JP2000514188A

JP2000514188A - ２つの標識を用いる分析物の決定

Info

Publication number: JP2000514188A
Application number: JP10504751A
Authority: JP
Inventors: ギーゼン，ウーズラ; ヴェンツィヒ，ペーター; ツィーグラー，ギュンター; ヴァインデル，クルト
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー
Priority date: 1996-07-06
Filing date: 1997-07-02
Publication date: 2000-10-24
Also published as: DE59707874D1; DK0912765T3; EP0912765B1; DE19627290A1; CY2403B1; ATE221579T1; US6447999B1; EP0912765A1; ES2184109T3; WO1998001578A1; AU3441997A

Abstract

(57)【要約】単純な装置での２つの検出メカニズムの組み合わせは、検出される分析物を容易に定量することが可能な方法に至る。好ましいフォーマットおよび試薬キットが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】２つの標識を用いる分析物の決定本発明の主題は、試料中の分析物の決定方法、該方法を行なうための試薬キットおよび試料中の分析物の定量決定のための２つの異なる標識プローブの使用である。試料中の分析物の決定は、特に健康保護の分野において、特に重要性をもたらしている。体液等の多くの分析物は、疾患または感染の存在に対する指標を提供するために使用されうる。しかしながら、多くの分析物は、直接には決定されえず、または、試料中に含まれる大量の非常に類似した物質とともに少量で存在すしているので、直接の決定は現実には不可能である。この理由のために、分析物の特異的決定が、検出可能で標識されたプローブの助けによりだんだん試みられている。これらのプローブは、分析物のみに結合し、よって、分析物を標識することが理想的である。一方、多数の標識基が利用可能である。これらには、例えば、金属、発色団、蛍光マーカーばかりでなく、酵素、電気発光基および化学的に活性化されうる基が含まれる。国際公開第９２／１４１３９号パンフレットにおいて、電気化学発光に基づく、決定対象の分析物の結合試験を行なうための装置の例が記載されている。この場合において、分析物は、金属複合体および電位差の適用による該複合体の励起を用いる標識プローブへの結合の力により決定される。次いで、発生した光のシグナルを検出する。同様に、例えば、欧州特許ＥＰ７６４４６８号明細書には、カルシウムで活性化されうる発光蛋白質が標識として提示されている。これらの蛋白質での光の発生のメカニズムは、アエクオリンで標識されたプローブで標識された分析物を含有する溶液へのカルシウム塩含有溶液の添加に基づいている。これは、アエクオリンによる電磁シグナルの発生を誘因する。核酸は、その塩基配列に保存された情報のため、診断分野で特に有用な補助物である。しかしながら、特定の核酸配列は、非常に類似した配列よりもかなり低い量で存在する。したがって、核酸の検出前に、検出対象の核酸を増幅すること、即ち、一定の配列の多数のコピーを生成することが有利であることがわかった。かかる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）である。特にこの増幅反応において、増幅効率は、様々な因子により非常に影響を受けるので、核酸の定量的検出は、不可能であるかまたは、非常に好適な条件下でのみ可能であることが見出された。したがって、増幅前に、分析物含有試料に既知量で標準分析物を添加することが示唆されている。該標準は、その検出特性において分析物とは異なるが、その増幅効率に関しては同様の様式で挙動するべきである。内部標準を利用するかかるポリメラーゼ連鎖反応は、例えば、米国特許第５，２１３，９６１号明細書または米国特許第５，２１９，７２７号明細書に記載されている。類似の方法は、国際公開第９２／０１８１２号パンフレット、国際公開第９４／０４７０６号パンフレット、欧州特許出願第０５２５８８２号明細書、国際公開第９５／０２０６７号パンフレットおよび国際公開第９４／０９１５６号パンフレットに記載されている。最後に掲げた特許出願において、固定化したプライマーをＰＣＲに用いて、得られた増幅量をプローブを用いて決定する方法が記載されている。国際公開第９３／１０２５７号パンフレットにおいて、最初にＰＣＲを行ない、次いで、反応混合物を２つの異なって標識されたプローブとインキュベートする方法が記載されている。国際公開第８９／１０５５２号パンフレットにおいて、励起されて電気化学発光可能な異なる標識を用いる２つの試料の同時決定のための装置が記載されている。２個の測定セルと、次いで検出される異なる波長を生じさせる２個の検出器を用いる。励起工程が、空間的に時間的に分離して許容されうる力学と感度を保証する様式で機能する方法は、試料処理量が小さく、要求される試料の容量が大きいという不利な点を有する。独国特許ＤＥ−Ｃ−３０２２４２６号明細書は、電位差の適用により生成される酸化生成物により化学発光標識が放射点まで励起される免疫アッセイを記載する。欧州特許ＥＰ−０４７８６２６号明細書において、得られる検出基が異なる動力学挙動を示すかまたは異なるスペクトルを示すような様式で様々な物質により修飾される検出基が記載されている。励起は、同一のトリガー（酸化剤）を用いて同時に起こる。実際のシグナル（スペクトルまたは動力学）は、非常に大きな程度まで重複し、減少した力学および低下した感度の結果となる。欧州特許ＥＰ−０１９９８０４号明細書、米国特許第５，２３８，８０８号明細書および米国特許第５，３１０，６８７号明細書において、種々の標識がそれらの異なるスペクトル特性を利用して光学的に検出される多重標識系が記載されている。国際公開第９３／０１３０８号パンフレットにおいて、アクリジニウムエステル標識抗体およびアルカリ性ｐＨでの酸化による化学発光シグナルの発生を用いる分析物の検出方法が記載されている。したがって、本発明の１つの目的は、一部または全体で当該技術の状態を改良し、特に、従来の同時蛍光励起法（非解像可能シグナルまたは不完全解像シグナル）の不利な点を回避すると同時に、分析器の処理量を増加させる方法を利用可能にすることであった。したがって、本発明の主題は、少なくとも１つは決定対象の分析物に特異的である、少なくとも２つのプローブでの試料のインキュベーションによる試料中の分析物の決定方法であって、少なくとも２つのプローブが異なる標識基を保持し、それぞれが各異なる標識基に対して異なる電磁シグナルを発生することが可能であり、発生したシグナルの評価が分析物の量の存在の指標として行なわれる。本発明の他の主題は、分析物の決定および試料中の分析物の定量的検出のために２つの異なる電磁シグナルを供給可能な２つのプローブの適用のための試薬キットである。図１では、本発明の方法を行なうための装置の概略的構造を示す。図２では、異なる分析物濃度での本発明の決定のためのシグナルの推移を示す。図３では、検出反応が側方に分離している本発明の２つの典型例の方法の比較がなされる。図４では、標識の結合用のリンカー分子の構造を示す。図５および６は、いかに決定が互いに完全に独立した様式で行なわれうるかを示す。図７および８では、同一の標的に対して競合する２つの異なって標識されたプローブ間の競合試験の結果を示す。本発明の分析物は、当該決定方法の主題であるすべての物質である。これらは、医学的診断に用いられる試料の成分、即ち、特に抗原、抗体、細胞または核酸等の体液成分であることが好ましい。該核酸は、ウイルスまたは細菌起源の物質、即ち、ウイルスもしくは細菌の核酸または生物の内因性核酸等の感染性剤に特異的な核酸であることができる。当業者は、当該量が１以上の位置で変異、欠失または挿入等の、正常な状態で見出される量とは異なるかどうかを決定する。ウイルス核酸は、例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶもしくはＨＧＶ等のＲＮＡウイルスのリボ核酸またはクラミジア、ナイセリアもしくはサルモネラ等の細菌のゲノムＤＮＡまたはｒＲＮＡである。本発明における試料は、特に、決定対象の分析物が溶解または懸濁されている液体試料である。体液の試料は、血液、尿もしくは唾液またはこれらに由来する血清、血漿、軟膜もしくは１以上の反応工程の実行後に生成する液体等の体液であることが好ましい。これらの反応工程は、試薬の添加後に行なわれることが好ましく、元の試料材料中の分析物の濃縮、修飾または複製をもたらすか元の試料中の干渉物質の分解をもたらすことができる。試料材料は、試料標品の作製および引き続くＰＣＲの実行後に生成する反応混合物であることが特に好ましい。本発明で理解するところのプローブとは、決定対象の分析物または／および標準分析物のための検出系の構成要素である。例えば、かかる構成要素は、免疫学的相互作用またはハイブリダイゼーションが起こるのに十分な数の核酸塩基の塩基対の相補的配列間の塩基対相互作用等の生物学的相互作用により分析物または標準分析物を検出するものである。したがって、プローブは、抗体、抗原、ハプテンまたは核酸もしくは天然の核酸とは異なる、例えば、糖リン酸骨格がペプチド骨格により置換されている核酸類似体（例えば、国際公開第９２／２０７０２号パンフレット等に記載されているようなもの）であることが好ましい。本発明の方法は、その内の少なくとも１つは決定対象の分析物に特異的な少なくとも２つのプローブを使用する。プローブとは、試験条件下では決定対象でない試料成分または試料中に存在すると予想される成分等の他の成分とは５％未満の交差反応性を示す、即ち、かかる他の成分が目的の成分、即ち分析物の結合量と比較して５％未満結合するような特異性であると定義される。また、決定対象の分析物に特異的でない少なくとも１つのさらなるプローブの使用も好ましい。当該プローブは、試料のさらなる成分、特に分析物とは構造的にわずかであるが一定の事項で異なっている成分に特異的であることが好ましい。標準分析物は、該試料の付加的な成分であることが好ましい。本発明において、標準分析物とは、試料中にある一定の量、好ましくは既知の量で含まれるかまたは既知の一定の量で試料中に添加される物質である。標準分析物は、例えは、分析物特異的プローブに結合する能力において、好ましい試験条件下では有意な程度まで結合しない、一定の事項で分析物とは異なっている。標準分析物は、元の試料にすでに存在することができるが、試料とプローブとのインキュベーションに先立ち当該試料に添加することが好ましい。また、試料中の特異的核酸の決定の場合には、標準分析物は、そのヌクレオチド配列または鎖の長さのいずれかにおいて、分析物核酸とは異なる核酸であることが好ましい。特に、分析物の塩基配列を有する核酸の部分セグメントを除去することが好ましく、他のセグメント（好ましくは分析物に含まれない配列）を、組換え技術を用いて挿入し、標準核酸を調製する。この場合、分析物核酸構造物は、その鎖の長さに関して標準核酸とは有意な程度に、標準分析物核酸と異なっている必要はない。分析物核酸のセグメントばかりでなく核酸のセグメントも、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載のようなポリメラーゼ連鎖反応等により、増幅手段および好ましくは前記配列の多重化手段に供することが好ましい。これを行なうためには、分析物核酸構造物および標準核酸構造物の増幅に使用可能なプライマーを用いることが好ましい。一般的に、この方法は、競合ＰＣＲ法として記載され、例えば、米国特許第５，２１３，９６１号明細書に記載されている。標準核酸を用いる前記の場合において、第１プローブ（分析物プローブ）のヌクレオチド配列は、分析物または標準核酸には存在しない分析物の部分配列の増幅産物の領域でハイブリダイズ可能な様式で選ばれるが、第２のプローブ（標準プローブ）は、鋳型としての標準核酸を用いるプライマー伸長によりプライマー伸長産物が生成した場合のみ、当該伸長産物がハイブリダイズすることができるように選択された配列を有する。当該プローブは、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ、国際公開第９２／２０７０２号パンフレット）であることが好ましい。第１のプローブが分析物特異的であり、標準分析物に有意に結合しないならば、第２のプローブは、標準分析物に特異的であるか標準分析物のみならず元の分析物にも結合できるように選択することができる。概略した第１の場合が特に好ましい。本発明の方法において、対応する数の決定対象の別々の分析物に特異的な２以上のプローブを用いることが原理的には可能である。この場合において、本発明の利点が明らかである。本発明の必須の有意な特徴は、少なくとも２つのプローブが異なる標識基を保持するという事実である。最も単純な場合において、それぞれが異なる標識基を保持する２つのプローブを用いる。これら２つのプローブの内で、１つは決定対象の分析物に特異的である。本発明のさらなる態様において、これらのプローブの１つ以上が複数の標識基を保持すること、例えば、１つのプローブが２つの標識基を有することが可能である。これは、感度の上昇に導くことができる。しかしながら、複数の分析物を決定するために、２を超える異なる標識基を保持する蓋然性のある２を超えるプローブを用いることも可能である。この場合において、各プローブは、１以上の同一の標識基を含むことが可能である。本発明においてプローブが２つの異なる標識基を保持する場合を避けるべきである。当該プローブは、当該プローブの１もしくは複数の分析物または標準分析物への十分な結合に適する量および濃度で試料に添加される。しかしながら、多くの場合、存在する分析物の量がわからないので、当該プローブは、通常、分析物の考えられうる最大量に比べて化学量論的に過剰に添加される。これは、本発明の方法の定量的評価が意図されるときに特に当てはまりうる。本発明により、増幅後に試料を分割して各アリコートにプローブを添加する必要性はない。当該プローブは、別々ではなく一緒に試料とインキュベートすることが好ましい。したがって、比較的少量の試料が要求される。本発明において、標識基とは、直接的または間接的に、プローブに結合可能な基である。さらに、標識基は、２つのタイプ、即ち、それ自体では検出のために十分大きな電磁シグナルを発生することができないような基および電磁シグナルを直接発生することができる基にさらに分割することができる。また、後者の基の標識基は、以下、検出基ともいう。それ自体では検出目的の適切な電磁シグナルを発生しない基は、好ましくは、例えば、ハプテン類、欧州特許出願ＥＰ−Ｂ −０３２４４７４号明細書に記載のジゴキシゲニンまたはビタミン類、例えば、ビオチン等のプローブと分析物との相互作用に関して前記したような生物学的相互作用を介して検出可能なすべての基である。例えば、ジゴキシゲニンは、ジゴキシゲニンに対する抗体により検出可能であり、ビオチンは、アビジン、ストレプトアビジンまたは抗ビオチン／抗体により検出可能である。間接標識の場合、本発明の方法においては、成分を認識する前記検出可能基（抗体、アビジン等）の１つと電磁シグナルを発生可能な基（検出基）からなるコンジュゲートの使用が好ましい。このコンジュゲートは、インキュベーション期間の開始時でもプローブとの試料インキュベーション混合物に添加することができるが、分析物結合プローブから分析物に結合していない分析物特異的プローブの分離なしに、または分離後に、プローブと分析物とのインキュベーションの完了後のコンジュゲートの添加が好ましい。さらに、分析物結合プローブから分析物に結合していない分析物特異的プローブを分離することならびに未結合プローブからさらなる試料成分結合プローブを分離することが、試料とプローブとのインキュベーション後に非常に薦められうることがわかった。また、同様のことが未結合コンジュゲートの分離にも当てはまる。この分離工程は、分析物の結合産物または試料中に存在するさらなる成分または標準分析物が固相（ビーズの形態の固体）の表面に存在する適当なプローブと結合し、残りの液相が当該固相から分離するときに有利に起こりうる。これは、例えば、フィルターに固相を保持し、液体が当該フィルターを通過できるようにすることにより起こりうる。磁気固相の使用は、別の可能性とある一定の回収地点で磁気固相を回収するためのその後の磁場の適用を開発する。ついで、未結合プローブを含む液体を除去することができる。また、物理学的に結合したプローブを洗浄溶液を用いて固相から除去するが、分析物または他の成分に特異的に結合したプローブは除去されない本発明の態様が好ましい。しかしながら、分析物の固相への結合は、決定対象の分析物のタイプに依存する。したがって、生物学的相互作用（しかしながら、好ましくは別のタイプの結合特異性または／および分析物もしくは標準分析物の結合特異性）は、結合の目的に使用することができる。分析物が抗原である場合、そのときはこの抗原に対する抗体の固相への結合により表面が修飾された固相への結合が起こりうる。核酸が問題の分析物である場合、そのときはさらなる試料成分または標準核酸の、分析物の一次構造に見出される配列に相補的な核酸配列を有するプローブを用いて、結合が起こりうる。この捕捉プローブに関する好ましい配列は、共有結合によりまたはビオチン／ストレプトアビジン等の生物特異的結合を介して固相に結合し、分析物の部分配列ばかりでなく標準核酸または他の分析物核酸配列にも相補的な配列でもあるような様式で選択される配列である。これは、両試料成分の捕捉のために１つのタイプの捕捉プローブのみが要求されるという程度に有利である。分析物が細胞である場合、そのときはこれらの細胞は、当該細胞の表面上に存在する抗原（Ｔ細胞に対するＣＤ３等）に対する抗体により固定することができる。選択／検出は、サブグループ（第１の標識基をもつＣＤ４を有するＴヘルパー細胞、ＣＤ８と第２の標識基を有するＴサプレッサー細胞）に対する抗体を用いて起こりうる。核酸への分析物または固相への標準核酸の結合のさらなる可能性は、核酸増幅手法中に生成したコピー中に固定基を取り込むことによるものである。これは、固定した標識プライマーまたは固定した標識モノヌクレオシド三リン酸を用いることにより起こりうる。ビオチンは、固定基として選択することができる。生じた増幅産物は、ストレプトアビジン被覆表面を用いて捕捉することができる。標識または検出基の存在に基づいて、標識または検出基の存在に与えられうる各種の標識または検出基に関して電磁シグナルが発生する。驚くべきことに、異なるプローブに関する異なる手段により励起されうる基の組合せが特に有利であるということか発見された。例えば、化学的手段（生物発光）により励起して発光しうるプローブと、電気（電気化学発光、ＥＣＬ）を用いて励起して発光しうるプローブとの組合せが有利である。選択的、即ち、励起によるシグナルの標的発生が劇的に低下するかまたは交差反応性、即ち、検出対象でない標識基の付随した励起さえも回避する。これは、方法全体に対する大きなダイナミックレンジおよび相対的に低いバックグランドノイズ（高感度）を惹起する。このタイプの発生は、シグナルの発生に関する個々の要求に依存する。標識基の第１のカテゴリーは、標識基をある種の（例えば、化学）試薬と接触させることによりシグナルか発生するという事実により特徴付けられる。励起して生物発光をしうる検出基の好ましいカテゴリーは、例えば、アロステリックに刺激可能な基である。異なるプローブの検出基は、異なる物質のクラス（例えば、低分子量有機金属複合体および蛋白質）に属することが好ましい。イオンにより活性化されうる発光蛋白質は、標識基のカテゴリー（アポー発光蛋白質：天然または組換え技術手段により製造される）に属する。アエクオリン、オベリン、ミトロコミン、タラシコリンおよびクリチンが発光蛋白質のこの群の代表例である。これらの蛋白質は、活性化されたときに光を放射するので、物質の量または存在が放射光の測定により決定されうるという特性を共有する。かかる発光蛋白質の使用は、慣用の試験およびシグナルが発生するメカニズムに関するコルミーア(Cormier，M．L.)ら、 Photochem & Photobiol．49/4，509-512（1989）またはスミス(Smith，D．F.)ら、「生物発光と化学発光」中：Current Status（スタンリーとクリッカ(P．Stan ley & L．Kricka)編）、John Wiley and Sons，Chichester，U．K．1991，529-5 32による文献に記載されている。この場合において、活性化は、標識された結合プローブへのカルシウムイオンの添加により生ずる。電光放電様プロフィールを示す適切な化学発光直接標識基は、例えば、アクリジニウムアリールエステル、アクリジニウムアシルスルホンアミドまたはＡＢＥＩ、ＡＥＥＩおよびＡＨＥＩ等のイソルミノール誘導体である。励起して電気化学発光することが可能な金属複合体は、標識基の特に好適なカテゴリーの代表例である。かかる複合体は、例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０１９９８０４号明細書、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２６５５１９号明細書、国際公開第８９／０４３０２号パンフレットおよび国際公開第９２／１４１３９号パンフレットに記載されている。リガンドとしてビピリジル部分を取り込んでいるルテニウム複合体が好ましい。特別なルテニウム複合体で標識されている核酸は、例えば、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３４０６０５号明細書に記載されている。欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０１７８４５０号明細書は、本発明の方法で非常によく使用されうるルテニウム複合体で標識されている免疫学的プローブを記載している。ルテニウム複合体に加え、電気化学発光のトリガーとなりうる他の遷移金属（オスミウム、イリジウム等）または電気化学発光の目的に適する他の複素環芳香族複合体リガンドを使用することができる。本発明の方法において、検出可能で追跡可能なシグナルを発生可能な検出基が励起される。当該シグナルは、発光シグナルであることが好ましい。通常、発光は、化学的に励起されて、準安定な分子状態が光量子の放出後により低いエネルギー状態に開放される（電磁放射）過程であると解される。本発明の状況においては、シグナルの独立した発生に導く過程は、一定の標識基が他のプローブ上に位置する他の標識基の励起の非存在下に選択的に励起される過程として定義される。電磁シグナルは、本発明の状況においては光のシグナルを意味すると見なされる。光の閃光放電が特に好ましい。種々のタイプの電磁シグナルは、例えば、標識基の異なる物質のカテゴリーに由来する様々な起源からシグナルが止まる下記で論じる。下記発光蛋白質を用いる電気化学発光および生物発光の組合わせとは、異なる手段により励起されうる２つの発光標識から構成される系の好ましい態様を意味すると解される。種々の電磁シグナルの発生は、同時にまたは連続して起こりうる。これは、シグナルが非常に異なる性質であるので同時に検出可能であるかどうかに特に依存する。しかしながら、種々の電磁シグナルが交互に発生してそれらを検出することが実行的であることが証明された。したがって、選択的に活性化されうる標識基の選択が好ましい、即ち、第１の基が化学または／およびアロステリックなトリガーにより活性化され、第２の基は、電気化学的トリガーにより活性化される。特に有利な点は、シグナルの発生に必要な反応条件が同一の溶液で再現される必要がないということである。第１標識基がイオンで活性化されうる発光蛋白質であり、第２標識基が電気化学的に励起可能な金属複合体の場合、同時にまたは連続して発生したシグナルを決定することが可能である。同時決定は、異なる放射スペクトルを有する標識基を用いて可能となる。光の検出に用いられるモジュールは、例えば、フィルター、プリズムまたは格子の適する選択によりシグナルの分光スペクトルの分解能を容易にするべきである。シグナルの連続決定が用いられる場合、発光蛋白質のシグナルの発生が必要な条件が最初に送られうるが、電気化学発光シグナルの発生に必要な条件を考案することが最初に設定されることが好ましい。この目的（標識がルテニウムトリスビピリジル複合体を用いて生ずる例では）のために、リン酸カリウム、トリプロピルアミンおよびＴｈｅｓｉｔ^TMの溶液を、固相に結合した分析物、標準分析物および決定対象であってプローブが結合する可能な他の成分と接触させる。これは、ピペッティングによる固相への当該溶液の添加によって行なうことができるが、しかしながら、当該固相を試薬溶液に添加することまたは固相溶液を流させることによっても可能である。後者の場合は、この場合洗浄も行なわれるので好ましい。２種以上のプローブの存在では、電気化学発光は、電位差の適用により発生する。放射された光は、適当な器具、例えば、光電子増倍管を用いてシグナルから測定値へ変換される。測定条件と試薬に関する以下の刊行物：ウーランド(Uland，J．K.)とポーウェル（Powell，M．J.）、J．Electrochem．Soc．137，pp．3127-3127(1990)を参照すべきである。驚くべきことに、電気シグナルの発生は、発光蛋白質活性に干渉しない。その後、発光蛋白質の存在に基づくシグナルの発生に必要な反応条件が考案される。この場合において、さらに適切な試薬を存在する溶液または適当な洗浄溶液または固相に添加することができる。活性化可能な発光蛋白質に関して、試薬溶液による電気化学発光の発生に必要な試薬溶液の置換が好ましい。また、発光蛋白質と活性化可能なイオンとの接触は、機器によって測定し、測定値に変換可能な強度の光シグナルも発生させる。また、但し、光電子増倍管が両波長に感受性であれば、ルテニウムビピリジル複合体により発生した光の検出に使用したのと同じ配置の装置を用いて、アエクオリンにより発生したシグナルを決定することも可能である。この場合、スミス(Smith，D．F.)ら、「生物発光と化学発光」：Current Status（スタンリーとクリッカ(P．Stanley & L．Kricka)編）、John Wiley，Chichester，U．K．529-532頁(1991)による文献は、アエクオリンを用いる光シグナルの発生に要求される条件に参照される。閃光放射シグナルが好ましく、かつ、有利である。これは、シグナルに導く励起および当該シグナルの測定が非常に迅速に起こることを意味する。両方の検出反応が起こるのに要する総時間は、両方の１回の決定（例えば、電気化学発光：４秒、アエクオリンを用いるその後の生物発光を伴う電気化学発光：５秒）に要するよりも有意に（＞２．５ｘ）長くはない。これは、二重標識検出の原理が測定ウインドーを広げた場合に汚されないので、（特にアナライザーにおいて）最大の処理量を促進する。記載された組合せに関しては、測定ウインドーの範囲内で、１つのプローブに与えられたシグナル反応と時間的な分割との両者間の干渉がないので、最後に概算値を与える数学的補正アルゴリズムの適用の必要がなく、両シグナルの純粋で各々独立した直接的な評価が可能である。両標識基のそれぞれの実行（例えば、分析感度、連続かつ日々の精度、測定ダイナミックレンジおよび測定リニアレンジ等の基準に関して）は、記載された組合せにおいて有利なままで変更しない。異なる検出基により生成したシグナルの決定は、例えば、同一の測定セル等の同一の測定装置を用いて起こることが好ましい。測定セルは、当該測定セルが両者により放射される波長を検出するために変える必要がないように選ばれることが好ましい。当該測定セルは、検出基に対する電気化学的トリガーを適応させるように構成されることが好ましい。引き続いて起こる検出工程は、検出基の別の物質カテゴリーに基づいており、励起過程が発光を生ずるＥＣＬ測定セルの電気装置を用いるのではなく、むしろ単に検出する。異なる検出基を検出するために実行しなければならない一連の工程は、異なる反応特性を示すか異なるスペクトル習性を有する基の必要性を有する。したがって、ルテニウム複合体は、アエクオリンのような青緑色のレンジで光を放射する蛍光体により置換することができる。シグナルの評価またはこれらのシグナルに対する測定値は、決定方法から要求される結果の性質に依存する。いかなる場合においても、プローブまたは分析物が存在しなかった校正方法から得られた測定値とは異なる測定値の存在は、分析物の存在の指標となる。また、同様のことがすべての他の成分または標準分析物の測定値にも当てはまる。これは、一次分析物または他の分析物の存在の定性的指標を得るために使用することができる。標準分析物の決定の結果は、当該系の校正のためおよび陽性対照として定性的決定に使用することができる。本発明の方法の好ましい態様は、以下の工程を含む： − 分析物および可能なさらなる分析物または標準分析物の固相（例えば、磁気粒子）への結合工程、 − プローブの分析物または追加の分析物または標準分析物への結合工程、 − 結合した第１プローブの（第２プローブの存在中の、しかしながら、第２プローブとは独立した）決定工程、 − 第２プローブの（第１プローブの存在中、かつ、第１プローブとは独立して）結合の決定工程、 − 第１プローブにより発生したシグナルの評価による少なくとも１つの分析物の存在または濃度の決定工程。この点に関して、さらなるプローブは他の標識基で標識され、独立した励起手段を利用する。そこに結合した分析物、追加の分析物または標準分析物およびブローブは、決定の実行、次いで、別の試料由来の分析物の決定等のさらなる決定に利用された後、励起または測定の部位から除去されることが好ましい。しかしながら、本発明の方法は、分析物の定量的決定に特に適する。この関係において定量的決定とは、一次試料の生成に使用される一次試料中の分析物の量の決定として定義される。定量的決定において、決定対象の分析物に特異的な少なくとも１つのプローブの使用が好ましい。複数の分析物が決定対象であるならば、さらなるプローブ／標識基が必要である。さらに、標準分析物に特異的なプローブを使用する。標準分析物の量は一定で既知であるため、標準分析物から得られた測定値は、分析物に関する測定値を校正するために使用することができる。当該系の校正は、例えば、以下の様式で行なうことができる：Ｉ．検量線の作成：異なるが既知の濃度の分析物核酸の、例えば５つの異なる溶液を、同一の既知量の標準核酸（例えば、１０００コピー）で添加して濃度を高める。これらの溶液のそれぞれに、少なくとも２つのプローブ（例えば、分析物プローブのルテニウム標識、標準プローブのアエクオリン標識）を有する溶液を添加する。ハイブリダイゼーション後、分析物および標準の既知の濃度の測定シグナルが得られる。これらの値を用いて検量線がプロットされ、標準と比較した分析物の決定からのシグナルの関係が、用いた既知の分析物濃度に依存してプロットされる。 II．試料の測定と評価測定に先立ち、検量線の作成に使用した標準核酸の同じ濃度（即ち、１０００コピー）を、未知の濃度の分析物を含有する試料に添加する。分析物由来のシグナルと標準由来のシグナルとの関係を計算し、分析物濃度を検量線から読み取る。一緒に生成した（即ち、反応混合物由来の）２以上のシグナル間の関係を比較することにより、シグナル発生における変動を補正する単純な可能性が提供される。したがって、分析物または標準に対する異なるプローブの増幅反応での可能な変動を補正することができる。かかる変動は、例えば、試料から試料または同一の試料に対するサイクルからサイクル等の変化しうる効率因子の原因となり、内部共増幅標準の利用による試料標品の質（例えば、精製の程度、インヒビターの分離）における変動に起因し、放射計による評価は、各反応バッチにおいてコンピュータの使用により補正される。個々のアナライザーとアナライザー当たりの時間との間のシグナルの関係は相対的に一定のままであるならば、このシグナルの関係は、装置の製造業者によって前もって決定することが可能であり、評価目的の試薬は、ファクターの補正または関数の補正を用いてソフトウエアルーチンで実行することができる。その時、顧客は、分析物核酸の異なる濃度由来の値を用いて検量線を作製するだけでよい。 III.検量線の作成の前に、例えば、ｌｏｇ最初のコピー数Ｎ₀（Ｘ）に対するｌｏｇシグナル（Ｙ）のプロットの並行直線数列から認識可能な、試料ＤＡＮおよび標準ＤＮＡ（内部標準）の増幅効率（収量）の比較において実験上のチェックがなされる。図１において、本発明の方法が行なわれうる装置の構成図が示される。本発明の方法が行なわれうるように容易に適応できる適当な装置は、ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー（Elecsys2010または1010）から入手することができる。好ましくは以下の工程を行なう：１．試料中に存在する分析物核酸の（ＰＣＲを用いる）増幅工程および既知量の標準核酸の共増幅工程。２．ＮａＯＨ溶液の添加による変性工程。３．サンプルローター５中の試料の保存工程。４．インキュベーター中の容器へのアリコートの移動工程。５．分析物特異的および標準分析物特異的プローブの添加工程。６．インキュベーター４でのストレプトアビジン被覆磁気粒子とのインキュベーション工程。７．ピペッティングニードル６を用いる試料溶液のインキュベーター４から測定セル１３への取り込み工程。８．液体流系を経由するアリコートの輸送のための容器１からのコンディショニング溶液の取り込み工程。結合した分析物、標準分析物およびプローブを有する磁気粒子は、磁石により作動電極で保持される。９．作動電極上のビーズを洗浄するための容器１からのコンディショニング溶液の取り込み工程。１０．作動電極と双電極１０および１１それぞれ（参照電極９を介して制御される）との間の電位差の適用は、閃光の放射を生ずる。放射光の測定は、光電子増倍管７により行なわれる。１１．カルシウム含有トリガー溶液の容器３からの測定セル１３中への取り込みと生じた発光の同時測定工程。当該粒子は、磁石８により測定セル中に保持される。１２．磁石８の除去、よって、ポンプで循環されている洗浄溶液を用いる容器２からの結合磁気粒子の移動工程。１３．シグナル強度の評価。１４．当該装置は、測定用の新しい試料の取り込みのために準備される（工程１）。本発明の主題は、多くの方法に有利に使用することができることである。まず、当該方法は、分析物の定量的決定の実行に有用である。必要とされる試料液体の量は低減され、５０％の削減でさえも可能である。好ましい検出標識を用いた場合、検出と評価にはただ１つの装置が必要とされる。さらに、免疫学的試験を核酸に基づく試験と組合せることも可能である。アナライザーでの試料の処理量は、すべての場合において有意に改良される。独立した励起技術を用いて、試料を時間的に分割することが可能である。これは、より大きなダイナミックレンジと感度の増大を惹起する。図２では、２つの検出基（ルテニウム複合体とアエクオリン）が連続して決定される場合のシグナル発生の例が示される。シグナル強度は、同じオーダーの倍率であることが明らかである、即ち、驚くべきことに、電気化学発光の決定を実際にしようとする装置を用いる場合は、アエクオリン標識を用いて十分なシグナル収率を得ることができる。図２において、曲線１〜７は以下の通りである：時間（秒）に対するシグナル強度をプロットする。図３は、驚くべきことに、実際上、第１のＥＣＬ測定の実行によりシグナルの損失を被らないことを示す。図３では、シグナル強度の推移が示される（一定の濃度関係）が、測定時間は秒で示され、第１の場合、ＭＤＰアエクオリン標識（検出、ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー、ドイツ、カタログ番号１４４７７７７で使用可能）および最終的にはオリゴヌクレオチド１（配列番号１）由来のＥＣＬシグナルが決定され（曲線１）、第２の場合、最初のすべてのＥＣＬシグナルおよび最後にアエクオリンシグナルが測定される（曲線２）。ＥＣＬ決定前のアエクオリンシグナルの強度は、ＥＣＬ測定後のシグナルの強度とは無視できる程度しか違わないことが明らかである。これは、驚くべきことに、生物発光標識が最初に起こる電気化学発光過程によりそれらの機能を乱されないことを意味する。ＥＣＬ決定に関するトリガーの閾値ポテンシャルは、水の解離ポテンシャルを超えている、即ち、電気化学発光が（アエクオリンが局在する）アノードで進行している間、水の酸化が起こり、したがって、大量の酸素が発生する。よって、蛋白質の環境は、実質的に乱される。驚くべきことに、蛋白質により生成されるシグナルの倍率は影響されない。しかしながら、以前の決定から繰延べられた反応溶液の残りが、干渉するほどの量で測定セル内に残らないことを保証しなければならない。これは、特に、異なる両反応溶液が出会った場合に殆ど溶解しない沈澱物（例えば、アエクオリントリガー過程由来のカルシウムイオンとＥＣＬトリガー過程由来のリン酸イオン）を生成する物質（イオン等）に当てはまる。特に、多数の決定がなされなければならず、それにより後に行なわれる決定がちょうど第１の場合と同じくらい確実な様式で行なわれなければならないアナライザーに関する連続決定反応において、完全に別々で独立して励起可能な標識の使用は、具体的には当業者にとって自明でない。これは、特に、種々の決定に関して使用されうるフロースルーセルを有するアナライザーにとって真実である。また、本発明の主題は、その内の少なくとも１つは決定対象の分析物に特異的であり、その際に少なくとも２つのプローブが異なる電磁シグナルを発生可能な異なる標識基をもつ２以上のプローブを１もしくは別々の容器に含有する分析物の決定用試薬キットである。他のプローブの特異性は、前記本発明の方法から抽出することができる。さらに、当該試薬キットは、標準分析物を有する容器を含有し、それにより標準分析物の濃度が既知または／および前もって定められている試薬キットが好ましい。さらに、試薬キットは、標識基の決定に必要な他の試薬を含有することができる。また、当該試薬キットは、分析物を含有し、決定を続行するのに適する溶液を生成するために試料を前処理するのに適した試薬をも含有してもよい。これらは、別々の容器に含有されていることが好ましい。好適な試薬としては、例えば、競合ＰＣＲを行なうためのプライマー、酵素−およびモノヌクレオシド三リン酸である。当該試薬キットの他の可能な成分は、分析物が結合した磁気粒子の懸濁物である。本発明のさらなる主題は、試料中の分析物の定量検出のために異なる電磁シグナルを発生することが可能な２つのプローブの使用である。以下の実施例により本発明の目的を説明する。実施例１第２の検出可能基として作用するルテニウム複合体の存在下でのストレプトアビジン被覆磁気粒子上の異なる検出基の連続決定ビオチニル化アエクオリン（１ｐＭ〜１０ｎｍの濃度範囲で）、および５’末端をＢｉｏ−ＬｉｎｋＩ（アプライドバイオシステムズ社、ビオチンアミダイト、カタログ番号４０１３９５）でビオチニル化し、３’末端でＡＭ III（オリゴヌクレオチド合成中にＣＰＧ（コントロールドポアグラス）への挿入と保護基Ｆｍｏｃの除去、図４）を介してＢＰＲｕ（Clin．Chem．37/9，1534-153 9(1991)）を用いた標識オリゴヌクレオチドＩ（配列番号１）を含む異なる検出可能基の決定のために、２００μｌの緩衝溶液を調製した。３６μｇのストレプトアビジンビーズを、前記緩衝液５０μ１中の試料溶液（ベーリンガーマンハイ号１７３１４５９）に添加し、３７℃で５分間インキュベートした。その後、１２０μｌのこの反応溶液をＥｌｅｃｓｙｓ２０１０−またはＥｌｅｃｓｙｓ１０１０−アナライザー測定セル（ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー）に入れた。次いで、３００ｍＭリン酸カリウム、１８０ｍＭトリプロピルア溶液１１００μｌをポンプで通過させる。次いで、電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを発生した（電圧：１．２５Ｖ、時間：０．８秒）。該ＥＣＬシグナルは記録され、図２の左側に見られうる。ルテニウム標識の一定の濃度は、ほとんど同一のシグナルがすべてのＥＣＬ測定に対して得られることを保証する。アエクオリンシグナルの決定のために、１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４および１００ｍＭ塩化カルシウムからなるトリガー溶液を測定セル内に押し込んだ。測定したシグナルを、図２に示す曲線の右側の枝分かれに示す。アエクオリン決定に由来するシグナルは、明らかにアエクオリン標識複合体の濃度に依存する。実施例２２つの異なるクラミジア標的配列の決定以下のことは、既知の濃度の内部標準核酸が未知の濃度の分析物核酸の存在下に決定されなければならない内部標準を用いるＤｕｅｌＬａｂｅｌＡｓｓａｙを伴う実際の状況を例示する。分析物核酸の可能な濃度範囲は、いくつかの桁の大きさに広がる。一定の質の全濃度範囲に渡る定量のためには、標準シグナルを一定、かつ、試料の濃度から独立させなければならない。分析物シグナルは、試料濃度を変化させるに従って直線、かつ、同様に存在する標準核酸の濃度から独立させなければならない。本発明の実施例において、両シグナルの独立性は、並行して行なわれる（標準または分析物）２つの異なる捕捉プローブならびに１つがＲｕｂｐｙおよび他のものがアエクオリンで標識され、それぞれがハイブリダイゼーション（標準−または分析物特異的）可能な２つの指標プローブ間の結合反応の利用により達成される。実際の試験状況は、１つの捕捉プローブの濃度を一定に保ち（これは標準をシミュレーションする）、一方、（標準をシミュレーションする）他の捕捉プローブの濃度は、４つの桁の大きさに渡って変化することにより模擬実験を行なう。捕捉プローブは、ビオチン化４０マー（２０マー−（または１９マー−）（非クラミジア特異的）スペーサー配列＋２０−マー−（または２１−マー−）ハイブリダイゼーション配列）である。両ハイブリダイゼーション配列は、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)ゲノムに由来する。第１の例では、ハイブリダイゼーションゾーンは、以下の配列５’−ＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号２）を有する。関連する指標プローブ（５’ＣＡＴＡＧＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３））は、アエクオリン標識（塩基性の活性化[Ｎ−トリフルオロアセトアミド]−アミノアルキル−ホスホロアミダイトを用いる官能基付与後のＭＨ：ＳＨ結合化学）される。他の捕捉プローブのハイブリダイゼーション配列は、５’−ＧＴＣＴＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧ−３’（配列番号４）である。指標プローブ（５’−ＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＣＴＡＴＧ−３ ’（配列番号５））は、ＮＨＳを用いてＲｕ（ｂｉｐｙ）₃に結合する。２つのクラミジア標的（捕捉プローブ）のうちの１つの濃度は、０．１ｎＭで一定に保たれるが、他方の濃度は、以下１^*１０^-9、１^*１０^-10、１^*１０^-11、１^*１０^-12 Ｍのように連続希釈される。両指標プローブの濃度は、（１０ｎＭ）で一定に保たれる。３７℃で形成されたハイブリッドをストレプトアビジ固定し、次いで、実施例１に記載のようにＤｕａｌＬａｂｅｌＣｙｃｌｅを用いて決定される。図５および６は、各独立に選ばれた標準の濃度をいかに一定に保ち、各分析物核酸に対して選ばれた各捕捉プローブが分析物濃度と標準により発生したシグナルから独立する４つの桁の大きさのシグナルとの間の優れた直線関係をいかに示すかを示す。実施例３競合アッセイこの実験において、内部標準の共増幅を用いるモデルＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイとして二重標識検出を使用し、それにより標識が増幅対象のポリヌクレオチドに無条件に与えられる競合試験を行なう。指標プローブは、分析物ＤＮＡを用いるプライマーと競合して結合するＰＣＲ産物の可変量を表す（各最初のコピー数の関数としてのハイブリダイゼーション率）。ａ．実験の設計：ビオチン化３０マー捕捉プローブ（１０ｄＴ−スペーサー配列＋２０−マーハイブリダイゼーションゾーン：５’−ＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＣＴＡＴＧ−３’（配列番号６））を、１０００、１００、１０ｐｍｏｌ／ｌ（さらに、０ｐｍｏｌ／ｌ＝緩衝液ブランク）と下げながら連続希釈し、それぞれをストレプトアビジン（ＳＡ）−被覆ＥＣＬ−ビーズ（７２０μｇ／ｍｌ）に固定する。アエクオリンで標識したＭＨ：ＳＨ結合化学を用いる一方を塩基性（ＮＨ₃）活性化可能[Ｎ−トリフルオロアセトアミド]−アミノアルキル−ホスホロアミダイトで、他方をＲｕ²⁺（ｂｉｐｙ）₃を用いてＮＨＳ化学を介して官能基に結合している２０マー指標プローブに相補的な塩基配列（５’−ＣＡＴＡＧＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＣＴＧ−３’（配列番号７））を捕捉プローブと反応させ、それによりアエクオリンおよびＥＣＬ標識プローブが通常の捕捉プローブ結合部位と反応する。かかる１つの場合において、ＥＣＬ標識指標プローブは、０．４ｎｍｏｌ／ｌで一定に保たれ、反対に、アエクオリン標識プローブは、０．１〜１０ｎｍｏｌ／ｌの範囲で変化する。別の場合において、アエクオリン−プローブ濃度は、１ｎｍｏｌ／ｌで一定に保たれるが、ＥＣＬプローブ濃度は、０．４〜４０ｎｍｏｌ／ｌの範囲で変化する。直接比較を可能にするために、この実験で得られた初期のデータを標準化した：４０ｎｍｏｌ／ｌ（＝大過剰＝１００％）に対するＥＣＬ−シグナル、１０ｎｍｏｌ／ｌ（＝１００％）に対するアエクオリン−シグナル。異なる濃度の捕捉プローブと指標プローブの一定の混合物との反応後に生じる相対的変化を決定し、次いで、可変指標プローブ濃度に対してグラフにプロットした。ｂ．結果：決定の結果を図７および８に示す。同一のハイブリダイゼーション配列に関して、曲線の接点は、厳密には、一定に保たれたプローブの濃度が濃度が（約５０％で）変化しなかったプローブの濃度に相当する点であることが予想される。アエクオリン標識プローブの濃度を１ｎｍｏｌ／ｌに設定し、Ｒｕ²⁺（ｂｉｐｙ）₃ −標識プローブの濃度を変化させた場合、そのときは、接点は、約０．８ｎｍｏｌ／ｌで曲線に対して得られる、即ち、０．８ｎｍｏｌ／ｌのＲｕ²⁺（ｂｉｐｙ）₃−標識プローブは、１．０ｎｍｏｌ／ｌのアエクオリン標識プローブと等価であり、これは、分子量効果を反映している（アエクオリン：２２０００Ｄａ、Ｒｕ²⁺（ｂｉｐｙ）₃＜１０００Ｄａ）。逆に、アエクオリン標識プローブを変化させた場合、約２ｎｍｏｌ／ｌの接点が得られる、即ち、２ｎｍｏｌ／ｌは、０．４ｎｍｏｌ／ｌのＲｕ²⁺（ｂｉｐｙ）₃標識プローブと等価である。平均値データから外挿されたこれらのデータは、両指標プローブとのハイブリダイゼーション率を示し、有意な分子量の相違にもかかわらず非常に類似し、相違は、理論的に予想された値とよく一致し、それにより、内部標準を用いる共増幅を基礎にした競合ｑＰＣＲに関する本発明に従って、二重標識検出の原理的適合性が強調される。これは、他のプローブが最大過剰で存在する場合の標識プローブの残存活性によりさらに確認される。これは、アエクオリン標識プローブの濃度を１ｎｍｏｌ／ｌで一定に保った場合４％に、Ｒｕ²⁺（ｂｉｐｙ）₃標識プローブの濃度を０．４ｎｍｏｌ／ｌで一定に保った場合１４％になる。これは、第１の場合４０：１および後者の場合の２５：１の他のそれぞれのプローブの相対的過剰を非常によく反映しており、分子量効果は、予想された傾向（即ち、第１の場合Ｒｕ²⁺（ｂｉｐｙ）₃標識プローブの動力学的有利性が、アエクオリン標識プローブを介してこれらのプローブの過剰濃度の効果を増幅させ、後者の場合アエクオリン標識プローブの過剰濃度の効果を低下させる）の方を選んで量を増加させる。実施例４核酸の定量的決定試料の調製とＰＣＲ増幅必要ならば、未処理の試料を核酸が接近しやすい形で存在しているような様式（例えば、細胞の溶解等）で処理する。また、必要ならば、核酸を欧州特許出願ＥＰ−Ｂ−０２０１１８４号明細書（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅することもできる。欧州特許出願ＥＰ０４２０２６０号明細書により、標識プライマーを用いてビオチンを取り込ませる。変性１０μｌのこの反応混合液を４０μｌの変性溶液（組成、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム溶液、０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液）により変性させる。ハイブリダイゼーション最後に、一方がルテニウム標識され（好ましくは分析物特異的プローブ）、他方がアエクオリン標識されている（好ましくは標準特異的プローブ）２つの型のプローブ２を添加する。当該プローブを、リン酸緩衝液、ｐＨ６．５、塩化ナトリウムおよびウシアルブミンからなるハイブリダイゼーション溶液中で溶解させる。前もって生成した反応混合液２００μｌを、ハイブリダイゼーション溶液に添加する。当該反応混合液を３７℃で２０分間インキュベートする。磁気粒子への結合イムノアッセイ由来、ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー、カタログ番号１７３１４５９）（７２０μｇ／ｍｌ）を該反応混合液に添加する。該反応混合液を３７℃で２０分間インキュベートする。測定得られた１５０μｌの反応溶液を図１に示す装置の測定セル内に入れる。まず第１に、電気化学発光シグナルを測定し、次いで、アエクオリンシグナルを実施例１に記載のように測定する。符号の説明（１）測定セル用コンディショニング溶液（２）測定セル用洗浄溶液（３）塩化カルシウム含有トリガー溶液（４）インキュベーター（５）第１試料ローター（６）可動式ピペッター（７）光電子増倍管（８）可動式磁石（９）参照電極（１０）作動電極（１１）対向電極（１２）ポンプ（１３）測定セル（１４）ピストンポンプ用スィッチユニット

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年７月１３日（１９９８．７．１３）【補正内容】請求の範囲１．下記工程： − 少なくとも１つは決定対象の分析物に特異的である、少なくとも２つのプローブでの試料のインキュベーション工程、その際、該少なくとも２つのプローブが異なる標識基を保持する、 − １つのシグナルが電気的に発生し、他のシグナルが化学的に発生することを特徴とする、それぞれ異なる標識基に対する電磁シグナルの独立した発生工程および − 分析物の存在または量の指標としての発生したシグナルの評価工程、による、試料中の分析物の決定方法。２．第２の可能なさらなるプローブが試料に含有される第２のまたは可能な他の成分に特異的であることを特徴とする、請求項１記載の方法。３．試料中の第２の成分が標準分析物であることを特徴とする、請求項２記載の方法。４．シグナルの発生前に、分析物に結合していない分析物特異的プローブが分析物に結合したプローブから分離されることを特徴とする、請求項１または３記載の方法。５．異なる標識基がそれ自体では検出するに十分大きな電磁シグナルを発生できないものの群より選ばれたものであり、該標識基は、それぞれ、化学的励起過程を介する電磁シグナルまたは電気的励起過程を介するシグナルの発生可能な検出基に該標識基を変換する試薬とのインキュベーション後に反応するように誘導されることを特徴とする、請求項１または３記載の方法。６．異なる標識基がハプテン類および／またはビタミン類からなる群より選ばれたものであることを特徴とする、請求項５記載の方法。７．該標識基が電磁シグナルを発生することが可能な基であることを特徴とする、請求項１または３記載の方法。８．標識基が発光可能な物質の異なる物質クラスの代表例であることを特徴とする、請求項１記載の方法。９．検出可能基の１つがイオンにより活性化されうる発光蛋白質を含有し、１つの検出可能基が励起されて電気化学発光することができる金属複合体を含有することを特徴とする、請求項８記載の方法。１０．異なる標識基に由来するシグナルが別々の時間に発生することを特徴とする、請求項１、３、５、６または７記載の方法。１１．第１のシグナルが１以上の発光蛋白質の存在下で発生する電気化学発光シグナルであることを特徴とする、請求項１記載の方法。１２．１もしくは別々の容器に、少なくとも１つは分析物の検出に特異的であり、その際、少なくとも２つのプローブが異なる発光標識基を保持する２以上のプローブを含有してなる分析物の決定用試薬キット。１３．標準分析物を有する容器を含有してなる請求項１２記載のキット。１４．少なくとも１つのシグナルが化学的に発生し他のシグナルが電気的に発生する、異なる発光シグナルを発生することが可能な、試料中の分析物の定量的検出のための２つのプローブの使用。１５．下記工程：ａ）試料中の分析物核酸の少なくとも一部の配列および一定量の標準核酸の一部の配列の増幅工程、ｂ）それぞれが電気的および化学的に励起可能な標識基を保持する分析物特異的プローブおよび標準核酸特異的プローブを、増幅された核酸に添加する工程、ｃ）前記ｂ）由来の混合物を、測定セル中に核酸およびプローブが残っていることの保証された測定セルから除去する工程、ｄ）前記ｂ）の混合物中の核酸の測定セルへの移動工程、ｅ）シグナルが生成するような第１標識基の励起工程、ｆ）励起による前記ｄ）で発生したシグナルの測定工程、ｇ）第２標識基を励起してシグナルを発生させる工程、ｈ）前記ｇ）で励起により発生したシグナルの測定工程、ｉ）分析物核酸の検出のための測定シグナルの比較工程、を含む、試料中の分析物核酸の検出方法。１６．下記工程： − 少なくとも１つは決定対象の分析物に特異的である、少なくとも２つのプローブでの試料のインキュベーション工程、その際、かかるプローブは異なる標識基を保持する、 − 一方が電気的に発生したシグナルであり、他方が化学的に発生したシグナルであることを特徴とする、各異なる標識基の電磁シグナルの独立した発生工程および − 分析物の存在または量の指標としての発生したシグナルの評価工程、による、試料中の少なくとも２つの分析物の決定方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ツィーグラー，ギュンタードイツ連邦共和国ポリンクデー― 82398 リンデンシュトラーセ９ (72)発明者ヴァインデル，クルトドイツ連邦共和国ヴィーレンバッハデー―82407 ヴェッソブルンネルヴェーク４

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程： − 少なくとも１つは決定対象の分析物に特異的である、少なくとも２つのプローブでの試料のインキュベーション工程、その際、該少なくとも２つのプローブが異なる標識基を保持する、 − それぞれ異なる標識基による電磁シグナルの独立した発生工程および − 分析物の存在または量の指標としての発生したシグナルの評価工程、による、試料中の分析物の決定方法。２．第２の可能なさらなるプローブが試料に含有される第２のまたは可能な他の成分に特異的であることを特徴とする、請求項１記載の方法。３．試料中の第２の成分が標準分析物であることを特徴とする、請求項２記載の方法。４．シグナルの発生前に、分析物に結合していない分析物特異的プローブが分析物に結合したプローブから分離されることを特徴とする、請求項１または３記載の方法。５．異なる標識基がそれ自体では検出するに十分大きな電磁シグナルを発生できないものの群より選ばれたものであり、該標識基は、電磁シグナルの発生可能な検出基に該標識基を変換する試薬とのインキュベーション後に反応するように誘導されることを特徴とする、請求項１または３記載の方法。６．異なる標識基がハプテン類および／またはビタミン類からなる群より選ばれたものであることを特徴とする、請求項５記載の方法。７．該標識基が電磁シグナルを発生することが可能な基であることを特徴とする、請求項１または３記載の方法。８．電磁シグナルが異なる励起手段により発生することを特徴とする、請求項１または３記載の方法。９．電気および他の化学シグナルが発生することを特徴とする、請求項８記載の方法。１０．該標識基が発光可能な化学品の異なる物質のクラスに属することを特徴とする、請求項１記載の方法。１１．検出可能基の１つがイオンにより活性化されうる発光蛋白質を含有し、１つの検出可能基が励起されて電気化学発光することができる金属複合体を含有することを特徴とする、請求項１０記載の方法。１２．異なる標識基に対するシグナルが連続して発生することを特徴とする、請求項１、３、５、６または７記載の方法。１３．第１のシグナルが電気化学発光シグナルであり、発光蛋白質の存在下で発生することを特徴とする、請求項１記載の方法。１４．１もしくは別々の容器に、少なくとも１つは分析物の検出に特異的であり、その際、少なくとも２つのプローブが異なる発光標識基を保持する２以上のプローブを含有してなる分析物の決定用試薬キット。１５．標準分析物を有する容器を含有してなる請求項１２記載のキット。１６．試料中の分析物の定量的検出のために異なる発光シグナルを発生することが可能な２つのプローブの使用。１７．下記工程：ａ）試料中の分析物核酸の少なくとも一部の配列および一定量の標準核酸の一部の配列の増幅工程、ｂ）増幅された核酸を含有する試料中のものへの、異なる標識基を保持する分析物特異的プローブおよび標準核酸特異的プローブの添加工程、ｃ）前記ｂ）由来の混合物を、測定セル中に核酸およびプローブが残っていることの保証された測定セルから除去する工程、ｄ）前記ｂ）の混合物中の核酸の測定セルへの移動工程、ｅ）シグナルが生成するような第１標識基の励起工程、ｆ）励起による前記ｄ）で発生したシグナルの測定工程、ｇ）第２標識基を励起してシグナルを発生させる工程、ｈ）前記ｇ）で励起により発生したシグナルの測定工程、ｉ）分析物核酸の検出のための測定シグナルの比較工程、を含む、試料中の分析物核酸の検出方法。１８．下記工程： − 少なくとも１つは決定対象の分析物に特異的である、少なくとも２つのプローブでの試料のインキュベーション工程、その際、かかるプローブは異なる標識基を保持する、 − 各標識基の検出のための電磁シグナルの独立した発生工程および − 分析物の存在または量の指標としての発生したシグナルの評価工程、による、試料中の少なくとも２つの分析物の決定方法。