JP2000513353A

JP2000513353A - 不安定結合による担体結合抗原から成るワクチン

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Publication number: JP2000513353A
Application number: JP10502729A
Authority: JP
Inventors: ヨハネスクリスティアーンマリアベークマン，ニコ; マルティニュスマリアスファーペル，ウィルヘルムス; ダルスハールト，クリスチャン; ハンスメルーン，ロベルト
Original assignee: DLO Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid
Current assignee: DLO Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid
Priority date: 1996-06-25
Filing date: 1997-06-24
Publication date: 2000-10-10
Anticipated expiration: 2017-06-24
Also published as: DK0912195T3; DE69739233D1; CA2260761A1; WO1997049425A1; BR9709993A; CA2260761C; JP4651753B2; AU3193897A; EP0912195A1; AU732085B2; ATE421331T1; EP0912195B1; NZ333562A

Abstract

(57)【要約】本発明はワクチンおよび免疫原調製物の分野に関係する。通常、これらの調製物においては抗原と担体化合物は安定な結合により不可逆的に結合している。それに対して本発明は、抗原（免疫化／予防接種手法用抗原として用いるタンパク質、炭水化物または他の分子）と担体化合物とを可逆的な不安定な様式、いわゆる不安定な結合により結合しているワクチンおよび免疫原調製物を提供する。この様式においては、本出願の実験の部に述べるように、それ自身では免疫原性の低い抗原においても、抗原と担体化合物との間に安定な結合を与える方法によるよりも驚くほど高い免疫応答を発現させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】不安定結合による担体結合抗原から成るワクチン本発明は免疫化およびワクチンの分野に関する。予防接種により、抗体および／または細胞内応答が予防接種した動物またはヒトに誘発される。これらの応答は抗原またはワクチンに用いられる抗原に対して向けられる。従来、抗原の抗原性および免疫原性は、例えば、抗原が予防接種動物に提示される仕方、あるいは抗原分子のサイズおよび構造により変化することが知られている。ワクチン調製物の抗原性を増大させる広く知られた方法は、この製剤にアジュバントを加える方法である。しかし、このようなアジュバントは非特異的な方法でのみ免疫応答を刺激し、用いた抗原の特異的な抗原性または免疫原性を増大させるものではない。それ自体抗原性または免疫原性の乏しい抗原の特異的な抗原性または免疫原性を高めることは、該抗原を担体化合物に結合させることによりしばしば達成される。合成ペプチドは動物を免疫するためによく使用されている。しかし、アミノ酸が約２０ないし３０以下のペプチドは、そのような免疫原の乏しい周知の例である。それらの特異的抗原性または免疫原性を高めるために、分子量を増やす必要があるとされている。分子量を増加させるために、抗原を担体分子に安定な結合で接合させる多くの試行がなされているが、そこでは担体タンパク質としてキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミン（ＯＶＡ）などの異なる担体化合物を使用する。そのような免疫接合は非常に複雑な構造に導き、不所望の副作用を生じるが、その意味は、例えば、担体化合物および抗原と担体の連結が生じている接合分子の領域に対して特異的な不所望の抗体が誘導されるということである。応用されている他の方法は抗原性または免疫原性の低いタンパク質またはペプチドに脂肪酸基を結合させることである。抗原に脂肪酸を導入する主な目的は、アジュバントーおよび免疫提示系、例えば、リポソームおよびＩＳＣＯＭ類に親水性の抗原を固定することである。その理由はそのような系がそれらの系にそれらを包含させるために疎水性分子の存在を必要とするからである。ワクチン調製物についてのそのような手法は、モデルタンパク抗原ではある程度上手く用いられているが、合成ペプチドではあまり上手くいっていない。オボアルブミンのリジンをパルミチン酸でアシル化すると、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のクラスII制限提示を増強することが見出された。このことは長鎖脂肪酸との接合が、ＭＨＣクラスIIおよび／またはＴ細胞レセプターに結合するために親和性を増大したリポペプチドＴ細胞エピトープが形成されることを示唆している(２０)。脂肪酸のそのような結合は、免疫化／予防接種の目的に使用することを企図するタンパク質またはペプチド（２６）のアシル化によって、単に脂肪酸を抗原に共役結合させることにより達成されている。これらの研究では、主にパルミチン酸またはミリスチン酸が用いられている。タンパク抗原に対しての「脂質尾部」の導入（パルミチル化）は主にパルミチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて実施されているが、この場合には、タンパク質と脂肪酸の間に不可逆的で安定な結合が形成される。合成ペプチド抗原に対しての最も一般的な手法は、ペプチド合成の後に続いて実施するが、ペプチド合成化学を続けることにより得られる末端アミノ酸の遊離アミノ基にパルミチン酸を付加することにより行う。この反応はパルミチン酸尾部とペプチドの間に不可逆的なアミド結合を形成させる。今回我々は、抗原を担体化合物に不可逆的に結合させる代りに、抗原（タンパク質またはペプチドまたは炭水化物または免疫化／予防接種手法にとって抗原として用いられる他の分子）と担体化合物との間に可逆的で不安定な様式、いわゆる不安定結合法で結合させることのできる手法を見出した。「不安定結合」(lab ile−link)とは抗原と担体タンパク質の間の不安定な化学結合を意味する。不安定なとは化学的または酵素的に不安定であることと理解すべきである。化学的に不安定な結合は、例えば、通常体内に見出される条件、例えば、一定の体組織に見ることのできる塩基性ｐＨでの条件、あるいは他の組織または一定の細胞区画に見ることのできる酸性ｐＨでの条件で切断するが、一方、酵素的に不安定な結合は、体組織に存在する酵素、例えば、チオエステラーゼまたはエステラーゼの存在下に切断する。そのような切断は、ワクチンの投与後、抗原と担体化合物の解離を招く。この方法によって、この記載の実験の部に詳細に説明するように、抗原と担体化合物の間の安定な結合を与える方法によるよりも、それ自体免疫性の高くない抗原によって驚くほどよい免疫応答を発現させることができる。本発明は脂質尾部などの担体化合物を抗原に導入するのを可能とするばかりでなく、抗原提示細胞の細胞表面によりよく道をつけることをも可能とする。その結果、抗原が解離したものとなり、それらの抗原提示細胞によりよりよく処理されてよりすぐれた免疫応答を示すことになる。それ故、本発明は担体タンパク、アジュバントまたは他の提示系に抗原を固定することを単に目指したものではなく、それ自体の能力によって抗原の抗原性または免疫原性を顕著に増大させることができるものである。本発明を制限するものではないとして理論的説明をすると、担体化合物に可逆的な結合または不安定な連鎖を介して結合した抗原、例えば、ペプチドのチオール基をパルミチン酸アシル化により結合した抗原は、種々細胞区画へのルートづけを容易にし、この方式によってその免疫原性を高める。ペプチド類は極めて多くの様式でパルミチン酸残基に置換されている。例えば、Ｎα，Ｎε−ジパルミトイルリジン・ペプチド（８，５）、Ｎα−パルミトイル−Ｓ−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−（２ＲＳ）−プロピル）−（Ｒ）−システイン(Ｐａｍ₃Ｃｙｓ−ペプチド(５，１３))、パルミトイル化ポリリジン(２３，２４)、Ｐａｍ₃Ｃｙｓ−多重抗原ペプチド(４，１０)、リポ−多重抗原ペプチド(９，１０)、ＩＳＣＯＭに包含させるのに用いるＮ−パルミトイル化タンパク質(３，１４，１７)、およびペプチジル−Ｎε−パルミトイルリジン（５）との接合などによる。これらの例では、パルミトイル化がアミノ基またはヒドロキシ基で起こり、アミドなどの非可逆的結合を与える。実験の部で例示するように、本発明は不安定な結合の形成を利用するものであるが、今回は、抗原と１個の長鎖脂肪酸との制御下での接合により不安定に連接した抗原と担体化合物を得るための非常に簡単な方法を提供する。脂肪酸の存在は抗原が抗原提示細胞に取り込まれるのを促進し、その結合が不安定で可逆的な性質のものであるために、抗原が再分離されたものとなり、抗原のみに対しての特異抗体形成を誘発する。実験の部においては、不安定な結合の概念について、担体化合物としてのパルミチン酸にチオエステル結合を介して結合した抗原としての合成ペプチドにより、また、担体化合物としてのＮ−パルミトイルペプチドにジスルフィド結合を介して結合した抗原としての合成ペプチドにより説明する。本発明の好ましい部分はこのように開示した実施例により説明する。しかし、ワクチン投与後、抗原が担体化合物から解離するという目的に適うすべての不安定な結合によりその抗原が担体化合物に可逆的にまたは変わり易くまたは不安定に結合しているワクチンまたは免疫原調製物もまた本発明の一部である。例えば、オボアルブミンにジスルフィド架橋を介して連接したグリコペプチドから成るワクチン組成物は、該組成物が還元的環境、例えば、グルタチオンの存在する血中にあるような環境に遭遇すると直ちに解離する。抗原としては、免疫応答が好ましく誘発される必要のある他のタイプの分子、例えば、ポリペプチド、炭水化物部分もしくは他の側鎖を有することのあるタンパク質、炭水化物鎖それ自体、核酸分子、ハプテンなどを選択できる。担体化合物としては、他の脂肪酸を用いることができるが、ＫＬＨまたはＯＶＡなどの担体タンパク質、または脂肪酸ペプチド、または他のタイプの分子を担体化合物として使用することができる。抗原と担体化合物間の不安定な結合としては、チオエステル結合が本発明の好ましい部分を説明する。しかし、通常、体液中あるいは体組織もしくは細胞内外に存在する生理条件下（例えば、ｐＨ，モル浸透圧性、塩濃度、または還元剤もしくは酵素の存在など）で不安定なエステルおよびジスルフィド結合などの他の化学結合もまた、生理条件下、すなわち、投与後に抗原がその担体化合物から解離するようなワクチンまたは免疫原調製物を提供することの目的に適うものである。不安定なリンカーの代表的な好ましい例がガン治療の分野に見出されるが、そこではリンカーが抗体と細胞増殖抑制剤との間に応用されている。また、本発明により調製されるワクチンおよび免疫原調製物は、抗原をより高活性の抗原もしくは免疫原とするために伝統的に用いられる担体化合物およびアジュバントと混合してもよい。更に、本発明により調製されるワクチンおよび免疫原調製物は、該調製物を投与した後、すなわち、解離速度を変化させる条件により調製物を包囲し、それによって正常な生理条件から一時的に調製物を遮蔽することにより、担体化合物から抗原が解離する速度を速めたり、遅くしたりするのに特に選択する他の化合物またはアジュバントまたは抗原搬送システムと混合してもよい。担体から抗原の放出を持続させるためには、担体と抗原間の異なる解離定数を有する異なるリンカーを適用するのが有用である。更に、また、本発明により調製されるワクチンおよび免疫原調製物は、技術上既知の種々の方法で投与することができる。例えば、筋肉内、鼻内、腹腔内、皮膚内、皮内、粘膜またはエアゾル製剤などとして投与できるが、これらに限定されるものではない。実施例序論不安定な結合の概念は抗原としての合成ペプチドおよび担体化合物としてのパルミチン酸もしくはＮ−パルミトイルペプチドにより説明し得る。ペプチドを溶液中または固相上でアシル化する条件は確立された。更に、我々の研究によれば、脂肪酸の接合はＮ−アシル化が関与する場合には安定なアミドの形成を伴い、Ｓ−アシル化の場合には不安定なチオエステルの形成を伴うために、結合の安定性が免疫の効能に影響することが証明された。アシル化の位置( ＮまたはＳ)によるこの相違はその免疫原性にとって重要であることが見出された。免疫化にもとづいて見出されたことは、不安定なＳ−パルミトイル化ペプチドまたは不安定なジスルフィド架橋を介してＮ−パルミトイル化ペプチドに結合したペプチドはＮ−パルミトイル化ペプチドに勝っており、少なくとも検出可能な抗体形成または生物学上の効果の応答時間に関しては、ＫＬＨ接合ペプチドに匹敵するということである。理論的な説明では、生物学的または生理学的条件下、不安定なチオエステルもしくはジスルフィド結合を介して化学的に結合した適切な脂肪酸の存在は免疫原性を改善するが、その理由は恐らくそれが免疫系細胞中での取り込みおよび処理工程での好適な前駆体を表しているからである。この処理工程はすでに単離されているパルミトイルチオエステル（１８）により、あるいはジスルフィドの場合にはグルタチオンにより仲介される。アミドおよびエステルと違って、チオエステルは求核性の攻撃を非常に受け易い。パルミトイルチオエステルの化学的安定性はこのように生理的ｐＨにおいて、および脱保護条件（酸、酸−チオール、塩基）について検討しなければならなかった。９種のペプチド構成物(Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，ＨおよびＩ，図１)はワクチン調製物として調製され、その２種のペプチドはＧｎＲＨ−縦列ペプチドを代表し、５種はイヌのパルボウイルス（ＣＰＶ(１１)）のＶＰ２（ｃｙｓ−２−２１位置）Ｎ−末端に基づいておりて、２種はネコの免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のＶ３ループからのものである。それらはそのアシル化部位（Ｓ，α −Ｎまたはε−Ｎ，図１）により相違する。Ｓ−パルミトイル化ペプチドは高いレベルの抗体を誘発し、そのレベルはＫＬＨ−ＭＢＳ結合ペプチドに比較し得るか、僅かに勝っており、検出可能な抗体（ＣＰＶ）または生物学上の効果(ＧｎＲＨ)の応答時間に関しては、Ｎ−パルミトイル化ペプチドより優れている。材料Ｎ−メチルピロリドン(ＮＭＰ)，２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびピペリジンはペプチド合成純度のものであり、パーキン・エルマー／ＡＢＩ（ワーリントン、英国）より入手した。ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)，ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)，Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢｔ)，ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＥＡ)，アセトニトリル( ＡＣＮ)，トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)，チオアニソール(ＴＡ)，フェノール、パルミチン酸およびエタンジチオール（ＥＤＴ）は分析純度のものであり、メルク（ダルムシュタット、ドイツ）より入手した。ジエチルエーテルは活性化塩基性酸化アルミニウ・カラムで精製し、ＤＩＥＡは使用前にニンヒドリンおよび水酸化カリウム上で２度蒸留した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体および樹脂（４ −（２'、４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂（リンク樹脂）(１９)）はサクソン・バイオケミカルズ（ハノーバー、ドイツ）より入手した。４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂はノババイオケム（ラオフェルフィンゲン、スイス）より入手した。分析用ＨＰＬＣについて、我々は２個のウオーターズ製ポンプ・モデル５１０、ウオーターズ製グラジエント・コントローラー・モデル６８０、ウオーターズ製ＷＩＳＰ７１２オート・インジェクター、およびウオーターズ製９９１光ダイオード・アレイ検出器を用いた。生成物を直線勾配（グラジデント）法により、０．１％ＴＦＡ含有水ないし０．１％ＴＦＡ含有６０％アセトニトリル／水を用い、ウオーターズ製デルタパックＣ₁₈−１００カラム（３．９ｘ１５０ｍｍ、５μｍ）上で、１ｍｌ／分の速度、６０分間で分析した。アミノ酸分析はウオーターズ製ピコータグ・システムを使用し、６Ｎ−ＨＣｌ、１５０℃１時間の条件下、ピコータグ・ワークステーションで水解し、フェニルイソチオシアネートで誘導化した後、実施した。分離ＨＰＬＣは、デルタ−パックＣ₁₈−１００（１５μｍ）を充填した２本のプレップパックカートリッジおよびガードカートリッジ（４０ｘ２１０ｍｍまたは２５ｘ２１０ｍｍ）を備えるウオーターズＲＣＭモジュール装備プレップ４０００液体クロマトグラフを用い実施した。ペプチドは分離用セルをもつウオーターズ４８６スペクトロホトメーターを用い、２３０ｎｍで検出した。方法１］ペプチドの合成すべてのペプチド（ペプチドＢを除く。図１）はＡＢＩ４３０Ａペプチド合成機によりファストモック（ＦａｓｔＭｏｃ）(商標)法を用い、リンク樹脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ負荷）上Ｃ−末端アミドとして合成した。システインのイオウはＳ−tert−ブチルスルフェニル基またはトリチル基で保護し、すべての他の側鎖機能はトリフルオロ酢酸反応活性基により保護した。合成終了後、ペプチドを無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＮＭＰ（０．１／０．０１／１(ｖ／ｖ／ｖ)）を用いてアセチル化するか、またはあらかじめ活性化したパルミチン酸を用いＮ-パルミトイル化した(方法・第３および４項参照)。Ｓ−トリチル保護システインを有するペプチドは、ＴＦＡ／水／ＥＤＴ／ＴＡ／フェノール（４０／２／１／２／３( ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｗ)）を用い、スカベンジャーの存在下、２時間、酸水解して樹脂から切断し、同時に脱保護した。粗製のペプチドを沈殿させ、ヘキサン／エーテル（１：１）で２度洗浄し、アセトニトリル／水（１：１）から凍結乾燥した。ペプチドＢはＮＭＰ中Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨから出発して、メチルベンズヒドリルアミン（ＭＨＢＡ，０．４６ｍｍｏｌ／ｇ）樹脂上、Ｃ−末端アミドとして合成した。ＴＦＡ／水（１９：１）でＢｏｃ基を切断後、あらかじめ活性化したパルミチン酸でパルミトイル化した(方法・第４項参照)。Ｆｍｏｃ脱保護後、上記のごとく、α−アミノ基を適切なＦｍｏｃ−アミノ酸で連続的にアシル化して保護ペプチドとした。化合物Ｂを脱保護し、ＨＦ／アニソール（９：１）で樹脂から切断した。２］Ｓ−(tert-ブチルスルフェニル)システイニル残基の溶液中脱保護システインの側鎖保護基を、還元剤を用い脱離した。３０分で行う定型の二重脱保護を採用し、窒素気流下、１０％Ｈ₂Ｏ／ＮＭＰ中、５０モル等量過剰のトリ（ｎ−ブチル）ホスフィンで実施した。反応はＨＰＬＣ分析によりモニターした。３］溶液中でのＳ−パルミトイル化パルミチン酸の活性化−パルミチン酸（１００μｍｏｌ）のＤＣＭ（２５０μ ｌ）溶液に、ＤＭＦ（２２０μｌ）中ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ１００μｍｏｌ（０．４５Ｍ）溶液およびＮＭＰ中の２Ｍ−ＤＩＥＡ溶液２００μｍｏｌを添加した。活性化パルミチン酸は室温２０分でこの混合物からゲルを形成した。チオール基のパルミトイル化−アセチル化したペプチド（リジン残基不含）をＮＭＰに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。溶液をｐＨ試験紙でチェックしながらＤＩＥＡ（２ＭＮＭＰ溶液）でｐＨ５とし、１等量のあらかじめ活性化したパルミチン酸と混合した。室温で９０分間攪拌後、サンプルを分析用ＨＰＬＣに付した。約５０％のペプチドが反応していることが判明した。二度目の等量の活性化パルミチン酸を、この場合は半量のＤＩＥＡで調製したものを添加すると、更に９０分後に７０％以上のペプチドがパルミトイル化されていた。副産物は認めなかった。総反応時間５時間後、混合物をアセトニトリル／水（１：１）で４倍に希釈し、２滴のＴＦＡを加え、パルミトイル化ペプチドを単離し、分離用ＨＰＬＣで精製した。 α−もしくはε−アミノ基のパルミトイル化−リジン残基の遊離Ｎαもしくは遊離Ｎεを、Ｓ−パルミトイル化について記載したようにＮ−パルミトイル化した。４］樹脂上Ｎ−パルミトイル化合成完了後、樹脂をＮＭＰ／水（９：１）中、トリ（ｎ−ブチル）ホスフィン（５０等量）で６０分間２度（またはホスフィンの品質により２度目は一夜）処理し、tert−ブチルスルフェニル基を除去した。樹脂をＮＭＰで充分に洗浄した。遊離のＳＨ基を、あらかじめ活性化したパルミチン酸試薬（パルミトイル化溶液、第３項参照）を用い、ＤＣＭ／ＮＭＰ中、それぞれ５時間と１５時間、２度の連結反応により樹脂上パルミトイル化した。５］脱保護混合物の選択と酸に対するチオエステルの安定性 tert−ブチルオキシ機能（ＢｏｃおよびＯＢｕ^t）の酸水解による除去および／または樹脂−ペプチド結合の切断におけるチオエステルの安定性を検討するために、２種のモデルペプチド、すなわち、Ac-C(palm)SEIFRPGGGDMR-NH₂およびAc -C(palm)VATQLPASF-NH₂（両方ともリジンを含まない）を溶液中でパルミトイル化し、分離用ＨＰＬＣで精製した。サンプルをスカベンジャーの存在下または不存在下に、ＴＦＡ／水（１９／１、ｖ／ｖ）(Ａ)，ＴＦＡ／水／ＥＤＴ／ＴＡ／フェノール（４０／２／１／２／３、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）(Ｂ)，またはＥＤＴ／水／ＴＦＡ（１／１／３８，ｖ／ｖ／ｖ）(Ｃ)を用いる酸水解条件に付した。酢酸／水（１／１）を対照として用いた。処理（３時間）は室温で実施した。チオエステルはこれら酸性条件のすべての下で安定であることが証明された。６］ヨードアセトアミドによる遊離ＳＨ基のブロッキングペプチドａｃ−ＣＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴＧ−ＮＨ₂の空気酸化による２量化を防ぐために、遊離ＳＨ基をブロックした。ペプチドａｃ− ＣＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＴＡＧ−ＮＨ₂（２０μｍｏｌ）およびヨードアセトアミド（１００μｍｏｌ）を、４００μｌのＤＭＦおよび６００ μｌの２％ＮＨ₄ＨＣＯ₃（ｐＨ８．０）中に溶解した。ｐＨを７．５〜８．５の間に保ち、必要があれば、特級ＮＨ₄ＨＣＯ₃（結晶）を用いて調整した。この溶液を、室温で約１．５または２時間攪拌した。酢酸（１００％、５０μｌ）を加えて、反応を停止させた。エルマン試験によって、得られた生成物を分析した。７］塩基に対するチオエステルの安定性リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）／ＤＭＦ（７／３）、ＮＨ₄ＨＣＯ₃水（２％、ｐＨ８）／ＤＭＦ（７／３）、ピペリジン／ＮＭＰ（３／７）中でのペプチドＡの安定性を検討した。ペプチドＡを、室温で、５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。安定性は、分析ＨＰＬＣで測定した（表１）。結果を表１にまとめた。８］ＣＰＶのジスルフィド構成物Ｃの合成ａｃ−ＣＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴＧ−ＮＨ₂（１３ｍｇ）およびｐａｌｍ−ＣＳＤＧＡＶＱＰＤＧＧＱＰＡＶＲＮＥＲＡＴＧ−ＮＨ₂（６．４ｍｇ）を、１ｍｌの５０％ＤＭＳＯ／ＤＣＭに溶解した。この溶液を、１５０ μｌの２％ＮＨ₄ＨＣＯ₃を用いて、ｐＨ７．０にした。この混合物を攪拌し、反応は、分析ＨＰＬＣで追跡した。３時間後、０．５ｍｌの酢酸を加えることによって反応を停止した。ヘテロダイマーＣ（図１、ジスルフィド）およびアセチルペプチドのホモダイマーは、ＨＰＬＣ精製によって単離した。最適な収率で化合物Ｃを得るために、等モル量の両出発ペプチドを用いてもよい。また、２量化は、中和にトリエチルアミンを用いて、１０％ＤＭＳＯ／ＮＭＰ中で行ってもよい。モル質量は、高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）で測定した。質量分析のために還元剤チオグリコール酸を添加したので、２つの１本鎖ペプチドだけが検出された（ａｃ−ペプチド：計算値：２４２２、測定値：２４２２および２４８９；ｐａｌｍ−ペプチド：計算値：２４６５．７９、測定値：２４６５．２０）。合成中に起こる２つの副反応が、いくつかの副生成物の原因であり（２６）、６７の質量の増加は、ピペリジンとアスパラギン酸残基の１つとの反応によっで引き起こされて、１分子の水が失われ、また１８の減少は、特にＤＧ配列において頻繁に起こる副反応であるＡｓｐ−Ｇｌｙ転位によって引き起こされた(ＤＧは、配列中に２回現れる)。エレクトロスプレー質量分析（electrospray ＭＳ：ＥＳ−ＭＳ）によって、完全な構成物Ｃの質量だけではなく、上述の副反応によって変形した構成物Ｃの質量もまた示された。これらの変形物は、免疫応答に重大な影響を与えないであろう。９］複合体の調製キーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin:ＫＬＨ、１０ｍｇ、カルバイオケム、ラ・ジョラ、カリフォルニア）を、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に、１２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。アセトニトリル（０．３ｍｌ）を添加し、続いて、１００μｌの０．１２５Ｍマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサッカリンイミドエステル（ＭＢＳ、ピアス、ロックフォード、イリノイ）のＤＭＦ溶液を添加した。１時間撹拌した後、溶液を、４℃でｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液に対して、３０分単位で３回透析した。ペプチド（１０ｍｇ）を修飾ＫＬＨに加え、この混合物を室温で一晩震盪した。この複合体を、２時間単位で２回透析した後、４℃でｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液に対して一晩透析した。１０］ワクチンの調製各ワクチン、（ＫＬＨと複合した、Ｎ−またはＳ−パルミトイル化した）ペプチド構成物を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）に溶解し、等体積で、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用いて乳化した。この混合物を、安定な油中水型乳剤が得られるまで、針を通して繰返し押出すことによって乳化した。この乳剤は、免疫化の直前に調製した。２回目の免疫化は、不完全フロイント・アジュバント（ＩＦＡ）を用いて準備された。１１］予防接種または免疫化ＧｎＲＨ−縦列構成物。７〜８頭の１０週齢の雄の仔ブタの６群を、化合物ＡまたはＢ（図１）で免疫化した。各動物に、１ｍｌのワクチン調製物（１、０．２５、または０．０５ｍｇ）を、首の筋肉内に投与されるように注射した。２回目の免疫化は、８週間後に行った。コントロール用の１群は、ＣＦＡおよびＫＬＨのみで擬似免疫化した。２６週目に、動物は屠殺される体重になり、精巣を摘出し、精巣上体を切除し、精巣の重量を記録した。ＣＰＶ構成物。第１の実験では、５頭のテンジクネズミの２群を、化合物ＣまたはＤで免疫化した（図１）。各動物に、５００μｌのワクチン調製物を、首の筋肉内に投与されるように注射した。２回目の免疫化は、６週間後に行った。コントロール用の１群は、化合物Ｆ（ＫＬＨ−ＭＢＳ結合ペプチド構成物、図１）で免疫化した。血液を、免疫化後０、６、７、および１２週目に採取し、抗ペプチド抗体価は、ＥＬＩＳＡで記録した。第２の実験では、３頭のテンジクネズミの１群を、ＣＦＡに乳化させた化合物Ｃで免疫化した。比較のために、化合物ＥをＣＦＡに乳化させた。血液を、免疫化後０、４、８、および１６週目に採取し、抗ペプチド抗体価は、ＥＬＩＳＡで記録した。第３の実験では、３頭のテンジクネズミの３群を、化合物Ｄ、ＥまたはＦで免疫化した。ＣＦＡを用いて、ペプチドを乳化した。コントロールとして、ペプチドの２量化を防ぐために、チオール基をヨードアセトアミドでブロックした遊離ペプチドＧを用いた。血液を、免疫化後０、４、および８週目に採取し、抗ペプチド抗体価は、ＥＬＩＳＡで記録した。ＦＩＶ構成物。この実験では、４頭のネコの６群を、（ＩＦＡ中、またはＩＳＣＯＭＳ中の）化合物Ｈで、または（ＭＢＳを介してコレラ毒素と複合化し、皮下、直腸、または鼻孔間のどこかに投与した）化合物Ｉで免疫化した。血液サンプルを、免疫化後８週目に採取し、ペプチドに対する抗体価は、ＥＬＩＳＡで記録した。結果１］方法溶液中、または固体担体のマトリックス内でペプチドチオールをアシル化する方法が確立された。溶液中では、予め活性化されたパルミチン酸を用いて、ただ１つの求核性官能基（ＮまたはＳ）を有するペプチドを非常に効率良くアシル化することができる。固体担体上の保護されたペプチドのＳ−アシル化には、tert −ブチルスルフィニル基を効率的かつ選択的に脱保護することが要求され、これはＮＭＰ／水（９／１）中でトリ（ｎ−ブチル）ホスフィンで還元することにより、効果的に行われた。この方法の利点は、リシンがまだ保護されたままであるため、リシンの存在下でも実施することができることにある。パルミチン酸チオール（ＡおよびＥ，図１）は、溶液中で予め活性化されたパルミチン酸によるアシル化によって得られ、Ｂ，Ｅおよび化合物Ｃのパルミトイルペプチドは樹脂上でパルミトイル化した。チオエステルペプチドは、他の保護官能基が酸分解される間、安定であることが判った。パルミトイル−チオエステル結合は、塩基性条件下で安定でない。ｐＨ８付近で緩衝作用を有するチオエステル溶液は、長時間にわたって効果を維持することができない(表１)。ｐＨ７において、安定性はかなり向上し、−１８℃で凍結乾燥したチオエステルは、２８ヶ月後でも安定であることが判った。２］パルミトイル化ペプチドの免疫効果ａ）ＧｎＲＨ−縦列ペプチドＡおよびＢ合成ＧｎＲＨ縦列ペプチドＡおよびＢの免疫効果は、７〜８頭の雄ブタ（１０週齢）から成る６つの群に対して行った実験で調べた。各グループは、Ｓ−パルミトイル化（Ａ）抗原またはＮ−パルミトイル化（Ｂ）抗原のいずれかの投与を受けている。ＧｎＲＨ縦列ペプチドＡまたはＢは、ＣＦＡまたはＩＦＡの存在下に２回の注射を行った後の、２６週齢における精巣重量（１５）から判るように、異なる免疫効果を示した(２回目の注射、表２を参照)。いずれの形でも精巣の大きさを小さく保つことができたが、Ｓ−パルミトイル化ペプチドＡのみが、全ての個体について、試験した最も高い用量（１ｍｇ）でも、さらに８個体中３個体について、最も低い用量（０．０５ｍｇ）でもこの効果を示した。反応は用量に依存した。Ｓ−パルミトイル化ペプチドＡの用量０．２５ｍｇは、Ｎ−パルミトイル化ペプチドＢの用量１ｍｇと同等の効果を示した。ｂ）ＣＰＶペプチド上で認められた、パルミトイル化ＧｎＲＨペプチドＡおよびＢによる効果を、他の構成物および他の動物種を用いてさらに調べた。以下の実験では、イヌパルボウィルスのＶＰ２のＮ末端断片（２〜２１位）を用いた。このペプチドは、ジスルフィド架橋を介して同ペプチドにＮ−パルミトイル基によって複合される場合(ペプチド構成物Ｃ)、ＫＬＨに複合されたペプチド（ペプチドＦなど）と同等の抗体反応を誘引するようである。一方、Ｎ−パルミトイル化ペプチド単独(ペプチドＤ，おそらく部分的に２量体として存在する)では、抗体の力価が低く、すべての個体で増加が認められなかったことから(表３を参照)、より低い免疫効果しか与えなかったことが判る。ペプチド構成物Ｃは、ペプチドＥの最初の合成中に形成された。この合成においては、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨを、パルボペプチド−樹脂に連結した後、システイン基を保護しているＳｔＢｕ側鎖を、２−メルカプトエタノールを用いて４８時間かけて切断した。この段階でＦｍｏｃ基も部分的に切断された。樹脂を洗浄し、遊離システインを、チオール基および上述のように部分的にアミノ基において、パルミトイル化した。次に、Ｆｍｏｃ基をピペリジンを用いて切断した。この段階でパルミトイルチオエステルも切断され、システインの遊離のアミノ基に部分的に転移した(Ｓ⇒Ｎ転移) 。次に、ペプチドをアセチル化し、脱保護し、上述のように樹脂から切断した。ワークアップおよび分取ＨＰＬＣによる精製を行ったところ、合成ペプチドである生成物Ｃであって、もう１つの同ペプチドに連結される脂肪酸に、ジスルフィド結合を介して連結された生成物Ｃを、少量の他の副産物とともに単離した。質量分析では、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列がパルボペプチド中で２回出現していることから、ペプチド構成物Ｃが部分的に転位していることが判った(２６)。しかしながら、３または９位のアスパラギン酸にピペリジン基を添加しても、またはアスパルトイミドを形成することによって水分子を欠失させても免疫応答に顕著な影響は及ぼさない。第２の実験は、ＣＦＡ中で、ペプチドＥをペプチド構成物Ｃと比較する実験であった。このペプチドＥの合成においては、ペプチドをＦｍｏｃ− Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨと連結した直後に、アセチル化し、アミノ基のパルミトイル化を防止した。ＳｔＢｕ基を切断し、Ｓ−パルミトイル化し、最終的に脱保護した後、パルボチオエステル生成物をＨＰＬＣを用いて精製した。結果として得られた生成物Ｅは、チオエステル結合によって脂肪酸に結合された合成ペプチドであり、分析ＨＰＬＣおよび質量分析のいずれによっても付加産物は一切検出されなかった。生成物ＥおよびＣは同様の免疫応答を示した(表４を参照)。Ｓ −パルミトイル化生成物が、Ｎ−パルミトイル化生成物よりも優れていることは、ペプチドＤ、ペプチドＥ、およびＫＬＨ−ＭＢＳ複合ペプチドＦを直接比較することによって確認した(表５)。この第３の実験において、ワクチン注射４週間目における、Ｓ−パルミトイル化ペプチドによって誘引される抗体の力価は、Ｎ −パルミトイル化ペプチドによって誘引される力価の約１００倍高かった。８週間目では、力価はほぼ同じであった。ＫＬＨ複合ペプチドと比較すると、Ｓ−パルミトイル化ペブチドに対する力価は、４週間目、８週間目のいずれにおいても高かった。ｃ）ＦＩＶペプチドパルミトイル−チオエステルペプチドＨの抗体反応は、ＩＦＡ，ＩＳＣＯＭＳのいずれにおいても、コレラ毒素複合ペプチドに対する反応よりもはるかに高かった。ＣＴペプチド複合物を投与するという方法によって、反応性を大きく高めることはできなかった(表６)。実施例の実験結果の考察免疫学的見地から本研究では、アミド結合またはチオエステル結合を介してパルミトイル化する方法が確立された。さらに、脂肪酸に複合されたペプチドの免疫効果を調べ、ＫＬＨ−ＭＢＳ複合ペプチドと比較した。アシル化（ＮまたはＳ）の部位が付加産物の免疫原性に影響することが判った。驚くべきことに、チオエステル結合を介するペプチドのパルミトイル化（Ｓアシル化）により、高い免疫原性を有する生成物が得られ、担体タンパク質（ＫＬＨ，ＯＶＡまたはＣＴ）に連結されたペプチドと同程度か、もしくはそれ以上の効用を示した。一方、Ｎ−パルミトイル化では、Ｓ−パルミトイル化またはＫＬＨ−ＭＢＳ複合化の場合に比べて、免疫原性はかなり低かった。しかしながら、不安定なジスルフィド結合を介してＮ−パルミトイル化ペプチド担体と複合されたペプチドは、高い抗体反応性を誘導した。このように、抗原ペプチドと、担体分子であるパルミチン酸またはパルミトイル化ペプチドとの間の可逆的で不安定な結合が、免疫応答性を激烈に高める。したがって、チオエステル結合を介しての脂肪酸の導入により、大きな担体タンパクが必要でなくなる。大きな分子（タンパク質）を用いた従来の複合化では、連結の際に引き起される化学作用を常に十分に制御できないことによる問題が生じるとともに、担体タンパク質およびリンカーに対する望ましくない抗体が誘導されてしまう。化学的見地からＮα−アセチル化ぺプチドのアミドは、固相合成により自動的に調製することができる。しかしながら、ピペリジンによって塩基に不安定なＦｍｏｃ基を除去すると、合成中のＳ−パルミトイル化システイン誘導物の使用が不可能になる。したがって、Ｓ−アシル化は、樹脂上で合成の終了時に実施するか、または切断および脱保護後に溶液中で実施しなければならない。ここで適用したアシル化反応では、チオールとアミノ基とを区別することができない。ペプチドは、担体から切断される際にＮ−保護基をも失うので、選択的パルミトイル化は、溶液中で、ただ１つの求核性の官能基を有する化合物を用いてしか行うことができない( ＮまたはＳ)。水酸基は反応しない。Ｓ−パルミトイル化ペプチドは塩基に対して不安定であるので、Ｓ−パルミトイル化ペプチドを緩衝溶液（ｐＨ７〜８）中に長期間放置しておくことは薦められない(表１を参照)。チオエステルは、酸性溶媒中では解離せず、したがってチオエステルを攻撃するであろうチオラートアニオンを含まない。我々は、チオエステルが強酸性溶媒中でチオールに耐性を有するため、チオールをカルボニウムイオンに対する捕獲剤として、tert−ブチロキシ官能基の保護時に使用することができるという一般則を立証した(２１参照)。表１．塩基溶液中でのチオエステル結合の安定性結果は、室温で所与時間後、分析ＨＰＬＣによって推定されるＧｎＲＨ縦列ペプチド（Ａ）の初期濃度のパーセンテージで示す。表２．ＧｎＲH縦列ペプチドの投与量を変化させて免疫した雄の仔ブタの精巣重量 ^a：重点が置かれる区分に該当する動物の個体数／動物の総数精巣重量＜１００グラムであるものは陽性であるとみなし、１００〜１５０グラムの間にあるものは中間、１５０グラムより重いものは陰性であるとみなした。表３：ＣＦＡ中に乳化させた１００μｇの化合物Ｃ、Ｄ、またはＦで予防接種したテンジクネズミの６、７、および１２週目における血清抗ペプチド抗体価。ＩＦＡ中に乳化させた化合物によるブースターワクチン投与は、最初のワクチン投与後６週目に行った。血液サンプルは、あらかじめ採取しておいたものである。力価^a 動物化合物６ｗｐｖ７ｗｐｖ１２ｗｐｖ１Ｃ５．１６．０＞６．５２Ｃ５．１５．０４．８３Ｃ６．１５．４５．４４Ｃ５．０４．９５．０５Ｃ４．６＃^b ６Ｄ３．５４．１４．３７Ｄ１．７１．６２．９８Ｄ３．５３．７３．７９Ｄ −^c − − １０Ｄ２．０２．０＃１１Ｆ５．１５．３５．７１２Ｆ５．０５．０＞６．５１３Ｆ４．５４．７＃１４Ｆ５．２＃１５Ｆ５．０５．２５．３^a ：ゼロ血液サンプルは、計算前に減じてある。力価は、−ｌｏｇ（希釈倍率）として計算した。バックグラウンドの３倍のシグナルを与えた。^b ：実験中に、動物が死んだことを意味する。^c ：力価が検出されなかったことを意味する。測定の最低希釈濃度は、１／１０であった。表４：テンジクネズミの４、８、および１６週間後の血清抗ペプチド抗体。化合物Ｃは、化合物Ｅと比較した。どちらの化合物も、ＣＦＡ中に乳化させたものである。力価^a 動物化合物４ｗｐｖ８ｗｐｖ１６ｗｐｖ１Ｃ２．２３．７３．８２Ｃ２．１２．４２．８３Ｃ２．２３．８３．８４Ｅ −^b ３．０４．０５Ｅ２．１３．５４．６６Ｅ２．１２．４２．５^a ：ゼロ血液サンプルは、計算前に減じてある。力価は、−ｌｏｇ（希釈倍率）として計算した。バックグラウンドの３倍のシグナルを与えた。^b ：−は、力価が２．０より低い値であったことを意味する。表５：１００μｇのパルミトイル化ペプチド（Ｓ、またはＮ）、複合ペプチド（ＫＬＨ−ＭＢＳ）、またはブロックペプチド（ヨードアセトアミド）で免疫したテンジクネズミの４および８週間後の血清抗ペプチド抗体価。力価^a 動物化合物４ｗｐｖ８ｗｐｖ１Ｅ２．５２．５２Ｅ４．０３．３３Ｅ３．１３．４４Ｄ１．８２．９５Ｄ −^b ３．４６Ｄ − ２．３７Ｆ２．５２．２８Ｆ２．７２．０９Ｆ − − １０Ｇ − １１Ｇ − − １２Ｇ − −^a ：ゼロ血液サンプルは、力価の計算前に減じてある。力価は、−ｌｏｇ（希釈倍率）として計算した。バックグラウンドの３倍のシグナルを与えた。^b ：−は、力価が検出されなかったことを意味する。測定の最低希釈濃度は、１／３０であった。表６：ネコの血清抗ペプチド抗体価動物化合物力価^a １Ｈ／ＩＦＡ１．６０２Ｈ／ＩＦＡ０．８５３Ｈ／ＩＦＡ１．７０４Ｈ／ＩＦＡ１．３５５Ｈ／ＩＳＣＯＭ０．２０６Ｈ／ＩＳＣＯＭ１．３５７Ｈ／ＩＳＣＯＭ０．０７８Ｈ／ＩＳＣＯＭ１．２５９Ｉ／ＣＴ−ＳＣ０．１５１０Ｉ／ＣＴ−ＳＣ０．１０１１Ｉ／ＣＴ−ＳＣ０．１２１２Ｉ／ＣＴ−ＳＣ０．０２１３Ｉ／ＣＴ−Ｒ０．０６１４Ｉ／ＣＴ−Ｒ０．０１１５Ｉ／ＣＴ−Ｒ０１６Ｉ／ＣＴ−Ｒ０１７Ｉ／ＣＴ−ＩＮ０．０２１８Ｉ／ＣＴ−ＩＮ０．１０１９Ｉ／ＣＴ−ＩＮ０．０１２０Ｉ／ＣＴ−ＩＮ０．１５２１コントロール０２２コントロール０２３コントロール０２４コントロール０^a 力価は、光学濃度からバックグラウンドを引いた値である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年６月２６日（１９９８．６．２６）【補正内容】請求の範囲１．ある特定の生理条件下で不安定であり、解離するチオエステルもしくはジスルフィド結合により直接もしくは間接に連結している抗原および脂肪酸もしくは脂肪酸ペプチド担体化合物から成ることを特徴とするワクチン。２．該抗原がワクチンまたはその調製物の投与後、該抗原が該担体化合物から解離することを特徴とする請求項１記載のワクチン。３．該抗原がタンパク質、ポリペプチド、合成ペプチド、炭水化物、またはハプテンである請求項１または２記載のワクチン。４．該抗原が合成ペプチドである請求項３記載のワクチン。５.該脂肪酸がパルミチン酸である請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン。６．該合成ペプチドが実質的にアミノ酸配列／EHWSYGLRPGQHW-SYGLRPGから成ることを特徴とする請求項４または５記載のワクチン。７．該合成ペプチドが実質的にアミノ酸配列SDGAVQPDGGQPA-VRNERATGから成ることを特徴とする請求項４または５記載のワクチン。８．該合成ペプチドが実質的にアミノ酸配列RAISSWKQRNRW-EWPRDから成ることを特徴とする請求項４または５記載のワクチン。９．該抗原がペプチドであり、該担体化合物が脂肪酸に結合した該ペプチドのもう一つのコピーであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン。１０．該担体化合物がＮ−パルミトイル化ペプチドである請求項９記載のワクチン。１１．該ペプチドが実質的にアミノ酸配列SDGAVQPDGGQPAVR-NERATGから成ることを特徴とする請求項９または１０記載のワクチン。１２．製薬的に可能な化合物またはアジュバントと共に請求項１〜１１のいずれかで調製したワクチン調製物。１３．チオエステル結合を介して脂肪酸に連結した合成ペプチドから成ることを特徴とする組成物。１４．該脂肪酸がパルミチン酸である請求項１３記載の組成物。１５．該ペプチドがEHWSYGLRPGQHWSYGLRPG、SDGAVQPD-GGQPAVRNERATGおよびRA ISSWKQRNRWEWPRDから成る群より選択されることを特徴とする請求項１３または１４記載の組成物。１６．合成ペプチドがジスルフィド結合を介して担体化合物に連結しており、該担体化合物が該合成ペプチドのもう一つのコピーに連結した脂肪酸であることを特徴とする組成物。１７．該脂肪酸がパルミチン酸である請求項１６記載の組成物。１８．該ペプチドがEHWSYGLRPGQHWSYGLRPG、SDGAVQPD-GGQPAVRNERATGおよびRA ISSWKQRNRWEWPRDから成る群より選択されることを特徴とする請求項１６または１７記載の組成物。１９．生理的条件下で不安定であり、解離する化学結合を介して合成ペプチドを担体化合物と連結させることを特徴とする免疫原調製物の製造方法。２０．該脂肪酸がパルミチン酸である請求項１９記載の方法。２１．該ペプチドがEHWSYGLRPGQHWSYGLRPG、SDGAVQP-DGGQPAVRNERATGおよびRA ISSWKQRNRWEWPRDから成る群より選択されることを特徴とする請求項１９または２０記載の方法。２２.請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法により得られる免疫原調製物。２３．製薬的に可能な化合物またはアジュバントと共に調製した請求項２２記載の免疫原調製物から成ることを特徴とするワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者スファーペル，ウィルヘルムスマルティニュスマリアオランダ国エヌエル―1313 エンイェーアルメーレデスペーセレイ 70 (72)発明者ダルスハールト，クリスチャンデンマーク国ディーケー―4771 カルフェハフェニーフォルディングボルフフェイ 80 (72)発明者メルーン，ロベルトハンスオランダ国エヌエル―8231 アーペーレリスタットカルフェール 10―04

Claims

【特許請求の範囲】１．ある特定の生理条件下で不安定であり、解離する化学結合により直接もしくは間接に連結している抗原および担体化合物から成ることを特徴とするワクチン。２．該抗原がワクチンまたはその調製物の投与後、該抗原が該担体化合物から解離することを特徴とする請求項１記載のワクチン。３．該抗原がタンパク質、ポリペプチド、合成ペプチド、炭水化物、またはハプテンである請求項１または２記載のワクチン。４．該担体化合物がタンパク質または脂肪酸または脂肪酸ペプチドである請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン。５．該化学結合がチオエステルまたはジスルフィド結合である請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン。６．該抗原がチオエステルアシル化反応により脂肪酸に連結していることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン。７．該抗原が合成ペプチドである請求項６記載のワクチン。８.該脂肪酸がパルミチン酸である請求項４〜７のいずれかに記載のワクチン。９．該合成ペプチドが実質的にアミノ酸配列／EHWSYGLRPWGQHW-SYGLRPGから成ることを特徴とする請求項７または８記載のワクチン。１０．該合成ペプチドが実質的にアミノ酸配列／SDGAVQPDGGQP-AVRNERATGから成ることを特徴とする請求項７または８記載のワクチン。１１．該合成ペプチドが実質的にアミノ酸配列／RAISSWKQRNRW-EWPRDから成ることを特徴とする請求項７または８記載のワクチン。１２．該抗原がペプチドであり、該担体化合物が脂肪酸に結合した該ペプチドのもう一つのコピーであることを特徴とする請求項５記載のワクチン。１３．該担体化合物がＮ−パルミトイル化ペプチドである請求項１２記載のワクチン。１４.該ペプチドが実質的にアミノ酸配列／SDGAVQPDGGQPAVR-NERATGから成ることを特徴とする請求項１２または１３記載のワクチン。１５．製薬的に可能な化合物またはアジュバントと共に請求項１〜１４のいずれかで調製したワクチン調製物。１６．チオエステル結合を介して脂肪酸に連結した合成ペプチドから成ることを特徴とする組成物。１７．該脂肪酸がパルミチン酸である請求項１６記載の組成物。１８．該ペプチドがEHWSYGLRPGQHWSYGLRPG、SDGAVQP-DGGQPAVRNERATGおよびRA ISSWKQRNRWEWPRDから成る群より選択されることを特徴とする請求項１６または１７記載の組成物。１９．合成ペプチドがジスルフィド結合を介して担体化合物に連結しており、該担体化合物が該合成ペプチドのもう一つのコピーに連結した脂肪酸であることを特徴とする組成物。２０．該脂肪酸がパルミチン酸である請求項１９記載の組成物。２１．該ペプチドがEHWSYGLRPGQHWSYGLRPG、SDGAVQP-DGGQPAVRNERATGおよびRA ISSWKQRNRNVEWPRDから成る群より選択されることを特徴とする請求項１９または２０記載の組成物。２２．生理的条件下で不安定であり、解離する化学結合を介して合成ペプチドを担体化合物と連結させることを特徴とする免疫原調製物の製造方法。２３．該担体化合物が脂肪酸であるかまたは該合成ペプチドのもう一つのコピーに連結した脂肪酸である請求項２２記載の方法。２４．該脂肪酸がパルミチン酸である請求項２３記載の方法。２５．該ペプチドがEHWSYGLRPGQHWSYGLRPG、SDGAVQP-DGGQPAVRNERATGおよびRA ISSWKQRNRWEWPRDから成る群より選択されることを特徴とする請求項２３または２４記載の方法。２６.請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法により得られる免疫原調製物。２７．製薬的に可能な化合物またはアジュバントと共に調製した請求項２６記載の免疫原調製物から成ることを特徴とするワクチン。