載の微量金属溶液，1ｇの尿素および2ｇの(NH₄)₂SO₄を含んで成るMY51培地４ml中で、12ウエルのマイクロタイタープレート上で、37℃で１〜５日間、静置状態で増殖させる。菌糸マットを採り、1.5mlのエッペンドルフ管に移し、ドライアイ（Savant Instruments，Inc.，Farmingdale，NY）の中に置き、室温で一晩真空乾燥する。乾燥培養物を滅菌済ランセットを使って試験管中で粉砕する。粉末状培養物を、１mM PMSFと0.1mMペプスタチンを含む50mMリン酸ナトリウム−0.5M N aCl緩衝液（pH5.5）400μｌ中に再懸濁する。菌糸破片をSorvall超遠心機MC12V 型（DuPont Instruments，Inc.，Newtown，CT）中で最高速度で20分間ペレット化する。上清の200μｌ容量を新しいエッペンドルフ管に移し、実施例３に記載した手順に従ってアッセイする。アスペルギルス・オリゼShTh340-19形質転換体はどれも、検出可能な蛍光を生成しない。実施例７：ｍＲＮＡ分析実施例６に記載のアスペルギルス・オリゼShTh340-19形質転換体から、Timber lakeとBarnardの方法（1981，Cell 26:29-37）により全ＲＮＡを単離する。製造業者の指示に従って3’Race Kit（Bethesda Research Labo-ratories，Ga ithersburg，MD）を使って特異的GFP cDNAを合成する。前記形質転換体から単離した全ＲＮＡ１μｇを、実施例１に記載の特異的５’オリゴヌクレオチドプライマー95-1202と共に３’UAPオリゴヌクレオチドプライマーを使った増幅反応に使用する。増幅反応液は次の成分を含んで成る：dATP，dCTP，dGTPおよびdTTP各々 200マイクロモル、各プライマー１ピコモル、鋳型50ng、１×Taqポリメラーゼ緩衝液、およびTaqポリメラーゼ0.5単位。この反応液を次の通りプログラムされたEricomp Thermal Cycler中でインキュベートする：94℃で５分を１サイクル；94℃で１分、50℃で１分および72℃で１分を30サイクル；そして74℃で５分を１サイクル。センスオリゴヌクレオチドプライマー95 -1202または95-88を実施例１に記載のアンチセンスプライマー95-89または95-65 6のいずれかと組み合わせて使用して、cDNA生成物を嵌め合わせ型（nested）ＰＣＲ増幅にかける。ＰＣＲ条件は上述したものと同じである。ＰＣＲ生成物を製造業者の指示に従ってＴＡクローニングキットを使ってpCRIIの中にクローニングする。次いでQIAwell-8プラスミドキット（Quiagen，Chatsworth，CA）を使って形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、そして実施例２に記載の方法に従ってプラスミド挿入断片を配列決定することにより、形質転換体をスクリーニングする。実施例８：陰性イントロンの同定実施例７に記載した配列決定済サブクローンは３グループに分かれ、下記の表２に記載される（図３、配列番号20）。第一グループは、ＧＦＰコード配列中に断片Ａおよび断片Ｄと命名された２つの欠失部を含む。断片Ａは、配列ＧＴＧを有するヌクレオチド347で始まり（ヌクレオチドＡＴＧがＧＦＰコード配列の第１，２，３位に相当する）、そして配列ＡＡＧを有するヌクレオチド397で終わる。断片Ｄは、配列ＧＴＡを有するヌクレオチド448で始まり、そして配列ＴＡＧを有するヌクレオチド503で終わる。第二グループは断片Ｂと命名された１つの欠失部を含む。断片Ｂは、配列ＧＴＡを有するヌクレオチド380で始まり、そして配列ＣＡＧを有するヌクレオチド463で終わる。第三グループも断片Ｃと命名された単一の欠失部を含む。断片Ｃは、配列ＧＴＡを有するヌクレオチド380 で始まり、そして配列ＴＡＧを有するヌクレオチド503で終わる。上述したヌクレオチドが両端に存在するこれらの欠失断片配列は、予想の共通５ ’および３’スプライス部位を有する糸状菌イントロンとして認識されるための条件を満たすので、おそらくアスペルギルス・オリゼ中でGFP mRNAから誤ってスプライスされた陰性イントロンであろう。実施例９・発現ベクターpShTh49の作製アスペルギルス宿主中でGFP遺伝子を発現させるために、同定された推定陰性スプライス部位を変更する。変更されたGFP遺伝子を含むようなＥ．コリ発現ベクターpShTh49を作製する。具体的には、実施例４に記載したのと同じ条件を使って、実施例１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー95-1422と95-1457を用いて、pUC19-GFPからのGFP遺伝子の５’末端を増幅せしめる。これらのプライマーの使用は、ＡＴＧ開始コドンの323bp下流にXhoI部位を導入する。標準アガロース電気泳動法を使って断片を単離し、次いでＴＡクローニングキット（Invitrog en Corp.，La Jolla，CA）を使って製造業者の指示に従ってpCRIIの中に該断片をサブクローニングして、pShTh46を得る。実施例４に記載したのと同じ条件を使って、実施例１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー95-1464と95-1458を用いて、GFP遺伝子の３’末端を増幅せしめることにより、終止コドンの191bp上流にPvuI部位を導入する。次いで該ＰＣＲ生成物をＴＡクローニングキットを使って製造業者の指示に従ってpCRIIの中にクローニングして、pShTh47を作製する。作製に必要な塩基323〜565に相当するGFPの残りの中間部コード配列は、アスペルギルス用のコドン用法表（表１，前掲を参照のこと）を利用して、製造業者の指示（Applied Biosystems，Fost er City，CA）に従って、Applied Biosystems 394型DNA/RNA合成装置を使って合成する。３つの84塩基オリゴヌクレオチド断片と１つの50塩基オリゴヌクレオチド断片（95-1411，95-1412，95-1413および95-1414）を合成し、一緒にアニーリングし、そしてT4 DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN ）を使って二本鎖にする。得られた断片を、実施例４に記載したのと同じ条件を使って、実施例１に記載のオリゴマー95-1414と95-1415を用いてＰＣＲにより増幅せしめる。増幅断片を標準アガロース電気泳動法により単離し、次いで製造業者の指示に従ってＴＡクローニングキットを使ってpCRII中にクローニングして、pShTh45を作製する。pShTh45，pShTh46およびpShTh47からの３つのGFP断片を集成し、そしてlacZ Shine-Delgarno（SD）配列に続いてHindIII，BamHI，EcoRI 制限部位を含むpUC19誘導体の中に、GFPの合成対立遺伝子であるgfp49を導入して、pShTh49を作製する（図４）。結果として、同定された陰性イントロン中に見つかる５’スプライス部位と３ ’スプライス部位の各々が変更される。加えて、デザインした断片の長さ全体に渡って、コドンゆらぎ位置のところで可能な時は常にＧ＋Ｃ含量が増大される。該遺伝子の総Ｇ＋Ｃ含量は38.5％から44.5％へと増大する（合成デザインした断片内では、増大は33.3％から51％へである）。実施例10：pShTh49による形質転換製造業者の指示に従ってpShTh49を用いてＥ．コリDH5α（Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD）を形質転換せしめ、得られた形質転換体を実施例３に記載の通りに蛍光顕微鏡下で観察する。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）が補足されたLuri a-Bertani培地５ml中で、形質転換体を37℃にて振盪培養する。IPTGによるgfp49 の誘導から14時間後、実施例５に記載のZeiss顕微鏡により蛍光性Ｅ．コリが観察され、このことは、gfp49が真正GFPと同じ条件下で蛍光を発することができる機能性タンパク質であることを証明する。実施例11：発現ベクターpShTh58.1の作製実施例４に記載したのと同じ条件を使って、実施例１に記載のプライマー96-6 7と96-68を用いてpShTh49からの断片を増幅せしめることにより、糸状菌発現ベクターであるpShTh58.1を作製する。まず前記断片を標準アガロース電気泳動法により単離する。得られたGFPコード断片は、それぞれ５’末端と３’末端にユニークSwaI制限部位部位とPacI制限部位を有する。次いでこの断片をSwaIとPacI で消化し、標準アガロース電気泳動法により単離し、そしてpBANe13ベクターＤＮＡ中に連結せしめて、pShTh58.1を得る（図５）。実施例12：pShTh58.1による形質転換実施例５に記載したのと同じプロトコルを使って、pShTh58.1を用いてアスペルギルス・オリゼHowB425を形質転換せしめる。得られた形質転換体をShTh581株と命名する。実施例13：gfp49の発現５つのShTh581形質転換体を、実施例６に記載したMY51培地の入ったマイクロタイタープレート中で増殖せしめ、GFP生産に向けてTAKAプロモーターを誘導する。３日目と４日目に菌糸を収集する。次いで実施例４に記載の通りに菌糸から細胞内タンパク質を単離し、実施例３に記載の通りにGFPの存在について分析する。５つの試験した形質転換体のうちの４つが、395nmの光で励起した時に509nmのところにGFP に相当する発光ピークを生じる（図６）。これらの結果は、gfp49のmRNA中の変更が、蛍光性GFP生産を考慮に入れたアスペルギルス・オリゼ中で正しいGFP生産をもたらすことを示す。実施例14：発現ベクターpShTh58.2の作製真菌発現ベクターpShTh58.2は、pShTh58.1をMorph変異誘発キット（5-Prime 3 -Prime，Boulder,Co.）で処理することにより作製する。プライマー96-83を製造業者の指示に従って14ngのpShTh-58.1と混合して、Ｗ57Ｃ変異を生成するpShTh5 8.2を作製する（図７）。実施例15：gpf58.2の発現１つのShTh582形質転換体を、実施例４に記載のMY51培地の入ったマイクロタイタープレート中で増殖させる。３日目と４日目に菌糸を集める。次いで、実施例４に記載の通りに菌糸から細胞内タンパク質を単離し、そして実施例６に記載の通りにＧＦＰタンパク質の存在について分析する。この形質転換体は、395nm の光で励起させるとＧＦＰのものに相当する509nmで最大蛍光を発する物質を生産することが観察される（図８）。これらの結果から、gfp49のmRNA中のこの変更が、ＧＦＰの生産を考慮に入れたアスペルギルス・オリゼ中で正確なＧＦＰ発現をもたらすことがわかる。実施例16：ＧＦＰ形質転換体のサザン分析形質転換体ShTh581.1（陰性イントロンとＧＣ含量変化を有するＧＦＰ）およびShTh582.1（陰性イントロンとＧＣ含量変化とＷ57Ｃ変異を有するＧＦＰ）並びに対照としてのShTh590.1（野性型ＧＦＰ）およびBANe130.1（ＧＦＰを持たないpBANe13）をYEG培地中で37℃にて一晩増殖させる。ミラクロスを通して菌糸を濾過し、蒸留水で３回すすぐ。余分な水分を絞り出す。菌糸を液体窒素中で凍結させ、乳鉢と乳棒を使って微粉末に粉砕する。Purgene ＤＮＡ単離キット（ Gentra Systems Inc.，Research Triangle Park，NC）を使ってゲノムＤＮＡを単離する。各試料からのゲノムＤＮＡ２μｇをPmeIで消化し、１％アガロースゲル上でサイズ分画する。各段階ごとにゲルを変性させ、中和し、そして20×ＳＳＣ中に10 分間浸漬する。消化したＤＮＡを、Schleicher & Schuell TurboBlotterを使ってニトロセルロース膜上に３時間移行せしめ、次いで該ＤＮＡをＵＶで層結合せしめる。Boehringer Mannheim Genius System（Boehringer Mannheim，Indianap olis，IN）を使って膜を探査する。Easy Hyb（Boehringer Mannheim，Indianapo lis，IN）を使ってその膜を42℃で１時間予備ハイブリダイズせしめる。pShTh58 .2 ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド96-67と96-68、およびBoehringer Mannheim Dig DNA標識配合物（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）を使って、ＧＦＰプローブをＤｉｇ標識する。標識したプローブを定量し、それを変性させた後で１ng/mlの濃度で添加する。次いで膜を一晩探査する。該プローブをデカントし、膜を２×ＳＳＣ−0.1％ＳＤＳ中で室温で５分間ずつ２回洗浄し、次いで0.1× ＳＳＣ−0.1％ＳＤＳ中で65℃で15分間ずつ２回洗浄する。Ｄｉｇ標識ヌクレオチドの検出は、Lumi-Phos 530（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）を使って、Boehringer Mannheimにより提供されたプロトコルに従って実施する。膜を20分間フィルムに暴露する。その結果は、形質転換体ShTh582.1，ShTh581.1およびShTh590.1にはＧＦＰバンドが観察されるが、BANe130.1形質転換体ではＧＦＰバンドが全く観察されないことを示す。微生物の寄託下記の菌株を、ブダペスト条約に従って、ザ・アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・パテント・カルチャー・コレクション〔the Agricult ural Research Service Patent Culture Collection(NRRL)，Northern Regional Research Laboratory，1815 University Street，Peoria，Illinois 61604，US A〕に寄託した。菌株受入番号寄託日 E.coli DH5α pShTh58.2 NRRL B-21584 1996年６月６日前記菌株は、本特許出願の係属中、37 C.F.R．§1.14および35U.S.C.§1.14のもとで米国特許商標局の長官により権利を与えられることが決定された者への培養物の入手可能性を保証するという条件下で寄託された。この寄託物は、寄託された各株の実質的純粋培養物を表す。この寄託物は、本願の対応物またはそれの子孫が出願される国の外国特許法により要求された時には入手可能である。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府当局の決定により授与される特許権を傷つけて本発明を実施できるという認可を設定するものではないと解釈すべきである。本明細書中に記載され特許請求される発明は、その中に開示される特定態様によって範囲が限定されるものではなく、それらの態様は本発明の幾つかの観点の例示のつもりである。いずれの同等の態様でも本発明の範囲内である。実際、今までの説明から、本明細書中に証明または記載されたものに加えて本発明の様々な変更が当業者に明らかになるであろう。そのような変更も添付の請求の範囲内に含まれるものである。様々な参考文献が本明細書中に引用されているが、その開示はそのまま参考として本明細書中に組み込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 組換え真菌宿主細胞を獲得する方法であって、核酸配列中の少なくとも１つの陰性スプライス部位が変更されている異種ポリペプチドをコードする核酸配列を、真菌宿主細胞に導入することを含んで成る方法。 2. 前記少なくとも１つの陰性スプライス部位が、少なくとも１つの陰性共通配列を非共通配列で置き換えることにより変更される、請求項１に記載の方法。 3. 前記陰性共通配列が５’陰性共通配列である、請求項２に記載の方法。 4. 前記５’陰性共通配列がＧＴ，ＧＣまたはＣＴである、請求項３に記載の方法。 5. 前記５’陰性共通配列がＧＴＡＮＧＴ，ＧＣＡＮＧＴまたはＣＴＡＮＧＴであり、ここでＮはＡ，Ｃ，ＧまたはＴである、請求項４に記載の方法。 6. 前記陰性共通配列が３’陰性共通配列である、請求項２に記載の方法。 7. 前記３’陰性共通配列がＡＧである、請求項６に記載の方法。 8. 前記３’陰性共通配列がＣＡＧ，ＴＡＧまたはＡＡＧである、請求項６に記載の方法。 9. 前記真菌宿主細胞により生産される異種ポリペプチドのアミノ酸配列が野性型ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。 10．前記少なくともつの陰性スプライス部位が、少なくとも１つの陰性イントロンまたはその部分を含んで成る第一領域を、約40％〜約70％の範囲のＧ＋Ｃ含量を有する第二領域で置き換えることにより変更される、請求項１に記載の方法。 11．前記Ｇ＋Ｃ含量が約40％〜約60％の範囲である、請求項10に記載の方法。 12．前記Ｇ＋Ｃ含量が約40％〜約50％の範囲である、請求項11に記載の方法。 13．少なくとも２つの陰性イントロンまたはその部分が置き換えられる、請求項10に記載の方法。 14．前記核酸配列中の陰性共通配列を非共通配列で置き換えることと、１つの陰性イントロンを含む第一領域を約40％〜約70％の範囲のＧ＋Ｃ含量を有する第二領域で置き換えることとの両方により、少なくとも１つの陰性スプライス部位が変更される、請求項１に記載の方法。 15．少なくとも２つの陰性スプライス部位が変更される、請求項１に記載の方法。 16．前記真菌宿主細胞により生産される異種ポリペプチドが、対応する野性型ポリペプチドと同じ数のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の方法。 17．前記非共通配列が前記共通配列と同じ数のヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。 18．前記核酸配列がホルモン、酵素、レセプターまたはレポーターをコードする、請求項１に記載の方法。 19．前記核酸配列が酵素をコードする、請求項１に記載の方法。 20．前記酵素がオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼまたはリガーゼである、請求項18に記載の方法。 21．前記酵素がアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α −ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼおよびキシラナーゼから成る群より選ばれる、請求項19に記載の方法。 22．前記核酸配列がレポーターをコードする、請求項18に記載の方法。 23．前記レポーターがクラゲ（Aequorea victoria）緑色蛍光タンパク質である、請求項22に記載の方法。 24．前記真菌細胞が糸状菌細胞である、請求項１に記載の方法。 25．前記糸状菌細胞がアクレモニウム、アスペルギルス、フザリウム、フミコラ、ミセリオフトラ、ムーコル、ニューロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラディウムまたはトリコデルマの種の細胞である、請求項24に記載の方法。 26．前記糸状菌細胞がアスペルギルス細胞である、請求項24に記載の方法。 27．前記アスペルギルス細胞がアスペルギルス・オリゼ細胞、アスペルギルス・ニガー細胞、アスペルギルス・フェティダス細胞、またはアスペルギルス・ジャポニカス細胞である、請求項26に記載の方法。 28．前記糸状菌細胞がフザリウム細胞である、請求項24に記載の方法。 29．前記フザリウム細胞がフザリウム・オキシスポラム細胞またはフザリウム・グラミネアラム細胞である、請求項28に記載の方法。 30．前記糸状菌細胞がフミコラ細胞である、請求項24に記載の方法。 31．前記フミコラ細胞がフミコラ・インソレンス細胞またはフミコラ・ラヌギノザス細胞である、請求項30に記載の方法。 32．前記糸状菌細胞がミセリオフトラ細胞である、請求項24に記載の方法。 33．前記ミセリオフトラ細胞がミセリオフトラ・テルモフィラ細胞である、請求項32に記載の方法。 34．前記糸状菌細胞がムーコル細胞である、請求項24に記載の方法。 35．前記ムーコル細胞がムーコル・ミーヘイ細胞である、請求項34に記載の方法。 36．前記糸状菌細胞がニューロスポラ細胞である、請求項24に記載の方法。 37．前記ニューロスポラ細胞がニューロスポラ・クラッサ細胞である、請求項 36に記載の方法。 38．前記糸状菌細胞がペニシリウム細胞である、請求項24に記載の方法。 39．前記ペニシリウム細胞がペニシリウム・プルプロゲナム細胞である、請求項38に記載の方法。 40．前記糸状菌細胞がチエラビア細胞である、請求項24に記載の方法。 41．前記チエラビア細胞がチエラビア・テレストリス細胞である、請求項40に記載の方法。 42．前記糸状菌細胞がトリコデルマ細胞である、請求項24に記載の方法。 43．前記トリコデルマ細胞がトリコデルマ・リーセイ細胞、トリコデルマ・ビリデ細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム細胞、トリコデルマ・ハージアナム細胞またはトリコデルマ・コニンギイ細胞である、請求項42に記載の方法。 44．前記真菌細胞が酵母細胞である、請求項１に記載の方法。 45．前記酵母細胞がカンジダ、クルイベロミセス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ピヒアまたはヤロウィアの種の細胞である、請求項44に記載の方法。 46．前記酵母細胞がサッカロミセス細胞である、請求項45に記載の方法。 47．前記サッカロミセス細胞がサッカロミセス・セレビシエ細胞、サッカロミセス・カールスバーゲンシス細胞、サッカロミセス・ジアスタティクス細胞、サッカロミセス・ドウグラシイ細胞、サッカロミセス・クルイベリ細胞、サッカロミセス・ノルベンシス細胞またはサッカロミセス・オビフォルミス細胞である、請求項46に記載の方法。 48．前記酵母細胞がクルイベロミセス細胞である、請求項45に記載の方法。 49．前記クルイベロミセス細胞がクルイベロミセス・ラクティス細胞である、請求項48に記載の方法。 50．前記酵母細胞がヤロウィア細胞である、請求項45に記載の方法。 51．前記ヤロウィア細胞がヤロウィア・リポリティカ細胞である、請求項50に記載の方法。 52．真菌宿主細胞中での異種発現のために単離された核酸配列から少なくとも１つの陰性スプライス部位を変更する方法であって、前記核酸配列中の陰性共通配列を非共通配列で置き換え、そして／または、１つの陰性イントロンを含む第一領域を、前記第一領域のＧ＋Ｃ含量に比較して約40％〜約70％の範囲に調整されたＧ＋Ｃ含量を有する第二領域で置き換えることを含んで成る方法。 53．請求項52の方法に従って得られる単離された核酸配列。 54．請求項53の核酸配列を含んで成る核酸構成物。 55．請求項54の核酸構成物を含んで成る組換え発現ベクター。 56．前記核酸配列がプロモーター配列に作用可能に連結されている、請求項55 に記載のベクター。 57．前記核酸配列が転写終結シグナルに作用可能に連結されている、請求項55 に記載のベクター。 58．選択マーカーを更に含んで成る、請求項55に記載のベクター。 59．請求項54の核酸構成物を含んで成る組換え真菌宿主細胞。 60．請求項１の方法に従って得られる組換え真菌宿主細胞。 61．真菌宿主細胞中でのポリペプチドの異種発現方法であって、請求項59の真菌細胞を栄養培地中で培養しそして前記培地から前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。