JP2000513811A - 核酸センサー - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は選択された核酸配列検出のためのバイオセンサーと方法を提供する。一つの形態においてそのバイオセンサーは、電極と、上層及び下層を有する二層膜を備える。該下層は該膜と該電極の間に空間を存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいている。該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと、該上層中に拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含む。該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散するのを防ぐ。該選択された核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部分の先端に付着され、且つ該選択された核酸と反応する第２のリガンド又はそれに付着したマーカーが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの残部の先端に付着される。
Description
【発明の詳細な説明】
核酸センサー
発明の分野
本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在の検出に使用するためのバ
イオセンサーおよびサンプル中の選択された核酸(ＮＡ)配列の存在を検出する方
法に関する。
発明の背景
サンプル中の特有なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在のためのアッセイは多くの
分野における適用を有する。例えば、特異的な微生物を持った患者の感染は、そ
の微生物に特有なＮＡ配列の存在のために患者からの生物学的サンプルの分析に
より評価することができる。別の適用は、食品または環境のサンプルの不純物を
検出するための分析を含む。突然変異によって生じる遺伝病の検出もまた、これ
らの技法によって達成することができる。
これまで、このより高い感受性の方法の普及した使用は、特異的な核酸配列の
量の顕著な増殖化の要求のために及び／又は増殖したＤＮＡを分析するための特
殊化された技法を用いることの要求のため、制限されていた。この増殖化は一般
に、ポリメラーゼ連鎖又はリガーゼ連鎖反応を用いて達成され、さらに増殖され
たＤＮＡはゲル上で分離され、そのゲルがＤＮＡの特異的なバンドの存在により
分析される。
別な方法は、核酸検出の方法を教示する米国特許第4,840,893号に含まれる。
該方法は接合されたリガンドを持ったプローブ配列、第２のリガンドに結合し且
つ該酵素が触媒的に活性である時に電極表面に電荷を転移することができる酵素
メディエーター系(enzyme mediator system)、及び該第１と第２のリガンドと結
合を競うアンチリガンドを用いる。該アッセイは競合系(competition system)で
あり、サンプル中の標的配列の結合は第１のリガンドの能力に影響を及ぼし且つ
電極への電荷転移の割合を変える。本発明は、酵素触媒によって発生した信号に
頼らない、直接ゲート化メカニズム(direct gating mechanism)を提供すること
の効
果を有する。
米国特許第4,868,104号は、重合化することができる第１の及び検出系を有す
る第２の、標的分析物上の異なる配列に結合する、２つのポリヌクレオチド試薬
の使用によってヌクレオチド配列を検出する方法を記載する。核酸検出方法を記
載する幾つかの他の特許は、大部分がプローブの標識化を含む。これらは：米国
特許第4,968,602号；米国特許第5,116,733号；米国特許第4,868,105号；米国特
許第4,716,106号；米国特許第4,883,750号；米国特許第5,242,794号；来国特許
第4,996,142号；米国特許第5,348,855号及び米国特許第5,053,326号を含む。
図面の簡単な説明
図１から３は、実施例１から３において得られた結果を示す。
図４はリンカーグラミシジンＢを示す
図５は膜スパンニング脂質を示す
図６はリンカー脂質Ａを示す
図７はビオチニル化グラミシジンＥを示す
発明の詳細な説明
本発明者は、サンプル中の特異的なＮＡ配列の存在を検出するために使用する
ことができる装置を提案する。その装置は、それが脂質膜の使用を含むバイオセ
ンサーとして最もよく記載される。バイオセンサーにおいて用いるための膜は、
国際特許出願 Nos PCT/AU88/00273，PCT/AU/89/00352，PCT/AU90/00025及びPCT/
AU92/00132中に開示されている。これらの出願の開示は参考によってここに包含
される。
これらの出願中に開示された通り、好適に修正された脂質分子は、電極／イオ
ンレザバー／隔離二層の、すなわちイオンチャンネルとイオノフォアの合併のた
めに好適である組合せの中に構築することによるであろう。それはまた、これら
の膜のコンダクタンスが分析物(analyte)の存在又は不存に基づいていることも
開示される。二層膜におけるイオンチャンネルを含む各層において、その膜のコ
ンダクタンスは、膜にのびる連続的なイオンチャンネルを形成するためのそれぞ
れの層中のモノマーの整列に基づく。これらの連続的なイオンチャンネルが恒常
的
に形成され及び破壊されるように、その膜のコンダクタンスはこれらの連続的な
イオンチャンネルの寿命に依存される。
第１の態様において、本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検
出することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは電
極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を
存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダク
タンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいてお
り、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと、該上層中に拡散された第１
の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモ
ノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノ
マーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該
下層内の横方向に拡散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異的に反応する
第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部分
の先端に付着し、且つ該選択された核酸と反応する第２のリガンド又はそれに付
着したマーカーが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの残部
の先端に付着している。
本発明の好ましい実施態様において、該膜は、その膜内の横方向の拡散を妨げ
る膜スパンニング両親媒体(membrane spanning amphiphiles)を含む。
第２の態様において、本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検
出することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは電
極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を
存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダク
タンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいてお
り、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ、該膜内の横方向に拡散するの
を防ぐ膜スパンニング両親媒体及び該上層中に拡散された第１の半膜スパンニン
グモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多
数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に
横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に
拡散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが
該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの少なくとも一部の先端
又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し、且つ該選
択された核酸と反応する第２のリガンド又はそれに付着したマーカーが該膜の表
面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの該少なくとも一部以外又は該膜
の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着している。
第３の態様において本発明は、サンプル内の選択された核酸配列の存在を検出
する方法であり、該方法は上記第１の又は第２の態様のバイオセンサーに該サン
プルを加えることを備える。
当業者によって理解されるであろうように、本発明のバイオセンサーと方法は
、イオンチャンネルを経て膜を横切るためのイオンの能力の変更を生じさせる第
１及び第２のリガンドへの選択された核酸配列の結合によって特徴付けられる。
その検出の特異性は、選択された核酸配列のための第１のリガンドの特異性によ
って提供される。この特異性は多くの手法により提供されてよいが、しかしなが
ら、それは、選択された核酸の中の第１の配列に相補的な配列を含む核酸分子又
はＰＮＡを備える第１のリガンドの使用によりこれが達成されることが目下のと
ころ好適である。理解されるであろうように、第１のリガンド内の配列は、感受
性の要求されるレベルを提供するために十分な何れかの長さ、典型的には少なく
とも１０残基である。その核酸分子は修正された塩基を含んでよいこともまた、
理解されるであろう。
その特異性は第１のリガンドによって最初に提供されるように、第２のリガン
ドは選択された核酸配列のために特異的であることは必須でなく、その第２のリ
ガンドが核酸又はそれに付着したマーカーと結合することが単に必要とされる。
従って、該第２のリガンドはＤＮＡに対して指示する抗体、またはそれの結合フ
ラグメントであってよい。第２のリガンドはまた、挿入剤、主溝又は小溝バイン
ダー、三重螺旋形成可能な作因(agent)又はＤＮＡに共有結合できる作因または
それの組合せであってもよい。第２のリガンドは、それぞれの選択されたすなわ
ち検出されるべき核酸配列のために作製される必要のあるただ一つの特異的なリ
ガンドと同じくこれが該バイオセンサーの簡単な構築の結果になる選択された核
酸配列のために特異的でないことが好適である。
該バイオセンサーはまた、該バイオセンサーを越えて変わる第２のリガンドの
多様性を含んでよい。例えば、膜スパンニング両親媒物に付着する第２のリガン
ドは、別の膜スパンニング両親媒物に付着する第２のリガンドの異なる部分であ
ってよい。その必須の特徴は、核酸に又はそれに付着したマーカーに結合した第
２のリガンドである。従って、用語「第２のリガンド」は、核酸又はそれに付着
したマーカーに結合する部分の単独の又は複数の種におよぶものと解される。
多数の適用におけるその分野の当業者によって予期されるであろうように、検
出されるべき核酸配列はマーカー、例えばビオチニル化ＰＣＲ生成物で標識され
るであろう。
それは、しかしながら、第１及び第２のリガンドの両方が、選択された核酸配
列のために特異的であることが本発明の範囲内であることも明らかである。その
ような実施態様において、第１と第２のリガンドは選択された核酸配列の中の異
なる配列によって特異的である。
第１及び第２のリガンドは、多数の手法のいずれかで付着させてよい。例えば
ストレプトアビジンは上記した出願中に記載された通り付着されてよい。これは
ビオチニル化核酸を結合させるために使用することもできる。第１及び第２のリ
ガンドは、リンカーを経てイオンチャンネル又は膜スパンニング脂質に付着させ
ることが好適である。リンカーを使用する場合、該リンカーはホスホラミダイト
(phosphoramidite)基であることがさらに好適である。
そのリンカー長の変更は、バイオセンサーにおいて検出されたゲート化応答に
影響を及ぼしてよいことも、予期される。
第１及び第２のリガンドが核酸配列である場合、これは、中央におけるＲＮＡ
配列とそれぞれの端でリガンドとして作用するものである２つのＤＮＡ配列を有
する分子の生成によって有利には達成されてよい。その分子の２つの端は、バイ
オセンサーの表面に付着され、さらにその主要なＲＮＡ部分は付着した２つの分
離したＤＮＡ配列をバイオセンサーから離すためにＲＮａｓｅＨで消化される。
好適な実施態様において、第１のリガンドは、選択された核酸の中の第１の配
列に相補の配列を含む核酸分子を備える。第２のリガンドは、選択された核酸配
列内の第２の配列に相補の配列を含む核酸分子を備えることがさらに好適である
。
そのような相補の配列の存在のため、第１と第２のリガンドは、ハイブリッド形
成によって選択された核酸に結合する。
第１と第２のリガンドは、サンプル中の選択された核酸配列の異なる領域に結
合するために選択したオリゴヌクレオチド配列であることが目下の処好適である
。国際特許出願 Nos PCT/AU88/00273，PCT/AU88/00273，PCT/AU89/00352，PCT/A
U90/00025及びPCT/AU92/00132に記載されたインピーダンスブリッジを用いて特
異的なＮＡ配列を検出する又は感知するための方法は、例えばビオチニル化膜ス
パンニング脂質(ＭＳＬ)とビオチニル化グラミシジンの両方を持った膜を作製す
ることによって達成されてよい。ビオチンに強力に結合するストレプトアビジン
は、これらのビオチニル化化合物との反応によって固定化される。
２つのビオチニル化オリゴヌクレオチド配列の混合物(第１と第２のリガンド)
は次いでストレプトアビジンに付着される。これらの配列は、相補でないことが
好適である。関係のある配列のために適当なプローブであろう１つの配列、例え
ば感染性生物プローブ、及びその他の配列は、標的ＤＮＡの別の部分に相補とさ
れるだろう。
検出すべきＤＮＡの添加に関して、２つのビオチニル化配列の架橋が、もしそ
のＤＮＡが２つの付着した、しかし異なっていない配列にハイブリダイズする配
列を含むならば生じる。
第４の態様において本発明は、サンプル内の選択された核酸の存在の検出方法
であり、該方法は、以下の工程：
（ｉ）電極と上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に
空間を存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該
膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又
は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと、
該上層中に拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散
された第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネル
を含み、該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散で
き且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散する
のを防ぎ、第１の核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の表
面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部分の先端に付着し、且
つ第２の核酸配列と特異的に反応する第２のリガンドが該膜の表面に近接
した第１の半膜スパンニングモノマーの残部の先端に付着し、該第１又は
第２の核酸配列のいずれか一方は選択された核酸の配列内にある、バイオ
センサーを用意すること；
（ii）該バイオセンサーに、選択された核酸を含むことが推測されるサンプルを
加えること、及び該膜のコンダクタンス及び／又はインピーダンスを測定
すること；及び
（iii）（ii）からバイオセンサーに対抗核酸を加えること、及び該膜のコンダ
クタンス及び／又はインピーダンスを測定すること、該対抗配列はそれが
第１及び第２の核酸配列の両方を含むように選択される、
を備える。
もしその標的核酸がサンプル中に存在するならば、その対抗配列は、第１及び
第２のリガンドの両方に結合することかできず、かくて架橋する。(ii)と(iii)
において、コンダクタンス／インピーダンス測定における相違の不存は、サンプ
ル中の選択された核酸の存在を示している。
第５の態様において本発明は、サンプル内の選択された核酸の存在の検出方法
であり、該方法は以下の工程：
（ｉ）電極と上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に
空間を存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該
膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又
は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ、該
膜内の横方向に拡散するのを防ぐ膜スパンニング両親媒体及び該上層中に
拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２
の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該
第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第
２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散するのを防ぎ、
該選択された核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の表面に
近接した第１の半膜スパンニングモノマーの少なくとも一部の先端又は該
膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し、且つ該選
択された核酸と反応する第２のリガンド又はそれに付着したマーカーが該
膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの該少なくとも一部
以外又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し
た、バイオセンサーを用意すること；
（ii）該バイオセンサーに、選択された核酸を含むことが推測されるサンプルを
加えること、及び該膜のコンダクタンス及び／又はインピーダンスを測定
すること；及び
（iii）（ii）からバイオセンサーに対抗核酸を加えること、及び該膜のコンダ
クタンス及び／又はインピーダンスを測定すること、該対抗配列はそれが
第１及び第２の核酸配列の両方を含むように選択される、
を備える。
もしその標的核酸がサンプル中に存在するならば、その対抗配列は、第１及び
第２のリガンドの両方に結合することができず、かくて架橋する。(ii)と(iii)
において、コンダクタンス／インピーダンス測定における相違の不存は、サンプ
ル中の選択された核酸の存在を示している。
第６の態様において本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出
することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは電極
と上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を存在
させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダクタン
ス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいており、
該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと、該上層中に拡散された第１の半
膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモノマ
ーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノマー
は該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層
内の横方向に拡散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異的に反応する第１
のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部分の先
端に付着し且つ第２のリガンドが該膜の表面に近接した該第１の半膜スパンニン
グモノマーの残部の先端に付着し、該第２のリガンドは該第１のリガンドが該第
２のリガンドに結合するように該選択された核酸配列のそれに結合され或いはそ
の中に含まれている。
第７の態様において本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出
することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは電極
と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を存
在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダクタ
ンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいており
、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ、該膜内の横方向に拡散するのを
防ぐ膜スパンニング両親媒体及び該上層中に拡散された第１の半膜スパンニング
モノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数
のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横
方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡
散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該
膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの少なくとも一部の先端又
は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し、且つ第２の
リガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの該少なくと
も一部以外又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し
、該第２のリガンドは該第１のリガンドが該第２のリガンドに結合するように該
選択された核酸配列のそれに結合され或いはその中に含まれている。
第６と第７の態様において特異化された配置において、該バイオセンサーは競
合によって選択された核酸配列の存在を検出する。その選択された核酸配列は、
もし試験するべきサンプル中に在るならば、第１のリガンドに結合するための第
２のリガンドと競合する。
第８の態様において本発明は、サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出
することにおいて用いるためのバイオセンサーであり、該バイオセンサーは、電
極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間に空間を
存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、該膜のコンダク
タンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在又は不存に基づいてお
り、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと、該上層中に拡散された第１
の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜スパンニングモ
ノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパンニングモノ
マーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該
下層内の横方向に拡散するのを防ぎ且つ該選択された核酸配列と特異的に反応す
る第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部
分の先端に付着している。
選択された核酸配列を含むサンプルの付加に関するこの構成において、第１の
リガンドは選択されたＤＮＡ配列に結合するであろうし、且つ第１の半膜モノマ
ーの移動性を変化させ又は該チャンネルを通るイオン流を制限するであろう。こ
れは、異なるコンダクタンスを持った膜の結果を与えるであろう。
本発明の他の好適な実施態様において、第１及び第２の半膜スパンニングモノ
マーはグラミシジン又はその誘導体の一つである。本発明のさらに好適な実施態
様において、二層膜は、膜と電極の間に空間が存在するようにリンカー分子(lin
king molecules)を経て電極に付着される。好ましいリンカー分子は、出願PCT/A
U92/00132中に開示されたそれらである。本発明のよりさらに好適な実施態様に
おいて、第２の半膜スパンニングモノマーはリンカー基を経て電極に付着される
。
本発明のさらに別の好適な実施態様において、二層膜は、膜スパンニング脂質
、アルカエバクテリア(archaebacteria)中に見出されるそれらと同じ、を含む。
「架橋」は、第２の半膜スパンニングモノマーによる整列の外に第１の半膜ス
パンニングモノマーを運ぶ架橋配列によって特徴付けされる。これは、第１のコ
ンダクタンスとは異なる第２のコンダクタンスを有する膜を生じる。コンダクタ
ンスにおけるこの相違は測定が可能であり且つサンプル中の選択されたＤＮＡ配
列の存在の証拠となるであろう。
第１と第２のリガンドは同じであっても又は異なっていてもよい。特異的なＮ
Ａ配列に結合するオリゴヌクレオチドリガンドは、当該技術分野で周知である。
本発明の代替の実施態様において、該リガンドはペプチド核酸(ＰＮＡ)である
。ＰＮＡに関する情報は、Science，1991，254，1497 1500;J．Am．Chem．Soc.
，1992，114，1895 1897，J．Am．Chem．Soc.，1992，114，9677 78;J．Chem．S
oc．Chem．Commun.,1993，800 801．Nature，1993，365，566，68;米国特許第4,
795,700号と国際特許出願No.WO 93/18187中に見出されるものでよく、さらにこ
れらの文献の開示は参考によってここに併合される。これらは、リガンドとして
ＰＮＡの使用によって多くの効果が得られる。これらは、二重鎖ＤＮＡにおいて
特異的な配列を認めるための及び鎖置換(strand displacement)又は三重螺旋構
造によるいずれか一方のそれに結合するためのＰＮＡの能力を含む。これは、単
鎖又は二重鎖との結合が可能であるが鎖置換によって結合できないオリゴヌクレ
オチドと対照をなす。ＰＮＡは単鎖ＤＮＡに結合することも可能であることに注
目すべきである。その標的プローブ配列は緊密な結合のためにＰＮＡ分子とする
ことができる。
代替の実施態様において、二つのビオチニル化オリゴヌクレオチド配列の混合
物はストレプトアビジン上に固定化される。一つは標的プローブ配列であり第２
は選択のいずれかの適当な架橋配列である。サンプルの添加によって、標的分析
物は捕捉される。その標的分析物は、関係のある配列を有することのみが要求さ
れる。架橋は起こらず、それ故にゲート化(gating)は観測されず、さらにコンダ
クタンスの第１の測定が実行される。第２のオリゴヌクレオチド配列は、そのシ
ステムに対抗するために用いられる。この対抗配列は、標的オリゴヌクレオチド
配列と架橋配列と相補の配列の両方を含む。もし両方のエピトープの結合が生じ
ると、架橋が起こるであろうし、かくしてイオンチャンネルがゲートオフになり
(gating off)、さらに膜のコンダクタンスが変化する。もしエピトープ２つでの
み結合か生じると(標識ＤＮＡの、そのプローブ配列への結合のために)、架橋が
起こることがなく、かくしてゲート化が見られることはない。対抗配列の付加に
続いて起こるコンダクタンスにおける変化の不存は、それ故に標的分析物の存在
の証拠である。
ＮＡプローブ配列は特に、いずれかの長さとすることができ且つ検出のための
標的分析物に相補の塩基配列を含むであろう。その標的分析物はＤＮＡ又はＲＮ
Ａ配列とすることができる。ＰＮＡプローブ配列もまた、いずれかの長さとする
ことができ且つ検出のための標的分析物に相補の塩基配列を含むであろう。その
標的分析物はＰＮＡが両方に結合するようなＤＮＡ又はＲＮＡ配列とすることが
できる。ＰＮＡはＤＮＡよりもより緊密にＤＮＡとＲＮＡと結合し、故に該対抗
配列は既に結合された標的配列と置換できないものとすべきである。
標的配列の幾つかの実施例が下記に示される。
Listeria monocytogenes;36SrRNA配列のために特異的な１９塩基対オリゴ
ヌクレオチド；食品工業において検出(牛乳、チーズ等)参照：R.F．Wang
W.W．Cao及びM.G．Johnson，App．Environ．Microbiol.，1991,3666-70。
コレラ菌(Vibrio cholerea c)の全てのコレラ毒素生産株は２３塩基対オ
リゴヌクレオチド配列とともに特にハイブリッド形成する(水検出、健康)
。参照：A C．Wrightら，J．Clin．Microbiol.，1992，2302。
Chiamydia及びGonorrhoeaの各種の株の検出のための特異的なオリゴヌク
レオチドプローブ(健康工業)。参照；R．Rossauら，u.Clin．Microbiol.
，1990,944 8;Gen．Microbiol，1989,135,1735 45;Loeffelholz，M．J，J
．Clin．Microbiol.，1992,2847 51。
使用するＤＮＡプローブが"DNA Probes",第二版:G．H Keller & M.M．
Manak，Stockton Press，1993中に見出される、最新技術の優秀な要約。
本発明の本質がより明確に理解できるためにその好適な形態が以下の限定する
ものでない実施例に関連してここに記載されるであろう。
実施例１：ＤＮＡの横方向分離
標的ポリヌクレオチド配列の検出は、特異的なＤＮＡゲート化が５ｎＭ(１pmo
le)の標的ＤＮＡ濃度により観測される以下の実施例によって説明することがで
きる。非-相補的なプローブ配列の存在中のいずれかの応答のトータルの欠落は
コントロール中で認めることができる。
第１の層： ９．３ｎＭリンカーグラミシジンＢ
１．１μＭ膜スパンナー(spanner)脂質Ｄ
２７．５ｎＭ膜スパンナー脂質Ｃ
３７μＭジチオジグリコン酸
７５μＭリンカー脂質Ａ
第２の層： １４ｍＭ(DPE-PC:GDPE=7:3)：ビオチニル化グラミシジンＥ＝
５０，０００：１ エタノール中
顕微鏡スライドガラス上のクロム吸着層(200Å)上に新たに蒸着した金(1000Å
)を持った電極は該第１の層の成分のエタノール溶液内に１時間室温で浸漬され
、エタノールで濯がれ、次いでインピーダンス測定のために用いられるまで４℃
でエタノール中に保存される。そのスライドは、ほぼ１６ｍｍ2として作動する
電極のエリアを定義したテフロン被覆したウェルを含むブロック内に固定される
。
全ての工程は室温で実行される。第２の層の５μＬは、１８０μＬ容量のリン
酸緩衝塩溶液(１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＰＢＳ)の添加の以前に作動電極に加えられる。その電
極はＰＢＳを用いて４回洗浄される。ストレプトアビジンが全てのウェルに添加
され(ＰＢＳ中５μＬ 0.01ｍｇ／ｍＬ)、そしてＰＢＳで過量の未結合のストレ
プトアビジンを洗い流す以前に１０−１５分間ビオチニル化グラミシジンＥと反
応させる。ＤＮＡプローブＦ(200nM)：ＤＮＡプローブＧ(PBS中200nM)の１：１
混合物の５μＬがセンサーウェルに加えられる。ＤＮＡ非-特異的結合プローブ
Ｈ(PBS中400nM ５μＬ)がコントロールウェルに加えられる。そのプローブはス
トレプトアビジンと１０−１５分間反応させ、次いで過量の非結合プローブがＰ
ＢＳで洗い流される。ＰＢＳ中のＤＮＡ標的Ｉ(10nM)の１００μＬが各ウェルに
加えられる。センサーウェルへのＤＮＡ標的Ｉの結合は、最小相でのアドミッタ
ンス(admittance at minimum phase)における増加を与えるがしかし、コントロ
ールウェル中の膜アドミッタンスにおいて顕著な変化はない(図１)。最小相での
アドミッタンスの増加の量と割合は試験溶液中のＤＮＡ存在量に関連し且つそれ
故に試験溶液中の濃度を決定するために使用することができる。
ＤＮＡプローブＦ：
ビオチンとＤＮＡの間に３１-原子ホスホラミダイト(phosphoramidite)リン
カー基を持った５’ビオチニル化リステリア(listeria)プローブＤＮＡ。
ＤＮＡプローブＧ：
ビオチンとＤＮＡの間に３１-原子ホスホラミダイトリンカー基を持った５'
ビオチニル化コレラ毒プローブＤＮＡ。
ＤＮＡ非-特異的結合プローブＨ：
標的ＤＮＡ配列のすべての部に非-相補的である、ビオチンとＤＮＡの間に
３１-原子ホスホラミダイトリンカー基を持った５'ビオチニル化１５-merオ
リゴヌクレオチド。
ＤＮＡ標的Ｉ：
１９-塩基リステリア配列、１０塩基‘スペーサー’と２３塩基コレラ毒配
列を含んだ６７塩基ＤＮＡ配列。
式中：
実施例２：酵素的開裂により続行されるＤＮＡの横方向分離
この試験は、第２の、確認工程を実行するための能力を説明し、それによって
酵素は結合したポリヌクレオチドを開裂するために使用することができ、かくし
て関係のある特異的領域が存在することを確認する。
第１の層： ９．３ｎＭリンカーグラミシジンＢ
１．１μＭ膜スパンナー(spanner)脂質Ｄ
２７．５ｎＭ膜スパンナー脂質Ｃ
３７μＭジチオジグリコン酸
７５μＭリンカー脂質Ａ
第２の層： １４ｍＭ(DPE-PC:GDPE=7:3)：ビオチニル化グラミシジンＥ＝
５０，０００：１ エタノール中
電極が調製され、さらに第２層が実施例１中に記載される通り加えられる。次
のストレプトアビジン、ＤＮＡプローブ及びＤＮＡ標的配列は、それらが３０℃
で実行されることを除いて、実施例１中に記載された通り加えられる。
ＤＮＡゲート化の１５分後、非結合ＤＮＡ標的Ｉが、DNaseＩ活性化緩衝液で
洗い流される。DNaseＩ活性化緩衝液は５０ｎＭトリス塩酸、ｐＨ7.6、５０ｎＭ
ＮａＣｌ、１０ｎＭ ＭｇＣｌ2、１０ｎＭ ＭｎＣｌ2、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳ
Ａからなる。DNaseＩ(２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＭｇＣｌ2の５
０％w/vグリセリン溶液中の１ｍｇ／ｍＬ ２μＬ)がセンサーとコントロールウ
ェルに
加えられる。DNaseＩの添加はセンサーウェルの最小相でのアドミッタンスの増
加を与えるがしかし、コントロールウェルの顕著な増加はなく(図２)、ＤＮＡの
開裂が検出されることを示す。
実施例３：２ ビオチニル化相補ポリヌクレオチド配列の付加によるＤＮＡゲー
ト化
この実施例は標的中に併合した捕捉分子を有することによって関係のあるポリ
ヌクレオチド上のただ一つの特異的配列の検出の可能性を説明する。またそれは
ペプチド核酸(ＰＮＡ)配列の使用をも説明する。
第１の層： ９．３ｎＭリンカーグラミシジンＢ
１．１μＭ膜スパンナー(spanner)脂質Ｄ
５．５ｎＭ膜スパンナー脂質Ｃ
３７μＭジチオジグリコン酸
７５μＭリンカー脂質Ａ
第２の層： １４ｍＭ(DPE-PC:GDPE=7:3)：ビオチニル化グラミシジンＥ＝
５０，０００：１ エタノール中
電極が調製され且つ第２層が実施例１中に記載された通り加えられる。全ての
工程は室温で実行される。第２の層の５μＬは、１８０μＬ容量のリン酸緩衝塩
溶液(１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．
７ｍＭ ＫＣｌ、ＰＢＳ)の添加の以前に作動電極に加えられる。その電極はＰＢ
Ｓを用いて４回洗浄される。ストレプトアビジンが全てのウェルに添加され(Ｐ
ＢＳ中５μＬ 0.01ｍｇ／ｍＬ)、そしてＰＢＳで過量の未結合のストレプトアビ
ジンを洗い流す以前に１０−１５分間ビオチニル化グラミシジンＥと反応させる
。
ＰＮＡ配列Ｊと相補のＤＮＡ配列Ｋのそれぞれの５ｎＭ(1.14μL 1.75μM)が
センサーウェルに連続して素早く加えられる。ＰＮＡ又はＤＮＡ配列のないもの
がコントロールウェルに加えられる。ストレプトアビジンに対するＰＮＡ(Ｊ)と
Ｄ
ＮＡ(Ｋ)及び互いの結合は最小相でのアドミッタンスの増加を与えるがしかし、
コントロールウェル中の膜アドミッタンスにおける顕著な変化はない(図３)。最
小相でのアドミッタンスの増加の量と割合は試験溶液中のＤＮＡ又はＰＮＡ存在
量に関連し且つそれ故に試験溶液中の濃度を決定するために使用することができ
る。
ＰＮＡ配列Ｊ：
８-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸リンカーの溶解性をプラスにするために
グリシンとリシンを含むＮ-ビオチニル化リステリアプローブ配列ＰＮＡ。
ＤＮＡ配列Ｋ：
ビオチンとＤＮＡの間にリンカー基を持たない５'-ビオチニル化リステリア
ＤＮＡ。
式中
広く記載された本発明の精神と範囲から逸脱することなく各種の変更及び／又
は修正を特有の実施態様中に示されたような本発明に遂行できることは当業者に
よって予測されるであろう。これらはＰＣＲ(又は別の増殖法)生成物の検出及び
遺伝に起因する病気における遺伝子突然変異、ここでその突然変異は知られる、
の検出を含む。欠陥のある遺伝子のためのおよそ３５００の患者のリストがMcKu
sickの"Mendelian Inheritance in Man"中に見出すことができ、そしてさらなる
実例が科学雑誌中に恒常的に報告される。本実施態様は、それ故に説明として関
連する全てを考慮すべきであり限定するものでない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，
ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ
，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，
ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ
Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ
，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ
(72)発明者 ハーディング，マーガレット
オーストラリア国 2040 ニュー サウス
ウェールズ リリーフィールド パーシ
ヴィル ストリート ４／１―３
(72)発明者 ルーカス，サリー ライト
オーストラリア国 2034 ニュー サウス
ウェールズ クーギー カール ストリ
ート ６／37
(72)発明者 アレンスドルフ，パトリック
アメリカ合衆国 ニューヨーク 10024
ニューヨーク ウエスト エイティフィフ
ス ストリート 327 アパートメント
１ディー
(72)発明者 ブラーチ―マクスヴィティス，ヴィヨレー
タ ルシジャ ブロニスラヴァ
オーストラリア国 2203 ニュー サウス
ウェールズ ダルウィッチ ヒル ダー
リー ストリート ９
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １． サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出することにおいて用いるた めのバイオセンサーであり、電極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下 層は該膜と該電極の間に空間を存在させるような手法において該電極に近接され 且つ結合され、該膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配 列の存在又は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ と、該上層中に拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散さ れた第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、 該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の 半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散するのを防ぎ、該選択され た核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半 膜スパンニングモノマーの部分の先端に付着し、且つ該選択された核酸と反応す る第２のリガンド又はそれに付着したマーカーが該膜の表面に近接した第１の半 膜スパンニングモノマーの残部の先端に付着したバイオセンサー。 ２． サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出することにおいて用いるた めのバイオセンサーであり、電極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下 層は該膜と該電極の間に空間を存在させるような手法において該電極に近接され 且つ結合され、該膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配 列の存在又は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ と、該上層中に拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散さ れた第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、 該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の 半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散するのを防ぎ、該選択され た核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半 膜スパンニングモノマーの部分の先端に付着し且つ第２のリガンドが該膜の表面 に近接した該第１の半膜スパンニングモノマーの残部の先端に付着し、該第２の リガンドは該第１のリガンドが該第２のリガンドに結合するように該選択された 核酸配列のそれに結合され或いはその中に含まれている、バイオセンサー。 ３． 膜は、その膜内の横方向の拡散するのを防ぐ膜スパンニング両親媒体を含 む請求項１又は２記載のバイオセンサー。 ４． サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出することにおいて用いるた めのバイオセンサーであり、電極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下 層は該膜と該電極の間に空間を存在させるような手法において該電極に近接され 且つ結合され、該膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配 列の存在又は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ 、該膜内の横方向に拡散するのを防ぐ膜スパンニング両親媒体及び該上層中に拡 散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜ス パンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパ ンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニング モノマーは該下層内の横方向に拡散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異 的に反応する第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモ ノマーの少なくとも一部の先端又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親 媒体の先端に付着し、且つ該選択された核酸と反応する第２のリガンド又はそれ に付着したマーカーが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの 該少なくとも一部以外又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先 端に付着したバイオセンサー。 ５． サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出することにおいて用いるた めのバイオセンサーであり、電極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下 層は該膜と該電極の間に空間を存在させるような手法において該電極に近接され 且つ結合され、該膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配 列の存在又は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ 、該膜内の横方向に拡散するのを防ぐ膜スパンニング両親媒体及び該上層中に拡 散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第２の半膜ス パ ンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、該第１の半膜スパン ニングモノマーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２の半膜スパンニングモ ノマーは該下層内の横方向に拡散するのを防ぎ、該選択された核酸配列と特異的 に反応する第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノ マーの少なくとも一部の先端又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒 体の先端に付着し、且つ第２のリガンドが該膜の表面に近接した第１の半膜スパ ンニングモノマーの該少なくとも一部以外又は該膜の表面に近接した該膜スパン ニング両親媒体の先端に付着し、該第２のリガンドは該第１のリガンドが該第２ のリガンドに結合するように該選択された核酸配列のそれに結合され或いはその 中に含まれている、バイオセンサー。 ６． 第１のリガンドが、選択された核酸の中の第１の配列に相補の配列を含ん だ核酸配列又はＰＮＡを備える請求項１から５のいずれか１項記載のバイオセン サー。 ７． 第２のリガンドが、ＤＮＡに対して指示する抗体、又はそれの結合フラグ メントである請求項１から６のいずれか１項記載のバイオセンサー。 ８． 第２のリガンドか、挿入剤、主溝又は小溝バインダー、三重螺旋形成可能 な作因又はＤＮＡに共有結合できる作因である請求項１から６のいずれか１項記 載のバイオセンサー。 ９． 第２のリガンドが選択された核酸配列のために特異的である請求項１から ６のいずれか１項記載のバイオセンサー。 １０． 第１及び第２のリガンドが、リンカーを経てイオンチャンネル又は膜ス パンニング脂質に付着した請求項１から９のいずれか１項記載のバイオセンサー 。 １１． リンカーが、ホスホラミダイトリンカー基である請求項１０記載のバイ オセンサー。 １２． サンプル中の選択された核酸配列の存在を検出することにおいて用いる ためのバイオセンサーであり、電極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該 下層は該膜と該電極の間に空間を存在させるような手法において該電極に近接さ れ且つ結合され、該膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸 配列の存在又は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレ イと、該上層中に拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散 された第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み 、該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該第２ の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散するのを防ぎ且つ該選択 された核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の表面に近接した第１ の半膜スパンニングモノマーの部分の先端に付着したバイオセンサー。 １３． 第１のリガンドが、選択された核酸の中の第１の配列に相補の配列を含 んだ核酸配列又はＰＮＡを備える請求項１２記載のバイオセンサー。 １４． 第１のリガンドが、リンカーを経てイオンチャンネルに付着した請求項 １２又は１３記載のバイオセンサー。 １５． リンカーが、ホスホラミダイトリンカー基である請求項１４記載のバイ オセンサー。 １６． 第１及び第２の半膜スパンニングモノマーが、グラミシジン又はその誘 導体の１種である請求項１から１５のいずれか１項記載のバイオセンサー。 １７． サンプル内の選択された核酸の存在の検出方法であり、以下の工程： （ｉ）電極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間 に空間を存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、 該膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在 又は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイと 、該上層中に拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡 散された第２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネ ルを含み、該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散 でき且つ該第２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散す るのを防ぎ、第１の核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の 表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの部分の先端に付着し、 且つ第２の核酸配列と特異的に反応する第２のリガンドが該膜の表面に近 接した第１の半膜スパンニングモノマーの残部の先端に付着し、該第１又 は第２の核酸配列のいずれか一方は選択された核酸の配列内にある、バイ オセンサーを用意すること； （ii）該バイオセンサーに、選択された核酸を含むことが推測されるサンプルを 加えること、及び該膜のコンダクタンス及び／又はインピーダンスを測定 すること；及び （iii）（ii）からバイオセンサーに対抗核酸を加えること、及び該膜のコンダ クタンス及び／又はインピーダンスを測定すること、該対抗配列はそれが 第１及び第２の核酸配列の両方を含むように選択される、 を備える方法。 １８． サンプル内の選択された核酸の存在の検出方法であり、以下の工程： （ｉ）電極と、上層及び下層を有する二層膜を備え、該下層は該膜と該電極の間 に空間を存在させるような手法において該電極に近接され且つ結合され、 該膜のコンダクタンス又はインピーダンスは該選択された核酸配列の存在 又は不存に基づいており、該膜は両親媒性分子の密に充填されたアレイ、 該膜内の横方向に拡散するのを防ぐ膜スパンニング両親媒体及び該上層中 に拡散された第１の半膜スパンニングモノマーと該下層中に拡散された第 ２の半膜スパンニングモノマーとを含む多数のイオンチャンネルを含み、 該第１の半膜スパンニングモノマーは該上層内に横方向に拡散でき且つ該 第２の半膜スパンニングモノマーは該下層内の横方向に拡散するのを防ぎ 、該選択された核酸配列と特異的に反応する第１のリガンドが該膜の表面 に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの少なくとも一部の先端又は 該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着し、且つ該 選択された核酸と反応する第２のリガンド又はそれに付着したマーカーが 該膜の表面に近接した第１の半膜スパンニングモノマーの該少なくとも一 部以外又は該膜の表面に近接した該膜スパンニング両親媒体の先端に付着 した、バイオセンサーを用意すること； （ii）該バイオセンサーに、選択された核酸を含むことが推測されるサンプルを 加えること、及び該膜のコンダクタンス及び／又はインピーダンスを測定 すること；及び （iii）（ii）からバイオセンサーに対抗核酸を加えること、及び該膜のコンダ クタンス及び／又はインピーダンスを測定すること、該対抗配列はそれが 第１及び第２の核酸配列の両方を含むように選択される、 を備える方法。 １９． 第１のリガンドが、選択された核酸の中の第１の配列に相補の配列を含 んだ核酸配列又はＰＮＡを備える請求項１７または１８記載の方法。 ２０． 第２のリガンドが、ＤＮＡに対して指示する抗体、又はそれの結合フラ グメントである請求項１７から１９のいずれか１項記載の方法。 ２１． 第２のリガンドが、挿入剤、主溝又は小溝バインダー、三重螺旋形成可 能な作因又はＤＮＡに共有結合できる作因である請求項１７から１９のいずれか １項記載の方法。 ２２． 第２のリガンドが選択された核酸配列のために特異的である請求項１７ から１９のいずれか１項記載の方法。 ２３． 第１及び第２のリガンドが、リンカーを経てイオンチャンネル又は膜ス パンニング脂質に付着した請求項１７から２３のいずれか１項記載の方法。 ２４． リンカーが、ホスホラミダイトリンカー基である請求項２３記載の方法 。 ２５． 第１及び第２の半膜スパンニングモノマーが、グラミシジン又はその誘 導体の１種である請求項１７から２４のいずれか１項記載の方法。
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