JP2000514403A

JP2000514403A - 免疫抑制剤としてのアスピロクロリンもしくはその誘導体の使用

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Publication number: JP2000514403A
Application number: JP09539473A
Authority: JP
Inventors: イスラム，カリド
Original assignee: グルポ・レペチツト・エス・ピー・エイ
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-04-23
Publication date: 2000-10-31
Anticipated expiration: 2017-04-23
Also published as: JP4287908B2; CA2253635C; IL126548A0; PT914129E; AU705290B2; EP0914129B1; EP0914129A1; AU2768497A; DE69708645D1; KR100439928B1; CA2253635A1; ATE209493T1; US6133254A; IL126548A; DK0914129T3; DE69708645T2; KR20000010724A; WO1997041862A1; ES2163763T3

Abstract

(57)【要約】免疫抑制薬を製造するための式（Ｉ）［式中、Ｒは、水素または塩素を表す］の化合物の使用。

Description

【発明の詳細な説明】免疫抑制剤としてのアスピロクロリンもしくはその誘導体の使用本発明は、式Ｉ［式中、Ｒは、水素もしくは塩素を表す］の化合物の免疫抑制剤としての新規な治療上の使用に関する。既に知られているように、免疫は、体内に存在する外来抗原物質の認識と処理に関わっている。典型的には、抗原は、粒状物（すなわち、細胞、細菌等）か、または大きなタンパク質もしくは多糖分子の形で存在し、免疫系によって「非自己」であるとして、すなわち、動物の自己成分とは明らかに異なるか、自己成分にとって外来であるとして認識される。潜在的な抗原は、種々の物質、しばしばタンパク質であり、ほとんどの場合には、それらは細胞の外面に位置している。例えば、潜在的な抗原は、花粉粒、組織移植片、動物の寄生虫、ウイルスおよび細菌に見い出すことができる。一旦、抗原物質が、免疫系によって「非自己」として認識されると、自然（非特異的）免疫応答および／または適応的な免疫応答が、特異的な免疫細胞、抗体および補体系の作用によって開始され、そして維持される。ある種の状態または疾病状態下では、動物の免疫系は、その自己成分を「非自己」として認識し、そして「自己」物質に対する免疫応答を開始する。免疫応答は、自然または適応機構により免疫系によって実施されるが、それぞれ、細胞（仲介）性および体液性因子の両方からなる。免疫応答に関する自然機構は、ある種の細菌、ウイルス、組織損傷およびその他の抗原との反応において、補体系および骨髄細胞、例えばマクロファージ、肥満細胞および多形核白血球（ＰＭＮ）を伴う本質的に非特異的な免疫反応に関わるメカニズムを指す。これらの自然機構は、自然免疫として言及されるものを提供する。免疫応答に関する適応機構は、リンパ球（ＴおよびＢ細胞）および「非自己」として認識される数千の異物に選択的に応答できる抗体によって仲介されるメカニズムを指す。これらの適応機構は、適応免疫として言及されるものを提供し、そして動物の自己環境への適応において、特異記憶と永久的に改変される応答パターンを生じさせる。適応免疫は、リンパ球と抗体によって別々に提供されるか、またはより普通には、リンパ球および抗体と、免疫の自然機構の補体系および骨髄細胞との相互作用によって提供される。抗体は、適応的免疫応答の体液性因子を提供し、そしてＴ細胞は、適応的免疫応答の細胞性因子を提供する。より具体的には、免疫応答の適応機構では、Ｂ−リンパ球（またはＢ細胞）によって分泌される抗体の特異抗原に対する作用、ならびに特異抗原、Ｂ細胞、他のＴ細胞またはマクロファージに対する種々のＴ−リンパ球（またはＴ細胞）の作用を伴う。細胞性免疫応答は、骨髄細胞とリンパ球細胞によって分泌される種々の調節メッセンジャー化合物を通して、Ｔ細胞によってコントロールされ、モニターされる。これらの調節メッセンジャー化合物の分泌を通して、Ｔ細胞は、他の免疫細胞、例えばＢ細胞、マクロファージ、ＰＭＮおよび他のＴ細胞の増殖および活性化を制御できる。例えば、外来の抗原に結合することにより、マクロファージまたは他の抗原提示細胞は、ヘルパーＴ細胞を活性化するインターロイキン−１（ＩＬ−１）を分泌できる。Ｔ細胞は、順に、インターロイキン −２（ＩＬ−２）とγ−インターフェロンを含むある種のリンホカインを分泌し、それらの各々が、細胞性免疫応答において種々の調節効果を発揮する。「自己」と「非自己」抗原を識別すべき免疫系、特に細胞性免疫系の能力は、侵入する微生物に対する特異的防御としての免疫系の機能にとって非常に重要である。「非自己」抗原は、動物自身の成分とは明らかに異なる（または外来である）、体内の物質についての抗原であり、「自己」抗原は、動物自身の成分とは明らかに区別できない（または外来ではない）抗原である。免疫応答は、病気を引き起しうる外来物質に対する主要な防御であるけれども、有益な外来物質と有害な外来物質および破壊物両方を区別することはできない。同種移植物によるか、または「移植片対宿主」疾患におけるような、ある状況が存在するが、その場合には、有益な外来組織または臓器の拒絶を防ぐために、免疫応答を抑制することが極めて有用であろう。同種組織および臓器は、同一種の遺伝的に異なる一員からの組織および臓器である。「移植片対宿主」疾患は、例えば骨髄移植における移植された組織が、レシピエントの自己組織に対して免疫応答を惹起するドナーの同種Ｔ細胞を含む場合に起きる。体液性と細胞性免疫応答の両方が、同種組織および臓器の拒絶に関わるけれども、それに伴う一次機構は、細胞性免疫応答である。免疫応答の抑制、特に細胞性免疫応答の抑制は、かくして、そのような同種組織および臓器の拒絶を防ぐのに有用であろう。例えば、シクロスポリンＡは、現在、同種移植片を受ける患者の治療において、また「移植片対宿主」疾患において免疫抑制剤として使用されている。アレルギー反応の場合のように、個体の免疫学的応答が、侵入する微生物もしくは外来物質よりも大きい障害または不快（ｄｉｓｃｏｍｆｏｒｔ）を惹起する場合がある。これらの場合には、免疫応答の抑制が望まれるであろう。場合によっては、免疫学的機構は、個体自身の体のある部分に対して感受性になって、その部分に干渉するかまたはその部分の破壊を引き起こす。「自己」および「非自己」を識別する能力が損なわれ、そして体は、それ自体、破壊始める。これは、自己免疫疾患、例えば類リウマチ関節炎、インシュリン依存型真性糖尿病（インシュリンの分泌に関与するランゲルハンス島のβ−細胞の自己免疫破壊を伴う）、ある種の溶血性貧血、リウマチ熱、甲状腺炎、潰瘍化大腸炎、重症性筋無力症、糸球体腎炎、アレルギー性脳脊髄炎、ある場合にウイルス性肝炎を起こす継続性神経および肝臓破壊、多発性硬化症および全身紅斑性狼癒を起こすことができる。ある型の自己免疫は、眼のレンズの神経組織のようなリンパ球に通常は曝露されない領域への傷害の結果として起きる。これらの領域における組織が、リンパ球に曝露されると、それらの表面タンパク質は、抗原として働くことができ、そして抗体の産生および細胞の免疫反応の引き金となって、次にはそれらの組織を破壊し始める。その他の自己免疫疾患は、個体の自己組織に抗原的に類似し、そのためにそれと交差反応するような抗原に曝露された後に発生する。リウマチ熱は、この種の疾患の例であり、その疾患では、リウマチ熱の原因となる連鎖球菌の抗原は、ヒトの心臓の部分と交差反応性である。抗体は、細菌の抗原と心筋の抗原とを区別できず、それらの抗原をもついずれの細胞も、その作用によって破壊できる。これらの自己免疫疾患のあるもの、例えばインシュリン依存型真性糖尿病、多発性硬化症および類リウマチ関節炎は、細胞性自己免疫応答の結果であると特徴づけられ、Ｔ細胞の作用によるものと考えられる[Sinha et al，Science 248，1380( 1990)]、参照］。かくして、免疫応答の抑制は、自己免疫疾患に罹っている患者の治療に有用であろう。より具体的には、細胞性免疫応答の抑制は、インシュリン依存型真性糖尿病、多発性硬化症および類リウマチ関節炎のようなＴ細胞の作用による自己免疫疾患に罹っている患者の治療に有用であろう。Ｒが塩素である前記式Ｉによって表される化合物は、アスピロクロリン（ａｓｐｉｒｏｃｈｌｏｒｉｎｅ）として既知である。この化合物は、抗生物質Ａ−３０６４１として米国特許第3991052号に開示されている；本開示によれば、該化合物は、微生物菌株アスペルギルス・タマリイ（Aspergillus tamarii）ＮＲＲＬ８１０１の液内好気条件下での発酵によって得られる複合体の主成分である。米国特許第3991052号は、この化合物についての抗菌・抗かび（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ）活性を開示している。アスピロクロリンは、A.Kato et al.，Jour．Antib.，1969，22，pp．322-326 によって開示された、最初に「オリザクロリン（ｏｙｚａｃｈｌｏｒｉｎ）」と命名された抗菌・抗かび抗生物質の真の抗微生物成分であることが明らかになった（A.Sakata et al.，Agric．Biol．Chem.，47(8)，1983，pp ．2673-2674）。該物質は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）ＩＡＭ−２６１３の発酵ブロスから単離され、そしてカンジダ・アルビカンス（Ca ndida albicans ）の増殖に対するその活性が報告された。該文献において、また抗ウイルスおよび抗腫瘍活性に関しての指摘もなされた。アスピロクロリン（Ａ３０６４１として報告された）の抗菌・抗かび性は、D. H．Berg et al,．Jour．Antib.，1976，29，pp．394-397によって確認された。該文献において、また、著者らは、Ａ３０６４１が、取るに足りない抗ウイルス活性をもつにすぎないと報告した。上記文献のすべては、アスピロクロリンに関する不正確な構造を報告している。正確な構造（式Ｉに示されるような）は、K．Sakata et al.，Tetr．Lett.，2 8，46(1987)，pp．5607-5610によって、その後初めて確認された。前記微生物発酵法に加えて、アスピロクロリン化学的合成方法が、近年、G.F ．Miknis et al.，J．Am．Soc.，1993，115，pp．536-547によって開示された。Ｒが水素である式Ｉの化合物（デクロロアスピロクロリン(ｄｅｃｈlｏｒｏａｓｐｉｒｏｃｈｌｏｒｉｎｅ)）は、K．Sakata et al.，Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu(1987)，29，684-91によって記述された（また、Chem ．Abstrsct，108，128151、参照）。該化合物は、Ａ．オリゼの発酵培地のハロゲン源を改変することによって生産され、そしてまた、アスピロクロリンの活性と類似の抗菌・抗かび活性を示す。式Ｉの化合物が免疫抑制活性をもつことが、ここに見い出された。本発明の化合物の免疫抑制活性は、標準の免疫学的試験によって例証されるが、この試験において、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の発現が、一次ヒトＴ細胞においてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）により誘導され、そして免疫抑制活性が、ＩＬ−２受容体発現の阻害％として示される。アスピロクロリンでは、０．１μｇ／ｍｌより低いＩＣ₅₀値が測定されたが、一方、デクロロアスピロクロリンでは、該値は、０．１μｇ／ｍｌよりわずかに高い。上記活性に鑑み、式Ｉの化合物は、特に細胞性免疫を抑制するための免疫抑制薬の製造に用いられるであろう。かくして、式Ｉの化合物を含有する免疫抑制製薬学的組成物は、先に報告されたように、改変された免疫の適応応答に関連する病気、例えば自己免疫疾患、アレルギー反応および「移植片対宿主］疾患を治療するのに特に有用であろう。そのような製剤は、それらの病気を患っている患者の病状のさらなる頽廃または悪化を防いだり阻止するのに特に有効であろう。また、該免疫抑制製薬学的組成物は、望ましくない免疫反応を防ぐために、同種組織または臓器移植を既に受けたか、または受けようとしている患者の予防的治療において有用であろう。本明細書に使用される用語「患者」は、自己免疫疾患または「移植片対宿主」疾患のような病気を患っているか、または移植された同種組織または臓器の拒絶が危惧される温血動物、例えば哺乳動物を指す。ヒト、愛玩動物、マウスおよびラットが、用語「患者」の範囲内に含まれる。標準の臨床および実験室試験ならびに操作に基づいて、技術上熟達した担当診断医は、式Ｉの化合物のような免疫抑制剤による治療の必要な患者を、容易に特定することができる。式Ｉの化合物の有効な免疫抑制量は、患者への単回もしくは複数回投与により、免疫抑制効果またはより具体的には細胞性免疫抑制効果を与えることに有効である量である。免疫抑制効果は、免疫応答または細胞性免疫応答のさらなる発現を緩和、中断、阻害または予防することを指す。式Ｉの化合物の有効な免疫抑制量は、技術上熟達した担当診断医によって、既知の技術を使用したり、また類似の状況下で得られる結果を観察することにより、容易に決定することができる。有効量または用量の決定には、限定はされないが、哺乳動物の種；そのサイズ、年令、および一般的健康；付随する特定の病状；病気の併発度もしくは重篤度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与方式；投与される製剤の生物学的利用能特性；選択される用量用法；随伴医薬の使用；およびその他の関連する状況を包含する多くののファクターが、担当診断医によって考慮される。式（１）の化合物の有効な免疫抑制量は、１日に体重１キログラム当たり約０．１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）から約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙまで変わると予測される。好適な量は、約０．５から約１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙまで変わると予測される。式Ｉの化合物を含有する製薬学的組成物は、化合物を有効量において生物学的に利用させうる、経口および非経口経路を含むいかなる形式または方式においても投与することができる。それは、例えば、経口的、皮下、筋肉内、静脈内、経皮的、鼻内、肛門に、およびそれに類する経路で投与できる。製剤製造の当業者は、選ばれた化合物の特性、治療されるべき病状、病気の段階およびその他の関連する状況に応じて投与の適当な形式または方式を容易に選択できる。本化合物は、薬物学的に許容しうるキャリアーまたは添加剤との組み合わせにおける製薬学的組成物の形で投与することができ、組成物の比率および性質は、選ばれた化合物の溶解度と化学特性、選ばれる投与経路、および標準の薬物学的慣行によって決定される。製薬学的組成物は、製薬技術分野における周知の方法で製造される。キャリヤーまたは添加剤は、有効成分のための担体または媒体として働くことができる固形、半固形または液状物質であってもよい。適切なキャリヤーまたは添加剤は、当該技術分野で周知である。製薬学的組成物は、経口または非経口用途のために適応されてもよく、そして錠剤、カプセル剤、坐剤、液剤、懸濁剤またはそれに類する形態で、患者に投与することができる。本発明の化合物は、例えば、不活性な賦形剤または食用キャリヤーとともに、経口的に投与することができる。それらは、ゼラチンカプセルに封入されても、または錠剤に圧縮されてもよい。経口治療的投与の目的では、化合物は、添加剤とともに組み込まれ、そして錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエファー剤、チューイングガム等の剤形で使用されてもよい。これらの製剤は、本発明の化合物、有効成分の少なくとも４％を含有しなくてはならないが、特定の剤形に応じて変えることができ、そして有利には、単位の重量の４％〜約７０％である。組成物中に存在する化合物の量は、適切な用量が得られるようにする。本発明による好適な組成物および製剤は、経口用量単位剤形が、本発明の化合物５．０〜３００ｍｇを含有するように製造される。また、錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、次の補助剤：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチン；添加物、例えば澱粉、乳糖；崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ^TM、コンスターチ等；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｘ^TM；滑沢剤（ｇｌｉｄａｎｔｓ）、例えばコロイド状二酸化ケイ素の１種以上を含有してもよく、そして矯味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン、または矯臭剤、例えばハッカ、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバーが添加されてもよい。用量単位剤形がカプセルである場合には、それは、上記種類の材料に加えて、液体キャリヤー、例えばポリエチレングリコールもしくは脂肪オイルを含有してもよい。その他の用量単位剤形は、用量単位の物理的形態を改変する他の種々の材料、例えばコーティング剤を含有してもよい。かくして、錠剤もしくは丸剤は、糖、セラックまたは他の腸溶コーティング剤によってコーティングすることができる。シロップ剤は、本化合物に加えて、矯味剤としてのスクロース、ならびにある種の保存剤、染料および着色剤、および矯臭剤を含有してもよい。これらの種々の組成物を製造するのに使用される材料は、薬物学的に純粋で、使用量において無毒でなければならない。非経口治療的投与の目的では、式Ｉの化合物は溶液もしくは懸濁液中に組み入れられてもよい。これらの製剤は、本発明の化合物の少なくとも０．１％を含有しなくてはならないが、それらの重量が０．１％〜約５０％になるように変えることができる。そのような組成物中に存在する化合物の量は、適切な用量が得られるようにすべきである。好適な組成物および製剤は、非経口用量単位が、式Ｉの化合物５．０〜１００ｍｇを含有するように製造される。また、液剤または懸濁液剤は、次の補助剤：無菌希釈剤、例えば注射用水、生理的食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒；抗バクテリア剤、例えばベンジルアルコールもしくはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；バッファー；例えば酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩、および等張化剤、例えば塩化ナトリウムもしくはデキストロースの１種以上を含有してもよい。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多用量のバイアル中に封入することができる。式Ｉの化合物の免疫抑制活性を測定するために、次の方法が用いられるが、この方法では、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）の発現が、１次ヒトＴ細胞においてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）により誘導される。次いで、式Ｉの化合物の免疫抑制活性が、Ｔ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現の阻害パーセントとして示される。１）Ｔ細胞の調製：ヒト末梢血液のリンパ球（ＰＢＬ）が、Ｈｉｓｔｏ−Ｐａｑｕｅ−１０７７（ Sigma）を用いて、血液サンプル（０．０１％Ｍクエン酸ナトリウム中）２００ｍｌから単離される。血液を、Ｈａｎｋ’ ｓＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（Sigma）により１：１希釈し、そして希釈した血液１０ｍｌを、５０ｍｌ容チューブ（Falcon，ポリプロピレン）中Ｈｉｓｔｏ−Ｐａｑｕｅ−１０７７１０ｍｌ上に重層する。Ｈａｎｋ溶液およびＨｉｓｔｏ−Ｐａｑｕｅは、室温に維持する必要がある。チューブを、室温で３０分間、１４００ＰＰＭで遠心分離する。血漿を除去し、そして界面における回収した細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ ｓＰｈｐｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ（Gibco BRL，ＤＰＢＳ）中で洗浄し、１４００ＲＰＭで５分間遠心し、そしてＤＰＢＳで再び洗浄する。細胞をカウントし、ＲＰＭ１１６４０（Gibco BRL）中に２ｘ１０⁶ｃｅｌｌ／ｍｌで再懸濁する。細胞液２ｍｌを、６穴プレート（Falcon，組織培養級）の各ウエルに入れる。プレートは３７℃で２時間インキュベートされる。インキュベート後、上澄液を除去し、保存する。粘着マクロファージ層をＤＰＢＳで２回洗浄し、そしてプレートを、この層の上に沈着した非粘着細胞を除去するために洗う（ｔａｐｐｅｄ）。上澄液および洗浄液を合体し、遠心し、カウントし、そして１０％ＦｅｔａｌＣａｌｆＳｅｒｕｍ（Hyclone，ＦＣＳ）、５ｘ１０^-5Ｍ２−メルカプトエタノール（Sigma，２−ＭＥ）、２ｍＭＬ−グルタミン（Gibco BRL）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Gibco BRL）、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（Gibco BRL）および１ｍＭＨＥＰＥＳバッファー（Research Organics）を含むＲＰＭ１１６４０中に２．０ｘ１０⁶ｃｅｌｌ／ｍｌで再懸濁する。２）細胞培養ヒトＴ細胞は、２４穴プレート（Falcon，組織培養級）において容量２ｍ１／ウェルで培養される。対照区は、ＣｏｎＡ無添加（ＩＬ−２Ｒ発現０％）およびＣｏｎＡ（Sigma）２．５μｇ／ｍｌ添加（ＩＬ−２Ｒ発現１００％）である。本発明の化合物は、各穴への適切な濃度（１，１０，１００および１０００μｇ／ｍｌ）において、２０μｌＤＭＳＯ溶液を添加して次の濃度０．０１，０．１，１．０および１０．０μｇ／ｍｌで試験される；２μｌＤＭＳＯが、供試化合物無添加区にも添加されて、すべての区は同量のＤＭＳＯを含有する。プレートを、５％ＣＯ₂中で、３７℃９６時間インキュベートする。細胞を収穫し、そしてウエルをＲＰＭＩで激しくピペッティングして２回洗浄する。細胞は、１４００ＲＰＭで５分間遠心分離される。３）ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）についての染色：上澄液を除去し、そしてペレットを１００μｌＤＰＢＳ中に再懸濁する。対照サンプルを、２つのサンプルに分け、１つを、蛍光標識されたマウスＩｇＧ１１０μｌで染色する（イソタイプ対照）。残りの細胞は、蛍光標識された抗ＩＬ−２Ｒ（Coulter）１０μｍｌで染色される。４℃で３０分間インキュベートする。ＤＰＢＳ１ｍｌを添加し、過剰の抗体を洗浄除去するために、１４００ＲＰＭで５分間遠心分離する。ＤＰＢＳ０．５ｍｌ中に再懸濁し、そしてフローサイトメトリー分析まで保存する。４）フローサイトメトリー分析：分析は、ＣｏｕｌｔｅｒＥＬＩＴＥフローサイトメーターにおいて４８８ｎｍレーザーにより遂行される。ポジティブセルｃｕｒｓｏｒはイソタイプ対照によりセットされる。最小１０⁴細胞が各サンプルのために分析される。ヒストグラムデータを、ＣｏｕｌｔｅｒＭｕｌｔｉｇｒａｐｈソフトウエアーを用いて解析する。結果は、次の表Ｉに報告されるように、ＣｏｎＡ活性化因子のみによるＴ細胞の発現（１００％発現）に比較して、増加する免疫抑制活性量の存在下でのＴ細胞から発現されるＩＬ−２Ｒのパーセンテージとして与えられる：表１：ＩＬ−２Ｒ発現の阻害

Claims

【特許請求の範囲】１．免疫抑制用の医薬を製造するための式Ｉ［式中、Ｒは、水素または塩素を表す］の化合物の使用。２．医薬が、細胞性免疫を抑制するために有用である、請求の範囲１記載の使用。３．医薬が、同種移植片拒絶の治療に有用である、請求の範囲１記載の使用。４．医薬が、自己免疫疾患の治療に有用である、請求の範囲１記載の使用。５．医薬が、ィンシュリン依存型真性糖尿病の治療に有用である、請求の範囲１記載の使用。６．医薬が、多発性硬化症の治療に有用である、請求の範囲１記載の使用。７．医薬が、類リウマチ関節炎の治療に有用である、請求の範囲１記載の使用。