JP2000515009A - 植物の保護方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 植物を病原体に対し保護する方法であって、ジャスモナートおよび／またはエチレン経路を刺激することにより植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導することを含む方法を記載する。同様に、植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導する方法、植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導しうる組成物、および抵抗性誘導活性を与える化合物のスクリーニング法を記載する。好ましくは病原体は壊死栄養性病原体である。

Description

【発明の詳細な説明】 植物の保護方法 本発明は、植物を病原体に対し保護する方法に関する。 より詳細には、本発明はこのような病原体の攻撃に対し植物を保護しうるタン パク質を発現する新規な情報伝達経路に関する。 特に、本発明は植物を真菌および細菌などの壊死栄養性（ｎｅｃｒｏｔｒｏｐ ｈｉｃ）病原体に対し保護する方法に関する。 微生物性病原体により攻撃された植物が一連の病原関連タンパク質（ＰＲタン パク質）をコードする防御関連遺伝子の発現を誘発しうることは周知である。こ れらのタンパク質は病原体攻撃部位に検出できるだけでなく、感染していない葉 にも検出でき、それらは全身性獲得抵抗性、すなわち植物がその後の微生物性病 原体攻撃に対し抵抗性の増大を示す状態を生じる。サリチル酸（ＳＡ）が全身性 獲得抵抗性をもたらす情報伝達経路において重要な役割をもつことも知られてい る。葉が微生物性病原体に感染すると内因性サリチル酸濃度が高まり、続いてＰ Ｒタンパク質が誘導されるからである。 本発明は、刺激されると病原体、特に微生物性病原体に対する抵抗性を同様に 誘発すると思われ、サリチル酸経路に加えて、またはその代わりに有用となりう る、別の情報伝達経路に関する。 従来の研究で、ジャスモナート（ｊａｓｍｏｎａｔｅ）およびジャスモン酸メ チルをジャガイモやトマトなどの植物に外部適用すると遅発性葉枯れ病（blight ）真菌Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対する抵抗性が誘導さ れることが証明された（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。しかし、植物 デフェンシン遺伝子の発現を誘導することにより植物を病原体に対し保護するこ とは教示されていない。 ジャスモン酸メチルによる処理は、他の２組の植物／病原体系、すなわちオオ ムギ／Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ（Ｋｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９ ９５）またはイネ／Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ（Ｓｃｈｗｅｉｚｅ ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）のいずれにも抵抗性を与えなかった。 サリチル酸依存型の病原体誘発性防御反応を活性化することが知られている化 合物、たとえばサリチル酸自身、アセチルサリチル酸、２，６−ジクロロイソニ コチン酸（ＩＮＡ）および１，２，３−ベンゾチアジアゾール−７−カルボチオ 酸Ｓ−メチルエステルがウイルス、細菌および真菌を含めた広範な微生物性病原 体に対する抵抗性を誘導しうることは十分に述べられている（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｋｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｌａｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｏｒｌａｃ ｈ ｅｔ ａｌ．）。興味深いことに、１，２，３−ベンゾチアジアゾール−７ −カルボチオ酸Ｓ−メチルエステルはタバコ植物を壊死栄養性病原体Ｂｏｔｒｙ ｔｉｓｃｉｎｅｒｅａおよびＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ感染に 対し防御できなかった（Ｌａｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）。 これまでに３種類のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子、すなわちＰＲ−１、ＰＲ −２（β−１，３−グルカナーゼ）およびＰＲ−５（オスモチン様タンパク質） が確認されており、これらは病原体に感染すると同調して全身的に誘導される（ Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｄｅｍｐｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９ ３，Ｍａｕｃｈ−Ｍａｎｉ ａｎｄ Ｓｌｕｓａｒｅｎｋｏ，１９９４）。これ らの遺伝子はすべて、ＳＡ、またはＳＡの作用を模倣すると思われる合成化合物 であるＩＮＡを外部適用すると、高度に誘導される（Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ，１９９２；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。 本発明者らは、保護タンパク質をコードする遺伝子の誘導は必ずしもサリチル 酸経路に依存するわけではなく、まったく別個の経路に関連する場合もあること を見出した。 本発明の第１態様によれば、植物を病原体に対し保護する方法であって、ジャ スモナートおよび／またはエチレン経路を剌激することにより植物デフェンシン 遺伝子の発現を誘導することを含む方法が提供される。 本発明の第２態様によれば、植物にエチレン、ジャスモナート、エチレンまた はジャスモナートの作用を模倣する薬剤、および酸化的ストレスを生じる薬剤の うち１種類またはそれ以上を適用することにより、植物デフェンシン遺伝子の発 現を誘導する方法が提供される。 本発明の第３態様によれば、ジャスモン酸（ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、 ジャスモナート、エチレン、エチレンまたはジャスモナートの作用を模倣する薬 剤、および酸化的ストレスを生じる薬剤のうち１種類またはそれ以上を含む、植 物デフェンシン遺伝子の発現を誘導しうる組成物が提供される。 本発明の第４態様によれば、エチレン発生化合物、脂質由来のシグナル分子、 サリチル酸、サリチル酸の官能性類似体、および反応性酸素発生化合物のうち１ 種類またはそれ以上を含む、植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導しうる組成物 が提供される。 本発明の第５態様によれば、抵抗性誘導（デフェンシン誘導）活性につき化合 物をスクリーニングする方法であって、このような抵抗性を与えると推定される 化合物を植物または植物の一部に適用し、そして植物デフェンシン遺伝子または 同調発現遺伝子の発現を検出することを含む方法が提供される。 本発明の第６態様によれば、ジャスモン酸もしくはその作用を模倣する薬剤お よび／またはエチレンもしくはその作用を模倣する薬剤により誘導される領域を 含む、植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導しうるプロモーターが提供される。 本発明の第７態様によれば、図１４に示した核酸配列もしくは図１４に示した 核酸配列と実質的相同性を有する配列、またはその変異体に含まれるプロモータ ー領域が提供される。 好ましくは、植物デフェンシン遺伝子はジャスモナートおよびエチレン経路の 刺激により誘導される。 好ましくは病原体は壊死栄養性病原体である。 好ましくは病原体は微生物性病原体である。 好ましくは病原体は真菌である。 好ましくは、ジャスモナートおよび／またはエチレン経路はエチレン、ジャス モン酸またはジャスモナートの適用により刺激される。しかし、エチレンまたは ジャスモン酸の作用を模倣する薬剤の適用も有効であろう。さらに、植物デフェ ンシンの発現は、酸化的ストレスを生じうる化合物を非除草量で適用することに より誘導できると思われる。このような薬剤の例には、超酸化物アニオンを形成 する、パラカット（ｐａｒａｑｕａｔ）もしくはダイカット（ｄｉｑｕａｔ）な どのジフェニル系除草剤、または一重項酸素種を生成するローズベンガルが含ま れる。 好ましくは、ジャスモナートおよび／またはエチレン経路の刺激には、Ａｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓ（シロイヌナズナ）由来の情報伝達成分ＥＩＮ ２およびＣＯ Ｉ １が伴う。しかしこれらの経路の刺激には、実質的にＥＩＮ ２およびＣＯ Ｉ １に相同な他の植物の対応する遺伝子産物を伴ってもよい。 好ましくは、エチレン発生化合物はエチレン、エテホン（ｅｔｈｅｐｈｏｎ） およびアミノシクロプロパンカルボン酸から選択される。 好ましくは、脂質由来のシグナル分子はアラキドン酸およびその誘導体、リノ レン酸およびその誘導体、ジャスモナートおよびその誘導体から選択される。 好ましくは、反応性酸素発生化合物はパラカット、ダイカット、ローズベンガ ルおよびエオシンから選択される。 いかなる植物種も使用できるが、特に適した植物にはラディッシュ、タバコま たはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属種が含まれる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属種を用 いる場合、デフェンシンは植物デフェンシン遺伝子ＰＤＦ １．２（図１４）、 ＰＤＦ １．２の配列と実質的相同性を有する配列、またはその変異体の産物で あってよい。 前記のように、ジャスモナートまたはエチレンの活性を模倣する化合物も植物 デフェンシン遺伝子の発現を誘導する。これは、この経路を利用して、内因性防 御機構を活性化する化合物をスクリーニングできることを意味する。 全植物体をスクリーニングに使用できるが、植物の一部、特に葉などの組織を 用いるのがより簡便であろう。 検出は任意の適した手段で、たとえばＰＤＦ １．１もしくはＰＤＦ １．２ の遺伝子産物または関連の植物デフェンシンに対する抗体を用いて、またはＰＤ Ｆ １．２のプロモーター領域に結合したリポーター遺伝子、たとえばＧＵＳ遺 伝子もしくはルシフェラーゼ遺伝子により実施できる。 本発明方法の利点は、生存微生物細胞を直接に妨害する細胞毒性または潜在的 に有害な化学物質を用いるのではなく、植物に存在する防御機構を活性化する化 学物質を利用することである。 本発明組成物の利点は、植物に特定のタイプの病原体に対する抵抗性、たとえ ば壊死栄養性病原体に対する抵抗性を与えるために使用できることである。ある いは本発明組成物は、サリチル酸、ジャスモナートおよび／またはエチレン経路 を誘導する化合物の使用により、植物に広範な病原体に対する保護を与えるため に使用できることである。 本発明の好ましい態様は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属種の植物を真菌に対し保 護する方法であって、ジャスモナートおよび／またはエチレン経路を刺激するこ とにより植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導することを含み、その際デフェン シン遺伝子の発現はエチレン２５ｐｐｍを含有する雰囲気において０．５μＭジ ャスモン酸メチルで葉を処理することにより誘導される。 本発明のさらに好ましい態様は、植物を多数の病原体の攻撃に対し保護するた めに植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導しうる組成物であって、エチレン、ジ ャスモン酸メチルおよびサリチル酸を含む組成物である。この場合、サリチル酸 依存性防御経路とジャスモナートおよび／またはエチレン経路の両方を活性化す ることができるであろう。 本発明に関して“その変異体”という語は、得られる配列の産物が抗病原体活 性をもちうる限り、その遺伝子配列に対する１またはそれ以上のヌクレオチドの いかなる置換、変更、修飾、交換、欠失または付加をも意味する。この語には、 その遺伝子配列に実質的にハイブリダイズしうる配列も含まれる。この語には、 本発明のＤＮＡにハイブリダイズし、その遺伝子配列の少なくとも一部をコード するＤＮＡも含まれる。好ましくは、このようなハイブリダイゼーションは低い および高いストリンジェンシー条件下で、またはその間で起きる。一般に、低い ストリンジェンシー条件は周囲温度ないし約６５℃で３×ＳＳＣ、高いストリン ジェンシー条件は約６５℃で０．１×ＳＳＣであると定義できる。ＳＳＣは０． １５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム緩衝液の名称である。３ ×ＳＳＣは３倍濃縮されたＳＳＣであり、その他同様である。 “実質的相同性”という語は、その相同配列がデフェンシン遺伝子として作用 する限り、すなわちそれの産物が植物病原体に対する抵抗性を与えることができ る限り、その遺伝子配列の、少なくとも必須ヌクレオチドに関する相同性を包含 する。一般に６０％以上のヌクレオチドが本発明の遺伝子配列と共通である場合 に相同性が示され、より一般的には６５％以上、好ましくは７０％以上、より好 ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上または８５％以上、特に好ま しくは９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上が相同である。 “微生物”という語には、細菌、真菌およびウイルスが含まれる。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて微生物攻撃に際し活性化され、かつその発現 がサリチル酸依存型でなく、エチレンおよびジャスモン酸反応経路の機能性成分 を必要とする遺伝子のひとつは、植物デフェンシン遺伝子である。植物デフェン シンは種々の昆虫種にみられる抗微生物性昆虫デフェンシン類と構造的に関連の ある、長さ約５ｋＤａの、システインに富む一群の塩基性タンパク質である（Ｂ ｒｏｅｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ，１９９５）。多数のこれら植物 デフェンシンが有効な真菌増殖阻害物質であることは知られており、これはそれ らが宿主防御において役割をもつことを示唆する。トランスジェニックタバコ植 物においてラディッシュ由来の植物デフェンシン遺伝子を発現させると真菌性病 原体Ａｌｔｅｒｎａｎｉａ ｌｏｎｇｉｐｅｓに対する抵抗性が与えられること が示された（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。この病原体が誘導する 植物デフェンシン遺伝子は、ジャスモナートおよび／またはエチレン依存型経路 、すなわちサリチル酸非依存型経路により活性化される唯一の遺伝子ではない可 能性がきわめて高いが、それをこの経路の活性化を監視するための指示薬として 利用できる。ただし同じ経路で作動する他のいかなる遺伝子も同じ目的に利用で きるであろう。 後記の実施例にさらに詳細に記載するように、植物デフェンシンをコードする ２種類のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子が発現することが認められた。これらの 遺伝子はGenebankデータベースを既知のラディッシュ植物デフェンシンＲｓ−Ａ ＦＰ１のｃＤＮＡに関するヌクレオチド配列に相同な配列につき探索していた際 に見出され、Genebank受託番号Ｚ２７２５８およびＴ０４３２３をもち、それぞ れＰＤＦ１．１およびＰＤＦ１．２と表示される。それらの配列を図１Ａおよび １Ｂに、また配列番号１および２として示す。これらの配列は、乾燥種子ｍＲＮ Ａ（ＰＤＦ１．１）または実生ｍＲＮＡ（ＰＤＦ１．２）から調製したｃＤＮＡ ライブラリー中に、発現配列標識として同定された。これらの遺伝子は、 ラディッシュタンパク質と９８％および９２％等しい推定ペプチドシグナルおよ び成熟植物デフェンシンドメインを含むプレタンパク質をコードする。 ＰＤＦ１．１およびＰＤＦ１．２の発現パターンを、種々のＡｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓ器官から単離したＤＮＡアーゼ処理ＲＮＡに対する逆転写ポリメラーゼ連 鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析した（図２）。ＲＴ−ＰＣＲ反応の対照とし て、９９塩基対イントロンを含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＡＣＴＩＮ−１遺伝 子の領域に対応する配列の増幅に用いるプライマー対を設計した（Ｎａｉｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８８）。この方法で、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅 に由来する生成物を、ＲＮＡから得られた真のＲＴ−ＰＣＲ生成物からサイズに より識別できる。図２にみられるように、乾燥種子以外のすべての分析組織から 得たＲＮＡ試料が予想サイズのアクチン−１ ＲＴ−ＰＣＲ増幅生成物を与えた のに対し、ゲノムＤＮＡは約１００ｂｐ長いＰＣＲ生成物を与えた。ＰＤＦ１． １に特異的なプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲは、長角果および乾燥種子由来 のＲＮＡを鋳型として用いた増幅生成物を示した。ＰＤＦ１．２に特異的なプラ イマー対は、健康な植物から得たいずれの分析組織においてもＲＴ−ＰＣＲ増幅 生成物を与えなかった。しかし、経時的に拡散しない褐色壊死病変を生じる真菌 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ ＭＵＣＬ ２０２９７株に 感染した葉に由来するＲＮＡにつき実施したＲＴ−ＰＣＲでは、予想サイズの増 幅生成物が検出された。ゲノムＤＮＡを用いて得たＰＣＲ増幅生成物は、感染し た葉に由来するＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲにより得たものより約１００ｂｐ長 かった。これは、ＰＤＦ１．２特異的プライマーがＰＤＦ１．２遺伝子のイント ロンを含むことを示す。これはＰＤＦ１．１特異的プライマーについてはみられ なかった。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓは、相同性の高い植物デフェンシンをコードするがま ったく異なる発現パターンをもつ、２種類の遺伝子を含むと結論された。ＰＤＦ １．１は主として種子において発現し、ラディッシュＲｓＡＦＰ１およびＲｓＡ ＦＰ２遺伝子の相同体であるのに対し、ＰＤＦ１．２は病原体によるストレスに 際し葉において発現し、ラディッシュ由来のＲｓＡＦＰ３およびＲｓＡＦＰ４遺 伝子の相同体であると考えることができる（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９ ９５）。 ＰＤＦ１．１およびＰＤＦ１．２遺伝子ならびにそれらの発現生成物をさらに 研究に用いた。それについては後記実施例にさらに詳細に述べる。 ２種類の植物デフェンシン遺伝子の発現をそれらの発現配列標識（ｅｘｐｒｅ ｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ，ＥＳＴ）配列により同定した分析で、そ れらは発現様式が異なり、これら２遺伝子のうち一方（ＰＤＦ１．２と表示され るもの）のみが病原体誘導性らしいことが明らかになった。これまでに２種類の 相同な植物デフェンシンＥＳＴ配列が確認されたにすぎないが、Ａｒａｂｉｄｏ ｐｓｉｓ中に他の植物デフェンシン遺伝子が存在する可能性があり、かつ発現す る可能性がある。ハイブリダイゼーションプローブとしてＲｓ−ＡＦＰ２に対す るｃＤＮＡクローンを用いて行った、４種類の別個の制限酵素で消化したＡｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムＤＮＡのサザンブロット分析で、用いた酵素に応じて３ 〜５個のバンドが明らかになったからである（データは示されていない）。現在 のところ、発症中の他の推定デフエンシン遺伝子の発現パターンは分かっておら ず、この遺伝子群を慎重に調べる必要があろう。 本発明の研究で、少なくともＰＤＦ１．２を含めた植物デフェンシン遺伝子の 発現も病原体感染に際し全身的に誘導されるが、この誘導はＰＲタンパク質がた どるのと明らかに異なる反応経路をたどることを見出した。この知見は幾つかの 証拠に基づく。 第１に、ＳＡまたはＩＮＡを外部適用してもＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物デフ ェンシンは誘導されなかった。これに対しジャスモン酸メチル、エチレン、また は反応性酸素種発生化合物であるパラカットおよびローズベンガルで処理すると 、植物デフェンシン転写体が蓄積した。第２に、ＳＡからＰＲタンパク質遺伝子 活性化に至る反応経路が遮断されていることが分かっているｎｐｒ−１ Ａｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体で、病原体誘導による植物デフェンシン遺伝子の全身発 現が低下しなかった（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。第３に、内因性ＳＡ 、ならびにＰＲ−１，ＰＲ−２およびＰＲ−５転写体を構成的に高められた濃度 で示すｃｐｒ１ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体で、植物デフェンシン遺伝子が 構成性発現しなかった（Ｂｏｗｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。第４に、 Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのｅｔｒ１−３、ｅｉｎ２およびｃｏｉ１変異体の分析に より、真菌攻撃に反応した植物デフェンシン誘導をもたらす機構はエチレンおよ びジャスモナート反応経路に由来するか共通する成分を伴うことが証明された。 したがってこれらの結果は、別個の２クラスの抗真菌性タンパク質（それぞれ、 たとえばＰＲ−１と植物デフェンシン）が別個の信号伝達経路で局部的および全 身的に誘導される可能性のあることを示す。 エチレンの存在下で生育した場合に形態的反応を示さないことにより同定され るｅｉｎ２ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体（Ｇｕｚｍａｎ ａｎｄ Ｅｃｋｅ ｒ，１９９０）は、病原体処理した葉および処理していない全身の葉の両方にお いて、病原体誘導によるその植物デフェンシン遺伝子の発現が実質的に遮断され る。これに対し、部分的にエチレン非感受性変異体であるｅｔｒ１−３変異体( Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３)は、感染した葉においては正常な植物デ フェンシン反応を示したが、感染植物の全身の葉においては植物デフェンシン遺 伝子発現の低下（ただし皆無ではない）を示す。病原体攻撃されたｅｔｒ１−３ 植物において植物デフェンシン遺伝子発現の抑制がこのように不完全であるのは 、この特定の変異体対立遺伝子の漏出による可能性が最も高い。ｃｏｉ１変異体 は、ジャスモン酸メチル、またはジャスモナート類似体として作用する細菌性植 物毒素コロナチン（ｃｏｒｏｎａｔｉｎｅ）で処理した際に、野性型植物より根 の生長阻害に対する感受性が低いことが知られている（Ｆｅｙｓ ｅｔ ａｌ． ，１９９４）。この変異体は、病原体処理した葉および処理していない全身の葉 の両方において、病原体誘導による植物デフェンシン反応のほぼ完全な遮断を示 した。 これらの分析から、ＥＩＮ２およびＣＯＩ１は局部的および全身的な植物デフ ェンシン誘導に必要であり、これに対しＥＴＲ １は全身反応にのみ関係すると 思われる。これら３遺伝子のうちＥＴＲ １のみが同定されている。ＥＴＲ １ は細菌の２成分ヒスチジンキナーゼセンサーに類似するタンパク質をコードし、 遺伝学的および生化学的証拠はＥＴＲ １がエチレン受容体であることを示す（ Ｓｃｈａｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｌｅｅｃｋｅｒ， １９９５）。遺伝子産物ＥＩ Ｎ２は、エチレン反応経路においてＥＴＲ １の下流で作用する（Ｅｃｋｅｒ， １９９５）。ＣＯＩ１はこれまでに同定されていないが、ジャスモナートにより 開始される信号伝達に関係していると考えられる（Ｆｅｙｓ ｅｔ ａｌ．，１ ９９４）。 興味深いことに、ｅｉｎ２植物は、細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎ ｇａｅ ｐｖ． ｔｏｍａｔｏのビルレント株を浸潤させた場合に、野性型植物 と対比して黄白化病変（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎ）形成の低下を示す ことがこれまでに見出されている（Ｂｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ｅｔ ｒ１−３変異（以前はｅｉｎ１−１と呼ばれた）を保有する変異体は、野性型植 物と同様に反応する。ｅｉｎ２植物は野性型およびｅｔｒ１−３植物と対比して 病状の低下を示したが、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｔｏｍａｔｏ菌はこれ ら３遺伝子型において同様に良好に増殖した。 病原体ストレスに際して防御関連遺伝子の誘導を導く２つの別個の経路のモデ ルを図９に示す。このモデルでは、過敏反応が分岐点の上に位置する。自然過敏 反応様病変を発現するａｃｄ２ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体（Ｇｒｅｅｎｂ ｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）は、植物デフェンシンおよびＰＲタンパク質 の両方につき高い濃度の転写体を含有することが見出されたからである（Ｇｒｅ ｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。サリチル酸によりＰＲタンパク質遺 伝子を発現する経路は信号伝達成分ＮＰＲ１およびＣＰＲ１を伴い、一方、植物 デフェンシン遺伝子を発現する経路はＥＩＮ２およびＣＯＩ１を要求する。両防 御反応経路間にはある程度の“混線”もありうる。またＳＡ蓄積を阻害すると、 ジャスモナートおよび／またはエチレン経路、すなわちＳＡ非依存型経路の活性 化が高まると考えられる。これに関してアセチルサリチル酸はジャスモナート生 合成を阻害することが示され（Ｐｅｎａ−Ｃｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９ ３）、一方ＳＡはジャスモン酸によるプロテイナーゼ阻害物質の誘導を阻害する ことが見出された（Ｄｏａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。 他の防御関連遺伝子が前記のＳＡ非依存型経路による植物デフェンシンと同調 して活性化される可能性がある。可能性のある第１候補はＨｅｌ、すなわちウイ ルス感染に際して局部的にも全身的にも誘導されるヘベイン（ｈｅｖｅｉｎ）様 （ＰＲ−４様）遺伝子である（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。Ｈｅ ｌはエチレンによって強く誘導されるが、ＳＡによっては弱く誘導されるにすぎ ない。一方ＰＲ−１、ＰＲ−２およびＰＲ−５はエチレン誘導性でなく、ＳＡに よって強く誘導される（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。第２候補は チオニン遺伝子Ｔｈｉ２．１であり、これは真菌感染およびジャスモン酸メチル 処理に際して誘導されるが、ＳＡ処理に際しては誘導されない（Ｅｐｐｌｅ ｅ ｔ ａｌ．，１９９５）。考えられる第３候補は塩基性キチナーゼ遺伝子ＣＨＩ Ｔ−Ｂであり、これは野性型植物においてエチレン処理により誘導されるが、ｅ ｉｎ２またはｅｔｒ１−３変異体においては誘導されない（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｂｌｅｅｃｋｅｒ，１９９５）。ウイルス感染したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉 におけるＣＨＩＴ−Ｂ誘導は、ＰＲ−１、ＰＲ−２およびＰＲ−５の誘導とは異 なる反応速度に従うことが認められた（Ｄｅｍｐｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９ ３）。 ２つの別個の病原体誘導性反応経路があるという証拠がタバコにもある。第１ 経路はＰＲ−１、ＰＲ−２、ＰＲ−３（酸性キチナーゼ）、ＰＲ−４およびＰＲ −５など酸性ＰＲタンパク質遺伝子を誘導し、一方、第２経路は塩基性β−１， ３−グルカナーゼ遺伝子および塩基性キチナーゼ遺伝子を誘導発現する。第１群 の遺伝子はＳＡによって強く活性化され、一方、第２群はエチレンに反応する（ Ｍｅｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。興味深いことに、Ｇタンパク質阻害物 質であるコレラ毒素のＡｌサブユニットをコードする遺伝子を発現するトランス ジェニックタバコ植物は、酸性ＰＲタンパク質遺伝子の構成性発現を示したが、 塩基性β−１，３−グルカナーゼ遺伝子および塩基性キチナーゼ遺伝子の発現は 示さなかった（Ｂｅｆｆａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。酸性ＰＲタンパク質遺 伝予は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）による攻撃に際して局部的にも全身 的にも誘導される（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。他方、塩基性β−１，３−グルカナーゼ遺伝子およ び塩基性キチナーゼ遺伝子も接種した葉では強く誘導されたが、それらの全身誘 導性については否定的な証拠がある。ＲＮＡブロット分析によれば、ＴＭＶ感染 植物の接種していない葉では、これらの遺伝子の転写体濃度の有意の上昇を検出 できず（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ ｅｔ ａｌ ．，１９９１）、一方、ウェスタンブロット分析によれば対応するタンパク質が これ らの葉に蓄積することが認められた（Ｈｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。 タバコにおける塩基性β−１，３−グルカナーゼ遺伝子および塩基性キチナー ゼ遺伝子の病原体誘導発現は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて植物デフェンシ ン遺伝子発現を誘導する経路と等しい経路に従うと推定できる。明らかな相違は 、植物デフェンシンの誘導された発現が転写体濃度およびタンパク質濃度の両方 とも、全身の葉で起きることである。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓはタバコよりはる かに小さいので、前者の全身反応ははるかに小さな距離で測定されたことを考慮 すべきである。一方ではタバコにおける塩基性β−１，３−グルカナーゼおよび 塩基性キチナーゼの発現と、他方ではＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける植物デフ ェンシン遺伝子発現との他の明らかな相違は、タバコ遺伝子が傷害誘導性である (Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１)のに対し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ ｉｓの植物デフェンシン遺伝子はそうでないことである。 本発明者らは、ラディッシュ由来のＰＤＦ１．２類似体（Ｒｓ−ＡＦＰ１）に 対し産生された抗体と交差反応する病原体誘導性タンパク質がインビトロで強い 抗真菌性をもつことを証明した。このタンパク質は真菌感染に際しかなり高い濃 度にまで、すなわち接種した葉および未処理の全身の葉においてそれぞれ全タン パク質の最高２％および１％にまで蓄積する。本発明者らは、ラディッシュ由来 のＰＤＦ１．２類似体（Ｒｓ−ＡＦＰ２）を全可溶性タンパク質の約０．２５％ 産生するトランスジェニックタバコ植物が、形質転換していない植物よりＡ．ｌ ｏｎｇｉｐｅｓに対する抵抗性が高いことを先に示した（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。これらの所見によれば、植物デフェンシンは宿主防御にお いて役割をもつらしい。ＳＡ依存型経路がＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍ ａｔｏおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａを含めたある種の 病原体に対し抵抗性を備えるのに重要であるという説得力のある証拠が、現在は ある。事実、ｎａｈＧ発現性植物は野生型植物と対比してこれらの病原体に対し かなり感受性が高いことが認められ（Ｄｅｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４ ）、野生型植物と異なり全身性獲得抵抗性を備えることはできなかった（Ｌａｗ ｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ＳＡ非依存型経路（植物デフェンシン遺伝 子および恐らく他のデフェンシン関連遺伝子をも活性化する）も、異なるタイプ の病 原体にではあるが抵抗性に関与することを示す証拠を本明細書に提示する。事実 本発明者らは、ＳＡ非依存型経路が明らかに遮断されているｅｉｎ２およびｃｏ ｉ１変異体は、野生型植物よりＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａによる感染に 対する罹患性が高いことを示した。 本発明を以下の実施例および図面によりさらに説明する。これらは例示にすぎ ない。 図１は、それぞれＰＤＦ１．２およびＰＤＦ１．２に対応する発現配列標識Ｚ ２７２５８およびＴ０４３２３のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示 す。 （Ａ）ＰＤＦ１．１に対応するＺ２７２５８のヌクレオチド配列および推定ア ミノ酸配列。実験により決定されたＰＤＦ１．１（以前はＡｔ−ＡＦＰ１と呼ば れた）のＮ−末端領域（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）に下線を施し てある。付加した配列データによれば位置１２３のヌクレオチド（Ｚ２７２５８ のＴ）がＧで置換されている。 （Ｂ）ＰＤＦ１．２に対応するＴ０４３２３のヌクレオチド配列および推定ア ミノ酸配列。 （Ｃ）それぞれラディッシュの種子および葉に由来する成熟Ｒｓ−ＡＦＰ１お よびＲｓ−ＡＦＰ３のアミノ酸配列（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５， 未発表の結果）と、ＰＤＦ１．１の成熟ドメインおよびＰＤＦ１．２の推定成熟 ドメインのアミノ酸配列とのアラインメント。 （Ａ）および（Ｂ）において下線を施したヌクレオチド配列は、ＲＴ−ＰＣＲ に用いたプライマーの位置に対応する。（Ａ）および（Ｂ）中の終止コドンには 二重下線を施した。 図２は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＰＤＦ１．１およびＰＤＦ１．２の 発現パターンを示す； （Ａ）ＰＤＦ１．１に特異的なプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析。 （Ｂ）ＰＤＦ１．２に特異的なプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析。 （Ｃ）ＡＣＴＩＮ−１に特異的なプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析。 ＲＴ−ＰＣＲ反応は、種々のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ器官から単離した無ＤＮ アーゼ全ＲＮＡにつき実施された。７週令の開花植物から根、幹、つぼみ、開い た花、および長角果を採集した。４週令の植物からは葉および感染した葉を採集 した。感染した葉は、Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａを接種し、３日間の保温後 に採集したものである。 図３は、感染したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉から得た植物デフェンシンの精 製および特性解明を示す； （Ａ）Ｃ２／Ｃ１８シリカ逆相クロマトグラフィーカラムにおける、健康なＡ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉（上部）およびＡ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ感染し たＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉（下部）の塩基性タンパク質画分の分離。カラム を０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸中０％から５０％（ｖ／ｖ）までのアセ トニトリル直線濃度勾配により溶離した。 （Ｂ）ピーク１に含まれていたタンパク質の電気泳動分析。ピーク１に含まれ ていたタンパク質２００ｎｇおよび２００ｎｇの精製Ｒｓ−ＡＦＰ２を、ＳＤＳ −ＰＡＧＥゲル（高密度ファストゲル（Ｐｈａｓｔｇｅｌ）、ファルマシア）上 で電気泳動し、銀染色した。分子質量マーカーのサイズを左側にキロダルトンで 示す。 （Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗体を用いて行った、ピーク１ に含まれていたタンパク質のイムノブロット。各列に２００ｎｇの精製Ｒｓ−Ａ ＦＰ２またはピーク１に含まれていた精製タンパク質２００ｎｇを装填した。 （Ｄ）Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａに対する、水（陰性対照、左パネル）、 ５μｇ／ｍＬの精製Ｒｓ−ＡＦＰ２（中パネル）、またはピーク１に含まれてい た精製タンパク質５μｇ／ｍＬ（右パネル）のインビトロ抗真菌活性。２２℃で ２４時間のインキュベーション後にミクログラフを作成した。 図４は、真菌感染した際のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける植物デフェンシン の発現を示す； （Ａ）病原体処理した葉（１°）および感染植物の処理していない全身の葉（ ２°）における、ＰＤＦ１．２およびβ−ツブリン（β−ＴＵＢ）発現のＲＮＡ ゲルブロット分析。分析試料はすべて４μｇの全ＲＮＡである。 （Ｂ）抗原アフィニティー精製した抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗血清を用いるＥＬＩＳ Ａにより測定した、病原体処理した葉（丸）および感染植物の処理していない全 身の葉（四角）の植物デフェンシン（ＰＤＦ）含量。数値は３回の独立した測定 からの平均値（±標準偏差）である。 ５×１０⁵個／ｍＬのＡ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ胞子５μＬ（葉１枚につ き５滴）を接種した後、０時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時 間、７２時間および９６時間目に回収した、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの病原体処 理した葉および処理していない全身の葉から全ＲＮＡおよびタンパク質を単離し た。 図５は、化学処理した、および傷をつけた際のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉にお ける植物デフェンシンの誘導を示す； （Ａ）傷をつけた、または指示した化学薬品で処理した葉における、ＰＤＦ１ ．２およびβ−ツブリン（β−ＴＵＢ）発現のＲＮＡゲルブロット分析。分析試 料はすべて４μｇの全ＲＮＡである。 （Ｂ）抗原アフィニティー精製した抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗血清を用いるＥＬＩＳ Ａにより測定した植物デフェンシン（ＰＤＦ）含量。数値は３回の独立した測定 の平均値（±標準偏差）である。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉に５μＬ滴（葉１枚につき５滴）の水、ＳＡ（５ ｍＭ）、ＩＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）、パラカット（２５μＭ）、ローズベンガル（ ２０ｍＭ）、ジャスモン酸メチル（０．１％（ｖ／ｖ）エタノール中４５μＭ） 、または０．１％（ｖ／ｖ）エタノール（０．１％ＥｔＯＨ）を接種した。エチ レン処理は、エチレン濃度２０ｐｐｍの気密室内に植物を置くことにより実施さ れた。対照植物（空気）は、エチレンを含まない等しい室内でインキュベートさ れた。傷は小刀で葉に切り込みを入れることによりつけられた。葉の試料はすべ て処理開始の４８時間後に採集された。この実験を１回繰り返して、同様な結果 を得た。 図６は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型（Ｃｏｌ−０）、およびＳＡ信号伝達 経路が影響を受けたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体（ｎｐｒ１およびｃｐｒ１） における植物デフェンシンの誘導を示す； 図の左側部分は、ＰＤＦ１．２発現のＲＮＡゲルブロット分析を示す。試料は ４μｇの全ＲＮＡである。 右側部分は、抗原アフィニティー精製した抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗血清を用いるＥ ＬＩＳＡにより測定した植物デフェンシン（ＰＤＦ）含量を示す。数値は３回の 独立した測定の平均値（±標準偏差）である。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の下側ロゼット葉４枚に、５μＬ滴の胞子懸濁液 （５×１０⁵胞子／ｍＬ）を付与することにより、Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌ ａ（Ａ．ｂｒａｓ．）を接種した（葉１枚につき５滴）。対照植物を５μＬ滴の 水（Ｈ₂Ｏ）で同様に処理した。病原体処理した葉（１°）および同植物の処理 していない葉（２°）を接種の３日後に採集した。全ＲＮＡおよびタンパク質を 前記に従って抽出した（方法を参照）。この実験を２回繰り返して、同様な結果 を得た。 図７は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型（ｃｏｌ−０）、エチレン反応経路が 影響を受けたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体（ｅｉｎ２およびｅｔｒ１−３）、 およびジャスモナート反応経路が影響を受けた変異体（ｃｏｉ１）における植物 デフェンシンの誘導を示す； 図の左側部分は、ＰＤＦ１．２発現のＲＮＡゲルブロット分析を示す。試料は ４μｇの全ＲＮＡである。 右側部分は、抗原アフィニティー精製した抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗血清を用いるＥ ＬＩＳＡにより測定した植物デフェンシン（ＰＤＦ）含量を示す。数値は３回の 独立した測定の平均値（±標準偏差）である。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の下側ロゼット葉４枚に、５μＬ滴の胞子懸濁液 （５×１０⁵胞子／ｍＬ）を付与することにより、Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌ ａ（Ａ．ｂｒａｓ．）を接種した（葉１枚につき５滴）。対照植物を５μＬ滴の 水（Ｈ₂Ｏ）で同様に処理した。病原体処理した葉（１°）および同植物の処理 していない葉（２°）を接種の３日後に採集した。全ＲＮＡおよびタンパク質を 前記に従って抽出した（方法を参照）。この実験を２回繰り返して、同様な結果 を得た。 図８は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型（Ｃｏｌ−０）およびＡｒａｂｉｄｏ ｐｓｉs病変模倣変異体（ａｃｄ２）における植物デフェンシンの誘導を示す； （Ａ）ＰＤＦ１．２発現のＲＮＡゲルブロット分析。全ての分析試料は４μｇ の全ＲＮＡである。 （Ｂ）抗原アフィニティー精製した抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗血清を用いるＥＬＩＳ Ａにより測定した植物デフェンシン（ＰＤＦ）含量。数値は３回の独立した測定 の平均値（±標準偏差）である。 全ＲＮＡおよびタンパク質を、健康な不顕性の上側ロゼット葉（ＵＨ）および ５週令のａｃｄ２植物より採集した壊死病変を示している下側ロゼット葉（ＬＮ ）、ならびに等しい条件下で生育させた対照植物（Ｃｏｌ−０）より採集した健 康な上側ロゼット葉（ＵＨ）および下側ロゼット葉（ＬＨ）から単離した。この 実験を２回繰り返して、同様な結果を得た。 図９は、２つの別個の経路、すなわちサリチル酸依存型経路ならびにジャスモ ナートおよび／またはエチレン依存型経路による、防御関連遺伝子の誘導につき 提示されたモデルである。 図１０は、病原体ストレスを受けたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物においてＰＤ Ｆ１．２遺伝子が活性化された際の、エチレン信号とジャスモナート信号の相互 作用に関する３つの代替モデルを示す。 図１１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型植物（Ｃｏｌ−０、上側パネル）お よびエチレン非感受性変異体（ｅｉｎ２、下側パネル）において、Ａｌｔｅｒｎ ａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａを接種(中実記号)または水を擬似接種(中 空記号)した際の、ジャスモン酸濃度の時間経過を示す。各データ点は、それぞ れ３植物２組に関する２回の別個の実験の平均である。 図１２は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型植物（Ｃｏｌ−０、上側パネル）お よびジャスモナート非感受性変異体（ｃｏｉ１、下側パネル）において、Ａｌｔ ｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａを接種（中実記号）または水を擬似 接種（中空記号）した際の、エチレン産生量の時間経過を示す。Ｃｏｌ−０に関 するデータは、各時点につき２植物を用いた３回の独立した実験の平均である。 ｃｏｉ１に関するデータは、各時点につき２植物を用いた１回の実験で得たもの である。 図１３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型植物（Ｃｏｌ−０）およびエチレン 非感受性変異体（ｅｉｎ２）において、０．１％エタノール（対照）または０． １％エタノール中の５０μＭジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）で処理した際の、 植物デフェンシン（ＰＤＦ）誘導を示す。 図１４は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＰＤＦ１．２遺伝子のヌクレオチド配列 を示す。四角で囲ったヌクレオチドは、発現配列標識Ｔ０４３２３の第１ヌクレ オチドである。この遺伝子産物のアミノ酸を、コード領域の対応するコドンの下 に示す。イントロンを小文字で示す。 図１５は、トランスジェニックｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳ Ａｒａｂ ｉｄｏｐｓｉｓ植物において、Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ接種（擬似または 胞子接種）またはＢ．ｃｉｎｅｒｅａ接種（擬似または胞子接種）した際のβ− グルクロニダーゼ活性を示す。同じ植物の処理した葉（１°）および処理してい ない葉（２°）を処理の３日後に採集した。結果を２植物４組の平均±標準偏差 として表示する。 図１６は、トランスジェニックｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳ Ａｒａｂ ｉｄｏｐｓｉｓ植物（パネルＡ）およびトランスジェニックｐＢｇｌ２−ＧＵＳ −ｔＮＯＳ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（パネルＢ）において、種々の化学物 質で処理した際のβ−グルクロニダーゼ活性を示す。処理した葉の試料を、処理 の４８時間後に採集した。結果を、別個に収穫した４植物の平均±標準偏差とし て表示する。 図１７は、タバコモザイクウイルス接種または擬似接種したトランスジェニッ クｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳタバコ（ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉ−ｎｃ）植物 におけるβ−グルクロニダーゼ活性を示す。最も若い完全に広がった葉のすぐ下 の葉にウイルス接種または擬似接種した。これらの葉（１°）、最も若い完全に 広がった葉（２°）および最も若い完全に広がった葉のすぐ下の葉（３°）を別 個に、処理後２日目（黒色の棒）、４日目（淡灰色の棒）および６日目（濃灰色 の棒）に収穫した。 図１８は、タバコモザイクウイルス接種または擬似接種したトランスジェニッ クｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳタバコ（ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉ−ｎｃ）植物 において、傷をつけた、または種々の化学物質で処理した際の、β−グルクロニ ダーゼ活性を示す。処理した葉の試料を処理の４８時間後に収穫した。 図１９は、トランスジェニックｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳ Ａｒａｂ ｉｄｏｐｓｉｓ植物において、２５ｐｐｍエチレンに暴露した際、０．５μＭジ ャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ，０．１％エタノール中）、３３３μＭエテホン、 ２５ｐｐｍエチレン＋０．５μＭジャスモン酸メチル、３３３μＭエテホン＋０ ．５μＭジャスモン酸メチルで処理した際、ならびに適切に対照処理した際、す なわち空気暴露および水および０．１％エタノール処理した際の、β−グルクロ ニダーゼ活性を示す。 図２０は、真菌性病原体Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ接種後のＡｒａｂ ｉｄｏｐｓｉｓ野生型植物（Ｃｏｌ−０、丸）、エチレン非感受性変異体（ｅｉ ｎ２、三角）およびジャスモナート非感受性変異体（ｃｏｉ１、四角）の衰退を 示す。データは、各植物系列につき２０の一連の植物につき行った４回の独立し た実験（Ｃｏｌ−０およびｅｉｎ２）および３回の独立した実験（ｃｏｉ１）の 平均（標準偏差付き）である。 図２１は、接種したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型植物（Ｃｏｌ−０）ならび にｅｉｎ２、ｃｏｉ１およびｎｐｒ１変異体の葉における、真菌Ｐｅｒｏｎｏｓ ｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｐａｔｈｏｖａｒ Ｗｅｌａの菌糸構造体の ラクトフェノール／トリパンブルー染色を示す。 方法 生物材料 変異体ｎｐｒ１（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４）およびｃｐｒ１（Ｂｏｗ ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）はＤｒ．Ｘ．Ｄｏｎｇ（デューク大学、米 国ノースカロライナ州ダーラム）により提供された。エチレン反応変異体ｅｉｎ ２（Ｇｕｚｍａｎ ａｎｄ Ｅｃｋｅｒ，１９９０）およびｅｔｒ１−３（Ｂ１ ｅｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ）はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓバイオロジカル・リソース・センター（米国オハイ オ州）から得られ（それぞれ受託番号ＣＳ３０７１およびＣＳ３０７０）、病変 模倣変異体ａｃｄ２（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）はＤｒ． Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌ（マサチュセッツ・ゼネラル・ホスピタル、米国ボストン）によ り提供された。ジャスモナート反応変異体ｃｏｉｌ（Ｆｅｙｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４）はＤｒ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ（イースト・アングリア大学、英国ノリッ ジ）から得られた。この変異体は劣性であり、雄性不妊を生じるので、ｃｏｉ１ 変異体は自己増殖ＣＯＩ１／ｃｏｉ１半接合体植物から得た種子より生育させた Ｆ２植物中に実際的観察により同定された。したがってＦ２集団に後記に示すよ うな種々の処理を施し、各個体から別個に葉を採集し、種子が実るまで植物をさ らに生育させた。長角果を形成しない個体はｃｏｉ１／ｃｏｉ１遺伝子型をもつ と同定された。病害検定に用いたｃｏｉ１変異体は、インビトロで５０μＭジャ スモン酸メチルの存在下に発芽させた若い実生の根の長さに基づいて予め選択さ れた。前記の変異体系列はすべてコロンビア（Ｃｏｌ−０）生態型に由来する。 真菌Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ（ＭＵＣＬ ２０２９７；Ｍｙｃｏｔｈｅｑ ｕｅ Ｕｎｉｘｅｒｓｉｔｅ Ｃａｔｈｏｌｉｑｕｅ ｄｅ Ｌｏｕｖａｉｎ） Ｌｏｕｖａｉｎ−ｌａ−Ｎｅｕｖｅ、ベルギー）の生育および胞子の収穫は、先 の記載に従って行われた（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。 植物生育条件、化学物質の適用、および接種 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子をペトリ皿内で、マクロ栄養素補給剤（Ａｓｅｆ ．Ｄｉｄａｍ、オランダ）を含む植木鉢用配合土にまいた。播種後、４℃で２日 間、春化処理した。生育室内で５日間保温した（昼間温度２０℃、夜間温度１８ ℃、光子束密度１００μＥｍ^-2ｓ^-1で１２時間の日照時間）後、マクロ栄養素を 補給した植木鉢用配合土を入れた植木鉢（５×４×４ｃｍ）に実生を移し、前記 と同じ条件下で生育させた。植木鉢を乗せたトレーに水道水を注いだ。中心葉脈 に傷をつけないように注意して、ピンセットで押しつぶすことにより、または小 刀で縁に切り込みをいれることにより、葉に傷をつけた。パラカット（２５μＭ ）、ローズベンガル（２０ｍＭ）、ジャスモン酸メチル（０．１％（ｖ／ｖ）エ タノール中４５μＭ）、０．１％（ｖ／ｖ）エタノール、サリチル酸ナトリウム （５ｍＭ）およびＩＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ湿潤性粉末中２５％の有効成分、Ｄｒ． Ｈ．Ｋｅｓｓｍａｎにより提供、ノバルティス、スイス、バーゼル）を、かっこ 内に 示した濃度で５μＬ滴として葉に適用した（葉１枚につき５滴）。ジャスモン酸 メチルの原液は、エタノール中４５ｍＭであった。エチレン処理は、植木鉢を半 透明気密室内に置き、ここにシリコンゴム製隔壁を介してエチレンガスを注入す ることにより行われた。室内のエチレン濃度をガスクロマトグラフィーにより確 認した。エチレン実験の対照植物を、エチレンを含まない等しい室内に置いた。 Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａの接種は、５μＬ滴の胞子懸濁液（密度５×１０⁵ 胞子／ｍＬ蒸留水中）を下側ロゼット葉４枚に適用することにより行われた（ 葉１枚につき５滴）。対照植物を同様に水滴で処理した。胞子懸濁液滴または水 滴を含む植物をランダムに（種々の遺伝子型を同時に処理する場合）、透明なポ リスチレン蓋を備えたプロパゲーター平箱に入れ、菌糸発芽による感染を促進す るために２日間、高湿に維持した。次いで蓋をとり、葉材料を収穫するまでさら に植物を保温した。ここで用いたＡ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａの分離株および 接種条件で、接種後４８時間以内に胞子懸濁液滴の下に限定された褐色壊死病変 が起き、これらの病変はそれ以上は拡散しなかった。 ＲＮＡブロット分析 液体窒素中で凍結させて−８０℃に保存した組織から、Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔら （１９９６）に従ってフェノール／ＬｉＣｌ法によりＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ 試料を各列４μｇずつホルムアルデヒド−アガロースゲルに装填し、正に帯電し たナイロン膜（ベーリンガー・マンハイム、ドイツ、マンハイム）上に、２０× ＳＳＣを用いてキャピラリーで移すことによりブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。ＲＮＡが等量ずつ移されたことを確認するために 、装填用緩衝液に５０μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを補充し、ＵＶ照射に際して ゲルおよびブロット上でＲＮＡが見えるようにした。両面を５分間ずつＵＶ照射 することにより、ＲＮＡをブロット上で架橋させた。ブロットをプレハイブリダ イズし、ジゴキシゲニン標識アンチセンスＲＮＡプローブとハイブリダイズさせ 、先に記載されたように免疫化学ルミネセンスにより現像した（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ジゴキシゲニン標識プローブは、ベーリンガー・マ ンハイムのＤｉｇ ＲＮＡ標識キットを用いるランオフ転写により調製された。 Ｐ ＤＦ１．２プローブは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、およびGenebank受託番号 Ｔ０４３２３の発現配列標識を含むＥｃｏＲＩ直線化プラスミドｐＺＬ１（ＢＲ Ｌライフ・テクノロジーズ、米国マリーランド州ゲイザースバーグ）を用いて合 成された。チューブリンβ−１鎖遺伝子のプローブは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー ゼ、およびGenebank受託番号Ｚ２６１９１の発現配列標識を含むＥｃｏＲＩ直線 化プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ(ストラタジーン、米国カリ フォルニア州ラヨラ)を用いて合成された。両プラスミドともＡｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓバイオロジカル・リソース・センター（米国オハイオ州コロンブス）から 得られた。種々のプローブを用いて分析した試料を複製ゲル上で走行させ、これ らを別個に現像した。 逆転写ＰＣＲ 全ＲＮＡ（１００ｍＭ酢酸ナトリウム／５ｍＭ ＭｇＳＯ₄（ｐＨ５．０）中 １μｇ）を３７℃において５分間、６単位の無ＲＮアーゼ-ＤＮアーゼＩ（ベー リンガー・マンハイム）で処理した後、９５℃に５分間加熱することによりＤＮ アーゼを不活性化した。０．２Ｍ酢酸ナトリウムおよび６６％（ｖ／ｖ）エタノ ールの存在下で一夜ＲＮＡを沈殿させ、１０００Ｘｇで１０分間の遠心により採 集し、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで２回洗浄し、最後に無ＲＮアーゼー水に溶 解した。１μｇのＤＮアーゼ処理−全ＲＮＡにつき１０単位のニワトリ骨髄芽細 胞腫（ｍｙｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ）ウイルス逆転写酵素（ファルマシア、スウェ ーデン、ウプサラ）により５２℃６０分間、逆転写反応を行った。逆転写反応を ホモポリマー型デオキシチミジンオリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ）につき行 い、Ｎａ−ＥＤＴＡを最終濃度１５ｍＭになるように添加することにより停止し た。５０μＬ中に逆転写反応液１画分（１／３０）を鋳型として使用し、２．５ 単位のＴａｑポリメラーゼ（アプリジーン（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ）、プレザント ン、米国カリフォルニア州）を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従っ てＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、ＰＤＦ１．１、ＰＤＦ１．２およびＡＣＴＩ Ｎ−１に特異的なプライマー対を用いる増幅につきそれぞれ５５℃、６５℃およ び６５℃のアニーリング温度で３０サイクル行われた。 ＰＤＦ１．１の増幅に用いたプライマーは以下のものであった： ＯＷＢ２６０（センス５’−ＧＡＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ ＧＧＣＣＡＡＧＴＧＧＧ−３’）；および ＯＷＢ２５９（アンチセンス５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴ ＣＣＡＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＴ−３’） ＰＤＦ１．２の増幅に用いたプライマーは以下のものであった： ＯＷＢ２４０（センス５’−ＡＡＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＴＴＴ ＧＣＴＴＣＣ−３’）；および ＯＷＢ２４１（アンチセンス５’−ＡＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＡＣＧＡ ＴＴＴＡＧＣＡＣＣ−３’） ＡＣＴＩＮ−１の増幅に用いたプライマーは以下のものであった： ＯＷＢ２７０（センス５’−ＧＧＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＧ −３’）；および ＯＷＢ２７１（アンチセンス５’−ＧＧＴＣＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＡ ＡＧＡＣＧ−３’） Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ感染したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉からの植物デ フェンシンの精製 ５週令のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の葉に５μＬ滴の蒸留Ｈ₂Ｏ（対照）ま たはＡ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ胞子懸濁液（５×１０⁵胞子／ｍＬ、Ｈ₂Ｏ中 ）を接種し、接種後３日間、透明なポリスチレン製蓋を備えた湿潤プロパゲータ ー平箱内で保温した後、採集した。Ｈ₂Ｏ処理した葉または接種した葉２０ｇか ら抽出物を調製し、先にＴｅｒｒａｓら（１９９５）が記載したとおりの精製処 理を行った。タンパク質測定、インビトロ抗真菌活性測定、およびプレキャスト したファストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ）高密度ゲル（ファルマシア）上でのＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ分析を、先の記載（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）に従 って行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析前に、タンパク質試料をＴｅｒｒａｓら（１ ９９２）に従ってジチオエリトリトールで還元し、Ｓ−ピリジルエチル化した。 １５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離したタンパク質のイムノブロ ッティングを、Ｔｅｒｒａｓら（１９９５）の記載に従って行った。 ＥＬＩＳＡ分析 凍結した葉材料から抽出用緩衝液（１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄，１５ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄，１００ｍＭ ＫＣｌ，１．５％（ｗ／ｖ）ポリビニルポリピロリドン ，ｐＨ７）中ヘタンパク質を単離した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）に従って 、ウシ血清アルブミンを標準品として用いて粗抽出物中のタンパク質濃度を測定 した。抽出物を熱処理（１０分、８０℃）した後、熱安定可溶性タンパク質画分 を競合的ＥＬＩＳＡにより分析した。 ＥＬＩＳＡミクロタイタープレート（グライナー・レイバーテクニック）をコ ーティング用緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ₂ＣＯ₃，３５ｍＭ ＮａＨＣＯ₃，ｐＨ９ ．６）中の１００ｎｇ／ｍＬ Ｒｓ−ＡＦＰ２により３７℃で２時間コーティン グした。コーティングされなかった部位をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中 の３％（ｗ／ｖ）非放射性魚類皮膚ゼラチン（シグマ）でブロックした（２時間 、３７℃）。アフィニティー精製した一次抗体を、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイー ン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有ＰＢＳ中の０．３％（ｗ／ｖ)ゼラチンで５０倍希釈 し、試料用緩衝液中に希釈した等容量（５０μＬ）の試料と同時にウェルに装入 した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）ツイ ーン２０含有ＰＢＳで数回洗浄した後、プレートウェルに、０．０５％（ｖ／ｖ ）ツイーン２０含有ＰＢＳ中の０．３％（ｗ／ｖ）ゼラチンで１０００倍希釈し た二次抗体（アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体、シグマ・イ ムノ・ケミカルズ）を装填した（ウェル当たり１００μＬ）。プレートを３７℃ で１時間インキュベートした。基質用緩衝液（２０ｍＭ Ｎａ₂ＣＯ₃，３５ｍＭ ＮａＨＣＯ₃，５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，ｐＨ９．６）中１ｍｇ／ｍＬ濃度の基質リ ン酸４−ニトロフェニル（ヤンセン・キミカ、ベルギー、ベールゼ）を用い、３ ７℃で３０〜６０分間インキュベートした後、４５０ｎｍでの吸収測定によりア ルカリホスファターゼ活性を測定した。タンパク質試料を三重試験用に調製した ４倍希釈系列で適用し、標準品としての精製Ｒｓ−ＡＦＰ１（Ｔｅｒｒａｓ ｅ ｔ ａ１．，１９９２）の２倍希釈系列と比較して植物デフェンシン濃度を測定 した。 抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗血清のアフィニティー精製は以下により行われた。等容量 の１００ｍＭ ３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７）中２０ ｍｇ／ｍＬの精製Ｒｓ−ＡＦＰ１と、水中で平衡化したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０ マトリックス（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ、米国カリフォルニア州ハーキ ュレス）とを混合することにより、抗原アフィニティーカラムを調製した。この スラリーを、緩和に連続撹拌しながら４℃で一夜インキュベートした。マトリッ クスの未反応部位を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８）０．０２５容量の添加によ りブロックした後、カラムを１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭグリシ ン（ｐＨ２．５）、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．８）および１００ｍＭトリエチル アミン（ｐＨ１１．５）で洗浄し、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で平衡化した 。ウサギ抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗血清（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を イムノ・ピュア・ジェントル（Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ Ｇｅｎｔｌｅ）Ａｇ／ Ａｂ結合用緩衝液（パース・ケミカル・カンパニー、米国イリノイ州ロックフォ ード）中に２倍希釈し、アフィニティーカラムに数回導通した。カラムを１５容 量のイムノピュア・ジェントルＡｇ／Ａｂ結合用緩衝液で洗浄した後、精製され た抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗体をイムノピュア・ジェントルＡｇ／Ａｂ溶離用緩衝液（ パース・ケミカル・カンパニー）で溶離した。２８０ｎｍでの吸収を測定するこ とにより、結合抗体の溶出を監視した。溶出画分をＰＢＳに対し一夜透析した。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＰＤＦ１．２遺伝子のプロモーター領域の増幅、クロ ーニングおよびＤＮＡ配列分析 逆方向ポリメラーゼ連鎖反応に基づく方法（この方法の詳細についてはＧａｓ ｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２参照）を用いて、ＰＤＦ１．２遺伝子の５’側調 節配列を増幅した。ＰＤＦ１．２ ｃＤＮＡに対応するGenebank受託番号Ｔ０４ ３２３の発現配列標識（ＥＳＴ）のＤＮＡ配列を用いて、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓゲノムに由来する５’側ゲノムフランキング配列の増幅用プライマーを設計し た。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ生態型Ｃｏｌ−０の約８週令植物より得た新鮮な葉 １０ｇから、Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａらの方法（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ ｅｔ ａ ｌ．）で全ゲノムＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、０．７５ｍｇ／ｍｌの臭 化エチジウムを含有するＣｓＣｌ溶液に最終濃度１．５５ｇ／ｍｌに再懸濁し、 ４５，０００ｒｐｍで遠心することにより、さらに精製した。バンド形成したＤ ＮＡを次いで遠心管から注射器で取り出し、イソアミルアルコールに対し分配す ることにより臭化エチジウムを除去し、次いでＤＮＡをエタノールで沈殿させた 。沈殿したＤＮＡを水に溶解し、１２０ｎｇを１０単位の制限酵素Ｓｐｈ１によ り４０μｌの反応において３７℃で１時間消化した。ＥＳＴ Ｔ０４３２３は内 部Ｓｐｈ１部位をもつ（塩基１７４〜１７９）ことが知られている。したがって この酵素を用いて、ｃＤＮＡの最初の１７８塩基、介在配列、およびゲノムＤＮ Ａ中における第１のＳｐｈ１部位に対しＥＳＴ配列の上流の５’側配列を含むと 思われるゲノムフラグメントを切り取った。６５℃で１０分間、反応を熱不活性 化し、短時間遠心し、上清からエタノールでＤＮＡを沈殿させた。次いで約３０ ｎｇの消化ＤＮＡを、１４℃で一夜、標準的な５０μｌの反応において、１単位 のＴ４ ＤＮＡリガーゼおよび酵素供給業者（ベーリンガー・マンハイム）が供 給する緩衝液を用いて、自己連結させた。６５℃で１０分間の加熱により連結反 応を停止し、短時間遠心し、上清からエタノールでＤＮＡを沈殿させた。次いで 鋳型として１０ｎｇの連結ＤＮＡ試料を、２００μＭのｄＮＴＰおよび各１μＭ の下記プライマーを含有する５０μｌポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に添加し た： ＯＷＢ２５７［５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣ ＣＡＣＣＡＴＴＧＣ−３’、ＢａｍＨＩ部位に下線を施した］および ＯＷＢ２５６［５’−ＧＡＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＴＧＧＧＡ ＣＡＴＧＧＴＣＡＧＧ−３’、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を施した］。 これらのプライマーは、それぞれＥＳＴ Ｔ０４３２３配列の位置１０４〜１２ ７および１３３〜１５６の配列に対応するが、逆方向であり、末端Ｓｐｈ１部位 にゲノムフラグメントの自己連結によりフランキング配列が並置した場合にのみ 増幅するであろう。ＰＣＲ反応物は、１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（反 応が最初の熱サイクルで９５℃に達した時点で添加）、および供給業者（アプリ ジーン社）が推奨する反応緩衝液を含有していた。ＰＣＲ反応物に以下の熱サイ クル方式を施した。最初に９５℃に４分間加熱し、その間にＴａｑポリメラーゼ 酵素を添加し、次いで９５℃で３０秒、５６℃（アニーリング温度）で２分、お よび７２℃で１分を３０サイクル、そして９５℃で３０秒、５６℃で２分、およ び７２℃で１０分の最終サイクルを行った。この反応の０．０５μｌに等しい試 料を鋳型として第２ＰＣＲ反応に添加した。これはゲノムＤＮＡを添加せず、プ ライマーＯＷＢ２５７の代わりに入れ子型プライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍ ｅｒ）ＯＷＢ２５５［５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＧＡ ＧＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧ−３’、ＢａｍＨＩ部位に下線を施した］を添加 した点以外は同じであった。プライマ−ＯＷＢ２５５はＴ０４３２３配列の位置 ６７〜９１に対応する。この反応には、５６℃の工程を５８℃に高めた点以外は 同じ熱サイクル方式を施した。サイズ約１．３ｋｂおよび０．８ｋｂの２ＤＮＡ フラグメントを得た。大きい方のバンドをアガロースゲルから単離し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで予備消化 したｐＥＭＢＬ１８＋に連結させた。このクローンをｐＪＭｉＰＣＲ−１ｔと命 名した。この挿入断片を、ジデオキシヌクレオチドターミネーターならびにＭ１ ３正プライマーおよびＭ１３逆プライマーにより部分的に配列決定した。これら の部分配列から、この挿入断片はＥＳＴ Ｔ０４３２３配列から存在が予想され たものと等しい配列を含むことが明らかになり、自己連結に用いたＳｐｈ１制限 部位に隣接する部分配列が同定された。次いで、ＰＤＦ１．２遺伝子の５’側プ ロモーター領域に位置する配列を含むことが予想されるｐＪＭｉＰＣＲ−１ｔ挿 入断片中のＳｐｈ１部位に隣接する配列に対するオリゴヌクレオチドプライマー を設計した。このプライマーをＯＷＢ２７３［５’−ＡＡＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴ ＧＣＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＣＣ−３’、ＨｉｎｄＩＩＩ 部位に下線を施した］と命名した。このプライマーを、ＥＳＴ Ｔ０４３２３配 列の位置２９２〜３２６に対応する配列を含むプライマ−ＯＷＢ２７６［５’− ＧＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＣＧＡＴＴ ＴＡＧＣＡＣＣ−３’、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を施した］と組み合わせてＰ ＣＲ反応に用いた。逆ＰＣＲ反応に適正に増幅されたＰＤＦ１．２遺伝子５’側 上流配列が含まれる場合、これらのプライマーはゲノムＤＮＡから、Ｔ０４３２ ３配列の位置３２６の５’側にあるすべてのＰＤＦ１．２遺伝子配列を増幅する はずであり、この領域は５’側上流プロモーター領域のＳｐｈ１部位まで延長す るはずである。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ生態型Ｃｏｌ−０の無傷ゲノムＤＮＡ１ ０ｎｇを鋳型として用い、これら上記プライマーによりアニーリング温度として ５８℃を用いて、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲにより、ゲル電気泳動により 判定したサイズ約１．６ｋｂの単一フラグメントを得た。このバンドをゲルから 切り取り、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断および脱リン酸化した ｐＥＭＢＬ１８＋に連結させた。このクローンをｐＦＡＪ３０８５と命名し、蛍 光標識ジデオキシヌクレオチドターミネーターおよびアプライド・バイオシステ ムズ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーを用いて、この挿入断片のオーバーラップ を含めた両鎖を完全に配列決定した。 ＰＤＦ１．２プロモーター−リポーター構築体の構築、ならびにＡｒａｂｉｄｏ ｐｓｉｓおよびタバコの形質転換 プライマ−ＯＷＢ２７２［５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡ ＧＣＡＡＡＣＴＴＡＧＣＣＡＴＧ−３’、ＢａｍＨＩ部位に下線を施した］およ びＯＷＢ２７３を用いて、ＰＤＦ１．２遺伝予のプロモーターフラグメントおよ びコード配列の一部（ｐＦＡＪ３０８５挿入断片の位置１〜１２５４）を増幅し た。この反応は、１ｎｇのｐＦＡＪ３０８５を鋳型として用い、前記に従ってア ニーリング温度５６℃を用いて行われた。予想したフラグメントサイズが得られ 、これをゲル精製した。このフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩの 両方で消化し、次いで市販の２成分ベクタープラスミドｐＢＩ１０１．３（クロ ーンテク社）に連結させた。このベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを中間宿主として用いて植物に伝達できるＴ−ＤＮＡ領域 を含む。Ｔ−ＤＮＡは、植物細胞中で発現した際にカナマイシン耐性を与える選 択性マーカー遺伝子を含む。さらに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ｉ）由来のＵｉｄＡシストロンのコード領域（酵素β−グルクロニダーゼまたは ＧＵＳをコードする）のすぐ５’側に位置するＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ 部位を含むポリリンカーがあり、続いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ由来のノパリンシンターゼ遺伝子（ｔＮＯＳ）のターミネーター がある。ＯＷＢ２７２およびＯＷＢ２７３により増幅したＰＤＦ１．２遺伝子の プロ モーター（ｐＰＤＦ１．２）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ消化したものをこの 領域に挿入すると、遺伝子が融合する。その際、ＰＤＦ１．２遺伝子の推定正常 翻訳開始コドン（ｐＦＡＪ３０８５の位置１２３３〜１２３５）において翻訳が 開始すると、以下のＮ−末端配列をもつＧＵＳ融合タンパク質が生成すると予想 される：ＭＡＫＦＡＳＩＲＩＰＧＹＧＱＳＬＭ。ここで下線を施したアミノ酸残 基は最初の７個のＮ−末端ＰＤＦ１．２コドンに由来し、活字体はｐＢＩ１０１ ．３ベクターのリンカー領域でコードされるアミノ酸を示し、最後のイタリック 体のＭ残基はＵｉｄＡシストロンによりコードされるＧＵＳ酵素のＮ末端残基で ある。キメラｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳ遺伝子を含むこのベクターを、 ｐＦＡＪ３０８６と命名する。ｐＦＡＪ３０８６中のこの挿入断片を、ＯＷＢ２ ７３および市販のプライマー［ＧＵＳシークエンシングプライマー、クローンテ ク社、５’−ＴＣＡＣＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣ−３’］を用いて再増 幅し、このＰＣＲ生成物の末端配列を直接に配列決定して、ＰＤＦ１．２遺伝子 の配列が適正に取り込まれたことを確認した。 次いで接合促進のためにベクターｐＲＫ２０１３を含む大腸菌ＨＢ１０１株を 用いる三親交配により、プラスミドｐＦＡＪ３０８６をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４に伝達した（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．）。ｐＦＡＪ３０８６ベクターを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株を用 いて、Ｎｉｃｏｔｉｎｉａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉ−ｎｃの葉の 外植片を葉ディスク法により形質転換し（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．）、Ａｒ ａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ生態型Ｃ２４を根の外植片を用いて形質 転換した（Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．）。 病害のアッセイ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、以下によりＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒ ｅａの病害アッセイを行った。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を生育室（２２℃、 光子束密度８０μＥｍ^-2ｓ^-1での光周期１４時間、相対湿度７０％）内で植木鉢 用配合土に生育させた。播種の３週間後、広がった葉をすべて針で刺すことによ り傷つけた（葉１枚につき３回穿刺）。傷つけた部位を、半濃度ジャガイモデ キストロースブロス（ディフコ）中のＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ懸濁液 （胞子１０⁵個／ｍｌ）５μＬ滴で覆った。接種したこれらの植物をランダムに 、透明なポリスチレン製蓋を備えたプロパゲーター平箱に入れ、前記のように保 温した。ただし光子束密度を５０μＥｍ^-2ｓ^-1に低下させた。２日後、蓋をとり 、植物を同じ条件下でさらに保温した。生長点および最も若い葉を含む幹が完全 に腐った場合、植物は枯死したとみなした。 Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａに対するＡｒａｂｉｄｏｐｓ ｉｓの罹患性を、以下により試験した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ生態型Ｗｅｉｎ ｉｎｇｅｎの感染した葉を水中で軽く振とうすることにより、Ｐ．ｐａｒａｓｉ ｔｉｃａ ｐａｔｈｏｖａｒ Ｗｅｌａの分生胞予を採集した。分生胞子懸濁液 を１０⁵胞子／ｍｌに調整し、４週令の植物に塗料用スプレーで吹き付けた。接 種したこれらの植物をランダムに、透明なポリスチレン製蓋を備えたプロパゲー ター平箱に入れ、２０℃で７日間、光周期８時間、光子束密度８０μＥｍ^-2ｓ^-1 で保温した。ラクトフェノール／コットンブルー染色法で葉の真菌構造体を染色 することにより、病害の伝播を調べた（Ｋｅｏｇｈ ｅｔ ａｌ．）。実施例１ 病原体ストレスを受けたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉における、抗真菌活性をも つ植物デフェンシンの蓄積 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉において病原体誘導された植物デフェンシンが生 物学的に活性であるか否かを調べるために、本発明者らは、真菌感染したラディ ッシュの葉からＲｓ−ＡＦＰ３およびＲｓ−ＡＦＰ４を精製するために先に開発 した方法でタンパク質を精製することを試みた（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。要約するとこの精製方法は、粗製の葉タンパク質抽出物をｐＨ７． ５のアニオン交換カラムに導通し、結合しなかったタンパク質をｐＨ５．５のカ チオン交換カラムに導通し、結合したタンパク質を高いイオン濃度で溶離し、最 後に溶出タンパク質を逆相クロマトグラフィーカラムで分離することからなる。 接種していないＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の葉から得たタンパク質の逆相クロ マトグラムをＡ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ接種した葉から得たタンパク質のも のと比較すると、後者のみに存在するピークが確認される（図３Ａのピーク１） 。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、このピーク画分のタンパク質はＲｓ−ＡＦＰ１ と共に移動する単一の５ｋＤａのバンドとして走行することが示された（図３Ｂ および３Ｃ）。このタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから調製して抗Ｒｓ− ＡＦＰ１抗血清で現像したイムノブロットにおいて、Ｒｓ−ＡＦＰ１として良好 に識別された（図３Ｃ）。さらに、ピーク１画分のタンパク質はインビトロでＡ ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａの生育（図３Ｄ）およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌ ｍｏｒｕｍの生育（結果は示されていない）を阻害することが証明された。この 生育阻害は、Ｒｓ−ＡＦＰ１（図３Ｄ）、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子か らのＰＤＦ１．１（以前はＡｔ−ＡＦＰ１と呼ばれた）を含めた、他のＢｒａｓ ｓｉｃａｃｅａｅからの関連植物デフェンシンにみられるように、菌糸の過剰分 岐および先端膨潤を特色としていた（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３） 。実施例２ 病原体ストレスを受けた際のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物デフェンシンの全身誘 導 本発明者らは先に、ラディッシュの葉の植物デフェンシン遺伝子がＡ．ｂｒａ ｓｓｉｃｉｃｏｌａの局部感染に際し全身的に誘導されることを示した（Ｔｅｒ ｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。これがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにも当ては まるか否かを調べるために、Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ感染したＡｒａｂｉ ｄｏｐｓｉｓの葉および感染植物の未処理葉（全身の葉）における植物デフェン シン誘導を、ＥＬＩＳＡ（抗原アフィニティー精製した抗Ｒｓ−ＡＦＰ１抗血清 を使用）と、ＲＮＡゲルブロット分析（デフェンシンに対するプローブとしてＰ ＤＦ１．２を使用）の両方により分析した。タンパク質濃度においては、植物デ フェンシンは接種直前のサンプリング時点の検出限界未満の量（０．０５μｇ／ ｍｇ全可溶性タンパク質）から、接種７２時間後の病原体処理した葉および処理 していない全身の葉における、それぞれ最高１０および３μｇ／ｍｇ（全可溶性 タンパク質）にまで上昇することが認められた（図４Ａ）。定常状態のデフェン シンｍＲＮ量は病原体処理した葉および処理していない全身の葉の両方において 接種後に上昇し、ｍＲＮＡ量はこれら両方の葉の試料において接種の４８時間後 に最高に達した（図４Ｂ）。実施例３ 化学処理に際してのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物デフェンシンの誘導 病原体ストレスを受けた際に全身的に誘導されるこれまでに研究された遺伝子 の大部分は、少なくとも一部はサリチル酸（ＳＡ）、またはＳＡの作用を模倣す る合成化合物２，６−ジクロロイソニコチン酸（ＩＮＡ）により誘導できる（Ｗ ａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいては、ＰＲ −１、ＰＲ−２およびＰＲ−３がＳＡおよびＩＮＡの両方の処理によって強く誘 導されることが示されている（Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．）。しかし植物デフェ ンシン遺伝子発現の誘導は、ＲＮＡブロット分析またはＥＬＩＳＡのいずれによ り評価しても、ＳＡまたはＩＮＡ処理に際してはみられなかった（図５）。これ に対し、エチレンまたはジャスモン酸メチルを適用すると、植物デフェンシン遺 伝子発現量が有意に増加した。適切な対照処理、すなわち空気中での保温（エチ レンに対する対照）または０．１％（ｖ／ｖ）エタノールの適用（ジャスモン酸 メチルに対する溶剤対照）では、植物デフェンシン遺伝予発現の上昇は検出され なかった。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＰＲタンパク質遺伝予（ＰＲ−１、 ＰＲ−２、ＰＲ−３）の発現がエチレン処理に反応しないことは、先に示されて いる（Ｌａｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。これらのデータをまとめると 、植物デフェンシン遺伝子とＰＲタンパク質遺伝子が異なる群の化学物質により 誘導されることが示される。 化学物質パラカットおよびローズベンガルも、それらが植物デフェンシン遺伝 子発現に与える影響につき試験された。植物をパラカットまたはローズベンガル で処理すると、それぞれ反応性酸素種である超酸化物アニオンおよび一重項酸素 を形成し（Ｂｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｆｌ ｕｈｒ，１９９５）、したがって酸化的ストレスを与えることが知られている。 植物デフェンシンタンパク質およびｍＲＮＡは、パラカットまたはローズベンガ ルによって強く誘導された（図５）。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉を傷つけても、処理の４８時間後に評価した場合 、検出できる量の植物デフェンシンｍＲＮＡは蓄積しなかった（図５）。多数の 傷 害誘導性遺伝子が処理後比較的短期間で一時的に作動することが知られているの で（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１ ９９３）、本発明者らは植物デフェンシン遺伝子の発現も、傷をつけた後３、６ 、９、１２、２４および４８時間目にＲＮＡブロット分析およびＥＬＩＳＡの両 方により確認した。しかし、傷が葉に小刀で切り込みをいれることによりつけら れたか、またはピンセットで葉を押しつぶすことによりつけられたかに関係なく 、いずれの分析時点でも植物デフェンシン遺伝子の発現を検出できなかった（結 果は示されていない）。実施例４ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける植物デフェンシンの全身誘導はジャスモナート および／またはエチレン依存型経路による ＳＡおよびＩＮＡは植物デフェンシン合成を誘導できなかったので、本発明者 らは真菌感染による植物デフェンシン誘導におけるＳＡの役割を調べた。したが って本発明者らは、ＳＡ信号伝達経路が遺伝的に変化していることが知られてい るＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物において、植物デフェンシン遺伝子発現を測定し た。ｎｐｒ１変異体はＳＡ処理または病原体感染に際してＰＲタンパク質遺伝子 を発現できないので、ＳＡ信号伝達経路の遮断を示す（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。これに対しｃｐｒ１変異体は、ストレス信号がない場合でも構成的 に上昇したＳＡおよびＰＲタンパク質濃度を示す。 ＳＡ信号伝達経路に影響を受けた種々のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系列の植物に 、水を擬似接種するか、またはＡ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ胞子懸濁液を接種 し、処理した葉および処理しなかった（全身の）葉を７２時間後に収穫した。植 物デフェンシン遺伝予発現の誘導を、ＲＮＡブロット分析およびＥＬＩＳＡの両 方により測定した。野生型（Ｃｏｌ−０）植物にＡ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ を接種した場合、擬似接種植物の対応する葉のものと比較して、病原体処理した 葉および処理しなかった全身の葉で植物デフェンシン遺伝子の発現が誘導された （図６）。ｎｐｒ１変異体およびｃｐｒ１変異体の両方において、Ａ．ｂｒａｓ ｓｉｃｉｃｏｌａ攻撃に際して植物デフェンシン遺伝子発現が同様に誘導され、 擬似接種ｃｐｒ１植物においては構成性発現はみられなかった。実施例５ 植物デフェンシン誘導経路にはエチレンおよびジャスモナート反応経路の成分が 必要 前記のように、外因性エチレンまたはジャスモン酸メチルを適用した後、Ａｒ ａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の葉に植物デフェンシンが蓄積する。植物デフェンシン の誘導におけるこれら２つの植物ホルモンの役割を明らかにするために、本発明 者らはエチレン非感受性変異体ｅｉｎ２およびｅｔｒ１−３（Ｇｕｚｍａｎ ａ ｎｄ Ｅｃｋｅｒ，１９９０；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、ならび にコロナチンおよびジャスモン酸メチル非感受性変異体ｃｏｉ１（Ｆｅｙｓ ｅ ｔ ａｌ．，１９９４）において植物デフェンシン遺伝子発現を調べた。 エチレン非感受性またはジャスモナート非感受性変異体を真菌感染させると、 植物デフェンシンの誘導が著しく影響された。植物デフェンシンの誘導は、ｅｉ ｎ２およびｃｏｉ１植物ではほぼ完全に遮断されているらしい。Ａ．ｂｒａｓｓ ｉｃｉｃｏｌａ接種後、ｅｉｎ２およびｃｏｉ１植物の病原体処理した葉および 処理しなかった全身の葉における植物デフェンシン濃度は、同様に病原体処理し た野生型植物の対応する葉の試料中における濃度より少なくとも３０倍低かった 。ｅｉｎ２およびｃｏｉ１植物の病原体誘導による植物デフェンシン遺伝子発現 遮断は、転写レベルで起きたと思われる。病原体処理した植物の葉に植物デフェ ンシンｍＲＮＡが検出されなかったからである。ｅｔｒ１−３植物では、病原体 処理した葉において、野生型植物の病原体処理した葉にみられたものと同様な水 準にまで植物デフェンシン遺伝子の発現が増大した。しかしｅｔｒ１−３植物の 処理しなかった全身の葉においては、植物デフェンシン蓄積の上昇は野生型植物 の全身の葉の場合より３倍低い水準であった。この低下は３回の独立した実験全 体をとおして一致したが、低下の程度には変動があった。実施例６ 病変模倣変異体ａｃｄ２では植物デフェンシンが構成性誘導される Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのａｃｄ２変異体は、無毒性細菌性病原体の攻撃を受 けた際に過敏反応を起こした野生型植物が呈するのと類似の病変を自然に呈する （Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。この変異体は不顕性の葉お よび壊死した葉の両方において高濃度のＰＲタンパク質遺伝子転写体を蓄積する ことが先に示されているので（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４） 、ａｃｄ２植物において植物デフェンシン遺伝子の発現を評価するのは有用であ ると思われた。健康な不顕性の上部ロゼット葉および壊死性病変を示している下 部ロゼット葉を５週令ａｃｄ２植物から別個に収穫し、同じ条件で生育させた野 生型（Ｃｏｌ−０）植物からも健康な上部ロゼット葉および下部ロゼット葉を収 穫した。ＥＬＩＳＡにより測定して、ａｃｄ２植物はきわめて高い濃度の植物デ フェンシンを蓄積した。これは、不顕性の葉および壊死性病変を伴う葉において 、それぞれ全可溶性タンパク質の約５％および１０％を占めると推定される（図 ８Ｂ）。ＲＮＡブロット分析は、ａｃｄ２の壊死した葉においても不顕性の葉に おいても、野生型植物の場合と比較して植物デフェンシンの転写体濃度が著しく 上昇していることを示した（図８Ａ）。実施例７ エチレンおよびジャスモン酸は平行した信号伝達経路でＰＤＦ１．２遺伝子を活 性化する 病原体により誘導されるＰＤＦ１．２発現はエチレン反応に影響を受けた変異 体（ｅｉｎ２）およびジャスモナート反応に影響を受けた変異体（ｃｏｉ１）の 両方により遮断されるという所見は、この遺伝子の発現においてエチレンとジャ スモナートが何らかの相互作用をもつことを暗示する。概念的にはエチレンとジ ャスモナートの相互作用につき３つの異なるモデルが考えられる（図１０）。 第１モデルは、病原体認識によりエチレンの産生が増加し、その結果ジャスモ ナートの産生が刺激され、続いてＰＤＦ１．２が活性化されることを暗示する。 第２モデルは第１モデルと同じであるが、エチレン信号とジャスモナート信号の 関係が逆である。最後に第３モデルでは、エチレンとジャスモナートは逐次様式 で作用するのではなく、むしろ平行した経路により作用し、病原体認識した際に ＰＤＦ１．２遺伝子が誘導されるためには、これらが両方とも活性化される必要 があると仮定する。 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型植物（Ｃｏｌ−０）にＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａを接種すると、葉のジャスモン酸濃度が上昇すること が 先に示された（Ｐｅｎｎｉｎｃｋｘ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。第１モデルで は病原体感染に際してのこのようなジャスモナート濃度上昇はエチレン非感受性 変異体ｅｉｎ２では起きないと推定し、一方モデル２および３によればｅｉｎ２ 変異は病原体刺激されたジャスモナート産生に影響を与えないであろう。これら の相違する推定を調べるために、ｅｉｎ２と野生型植物（Ｃｏｌ−０）に病原体 Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａを感染させた後、種々の時点でジャスモナート濃 度を監視した。図１１に示すように、真菌接種した野生型植物のジャスモナート 濃度は接種の２４時間後から上昇し始め、接種の４８時間後からはさらに劇的に 上昇して、接種後約７２時間目にピーク濃度に達した。ｃｏｉ１変異体では、病 原体刺激による産生は明らかに失われず、野生型植物と比較してよりいっそう顕 著である。したがってこれらの結果は、モデル１に基づいてなされた推定と矛盾 する。 モデル２と３をさらに区別するために、Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａの接種 に反応した野生型植物およびｃｏｉ１変異体によるエチレン産生を測定した。モ デル２では、ｃｏｉ１変異体は病原体攻撃に際してのエチレン産生刺激能が遮断 されていると予想する。一方モデル３は、ｃｏｉ１変異体のエチレン反応は野生 型植物と対比して低下しないことを暗示する。野生型植物にＡ．ｂｒａｓｓｉｃ ｉｃｏｌａを接種すると、エチレン産生量が擬似接種植物の約２倍となり、接種 の約６０時間後にピークに達した（図１２）。Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ処 理したｃｏｉ１変異体植物でも、同様に２倍のエチレン産生量増加がみられた（ 図１２）。接種および擬似接種ｃｏｉ１変異体の両方におけるエチレン産生量は 、野生型植物のものと対比して平均約２倍であった。ｃｏｉ１変異体においては 明らかに病原体刺激によるエチレン産生が失われなかったので、モデル２は有効 でないと結論された。したがって、平行したエチレンおよびジャスモナート信号 伝達経路を提唱するモデル３がすべての所見に一致する唯一のモデルである。 モデル１の有効性を証明する他の方法は、野生型植物とｅｉｎ２変異体をジャ スモン酸メチルで処理し、処理の２日後にＥＬＩＳＡにより植物デフェンシン濃 度を測定するものである。野生型植物を５０μＭのジャスモン酸メチルで処理す ると、溶剤処理した野生型植物のものと対比して少なくとも１００倍高い植物デ フェンシン濃度となった。これに対し、ジャスモン酸メチルで処理したｅｉｎ２ 変異体の植物デフェンシン含量は溶剤処理した植物のものと対比して増加しなか った（図１３）。この所見は、ジャスモナートにより誘導されたＰＤＦ１．２蓄 積がｅｉｎ２変異により影響されないと推定するモデル１と矛盾する。 ジャスモン酸メチル単独処理でＰＤＦ１．２遺伝子を活性化できるという事実 は、必ずしもモデル３と矛盾しない。植物をジャスモン酸メチルの外部適用によ り処理するとエチレン産生が増加することは、十分に確立されているからである （Ｃｚａｐｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｎｉｅｗｓｋｉ，１９９２）。無菌でない土壌 で生育させた植物をエチレン単独で処理すると、植物デフェンシン蓄積が増加す る（実施例３参照）。これも見かけ上はモデル３と一致しない。しかし、寒天培 地で生育させた無菌植物をエチレン単独（２５ｐｐｍ）で処理した場合、ＰＤＦ １．２蓄積の誘導はみられなかった（結果は示されていない）。無菌植物をジャ スモン酸メチルで処理しても、ＰＤＦ１．２蓄積が誘導された。これはエチレン 産生の同時刺激による確率が最も高い。エチレンが無菌でない植物のＰＤＦ１． ２蓄積を刺激するが無菌植物では刺激がみられないという所見は、植物が土壌中 の微生物と接触することによりエチレン処理に対するそれらの反応性が変化した と推定することにより説明できる。 モデル３は最も可能性の高いモデルであると考えられるが、さらに実験を行う ことにより、他のいずれかのモデルがエチレンとジャスモナートの相互作用を最 も良く記述するモデルである可能性がより高いことが示されるかもしれない。実施例８ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびタバコにおけるジャスモナートおよび／またはエ チレン依存型防御経路の誘導に関するスコア可能なマーカー遺伝子の開発 ＰＤＦ１．２ ｃＤＮＡ配列（Genebank受託番号Ｔ０４３２３）に基づくプラ イマーを用いて、逆ＰＣＲ法によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＰＤＦ１．２遺伝 子プロモーターをクローン化した。この方法で１６１６ｂｐのゲノムＤＮＡフラ グメントがクローニングされた。その配列を図１４に示す。このゲノムフラグメ ントの位置１２０２〜１２９６および１３８８〜１６１６の配列は、ＰＤＦ１． ２ ｃＤＮＡの位置１〜３２６の配列に正確に一致する。ｃＤＮＡ配列と対比し て位置１２９７〜１３８７におけるゲノム配列一致の中断は、ＰＤＦ１．２シグ ナルペプチドに対するコード配列内にある９１ｂｐイントロンを表すと推定され る。この推定イントロンスプライス部位を囲む配列は、他の植物遺伝子にみられ たコンセンサス配列と一致した。重要な点は、このゲノムフラグメントがｃＤＮ Ａ配列の５’側に１２０１ｂｐを含み、ＰＤＦ１．２遺伝子産物の推定翻訳開始 部位の上流に１２３２ｂｐを含むことである。そこで、ＰＤＦ１．２遺伝子の翻 訳開始コドンの５’側にあるＤＮＡ配列が、病原体誘導によるこの遺伝子の局部 および全身発現ならびにジャスモナートそのほか、ＰＤＦ１．２遺伝子産物の蓄 積を誘導する化学的刺激物質による誘導を決定する調節要素を備えたプロモータ ーを含むか否かを調べる実験を企画した。このために、推定プロモーター要素な らびに５’側非翻訳リーダーおよび最初の７つのＰＤＦ１．２コドンをコードす る領域の部分を包含する、最初の１２５４ｂｐのゲノムフラグメントを、翻訳融 合体として大腸菌ＵｉｄＡ遺伝子（β−グルクロニダーゼまたはＧＵＳをコード する）のコード領域に結合させ、次いでこれをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター（ｔＮＯＳ）に 結合させた。得られたｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳ発現カセットを、植物 形質転換用ベクターに挿入して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓに基づく根の形質転換により、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａ ｎａ生態型Ｃ２４中へ伝達した。 ｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳトランスジーンがジャスモン酸処理に反応 する能力を、まず６種類の独立したＴ０トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓ ｉｓ系列の子孫につき評価した。これら各系列の種子を、１％スクロースおよび ５０μＭカナマイシンを含有するムラシゲおよびスクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）寒天培地、または１０μＭジャスモン酸を補充した同培 地で、無菌的に発芽させた。発芽の１０日後に実生を収穫し、Ｊｅｆｆｅｒｓｏ ｎ（１９８７）の方法に従い４−メチルウンベリフェリルグルクロニドを基質と して用いる蛍光定量法により、それらのβ−グルクロニダーゼ活性を測定した。 Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法でウシ血清アルブミンを標準品として用い て測定した各試料の全タンパク質含量に対し、β−グルクロニダーゼ活性を標準 化 した。 表１に示すように、試験したすべての系列がジャスモナート処理実生において 、非処理実生と対比して顕著なβ−グルクロニダーゼ活性上昇（９〜２５倍）を 示した。ジャスモナートにより誘導された最も高い相対β−グルクロニダーゼ活 性上昇を示した系列１９をさらに自家受粉により繁殖させ、トランスジーンにつ きホモ接合体であるＴ３世代の種子を得た。以後の分析すべてにこの系列を用い た。 表１ １０μＭジャスモン酸の不在下または存在下で発芽させた後の、ｐＰＤＦ１．２ −ＧＵＳ−ｔＮＯＳトランスジーンを保有する６種類の独立したＡｒａｂｉｄｏ ｐｓｉｓ系列の１０日令実生におけるβ−グルクロニダーゼ活性 ^* ３７℃で１分につき可溶性タンパク質１ｍｇ当たり、４−メチルウンベリフ ェリルグルクロニドから放出された４−メチルウンベリフェリフェロンのｐｍｏ ｌとして表示 ＲＮＡゲルブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイにより、Ａｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓの葉に真菌性病原体Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａを 接種した際にＰＤＦ１．２遺伝子は全身的に誘導されることが示された。トラン スジェニック４週令Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物において、真菌性病原体Ａｌｔ ｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａおよびＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅ ｒｅａ接種に反応したｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳリポーター遺伝予の発 現を、トランスジェニック植物処理の４８時間後に、接種した葉および接種しな かった全身の葉の両方でβ−グルクロニダーゼ活性を測定することにより評価し た。Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａは、分生胞子懸濁液（水中５×１０⁵胞子／ ｍＬ）５μＬ滴を下側ロゼット葉に適用することにより接種された（葉１枚につ き４滴）。Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａは、下側ロゼット葉につけた穿刺傷を覆う、半濃 度ジャガイモデキストロースブロス（ディフコ）中の５×１０⁵胞子／ｍＬ分生 胞子懸濁液５μＬ滴として接種された（傷１カ所につき１滴、葉１枚につき４カ 所の傷）。図１５に示すように、擬似接種した対照と対比して、接種した葉およ び接種しなかった全身の葉の両方で、Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａまたはＢ． ｃｉｎｅｒｅａ接種後にβ−グルクロニダーゼ活性が著しく上昇した。これは、 ｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳリポーター遺伝子がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ における全身的な病原体誘導性遺伝子発現に適したマーカーであることを示す。 ４週令ｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏ ｐｓｉｓ植物を種々の化学物質で処理し、それらの物質がこのリポーター遺伝子 発現を誘導する能力を評価した。これらの試験に用いた化学物質は、ジャスモン 酸（ＪＡ、０．１％エタノール中５００μＭ）、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ 、０．１％エタノール中５０μＭ）、サリチル酸（ＳＡ、Ｈ₂Ｏ中５ｍＭ）、２ ，６−ジクロロイソニコチン酸（ＩＮＡ、Ｈ₂Ｏ中１ｍｇ／ｍｌ）、１，２，３ −ベンゾチアジアゾール７−カルボチオ酸Ｓ−メチルエステル（ＢＴＨ、Ｈ₂Ｏ 中３００μＭ）、パラカット（ＰＱ．Ｈ₂Ｏ中２５μＭ）であった。化学物質溶 液を植物の完全に広がった葉の上面に５μＬ滴として適用した（葉１枚につき５ 滴）。別個の組の植物を同様に機密室内でエチレン（２５ｐｐｍ）に暴露するこ とにより処理した。化学物質または適切な対照で４８時間処理した後、処理した 植物からの葉を収穫し、β−グルクロニダーゼ活性を測定した。 図１６に示すように、ＪＡ、ＭｅＪＡまたはパラカットによる処理はｐＰＤＦ １．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳリポーター遺伝子を誘導するのに対し、ＳＡ、ＩＮＡ 、ＢＴＨまたはエチレンの適用は影響を与えなかった。これらの所見は、エチレ ン処理以外の化学物質処理に反応したＰＤＦ１．２遺伝子のＲＮＡゲルブロット 分 析およびＥＬＩＳＡアッセイに基づく発現試験を裏付ける。エチレン処理は無菌 でない土壌に生育した植物においてＰＤＦ１．２濃度を高めることが認められた （実施例３参照）が、このガス状ホルモンは無菌植物においてはＰＤＦ１．２蓄 積を高めなかった（実施例７参照）。したがって、無菌でない培養条件はエチレ ンに対するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の反応性を高めると思われる。この反応 性上昇は内因性ＰＤＦ１．２遺伝子を活性化するには十分であるが、ｐＰＤＦ１ ．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳキメラリポーター遺伝子を活性化するには不十分である 。 ＳＡ、ＩＮＡおよびＢＴＨがＳＡ依存型の病原体誘導遺伝子を誘導する条件下 で適用されたか否かを証明するために、Ｂｇｌ２と命名されるＡｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓβ−１，３−グルカナーゼＰＲ−２タイプ遺伝子のプロモーターの制御下 にあるβ−グルクロニダーゼコード領域から構成されるキメラトランスジーンを 保有するトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物についても、上記の試 験を実施した（Ｂｏｗｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ ｌ ６，１４８５−１８５７）。このキメラ遺伝子を、以下ｐＢｇｌ２−ＧＵＳ −ｔＮＯＳと略称する。図３に示すように、トランスジエニックｐＢｇｌ２−Ｇ ＵＳ−ｔＮＯＳ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物をＳＡならびにその機能性類似体 ＩＮＡおよびＢＴＨで処理すると実際にβ−グルクロニダーゼ活性が顕著に上昇 したが、ＪＡ，ＭｅＪＡ、エチレンまたはパラカットは何ら影響を与えなかった 。ＳＡ、ＩＮＡおよびＢＴＨがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてＳＡ依存型の病 原体誘導遺伝子、たとえばＰＲ−１、ＰＲ−２およびＰＲ−３を誘導することは 先に示された（Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。 これらのデータを合わせると、ｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳリポーター 遺伝子はＳＡの介在なしに病原体感染に対し全身的に反応することが示され、こ れはＳＡ非依存型の病原体誘導性遺伝子活性化および恐らくＳＡ非依存型の誘導 された抵抗性の適切なマーカーであることを示す。 ｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳプロモーターをＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以 外の植物においてＳＡ非依存型の病原体誘導性遺伝子発現のマーカーとして使用 できるか否かを評価するために、ｐＰＤＦ１．２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳ遺伝子をＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介による葉ディスク形質転換法により、タバコ栽培 品種Ｘａｎｔｈｉ−ｎｃにも導入した。このトランスジーンにつきホモ接合体で あるＴ２世代植物を選択した。８週令の植物において最も若い完全に広がった葉 の直下の葉にタバコモザイクウイルスを接種した後、トランスジェニックタバコ 系列における全身的な病原体誘導発現を評価した。タバコ品種Ｘａｎｔｈｉ−ｎ ｃはタバコモザイクウイルスに抵抗性であり、過敏性反応を生じることによりウ イルスと反応し、これによりウイルスが病変部から拡散するのを阻止する。最も 若い完全に広がった葉および最も若い完全に広がった葉の上の葉を別個に、接種 後２、４および６日目に収穫し、β−グルクロニダーゼ活性を測定した。タバコ モザイクウイルス接種物は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中にタ バコモザイクウイルスを予め感染させたタバコ品種Ｈｉｃｋｓの葉をすりつぶす ことにより調製された（緩衝液１０ｍｌにつき組織１ｇ）。この懸濁液を緩衝液 中に１０倍希釈し、カーボランダム粉末と共に擦り込むことによりタバコの葉に 付与した。対照植物には緩衝液と粉末のみを擬似接種した。図１７に示すように 、接種した葉では接種の２日後から、全身の葉では接種の４日後から、β−グル クロニダーゼ活性が顕著に上昇した。さらに、サリチル酸（ＳＡ、Ｈ₂Ｏ中５ｍ Ｍ）、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ、０．１％エタノール中５０μＭ）、パラ カット（ＰＱ、Ｈ₂Ｏ中２５μＭ）で葉を処理することにより、および傷をつけ ることにより、リポーター遺伝予の誘導性を評価した。化学物質は１００μｌの ４滴として、８週令の植物の完全に広がった葉に適用された。傷害試験は、末端 がのこぎり状のピンセットにより葉を２ｃｍ間隔でつぶすことにより行われた。 処理した葉および適切な対照のβ−グルクロニダーゼ含量を、処理の４８時間後 に測定した。 図１８に示すように、ジャスモン酸メチルおよびパラカットは両方ともβ−グ ルクロニダーゼ活性を３５倍以上高めた。これに対し、傷害およびサリチル酸処 理は活性を２倍高めたにすぎない。同じ方法で処理したタバコ植物におけるＲＮ Ａゲルブロット分析でタバコＰＲ−１遺伝子の活性化を証明することにより、Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの場合と同様に、この遺伝子はサリチル酸のみにより誘導 され、ジャスモン酸メチル、パラカットまたは傷害によっては誘導されないこと が示された（記載してない）。 これらの結果は、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ科の植物であるタバコではＰＤＦ１． ２プロモーターがＳＡ非依存型様式で活性化され、一方これは病原体攻撃に際し 植物全身にわたって誘導されうることを示す。したがってｐＰＤＦ１．２−ＧＵ Ｓ−ｔＮＯＳリポーター遺伝子は、ＳＡ非依存型防御経路を誘導する化合物、微 生物または物理的処理をスクリーニングするために種々の植物に利用できる。実施例９ エチレンおよびジャスモナートによる植物デフェンシンプロモーターの相乗誘導 ジャスモナートおよびエチレンが平行な経路で作用してＰＤＦ１．２遺伝子を 活性化するという本発明者らの所見（実施例７参照）は、ジャスモナートとエチ レンの組み合わせはこの遺伝子の活性化に対し相乗効果をもつ可能性のあること を示唆する。この仮説を調べるために、エチレンとジャスモン酸メチルを両化合 物それぞれが単独ではトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓリポーター植 物のｐＰＤＦ１.２−ＧＵＳ−ｔＮＯＳ遺伝子を活性化できない用量で併用した 。図１９に示すように、２５ｐｐｍのエチレンを含む雰囲気においてジャスモン 酸メチル０．５μＭ滴でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉を処理すると、きわめて高 いβ−グルクロニダーゼ活性が生じた。一方、それぞれの単独処理ではβ−グル クロニダーゼ濃度は上昇しなかった。エテホン（植物に噴霧された際にエチレン を発生する化合物）３３３μＭをジャスモン酸メチル０．５μＭと併用すると、 有意ではあるがより低い水準の相乗作用が検出された（図１９参照）。この試験 では、エテホンを植物の老化プロセス活性化のために通常用いる割合より１０倍 低い割合で適用した。 これらの所見は、エチレン反応経路とジャスモナート反応経路を別個に活性化 する化合物の混合物で植物を処理すると、特定のタイプの病原体に対する自然抵 抗性をより効果的に刺激しうることを示唆する。実施例１０ ジャスモナートおよび／またはエチレン依存型防御経路が、ある種の病原体に対 するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの防御において重要な役割をもつことの証明 ジャスモナートおよび／またはエチレン依存型防御経路に影響を受けたＡｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓ変異体の病害感受性を調べるために、子のう菌性壊死栄養性真 菌病原体Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ（テレオモルフ＝Ｂｏｔｒｙｏｔｉ ｎｉａ ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）の病害バイオアッセイ法を開発した。このアッ セイ法は、穿刺傷にＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ胞子懸濁液滴を付与した 後、接種植物の病状を監視することよりなっていた。図２０に、一連の野生型Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（Ｃｏｌ−０）、エチレン非感受性変異体（ｅｉｎ２ ）およびジャスモナート非感受性変異体（ｃｏｉ１）を用いて設定した試験にお いて病害がみられた植物の数を示す。１６日後、野生型植物のうち１％が病状を 示したにすぎないのに対し、接種したすべてのｅｉｎ２変異体のうち４１％およ び接種したすべてのｃｏｉ１変異体のうち８６％が病状を示した（図２０参照） 。ｅｉｎ２およびｃｏｉ１植物の衰退に伴って、多量の分生胞子が形成された。 予備試験で、サリチル酸依存型防御経路に影響を受けた変異体ｎｐｒ１は、Ｃｏ ｌ−０野生型植物と同様にＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ感染に対し抵抗性 であることが示された。これらの結果は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が灰色か び病真菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａに対する抵抗性を確立するためには ジャスモナートおよび／またはエチレン依存型防御反応経路が重要であることを 指摘する。 野生型植物（Ｃｏｌ−０）、ならびに変異体ｎｐｒ１，ｅｉｎ２およびｃｏｉ １につき、同様に卵菌性寄生真菌病原体Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉ ｔｉｃａ ｐａｔｈｏｖａｒ Ｗｅｌａを用いて病害バイオアッセイを行った。 この真菌による感染は、接種した葉においてラクトフェノール／トリパンブルー 染色法により真菌構造体を検出することにより評価された。これらの試験では、 Ｃｏｌ−０、ｅｉｎ２およびｃｏｉ１が検出可能なほどには病原体増殖を支持せ ず、一方ｎｐｒ１変異体は真菌菌糸に著しく感染して卵胞予を多量に形成するこ とが示された（図２１）。 これらのデータを合わせると、ここに記載するジャスモナートおよび／または エチレン依存型防御経路はＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａによる感染試験で は防御の成功に重要な決定因子であるが、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓ ｉｔｉｃａによる試験に対してはそうでなく、サリチル酸依存型防御経路につい ては逆であることが示される。したがって、植物では別個の病原体群に対し有効 な少なくとも２つの異なる防御経路が作動すると思われる。重要な点は、この所 見がジャスモナートおよび／またはエチレン依存型防御経路とサリチル酸依存型 防御経路の両方を誘導する化合物の混合物で植物を処理すると、より広いスペク トルの誘導抵抗性が得られるであろうということを暗示している点である。 エチレン非感受性およびジャスモナート非感受性のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ変 異体につきみられた罹患性の高い表現型から推定されるように、ジャスモナート および／またはエチレン依存型の病原体誘導性防御反応が、ある種の病原体に対 する宿主防御において中枢の役割をもつとすれば、この反応を活性化する化合物 で植物を前処理すると特定の病原体に対する罹患性が低下すると期待できる。 本発明者らは、少なくともＢ．ｃｉｎｅｒｅａに対し少なくともＡｒａｂｉｄ ｏｐｓｉｓ植物は、ジャスモナートおよび／またはエチレン依存型遺伝子の活性 化により抵抗性を備えうるが、サリチル酸依存型遺伝予についてはそうでないこ とを示した。これにより、この病原体に対し１，２，３−ベンゾチアジアゾール −７−カルボチオ酸Ｓ−メチルエステルによる保護がみられなかったことを説明 できる（Ｌａｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）。 ほとんどすべての栽培植物が１または２種類ではなく広範な病原性微生物に対 し罹患性である。したがって、病害抑制に用いる化学物質が可能な限り広範な病 原体に対する抵抗性を与えることが重要である。本発明者らは、これまで確認さ れていなかったジャスモナートおよび／またはエチレン依存型防御経路と呼ばれ る防御経路を本明細書に記載した。これは、十分に研究されているサリチル酸依 存型防御経路とは遺伝的に異なるだけでなく、サリチル酸依存型防御経路の活性 化では抑制できない特定の病原体に対する抵抗性にも関与する。これらの所見か らみて、サリチル酸依存型防御経路とジャスモナートおよび／またはエチレン依 存型防御経路の両方を活性化するカクテルおよび化合物類で植物を処理すること により、さらに広範な病害抑制スペクトルを得ることができる。 当業者には本発明の範囲から逸脱しない他の本発明の変法が自明であろう。た とえば本発明のスクリーニング法を利用して、病害または寄生生物に対しサリチ ル酸に関係なく抵抗性を増大させる化学的、生物学的、微生物学的または物理的 な植物処理をスクリーニングすることができる。参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/48 33/48 Ｎ 33/50 33/50 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ペニンクス，アイリス・アン・マリー・ア ルマンデ ベルギー王国ベ―3001 エヴェルレー，ブ ルクストラート 67 (72)発明者 テラス，フランキー・レイモンド・ジェラ ルド ベルギー王国ベ―8570 アンゼゲム，シャ ークストラート 96 (72)発明者 マナーズ，ジョン・マイケル オーストラリア連邦クイーンズランド 4064，パディントン，ウォーミントン・ス トリート 28 (72)発明者 カザン，ケマル オーストラリア連邦クイーンズランド 4072，セント・ルシア，ダーラム・ストリ ート １／24

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物を病原体に対し保護する方法であって、ジャスモナートおよび／また はエチレン経路を刺激することにより植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導する ことを含む方法。 ２．ジャスモナートおよびエチレン経路を刺激することにより植物デフェンシ ン遺伝子または同調発現遺伝子の発現を誘導する、請求項１記載の方法。 ３．病原体が壊死栄養性病原体である、請求項１または２記載の方法。 ４．病原体が微生物性病原体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法 。 ５．病原体が真菌である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 ６．経路が、エチレン、ジャスモン酸またはジャスモナート様化合物、エチレ ンの作用を模倣する薬剤、ジャスモン酸の作用を模倣する薬剤、エチレンの作用 を模倣する非除草量の薬剤、ジャスモナートの作用を模倣する非除草量の薬剤、 および酸化的ストレスを生じる薬剤のうちの１種類またはそれ以上の適用により 刺激される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 ７．ジャスモナートおよび／またはエチレン経路の剌激に際し、Ａｒａｂｉｄ ｏｐｓｉｓ由来の情報伝達成分ＥＩＮ ２およびＣＯＩ １を伴う、請求項１〜 ６のいずれか１項記載の方法。 ８．植物にエチレン、ジャスモナート、エチレンまたはジャスモナートの作用 を模倣する薬剤、および酸化的ストレスを生じる薬剤のうち１種類またはそれ以 上を適用することにより、植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導する方法。 ９．酸化的ストレスを生じる薬剤が、超酸化物アニオンを形成するパラカット もしくはダイカットなどのジフェニル系除草剤、または一重項酸素種を生成する ローズベンガルもしくはエオシンである、請求項７または８記載の方法。 １０．ジャスモン酸、ジャスモナート、エチレン、エチレンまたはジャスモナ ートの作用を模倣する薬剤、および酸化的ストレスを生じる薬剤のうち１種類ま たはそれ以上を含む、植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導しうる組成物。 １１．エチレン発生化合物、脂質由来のシグナル分子、サリチル酸、サリチル 酸の官能性類似体、および反応性酸素発生化合物のうち１種類またはそれ以上を 含む、植物デフェンシン遺伝子の発現を誘導しうる組成物。 １２．エチレン発生化合物がエチレン、エテホンおよびアミノシクロプロパン カルボン酸から選択される、請求項１１記載の組成物。 １３．脂質由来のシグナル分子がアラキドン酸およびその誘導体、リノレン酸 およびその誘導体、ならびにジャスモナートおよびその誘導体から選択される、 請求項１１または１２記載の組成物。 １４．反応性酸素発生化合物がパラカット、ダイカット、ローズベンガルおよ びエオシンから選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項記載の組成物。 １５．抵抗性誘導活性につき化合物をスクリーニングする方法であって、この ような抵抗性を与えると推定される化合物を植物または植物の一部に適用し、そ して植物デフェンシン遺伝子または同調発現遺伝子の発現を検出する方法。 １６．病原体が壊死栄養性病原体である、請求項１５記載の方法。 １７．病原体が微生物性病原体である、請求項１５または１６記載の方法。 １８．病原体が真菌である、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の方法。 １９．植物がラディッシュ、タバコまたはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓである、請 求項１５〜１８のいずれか１項記載の方法。 ２０．植物がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓであり、デフェンシンが植物デフェンシ ン遺伝子ＰＤＦ １．２（図１４）、ＰＤＦ １．２の配列と実質的相同性を有 する配列、またはその変異体の産物である、請求項１９記載の方法。 ２１．化合物を葉に適用する、請求項１５〜２０のいずれか１項記載の方法。 ２２．ＰＤＦ １．１またはＰＤＥ １．２の遺伝子産物に対する抗体を用い て検出を行う、請求項１５〜２１のいずれか１項記載の方法。 ２３．ジャスモン酸もしくはその作用を模倣する薬剤および／またはエチレン もしくはその作用を模倣する薬剤により誘導される領域を含む、植物デフェンシ ン遺伝子の発現を誘導しうるプロモーター。 ２４．図１４に示した核酸配列もしくは図１４に示した配列と実質的相同性を 有する配列、またはその変異体の中に含まれるプロモーター領域。 ２５．実質的に図面のいずれかに関して前記に記載した方法、組成物およびプ ロモーター。