JP2000513566A - アポプトシス―制御遺伝子のｂｃｌ―２ファミリーに属する新規哺乳類遺伝子、ｂｃｌ―ｗ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は哺乳類細胞においてとりわけアポプトシスを調節することができる治療用分子に広く関係する。本発明の治療用分子はｂｃｌ−２ファミリーに属する新規な哺乳類遺伝子の発現を調節することができ、そして細胞の生存を増進させる遺伝子配列および化学的実体を包含する。本発明の治療用分子はさらに細胞周期への移行を遅延させる場合にも有用である。さらに、本発明はｂｃｌ−２ファミリーの該新規遺伝子の翻訳生産物の活性や機能を調節することができる化学的実体に及ぶ。本発明はｂｃｌ−２ファミリーのこの新規遺伝子の翻訳生産物および、例えば、治療、診断、抗体形成におけるその使用、そして細胞の生理的死または生存を調節することができおよび／または細胞周期への移行を調節することができる治療用分子をスクリーニングするための道具としての使用をも包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 アポプトシス−制御遺伝子のｂｃｌ−２ファミリーに属する 新規哺乳類遺伝子、ｂｃｌ−ｗ 本発明は哺乳類細胞におけるとりわけアポプトシス（apoptosis）を調節する ことができる治療用分子に広く関係する。本発明の治療用分子はｂｃｌ−２ファ ミリーに属する新規な哺乳類遺伝子の発現を調節することができ、そして細胞の 生存を増進させる遺伝子配列および化学的実体を包含する。本発明の治療用分子 はさらに細胞周期への移行を遅延させる場合にも有用である。さらに、本発明は ｂｃｌ−２ファミリーの該新規遺伝子の翻訳生産物の活性や機能を調節すること ができる化学的実体に及ぶ。本発明はｂｃｌ−２ファミリーのこの新規遣伝子の 翻訳生産物および、例えば、治療、診断、抗体形成におけるその使用、そして細 胞の生理的死または生存を調節することができおよび／または細胞周期への移行 を調節することができる治療用分子をスクリーニングするための道具としての使 用をも包含する。 本明細書で数字によって言及された出版物の文献的詳細は本明細書の末尾に集 めてある。本明細書で言及されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の配列番 号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．）は文献の後ろに定義されている。配列番号の概要 は実施例の前に示してある。 本出願を通じて、論旨が他の意味を要求する場合を除き、用語「 コンプライズ（comprise）含む」または「コンプライジーズ(co・prises)」や「 コンプライジング(comprising)」などのその変形は述べられている要素または実 体あるいは要素群または実体群を包含するが他のいかなる要素または実体あるい は要素群または実体群をも排除するものでないことを意味するものと理解すべき である。 組換えＤＮＡ技術の高度化が進んだことにより、医学および関連する保険分野 における研究および開発が極めて容易になっている。この技術はガンや肉腫など の増殖性細胞障害およびある種の自己免疫状態などの変性疾患の両方の治療およ び診断の研究において特に重要になってきている。細胞の生存および生理学的細 胞死（アポプトシス）に関与する要素を遺伝子レベルで同定し特性を決定する必 要がある。 アポプトシスは線虫およびヒトなどの多様な生物の間で保存されているプロセ スにより遂行される。細胞生存の正および負の調節は胚の適切な発育および分化 のために、そして成熟組織におけるホメオスタシスを確保するために欠くことが できない。細胞の生存は成長因子がその受容体に結合することによりまたは細胞 接着分子の相互作用により助長することができる。一群の細胞毒物質はこれらの シグナルを妨害し、そしてクロマチン縮合（chromatin condensation）、細胞圧 縮、膜膨張(membrane blebbing)および時にはＤＮＡのヌクレオソーム間開裂な どの特異的な形態学的基準により最初に定義されたプロセスであるアポプトシス を活性化することができる。 細胞生存および細胞死を支配する細胞内経路の生化学的詳細はほとんど未解決 のままである。しかしながら、幾つかの鍵となる調節因子が現れた。発見された 最初のものはＢｃｌ−２であった。これはヒト濾胞性リンパ腫中のＩＧＨ座に転 座されたｂｃｌ−２遺伝子がコードする２６ｋＤの細胞質タンパクである。Ｂｃ ｌ−２の高レベルはサイトカイン欠損やＤＮＡ損傷を含む極めて多様な他の細胞 毒性条件を生き延びる細胞の能力を顕著に増強する。 哺乳類のゲノムはｂｃｌ−２に相同なしかし機能の点では異なるほかの遺伝子 を含んでいる。例えば、ｂｃｌ−ｘはアポプトシスを防止する（ボイセら、1993 ）、一方、ｂａｘおよびｂａｋはｂｃｌ−２およびｂｃｌ−ｘの生存機能を阻害 する（オルトバイら、1993、チテンデンら、1995、ファロウら、1995、キーファ ーら、1995）。ガンや肉腫の治療および変性障害の治療における細胞のアポプト シスを制御する遺伝子の潜在的重要性のため、ｂｃｌ−２に構造および機能が相 同な新規な遺伝子を同定する必要がある。 本発明により、本発明者らはここに「ｂｃｌ−ｗ」と名付ける哺乳類由来の新 規な遺伝子を同定した。遺伝子移転研究により、ｂｃｌ−ｗは細胞の生存を増強 しそしてアポプトシス−制御遺伝子のｂｃｌ−２ファミリーに属することが示さ れた。この新規な遺伝子の同定は、ｂｃｌ−ｗの発現または活性のアンタゴニス トかまたはアゴニストとして作用することができる一群の治療用分子の創薬に導 き、そしてガンまたは変性疾患の治療に有用である。この遺伝子の同定は、治療 、診断、抗体製造における使用および細胞周期への移行の調節を含む生理学的細 胞死または細胞生存を調節することがで きる治療用分子のための篩（スクリーン）としての使用のための大量の組換え翻 訳生産物の製造をも可能とする。 従って、本発明はｂｃｌ−２ファミリーに属する新規な哺乳類遺伝子をコード する配列をコードするヌクレオチド配列または該コードする配列に相補的なヌク レオチド配列を含みそして配列番号：７または配列番号：９に実質的に記載され たアミノ酸配列または配列番号：７かまたは配列番号：９に４７％以上の類似性 を有するアミノ酸配列を含む核酸分子に関する。 本発明の別の側面は配列番号：７または配列番号：９に記載されたアミノ酸配 列またはそれらの誘導体をコードする配列、または配列番号：７かまたは配列番 号：９に４７％以上の類似性を有するアミノ酸配列をコードする配列をコードす るヌクレオチド配列または該コードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む 核酸分子に関する。 本明細書で用いられる「類似性」という用語はヌクレオチドレベルまたはアミ ノ酸レベルで比較された配列の間の完全一致を含む。ヌクレオチドレベルで一致 が全くない場合には、「類似性」は、それにもかかわらず、構造、機能、生化学 および／またはコンフォメーションのレベルで相互に関連している別異のアミノ 酸を生ずる配列の間の相違を含む。アミノ酸レベルで一致がない場合には、「類 似性」は、それにもかかわらず、構造、機能、生化学および／またはコンフォメ ーションのレベルで相互に関連しているアミノ酸を含む。 類似性のパーセンテージは４８％と１００％の間で、例えば、約５０％または ５５％、５９％または６５％、７０％または７５％、８０％または８５％、９０ ％または９５％または９６％よりも大またはそれらの間の類似性パーセンテージ であることが好ましい。 本発明の別の側面は配列番号：６または配列番号：８に実質的に記載されたヌ クレオチド配列または配列番号：７または配列番号：９に４７％以上の類似性を 有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。 本発明のこの側面による核酸分子は本明細書で「ｂｃｌ−ｗ」に相当する。こ の遺伝子は本発明に従って本発明者により細胞の生存を増強すると決定された。 ｂｃｌ−ｗ遺伝子の生産物はＢｃｌ−ｗと呼ばれる。ヒトのＢｃｌ−ｗは配列番 号：７に記載されたアミノ酸配列により規定され、そしてマウスのＢｃｌ−ｗは 配列番号：９で規定される。ヒトｂｃｌ−ｗおよびマウスｂｃｌ−ｗ由来のそれ ぞれのヌクレオチド配列は配列番号：６および配列番号：８にそれぞれ示される 。本明細書で「ｂｃｌ−ｗ」というときは、１個または多重のヌクレオチド置換 、ヌクレオチド欠失および／またはヌクレオチド付加を含むそれらの誘導体への 言及を含んでいる。同様に、本明細書で「Ｂｃｌ−ｗ」というときは、アミノ酸 の置換、欠失および／または付加を含むすべての誘導体を含んでいる。この遺伝 子はヒト、霊長類、家畜動物（羊、豚、牛、馬、ロバ）、実験室テスト動物（例 えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、愛玩動物（例えば，犬、猫）ま たは捕獲された野生動物（例えば、狐、 カンガルー、鹿）由来のものが好ましい。 本発明は配列番号：７または配列番号：８に４７％以上の類似性を持つアミノ 酸配列を有するＢｃｌ−ｗの哺乳類相同体に関するが、主題たる発明はこれまで 開示されていない、哺乳類を含むすべての動物由来の新規なＢｃｌ−ｗ相同体を も包含する。 従って、本発明の別の側面はヒトＢｃｌ−ｗまたはその誘導体をコードするヌ クレオチド配列を含む核酸分子を提供するものであり、該ヒトＢｃｌ−ｗは配列 番号：７に実質的に記載されたアミノ酸配列を有するもの、または配列番号：７ に記載されたアミノ酸配列と実質的に４７％以上の類似性をもつアミノ酸配列を 有するその哺乳類相同体である。 さらなる側面はネズミＢｃｌ−ｗまたはその誘導体をコードするヌクレオチド 配列を含む核酸分子を提供するものであり、該ネズミＢｃｌ−ｗは配列番号：９ に実質的に記載されたアミノ酸配列を有するものであり、または配列番号：９に 記載されたアミノ酸配列と実質的に４７％以上の類似性をもつアミノ酸配列を有 するその哺乳類相同体である。 本発明の核酸分子は単離された形または発現ベクターなどのベクターに連結さ れた形であることが好ましい。「単離された」とは核酸分子が少なくとも一つの 精製工程を経験していることを意味し、これは、例えば、分子量、コードしてい る活性、ヌクレオチド配列、塩基組成あるいは他の便利な手段で測定したとき他 の成分に比し て対象である核酸分子を、少なくとも約１０％の対象核酸分子、好ましくは少な くとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、一層好ましくは少なくと も約４０〜５０％、より一層好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに一層 好ましくは約８０〜９０％またはそれ以上含む組成物により便宜上定義される。 本発明の核酸分子は、好ましい態様では生物学的に純粋であると考えることもで きる。 ｂｃｌ−ｗをコードする核酸分子はｃＤＮＡ配列またはゲノム配列などのデオ キシリボ核酸の配列であることが好ましい。ゲノム配列はエキソンおよびイント ロンを含んでもいる。ゲノム配列はプロモーター領域または他の調節領域を含ん でもいる。特に好ましい態様では、ｂｃｌ−ｗに対応するヌクレオチド配列は配 列番号：６（ヒト）または配列番号：８（マウス）に記載されたヌクレオチド配 列を含むｃＤＮＡ配列、または配列番号：６または配列番号：８に類似であるが 配列番号：７かまたは配列番号：９に４７％以上の類似性を有するアミノ酸配列 をコードするヌクレオチド配列を含むその誘導体である。 「誘導体」という用語は、本明細書で使用するとき、核酸分子またはその翻訳 生産物の部分、断片、一部、相同体またはアナログを包含する。誘導体はヌクレ オチドまたはアミノ酸の一個または多重の置換、欠失、および／または付加産物 であることもある。本明細書の核酸分子の誘導体は配列番号：６または配列番号 ：８に記載されたヌクレオチド配列に低厳格条件下でハイブリッド形成をするこ とができる核酸分子をも含む。低厳格性は４２℃であることが好ま しい。 より具体的には、本発明は配列番号：６または配列番号：８に実質的に記載さ れたヌクレオチド配列または低厳格条件下で配列番号：６または配列番号：８に ハイブリッド形成をすることができそして配列番号：７または配列番号：９に記 載されたアミノ酸配列と４７％以上の類似性を有するアミノ酸配列をコードする その誘導体または相同体を含む核酸分子を提供する。 本明細書において４２℃での低厳格性というときは、ハイブリッド形成条件に は少なくとも約１％ｖ／ｖから少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドおよび 少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍの塩、そして洗浄条件には少なくとも約 １Ｍから少なくとも約２Ｍの塩を含みかつ包含する。必要なときは、別の厳格条 件、例えば、ハイブリッド形成条件には少なくとも約１６％ｖ／ｖから少なくと も約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約 ０．９Ｍの塩を、そして洗浄条件には少なくとも約約０．５Ｍから少なくとも約 ０．９Ｍの塩を含みかつ包含する中厳格性、あるいはハイブリッド形成条件には 少なくとも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび 少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩を、そして洗浄条件に は少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩を含みかつ包含する 高厳格性を適用することができる。 本発明の核酸分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、ア ンチセンス分子、同時サプレッションに使用するのに 適する分子および融合核酸分子が含まれる。ｂｃｌ−ｗの発現を調節することが できる一部の分子も含まれる。本発明はｂｃｌ−ｗに対するリボザイムをも包含 する。本発明のＢｃｌ−ｗ翻訳生産物の誘導体はペプチド、ポリペプチドまたは 他のタンパクに融合した全Ｂｃｌ−ｗタンパクの特定のエピトープまたは部分を 持つ断片を含む。Ｂｃｌ−ｗまたはその誘導体に対する触媒活性を持つ抗体も含 まれる。このような触媒活性を持つ抗体はＢｃｌ−ｗを制御したりその他の方法 で調節したりするのに有用であろう。この触媒活性を持つ抗体や他の調節分子は 細胞内への侵入が容易になるように修飾する必要がありうる。また、これらはト ランスジェニック細胞中で遺伝子的手法で生産されあるいはウイルス性ベクター または他の適当なベクターを介して導入されうる。 別の態様では、本発明はｂｃｌ−ｗまたはその誘導体をコードする単離された 核酸分子に関する。該核酸分子は下記のリストから選択される。 （Ｉ）配列番号：７または配列番号：９に記載されたアミノ酸配列または配列番 号：７または配列番号：９と４７％以上の類似性を有するアミノ酸配列をコード するヌクレオチド配列を含む核酸分子、 （ii）配列番号：６または配列番号：８に実質的に記載されたヌクレオチド配列 を含む核酸分子または配列番号：７または配列番号：９と４７％以上の類似性を 持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、 (iii)配列番号：６または配列番号：８に実質的に記載されたヌクレオチド配 列と低厳格条件下でハイブリッド形成をすることができそして配列番号：７また は配列番号：９と４７％以上の類似性を持 つアミノ酸配列をコードする核酸分子、 （iv）低厳格条件下で（Ｉ）部または（ii）部または(iii)部の核酸とハイブリ ッド形成をすることができそして配列番号：７または配列番号：９と４７％以上 の類似性を持つアミノ酸配列をコードする核酸分子、 （ｖ）（Ｉ）部または（ii）部または(iii)部または（iv）部の核酸分子の誘導 体または哺乳類相同体。 前段の（ｖ）部で予定する哺乳類相同体は、新規な相同体であり、例えば、既 知のＢｃｌ−２は含まない。上に述べたように、ここに述べた定義から外れるＢ ｃｌ−ｗの新規相同体は本発明によっても予定される。 これらの核酸分子は原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、酵 母細胞、カビ細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞または植物細胞）で発現することがで きる発現ベクターに連結されていてもよい。これらの核酸分子はシグナルペプチ ド、サイトカインまたはＢｃｌ−２ファミリーの他のメンバーなどの別の実体を コードする核酸分子と連結または融合またはその他の方法で結合していてもよい 。 本発明はこれまでに定義した核酸分子の発現生産物にも及ぶ。 この発現生産物は配列番号：７または配列番号：９に記載されたアミノ酸配列 を有するＢｃｌ−ｗでありまたは上に定義したようなその誘導体でありまたは配 列番号：７または配列番号：９に記載さ れたアミノ酸配列と４７％以上の類似性を持つアミノ酸配列を有する哺乳類相同 体である。誘導体には１個また多重のアミノ酸置換、アミノ酸欠失および／また はアミノ酸付加が含まれる。他の誘導体にはＢｃｌ−ｗの化学的アナログが含ま れる。ここで予定するＢｃｌ−ｗのアナログには、ペプチド、ポリペプチドまた はタンパクの合成の過程での側鎖の修飾、非天然型アミノ酸および／またはその 誘導体の取り込み、および架橋剤やタンパク性分子やそのアナログのコンフォメ ーションに対し制約を与える他の方法の使用が含まれるが、これらに限定される ものではない。 本発明の別の側面は下記のリストから選択される単離されたポリペプチドに関 する、 （Ｉ）配列番号：７または配列番号：９に実質的に記載されたアミノ酸配列また は配列番号：７または配列番号：９と４７％以上の類似性を持つ配列を有するポ リペプチド、 （ii）配列番号：６または配列番号：８に実質的に記載されたヌクレオチド配列 または配列番号：７または配列番号：９と４７％以上の類似性を持つアミノ酸配 列をコードする配列によりコードされるポリペプチド、 (iii)配列番号：６または配列番号：８に記載されたヌクレオチド配列と低厳 格条件下でハイブリッド形成をすることができる核酸分子であって、かつ、配列 番号：７または配列番号：９に実質的に記載されたアミノ酸配列または配列番号 ：７または配列番号：９と４７％以上の類似性を持つアミノ酸配列をコードする 核酸分子によりコードされるポリペプチド、 （iv）（Ｉ）部または（ii）部または(iii)部に定義されたポリペ プチドであってホモダイマーの形をしたもの、 (v)（Ｉ）部または（ii）部または(iii)部に定義されたポリペプチドであってヘ テロダイマーの形をしたもの。 誘導体はＢｃｌ−ｗ分子のどこか、例えば、これらに限定されるものではない が、Ｓ１領域および／またはＳ２領域などに突然変異を持っていてもよい。例え ば、Ｓ２領域の９４位におけるＧｌｙからＧｌｕへの置換は本発明により包含さ れる。突然変異が予想されるＢｃｌ−ｗの他の領域には、Ｓ２の直前のＮ末端領 域、ＮＨ１領域、Ｓ３領域、Ｓ２−Ｓ３領域およびＢＨ３領域が含まれるが、こ れらに限定されるものではない。 本発明により予定される側鎖修飾の例としては、アルデヒドとの反応の後Ｎａ ＢＨ₄で還元することによる還元的アルキル化、メチルアセトイミデートを用い るアミディン化(amidination)、無水酢酸を用いるアシル化、シアネートを用い るアミノ基のカルバモイル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（Ｔ ＮＢＳ）を用いるアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸や無水テトラ ヒドロフタル酸を用いるアミノ基のアシル化、およびピリドキサル−５−ホスフ ェートに続くＮａＢＨ₄での還元を用いるリジンのピリドキシル化などによるア ミノ基の修飾が挙げられる。 アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキ サルおよびグリオキサルなどの試薬と複素環縮合産物を形成させることにより修 飾することができる。 カルボキシル基は、カルボジイミド活性化によるＯ−アシルイソ尿素体形成に 続く誘導体化を経て、例えば、対応するアマイドへ修飾することができる。 スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いるカルボキ シメチル化、システイン酸への過ギ酸酸化、他のチオール化合物との混合ジスル フィドの形成、マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応 、４−クロロマーキュリベンゾエート、４−クロロマーキュリフェニルスルホン 酸、フェニルマーキュリクロリド、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノー ルおよび他の水銀化合物を用いる水銀誘導体の形成、アルカリｐＨでシアン酸塩 を用いるカルバモイル化などの方法により修飾することができる。 トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドを用いる酸化ある いは２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはスルフェニルハライド 類を用いるインドール環のアルキル化により修飾することができる。他方、チロ シン残基はテトラニトロメタンで硝酸化して３−ニトロチロシン誘導体を形成さ せることにより変更することができる。 ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル 化またはジエチルピロカーボネートによるＮ−カルボエトキシ化により行うこと ができる。 ペプチド合成の間に非天然型アミノ酸およびその誘導体を取り込 む例としては、これらに限定されるものではないが、ノルロイシン、４−アミノ 酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキ サン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、ザ ルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニル アラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体が挙げられる。本発明で予定して いる非天然型アミノ酸のリストは表１に示してある。 ３Ｄコンフォメーションを安定させるための架橋剤としては、例えば、ｎ＝１ からｎ＝６のスペーサー基(ＣＨ₂)_nを持つ二官能性イミドエステル、グルタルア ルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ−二官能性架橋剤 およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ−反応性部分およびマレイミ ドまたはジチオ部分（ＳＨ）またはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）などの別の基に 特異的な反応性部分を通常含むヘテロ−二官能性試薬を用いることができる。さ らに、例えば、ＣαおよびＮα−メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸のＣα原 子とＣβ原子の間に二重結合の導入、そしてＮ末端とＣ末端の間、二つの側鎖の 間、または側鎖とＮ末端またはＣ末端の間にアマイド結合を形成するなどの共有 結合を導入することにより環状ペプチドまたはアナログの形成によって、ペプチ ドのコンフォメーションを制限することができる。 ｂｃｌ−ｗの同定により、ｂｃｌ−ｗの発現を調節しあるいはＢｃｌ−２の活 性を調節することができる一群の治療用分子の創製が可能となる。本発明が予定 する調節因子には、ｂｃｌ−ｗ発現のアゴニストおよびアンタゴニストが含まれ る。ｂｃｌ−ｗ発現のアン タゴニストとしては、アンチセンス分子、リボザイムおよび同時サプレッション 分子が挙げられる。アゴニストとしては、プロモーター能力を増大する分子ある いは負の調節機構を妨害する分子が挙げられる。Ｂｃｌ−ｗのアゴニストには負 の調節機構に打ち勝つ分子が含まれる。Ｂｃｌ−ｗのアンタゴニストとしては抗 体や阻害剤ペプチド断片が挙げられる。 Ｂｃｌ−ｗの存在型は２以上の分子が一緒に結合しているという意味でマルチ マー型であり得る。同一のＢｃｌ−ｗ分子が一緒に結合している場合は、この複 合体はホモマルチマーである。ホモマルチマーの１例はホモダイマーである。少 なくとも一つのＢｃｌ−ｗが少なくとも一つの非−Ｂｃｌ−ｗ分子と結合してい る場合は、この複合体はヘテロダイマーのようなヘテロマルチマーである。ヘテ ロマルチマーはＢｃｌ−２ファミリーの別のメンバーの分子また細胞生存を増強 することができる分子を含んでもよい。 従って、本発明は哺乳類中のｂｃｌ−ｗの発現を調節する方法であって、ｂｃ ｌ−ｗ遺伝子とｂｃｌ−ｗ発現の調節因子の有効量を、ｂｃｌ−ｗの発現を高レ ベルに調節、または低レベルに調節またはその他の仕方で調節するのに十分な時 間および条件の下で接触させる工程を含む方法を提供する。例えば、Ｂｃｌ−ｗ またはその誘導体をコードする核酸分子は細胞中に導入するとその細胞が生き残 る能力を増強し、逆にオリゴヌクレオチドのようなｂｃｌ−ｗアンチセンス配列 を導入すると内因性ｂｃｌ−ｗ遺伝子を発現する細胞の生き残り能力を減少させ ることになる。 本発明の別の側面は哺乳類におけるＢｃｌ−ｗの活性を調節する方法であって 、該哺乳類に調節有効量の分子をＢｃｌ−ｗ活性を増加または減少させるのに十 分な時間および条件の下で投与する工程を含む方法を提供する。この分子はタン パク性分子または化学的実体であってＢｃｌ−ｗまたはその受容体の誘導体であ ってもよい。 ｂｃｌ−ｗ発現またはＢｃｌ−ｗ活性の増大は、例えば、γ−照射および化学 療法の間における細胞毒性状態のような細胞変性の阻害または予防を調節する場 合に大きな影響を持ちうる。ｂｃｌ−ｗ発現またはＢｃｌ−ｗ活性の減少は、例 えば、選択的ガン療法において重要であり、そしてｂｃｌ−ｗ発現の増加は発作 やアルツハイマー病などの状態の治療または予防に重要でありうる。 従って、本発明はｂｃｌ−ｗ発現またはＢｃｌ−ｗ活性の調節因子および一つ 以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤を含む薬学的組成物を提 供する。 注射による使用に適する薬学的剤形としては、滅菌水性溶液（水溶性の場合） または分散剤および滅菌注射用溶液または分散剤の即時調製用の滅菌粉末が挙げ られる。すべての場合に剤形は滅菌せねばならずそして注入が容易な程度までに 流体でなければならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければなら ず、細菌やカビなどの微生物の汚染作用に対しても保護されなければならない。 担体としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、 プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール 、および類似のもの）、それらの適当な混合物および植物油を含む溶媒または分 散媒体が使用できる。適当な流動性は、例えば、リシチン（licithin）などの被 覆剤の使用により、分散剤の場合には必要な粒子サイズを維持することによりそ して界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、 種々の抗細菌剤や抗カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール 、ソルビン酸、チルメロサルおよび類似のものにより達成することができる。多 くの場合には、それは等張剤、例えば、糖類または食塩を含むことが好ましい。 注射可能な組成物の長期間吸収は、例えばアルミニウムモノステアレートおよび ゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に使用することにより達成することができる 。 滅菌用注射溶液は適当な溶媒中に必要量の活性成分を上記のさまざまな他の成 分と共に、必要なときはろ過滅菌を行った後に、含めることにより調製される。 一般に、分散剤は、滅菌した種々の活性成分を、基本分散培地および上記のもの のうちの必要な他の成分を含む滅菌ビークル中へ含めることにより調製される。 注射用滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は予め 滅菌濾過されたそれらの溶液から活性成分プラス付加的必要成分の粉末を作る真 空乾燥法および凍結乾燥法である。 ｂｃｌ−ｗおよびＢｃｌ−ｗ調節因子は適当に保護されると、例えば不活性希 釈剤または資化性の食用担体と共に経口的に投与することができ、あるいはそれ は固いまたは柔らかい殻のゼラチンカプセルの中に包み込むことができ、あるい はそれは錠剤に圧縮することができ、あるいはそれは食事の食料に直接含めるこ とができる。 治療用の経口投与には、活性化合物は賦形剤に含められ、摂取可能な錠剤、バッ カル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハー、お よび類似のものの形で使用される。このような組成物および調製物は活性化合物 を少なくとも１重量％含むべきである。組成物および調製物のパーセンテージは 、もちろん、変えることができ、単位重量の約５から約８０％の間にあることが 便利である。このような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は適当な投与量 が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物および調製物は経口 投与単位剤形が０．１μｇと２０００ｍｇの間の活性化合物を含むように調製さ れる。 錠剤、トローチ、ピル、カプセルおよび類似のものも後にリストされる成分を 含むことができる。トラガカント・ガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラ チンなどのバインダー、ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤、コーンスター チ、ポテトスターチ、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなど の滑剤、およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤またはペ パーミント、サリチル酸メチル（oil of wintergreen）、または桜の芳香などの 芳香剤を添加することができる。投与単位の剤形がカプセルのときは、上のタイ プの物質に加えて液体の担体を含めることができる。投与単位の物理的剤形を被 覆あるいは別の仕方で修飾するための様々な物質がほかにもある。例えば、錠剤 、ピル、またはカプセルはシェラック、砂糖または両方で被覆することができる 。シロップまたはエリクシルは活性化合物、甘味剤として砂糖、保存剤としてメ チルおよびプロピルパラベン、色素および桜またはオレンジなどの芳香剤を含む ことができる。もちろん、いかなる投与 単位剤形を作る場合に使用されるどんな物質も薬学的に純粋でありそしてその使 用量では実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物（単数または複数 ）は制御放出(sustained-release)用の調製物や処方に加えることもできる。 薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤としては、溶媒、分散媒体、 被覆剤、抗細菌および抗かび剤、等張物質および吸収遅延物質などのいずれかお よびすべてが挙げられる。このような媒体や物質を薬学的に活性な物質に使用す ることは当技術分野では良く知られている。通常の媒体または物質が活性成分と 配合禁忌である場合を除き、治療用組成物にそれらを使用することは本発明に包 含される。補充的な活性成分もこの組成物の中に含めることができる。 投与の容易および投与量の均一性のため投与単位の剤形で非経口的組成物を処 方することはとりわけ有利である。本明細書で使用されるとき投与単位剤形とは 治療すべき対象哺乳類に対し１回投与に適した物理的に区別された単位を指し、 各単位は必要な薬学的担体との組み合わせで望まれる治療効果を生じさせるよう に計算された活性物質の予め計測された量を含んでいる。本発明の新規な投与単 位剤形の仕様は、（ａ）活性物質のユニークな特性および達成すべき具体的治療 効果、および（ｂ）本明細書で詳細に開示したように身体の健康が損なわれてい る疾病状態を持つ対象生物における疾病の治療のためにこのような活性物質を混 ぜ合わせる技術上の固有の制約、により支配されそして直接それらに依存してい る。 主要な活性成分は便利で効果的な投与のために、前に開示したような投与単位 剤形で、その有効量が薬学的に許容され得る適当な担体と混ぜ合わされる。単位 の投与剤形は、例えば、０．５μｇから約２０００ｍｇにわたる量で主要な活性 化合物を含むことができる。比率で表すと、活性化合物は一般に担体の１ｍｌ当 たり約０．５μｇから約２０００ｍｇまで含まれる。補充的活性成分を含む組成 物の場合は、投与量は該成分の通常の投与量および投与方法を参照して決定する 。 薬学的組成物は標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターのよう な遺伝子分子を含むこともでき、該ベクターはｂｃｌ−ｗの発現またはＢｃｌ− ｗの活性を調節することができる核酸分子を担っている。このベクターは例えば ウイルスベクターであることができる。 生理学的細胞死の調節を必要とする状態としては、神経変性疾患、心筋梗塞、 筋変性疾患、低酸素症、虚血症、ＨＩＶ感染を患う患者の細胞の生き残りの増強 あるいは疾患の治療のために移植される細胞の生き残りを長期化するためが挙げ られる。また、例えば、腫瘍細胞または自己反応性リンパ球の生存能力を減少さ せるために、アンチセンス配列を使用することができよう。センス配列も、例え ば、未同定の成長因子を要求する細胞型から新規な細胞ラインを形成させるため のプロトコルの一部として、細胞のイン・ビトロの挙動を調節するため、以下に 記述するようにモノクローン抗体を産生するハイブリドーマ細胞の単離を容易に するため、そして遺伝的に修飾されている一次体外移植組織の細胞の生存を増強 させるために 使用することができる。 本発明のさらに別の側面は、Ｂｃｌ−ｗおよび触媒活性を有するその誘導体に 対する抗体に関する。このような抗体はモノクローンでもポリクローンでもよく 、そしてＢｃｌ−ｗに対して天然に生ずる抗体から選択することができ、あるい はＢｃｌ−ｗまたはその誘導体に対して特異的に抗体を作成することができる。 後者の場合、Ｂｃｌ−ｗまたはその誘導体をまず担体分子と結合させる必要があ るかも知れない。本発明の抗体および／または組換えＢｃｌ−ｗまたはその誘導 体は治療剤または診断薬として特に有用である。また、抗体の断片はＦａｂ断片 などの抗体断片を使用することができる。さらに、本発明は組換え抗体や合成抗 体およびハイブリッド抗体をも包含する。「合成抗体」とは、本明細書では抗体 の断片およびハイブリッドを含むものと考える。本発明のこの側面の抗体は免疫 療法に特に有用であり、そしてアポプトシスを評価するかあるいは治療分野のプ ログラムを監視するための診断用具としても使用することもできる。 例えば、Ｂｃｌ−ｗおよびその誘導体はＢｃｌ−ｗに対して天然に生じる抗体 をスクリーニングするために使用することができる。 これらは、例えば、一部の自己免疫疾患で生じうる。 例えば、特異的抗体をＢｃｌ−ｗタンパクをスクリーニングするために使用す ることができる。後者は、例えば、細胞抽出物または他の生物学的流体または組 換え手段により作成されたＢｃｌ−ｗの培養上清から精製されたもののＢｃｌ− ｗのレベルをスクリーニン グするための手段として重要となろう。本発明で予定される検定のための技法は 当分野で知られており、例えば、サンドイッチ検定法、ＥＬＩＳＡおよびフロー サイトメトリーが含まれる。 上述の最初に述べた抗体に対する第二の抗体（モノクローン、ポリクローン、 または抗体断片）を含めることは本発明の範囲内にある。第一および第二の抗体 は両方とも検出検定に使用することができ、あるいは第一の抗体は市場で入手可 能な抗免疫グロブリン抗体と共に使用することができる。本発明で予定される抗 体はＢｃｌ−ｗのどこかの領域に特異的なすべての抗体を包含する。 モノクローン抗体およびポリクローン抗体は両方ともタンパクまたはペプチド の誘導体で免疫化することにより得ることができ、そしていずれのタイプも免疫 検定に利用可能である。両方の型の血清を得る方法は当分野で良く知られている 。ポリクローン血清は好ましくないが、Ｂｃｌ−ｗまたはその抗原性部分の有効 量を適当な実験室動物に注射し、その動物から血清を採取し、そして既知の免疫 吸着技術の何れかにより特異的血清を単離することにより、比較的容易に調製さ れる。この方法で製造した抗体は実際上どのタイプの免疫検定にも利用可能であ るが、この生産物の潜在的不均一性のため一般にはあまり好ましくない。 免疫検定におけるモノクローン抗体の使用は、これを大量に製造する能力およ び生産物の均一性の故に、特に好ましい。不死化セルラインと免疫原調製物に対 し感作されたリンパ球を融合することにより誘導されるモノクローン抗体生産用 のハイブリドーマ・セルラ インの調製は、当分野の熟練者に良く知られた技法により行うことができる（例 えば、ドゥイラードおよびホフマン、「ハイブリドーマに関する基本的事実」、 Compendium of Immunology Vol.II,シュワルツ編、1981中、コーラーおよびミル シュタイン、Nature 256:495-499，1975;European Journal of Immunology 6:51 1-519，1976を参照のこと）。 本発明の別の側面は、主体から得た生物試料の中のＢｃｌ−ｗを検出する方法 を提供する。該方法は該生物試料をＢｃｌ−ｗまたはその誘導体または相同体に 対する特異的抗体と、抗体−Ｂｃｌ−ｗ複合体が形成するのに十分な時間および 条件の下で接触させる工程、および該複合体を検出する工程を含んで成るもので ある。 Ｂｃｌ−ｗの存在は、ウエスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはフロー ・サイトメトリー法によるなどの幾つかの方法で行うことができる。米国特許第 ４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号および第４，０１８，６５３号 を参照すれば明らかなように、広範囲の免疫検定法が利用可能である。これらは 、もちろん、非競争型の１部位および２部位の両検定法または「サンドイッチ」 検定法ならびに伝統的な競争的結合検定を含んでいる。これらの検定法は標的に 対する標識化抗体の直接結合をも含んでいる。 サンドイッチ検定法は最も有用性が高くそして普通に使用される検定法であり 、本発明でも使用することが好ましい。サンドイッチ検定法には幾つかの変法が あり、そのすべてが本発明に包含されるのである。簡単に述べると、典型的なホ ワード検定では、非標識抗 体を固体物質の上に固定化し、そしてテスト対象である試料をこの結合した分子 と接触させる。次いで、適当な時間、すなわち、抗体−抗原複合体の形成が行わ れるのに十分な時間、インキュベートした後、この抗原に特異的なそして検出可 能なシグナルを作ることができるレポーター分子で標識化された第二の抗体を添 加し、抗体−抗原−標識化抗体という別の複合体の形成に十分な時間インキュベ ートする。未反応物質をすべて洗い流し、抗原の存在をレポーター分子が作るシ グナルの観察により測定する。その結果は、目に見えるシグナルの単なる観察に よる定性的なものとすることも、既知量のハプテンを含む対照試料と比較するこ とにより定量化することもできる。ホワード検定の変法には、試料と標識化抗体 の両方が結合抗体に同時に添加される、同時検定法が含まれる。これらの技法は 、容易に明らかになるような僅かな変法をも含み、当分野の熟練者には良く知ら れている。本発明によれば、試料は、細胞抽出物、組織生検あるいはおそらく血 清、唾液、粘膜分泌物、リンパ液、組織液および呼吸液などのＢｃｌ−ｗを含む ものである。従って、試料は一般に生物液を含む生物試料であるが、醗酵液およ び細胞培養由来のものなどの上清をも包含する。 典型的なホワードサンドイッチ検定では、Ｂｃｌ−ｗまたはその抗原部分に対 し特異性を有する第一の抗体は固体表面に共有結合的にかまたは受動的に結合し ている。固体表面は典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も普通に使用さ れるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポ リ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は管、ビーズ、微少プレ ートの円板などの形状のもの、または免疫検定を行うのに適する他 のどのような表面でもよい。結合プロセスは当分野で良く知られており、一般に 架橋する共有結合または物理的吸着から成り、ポリマー−抗体複合体はテスト試 料用の調製物の中で洗浄する。次いで、テスト対象の試料の一部を固相複合体に 添加し、抗体中に存在するサプユニットのいずれかと結合するのに十分な時間（ 例えば、２〜４０分間）そして適当な条件（例えば、２５℃）の下でインキュベ ートする。インキュベーション期間の後、抗体ザブユニット固相を洗浄し、乾燥 し、そしてこのハプテンの部分に特異的な第二の抗体と共にインキュベートする 。第二の抗体はレポーター分子に連結しており、ハプテンに第二の抗体が結合し たことを示すために使用される。 別の方法は生物試料中の標的分子を固定化する工程、次いでその固定化された 標的をレポーター分子で標識化されまたはされていない特異的抗体に接触させる 工程を含む。標的の量およびレポーター分子シグナルの強度に依存して、結合し た標的は抗体で直接標識化することにより検出可能となる。また、第一の抗体に 特異的な第二の標識化された抗体は、標的一第一抗体複合体に接触させると標的 −第一抗体−第二抗体の３次複合体を形成する。この複合体はレポーター分子が 放出するシグナルにより検出される。 「レポーター分子」とは、本明細書で使用するとき、その化学的性質により抗 原に結合した抗体の検出を可能とする分析的に同定可能なシグナルを提供する分 子を意味する。検出は定性的かまたは定量的であり得る。このタイプの検定で最 も普通に使用されるレポーター分子は酵素、発蛍光団または放射核を含む分子（ すなわち、放 射性同位元素）のいずれかでありそして化学発光性分子である。 酵素免疫検定の場合には、酵素は、一般にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素 酸塩を用いて、第二の抗体に結合させる。しかしながら、容易に分かるように、 多様な異種の結合技法があり、これらは熟練した職人には容易に利用可能である 。普通に用いられる酵素は、中でも、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、 グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファタ ーゼである。特異的酵素と共に用いられる基質は一般に対応する酵素による加水 分解の際に生ずる検出可能な色変化の形成に基づいて選択される。適当な酵素の 例としては、アルカリホスファターゼとペルオキシダーゼが挙げられる。上記の 発色性基質ではなく蛍光性生産物を生ずる発蛍光基質を採用することも可能であ る。すべての場合に、酵素−標識化抗体を第一抗体ハプテン複合体に添加して結 合させ、次いで過剰の試薬を洗い流す。適当な基質を含む溶液を抗体−抗原−抗 体の複合体に次に添加する。基質は第二抗体に連結した酵素と反応して定性的な 目に見えるシグナルを形成させる、さらにこれは通常分光学的に定量化すること ができ、試料中に存在したハプテンの量を表示する。「レポーター分子」は、ラ テックスビーズなどの上の赤血球のような細胞の凝集または凝集阻害の使用にも 及ぶ。 また、フルオレセインおよびロダミンなどの蛍光性化合物は、その結合能力を 変えることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定波長の光を照射す ることにより活性化すると、蛍光色素−標識化抗体が光エネルギーを吸収して分 子内で励起状態を誘発し、 続いて光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光を放射する。ＥＩＡの場 合のように、蛍光標識化抗体は第一抗体−ハプテン複合体に結合させられる。未 結合の試薬を洗い流した後、残っている３次複合体を次に適当な波長の光に曝す 。観察される蛍光は目的のハプテンの存在を示す。免疫蛍光法およびＥＩＡ法は 両者とも当分野で極めてよく確立されており、本発明の方法にとっても特に好ま しい。しかしながら、放射性同位元素、化学発光性分子または生物発光分子など の他のレポーター分子も採用することができる。 本発明はｂｃｌ−ｗまたはその誘導体を検出するためのＰＣＲ分析を含むよう な遺伝検定をも提供する。 本発明は下記の非−限定的な図面および実施例を参照してさらに説明する。図面の簡単な説明 図１は、ｂｃｌ−ｗ遺伝子のエキソン３から隣接するｒｏｘ遺伝子のエキソン までスプライスされた転写物に相当するネズミｂｃｌ−ｗのｃＤＮＡおよびキメ ラＤＮＡによりコードされる予言されたアミノ酸配列を示す表示である。ボック スはＳ１、Ｓ２およびＳ３と名付けられた（コリ、1995）Ｂｃｌ−２ファミリー 内の最高の相同性を持つ領域を強調する。矢印の先は遺伝子内のイントロンに相 当する位置をマークする。ヒトＢｃｌ−ｗ内で異なる二つの残基がマウス配列の 上に示してある。ｒｏｘのｃＤＮＡ配列のすべてが両方向で決定されているわけ ではない。 図２は、ゲノムｂｃｌ−ｗ座位の構造およびｂｃｌ−ｗのｃＤＮＡとｂｃｌ− ｗ／ｒｏｘのｃＤＮＡの誘導を示す図式的表示である。２２ｋｂ領域を覆う、オ ーバーラップしているゲノム断片はクローニングされたものであるが、その中の 一つ（ａ）だけが示してある。断片ｂからｆは断片ａのサブクローンである。エ キソンはボックスで示し、非−コード領域は白抜きで、ｂｃｌ−ｗ遺伝子のコー ド領域は密な斜線で、ｒｏｘ遺伝子のコード領域は（本文を参照）粗い斜線で示 す。５’−末端の二つのタイプが各クラスのｍＲＮＡで見出された。これは別の プロモーターおよび／またはスプライシングがあることを示唆する。ｂｃｌ−ｗ の３’非翻訳領域の最初の８１５残基はゲノムのエキソン４の中のそれに正確に 対応する。未だ配列決定がなされていない領域は破線で示してある。制限地図は ｂｃｌ−ｗの３’非翻訳領域が少なくとももう一つのイントロンを含むと示唆す る。ｒｏｘ遺伝子の残りの位置は知られていない。 図３は、造血細胞ライン中でのｂｃｌ−ｗＲＮＡの発現を示す写真である。示 したマクロファージ（ｍφ）、骨髄セルライン、およびＴおよびＢリンパ球セル ラインから調製されたポリアデニル化ＲＮＡを電気泳動で分画し、ニトロセルロ ースフィルターに移し、そしてｂｃｌ−ｗのｃＤＮＡプローブとハイブリッド形 成をさせた。コード領域およびｂｃｌ−ｗの３’非翻訳領域に由来するプローブ は同一の結果を生じた。 図４は、Ｂｃｌ−ｗタンパクの発現を示す。（Ａ）ＦＬＡＧ−ｂｃｌ−ｗＰＧ Ｋｐｕｒｏ発現ベクターでトランスフェクトされたＦ ＤＣ−Ｐ１細胞の１クローン（Ｄ３Ｂ５）内でのＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ｗの発現。 トランスフェクタント（黒塗り）および親細胞（白抜き）を抗−ＦＬＡＧモノク ローン抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）エピトープ−標 識生存タンパクの存在を明らかにするイムノブロット。ＦＤＣ−Ｐ１細胞および ＦＬＡＧ−標識化されたマウスＢｃｌ−ｗ（クローンＤ３Ｂ５）、ヒトＢｃｌ− ｘ_LまたはヒトＢｃｌ−２を発現するＦＤＣＰ１細胞の溶解液を抗−ＦＬＡＧア フィニティゲル（コダック）に通し、ＦＬＡＧペプチドで溶出し、電気泳動で分 画し、次いで抗−ＦＬＡＧ抗体で分析した。（Ｃ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動で分画した細胞溶解液についてのポリクローン・ウサギ抗−Ｂｃｌ −ｗ抗血清を用いたイムノブロット。（Ｂ）および（Ｃ）では、染色されたタン パクは増強された化学発光（アマシャム）で可視化された。ＷＥＨＩ−１１２． １およびＥＬ４．１はＴリンパ腫ライン（ハリスら、1973）であり、そしてＪ７ ７４はマクロファージ・ライン（ラルフら、1975）である。約１８ｋＤの余分の タンパクも抗血清で検出されたが、明らかに偶発的交差反応によるものである。 分子量マーカー（バイオーラド）はｋＤで示してある。 図５は、Ｂｃｌ−ｗが、幾つかの、しかし全てではない細胞毒物質により誘導 されるアポプトシスを阻害することを示すグラフ的表示である。ＦＤＣ−Ｐ１細 胞は、生存および増殖にＩＬ−３を必要とする（デキスターら、1980）が、この 細胞を（Ａ、左パネル）ＩＬ−３を含まない培地中で３回洗浄するか、または（ Ａ、右パネル）照射（１０Ｇｙ）し、次いで、（Ａ、左パネル）ＩＬ−３を含ま ない培地中で培養するかまたは（Ａ、右パネル）ＩＬ−３を含む培 地で培養した。Ｂ６．２．１６ＢＷ２Ｔハイブリドーマ細胞（テーら、1989）を １μＭデキサメタソンを含む培地で培養するか（Ｂ、左パネル）または照射（１ ０Ｇｙ）するか（Ｂ、右パネル）した。ＣＨＩＢリンパ腫細胞（ラインスら、19 78）は０．１μｇ／ｍｌのＪｏ２抗マウスＣＤ９５抗体（オガサワラら、1993） の存在下で培養するか（Ｃ、左パネル）または照射（１０Ｇｙ）するか（Ｃ、右 パネル）した。培養は２．５×１０⁵細胞／ｍｌで開始し、そして示した日に０ ．４％ｗ／ｖエオシンで染色することにより生存率を求めた。 図６は、マウス染色体１４の中央領域にあるＢｃｌ−ｗ地図を示す図式的表示 である。すべての座位に対してタイプ分けされた１３４匹の戻し交雑動物におけ るｂｃｌ−ｗおよびその両側の遺伝子の分離パターンが上部に示してある。各カ ラムは(Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＭ．spretus)Ｆ₁親から遺伝したハプロタイプを示す 。斜線を引いたボックスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ対立遺伝子を、そして白抜きボック スはＭ．spretus対立遺伝子を表す。各タイプの染色体を受け継ぐ子孫の数は各 カラムの下にリストしてある。連結した遺伝子に関するｂｃｌ−ｗの位置を示す 部分染色体１４のリンケージ地図は下部に示してある。センチモルガンで表した 座位間の組換え距離はその染色体の左に示し、ヒト染色体の座位の位置は、知ら れている場合は、その右に示してある。この研究で引用した座位のヒト地図の位 置についての言及はジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ（ボルチモア、ＭＤ ）のウイリアム・エイチ・ウエルチ・メディカル・ライブラリに保存されている ヒトリンケージ情報のデータベースである、ＧＤＢ（ゲノムデータベース）から 得ることができる。 図７は、ヒト染色体１４上のｂｃｌ−ｗの位置を示す写真である。ｂｃｌ−ｗ のイントロンプローブとのＦＩＳＨを示す部分的中期(metaphase)。（Ａ）プロ ピディウム アイオダイドで染色した正常な雄染色体。染色体１４上のハイブリ ッド形成部位は矢で示してある。（Ｂ）（Ａ）と同じ中期を、染色体同定のため ＤＡＰＩで染色したもの。 図８は、生存性と抗−生存性Ｂｃｌ−２サブファミリーの比較を示す図である 。ヒトのＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ_L、Ｂｃｌ−ｗ、ＢａｘおよびＢａｋアミノ酸 配列をウイスコンシンＰＩＬＥＵＰプログラムにより配列させた。Ｃｅｄ９配列 の最も保存されている部分とＢｉｋの短い保存断片も示してある。配列を最適化 するために作られた個々の配列の中のギャップはドットで示してある。生存−増 強タンパクＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ_LおよびＢｃｌ−ｗの中の同一または極めて 類似の残基（Ｌ〜Ｍ、Ｅ〜Ｄ、Ｋ〜Ｒ、Ｖ〜Ｉ）は黒の背景の上に示してあり、 すべてのＢｃｌ−２相同体の中の同一または極めて類似の残基もそのようにして ある。灰色の背景はＢａｋとＢａｘが共有しているが生存タンパクには存在しな い残基を示す。相同領域であるＳ１、Ｓ２およびＳ３（コリ、1995）および疎水 性Ｃ−末端断片はボックスで囲み、一方他の研究者（イインら、1994、スブラマ ニアンら、1995）により定義されたＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３およびＮＨ１領域は 上部に線を引いてある。黒矢じりは生存タンパクに特異的な保存された残基を示 す。白矢じりは抗−生存タンパクに特異的なものを示す。実線の矢は全てのタン パクに共通のスプライス部位の位置を示す。破線の矢はより小さなＢｃｌ−ｘタ ンパクを作るもう一つの５’スプライスの位置を示し、そして波状の線は保存さ れたＣ−末端のモチーフを示す。 図９は、（Ａ）ヒトのｂｃｌ−ｗおよび（Ｂ）ネズミのｂｃｌ−ｗのコード領 域を表す。 表２に記載されているようなアミノ酸残基に対する１文字略号および３文字略 号が本明細書で使用されている。 表２ アミノ酸略号 実施例１ ＰＣＲクローニング Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ_LおよびＢａｘの間の強い相同性に基づき、全体的に 縮重した位置にあるイノシンを用いて、Ｓ２およびＳ３領域内に（図８を参照） 、縮重したＰＣＲプライマーを設計した。クローニングを容易にするため、両端 にＸｂａｌおよびＥｃｏＲＩ制限部位を組み込んだ。５’プライマーは５’ＧＣ ＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＧＧＧＩ（ＡＣ）ＧＩ（ＡＧ）ＴＩＧＴＩＧＣＣＴＴ（Ｃ Ｔ）ＴＴ３’〔配列番号：１〕であり、ＸｂａＩ−ＮＷＧＲ（ＩＶ）ＶＡＦＦ〔 配列番号：２〕に対応していた。そして３’プライマーは５’ＧＧＡＡＴＴＣＣ ＣＡＧＣＣＩＣＣＩＴ（ＧＴ）ＩＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡ３’〔配列番号：３〕 であり、ＷＩＱ（ＤＥ）（ＮＱ）ＧＧＷ−ＥｃｏＲＩ〔配列番号：４〕に対応し ていた。逆転写のためのポリアデニル化ＲＮＡ鋳型（１μｇ）はマウスマクロフ ァージ・セルラインＪ７７４およびｄ１８マウス脳から得た。このＲＮＡをエタ ノール沈澱し、乾燥し、１０μｌの水に再懸濁し、６５℃で１０分間加熱した後 氷上で冷却した。次いでこれを、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３、２５℃） 、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのジチオスレイトール、０ ．５ｍＭのｄＮＴＰ類、２μｌの無差別ヘキサマープライマー（アマシャム・フ ァースト・ストランド・ｃＤＮＡ・シンセシス・システム）および２００Ｕスー パースクリプトII^TM逆転写酵素（ギブコ）を含む２０μｌの反応液中で、４８℃ で６０分間逆転写した。ＰＣＲ反応のため、この反応混合物の１μｌを、５０ｍ ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ９．０、２５℃）、０．１％ｖ／ｖの トリトンＸ− １００、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭのｄＮＴＰ類、１０％ｖ／ｖのグ リセロール、０．０５％ｗ／ｖのゼラチン、０．３μｇの各プライマーおよび２ ．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼより成るカクテル４９μｌに添加した。この 混合物を９４℃で３分間変性させ、次いで、９４℃で１分、３７℃で２分、０． ３℃／秒の勾配で７２℃まで加温しその後７２℃で１分から成るサイクルを５回 行った。次の３５サイクルに対する熱的プロフィルは、９４℃で１分、４２℃で ２分、７２℃で１分であった。最後に、この混合物を７２℃で５分間インキュベ ートした。このＰＣＲ生産物をゲル電気泳動で分画し、予想されたサイズ（１５ ９ｂｐ）のＤＮＡ断片をゲルから抽出し、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで制限し、そし てＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）中にサブ クローニングした。得られたクローンの配列を、ｆｍｏｌ^TMシーケンシングシス テム（プロメガ）および製造者のプロトコルを用いる１塩基（Ｔ）反応を用いて 決定した。次いで、ユニークＴ−トラックパターンのそれぞれに対する代表的な クローンについて完全な配列分析を行った。 実施例２ マウスの種間戻し交雑地図 記述された（コープランドおよびジェンキンス、1991）ように、(Ｃ５７ＢＬ ／６ＪｘＭ．spretus)Ｆ_l雌とＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄を交配させて種間戻し交雑の 子孫を作成した。全部で２０５Ｎ₂マウスを用いてＢｃｌ−ｗ座位の地図を作成 した。ＤＮＡ単離、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、サザンブロット移 転およびハイ ブリッド形成は基本的には記述された（ジェンキンスら、1982）ように行った。 プローブ、マウスｃＤＮＡの２．６ｋｂＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ断片をランダム・ プライムド・ラベリング・キット（ストラタジーン）を用い（α³²Ｐ）ｄＣＴＰ で標識化した。洗浄は、１．０×ＳＳＣＰ、０．１％ｗ／ｖのＳＤＳ、６５℃の 最終厳格性まで行った。３．８ｋｂの断片はＣ５７ＢＬ／６ＪのＤＮＡのＢａｍ ＨＩ消化物中にそして７．８ｋｂはＭ．spretus ＤＮＡ中に検出された。その分 布は戻し交雑マウスについて追跡した。界面活性剤結合タンパクＩ（Ｓｆｔｐ１ ）、Ｔ細胞受容体α鎖（Ｔｃｒα）、およびギャップ結合膜チャンネルタンパク ・アルファ−３（Ｇｊα３）を含むｂｃｌ−ｗにリンクした座位に対するプロー ブおよびＲＦＬＰは以前に記述されてきた（ヘフリガーら、1992、ムーアら、19 92）。組換え距離はコンピュータープログラムＳＰＲＥＴＵＳ・ＭＡＤＮＥＳＳ を用い、記述されたように計算した（グリーン、1981）。遺伝子順位は対立遺伝 子分布パターンを説明するために必要な組換え事象の数を最小にすることにより 決定した。 実施例３ 蛍光インサイチュハイブリッド形成（ＦＩＳＨ） ｃＤＮＡおよびイントロンプローブは、ビオチン−１４−ｄＡＴＰでニック翻 訳して作成し、正常な雄の中期に２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でインサイチュ・ハ イブリッド形成を行った。ＦＩＳＨ法は染色体を分析前にプロピディウム・アイ オダイド（反対染色として）および４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドー ル（ＤＡＰＩ）（染色体同定のため）の両方で染色した点で従来の方法（カレン ら、1990）を修飾したものである。中期プレパレーションのイメージはＣＣＤカ メラで捕捉し、コンピュータで増幅した。 実施例４ 発現ベクター 真核細胞での発現および選択のために使用したプラスミドベクターは、高度に 発現した延長因子１α遺伝子由来の強力なプロモーター（およびスプライス）を 含むｐＥＦＢｏｓベクターに基づいており、ＰＧＫプロモーター（ミズシマおよ びナガタ、1990、ビスベイダーら、1992）によりドライブされる選択可能なマー カー（ｐｕｒｏＲ）を含んでいる。ＦＬＡＧエピトープ標識（ホップら、1988） はタンパク生産物の同定を助けるために組み込んだ。ｂｃｌ−ｗｃＤＮＡは、ｐ ＥＦＦＬＡＧ−Ｘ−ＰＧＫｐｕｒｏ中に挿入し、配列を決定してリーディングフ レームを確認し、そして電気穿孔法により、ＦＤＣ−Ｐ１細胞(デキスターら、1 980)、Ｂ６．２．１６ＢＷ２細胞（ジーら、1989）およびＣＨ１（ラインズら、 1978）細胞中に挿入した。トランスフェクタントは、２μｇ／ｍｌのピュロマイ シンを含む培地中で７日間培養することにより選択し、続いてクローンを独立の プールから限界希釈法により単離した。 細胞質免疫蛍光法によりＦＬＡＧ−標識タンパクを検出するため、細胞を−２ ０℃の８０％ｖ／ｖメタノール中で５分間固定し、ついで０．３％サポニン（シ グマ）で透過性を高くした。これは続く全ての染色工程および洗浄工程に含めら れた。この細胞をまず一次Ｍ２モノクローン抗体（イーストマン−コダック、ニ ューヘブン、 ＣＴ）と氷上で４０分間インキュベートし、ついでフルオレセイン−イソチオシ アネート（ＦＩＴＣ）−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１〜２μｇ／ｍｌ、サザン・ バイオテクノロジー、バーミンガム）で修飾し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・デ ィキンソン）を用いるフローサイトメトリーにより分析した。 実施例５ Ｂｃｌ−ｗ抗体 ウサギポリクローン抗−Ｂｃｌ−ｗ抗体をＮ−末端ペプチドであるＡｃ−ＭＡ ＴＰＡＳＴＰＤＴＲＡＬＶ−ＮＨ₂〔配列番号：５〕（キロン・ミモトープ）に 対して作成した。ＫＬＨ−結合ペプチド（０．５ｍｌのリン酸緩衝化食塩水と等 量のフロイントのアジュバントを含む液に１００μｇ含まれる）をウサギに注射 し、３、７、１４日後にフロイントの不完全アジュバント中の同じペプチドでブ ーストした。ウサギ抗血清はＢＳＡ−結合ペプチドに対してＥＬＩＳＡによりス クリーニングした。 実施例６ 新規なｂｃｌ−２−関連遺伝子の同定 当時知られていた３種のｂｃｌ−２相同体（ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘおよびｂ ａｘ）のＳ２およびＳ３領域の部分をコードする縮重ＰＣＲプライマーを用いて 、マウスマクロファージ・セルラインおよびマウス脳（実施例１参照）のｍＲＮ Ａから誘導したｃＤＮＡ鋳型の低厳格性増幅を行った。既知のＢｃｌ−２ファミ リーのメンバ ーに対して予想されるサイズ（１５９ｂｐ）の断片をサブクローニングしそして 配列決定によりスクリーニングした。予期したように、多重のｂｃｌ−２、ｂｃ ｌ−ｘおよびｂａｘクローンが同定されたが、両ＲＮＡ起源とも新規な遺伝子を 表すクローンをも生じた。全長のｃＤＮＡを得るため、クローン化したＰＣＲ生 産物をプローブとして用いて成熟マウスの脳、脾臓および骨髄のセルライン由来 のｃＤＮＡライブラリーを探った。二つのクラスのｃＤＮＡが得られた（図１） 。最初はＢｃｌ−２に極めて類似するポリペプチドをコードしており、本発明者 らはこれをＢｃｌ−ｗと名づけた。第二ははるかかに大きなポリペプチドをコー ドしており、これは最初の１４４残基がＢｃｌ−ｗと同一であったが、それから 著しく逸れていた。逸れた点は、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘおよびｂａｘ遺伝子内 のスプライス結合に対応する点にあるＳ３領域内にあった。このようにして、第 二のクラスのＲＮＡがｂｃｌ−ｗ転写物のもう一つのスプライシングにより作ら れるという可能性があるように思われた。 この問題を解決するため、ｂｃｌ−ｗ座位の２２ｋｂを覆う重なり合うゲノム クローン（図２）を単離した。コード領域のＮ−末端部分は１．３ｋｂのＢａｍ ＨＩ断片（サブクローンｃ）まで地図化された。その配列および隣接する断片の 配列が決定された。ｃＤＮＡの第一のクラスの配列と比較することにより、ｂｃ ｌ−ｗ遺伝子がエキソン３とエキソン４の間にコード領域のスプリットを持つ短 い間隔で繋がった少なくとも４個のエキソンを含むことが明らかになった。異常 に大きい（約２．８ｋｂ）３’非翻訳領域はエキソン４で始まる。これらのｂｃ ｌ−ｗのｃＤＮＡのコード領域かまたは ３’非翻訳領域に対応するプローブは比較的少ない量の３．７ｋｂポリアデニル 化ＲＮＡとハイブリッドを形成した（図３）。最大のｂｃｌ−ｗｃＤＮＡはほぼ その長さである。 ｃＤＮＡの第二のクラスはｂｃｌ−ｗと隣接する遺伝子から作られたキメラＲ ＮＡに相当することが証明された（図２）。ゲノム配列とｃＤＮＡ配列はエキソ ン３の３’末端で分かれ、そしてｃＤＮＡの３’部分は約９．２ｋｂ下流のエキ ソンに由来する（図２）。 データベースの調査により、下流のエキソンとショウジョウバエのｒｏｘ２遺 伝子の間に強い相同性があることが明らかにされた。予言されたマウスｒｏｘア ミノ酸配列は、ＲＮＡ結合タンパクをコードする（ブランドら、1995）ショウジ ョウバエ遺伝子と６６％の同一性および７９％の類似性を示した。こうして、も う一つのスプライシングはｂｌｃ−ｗ／ｒｏｘ転写物を形成する。ネズミｒｏｘ 遺伝子の残りの位置はさらなるゲノムクローンの単離を待つことになる。 ショウジョウバエのｒｏｘに対する特異的プローブ（ブランドら、1995）は、 おそらくｒｏｘ遺伝子の真実の（非−キメラ）転写物である２．８ｋｂおよび１ ．８ｋｂの豊富なｍＲＮＡとハイブリッドを形成した。ｂｃｌ−ｗのエキソン３ に対応するｃＤＮＡプローブは３．７ｋｂＲＮＡだけを検出したのであるから、 キメラｂｃｌ−ｗ／ｒｏｘ転写物の生成量は低いように見える。ｂｃｌ−ｗ／ｒ ｏｘ転写物の意義は不明であり、そして対応するタンパクを検出可能なレベルま で発現させることに本発明者らが失敗したため、これ までのところは、さらなる分析は不可能であった。 実施例７ ヒトおよびマウスのｂｃｌ−ｗ遺伝子は高度に相同である ヒトｂｃｌ−ｗのｃＤＮＡは成熟脳のｍＲＮＡに由来するライブラリーから単 離された。６個のクローンはすべてｂｃｌ−ｗのｃＤＮＡに相当し、そしてキメ ラｃＤＮＡは全く検出されなかった。ヒトおよびマウス遺伝子のコード領域は極 端に相同的であり、アミノ酸レベルで９９％同一そしてヌクレオチドレベルで９ ４％同一であった。唯一のアミノ酸の相違は二つの保存性の置換、すなわち、残 基７におけるスレオチンの代わりにアラニンそしてＳ３領域の丁度上流の残基１ ２４におけるアスパラギン酸の代わりにグルタミン酸であった。比較すると、ヒ トとマウスのｂｃｌ−２コード領域の相同性はアミノ酸レベルで９０％、ヌクレ オチドレベルで８８％であり、そしてｂｃｌ−ｘのそれは９７％および９４％で ある。 実施例８ ｂｃｌ−ｗ遺伝子は細胞の生存を増強する その機能に関しテストをするため、ｂｃｌ−ｗのｃＤＮＡを発現ベクターの中 に挿入し、３種の造血細胞ライン（ＦＤＣ−Ｐ１、すなわちＩＬ３依存性骨髄ラ イン、Ｂ６．２．１６ＢＷ２、すなわちＴハイブリドーマライン、およびＣＨ１ 、すなわちＢリンパ腫ライン）にトランスフェクトさせた。検出を容易にするた め、組換えタンパクにはＮ−末端にＦＬＡＧエピトープ（ホップら、1988）を含 ませた。幾つかの独立のプールおよび抗−ＦＬＡＧモノクローン抗体（例えば、 図４Ａ）で強く染まった薬剤耐性細胞のクローンを研究のために選択した。ウエ スタン・ブロット分析（図４Ｂ）により、ＦＬＡＧ−Ｂｃｌ−ｗタンパクの見掛 けの分子量が２５ｋＤであることが示された。Ｂｃｌ−ｗのＮ−末端ペプチドに 対して作成されたウサギ抗血清はＦＬＡＧ−標識化タンパクばかりでなく、４種 のトランスフェクトされていないセルラインの溶解液にも明らかであったおそら く内因性のＢｃｌ−ｗと思われる、約２２ｋＤのタンパクをも検出した（図４Ｃ ）。内因性タンパクの移動度はＣＯＳ細胞中で一過性に発現したＦＬＡＧ標識を 持たないＢｃｌ−ｗの移動度と区別できなかった。 Ｂｃｌ−ｗはカルボキシ−末端の近くに疎水性領域を持つ。従って膜に関連し ていると予想される。ｂｃｌ−ｗ発現ベクターでトランスフェクトされそしてウ サギポリクローン抗体で染色されたＦＤＣ−Ｐ１細胞の共焦点顕微鏡により、Ｂ ｃｌ−ｗが細胞質に局在していること、そしてその分布がＢｃｌ−２のそれに極 めて似ていることが明らかにされた。Ｂｃｌ−ｗが細胞質に局在することは、核 タンパク画分および細胞質タンパク画分のウエスタンブロットで確認された。 Ｂｃｌ−ｗが細胞の生存を増強するかあるいはそれと拮抗するかを確認するた め、トランスフェクトされたラインを種々の細胞毒性条件に付した。Ｂｃｌ−ｗ を発現するＦＤＣ−Ｐ１細胞は親細胞よりも顕著により強健であった。実際、Ｉ Ｌ−３欠如かまたはγ−照射かの後のそれらの生存は、Ｂｃｌ−２かまたはＢｃ ｌ−ｘ_Lかを 過剰に発現するラインの生存と同等であった（図５Ａ）。Ｂｃｌ−ｗもデキサメ タソンまたは照射に曝されたＴハイブリドーマ細胞の生存を甚だしく増強した（ 図５Ｂ）。これらの結果は明らかに、細胞死を阻害するＢｃｌ−２関連タンパク のサブ−ファミリーの中にＢｃｌ−ｗを置くものである。 Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ_Lは、ＦａｓまたはＡＰＯ−１としても知られて いる（シュトラサーら、1995）細胞表面受容体ＣＤ９５を始動させることにより 誘発されるアポプトシスに対しリンパ系細胞を保護する点では比較的有効でない 。これはＢｃｌ−ｗにも妥当する。放射誘発アポプトシスを保護するに十分なレ ベルのＢｃｌ−ｗを発現するＣＨ１・Ｂリンパ腫細胞（図５Ｃ、右パネル）は、 抗−ＣＤ９５抗体Ｊｏ２とインキュベートすると、対照細胞と同様に急速に死滅 した（図５Ｃ、左パネル）。対照的に、牛痘ウイルスタンパクＣｒｍＡ、ＩＣＥ システインプロテアーゼの強力な阻害剤（レイら、1992）はＣＤ９５により誘発 されるアポプトシスを極めて効果的に阻止した（図５Ｃ、左パネル）が、照射に より誘発される死から細胞を保護することは失敗した（図５Ｃ、右パネル）。こ れらの結果は、アポプトシスが少なくとも二つの経路により誘発され、そのうち の一つだけがＩＣＥの活性化を含んでいることを意味する。 実施例９ 発現パターン ｂｃｌ−２とｂｃｌ−ｘは両者とも広く発現されるが、それらの 発現パターンは著しく異なっている（ホッケンベリら、1991、クラジュースキー ら、1994）。ｂｃｌ−ｘとｂｃｌ−ｗの発現パターンをポリアデニル化ＲＮＡの ノーザンブロット分析で比較した。両遺伝子は多くの組織で発現され、それぞれ 脳、結腸および唾液腺で最高のレベルを示した（表３）。それにもかかわらず、 造血セルラインのパネルを分析すると、明瞭な相違が現れた（表４）。ｂｃｌ− ｘＲＮＡは分析した１２個のＴリンパ系ラインのすべておよび数個のＢリンパ系 ラインで検出されたが、ｂｃｌ−ｗの発現はＴおよびＢリンパ系ラインでは稀で あった。しかしながら、両生存遺伝子の転写物は調査した２３個の骨髄ライン、 この中にはマクロファージ、巨核球、赤血球および肥満細胞起源のセルラインが 含まれるが、それらの大部分で見出された。比較的高レベルのｂｃｌ−ｗＲＮＡ を持つ４個のラインは、ポリクローン抗−Ｂｃｌ−ｗ抗血清を用いそして予想さ れる２２ｋＤタンパクをそれぞれ含め、ウエスタンブロットで分析した（図４Ｃ ）。これらの発見から、ｂｃｌ−ｗの発現パターンはｂｃｌ−ｘのそれと異なっ ていることが確立され、そして造血システム内では、リンパ系細胞にではなく骨 髄細胞においてｂｃｌ−ｗが生存を調節しているという可能性が提起される。要 約すると、ｂｃｌ−ｗ遺伝子は多くの細胞タイプで発現され、そして調査した組 織の中ではそのレベルは脳、結腸および唾液腺で最高であった。５０匹のマウス の造血セルラインの調査から、ｂｃｌ−ｗの発現は、マクロファージ、巨核球、 赤血球および肥満細胞のセルラインを含む幾つかの骨髄系の細胞に共通であるが 、ＢまたはＴリンパ系ラインにはいずれも稀でることが明らかにされた。 実施例１０ ヒトおよびマウスのｂｃｌ−ｗ遺伝子の位置の決定 マウスにおけるｂｃｌ−ｗの染色体上の位置は、Ｘ染色体と同様にすべての常 染色体にわたって良く分布している２０００を越える座位に対してタイプ分けさ れた種間戻し交雑パネルを利用することにより遺伝的に決定された（コープラン ドおよびジェンキンス、1991）。〔（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ_x Mus spretus）Ｆ_l×Ｃ ５７ＢＬ／６Ｊ〕マウスの交配から誘導された子孫由来のＤＮＡについてｂｃｌ −ｗプローブを用いて行われたサザンブロットにより、ｂｃｌ−ｗが界面活性剤 結合タンパク１（Ｓｆｔｐ１）、Ｔ細胞受容体アルファ鎖（Ｔｃｒα）、および ギャップ結合膜チャンネルタンパクアルファ−３（Ｇｊα３）にリンクしたマウ スの染色体１４の中心領域に存在することが示された。少なくとも１３４匹のマ ウスが、分離分析（図６）に示すように個々のマーカーに対して分析され、そし て１８３のマウスがマーカーの幾つかの対についてタイプ分けされた。マーカー の対型の組み合わせのそれぞれに対する完全なデータが組換え頻度の計算に使用 された。各対の座位に対し、組換え染色体を示すマウスの数の分析されたマウス の数に対する比および最も蓋然性の高い遺伝子順序は、セントロメア−Ｓｆｔｐ １−１４／１８３−Ｔｃｒα−１／１８２−Ｂｃｌ−ｗ−１／１４７−Ｇｊα３ である。センチモルガン（ｃＭ）で表した組換え頻度±標準誤差は、Ｓｆｔｐ１ −７．７±２．０−Ｔｃｒα−０．６±０．６−Ｂｃｌ−ｗ−０．７±０．７− Ｇｊα３である。 マウス染色体１４の中心領域はヒト染色体１０ｑ、１４ｑおよび１３と相同の 領域を共有している（図６に要約してある）。特に、 Ｔｃｒαはヒト１４ｑ１１．２の上に置かれておりそしてＧｊα３は１３の上に 置かれている。マウスにおけるＢｃｌ−ｗ、ＴｃｒαおよびＧｊα３の間のタイ トな結合はＢｃｌ−ｗがヒト１４ｑかまたはヒト１３かの上にあることを示唆し た。コード領域由来のヒトｃＤＮＡおよびエキソン（コードする）間のイントロ ンを埋めるゲノムプローブを用いる蛍光インサイチュハイブリッド形成（ＦＩＳ Ｈ）分析により、ｂｃｌ−ｗはｑ１１．２にあるヒト染色体１４に明確に割り当 てられた（図７）。イントロンプローブを用いる蛍光シグナルに対しスコアを取 った２０の中期の中で、１５が染色体１４の染色分体の一方または両方で領域ｑ １１．２−ｑ１２においてシグナルを示し、そしてそのシグナルの９０％が１４ ｑ１１．２においてであった。 実施例１１ Ｎ−末端断片を作成する方法 Ｎ−末端のＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＫ）で標識されたマウスの組換 えＢｃｌ−ｗポリペプチドは、ＢＬ−２１ｐＬｙＳ細菌細胞中で発現させ、抗− ＦＬＡＧ抗体アフィニティマトリックス（イーストマン−コダック）上で精製し た。Ｎ−末端の４５のアミノ酸はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび固定化膜ＰＶＤＦ（ワ ードら、1990）上への電気移転の後に標準的手順で決定した。最初の２７個のア ミノ酸はＦＬＡＧエピトープおよび発現ベクターがコードした予想された付加的 アミノ酸に対応するものであった。次の１８アミノ酸はＢｃｌ−ｗのＮ−末端配 列に対応していた。実施例１２ ヒトおよびネズミのｂｃｌ−ｗのヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列は 図９に示してある。 当分野の熟練した者は本明細書に記述された発明が具体的に記述されたもの以 外に変更および修飾を受け易いことを認めるであろう。本発明はこのような変更 および修飾のすべてを包含するものであることを理解すべきである。本発明は本 明細書で個々にあるいは集合的に言及しあるいは示した工程、特性、組成物およ び化合物のすべて、そして該工程あるいは特性の二つ以上の組み合わせのいずれ もそしてすべてをも包含する。表３ ｂｃｌ−ｗおよびｂｃｌ−ｘ（ＲＮＡ）の組織発現 ^α 大きなサイズの転写物表４ ｂｃｌ−ｗおよびｂｃｌ−ｘのセルラインにおける発現パターン ¹指摘した２種のセルラインを除きすべてで検出限界レベル

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 レオニー エム．ギブソン オーストラリア国、ビクトリア、3039、ム ーニー ポンズ、パーク ストリート 13 番地 (72)発明者 シャウン ピー．ホームグリーン オーストラリア国、ビクトリア、3128、ボ ックス ヒル、アルビオン ロード 27、 ユニット ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ｂｃｌ−２ファミリーに属する新規な哺乳類遺伝子をコードする配列をコ ードするヌクレオチド配列または該コードする配列に相補的なヌクレオチド配列 を含みそして配列番号：７または配列番号：９に実質的に記載されたアミノ酸配 列または配列番号：７または配列番号：９のいずれかに４７％以上の類似性を有 するアミノ酸配列を含む単離された核酸分子。 ２． 該ヌクレオチド配列が配列番号：７または配列番号：９に記載されたアミ ノ酸配列をコードしあるいはその誘導体をコードするものである請求項１記載の 単離された核酸分子。 ３． 該核酸分子が配列番号：６または配列番号：８に実質的に記載されたヌク レオチド配列を含みまたは該配列の誘導体を含むものである請求項１または請求 項２記載の単離された核酸分子。 ４． 該核酸分子が配列番号：６または配列番号：８に記載されたヌクレオチド 配列と低厳格条件下でハイブリッド形成をすることができそして配列番号：７ま たは配列番号：９に記載されたアミノ酸配列に４７％以上の類似性を有するアミ ノ酸配列をコードするものである請求項１または請求項２記載の単離された核酸 分子。 ５． Ｂｃｌ−ｗまたはその誘導体をコードする単離された核酸分子であって、 下記のリストから選択されるものである核酸分子、 （ｉ） 配列番号：７または配列番号：９に記載されたアミノ酸配 列または配列番号：７または配列番号：９に対し４７％以上の類似性を有するア ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、 （ii） 配列番号：６または配列番号：８に実質的に記載されたヌクレオチド配 列または配列番号：７または配列番号：９に４７％以上の類似性を有するアミノ 酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、 （iii） 配列番号：６または配列番号：８に実質的に記載されたヌクレオチド 配列と低厳格条件下でハイブリッド形成をすることができそして配列番号：７ま たは配列番号：９に４７％以上の類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸 分子、 （iv） 低厳格条件下で（ｉ）部または（ii）部または(iii)部の核酸とハイブ リッド形成をすることができそして配列番号：７または配列番号：９に４７％以 上の類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子、および （ｖ） （ｉ）部または（ii）部または(iii)部または（iv）部の核酸分子の誘 導体または哺乳類相同体。 ６． 下記のリストから選択される単離されたポリペプチド、 （ｉ） 配列番号：７または配列番号：９に実質的に記載されたアミノ酸配列ま たは配列番号：７または配列番号：９に４７％以上の類似性を有する配列を有す るポリペプチド、 （ii） 配列番号：６または配列番号：８に実質的に記載されたヌクレオチド配 列または配列番号：７または配列番号：９に４７％以上の類似性を有するアミノ 酸配列をコードする配列によってコードされるポリペプチド、 （iii） 配列番号：６または配列番号：８に記載されたヌクレオチド配列と低 厳格条件下でハイブリッド形成をすることができそして配列番号：７または配列 番号：９に実質的に記載されたアミノ酸配列または配列番号：７または配列番号 ：９に４７％以上の類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子によりコ ードされるポリペプチド、 （iv） （ｉ）部または（ii）部または(iii)部で定義されたポリペプチドのホ モダイマー型、および （ｖ） （ｉ）部または（ii）部または(iii)部で定義されたポリペプチドの ヘテロダイマー型。 ７． 請求項６記載の単離されたポリペプチドのそれ自体のマルチマー型または 他の分子とのマルチマー型。 ８． 該他の分子が細胞生存を増強することができおよび／または細胞周期への 移行を遅延させることができる分子である請求項７記載の単離されたポリペプチ ド。 ９． 該他の分子が細胞生存に拮抗することができる分子である請求項７記載の 単離されたポリペプチド。 １０． 該他の分子がＢｃｌ−２ファミリーのメンバーである請求項７記載の単 離されたポリペプチド。 １１． 哺乳類中でのｂｃｌ−ｗまたはその誘導体の発現を調節する方法であっ て、ｂｃｌ−ｗ遺伝子をｂｃｌ−ｗ発現の調節因子の 有効量と、ｂｃｌ−ｗまたはその誘導体の発現を高レベルに調節または低レベル に調節またはその他の方法で調節するのに十分な時間および条件の下で接触させ る工程を含んで成る方法。 １２． その調節因子がｂｃｌ−ｗまたはその誘導体に対するアンチセンス分子 である請求項１１記載の方法。 １３． その調節因子がＢｃｌ−ｗまたはその誘導体の発現を調節するセンス分 子である請求項１１記載の方法。 １４． その調節因子がｂｃｌ−ｗｍＲＮＡを標的とすることができるリボザイ ムである請求項１１記載の方法。 １５． 哺乳類中でのＢｃｌ−ｗまたはその誘導体の活性を調節する方法であっ て、該哺乳類に、ある分子の調節有効量を、Ｂｃｌ−ｗの活性を増加または減少 させるのに十分な時間および条件の下で投与する工程を含んで成る方法。 １６． その分子がＢｃｌ−ｗまたはその誘導体に対する抗体である請求項１５ 記載の方法。 １７． その分子がＢｃｌ−ｗの非−膜型またはその誘導体である請求項１５記 載の方法。 １８． Ｂｃｌ−ｗまたはその誘導体またはＢｃｌ−ｗ活性の調節因子および一 つ以上の薬学的に許容され得る担体および／または希 釈剤を含んで成る薬学的組成物。 １９． 請求項６〜請求項１０いずれか１項に記載のポリペプチドに対する抗体 。 ２０． 該抗体がモノクローン抗体である請求項１９記載の抗体。