JP2000513565A - 組換え欠陥ウイルスゲノムに基づくベクター及びワクチン製剤におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明のベクターは、全身性及び分泌性免疫応答の誘発に適する少なくとも１つの抗原又は感染作用物に対して保護を与える抗体を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムを含んでいる。上記欠陥ウイルスゲノムは、３'及び５'末端に位置するウイルスレプリカーゼ認識シグナルを有する親ウイルスゲノムを含み、更に内部欠失を含んでおり、そして上記欠陥ウイルスゲノムはその複製及びキャプシド化をヘルパーウイルスに依存している。これらのベクターは上記発現ベクター及びヘルパーウイルスを含んでいる組換え系の形成に適している。この系は、種々の動物種、特にブタ、イヌ及びネコ感染作用物に対する単価及び多価ワクチンの製造に適しており、そして感染作用物に対して保護的な抗体用の発現媒体として適切である。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え欠陥ウイルスゲノムに基づくベクター及び ワクチン製剤におけるそれらの使用 本発明のベクターは、全身性及び分泌性免疫応答の誘発に適する少なくとも１ っの抗原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムを含んでいる。本発明の欠陥ウイ ルスゲノムは、３'及び５'末端に配置されたウイルスレプリカーゼ認識シグナル を有しそして更に内部欠失を有する親ウイルスゲノムを含んでおり、そしてこの 欠陥ウイルスゲノムはその複製をヘルパーウイルスに依存している。これらのベ クターは、（ａ）上記の発現ベクターと（ｂ）欠陥ゲノムの複製及びキャプシド 化用の機能及び構造タンパク質を提供するヘルパーウイルス、を含んでいる組換 え系の形成に適している。この系は種々の動物種、特にブタ、イヌ及びネコの感 染作用物に対する単価及び多価ワクチンの製造に適している。 発明の分野 本発明は、粘膜感染を予防するために全身性及び分泌性免疫応答を誘発するの に適する抗原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づく多数のベクターに関 するものであり、そしてワクチン目的でこれらベクターを適当なヘルパーウイル スと一緒に使用することに関するものである。 発明の背景 発現ベクターを使用して組換えタンパク質を達成することは周知の事実である 。一般的に、原核生物及び酵母の発現系は非常に有効でありそして使用し易いが 、優れた真核細胞を含有する使用された発現系はタンパク質産生値の低さや宿主 範囲の制限に関して多数の欠点を示している。優れた真核細胞の現存する発現系 のうちで、バクロウイルスに基づくベクターはタンパク質産生に関して最も有効 である。しかし乍らこれらは、知られているように、動物細胞とは異なる方法で タンパク質をグリコシル化する昆虫細胞でしか使用できない。加えて、組換えウ イ ルスの構築は同種組換えによって行われるが、これは、特に多数の遺伝子変異体 を分析しなければならないとき、骨の折れる技術である。 他方、異種遺伝子発現に適するＤＮＡウイルスに基づくベクターが知られてい る。しかし乍ら、ＤＮＡに基づくベクターの使用では、これらが宿主細胞の核で 複製しそしてゲノムに組込まれる可能性があるので信頼性がないため多数の欠点 が示されている。反対に、ＲＮＡに基づくベクターを使用すると、これらは宿主 細胞のゲノムではなくて細胞質中で複製し、複製がＤＮＡではなくてＲＮＡによ って行われそしてゲノムへの組込みの可能性が非常に低いため、これらのＲＮＡ ウイルスに基づくベクターが一層確実なものになるので、ＤＮＡウイルスの使用 に関連した欠点が克服される。 ビリオンキャプシドを含有する欠陥干渉粒子（ＤＩ）や欠陥ゲノムも良く知ら れており、そしてこれらは殆どが複製エラーによって感染性ウイルスゲノムから 産生される欠失サブゲノム突然変異体である。一般的に、用語「ＤＩ粒子」はＲ ＮＡ又はＤＮＡゲノムの或る領域を欠き、ウイルスのタンパク質及び抗原を含有 し、複製には感染性親ウイルス（ヘルパーウイルス）の同時感染を必要とする欠 陥ウイルスを言い、そしてこれら欠陥ウイルスは同種ヘルパーウイルスを犠牲に して複製するので同種ヘルパーウイルスと特異的に干渉する[Huang及びBaltimor e、Nature、226、325〜327(1970年)]。ＤＩゲノムは、１つのＲＮＡ鋳型から別 のＲＮＡ鋳型に又はＲＮＡ鋳型の１つの断片から同じ分子の別の断片にＲＮＡポ リメラーゼがシフトした結果として、ゲノム再編成から生じる。これらのＤＩゲ ノムは一度生成すると、親ゲノム又は複製及びキャプシド化に関与するタンパク 質をコードする増幅ウイルスを犠牲にして自己増幅し、そして親ウイルス又は増 幅ウイルスはこのような生成物について欠陥ゲノムと競合しなければならない。 ＤＩ粒子は或る種のコロナウイルス、例えば、ネズミ肝炎ウイルス(ＭＨＶ)、 感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）及びウシコロナウイルス（ＢＣＶ）から得ら れそして特徴が決定されているが、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）から 誘導されるＤＩ粒子は記載されていない。ＭＨＶ天然ＤＩ粒子の１つは、外来遺 伝子が内部プロモーター転写配列の制御下に挿入されている発現ベクターを開発 する基礎として使用されてきた［Lin及びLai、J．Virol.、6110〜6118、10月（1 993年）］。 一般的に、ＤＩ粒子に基づく既知の異種遺伝子発現ベクターはそれらの種及び 標的器官特異性に関連して幾つかの欠点を有しており、そしてクローニング能力 が制限されているので、基礎的な研究とワクチンを含む治療目的でこのようなベ クターの開発に適用される研究の両方でこれらの使用可能性が制限されている。 従って、上記した欠点を成功裏に克服できる異種遺伝子発現ベクターの需要が 依然として存在する。詳細には、安全性やクローニング能力の値が高くそして種 特異性や向性を容易に制御できるように設計できる幾つかの異種遺伝子発現ベク ターを利用できることが非常に有利であろう。 本発明はこの課題に対する解決を提供し、そしてこの解決は種々の動物種にお ける免疫応答の誘発及び種々の感染作用物によって生じる感染の予防に適する抗 原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づくベクターを含んでいる。本発明 によって提供される異種遺伝子発現ベクター（又はＤＮＡ配列）は高い安全性値 並びに高いクローニング能力を有しているので、これらの種特異性及び向性を容 易に制御できるように設計して、種々の動物種において種々の感染作用物によっ て生じる感染に対して保護を与え得るワクチン製剤に適するベクターを作成する ことができる。 それ故、本発明の目的は、免疫応答−詳細には、種々の動物種における感染作 用物に対する全身性及び分泌性免疫応答−又は感染作用物に対して保護を提供し 高い安全性値やクローニング能力値を備えた抗体の誘発に適する少なくとも１つ の抗原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づくベクターであり、そしてこ れは種特異性や向性を容易に制御できるように設計することができる。 上記ベクターを構築する基礎として役立つ欠陥ウイルスゲノムも本発明の更な る目的である。 本発明のもう１つの目的は、（ａ）上記したベクター及び（ｂ）組換え欠陥ウ イルスゲノムの複製及びキャプシド化に関与するタンパク質を提供するヘルパー ウイルス、を含んでいる異種タンパク質の組換え発現系である。 本発明の更にもう１つの目的は、種々の動物種において種々の感染作用物によ って生じる感染に対して保護を誘発し得るワクチンであり、そしてこれは製薬的 に許容可能な賦形剤と一緒に、上記した組換え系を含んでいる。これらのベクタ ーは、組換え系中に存在する発現ベクターが１つ若しくはそれより多い感染作用 物に対して免疫応答を誘発し得る１つ若しくはそれより多い抗原を発現するのか 、又は１つ若しくはそれより多い感染作用物に対して保護を提供する１つ若しく はそれより多い抗体を発現するのかに依存して単価又は多価であることができる 。 本発明によって提供される他の目的には動物の免疫感作方法が含まれ、そして これは上記組換え系又はワクチンの投与並びに新生動物種に感染する感染作用物 から新生動物を保護する方法からなっている。 図面の簡単な説明 図１はＴＧＥＶの構造を示す。ビリオンは、内郊が28.5キロベース（kb）の正 の極性の一本鎖ＲＮＡ分子である脂質エンベロープからなる球形粒子である。こ のＲＮＡはヌクレオキャプシドを形成するＮタンパク質に関係している。Ｍ及び ｓＭ構造タンパク質は膜内に含まれている。タンパク質Ｓは三量体の一員であり 、そしてペプロマーを形成しているエンベロープの外部に固定されている。 図２は、配列が決定された４つのコロナウイルス:ＭＨＶ、ＩＢＶ、ＨＣＶ229 Ｅ(ヒトコロナウイルス229Ｅ)及びＴＧＥＶのゲノム構成を示す。各タンパク質 をコードする読取り枠は目盛りに対して示されている。各ゲノムにおいて、各ウ イルスを発現するＲＮＡの開始点は矢印で示されている。ウイルスＭＨＶ又はＴ ＧＥＶによって発現されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の数はウイルス株 に依存して変動する可能性がある。この略図では、ＴＧＥＶの矢印は株ＴＨＥＲ -１によって発現されるｍＲＮＡに対応する。これらのｍＲＮＡは３'が共通末端 であり、そして大きいものから順に番号付けされている。 図３は、ＴＧＥＶゲノム、株ＴＨＥＲ-１の発現を示す。このゲノムの読取り 枠(ＯＲＦ)の配置が示されている:Pol、ポリメラーゼ;Ｓ、ｓＭ、Ｍ及びＮ、構 造タンパク質; nsp ３a、３b及び７、非構造タンパク質(タンパク質３bはこのウ イルスでは産生されない)。このゲノムは、同じ長さであるが、７つのｍＲＮＡ （１〜７）を合成する鋳型として役立つ負の極性(−)のＲＮＡ中で転写される。 各ｍＲＮＡでは、５'末端の共通配列、リーダー(四角)、３'末端のポリアデニン 部分及びこれらの各々で転写される領域（太線）が示されている。 図４は、ＳＴ細胞中高い感染多重度（m.o.i.）での継代数に伴うＴＧＥＶのＴ ＨＥＲ-１（Ａ）及びＰＵＲ46-marlＣＣ12（Ｂ）単離物の力価の進展を示す。 図５は、高いm.o.i.で46回継代したＴＨＥＲ-１ウイルスを用いて感染させた ＳＴ細胞中で産生されたＲＮＡの電気泳動分析の結果を示す。継代数は各レーン の上部に示し、そして左側のスケールは、kbで表される分子量マーカー（ＴＧＥ Ｖ及びGibcoＢＲＬマーカーのゲノムＲＮＡ）の位置を示す。右側のスケールは ＴＧＥＶ ｍＲＮＡ及び欠陥干渉（ＤＩ）ＲＮＡを示す。ＮＩ、感染なし。 図６は、ＴＨＥＲ-１ｐ35ウイルスで感染させたＳＴ細胞のＲＮＡのノーザン ブロットアッセイの結果を示す。 図７は、ＳＴ細胞中におけるＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスの希釈継代物から 進めるＲＮＡのノーザンブロットアッセイの結果を示す。 図８は、欠陥ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣの増殖に与える細胞系統変動の影響を示す 。ウイルスＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46はＩＰＥＣ（ブタ腸上皮細胞）中希釈しないで1 0回継代し、そしてＰＭ（ブタマクロファージ）細胞中で５回継代した。図８Ａ 及び８Ｂ:それぞれＩＰＥＣ及びＰＭ中での継代数に伴うウイルスカ価の進展。 図８Ｃ:ＩＰＥＣ（32Piによる代謝物標識によって）中での継代数１及び10又は ＰＭ細胞（リーダーＲＮＡに相補的な１個のオリゴヌクレオチドとのハイブリッ ド形成によって）中での継代数１及び５のウイルスで感染させたＳＴ細胞のＲＮ Ａの分析。 図９は、欠陥ゲノムＡ、Ｂ及びＣのキャプシド化を示す。図９Ａは、臭化エチ ジウムで染色したアガロースゲルを示し、ここでは継代数１及び継代数41の精製 ビリオンから抽出されたＲＮＡは、15％のスクロースクッション(ｗ／ｖ)による 遠心によって分析されている。継代数41のレーンでは、親ゲノムのみならずＲＮ Ａ Ａ、Ｂ及びＣを観察することができる。左側のスケールは移動マーカーをkb で示している。図９Ｂは、リーダーＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを用い るノーザンブロットアッセイによって、スクロースクッション又は連続傾斜によ る遠心で精製した継代数41のビリオンのＲＮＡの分析結果を示す。市販のGibco ＢＲＬのＲＮＡ及び継代数１のビリオンのＲＮＡ(レーンａ)をマーカーとして使 用した。レーンｂ及びｃ、それぞれ31％及び15％のスクロースクッション（ｗ／ ｖ）で沈殿させたビリオンから抽出したＲＮＡ。レーンｄ及びｅ、連続スクロー スクッションで精製したウイルスから抽出したＲＮＡ、それぞれ1.20及び1.15ｇ ／mlのフラクション。 図10は、欠陥ＲＮＡのＤＩ-Ｂ及びＤＩ-Ｃのクローニング方法を示しており、 この図では、鋳型として全長ゲノムＲＮＡ（Ａ）、ＤＩ-Ｂ（Ｂ）及びＤＩ−Ｃ （Ｃ）を使用し、ＲＴ-ＰＣＲで得られた相補的なＤＮＡフラグメント（ｃＤＮ Ａ）の概略図を見ることができる。点線は、サイズが大きいため予想されたフラ グメントの不存在を示している。欠陥ＲＮＡは線で示した４つの重複フラグメン ト（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）にクローン化された;これらの線の下の数字はアガロー スゲル中で決定されたフラグメントの大きさを示す。プライマーとして使用した オリゴヌクレオチドとそれらの極性は矢印と数字で示す。オリゴヌクレオチドの 配列は表２に示す。（Ａ）中の縞模様又は白い箱はウイルス遺伝子の相対的位置 を示している:pol、ポリメラーゼ;Ｓ、Ｍ及びＮ、構造遺伝子;３a、３b、ｓＭ及 び７、小さいＯＲＦ。陰影を付けた細い箱はリーダー配列を示す。 図11は、欠陥ＲＮＡの増幅で得られたＰＣＲ生成物の電気泳動分析の結果を示 す。オリゴヌクレオチド１及び２(ａ)、３及び４(ｂ)、５及び６（ｃ）又は７及 び８（ｄ）とのＲＴ-ＰＣＲ反応では精製ビリオンＴＨＥＲ-１ｐｌ又はＴＨＥＲ -１ｐ41のＲＮＡが鋳型として使用され、そして親ゲノムにおけるこれらオリゴ ヌクレオチドの配列と位置は表２に示す。継代数１（親ゲノムＲＮＡ）又は継代 数41（親ＲＮＡ、ＤＩ-Ａ、ＤＩ-Ｂ及びＤＩ-Ｃ）のＲＮＡ鋳型に対応するレー ン、及びＤＮＡ移動性マーカー（Ｍ、GibcoＢＲＬ）のレーンが各々の場合に示 されている。肉太タイプの数字は、欠陥ＲＮＡに特異的な増幅生成物の大きさを kbで示している。ＲＮＡ Ｂ＋Ｃ、即ちＢとＣのＲＮＡ:ＴＨＥＲ-１ ＳＴｐ41 ウイルスのＲＮＡをゲルで分画する実験で精製されたバンド。ＢとＣのＲＮＡは 非常に近接して移動したので、単一バンドとして切断された。 図12は、ａ、ｂ、ｃ及びｄクローニングの重複フラグメントの配列決定によっ て得られた完全なＲＮＡ ＤＩ-Ｃ ｃＤＮＡ配列（配列識別番号24参照）を示す 。 ＲＮＡ ＤＩ-Ｃは４つの不連続親ゲノム領域:I、II、III及びIVを保持している 。これらの領域のフランキング部位は矢印で示されている。ゲノムＤＩ-Ｃ中に 存在する３つのＯＲＦ:相中の不連続領域IとIIの融合から生じる6.7kbのキメラ ＯＲＦ；相中の上記ＯＲＦに先行するアミノ酸３個のミニ-ＯＲＦ、及び遺伝子 ＳのＡＵＧで始まるＯＲＦ、の翻訳が示されている。高度に同種の領域−これら はポリメラーゼ及びヘリカーゼ活性に関与しているので、他のコロナウイルスで 記載されたタンパク質ドメイン及び金属イオン結合部位を有する−には陰影が付 けられている。ＣＴＡＡＡＣ転写プロモーター配列には陰影が付けられている。 ＯＲＦ１ａと１ｂの間の重複部分（41個のヌクレオチド）には陰影が付けられて おり、リボソームのスリッパリィ（slippery）配列には下線が引かれており、そ してＯＲＦ1ａ終結コドンは箱で囲まれている。637、6397及び6485位では、親ゲ ノムに関して特異的な変化が示されている。親ゲノムのこれらの位置に存在する ヌクレオチドが示されている。 図13は、ＲＮＡ ＤＩ-Ｃ構造の略図である。総ゲノム長は箱の右に見られる。 ＲＮＡ ＤＩ-Ｃは４つの不連続ＴＧＥＶゲノム領域（Ｉ、II、III及びIV）を含 んでいる。これらの領域は2.1kbのゲノム５'末端、ＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領 域を含むほぼ完全なＯＲＦ１ｂ、遺伝子Ｓの開始部、不完全なＯＲＦ7及び非翻 訳領域３'を含んでいる。親ゲノムの箱の上部の文字と数字はウイルス遺伝子を 示している。箱の下部の数字は、ＴＧＥＶ ＰＵＲ46-ＰＡＲ単離物の配列を参照 して、不連続領域のフランキングヌクレオチドの親ゲノム中の位置を示している 。ＲＮＡ ＤＩ-Ｃに対応する箱には４つの不連続領域の長さをヌクレオチドで示 している。３番目の箱では、ＯＲＦ１ａと１ｂの43個のヌクレオチドが親ゲノム 中で互いに重なっていることを考慮に入れて、各ウイルス遺伝子から誘導される ヌクレオチドの数を示している。コンピューター分析で予測されたＯＲＦは矢印 又は籏で示している。Pnt、プソイドノット;Pol、ポリメラーゼ;Mib、金属イオ ン結合部;Hel、ヘリカーゼ;Cd、保持ドメイン。 図14は、ＲＮＡ ＤＩ-Ｂの構造を示す。ＲＮＡ ＤＩ-ＢはＴＧＥＶゲノムの３ つの不連続領域（Ｉ、II及びIII）を含有しており、そしてこれらは2.1kbのゲノ ム５'末端、ＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領域を含む完全なＯＲＦ１ｂ、遺伝子 Ｓの開始部、ＯＲＦ7の終結部及び３'末端の非翻訳領域を含んでいる。親ゲノム の箱の上部の文字と数字はウイルス遺伝子を示している。箱の下の数字は、ＴＧ ＥＶ ＰＵＲ46-ＰＡＲ単離物の配列を参照して、不連続領域のフランキングヌク レオチドの親ゲノム中の位置を示している。不連続領域IIとIIIの間に生じてい る欠失の大きさが不均一性であるためＤＩ-Ｂゲノム集団が実際に存在している 。２番目と３番目の箱では、それぞれ最大及び最小の大きさのゲノムについて３ つの不連続領域のヌクレオチドの長さを示している。３番目の箱では、ＯＲＦ１ ａと１ｂの43個のヌクレオチドが親ゲノム中で互いに重なっていることを考慮に 入れて、各ウイルス遺伝子から誘導されるヌクレオチドの数を示している。コン ピューター分析で予測されたＯＲＦは矢印又は簇で示している。Pnt、プソイド ノット;Pol、ポリメラーゼ;Mib、金属イオン結合部;Hel、ヘリカーゼ;Cd、保持 ドメイン。 図15は、ＲＮＡ ＤＩ-Ｃ中のＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領域のＲＮＡの二次及 び三次構造を示す。（Ａ）はプソイドノット（ヌクレオチド2354〜2358）を構成 するノットのヌクレオチドに相補性を示すフォーク様構造に最も近接した領域を 考慮したとき予測された構造。スリッパリィ配列ＵＵＵＡＡＡＣには下線が引か れている。ＯＲＦ１ａ終結コドンが箱で示されている。（Ｂ）は２つの配列相補 性部分（幹：Ｓ1及びＳ2）を含んでいる上記プソイドノットの概略図。スリッパ リィ配列は箱で示されている。（Ｃ）はプソイドノットの折り畳み中のヌクレオ チド2489から2493の配列を考慮に入れた別のモデル。この構造は更なる相補性配 列（幹）部分を含んでいる。（Ｄ）は３つの幹に印を付けたプソイドノットの概 略図:Ｓ1、Ｓ2及びＳ3。 図16は、ノーザンブロットアッセイでウイルスに特異的なオリゴヌクレオチド とのハイブリッド形成によるＲＮＡ ＤＩのマップ作成を示す。ＴＨＥＲ-1-ＳＴ ｐ41ウイルスのＲＮＡは、親ゲノムＲＮＡ並びにＤＩ Ａ、Ｂ及びＣが明白に分 離されるまでアガロースゲルで分画した。ＲＮＡをナイロンフィルターに移し、 そしてこれは³²ｐ_iで標識した数個のオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成 し、親ゲノムとハイブリッドを形成し（＋）そして欠陥ゲノムとハイブリッドを 形成し（＋）又は形成しなかった（−）。親ゲノムのオリゴヌクレオチドと相補 的な配列の凡その位置は矢印で示されている。これらの正確な配列と位置は表３ に示す。これらのオリゴヌクレオチドは全て親ゲノムとハイブリッドを形成し、 そしてＲＮＡ Ｂ及びＣと予想される結果を示した。 図17は、ＲＮＡ ＤＩ-Ｃで感染させた細胞のトランスフェクションによってワ クチン用ウイルスを取得する方法の概略を示す。元の欠陥粒子中に存在する５' 及び３'末端を維持し乍ら、インビトロ転写によってＤＩ-Ｃ ＲＮＡの産生を可 能にした構築に関する標準的な概略を示す。Ｔ7プロモーター［ＰｒＴ7］の配列 及び肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）の自己触媒リボザイム［ＲｚＨＤＶ］の配列 をＤＩ-Ｃ ＲＮＡ配列のフランキングにクローン化した。リボザイムで導入され た自己触媒開裂位置は配列の上部に印が付けられている。矢印はＲＮＡ ＤＩ-Ｃ 中の天然形態で維持された内部転写プロモーター配列の位置を示す。Ｌ、リーダ ー。Ｔ7φ、Ｔ7バクテリオファージ転写終結シグナル。異種遺伝子がクローン化 されている欠陥ゲノムとヘルパーウイルスの両方がキャプシド内に入っているビ リオンは、インビトロで転写されたＲＮＡを対応するヘルパーウイルスで感染さ せたＳＴ細胞中にトランスフェクションしたときに回収された。 図18は、元の欠陥粒子中に存在する３'及び５'末端を維持し乍ら、インビトロ 転写によってｐＤＩＡ-６Ａ.Ｃ３の産生を可能にした構築の標準的な概略を示す 。バクテリオファージＴ7プロモーター［ＰｒＴ7］の配列及び肝炎デルタウイル ス（ＨＤＶ）の自己触媒リボザイム［ＲｚＨＤＶ］の存在は、自己複製ＲＮＡを コードするｃＤＮＡ配列のフランキングにクローン化した。プラスミドｐＤＩＡ -６Ａ.Ｃ３は、ＴＧＥＶを無効化するモノクローナル抗体６Ａ.Ｃ３をコードす る遺伝子を含有している[実施例４参照]。異種遺伝子のクローニングは、Ｓ遺伝 子開始コドン（ＡＵＧ）に続くＯＲＦ１ｂの後にそしてこの遺伝子の読取り相内 に実施した（ＩＧＳ:遺伝子間配列;Ｌ：リーダー配列;Ｄ;多様性領域;Ｊ：結合 領域;ＶＨ：免疫グロブリンＨ鎖の可変モジュール;ＣＨ:免疫グロブリンＨ鎖の 定常モジュール;ＶＫ:免疫グロブリンＬ鎖の可変モジュール;ＣＫ:免疫グロブリ ンＬ鎖の定常モジュール;ポリＡ:ポリＡ配列;Ｔ7φ:Ｔ7転写ターミネーター）。 発明の詳細な説明 本発明は、種々の動物種の種々の感染作用物に対する免疫応答の誘発に適する 少なくとも１つの抗原、又は感染作用物に対して保護を与え、高い安全性とクロ ーニング能力を有する抗体を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づいて異種 ＤＮＡ発現ベクターを提供し、そしてこれらベクターはそれらの種特異性及び向 性を容易に制御できるように設計することができる。 本明細書で使用される意味における用語「感染作用物」には、動物を感染させ そして病理学を生じさせ得るウイルス、細菌又は寄生虫感染作用物が含まれる。 用語「動物種」には、任意の種の動物、通常は哺乳動物、そして特にブタ、イ ヌ又はネコが含まれる。 本発明の特別な具体化では、全身性及び分泌性免疫応答の誘発、粘膜感染の予 防に適する抗原を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づいて、種特異性や腸 又は呼吸器粘膜の感染に対する向性を容易に制御できるように設計され、そして それによって、腸管の感染に対する新生動物の保護に特に有益な粘膜及び乳腺刺 激性免疫の誘発に完全に適合されている発現ベクターが得られる。本発明のもう １つの特別な具体化では、感染作用物に対する保護を提供する少なくとも１つの 抗体を発現する組換え欠陥ウイルスゲノムに基づく発現ベクターが提供される。 本発明によって取得される発現ベクターは、ウイルス、好ましくはＲＮＡゲノ ムと正の極性を有するウイルスから誘導され、親ウイルスの３'及び５'末端を維 持し、内部欠失を有しそしてその複製をヘルパーウイルスに依存する欠陥ウイル スゲノムを含んでいる。それ故、本発明は３'及び５'末端に位置するウイルスレ プリカーゼ認識シグナルを有する親ウイルスのゲノムを追加的に含んでおり、更 に内部欠失も含んでいる欠陥ウイルスゲノムを提供し、そしてこの欠陥ウイルス ゲノムは組換え欠陥ウイルスゲノムの複製及びキャプシド化用の機能及び構造タ ンパク質を供給するヘルパーウイルスに依存している。特別な具体化では、欠陥 ウイルスゲノムは、追加的に、親ウイルスレプリカーゼをコードする完全な配列 を含んでいる。この場合には、希望する場合、ヘルパーウイルスは組換え欠陥ウ イルスゲノムのキャプシド化に必要な構造タンパク質だけを提供するか、又はそ うではなくて組換え欠陥ウイルスゲノムの複製及びキャプシド化用の機能及び構 造タンパク質を提供することができる。組換え欠陥ゲノムが由来するウイルスが ＲＮＡゲノムを有するウイルスであるとき、発現ベクターは上記した欠陥ＲＮＡ と相補的なｃＤＮＡ又は上記した欠陥ＲＮＡと実質的に相補的なｃＤＮＡを含ん でいる。 本発明によって提供されるベクターは高いクローニング能力−少なくとも18kb −を有しており、これはＲＮＡ真核ウイルスに基づくベクターで記載された最大 のクローニング能力である。更に、これらのベクターは、（ａ）欠陥ゲノムに基 づいており、（ｂ）ＲＮＡゲノムを含んでおり且つ複製中間体としてＤＮＡを使 用しておらず、そしてｃ）感染細胞の細胞質中で増殖するウイルスに基づいてお り、これらａ）〜ｃ）は全て欠陥ゲノムと細胞染色体との組換えを妨げるので、 安全性レベルが高ぃ。 本発明の特別な具体化では、コロナウイルスから、特にＴＧＥＶから誘導され る欠陥ＲＮＡゲノムの取得を記載する。これらのゲノムは非常に低いＴＧＥＶ組 換え頻度（＜１×10⁹）という更なる利点を有しており、そしてこれによって欠 陥ゲノムとヘルパーウイルスゲノムとの容易な組換えが妨げられる。しかし乍ら 、たとえこの組換えが実際に生起したとしても、本発明は弱毒ウイルスをヘルパ ーウイルスとして且つ欠陥ゲノム取得用の出発材料として使用することの便宜性 を意図しているので、弱毒ウイルスが得られよう。 このようなベクターの基礎を構成する欠陥ゲノムは、これらが誘導されるウイ ルスの非希釈連続継代によって種々の細胞系で得ることができる。ＤＩ粒子の産 生頻度は種々のウイルス−細胞系で非常に変動する可能性がある;この理由のた め、適当な単離物及び細胞系統を選択するという目的で種々の細胞系統中で種々 のウイルス単離物を用いて継代物を作ることが推奨される。或る継代数後に、ウ イルスを単離し、そしてその後、これを使用してどのウイルスｍＲＮＡにも対応 しないバンドの出現の可能性を観察する目的で、感染で産生された細胞内ＲＮＡ を分析し、そして上記のバンドが出現した場合には、これらの新しいＲＮＡの性 質−サブゲノムかそれとも欠陥か−を分析するために、親ウイルスを用いた非希 釈連続継代を継続する。数回の継代の後に、連続継代中のＲＮＡパターンの進展 を分析し、そしてこの目的で、適当な細胞系の細胞を種々の継代物から生 じるウイルスで感染させ、そして産生されたＲＮＡは慣用の技術、例えば、³²Ｐ_i による代謝物標識又は適当なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によっ て分析する。ＴＧＥＶから誘導される幾つかの欠陥ＲＮＡの取得及び特徴決定に 関する詳細な説明は実施例１で行う。 欠陥ＲＮＡでは、逆転写（ＲＴ）反応及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増 幅（以下、ＲＴ-ＰＣＲ）によって上記欠陥ＲＮＡに−相補的な又は実質的に相 補的な−対応するｃＤＮＡを取得することができる。この後ｃＤＮＡを有効なプ ロモーターの制御下で適当なプラスミド、例えばブルースクリプト（Ｂluescrip t）IIにクローン化することができる。得られたプラスミドは、複製の調節及び 制御用並びに転写及び翻訳の開始及び終結用のシグナルを含有する幾つかの調節 要素で制御される欠陥ウイルスゲノムを含有している。それ故、これらのプラス ミドはポリＡ配列、自己触媒切断配列又は異種ＤＮＡの挿入を可能にする制限酵 素認識配列、並びに対応する調節、制御及び終結シグナルを含有することができ る。 このようにして得られ、欠陥ゲノム又は対応するｃＤＮＡを含有するプラスミ ドは、欠陥ゲノム中に存在する遺伝子のプロモーター若しくは該欠陥ゲノムが由 来するウイルスの他の任意のプロモーター又はこれらプロモーターの改変体と、 得られた発現ベクター中に含まれる調節配列の制御下で特定の活性をコードする 少なくとも１つの異種ＤＮＡ配列を高い効率でクローン化するために、慣用の遺 伝子工学技術で操作することができる。実施例２は、種々のウイルスに対して保 護を誘発する抗原をコードする発現ベクターの産生を記載している。 本発明で得られる発現ベクターは１つ若しくはそれより多い活性、例えば、種 々の感染作用物に対して免疫応答を誘発し得る１つ若しくはそれより多い抗原、 又は１つ若しくはそれより多い感染作用物に対して保護を提供する１つ若しくは それより多い抗体を発現することができる。１つの特別で且つ好ましい具体化で は、これらのベクターは、呼吸器又は腸粘膜で増殖する種々の感染作用物に対し て全身性免疫応答又は粘膜性免疫応答を誘発し得る少なくとも１つの抗原を発現 する。もう１つの特別で且つ好ましい具体化では、上記発現ベクターは、感染作 用物に対して保護を与える任意のイソタイプ（例えば:IgG₁、IgA等）の抗体のＨ 及びＬ鎖をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する。特別の場合には、発 現される抗体はＴＧＥＶを無効化する６Ａ.Ｃ３として同定されるモノクローナ ル抗体であり(実施例４参照)、そしてこれは免疫グロブリンの定常部分がブタ起 源であるイソタイプIgG₁又はIgAと共に発現される。 本発明の特別な具体化では、誘導された欠陥ＲＮＡの１つのｃＤＮＡを含有す るプラスミド中の異種遺伝子のクローニングは、Ｓ遺伝子開始コドン（ＡＵＧ） に続くＯＲＦ１ｂの後にそしてこの遺伝子の読取り枠内に行われた(実施例２)。 或いは、異種ＤＮＡ配列はこのゲノムの他の領域、例えば、ＴＧＥＶのＯＲＦ１ 、２又は３に対応する領域にクローン化することができる。得られたプラスミド から、適当なポリメラーゼを使用してＲＮＡを発現させ、そしてこれで適当な細 胞−弱毒ヘルパーウイルスで前以て感染させた−を形質転換し、ヘルパーウイル スゲノムを含有するビリオン及び欠陥ゲノムを有する他のビリオンを回収するこ とができた（図17）。 或いは、本発明の発現ベクターは、上記方策を使用して１つ又は幾つかの遺伝 子を発現させることができる。この目的のために、１つ若しくは幾つかのプロモ ーター又は１つのプロモーターと幾つかの内部リボソーム侵入部位(ＩＲＥＳ)、 或いは幾つかのプロモーターと１つの内部リボソーム侵入部位を使用することが できる。 本発明は、（ａ）上記したベクター及び（ｂ）組換え欠陥ウイルスゲノムの複 製及びキャプシド化に関与するタンパク質を助けるヘルパーウイルスを含んでい る異種タンパク質を発現する組換え系も提供する。それ故、異種タンパク質発現 用の組換え系が、少なくとも１つの特定の活性を有するタンパク質を発現する組 換え欠陥ウイルスゲノムに基づいて提供され、該系は： ａ）ｃＤＮＡが得られている場合には、慣用の遺伝子工学によって操作するこ とができる欠陥ウイルスゲノムを含有し、３'及び５'末端に位置するウイルスレ プリカーゼ認識シグナルを含有し、追加的に内部欠失や１つの活性、例えば全身 性及び粘膜性免疫を与え得る抗原;若しくは感染作用物に対して保護を与える抗 体をコードする少なくとも１つの内部ＤＮＡ配列を含んでいる組換えベクター; 並びに ｂ）欠陥ゲノムの複製及びキャプシド化用の機能及び構造タンパク質を提供す るヘルパーウイルス、 を含んでいる。 或いは、上記の異種タンパク質発現用組換え系は、親ウイルスレプリカーゼを コードする完全な配列を含んでいる上記したタイプの発現ベクター、及び欠陥ゲ ノムのキャプシド化用の構造タンパク質と、任意に、欠陥ウイルスゲノムの複製 用の機能タンパク質（レプリカーゼ）を提供するヘルパー親ウイルスを含んでい る。 これらの系によって、感染作用物に対して免疫応答を誘発し得る抗原か又は保 護を与える抗体のどちらかを発現することができ、そしてこのため、これらの系 はワクチン目的でそして感染に対する保護のために使用するのに適している。 本発明はまた、種々の動物種において種々の感染作用物によって生じる感染に 対して保護を誘発し得るワクチンも提供し、そしてこれらのワクチンは(ｉ)（ａ ）異種ＤＮＡ配列がクローン化されている欠陥ウイルスゲノムに基づく発現ベク ターと（ｂ）欠陥ゲノムの複製に一緒になって協力するヘルパーウイルスからな る上記組換え系、任意に、（ii）製薬的に許容可能な賦形剤を含んでいる。それ 故、本発明で提供されるワクチンは種々の動物種に影響を与える種々の感染作用 物に対して免疫を与えるのに適している。 本明細書で使用した意味においては「免疫を与えること」は、上記した組換え 系によって適当なメカニズム、例えば抗原提供細胞、Ｂ及びＴリンパ球、抗体、 細胞の免疫応答を高める物質(インターロイキン、インターフェロン等)、細胞壊 死因子並びに病原性作用物によって生じた感染に対して動物に保護をもたらす類 似物質がレセプター生物（治療される動物）で開始することを意味すると理解す べきである。 本発明で提供されるワクチンは、組換え系に存在する発現ベクターが１つ又は それより多い感染作用物に対して免疫応答を誘発し得る１つ又はそれより多い抗 原を発現するかどうかに依存して、単価又は多価であることができる。発現ベク ターは、１つ又はそれより多い感染作用物に対して保護を与える１つ又はそれよ り多い抗体を発現するかどうかに依存して、単価又は多価であることができる。 種特異性は、ヘルパーウイルスが対応する種の細胞レセプターによる認識に適 しているエンベロープタンパク質を発現するような方法で制御される。本発明で 得られるワクチンの特別の群はコロナウイルス、好ましくはブタ、イヌ又はネコ コロナウイルスをヘルパーウイルスとして含んでいる。 これらのワクチンは、特にブタ、イヌ及びネコ種に影響を与えるか、粘膜に感 染するか又は侵入経路として粘膜を経由する感染作用物に対して処方される。 本発明の特別な具体化によって、種々のブタ、イヌ及びネコの感染作用物に対 してブタ、イヌ及びネコを保護し得る単価ワクチンが提供され、そして向性はコ ロナウイルスのＳ糖タンパク質を発現することによって制御される。 ブタ感染作用物に対する単価ワクチンは、以下のブタ病原体:アクチノバシラ ス プルロニューモニエ(pleuropneumoniae)、アクチノバシラス スイス(suis)、 ヘモフィルス パラスイス(parasuis)、ブタ パーボウイルス、レプトスピラ、大 腸菌、エリジペロトリックス ルシオパシエ(rhusiopathiae)、パスツレラ マル トサイダ、気管支敗血症菌、クロストリジウム種、セルプリナ ヒオジセンテリ エ(hyodisenteriae)、マイコプラズマ ヒオニューモニエ(hyopneumoniae)、ブタ 流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス、ロタウイルス、 又はブタ繁殖性及び呼吸器症候群、アウジェスキー病(偽性狂犬病)、ブタインフ ルエンザ、伝染性胃腸炎を引き起こす病原体並びに萎縮性鼻炎及び増殖性回腸炎 の病因学的物質の抗原から本質的になる群から選択される抗原を発現する発現ベ クターを含有することができる。 イヌ感染作用物に対する単価ワクチンは、以下のイヌ病原体:イヌ ヘルペスウ イルス、イヌ アデノウイルス１及び２型、イヌ パーボウイルス１及び２型、イ ヌ レオウイルス、イヌ ロタウイルス、イヌ コロナウイルス、イヌ パラインフ ルエンザウイルス、イヌ インフルエンザウイルス、ジステンパーウイルス、狂 犬病ウイルス、レトロウイルス及びイヌカリチウイルスの抗原から本質的に構成 される群から選択される抗原を発現する発現ベクターを含有することができる。 ネコ感染作用物に対する単価ワクチンは、以下のネコ病原体:ネコ カリチウイ ルス、ネコ免疫欠損症ウイルス、ネコ ヘルペスウイルス、ネコ汎白血球減少 症ウイルス、ネコ レオウイルス、ネコ ロタウイルス、ネコ コロナウイルス、 ネコ感染性腹膜炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコオウム病クラミジア及びネコ 白血病ウイルスの抗原から本質的に構成される群から選択される抗原を発現する 発現ベクターを含有することができる。 これらのベクターは感染作用物、例えば、上記したようなブタ、イヌ又はネコ 感染作用物に対して保護を与える抗体を発現することができる。特別な具体例で は、ＶＧＰＴを無効化する６Ａ.Ｃ３として同定される組換えモノクローナル抗 体を発現する幾つかのベクターが産生された。 本発明で得られるワクチンは乳腺刺激性免疫を誘発することによって子ブタを 保護することができ、そしてこれは腸管の感染に対して新生子ブタを保護するの に特に有益である。 一般的に、本発明で得られるワクチンは、免疫化すべき動物に少なくとも10⁸ プラーク形成単位（pfu）の力価のヘルパーウイルスを導入し得る抗原量を含有 する。 賦形剤として、生理学的食塩血清又は他の類似する食塩溶液のような希釈剤を 使用することができる。同様に、これらのワクチンは、ワクチン製剤で通常使用 されるようなアジュバント:水性物（水酸化アルミニウム、QuilA、アルミナゲル 懸濁物等）又は油性物［鉱物油、グリセリド及び脂肪酸副生成物並びにこれらの 混合物に基づく、例えば、Marcol 52（ＥＳＳＯ Espa olaＳ.Ａ.)、Simulsol 51 00（ＳＥＰＩＣ）及びMontanide 888（ＳＥＰＩＣ）］を含有しても良い。 これらのワクチンは、細胞応答増強物質（ＣＲＰ）、即ちＴヘルパー細胞（Ｔ ｈ₁及びＴｈ₂）サブ集団増強物質、例えばインターロイキン１(ＩＬ−１)、ＩＬ -２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-12、ｇ−ＩＦＮ(ガンマインターフェロ ン)、細胞壊死因子及びワクチンを接種した動物で理論的に細胞免疫を誘発し得 る同様な物質を含有することもできる。これらのＣＲＰ物質は水性又は油性アジ ュバントを有するワクチン製剤中で使用することができよう。細胞応答を調節し そして免疫を刺激する他のタイプのアジュバント、例えばＭＤＰ(ムラミルジペ プチド)、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激剤コンプレックス）又はリポソームを使用する こともできる。 本発明は、動物を種々の感染から予防しそして保護し得る多価ワクチンを提供 する。これらの多価ワクチンは、対応する抗原をコードする種々の配列が同じ組 換えベクターに挿入されている発現ベクターからか又はヘルパーウイルスと一緒 に同時接種するためにその後混合される別個の組換えベクターを構築することに よって製造することができる。それ故、これらの多価ワクチンは、発現ベクター 自体が、１つより多い感染作用物をコードする１つより多いＤＮＡ配列を含有し ている組換え系を含んでいるか、又はそうではなくて、ワクチンの製造で使用さ れる組換え系が、各々少なくとも１つの異なる抗原を発現する種々の発現ベクタ ーを含有することができる。このタイプの多価ワクチンにおける実際上の制限は 、上記した発現ベクターが同一の動物種の感染作用物の抗原を発現しなければな らないということ及びヘルパーウイルスが上記の特定の種に対して適するもので なければならないということである。同様に、多価ベクターを含んでいる多価ワ クチンは、抗原をコードする配列の代わりに感染作用物に対して保護を与える抗 体をコードする配列を使用して製造することができる。これらのベクターは、１ つより多い抗体をコードする１つより多いＤＮＡ配列を含有する発現ベクターか 又は各々が少なくとも１つの異なる抗体を発現する種々の発現ベクターかのどち らかを含んでいる組換え系を含有し得る。 本発明の特別な具体化によって、それぞれ種々のブタ、イヌ及びネコ感染作用 物に対してブタ、イヌ及びネコを保護し得るワクチンが提供される。この目的の ために、ワクチンの組換え系に含有される発現ベクターは上記したブタ、イヌ又 はネコ病原体の種々の抗原を発現しなければならない。 本発明のワクチンは液体又は凍結乾燥形態で提供することができ、そして組換 え系を賦形剤中に懸濁して製造することができる。上記の系が凍結乾燥形態の場 合、賦形剤自体は希釈剤であることができる。 或いは、本発明によって達成されワクチンは、一部としてか又は希釈剤として か又は他の慣用若しくは組換えワクチンのどちらかで希釈される凍結乾燥フラク ションとして、他の慣用のワクチンと組み合わせて使用することができる。 本発明で提供されるワクチンは経口、経鼻、皮下、皮内、腹腔内若しくは筋肉 内経路によって又はエアゾールで動物に投与することができる。 本発明はまた、動物、特にブタ、イヌ及びネコを種々の感染作用物に対して同 時に免疫化する方法−本発明で提供される免疫学的に有効な量の組換え系を含有 するワクチンを、経口、経鼻、皮下、皮内、腹腔内若しくは筋肉内経路によって か又はエアゾールで(又はこれらを組合せた形態で)投与することを含んでいる− も提供する。 更に、本発明は、妊娠期間前又は中に、経口、経鼻、皮下、皮内、腹腔内及び 筋肉内経路によってか又はエアゾールで(又はこれらを組合せた形態で)母親に又 はこれらの子孫に、本発明で提供される免疫学的に有効な量の組換え系を含有す るワクチンを投与することからなる、新生動物に感染する感染作用物から新生動 物を保護する方法も提供する。 本発明は、欠陥ウイルスゲノムの取得、これらの特徴決定、プラスミドの構築 及び発現ベクターを取得する目的でのこれらの操作並びに種々の種の種々の感染 作用物に対する無効化抗体の誘発を詳細に記載している以下の実施例によって説 明される。 実施例１ ＴＧＥＶから誘導される欠陥粒子の生成 １．１ 高い感染多重度（m.o.i.）でのＴＧＥＶ株の非希釈連続継代 欠陥粒子の生成又はウイルス集団中に少ない比率で既に存在している欠陥粒子 の賦課を促進するために、種々の非希釈ＴＧＥＶ単離物の連続継代を種々の細胞 系中で実施した。ＤＩ粒子が生成する頻度は種々のウイルス−細胞系で非常に変 動し得るので、継代はＳＴ（ブタ精巣、ブタ精巣上皮細胞）細胞系統中で種々の ＴＧＥＶ単離物（ＴＨＥＲ-１及びＰＵＲ46-mar 1ＣＣ12）を用いて実施した。 株ＴＨＥＲ-１（伝染性胃腸炎ヘルパー腸及び呼吸器コロナウイルス、株１） はＰＵＲ46-ＭＡＤ株［S nchez等、Virology 174、410〜417（1990年）］から誘 導されるＳＴ細胞培養物中で20回継代して弱毒化した変異株である。株ＰＵＲ46 -mar 1ＣＣ12もサンチェス（S nchez）等（上述）によって記載されている。 各ＴＧＥＶ株をＳＴ細胞中希釈しないで35回継代した。３つの場合における 各々の最初の継代のm.o.i.は１個の細胞当たり100pfuであった。明確な細胞変性 効果が観察されたとき−通常は、上記効果によって細胞単層の半分以上に影響が あったとき−、感染後20時間から48時間（h.p.i.）の間に各継代の上清液を集め 、そしてこの上清液の半量を次の継代の感染で使用した。継代数に伴うウイルス 力価の変動は図４に示す。ウイルスの力価は各ウイルスの連続継代をとおして２ 対数単位の間の範囲であった。株ＴＨＥＲ-１の場合には、継代数30〜46におけ る力価は最初の30回継代したものより低かった。 ＳＴ細胞中で35回継代されていたウイルスを使用して、感染で生じた細胞内Ｒ ＮＡを分析した。感染後６時間から９時間の間に³²ｐ₁で代謝的に標識したＲＮ Ａを分析した[Maniatis等、Molecular cloning:実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory（1982年）]。ＴＨＥＲ-1-ｐ35感染（ＴＨＥＲ-１株ウイル スを高いm.o.i.で35回継代した）では、どのウイルスｍＲＮＡにも対応しない３ つの強いバンドが観察された。これらのバンドはゲノムＲＮＡとＳ遺伝子メッセ ンジャーの間に位置していた(図５)。これらの新しいサブゲノムＲＮＡの性質を 分析するために、株ＴＨＥＲ-１を用いて非希釈連続継代を継続した。46回の継 代後、連続継代中のＲＮＡパターンの進展を分析した。この目的のために、ＳＴ 細胞を種々の継代から得られたウイルスで感染させ、そして代謝的に標識された 生成したＲＮＡを変性アガロースゲルで分析した(図５)。最初の継代ではゲノム ＲＮＡとサブゲノムウイルスメッセンジャーしか検出されなかったが、継代数30 では、22、10.6及び9.7kbの３つの新しいＲＮＡ（それぞれ図５でＤＩ-Ａ、ＤＩ -Ｂ及びＤＩ-Ｃとして示されているＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣ）が検出された。これ らのサブゲノムＲＮＡはその後の15回の継代をとおして安定な形態のままであり 、ゲノムＲＮＡの複製及びヘルパーウイルスのｍＲＮＡの合成に顕著に干渉した (図５、レーン30〜45)。これらの結果は、非希釈連続継代で生成するか又は増幅 された３つのＲＮＡが安定であること及びこれらのうちの少なくとも１つが干渉 していることを示している。１.２ サブゲノムＲＮＡの特徴決定 １.２.１ 末端及び内部領域の分析 サブゲノムＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣがコロナウイルス欠陥ＲＮＡの標準的な構造 を有しているかどうか、そして特に、これらが野生ゲノムの５'及び３'末端を保 持しているかどうかそしてその小さいサイズが内部欠失によるものかどうかを決 定するために、このウイルスに特異的なプローブを用いて幾つかのハイブリッド 形成アッセイを実施した。この目的のために、ＴＨＥＲ-１-ＳＴｐ35ウイルス（ ＳＴ細胞中で35回継代したＴＨＥＲ-１株ウイルス）で感染させた細胞からＲＮ Ａを抽出し、そしてそのハイブリッド形成は、リーダー及びウイルス３'末端配 列と相補的なオリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロットアッセイ（Mani atis等、上述）で特定のウイルスプローブを用いて分析した。各々の場合に、Ｔ ＨＥＲ-1-ｐ１ウイルス（ＳＴ細胞中で１回継代した株ＴＨＥＲ-１ウイルス）で 感染させた細胞及び非感染ＳＴ細胞（ＮＩ）から得られたＲＮＡ（それぞれ、各 フィルターのレーン１及び２）を対照として使用した。プローブとして使用した オリゴヌクレオチドはリーダーＲＮＡ(親ゲノムの５'末端の66〜91位)、３'末端 の非翻訳領域（親ゲノムの５'末端のヌクレオチド28524〜28543）及び構造遺伝 子Ｍ及びＮ（それぞれ、各遺伝子のプライマーＡＵＧから始まる97〜116及び5〜 24位）と相補的である。 図６に示されるように、２つのオリゴヌクレオチドは全ての親ウイルスｍＲＮ Ａとハイブリッドを形成し、そしてこれらはＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣも検出したの で、これらのＲＮＡには内部欠失がありそして末端は維持されていることが示さ れた。これらのＲＮＡ中にどのゲノム配列が存在するのかに関する分析の最初の 試みとして、感染細胞のＲＮＡを、構造ウイルスタンパク質Ｓ、Ｍ及びＮの遺伝 子と相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させた。これらのどれも欠 陥ＲＮＡとはハイブリッドを形成せず、構造タンパク質遺伝子が欠失されている ことが示唆された。かくして、サブゲノムＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣは親ウイルス末 端を維持しそして内部欠失を有している。１.２.２ ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣの増殖 ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣが、培養中の増殖を親ウイルスに依存する欠陥ゲノムで あることを証明するために、ＳＴ細胞を種々のm.o.i.:10、0.1、0.01及び0.001 pfu／細胞のウイルスＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41（ＳＴ細胞中で41回継代したＴＨＥＲ -１株ウイルス）で感染させた。この継代から得られ、10 h.p.i.で集めたウイル スを滴定し、そしてＳＴ細胞中で更に１回継代して増幅させ、そしてこれを順次 使用して、細胞質ＲＮＡを抽出した（Maniatis等、上述）新しい細胞を感染させ た。ＲＮＡはリーダーＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを使用してノーザン ブロットアッセイで分析した。図７は得られた結果を示す。m.o.i.は各レーン上 に示す(10^-3、１０^-2、１０^-1及び10pfu／細胞)。陰性対照として、ＴＨＥＲ-1- ｐ1ウイルスでＳＴ細胞を感染させて得られたＲＮＡが含まれており、そしてこ れは10pfu／細胞のm.o.i.のサブゲノムＲＮＡを含有していない(第１レーン)。1 0pfu／細胞のm.o.i.のＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスによる感染に対応するレー ン、陽性対照では、ゲノムＲＮＡ（ｍＲＮＡ １）が標識されており、そして欠 陥ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣ（ＤＩ-Ａ、ＤＩ-Ｂ、ＤＩ-Ｃとして示されている）並び に対応するＳ遺伝子（ｍＲＮＡ ２）が標識されている。 最初の継代（これに続く継代が増幅継代であるのでこの実験における隘路）の m.o.i.が0.1pfu／細胞又はこれ未満であるとき、ウイルスのゲノムＲＮＡ及びｍ ＲＮＡが予想された割合で検出される条件下でＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣの消失が観 察される(図７)。m.o.i.が10pfu／細胞であるとき、３つの欠陥ＲＮＡは維持さ れている。ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣが、感染に使用したＴＨＥＲ-1-ｐ41ウイルス中 のゲノムＲＮＡより高い割合で見い出されるので、これらの結果は、これらのＲ ＮＡの複製又は増殖には細胞が欠陥ウイルスによってそして更にはヘルパーウイ ルスによっても感染される必要があることを示している。かくして、ＲＮＡ Ａ 、Ｂ及びＣには、トランスで提供されるヘルパーウイルスの機能が必要である。 それ故、ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣは、増殖をヘルパーウイルスに依存している欠陥 ゲノムである。１.２.３ 別の細胞系統におけるＤＩ ＲＮＡのインビトロ産生、増幅、増殖及び 干渉 ＲＮＡ ＤＩのインビトロ産生、増幅、増殖及び干渉は細胞系統に特異的であ り、そしてこの理由により、細胞系統の変化が欠陥ＲＮＡに対して有する影響に ついて試験した。この目的のために、ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46ウイルス（ＳＴ細胞 中、高m.o.i.で46回継代したＴＨＥＲ-１ウイルス）を、ブタ腸上皮細胞（ＩＰ ＥＣ）及びブタマクロファージ（ＰＭ）中で新しい一連の非希釈継代に付した。 図８はＩＰＥＣ中10回までの継代（図８Ａ）とＰＭ中５回までの継代（図８Ｂ） での力価の変動と継代数を示す。両細胞系統でのウイルス収量はＳＴ細胞中で得 られた収量より低く、そして各継代のm.o.i.は20から0.2pfu／細胞の間の範囲で 変動したと推定される。 ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＩＰＥＣｐ１（ＩＰＥＣ細胞中で１回継代したＴＨＥＲ -1-ＳＴｐ46ウイルス）及びＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＩＰＥＣｐ10（ＩＰＥＣ細胞 中で10回継代したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46ウイルス）を³²ｐ_iで標識しそして変性ア ガロースゲルで分析した（図８Ｃ）。 ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＰＭｐ1ウイルス（ＰＭ細胞中で１回継代したＴＨＥＲ- 1-ＳＴｐ46ウイルス）及びＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＰＭｐ5（ＰＭ細胞中で５回継 代したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46ウイルス）で感染させたＳＴ細胞のＲＮＡは、リー ダーＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを用いてノーザンブロットアッセイで 分析した（図８Ｃ）。 結果は図８Ｃに見られ、そしてこれは両細胞系統中で１回の継代では３つの欠 陥ＲＮＡが残っていたが、ＰＭ中での少なくとも５回の継代とＩＰＥＣ中での少 なくとも10回の継代ではＲＮＡ Ａしか残らなかったことを示している。両方の 場合で、野生ゲノム（１）に対応するＲＮＡ、即ちＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣ（それ ぞれ、ＤＩ-Ａ、ＤＩ-Ｂ及びＤＩ-Ｃ）並びにｍＲＮＡ２（タンパク質Ｓ）の位 置に印が付けられている。ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ46-ＰＭｐ5ウイルスＲＮＡに対応 するレーンではゲノムＲＮＡの位置が示されている−オートラジオグラフの暴露 期間が図８Ｃで示された期間の10倍であったときにだけ観察される。１.３ 欠陥ゲノムのキャプシド化 欠陥ＲＮＡがキャプシド化能力を有しているかどうかを試験するために、ウイ ルスＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ1（ＳＴ細胞中で１回継代したＴＨＥＲ-１ウイルス）及 びＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41（ＳＴ細胞中で41回継代したＴＨＥＲ-１ウイルス）に対 する部分的な精製を、15重量／容量（ｗ／ｖ）％のスクロースクッションで遠心 して同時に実施した。ＲＮＡを精製ビリオンから抽出し、そして臭化エチジウム 染色によってアガロースゲルで分析した(図９Ａ)。継代数41のビリオンでは、Ｒ ＮＡ Ａ、Ｂ及びＣがゲノムＲＮＡと同じ強度で検出されたので、これら３つの 欠陥ＲＮＡが効率的にキャプシド化することを示していた。 欠陥ゲノムが完全なゲノムと一緒にキャプシド化するのか、それとも反対に欠 陥ゲノムが独立してキャプシド化するのかを決定するために、ＴＨＥＲ-1-ＳＴ ｐ41ウイルスを、スクロースクッションの密度を変えるか又は連続スクロース傾 斜で遠心して精製した。各々の場合における精製ビリオンのＲＮＡを、リーダー ＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを用いてノーザンブロットアッセイで分析 した(図９Ｂ)。31％（ｗ／ｖ）のスクロースクッション（ｄ＝1.19ｇ／ml）で遠 心を実施したとき、沈殿したビリオン中では野生ゲノムしか検出されなかった。 しかし乍ら、15％（ｗ／ｖ）のより低い密度（ｄ＝1.11ｇ／ml）のスクロースク ッションを使用したとき、完全なゲノムに加えて３つの欠陥ＲＮＡが検出された 。連続スクロースクッション（15〜42％、ｗ／ｖ）では、図９Ｂのレーンｄ及び ｅで示されるように、この傾斜の上部フラクション（1.15ｇ／mlに近い密度）に 欠陥ビリオンを、そして下部フラクション（1.20ｇ／mlに近い密度）に標準的な ビリオンを豊富化することができた。各レーンの上部バンドは野生型ゲノムと欠 陥ゲノムＡ（ＤＩ-Ａ）に相当しそして下部バンドは欠陥ゲノムＢとＣ（ＤＩ-Ｂ とＤＩ-Ｃ）に相当する。これらの結果は、標準的なビリオンより軽い欠陥ビリ オンでは、ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣは効率的にキャプシド化し、そしてゲノムＤＩ- Ｂ及びＤＩ-Ｃ（10.6及び9.7kb）は野生型ゲノムとは別個にキャプシド化するこ とを示している。１.４ 欠陥ＲＮＡ Ｂ及びＣのクローニング及び配列決定。これらの一次構造の 決定。 １.４.１ 相補的ＤＮＡの合成及びＲＮＡ Ｂ及びＣの増幅 欠陥ＲＮＡ Ｂ及びＣの大きさは、電気泳動ゲルにおける移動性に基づいて、 それぞれ10.6及び9.7kbと推定されていた。これらの大きさが大きいため、ゲノ ム末端と相補的なプライマーを使用して単一の逆転写酵素及びポリメラーゼ連鎖 反応（ＲＴ-ＰＣＲ）で上記欠陥ＲＮＡを増幅することはできなかった。この制 限を克服するために、４つの重複フラグメントが全ての場合にゲノム全長をカバ ーできるようにするプライマー対を使用して、欠陥ゲノムを４つの別々の反応で 増幅させた。５'末端から３'末端に並べたこれらの重複フラグメントはａ、ｂ、 ｃ及びｄと称した(図10)。精製ビリオンから抽出したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41 ウイ ルス ＲＮＡを鋳型として使用した。このＲＮＡは、親ゲノムに加えて、３つの 欠陥ＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣを含有していた。対照として、ＴＨＥＲ-1 野生ウイル スのゲノムＲＮＡの増幅を同時に実施した。 ＲＴ-ＰＣＲ反応でプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドの配列と位 置を表２に示す。 ^a)：５'の制限部位はその後のクローニングを容易にするために含めた。^b) ：対応するＯＲＦ中のオリゴヌクレオチドの位置は配列に関連して図12に示さ れている。 プライマー１及び２を用いてＲＴ-ＰＣＲでＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41 ウイルスＲ ＮＡと親ウイルスＴＨＥＲ ＲＮＡを増幅すると1.9kbのＰＣＲ生成物が主として 生じた(図11、フラグメントａ)。小さいバンドが２つのレーンに見られるので、 この反応で観察されたこれらの小さいバンドは非特異的なハイブリッド形成によ るものである。同じＲＴ-ＰＣＲ反応を、ゲル精製物から抽出したＤＩ-Ｂ及びＤ Ｉ-Ｃ ＲＮＡのプールを含有するアガロースフラクションから出発して実施した が、結果は同じであった。これは、フラグメントａが全てのＲＮＡ ＤＩに共通 でありそして野生ＴＧＥＶゲノムの５'末端の1.9kb領域に相当することを示して いる。 ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡから出発し、オリゴヌクレオチド３及び ４を用いて増幅すると2.8kbの特有のＰＣＲ生成物が生じた(図11、フラグメント ｂ)。予想される生成物の大きさが12kbであるようなＰＣＲ生成物はＴＨＥＲ-１ 対照ウイルスＲＮＡからは得られなかった。これらのデータに基づいて、少なく とも１つの欠陥ゲノムは2.8kbの１つのｂフラグメントを有しており、そしてそ の他の欠陥ゲノムは同じフラグメント又はより大きいフラグメントを有している が、これは大きさが大きいためＰＣＲ反応では検出可能でないと推論することが できる。 親ゲノム中4.6kbで分離されたオリゴヌクレオチド５及び６は、ＴＨＥＲ-1-Ｓ Ｔｐ41ウイルスＲＮＡから得られる3.5及び4.6kbの２つの異なる生成物を生じさ せた(図11、フラグメントｃ)。4.6kbの生成物は対照として使用した野生ウイル スＲＮＡからも得られた。これらの結果は、少なくとも１つの欠陥ゲノム中（多 分、最も豊富な欠陥ゲノムであるＤＩ−Ｃ中）ではフラグメントｃが１つの欠失 を含有しており、ＰＣＲによって3.5kbのフラグメントを生じさせたことを示唆 している。4.6kbのフラグメントは、ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡ集団中 に存在する親ゲノムとこのゲノム領域を維持している欠陥ゲノムに由来している 。 親ウイルスゲノムＲＮＡのプライマー７及び８を用いたＲＴ−ＰＣＲによる増 幅では、これらのオリゴヌクレオチド間の分離が完全ゲノムでは9.5kbである（ 図 10）ので、バンドは生じなかった(図11、フラグメントｄ)。対照的に、ＴＨＥＲ -1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡを鋳型として使用したとき、1.9及び2.1kbの２つの 非常に強いバンドが観察された。これらのバンドは多分1.9kbバンド周辺のより 小さいバンド群と一緒に移動するのでフラグメントｄに相当する幅広い連続バン ドとして現れ、ゲルでの解像が妨げられる(図11)。異種混交性は、クローニング フラグメントｄの大きさで観察された(以下参照)。１.４.２ 増幅生成物（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）の種々の欠陥ＲＮＡへの割当て 大きさが1.9から2.1kbの間で変動するｄフラグメントを種々の欠陥ゲノムに割 り当てるために、鋳型として使用したＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスＲＮＡを、 野生ゲノム、ＤＩ-Ａ、ＤＩ-Ｂ及びＤＩ-ＣのＲＮＡに対応するバンドが明確に 分離されるまでアガロースゲルで分画した。これら４つのＲＮＡの各々に対応す るバンドを別々に切り取り、そしてオリゴヌクレオチド８及び９を用いたＲＴ- ＰＣＲの増幅反応で鋳型として使用した。精製したゲノムバンドＲＮＡから出発 しても、ＰＣＲ生成物は全く得られなかった。ＲＮＡ ＤＩ-Ｂから主として1.9k bのＰＣＲ生成物が得られたが、大きさが1.9kb近くで変動するＤＮＡも少し得ら れ、この領域における或る種の異種混交性が示される。ＲＮＡ ＤＩ-Ｃの増幅に よって2.1kbのＰＣＲ生成物が主として生じた。これらの結果から、1.9kbのフラ グメントは欠陥ＲＮＡ Ｂに、そして2.1kbのフラグメントはＲＮＡ ＤＩ-Ｃに割 り当てることができた。 ｄフラグメントが割り当てられると、プライマー５及び６で得られた3.5及び4 .6kbのｃフラグメントはそれぞれ欠陥ＲＮＡ Ｃ及びＢに割り当てられた。何と なれば、この割当てから生じるフラグメントａ〜ｄは全て、各々の場合に移動性 で推定されたＲＮＡ Ｂ及びＣの大きさと一致したからである。 ゲノムＢ及びＣの完全な配列が決定されると、フラグメントの割当ては、特定 の欠失の側部に位置するオリゴヌクレオチドを使用して、各精製バンドのＲＮＡ の増幅によって証明された。フラグメントの割当てはまた、ＤＩ-Ｃには存在し ないＤＩ-Ｂ領域とＤＩ-Ｂには存在しないＤＩ-Ｃ領域をマップ化したオリゴヌ クレオチドを使用して、ノーザンブロットアッセイでも確認された。１.４.３重複フラグメントａ、ｂ、ｃ及びｄのクローニング及び配列決定 ＲＮＡ Ｃと相補的な４つの重複ＤＮＡフラグメントａ（1.9kb)、ｂ(2.8kb)、 ｃ（3.5kb）及びｄ（2.1kb）をブルースクリプト(Bluescript)ＳＫ￣にクローン 化した。別々のＲＴ-ＰＣＲ反応から誘導された少なくとも２つのクローンの配 列が決定された。種々のクローン中で一致しなかった位置の配列（多分Taqポリ メラーゼのエラー）は、対応する非クローン化ＰＣＲ生成物から直接決定した。 この手順後に、ＲＮＡ ＤＩ-Ｃコンセンサス配列が決定された。Taqポリメラー ゼの１エラーの平均は各コピーの1.2kbであった。ＤＩ-Ｃゲノムの完全な配列は 図12に示す。 このようにして得られた完全なＲＮＡ ＤＩ-Ｃ配列は、ＰＵＲ46-ＰＡＲウイ ルスのＯＲＦ１ａ及び１ｂ配列［Eleouet等、Virology 206、817〜822（1995年 ）］や他のＴＨＥＲ-１ウイルスのＯＲＦについて我々の研究室で決定した配列 と比較した。完全なＲＮＡ ＤＩ-Ｃ配列では、株ＰＵＲ46-ＰＡＲの配列の比較 で14個ヌクレオチドの差異が見い出された。ゲノム欠陥ＲＮＡ ＤＩ-Ｃの特異的 な変化を特定するために、株ＴＨＥＲ-１、即ち欠陥ゲノムの親ウイルス中のこ れらの位置の配列を決定した。ＤＩ-Ｃ ＲＮＡ配列は、対応する親ウイルスの配 列と比較して僅か３つのヌクレオチドの差異と、ＯＲＦに何も影響を与えない91 89位での１個の挿入しか示さなかった（図12）。１.４.４ ＤＩ-Ｃ及びＤＩ-Ｂゲノムの一次構造 配列データによって、ＤＩ-Ｃゲノムは４つの不連続親ゲノム領域から構成さ れ(図13)、そしてこれらの領域は:ａ）このゲノムの５'末端の2144個ヌクレオチ ド;ｂ）ＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領域及びＯＲＦ 1bの５'の凡そ半分を含んで いる親ゲノムの12195位から16734位間の領域に対応する4540個ヌクレオチド;ｃ ）野生ゲノムの17843〜20372位に対応しそしてＯＲＦ１ｂの３'の半分と第８遺 伝子Ｓヌクレオチドを含んでいる2531個ヌクレオチドの領域;及びｄ）３'末端の 493個ヌクレオチドを含んでいることが示された。 ＤＩ-Ｂゲノムの一次構造はクローン化したフラグメントａ及びｂ(ゲノムＤ Ｉ-Ｃに共通)、ｃ（親ゲノムに類似）及びｄ（ゲノムＤＩ-Ｂに特異的）の配列 決定によって決定した。ゲノムＤＩ-Ｂはこのゲノムの３つの不連続領域:ａ）全 てのＤＩ-Ｂクローンに共通でありそしてＲＮＡ ＤＩ-Ｃの領域Ｉと同一のゲノ ムの５'末端の2144個ヌクレオチド;ｂ）親ゲノムの12195〜20369位から20436位 に対応し、そして遺伝子１の２つのＯＲＦ間の重複領域、完全なＯＲＦ1ｂ及び 遺伝子Ｓの最初のヌクレオチドを含んでいる8178〜8243個ヌクレオチドの大きさ が変動する領域;及びｃ）このゲノムの３'領域のヌクレオチドの278乃至303個か ら構成されている（図14）。 ゲノムＤＩ-Ｂと称される集団を構成するクローンは領域IIからIIIの間に生じ た欠失の大きさが異なっており、そしてこの欠失は遺伝子Ｓ（ヌクレオチド６か ら73の間）の開始点で始まりそして遺伝子７（ヌクレオチド195から233の間）の 終了点で終わっている。 親ＲＮＡ ＴＨＥＲ-１の５'末端配列はＲＮＡの直接配列決定で決定され、そ してこれは５'-ＮＣＵＵＵＵＡＡＡＧ-３'である。この配列の最初の「Ｎ」ヌク レオチドの性質は決定されていない。これまでのところ、３つのＴＧＥＶ単離物 、ＰＵＲ46-ＰＡＲ、ＰＵＲ46-ＢＲＩ及びＦＳ772/70の５'末端の配列が記載さ れており[Eleouet等、上述;Page等、Virus Genes 4、289〜301(1990年);Sethna 等、Ｊ．Virol．65、320〜325（1991年）]、そしてこれらは全て最初のヌクレオ チドが異なっている。コロナウイルス感染で生起するリーダーの交換からみて、 欠陥ＲＮＡのリーダー配列は親ウイルスのリーダー配列と同一でなければならな い［Makino等、Ｊ．Virol．57、729〜737（1986年）］。 これら３つの欠陥ＲＮＡは、これら自体がオリゴｄＴカラムに結合する（結果 は示していない）ので、ポリＡを含有している。 １.４.５ ＲＮＡＢ及びＣはＯＲＦ１ａと１ｂ間に重複領域を保持しており、そ してこの領域にはリボソームの転位（−１）の原因となるモチーフが含まれてい る。 ゲノムＤＩ-ＣとＤＩ-Ｂに割り当てられた配列によれば、6370及び10003個ヌ クレオチドのＯＲＦがそれぞれ、このゲノムの５'末端から数えてヌクレオチド3 15で開始していると予測することができる。ＲＮＡ ＤＩ-ＣのＯＲＦは、ＤＩ- Ｃゲノムの6685位のＯＲＦ １ｂに内部欠失が生起していた不連続領域IIとIIIの 結合部位で生じた終結コドンで終わる。ＤＩ-ＢゲノムのＯＲＦはＯＲＦ1ｂの天 然の終結コドンで終わる。 ２つの欠陥ＲＮＡはＯＲＦ１ａと１ｂ間の重複領域を保持しており、そしてこ の領域はこの領域のリボソームの転位（−１）の原因となるスライディング配列 及び三次構造モチーフ、プソイドノット（Eleouet等、上述）を含んでいる。図1 5はこの領域のＲＮＡの考えられる二次及び三次構造を示す。この領域のプソイ ドノットについてエリューエット（Eleouet）等が提案した構造はＣ及びＤで示 された構造である;しかし乍ら、他の構造も考えられる（Ａ及びＢで示されるよ うな）が、どれが正しい構造かは分かっていない。 転位がＴＧＥＶでは20％の効率で生じ（Eleouet等、上述）そしてこの転位に よって遺伝子１の連続翻訳が可能になることを示す説明がなされている。ＤＩ- ＢとＤＩ-ＣのＲＮＡ（そして多分ＤＩ-ＡＲＮＡ）が親ゲノムのこの領域を保持 しているという事実は、ＲＮＡの複製又はゲノムの増殖にはこの領域が必要であ る可能性を示唆している。 欠陥ゲノムＤＩ-ＣとＤＩ-Ｂには他の２つの小さなＯＲＦが存在している。そ の１つ、即ち、長い読取り枠に先行するＯＲＦは３個のアミノ酸のペプチドをコ ードしており、そしてこのペプチドは野生型のゲノムにも見られるがその機能は 知られていない。もう一方のＯＲＦは両方の場合に遺伝子ＳのＡＵＧで開始し、 そしてＤＩ-Ｃでは16個のアミノ酸のペプチドを、そしてＤＩ-Ｂでは大きさが変 動するペプチドをコードしている。これらのＯＲＦが機能的であるかどうかは知 られていない。保持されているウイルスの２つの転写プロモーターコンセンサス 配列（ＣＵＡＡＡＣ）だけが、欠陥ＲＮＡ Ｂ及びＣにおいて遺伝子１及び遺伝 子Ｓに正しく先行するものである。これらの配列には図12中で印が付けられてい る。 図16は、ノーザンブロットアッセイでウイルスに特異的なオリゴヌクレオチド とのハイブリッド形成によるＲＮＡ Ａ、Ｂ及びＣのマップ作成を示している。 親ゲノム並びにＤＩ Ａ、Ｂ及びＣから得られるＲＮＡが明確に分離されるまで ＴＨＥＲ-1-ＳＴｐ41ウイルスのＲＮＡをアガロースゲルで分画した。このＲＮ Ａを、³²ｐｉで印を付けた種々のオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する ナイロンフィルターに移し、親ゲノムとハイブリッドを形成した(＋)、そして欠 陥ゲノムとハイブリッドを形成した（＋）か又はハイブリッドを形成しなかった (−)。親ゲノム中のオリゴヌクレオチドと相補的な配列の凡その位置には矢印で 印を付けた。これらの正確な配列と位置は表３に見られる。オリゴヌクレオチド は全て親ゲノムとハイブリッドを形成し、そしてＲＮＡ Ｂ及びＣで予想された 結果が得られた。a):ゲノム中の位置は、遺伝子１（ＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ｂ）及び３'末端の非 翻訳領域（３'-ＵＴＲ）と相補的なオリゴヌクレオチド（ＯＮ）では野生型ウイ ルスゲノムの５'末端から;そして遺伝子Ｓ、Ｍ及びＮ中でマップ化しているプラ イマーの場合にはＯＮのヌクレオチド５'に対応する遺伝子のプライマーＡＴＧ の最初のヌクレオチドから始まる塩基の数として示されている。 実施例２ 発現ベクターの生成 ＲＮＡ ＤＩ-ＣをコードするｃＤＮＡをファージＴ7プロモーターの制御下で ブルースクリプトIIプラスミドにクローン化した。このｃＤＮＡはポリＡ配列、 肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム及びファージＴ7終結シグナルを含ん でいる。図17に構築が示されているこれらプラスミドの１つはｐＤＩＣ-１と命 名されている。これらのプラスミドを操作して、異種遺伝子を欠陥ゲノム中に存 在する遺伝子Ｓプロモーター若しくは別のＴＧＥＶプロモーター又は有効性を高 めたこれらの改変体の制御下で上記プラスミドにクローン化することができる。 これら異種遺伝子のクローニングは、Ｓ遺伝子の開始コドン（ＡＵＧ）に続く ＯＲＦ1ｂの後にそしてこの遺伝子に関する読取り相内に実施した。 これらのｃＤＮＡから、ファージＴ7ポリメラーゼを使用してＲＮＡを発現さ せ、そしてこれで、弱毒ヘルパーウイルスＴＨＥＲ-１で前以て感染させたＳＴ 細胞を形質転換して、ヘルパーウイルスゲノムを含有するビリオンや対応する欠 陥ゲノムを含有する他のビリオンが回収できた。２％のウシ胎児血清の存在下で 凍結乾燥した上記ウイルスを、ブタ、イヌ及びウサギの胃腸管及び気道に感染す る作用物に対して特異的な抗体を誘発するワクチンとして使用した。 ベクターの向性は適当な弱毒ヘルパーウイルスを使用してブタ、イヌ又はネコ 種に特異的に標的化した。 実施例３ 無効化抗体の誘発 ３.１ ブタ流行性下痢コロナウイルス（ＰＥＤＶ）に対する保護の誘発 ヘルパーウイルス（ＴＨＥＲ-１）及びＰＥＤＶ糖タンパク質Ｓ遺伝子がクロ ーン化されているｐＤＩＣ-１プラスミドからなる組換え系を使用してブタを免 疫化した。 免疫化は、子ブタ１匹当たり10⁹pfuを経口経路で投与して実施した。 無効化抗体の存在は、免疫化後15、30、45及び60日目のワクチン接種動物の血 清でアッセイした;そしてＰＥＤＶに特異的な抗体の存在はラジオイムノアッセ イ（ＲＩＡ）（Maniatis等、上述）を使用して測定した。 免疫化後45日目に集めた血清では、これらの血清を経口投与前にＰＥＤＶ（株 ＳＥＧ86-1）の有毒ウイルスと共に予めインキュベートしていたとき、このウイ ルスによる感染に対して10日齢の子ブタで完全な保護がもたらされた。３.２ イヌコロナウイルスに対する保護の誘発 ヘルパーウイルス（イヌコロナウイルス株Fort Dodge）と、イヌコロナウイル ス糖タンパク質Ｓ遺伝子がクローン化されていたｐＤＩＣ-１プラスミド（株For t Dodge）からなる組換え系を使用してイヌを免疫化した。 免疫化は、イヌ１匹当たり10⁹pfuを経口経路で投与して実施した。 免疫化後15、30、45及び60日目のワクチン接種動物の血清中の無効化抗体の存 在をアッセイし、そしてイヌコロナウイルスに特異的な抗体の存在はＲＩＡを使 用して測定した。 免疫化後45日目に集めた血清では、これらの血清を経口投与前にイヌコロナウ イルス（株Fort Dodge）の有毒ウイルスと共に予めインキュベートしたとき、こ のウイルスによる感染に対して10日齢の子イヌで完全な保護が与えられた。３.３ アルテリウイルス（arterivirus）ＰＲＲＳＶによって引き起こされる感 染に対する保護の誘発 ヘルパーウイルス（ＴＨＥＲ-１）と、アルテリウイルスＰＲＲＳＶ ＯＲＦ３ 及びＯＲＦ５（株Fort Dodge）がクローン化されていたｐＤＩＣ-１プラスミド からなる組換え系を使用してブタを免疫化した。 免疫化は、子ブタ１匹当たり10⁹pfuを経口経路で投与して実施した。 無効化抗体の存在は免疫化後15、30、45及び60日目のワクチン接種動物の血清 でアッセイし、そしてＰＲＲＳＶに特異的な抗体の存在はＲＩＡによって測定し た。 免疫化後45日目に集めた血清では、これらの血清を経口経路で投与する前にＰ ＲＲＳＶ（株Fort Dodge）の有毒ウイルスと共に予めインキュベートしていたと き、このウイルスによる感染に対して10日齢の子ブタで完全な保護がもたらされ た。 実施例４ 発現ベクターの生成 実施例２に記載した方法に類似する方法に従って、自己複製ＲＮＡをコードし ているｃＤＮＡを、ファージＴ7プロモーターの制御下ブルースクリプトIIプラ スミドにクローン化した。このｃＤＮＡはポリＡ配列、肝炎デルタウイルス（Ｈ ＤＶ）のリボザイム及びファージＴ7終結シグナルを含んでいる。図18に構築が 示されているこれらプラスミドの１つは、ｐＤＩＡ-６Ａ.Ｃ３と命名されている 。このプラスミドは、ＴＧＥＶを無効化するモノクローナル抗体６Ａ.Ｃ３をコ ードする遺伝子を含有している。モノクローナル抗体６Ａ.Ｃ３の特徴及びその 構築はドクタージョアクイン カスチラ カリオン（Dr．Joaquin Castilla Carri n）の博士論文、表題「コロナウイルスの無効化抗体を分泌するトランスジェニ ック動物の構築」、マドリッドのオートノーマ（Aut noma）大学、理学部、1996 年12月、43〜52頁、65〜79頁中に記載されている。 この異種遺伝子のクローニングは、遺伝子Ｓ開始コドン（ＡＵＧ）に続くＯＲ Ｆ１ｂの後にそしてこの遺伝子に関する読取り枠内に実施した。 このｃＤＮＡから開始して、ファージＴ7ポリメラーゼを使用してＲＮＡを発 現させ、そしてこれで、弱毒ヘルパーウイルスＴＨＥＲ-１で前以て感染させた ＳＴ細胞を形質転換し、その結果ヘルパーウイルスゲノムを含有するビリオン及 び対応する欠陥ゲノムを有する他のビリオンが回収された。２％のウシ胎児血清 の存在下で凍結乾燥した上記ウイルスを、組換え６Ａ.Ｃ３モノクローナル抗体 を発現するベクターとして使用することができる。これらベクターの向性は、適 当な弱毒ヘルパーウイルスを使用してブタ種に特異的となった。実施例５ 無効化抗体の発現 ヘルパーウイルス（ＴＨＥＲ-１）と、ＴＧＥＶを無効化する組換えモノクロ ーナル抗体６Ａ.Ｃ３をコードする配列を含有するｐＤＩＡ-６Ａ.Ｃ３プラスミ ド（実施例４）から構成される組換え系を使用してブタを免疫化した。 免疫化は、経口経路で子ブタ１匹当たり10⁹pfuを投与して実施した。 無効化６Ａ.Ｃ３抗体の存在は、免疫化後15、30、45及び60日目のワクチン接 種動物の血清中でＲＩＡ［Maniatis等、上述］を使用してアッセイした。組換え 抗体は10³倍より高い力価を有していたので、10⁴倍以上の感染性ウイルスの力価 を低下させることができる。 微生物の寄託 大腸菌から誘導されたＤＨ-５細菌中に導入されたｐＤＩＣ-１と命名されたプ ラスミド、［ＤＨ５／ｐＤＩＣ-１］は、ヨーロッパ動物細胞培養物収集所(ＥＣ ＡＣＣ)、英国 ＳＰ4 ＯＪＧ ウィルトシャー、サリスベリー、ポートンダウン に、対応する受理番号Ｐ96030641で1996年3月6日に寄託された。 更に、ＴＨＥＲ-１と命名された弱毒ヘルパーウイルスはＥＣＡＣＣに、対応 する受理番号Ｖ96030642で1996年3月6日に寄託された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ 31/14 31/14 Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ０７Ｋ 16/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アロンソ ヴィラヌエヴア サラ スペイン国、Ｅ―48012 ビルバオ、アウ トノモ 62、３゜ (72)発明者 バレステロス ジヤレノー エム ルイサ スペイン国、クエンカ Ｅ―16002、カレ サンチェス ヴエラ ７、３゜Ｂ (72)発明者 カスティラ カストリロン ジョアクイン スペイン国、アルコベンダス Ｅ―28100、 エスカレラ ２、４゜Ａ、マルケス デ ラ ヴァルダヴィア 94 (72)発明者 ゴンザレス マルティネス ホセ マヌエ ル スペイン国、Ｅ―30319 カルタゲナ、ミ ランダ、ヴィセンテ メディナ 28 (72)発明者 イゼタ パルメサン アンデル スペイン国、Ｅ―20009 サン セバスチ ャン、ピー デ ロス アルバスト 18、 ５゜ (72)発明者 メンデス ツンツネグィ アナ スペイン国、ヴィゴ Ｅ―36210、グラン ヴィア 170 (72)発明者 ムンティオン サエンツ マリア スペイン国、Ｅ―31010 パンプローナ、 アヴェニダ パンプローナ 25、６゜Ｂ (72)発明者 ペンゼス ゾルタン スペイン国、Ｅ―28035 マドリード、イ スラ デ オンス ６、４゜ (72)発明者 サンチェス モルガド ホセ マヌエル スペイン国、Ｅ―28933 モストレス、ア ヴェニダ ポーチュガル 62、３゜ (72)発明者 サンチェス サンチェス カルロス ミグ エル スペイン国、マドリード Ｅ―28041、バ ジョＦ、カレ ヴィラジョイオサ 94 (72)発明者 スメルドウ ピカゾ クリスチャン スペイン国、マドリード Ｅ―28028、ア ヴェニダ ブラジリア 37 (72)発明者 ソラ グルペグイ イサベル スペイン国、Ｅ―31570 サン アドリア ン、カレテラ エストレーラ 61

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．３'及び５'末端に位置するウイルスレプリカーゼ認識シグナルを有する親 ウイルスゲノムを含み、更に内部欠失を含んでいる欠陥ウイルスゲノムであって 、該欠陥ウイルスゲノムはその複製をヘルパーウイルスに依存している。 ２．親ウイルスレプリカーゼをコードする完全配列を更に含んでいる請求項１ に記載のゲノム。 ３．上記親ウイルスがコロナウイルスである上記請求項に記載のゲノム。 ４．ブタ、イヌ又はネココロナウイルスの欠陥ゲノムを含んでいる上記請求項 に記載のゲノム。 ５．ブタの伝染性冑腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）の欠陥ゲノムを含んでいる請求 項４に記載のゲノム。 ６．上記ヘルパーウイルスが親ウイルスである上記請求項のいずれか１項に記 載のゲノム。 ７．全身性及び分泌性免疫応答を誘発し得る少なくとも１つの抗原を発現する 組換え欠陥ウイルスゲノムに基づく発現ベクターであって、該発現ベクターは請 求項１から６に記載の欠陥ウイルスゲノム又はその対応する相補的ＤＮＡ（ｃＤ ＮＡ）並びに全身性及び粘膜性免疫を与え得る抗原をコードする少なくとも１つ のＤＮＡ配列を含んでいる。 ８．１つより多いＤＮＡ配列を含んでいる請求項７に記載のベクターであって 、これらベクターの各々は全身性及び粘膜性免疫を与え得る異なる抗原をコード している。 ９．感染作用物に対して保護を与える少なくとも１つの抗体を発現する組換え 欠陥ウイルスゲノムに基づく発現ベクターであって、該発現ベクターは請求項１ から６に記載の欠陥ウイルスゲノム又はその対応する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ） 及び１つの感染作用物に対して保護を与える抗体をコードする少なくとも１つの ＤＮＡ配列を含んでいる、。 １０．１つより多いＤＮＡ配列を含んでいる請求項９に記載のベクターであっ て、これらベクターの各々は感染作用物に対して保護を与える異なる抗体をコー ドしている。 １１．全身性及び粘膜性免疫を誘発し得る少なくとも１つの抗原を発現する組 換え欠陥ウイルスに基づく組換え系であって、該組換え系は： ａ）全身性及び粘膜性免疫を与え得る抗原をコードする少なくとも１つのＤＮ Ａ配列を含有する請求項７又は８に記載の欠陥ウイルスゲノムに基づく組換え発 現ベクター;並びに ｂ）ヘルパーウイルス、 を含んでいる。 １２．上記発現ベクターが１つより多いＤＮＡ配列を含んでいる請求項１１に 記載の系であって、上記ＤＮＡ配列の各々は全身性及び粘膜性免疫を与え得る異 なる抗原をコードしている。 １３．種々の発現ベクターを含んでいる請求項１１に記載の系であって、上記 発現ベクターの各々は全身性及び粘膜性免疫を与え得る異なる抗原をコードする 異なるＤＮＡ配列を含有している。 １４．上記ヘルパーウイルスが、上記欠陥ウイルスゲノムが由来する親ウイル スである請求項１１から１３のいずれか１項に記載の系。 １５．上記ヘルパーウイルスが上記欠陥ゲノムの複製及びキャプシド化用の機 能及び構造タンパク質を提供する請求項１４に記載の系。 １６．上記ヘルパーウイルスが上記欠陥ゲノムのキャプシド化用の構造タンパ ク質を提供する請求項１４に記載の系。 １７．感染作用物に対して保護を与える少なくとも１つの抗体を発現する組換 え欠陥ウイルスに基づく組換え系であって、該系は： ａ）感染作用物に対して保護を与える抗体をコードする少なくとも１つのＤＮ Ａ配列を含有する請求項９又は１０に記載の欠陥ウイルスゲノムに基づく組換え 発現ベクター、及び ｂ）ヘルパーウイルス、 を含有している。 １８．上記発現ベクターが１つより多いＤＮＡ配列を含んでいる請求項１７に 記載の系であって、上記ＤＮＡ配列の各々は感染作用物に対して保護を与える異 なる抗体をコードしている。 １９．種々の発現ベクターを含んでいる請求項１７に記載の系であって、上記 発現ベクターの各々は感染作用物に対して保護を与える抗体をコードする異なる ＤＮＡ配列を含有している。 ２０．上記ヘルパーウイルスが、上記欠陥ウイルスゲノムが由来する親ウイル スである請求項１７から１９のいずれか１項に記載の系。 ２１．上記ヘルパーウイルスが上記欠陥ゲノムの複製及びキャプシド化用の機 能及び構造タンパク質を提供する請求項２０に記載の系。 ２２．上記ヘルパーウイルスが上記欠陥ゲノムのキャプシド化用の構造タンパ ク質を提供する請求項２０に記載の系。 ２３．感染作用物に対して動物内で保護を誘発し得るワクチンであって、該ワ クチンは製薬的に許容可能な賦形剤と一緒に請求項１１から２２のいずれか１項 に記載の適当な量の組換え系を含んでいる。 ２４．上記組換え系が、全身性及び粘膜性免疫を与え得る抗原をコードするＤ ＮＡ配列を含有する発現ベクターを含んでいる請求項２３に記載のワクチン。 ２５．上記組換え系が１つより多いＤＮＡ配列を含有している発現ベクターを 含んでいる請求項２３に記載のワクチンであって、上記ＤＮＡ配列の各々は全身 性及び粘膜性免疫を与え得る異なる抗原をコードしている。 ２６．上記組換え系が種々の発現ベクターを含んでいる請求項２３に記載のワ クチンであって、上記発現ベクターの各々は全身性及び粘膜性免疫を与え得る異 なる抗原をコードする少なくとも１つの異なるＤＮＡ配列を含有している。 ２７．ブタ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系はブタ病原体抗原をコードする少なく とも１つのＤＮＡ配列を含有する少なくとも１つの発現ベクターを含んでいる。 ２８．ブタ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系は１つより多いＤＮＡ配列を含有する １つの発現ベクターを含んでおり、そしてこれらＤＮＡ配列の各々は異なるブタ 病原体抗原をコードしている。 ２９．ブタ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系は種々の発現ベクターを含んでおり、 そしてこれら発現ベクターの各々はブタ病原体抗原をコードする少なくとも１つ のＤＮＡ配列を含有している。 ３０．上記ブタ病原体が:アクチノバシラス スイス、アクチノバシラス プル ロニューモニエ、ヘモフィルス パラスイス、ブタ パーボウイルス、レプトスピ ラ、大腸菌、エリジペロトリックス ルシオパシエ、パスツレラ マルトサイダ、 気管支敗血症菌、クロストリジウム種、セルプリナ ヒオジセンテリエ、マイコ プラズマ ヒオニューモニエ、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ呼吸 器コロナウイルス、ロタウイルス、又はブタ繁殖性及び呼吸器症候群、アウジェ スキー病（偽性狂犬病）、ブタインフルエンザ若しくは伝染性胃腸炎を引き起こ す病原体並びに萎縮性鼻炎及び増殖性回腸炎の病因学的作用物から本質的になる 群から選択される請求項２７から２９に記載のワクチン。 ３１．イヌ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系はイヌ病原体抗原をコードする少なく とも１つのＤＮＡ配列を含有する少なくとも１つの発現ベクターを含んでいる。 ３２．イヌ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系は１つより多いＤＮＡ配列を含有する 発現ベクターを含んでおり、そしてこれらＤＮＡ配列の各々は異なるイヌ病原体 抗原をコードしている。 ３３．イヌ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系は種々の発現ベクターを含んでおり、 そしてこれら発現ベクターの各々はイヌ病原体抗原をコードする少なくとも１つ のＤＮＡ配列を含有している。 ３４．上記イヌ病原体が:イヌ ヘルペスウイルス、イヌ アデノウイルス１及 び２型、イヌ パーボウイルス１及び２型、イヌ レオウイルス、イヌ ロタウイ ルス、イヌ コロナウイルス、イヌ パラインフルエンザウイルス、イヌ イン フルエンザウイルス、ジステンパーウイルス、狂犬病ウイルス、レトウイルス及 びイヌ カリチウイルスから本質的に構成される群から選択される請求項３１か ら３３に記載のワクチン。 ３５．ネコ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系はネコ病原体抗原をコードする少なく とも１つのＤＮＡ配列を含有する少なくとも１つの発現ベクターを含んでいる。 ３６．ネコ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系は１つより多いＤＮＡ配列を含有する １つの発現ベクターを含んでおり、そしてこれらＤＮＡ配列の各々はネコ病原体 抗原をコードしている。 ３７．ネコ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系は種々の発現ベクターを含んでおり、 そしてこれら発現ベクターの各々は１つのネコ病原体抗原をコードする少なくと も１つのＤＮＡ配列を含有している。 ３８．上記ネコ病原体が:ネコ カリチウイルス、ネコ免疫欠損症ウイルス、ネ コ ヘルペスウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ レオウイルス、ネコ ロタウイルス、ネコ コロナウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、狂犬病ウイ ルス、ネコ オウム病クラミジア及びネコ白血病ウイルスから本質的に構成され る群から選択される請求項３５から３７に記載のワクチン。 ３９．上記組換え系が感染作用物に対して保護を与える抗体をコードするＤＮ Ａ配列を含有する発現ベクターを含んでいる請求項２３に記載のワクチン。 ４０．上記組換え系が１つより多いＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを含ん でいる請求項２３に記載のワクチンであって、これらＤＮＡ配列の各々は感染作 用物に対して保護を与える抗体をコードしている。 ４１．上記組換え系が種々の発現ベクターを含んでいる請求項２３に記載のワ クチンであって、これら発現ベクターの各々は感染作用物に対して保護を与える 抗原をコードする少なくとも１つの異なるＤＮＡ配列を含有している。 ４２．ブタ感染作用物に対して免疫を与えるのに適している請求項２３に記載 のワクチンであって、その際上記組換え系は上記のブタ感染作用物に対して保護 を与える抗体をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含有する少なくとも１ つの発現ベクターを含んでいる。 ４３．上記組換え系が、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）を無効化し得 る６Ａ.Ｃ３として同定されるモノクローナル抗体をコードする少なくとも１つ のＤＮＡ配列を含有する少なくとも１つの発現ベクターを含んでいる請求項４２ に記載のワクチン。 ４４．上記組換え系のヘルパーウイルスがコロナウイルスを含んでいる請求項 ２３に記載のワクチン。 ４５．上記コロナウイルスがブタ、イヌ及びネココロナウイルスからなる群か ら選択される請求項４４に記載のワクチン。