JP2000515362A - トランス―スプライスにより生成される治療用分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の分子および方法は、細胞の選択されたサブセットにおける治療用分子のインビボ産生の手段を提供する。本発明のプレ−治療用分子は、プレ−治療用分子と、特定の標的細胞中でユニークに発現されるプレ−ｍＲＮＡとの間のトランス−スプライス反応の基質である。インビボトランス−スプライス反応は、ＲＮＡとして機能するかまたは標的細胞中で発現されるタンパク質をコードする活性のある治療用ＲＮＡを提供する。このｍＲＮＡの発現産物は、細胞にとって治療的価値のあるタンパク質であるか、または特定の細胞の死滅を引き起こす毒素である。

Description

【発明の詳細な説明】 トランス−スプライスにより生成される治療用分子発明の背景 発明の分野 本発明の分子および方法は、細胞の選択されたサブセットにおける異種遺伝子 を発現する手段を提供する。本発明の前駆体−治療用分子（ＰＴＭ）は、前駆体 治療用分子とプレ−ｍＲＮＡ分子（これは、特定の標的細胞でユニークに発現さ れる）との間の標的であるかまたは規定されたトランス−スプライス反応の基質 である。ＰＴＭは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）のような他 の分子であってよい。インビボのトランス−スプライス反応は、標的細胞で発現 される活性のある治療用分子を提供する。ｍＲＮＡの発現生成物は、細胞に対し て治療用価値を有するタンパク質、または特定の細胞を死滅させる毒素でもよい 。あるいは、治療用ＲＮＡ（ｔｈ−ＲＮＡ）または他の分子は、それ自身が治療 的機能を果たしてもよい。本発明の別の実施態様において、治療効果を達成する ために、複数のＰＴＭが組合せて使用される。 関連技術の説明 癌やＡＩＤＳのような多くの生命に関わる疾患の治療における最も大きな問題 の１つは、生命体の他の細胞に治療用分子を投与することなく、この分子を特異 的な標的細胞に投与することである。この問題を解決するための従来の試みには 、ウイルスベクターを用いる遺伝子治療、薬物送達、またはモノクローナル抗体 に結合した毒素などがある。今日までこれらの方法は、必ずしも成功していない 。 本発明の方法は、標的細胞のみへの送達を必要としない。治療用分子の前駆体 分子は、生命体のすべての細胞に送達され、生命体のすべての細胞に摂取される が、治療用ｍＲＮＡは、インビボで特異的な標的細胞でのみ作成される。この治 療法の特異性は、標的細胞中の標的プレ−ｍＲＮＡのユニークな（限定された） 転写に依存する。正常細胞（標的ではない）は、標的遺伝子を転写しない（また は、ほんのわずかに転写する）。従って、そのような正常細胞では治療用分子の 選択的な生成は起きない（または、ほんのわずかに起きる）。 遺伝子含量が実質的に同一であるにもかかわらず、同じ生物の真核細胞が互い に異なる１つの重要な方法は、これらが異なる遺伝子または遺伝子の異なる部分 を発現するためである。遺伝子発現の制御は、多くのレベルで起き、遺伝子発現 に関する古典的な研究は、転写および翻訳のレベルで制御されることを証明して いる。さらに最近の研究は、細胞は、遺伝子コピー数およびスプライスの制御に より、遺伝子発現を制御する能力を有することを、示している。 染色体内でＤＮＡ配列として保存されている遺伝子は、コード領域（エキソン ）とまた一般的に介在する非コード領域（イントロン）とを含有するプレ−ｍＲ ＮＡ中に転写される。プレ−ｍＲＮＡは核内でプロセシングされ、イントロンが 不要なエキソンとともに除去される。残りのエキソンは一緒にスプライスされ、 ｍＲＮＡを生成し、これが核から細胞質に出て、リボゾームによりタンパク質に 翻訳される。例えば、エム・ジェイ・ムーア（Moore，M.J．）、シー・シー・ク エリー（C.C．Query）、およびピー・エー・シャープ（P.A．Sharp）、Ｃｅｌｌ 、７７：８０５−８１５（１９９４）；エム・ジェイ・ムーア（Moore，M.J．） 、シー・シー・クエリー（C.C．Query）、およびピー・エー・シャープ（P.A．S harp）、Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ、コールドスプリングハーバーラボラトリ ープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、３０３−３５８（１９９ ３）を参照されたい。 イントロンは、スプライスと呼ばれる正確なプロセスによりプレ−ｍＲＮＡか ら除去される。エル・ティー・チョウ（Chow，L.T.）、アール・イー・ゲリナス （R.E．Gelinas）、ティー・アール・ブローカー（T.R．Broker）、アール・ジ ェイ・ロバーツ（R.J．Roberts）、（１９７７） Ｃｅｌｌ，１２：１−８；お よびエス・エム・ベルゲット（Berget，S.M.）、シー・ムーア（C．Moore）およ びピー・エー・シャープ（P.A．Sharp）、（１９７７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：３１７１−３１７５。プレ−ｍＲＮＡスプラ イスは、２工程の機構で進行する。第１の工程では、５’スプライス部位が切断 され、「遊離」の５’エキソンとラリアット中間体が放出される（エム・ジェイ ・ムーア（Moore，M.J．）とピー・エー・シャープ（P.A．Sharp）、Ｎａｔｕｒ ｅ，３６５：３６４−３６８，１９９３）。イントロンの５’ヌクレオチド（通 常グアニン）は、イントロン中の分岐点ヌクレオチド（通常アデノシン）と２’ ，５’−ホスホジエステル結合を介して、ラリアット中間体を形成する。第２の 工程では、５’エキソンは、ラリアット生成物としてイントロンを放出しながら ３’エキソンに結合する。これらの工程は、小さな核リボヌクレオタンパク質と スプライソソーム（spliceosome）と呼ばれるタンパク質との複合体中で触媒さ れる（ムーア（Moore）ら、Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ）。 エステル交換スプライス反応部位は、５’および３’スプライス部位の周りの 共通配列（consensus sequences）により規定される。５’スプライス部位共通 配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵである（ここで、Ｎ＝任意のヌクレオチド、Ａ＝ア デノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリン、Ｙ＝ピリ ミジン、および／＝スプライス部位である）。ムーア（Moore）ら、Ｔｈｅ Ｒ ＮＡ Ｗｏｒｌｄ。下線を引いたヌクレオチド配列は、ほとんどすべてのプレ− ｍＲＮＡイントロンに対して共通であり、まれに例外的にＧＵの代わりにＧＣが 存在することがある。３’スプライス部位は、３つの異なる配列成分からなる： 分岐点または分岐部位、ポリピリミジン領域、および３’共通配列。これらの成 分は、３’スプライス部位領域をゆるく規定し、これは３’スプライス部位の上 流の１００ヌクレオチドのイントロンを含むこともある。哺乳動物の分岐点共通 配列は、ＹＮＣＵＧＡＣである。下線を引いたＡは、分岐形成の部位である（Ｂ ＰＡ＝分岐点アデノシン）。３’スプライス共通配列は、ＹＡＧ／Ｇである。分 岐点とスプライス部位の間に、通常ポリピリミジン領域があり、これは、効率的 な分岐点利用と３’スプライス部位認識のために哺乳動物系において重要である （アール・ロスシグノ（Roscigno，R.）、エム・ウェイナー（M．Weiner）およ びエム・エー・ガルシア−ブランコ（M.A．Garcia-Blanco）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．２６８、１４：１１２２２−１１２２９，１９９３）。分岐点とポリピ リミジン領域の下流の最初のＹＡＧジヌクレオチドは、最も一般的に使用される ３’スプライス部位である。シー・ダブリュー・ジェイ・スミス（Smith，C.W.J ．）、イー・ビー・ポッロ（E.B．Porro）、ジェイ・ジー・パットン（J.G．Pat ton）およびビー・ナダール−ギナンド（B．Nadal-Ginand）（１９８９）Ｎａｔ ｕｒｅ ３４２：２４３−２４７。 シス対トランス−スプライス 通常エキソンは、同じプレ−ｍＲＮＡ中の他のエキソンに結合し（シス−スプ ライス）、他のプレ−ｍＲＮＡ中のエキソンには結合（トランス−スプライス） しない。しかし、相補的配列を使用して、プレ−ｍＲＮＡの半分ずつをつなぐこ とによりインビトロで効率的なトランス−スプライスを観察することが可能であ る。これらは、「ワトソン−クリック」様の塩基対合により安定な２本鎖の幹を 形成する。エム・エム・コナルスカ（Konarsk，M.M．）、アール・エー・パジェ ット（R.A．Padgett）、およびピー・エー・シャープ（P.A．Sharp）（１９８５ ）、Ｃｅｌｌ ４２：１６５−１７１。このタイプのトランス−スプライスは、 インビボでは明確には観察されていない。 「スペース」を介するスプライス部位の接近の機構は、例えば、トリパノソー マや線虫中に一般的に観察されるトランス−スプライスの、スプライス部位間の イントロンには依存しない。アール・イー・スットン（Sutton，R.E.）とジェイ ・シー・ブースロイド（J.C．Boothroyd）、Ｃｅｌｌ ４７：５２７−５３５（ １９８６）；ダブリュー・ジェイ・マーフィー（W.J．Murphy）ら、Ｃｅｌｌ ４７：５１７−５２５（１９８６）；エム・クラウセ（Krause，M.）とディー・ ハーシュ（D．Hirsh）、Ｃｅｌｌ ４９：７５３−７６１（１９８７）。これら の非常に特殊な場合に、ショートリーダー（ＳＬ）ＲＮＡを含有する５’スプラ イス部位は、小さな核リボヌクレオタンパク質粒子（ｓｎＲＮＰ）を形成し、こ れは大きなプレ−ｍＲＮＡ中のイントロンの３’末端と相互作用する（ジェイ・ ピー・ブルジック（Bruzik，J.P.）とジェイ・エー・ステイツ（J.A．Steitz） 、Ｃｅｌｌ ６２：８８９−８９９（１９９０）；ジェイ・ピー・ブルジック（ Bruzik，J.P.）とティー・マニアティス（T．Maniatis）、Ｎａｔｕｒｅ ３６ ０：６９２−６９５（１９９２））。このタイプのスプライスは、哺乳動物細胞 で自然に起きることは観察されていない。 コナルスカ（Konarska）ら（１９８５）、ディー・ソルニク（D．Solnik)（１ ９８５）Ｃｅｌｌ ４２：１５７−１６４は、ＳＬ ＲＮＡに似ていないＲＮＡ を使用して、インビトロでトランス−スプライスを検出した。前駆体をつないで いるＲＮＡ−ＲＮＡ二次構造は、トランス−スプライス反応の効率を大きく上 昇させた（野生型のシス−スプライス効率の＜１％から１５〜３０％まで）。 相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡのユニークな標的配列 と特異的に塩基対合することができる。結合の特異性は、結合部位の配列、相補 的領域、および二次構造により影響を受ける。結合特異性を得るために、ユニー クな配列が標的として選択される。結合特異性を達成するのに１７ヌクレオチド の鎖の長さが、充分であることが計算されている（すなわち、ヒトのハプロイド ゲノム中でのユニークなポリヌクレオチド標的は、統計的には３×１０⁹塩基対 に１回起きる）。エム・スミス（M Smith）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、エス・エム・ワイズマン（S.M．weiss man）編、プレーガー（Praeger）、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国、３９ 頁（１９８３）。２本鎖の安定性は、２００ヌクレオチド以上の相補的配列につ いては長さに依存しない［アール・エフ・スタイナー（Steiner，R.F．）とアー ル・ジェイ・ビアーズ・ジュニア（Beers，R.J．Jr．）（１９８６）］。Ｐｏｌ ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（エルセビア（Elsevier）、アムステルダム）。長い 相補的配列は、２本鎖の安定性を上昇させるが、非常に長い領域は、わずかに５ １０の連続的な塩基を介して複数のｍＲＮＡと相互作用し、こうしてその特異性 を低下させることがある。相補的配列は、その５’末端および／または３’末端 に、非結合性ＲＮＡまたはＤＮＡ配列または他の核酸類似体または化学基を有す ることがある。結合はまた、他の機構、例えば３本鎖らせん形成、およびタンパ ク質−核酸相互作用（例えば、遺伝子プロモーターとＤＮＡの間の相互作用）に よっても行われる。組織特異的プロモーターの例には、ブリンスター（Brinster ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３０６：３３２−３３６（１９８３）が記載した免疫グロ ブリンプロモーターや、ブッチーニ（Bucchini）ら、ＰＮＡＳ ８３：２５１１ −２５１５（１９８６）が記載したインスリンプロモーターがある。当業者に公 知の結合の他の手段を使用してもよい。 ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、シュードモナス（Pseudomonas）毒素、シ ガ毒素、およびコレラ毒素のような毒素は、極めて強力である。１つのＤＴの分 子が、細胞質内で酵素的に作用して、細胞を死滅させることができる。エム・ヤ マイズミ（Yamaizumi，M．）、イー・メカダ（E．Mekada）、ティー・ウチダ（ T．Uchida）およびワイ・オカダ（Y．Okada）、Ｃｅｌｌ １５：２４５−２５ ０（１９７８）。これらの毒素は、ＡサブユニットおよびＢサブユニットからな る同様の基本構造を有しているようであり、ここで、Ｂサブユニットは細胞表面 に結合し、細胞へのＡサブユニットの移動を促進し、Ａサブユニットは酵素的毒 素活性を有する。アール・コリア（Collier，R．）とジェイ・コンデル（J．Kon del）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：１４９６−１５０３（１９７１）； およびディー・ギル（Gill，D.）とエー・パッペンハイマー（A．Pappenheimer ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：１４９２−１４９５（１９７１）。ＤＴ のＡサブユニット（ＤＴ−Ａ）は、伸長因子２中のＮＡＤから通常のアミノ酸（ ジプタミド（dipthamide））へのＡＤＰ−リボゾームの移動を触媒する。ティー ・ホンジョー（Honjo，T．）、ワイ・ニシズカ（Y．Nishizuka）およびオー・ハ ヤイシ（O．Hayaishi）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：３５５３−３５５ ５（１９６８）；およびディー・ギル（Gill，D.）、エー・パッペンハイマー（ A．Pappenheimer）、アール・ブラウン（R．Brown）およびジェイ・クルニック （J．Krunick）、Ｊ．ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １ ２９：１−２１（１９６９）。そのような結合は、細胞のタンパク質合成を停止 させ、細胞にとって致死的である。選択された細胞内にＤＴ−Ａを送達するかこ の発現を試みる多くの治療上の方策があり、例えばＤＴ−Ａの遺伝子発現の転写 制御がある。(ディー・エフ・ロビンソン（Robinson，D.F.）、ティー・エィチ ・マクスウェル（T.H．Maxwell）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（６）２：１ ３７−１４５，１９９５；ディー・アール・クック（Cook D.R．）ら、Ｃａｎｃ ｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．９（２）：１３１−１４１、１９９４；ティー・ジェイ ・クリエル（Curiel，T.J.）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４（６）：７４ １−７４７，１９９３）。発明の要約 本発明は、トランス−スプライス機構を介してユニークなｔｈ−ｍＲＮＡを作 成することによる、目的の標的細胞中の異種遺伝子産物の制御発現のための新規 方法を提供する。このユニークｍＲＮＡは、以下の機能の１つを有する：治療効 果のあるタンパク質をコードする、標的細胞を選択的に死滅させる、マーカーと して機能する、または通常は標的細胞中には存在しない新規遺伝子産物を提供す る。 トランス−スプライスに使用されるＲＮＡ、ＤＮＡ、またはヌクレオチド類似 体は、トランス−スプライス後のその発現産物が細胞の死を引き起こすものであ る（例えば、ジフテリア毒素サブユニットＡの１つの分子の発現は、ヒトの細胞 を死滅させるであろう）。別の実施態様において、発現産物は、細胞により分泌 される。さらなる実施態様において、治療用ＲＮＡ自身が、細胞内で目的の機能 を果たす。図面の簡単な説明 図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、本発明のプレ−治療用分子の構造を示す。 これらの構造は、５つの主要な特徴を有する： １）標的結合領域： 選択されたプレ−ｍＲＮＡの標的領域に対して相補的であるかまたはアンチセ ンス配向にある、少なくとも１５〜３０（数百まで）ヌクレオチドの１つまたは ２つの結合ドメイン（第２の標的結合領域は、分子の３’末端に位置してもよい ）。他の結合ドメインは、ＰＴＭに取り込まれることができる。結合ドメインは 、標的ｍＲＮＡ中の下流のエキソンをスプライスするのに必要な部位（例えば、 分岐点アデノシン、スプライソソーム結合部位、ポリピリミジン領域、またはス プライス部位）を覆うかまたは阻止する能力のような特徴により増強される。 ２）スペーサー領域： 治療用ＲＮＡスプライス部位を標的結合ドメインから分離するためのスペーサ ー領域。スペーサー領域は、スプライスされていない治療用ＲＮＡの翻訳を阻止 する停止コドン、および標的へのスプライスを増強する配列のような特徴を有し てもよい。 プレ−治療用分子（ＰＴＭ）のための「安全装置」を、スペーサー、結合ドメ イン、またはＰＴＭ内のいずれかに取り込んでもよい（図１−Ｂ）。これは、比 較的弱い相補性によりＰＴＭの３’スプライス部位および／または５’スプライ ス部位の成分を覆って、非特異的トランス−スプライスを防ぐ、ＰＴＭの領域で ある。ＰＴＭの結合／標的部分のハイブリダイゼーションにより、３’スプライ ス部位が露出し、充分に活性になる（図１−Ｃを参照）。 「安全装置」は、シス−配列の１つまたはそれ以上の相補的区間（または、第 ２の異なる核酸鎖）からなり、ＰＴＭの分岐点片側または両側、ピリミジン領域 、および／または３’スプライス部位（スプライス成分）に弱く結合するか、ま たはスプライス成分自身の一部に結合できる。この「安全装置」結合は、スプラ イス成分が活性になるのを防止するであろう（すなわち、Ｕ２ ｓｎＲＮＰまた は他のスプライス成分が、ＰＴＭスプライス部位認識成分に結合するのを阻止す る）。「安全装置」の結合は、ＰＴＭの標的結合領域が標的プレ−ｍＲＮＡに結 合し、こうしてＰＴＭスプライス成分を露出させ活性化（これらが、標的プレ− ｍＲＮＡにトランス−スプライスされることを可能にする）することにより、破 壊される。 ３）３’スプライス部位および／または５’スプライス部位 これは、分岐点、ピリミジン領域および３’スプライス部位を含有する。 ４）治療用遺伝子： 標的ｍＲＮＡ内でスプライスされ次に発現されて、細胞の死滅のような治療効 果を現す、１つまたはそれ以上の例えばジフテリア毒素のような治療用遺伝子（ 治療用遺伝子は、例えば、欠失している機能の回復、マーカーとして作用、また は不要な細胞の死滅、のような臨床的に有用な機能を与えるものであり得る）。 ５）スプライスおよび翻訳を調節する配列 スプライスを増強するためのポリアデニル化シグナルまたは５’スプライス配 列、追加の結合領域、「安全装置」−自己相補的領域、追加のスプライス部位、 または分子の安定性を調節する（分解を防ぐ）保護基のような、追加の特徴を、 毒素遺伝子の後（または前）に付加することができる。 図２は、プレ−治療用ＲＮＡの結合とトランス−スプライスを示す。 ２ａ）細胞が次にＡ−Ｂタンパク質を発現するための正常な経路である、Ａ−Ｂ プレ−ｍＲＮＡからＡ−Ｂ ｍＲＮＡへのシス−スプライス産物。 ２ｂ）相補的塩基対合によりＡ−Ｂ プレ−ｍＲＮＡに結合したプレ−ｔｈ−Ｒ ＮＡ分子。この例では、結合領域はシス−分岐点アデノシンを阻止し、５’オー バーハングはシス−ピリミジン領域を部分的に妨害する。これは、エキソンＢの シス−スプライスを破壊し、トランス−スプライスの候補としてプレ−ｔｈ−Ｒ ＮＡ毒素遺伝子を、エキソンＡに提示する。 ２ｃ）Ａ−Ｂ プレ−ｍＲＮＡとプレ−ｔｈ−ＲＮＡのトランス−スプライス産 物。エキソンＡは毒素遺伝子に結合し、これは充分に機能する異種治療用ＲＮＡ 分子（ｔｈ−ｍＲＮＡ）中で発現される。このｍＲＮＡの翻訳は、発現する細胞 を死滅させる。 図３は、ジフテリア毒素の地図と配列を示す。サブユニットＡのコード領域は 、ヌクレオチド３１２〜８９０である。 図４は、本発明のプレ−治療用分子の作製を示す。 図５は、ベータＨＣＧの地図と配列を示す。 図６ＡとＢは、トランス−スプライス反応の結果を示す。図６Ａは、ＲＴ−Ｐ ＣＲ産物のアガロースゲルを示し、図６Ｂは、トランス−スプライスされた生成 物のヌクレオチド配列を示す。 図７は、例５のトランスフェクション毒性測定法の結果を示す。発明の詳細な説明 前述のように、本発明は、細胞内で治療用分子を産生する手段としての、標的 とされたプレ−メッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）トランス−スプライス の使用に関する。治療用分子自身は、目的の機能を提供するか、または特定の型 の細胞で遺伝子産物を産生する。遺伝子産物は、臨床的有用性を有する遺伝子（ 例えば、治療用遺伝子またはマーカー遺伝子、および毒素）を含む任意の遺伝子 である。本発明の１つの実施態様において、送達される遺伝子は、毒素遺伝子で あり、ここで１つの分子の発現は、標的とされたプレ−ｍＲＮＡを含有する細胞 に対して致死的である。 １つの実施態様において、本発明は、特異的ｍＲＮＡを作成して、選択された 細胞集団内で治療用毒素遺伝子を発現させ、その結果その特定の細胞を破壊する 方法に関する。標的とされる細胞には、ウイルスまたは他の感染性物質に感染し たもの、良性または悪性新生物、または自己免疫疾患もしくは組織拒絶に関与す る免疫系の成分があるが、これらに限定されない。特異性は、標的に結合するよ うにＰＴＭの結合ドメインを修飾することにより達成される。 本発明の方法の１つの実施態様を含む工程は： ｉ）当業者により使用される任意の型の前駆体分子、治療用ＲＮＡ分子（または 、ＲＮＡに転写されるＤＮＡベクター、または合成類似体）を、細胞の核に送達 する工程であって、ここで前駆体治療用ＲＮＡ（プレ−ｔｈＲＮＡ）は、異なる 機構により、標的プレ−ｍＲＮＡ、スプライス部位、治療用遺伝子に結合する結 合領域を含有し、かつポリアデニル化シグナル、エンハンサー、または他の調節 配列成分を含有してもよい［図１のパートＡ、Ｂ、およびＣを参照］； ii）標的とされたプレ−ｍＲＮＡにより前駆体治療用ＲＮＡ分子をトランス−ス プライスして、治療用翻訳可能なｍＲＮＡを作成する工程［図２ｂを参照］；そ して iii）標的細胞内でトランス−スプライスされた治療用ｍＲＮＡを発現（翻訳） する工程［図２ｃを参照］。 標的細胞は、プレ−ｍＲＮＡのユニークな集団を発現することが知られている 任意の細胞であり、プレ−ｍＲＮＡはトランス−スプライス反応の基質として使 用することができる。このユニークな集団は、１つのユニークな型のＲＮＡであ るか、または、他の型のいかなる細胞中でも、群として一緒には発現されないい くつかのものである。前駆体治療用ＲＮＡは、標的とされたプレ−ｍＲＮＡに特 異的な結合領域を含有するであろう。 プレ−治療用分子は、任意の送達方法、例えば、ウイルス介在、電気穿孔法、 微量注入法、リン酸カルシウム介在トランスフェクション、リポソーム、サイト フェクチンにより、または直接、細胞に投与される。プレ−治療用分子は、治療 用分子自身の目的の量を産生するのに有効な量で投与されるであろう。投与され る正確な量は、送達システムの詳細に依存して変化してもよい。有効量はまた、 欠失している機能（例えば、遺伝的疾患の治療における）、細胞死滅（例えば、 癌の治療における）、または細胞制御（異なるタイプの疾患とともに使用されて もよい）を提供する。有効量は、患者の体重１kg当たり０．００１ピコグラムま たはそれ以下から１．０ｇ核酸の範囲でもよい。 治療用分子は、臨床的に有用な何らかの機能（例えば、欠失している機能の回 復、マーカーとしての作用、または不要な細胞の死滅）を提供するものであり得 る。 １つの実施態様において、プレ−治療用ＲＮＡ分子は、４つの主要な特徴を有 する翻訳不可能な１本鎖ＲＮＡである：１）ユニークなプレ−ｍＲＮＡの標的と された領域に対して相補的であり、かつアンチセンス配向にある少なくとも１５ 〜３０ヌクレオチド（および、最高数百ヌクレオチドまたはそれ以上）の１つま たは２つの結合ドメイン。これは、結合の特異性を与え、プレ−治療用ＲＮＡを スペース内に密接に固定して、核のスプライソソームのプロセシング機構が、こ れを標的プレ−ｍＲＮＡにトランス−スプライスすることができるようにする。 結合ドメインは、標的プレ−ｍＲＮＡ中の下流のエキソンをシス−スプライスす るのに必要な部位（例えば、分岐点アデノシン、スプライソソーム結合部位、ポ リピリミジン領域、または真正３’もしくは５’スプライス部位）を被覆するか または阻止する能力のような特徴により増強し得る。２）プレ−治療用ＲＮＡス プライス部位を、標的と並ばせるためのスペーサー領域。このスペーサー領域は 、スプライスされていないプレ−治療用ＲＮＡの翻訳を阻止する停止コドン、お よび標的へのスプライスを増強する配列のような特徴を有することができる。こ のスペーサーはまた、スプライス部位から結合ドメインを分離する作用を有する （および、「安全装置」ドメインを含有してもよい）。３）３’スプライス部位 。４）ジフテリア毒素のような１つまたはそれ以上の治療用遺伝子であり、これ は、スプライスされて標的ｍＲＮＡになり、次に発現されて、治療効果（例えば 、悪性腫瘍を治療している時に好ましい細胞死滅）を示す。必要に応じて毒素遺 伝子（読みとり枠）の後に、分子に追加の特徴（例えば、スプライス、翻訳およ び発現につながる工程を増強するためのポリアデニル化シグナルまたは５’スプ ライス配列）があってよい。スプライスされたＲＮＡ自身が治療用分子である本 発明の実施態様において、治療用遺伝子はないかも知れないが、目的の効果を有 するＲＮＡはある。トランス−スプライスは、任意の公知の機構により仲介され る（群Ｉ、群II、またはスプライソソーム）。 本発明の方法は、癌、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、および他の重篤なウイルス感染症、 自己免疫疾患、ならびに特定の型の細胞の変更または排除が有効である他の病状 の治療において、大きな臨床的用途を有する。この例としては、良性の前立腺肥 大、および他の前癌症状がある。さらに、本方法はまた、遺伝的疾患（例えば、 少量の欠失しているかまたは突然変異遺伝子産物の発現が正常の表現型を示すゴ ーシェ病）の治療に使用することもできる。 別の実施態様において、ＰＴＭは、前述の特徴を有する翻訳不可能な１本鎖Ｒ ＮＡである：１）１つまたは２つの結合ドメイン；２）スペーサー領域；３）５ ’スプライス部位、および４）１つまたはそれ以上の治療用遺伝子、および追加 の特徴（他の例で記載したように）を与える追加の配列がある。トランス−スプ ライスは任意の公知の機構（例えば、群Ｉ、群II、またはスプライソソーム）に より仲介される。 トランス−スプライスの最大化 １．プレ−ｔｈ−ＲＮＡは、ＢＰＡから５’および３’を補足し結合するよう に作製され、分岐点アデノシン（これを阻止する）を含有してもしなくてもよい 。これは、最適化アンチセンス結合ドメインを見つけることを可能にする。 ２．ＰＴＭを、プレ−ｔｈＲＮＡ中の分岐点アデノシンを含有させてまたは含 有させずに作成し、ＢＰＡを含有させることにより（非標的ｍＲＮＡ内に）非選 択性スプライスが起きるかどうかを決定する。 ３．ＰＴＭを、結合ドメインとスプライス部位の間の領域に停止コドンまたは 他の成分を含有させてまたは含有させなくて作成し、そのような成分がスプライ スされていないプレ−ｔｈＲＮＡ発現を必ず防止するかどうかを決定する。 ４．ＰＴＭを、毒素遺伝子の強いポリアデニル化シグナルまたは下流のエンハ ンサーまたは下流の５’スプライス配列を含有させてまたは含有させなくて作成 し、これらの成分がトランス−スプライスを促進するかどうかを決定する。 ５．ＰＴＭを、毒素遺伝子の下流に第２のアンチセンス結合ドメインを含有さ せてまたは含有させなくて作成し、このような成分が３’標的エキソンへの結合 を促進し、かつ伸長を促進して真正シス−３’スプライス部位（Ｕ５および／ま たはＵ１結合部位）を阻止するかどうかを決定する。ＰＴＭはまた、トランス− スプライスされた産物の発現のための第２のトランス−スプライスを必要とする ように作成してもよい。 ６．さらなる成分（例えば、３’ヘアピン構造、環状化ＲＮＡ、ヌクレオチド 塩基修飾、または合成類似体）を作製体中に取り込んで、核局在化やスプライソ ソーム取り込み、および細胞内安定性を促進させる。 ７．最終治療用作製体は、外部の細胞膜から送達されて、核に移動して標的プ レ−ｍＲＮＡのスプライソソームに取り込まれる必要があるか、またはこれらは 、前駆体分子（ＤＮＡベクター、ＲＮＡウイルスなど）から細胞自身により産生 されてもよい。 送達システム 本発明は、他の遺伝子治療またはアンチセンス法のために開発された任意の公 知の送達システムを使用することができる。プレ−治療用ＲＮＡは、作成し、パ ッケージングし、細胞への取り込みのために試験する必要がある。化学合成は約 １００ヌクレオチドに限定されているように、現在完全長プレ−ｔｈ−ＲＮＡの 化学合成は現実的ではないが、可能であろう。完全長プレ−ｔｈ−ＲＮＡは、Ｐ ＣＲ増幅した鋳型から（高忠実度酵素を使用して）、または適切なプロモーター が取り込まれたクローン化したＤＮＡから転写される。また使用可能なＱ−β増 幅法のようなＲＮＡ増幅法がある。スプライスされたｔｈ−ＲＮＡは精製して、 配列決定するか、または標的をトランス−スプライスし、インビトロ系で毒素ま たはマーカーを産生する能力により試験する。 リポソーム、電気穿孔法。およびサイトフェクチンは、ＲＮＡを細胞に直接導 入する方法である。これらは、アンチセンスＲＮＡ送達プロトコルで広く使用さ れている。裸のまたはパッケージングされたＤＮＡは、送達の別の可能な手段で ある。ウイルス送達システムも使用される。ただし、これらは、増殖および操作 することがより高価であり、一般には容易に利用できないかも知れない。一過性 発現を有するウイルスベクター（例えば、ゲノム内に組み込まれないアデノウイ ルスやアデノ関連ウイルス）は、問題がより少ないかも知れない。核酸ポリマー はまた、これらを複製が不可能なウイルスの空の殻に結合させて送達することが できる。ディー・アール・クック（Cook，D.R.）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈ ｅｒ．９（２）：１３１−１４１（１９９４）。 例１：治療用遺伝子の選択 治療用遺伝子は、いくつかの新規機能（例えば、欠失している機能の回復、マ ーカーとして作用、または不要な細胞の死滅）を提供する任意の遺伝子である。 欠失している機能の回復のための遺伝子は、既知の遺伝疾患で欠失しているかま たは変更されている遺伝子産物を、コードする遺伝子であってよい。マーカー遺 伝子は、細胞を同定またはイメージングするために使用される特異的な異種タン パク質またはペプチドの発現を引き起こす遺伝子であってよい。細胞を死滅させ る遺伝子は、以後の治療（例えば、放射線照射または化学療法）に対する細胞の 感受性を増強する機能を提供する、単純な毒素または他の遺伝子であってよい。 ジフテリア毒素は、単純な毒素の良い例である。未変性のＤＴは、Ａサブユニ ットとＢサブユニットから構成される。ジフテリア毒素のサブユニットＡは、酵 素的毒素活性を含有し、発現されるかヒト細胞に送達されるなら機能する。Ｂサ ブユニットは、ヒト細胞への経膜的移動のために必要である。サブユニットＡは 、単独で完全な細胞に入ることができない。サブユニットＡは、Ｂサブユニット 無しで細胞膜の脂質二重層を通過することができないため、単独では非常に毒性 が低い。ジェイ・エム・シモン・ドノバン（Donovan，J.M．Simon）とエム・モ ンタル（M．Montal）、Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．２６０：８８１７−８８２３ （１９８５）。Ａサブユニットは、いくつかのコンフォメーションで存在するこ とができる。ジフテリア毒素のサブユニットＡのための遺伝子は、長さが６００ ｎｔ未満である。エル・グリーンフィールド（Greenfield，L.）、エム・ビョン （M．Bjorn）、ジー・ホーン（G．Horn）、ディー・フォング（D．Fong）、ジー ・バック（G．Buck）、アール・コリア（R．Collier）、およびディー・カプラ ン（D．Kaplan）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６ ８５３−６８５７（１９８３）。図３を参照されたい。ＤＴ−Ａペプチドは、異 種ペプチド配列が結合しており活性である。ビー・レケット（Leckett，B）、お よびアール・ジェイ・ゲルミナリオ（R.J．Germinario）、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ １０（２）：１２５−１３６（１９９２）。追加の安全策として、 細胞外の環境に放出されたＤＴ−Ａに対する免疫化が可能である。ジェイ・ティ ー・バルビエリ（Barbieri，J.T.）、ディー・アルメリニ（D．Armellini）、ジ ェイ・モルケンチン（J．Molkentin）、およびアール・ラプオリ（R．Rappuoli ）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０（１２）：５０７１−５０７７（１９９２ ）。本発明で使用できる、多くの他の公知の毒素がある。 例２：プレ−治療用分子の作製 インビトロのモデル系を使用して、最も効率的なトランス−スプライスのため のプレ−治療用分子と標的ｍＲＮＡのパラメータを決定する。 １．トランス−スプライスの証明：プレ−ｍＲＮＡ（これは、標的の分岐点アデ ノシン（ＢＰＡ）を含有し、従ってシス下流のエキソンのスプライスを阻止する ）に対して相補的なアンチセンス結合ドメインを含有する実験的プレ−ｔｈＲＮ Ａ分子（ＰＴＭ）（図４と凡例を参照）、露出したＢＰＡを含有する種々のスペ ーサー領域、３’スプライス部位およびマーカー遺伝子（ジフテリア毒素サブユ ニットＡ−（ＤＴＡ））は、すべての核スプライス成分と標的とされたプレ−ｍ ＲＮＡ（ベータＨＣＧ）を含有するインビトロ系に添加される。図５を参照され たい。トランス−スプライスは、ベータＨＣＧの５’エキソン１に相補的な１つ のプライマーとマーカー遺伝子（ＤＴＡ）に相補的な第２の（逆）プライマーを 使用する、逆転写酵素ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により証明さ れる。ＰＣＲ産物は配列決定して、上流の５’エキソンとマーカー遺伝子の正し いトランス−スプライス産物を証明した。 図６−Ａは、ＨｅＬａ核抽出物スプライス反応で６０分目に、ＰＴＭ＋スペー サー（ＰＴＭ２）は、ＰＴＭ１（ＰＴＭ＋）またはＰＴＭ４（ＴＢ＋スペーサー ）より実質的に多いトランス−スプライスされたＨＣＧ／ＤＴＡ産物を産生し、 ９０分の反応後にＰＴＭ１またはＰＴＭ４より５倍多いトランス−スプライスさ れたＨＣＧ／ＤＴＡを産生したことを示す。ＰＴＭ１とＰＴＭ４は、９０分のイ ンキュベーション後に、ほぼ等量のトランス−スプライス産物を産生した。この 実験は、１８ｎｔの結合領域は、結合ドメインと分岐部位の間のスペーサー領域 と一緒に使用される時、トランス−スプライスの特異性を顕著に上昇させること を証明している。ＰＴＭ１がＰＴＭ３（データは示していない）またはＰＴＭ４ に対してトランス−スプライスが上昇していないのは、結合ドメインがＰＴＭ１ 中の分岐点に近いためであり、これらの部位を分離するのはわずかに６ｎｔであ るため、スプライス因子が、隣接する分岐点に近づくのを、標的遺伝子への結合 が阻止するためである。比較的弱い哺乳動物のコンセンサスであるＹＮＹＵＲＡ Ｃ（ここで、Ａは分岐形成部位であり、Ｙ＝ピリミジン、Ｎ＝任意のヌクレオチ ド、およびＲ＝プリン）より活性の強い、酵母コンセンサス分岐部位を使用して ＰＴＭ作製体１〜４が産生されたため、ベータＨＣＧのプレ−ｍＲＮＡとＰＴＭ ３またはＰＴＭ４の間で少量の非標的トランス−スプライスが観察されることは 、予測できないことではなかった。さらに、ＰＴＭ作製体１〜４は、非常に強い ピリミジン領域を含有する。この分岐部位−ピリミジン領域の組合せは、スプラ イス因子（例えば、Ｕ２ ＡＦおよびＵ２ ｓｎＲＮＰ）への結合傾向、および 非常に効率的にスプライスする傾向の強いＰＴＭを与える。さらに、標的ベータ ＨＣＧプレ−ｍＲＮＡとプレ−治療用分子の濃度は、この実験では生理的濃度以 上であり、これは非標的（つながった）トランス−スプライスの確率を上げる。 ＰＴＭとベータＨＣＧのエキソン１との結合はトランス−スプライスの結果で あることを証明するために、ＰＴＭ５とＰＴＭ６は、ピリミジン領域と３’スプ ライス部位を排除するように設計されている。ＰＴＭ７は、３’ＡＧスプライス 部位のみを除去するために作成した。ビー・パッターソン（Patterson B）とシ ー・ガスリー（Guthrie C）、Ｃｅｌｌ ６４：１８１−７（１９９１）。完全 な細胞内の特異性は治療への応用により関係があるため、ＰＴＭ５〜７は、トラ ンスフェクションされた組織培養実験で試験されている。 この実験モデルのイントロンは、５’スプライス部位、分岐点、ピリミジン領 域、および３’スプライス部位を含有する、アデノウイルス２主要後期プロモー ターリーダー１およびリーダー２スプライスユニットの部分にクローン化する。 この配列は、上流にＴ７ ＲＮＡプロモータ-を有するｐｃＤＮＡ３，１（イン ビトロゲン社（Invitrogen Corp.）のような発現ベクター内にクローン化し、そ の結果、スプライスユニットのＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ストラタ ジーン（Stratagene））を使用して転写できる。このような挿入体の１つのヌク レオチド（ＤＮＡ）配列は次の通りである： ｐｃＤＮＡＩＩ−Ｔ７プロモーター 5'-３’マーカー配列 記号： ＊＝５’スプライス部位；CATACT..＝結合の標的領域；ＢＰＡ＝分岐点アデノシ ン；＃＝Ｐｙ領域；**＝３’スプライス部位 モデルイントロンの３’末端は、マーカー配列（例えば、Ｓｐ６プロモーター または発現可能なペプチド選択マーカー）を含有し、その結果正しくスプライス された生成物は、スプライスされていないＴ７転写体より短いｍＲＮＡ配列とし て電気泳動分離により検出できる。スプライスされた生成物はまた、Ｔ７および Ｓｐ６配列に対するプライマー（または、使用されるマーカーに対する適切なプ ライマー）を使用してＰＣＲ増幅により検出できる。 プレ−治療用ＲＮＡ分子のいくつかの領域は変化しており、特異的にトランス −スプライスする能力について試験し、トランス−スプライスの頻度を測定する 。 ａ）結合ドメイン−ピリミジン領域と分岐点の標的化： プロモーターの標的配列 モデルプレ−ｔｈＲＮＡ分子記号： AAAAGG..＝結合の標的領域；+++++＝スペーサー領域；ＢＰＡ＝分岐点アデノ シン；＃＝Ｐｙ領域；**＝３’スプライス部位；ACCCAG＝ＨＳＶタンパク質マー カー；CACCAC...＝ヒスチジンタンパク質マーカー；！＝停止コドン。 ヒスチジンタンパク質マーカーを含有させると、金属キレートクロマトグラフ ィーを使用して検出が可能になり、ＨＳＶタンパク質マーカーは、モノクローナ ル抗体を使用する検出を可能にする。これらの試薬はノバゲン社（Novagen，Inc ．）から入手できる。 ｂ）上記と類似であり、異なる相補的結合領域を有する、標的／阻止に対する最 適化領域を確認するためにかつトランス−スプライス反応を増強するために、標 的分子内でより５’または３’にハイブリダイズするようにシフトしている、追 加のモデルプレ−治療用ＲＮＡ分子が作成される。トランス−スプライスの効率 を上げたり下げたりするために、スプライスを調節する他の配列成分が加えられ る。 例３：インビトロスプライス反応 これらのＤＮＡ配列は、発現プラスミドと宿主にクローン化した。配列は、サ ンガー（Sanger）のジデオキシＤＮＡ配列決定により証明した。ＲＮＡはプラス ミドＤＮＡまたはＰＣＲ増幅した鋳型から作成し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを 使用して転写した。標的またはプレ−ｔｈ−ＲＮＡを［ＳＹＭＢＯＬ９７＼ｆ「 ｓｙｍｂｏｌ」３２Ｐ］ＵＴＰの存在下で合成される。完全長プレ−ｍＲＮＡと 標的は、ゲル電気泳動により精製される。エス・エフ・ジャミソン（Jamison，S .F．）、エー・クロウ（A．Crow）、およびエム・エー・ガルシア−ブランコ（M .A．Garcia-Blanco）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４２７９−４２８ ７（１９９２） ジェイ・ディー・ディグナム（Dignam，J.D.）ら（Ｎｕｃ１．Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．１１：１４７５−１４８９、１９８３）の方法を使用して核抽出物を作成 した。インビトロスプライス測定法は、エム・エー・ガルシア−ブランコ（M.A. Garcia-Blanco）、エス・エフ・ジャミソン（Jamison，S.F．）、ピー・エー・ シャープ（P.A．Sharp）（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．３：１８７４−１８８ ６、１９８９）のように行った。スプライス反応物は、種々の時間インキュベー トする。終了後、反応生成物をポリアクリルアミドゲルの電気泳動で分離する。 スプライス複合体は、非変性アクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグ ラフィーで視覚化する。インビトロのスプライス産物は、変性アクリルアミドゲ ルで解析する。ジャミソン（Jamison）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ．１２ ：４２７９−４２８７（１９９２）。 スプライスした生成物は、未変性のシス−スプライスした生成物に対して特異 的であるか、またはハイブリッドトランス−スプライスした生成物に対して特異 的なプライマーを使用して、別の反応中で逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により 、標的ｍＲＮＡ５’エキソンに相補的な５’プライマー、およびトランス−スプ ライスしたマーカーまたは治療用遺伝子に対して相補的な３’プライマーを用い て解析した。同じ５’プライマーを使用して、シスおよびトランス−スプライス した生成物を検出した。結合ドメインの特異性により提供されるトランス−スプ ライスが上昇している（ゲル、図６Ａを参照）。 スプライスした生成物はまた、無細胞翻訳系で発現され、トランス−スプライ スした生成物は、ある条件下で（すなわち、もしトランス−スプライスの速度が 、検出のためのマーカータンパク質の充分な濃度を産生するのに充分なだけ高い なら）ウェスタンブロットとタンパク質配列決定により検出される。 例４：競合的インビトロスプライス反応 本例は例３と同じであるが、ほんのわずかの限定された量の標的とされたプレ −ｍＲＮＡを有するプレ−ｍＲＮＡ分子の混合物を含有する。これは、おそらく 好適なシス−スプライス反応の存在下でトランス−スプライス反応の証明を可能 にする。ＲＴ−ＰＣＲは、競合する標的ではないプレ−ｍＲＮＡの存在下で、標 的プレ−ｍＲＮＡとプレ−ｔｈＲＮＡとの間のトランス−スプライスの特異性を 測定するのに使用される。可能なランダムトランス−スプライスを検出するため に、マーカー配列に対するプライマーおよび標的ではないプレ−ｍＲＮＡに対し て特異的なプライマーを使用して、追加のＲＴ−ＰＣＲ増幅が行われる。 例５：ヒト肺癌培養細胞中のトランス−スプライス反応 ユニークな遺伝子（プレ−ｍＲＮＡ）を発現する標的細胞の治療的除去（死滅 ）は、本発明のプレ−治療的毒素分子を使用して行われることを証明するために 、ヒト肺癌の細胞培養モデルを使用した。図７を参照されたい。混合細胞実験を 使用して、標的細胞のみが排除されることを証明する。インビトロ実験で同定さ れるうまくいったプレ−ｔｈＲＮＡ作製体は、細胞培養実験で使用するために適 当に修飾された。細胞死滅の特異性を改良（例えば、「安全装置」の追加）する ための実験が、現在進行中である。 予備的実験は、第１世代のＰＴＭは、標的ではない（無差別の）トランス−ス プライスが高率に有することを示唆する。第１世代ＰＴＭはスプライス効率を最 大にするように設計されているため、これは予測しなかった結果ではない。特異 性を改良するためのいくつかの修飾が試験されている。これらには、以下のもの がある： １．ＰＴＭのスプライス成分の一部またはすべてを被覆するための「安全装置」 の追加。 ２．効率がより低いスプライス成分になるように、分岐点とピリミジン領域の配 列を変化させる。 ３．ベータＨＣＧの末端抽出物の３’スプライス部位に対する５’ドナースプラ イス部位として作用して、細胞質への排出および治療用キメラタンパク質の翻訳 に必要なポリアデニル化シグナルが得て、ポリアデニル化シグナルを含まないよ うに、しかし第２のトランス−スプライス反応を受けることができるように、Ｐ ＴＭの３’末端を変化させる。 ４．誘導性発現ベクターへのＰＴＭのクローニング、ここで転写されるＰＴＭの 量は制御可能である（おそらく、トランス−スプライスは普通に起きることであ る）。 例６：ヒト子宮頚癌細胞株でのトランス−スプライス反応 安定性と、特異的部位に結合し、スプライスが好ましい細胞の部位でプレー治 療用分子が産生、そこに移送、および／または送達されることを確保する能力に ついて、作製体は最適化される。核内でプレ−ｔｈ−ＲＮＡ作製体を産生する、 真核生物発現プラスミドを使用して予備試験を行い、従って特異的結合、標的と されたトランス−スプライス、および安定性は、最初のプレ−治療用分子の設計 目標である。誘導性プロモーターを含有するベクターは、便利性について、また は細胞中のＰＴＭの濃度を制御するために使用される。プレ−治療用ＲＮＡの誘 導は、培地への単純な非毒素化学物質の導入により達成される。例えば、ＩＰＴ Ｇは、ｐＯＰ１３ ＣＡＴ（ストラタジーン（Stratagene））中の挿入体の転写 を誘導する。追加の第２の選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性）もまた取 り込まれる；このようなマーカーにより、ベクターを摂取した細胞のみが、選択 増殖条件下で生存するであろう。 ユニークな遺伝子標的を有する他の可能な疾患モデルは以下のものがある：パ ピローマウイルスウイルスＥ６またはＥ７タンパク質を発現するヒト子宮頚癌細 胞株、前立腺特異的抗原を発現する前立腺癌細胞株、ＣＥＡタンパク質を発現す るヒト肝臓癌細胞、または組織特異的遺伝子産物（膵臓、肝臓、乳房、大腸、黒 色腫）を発現するか、悪性腫瘍関連タンパク質（例えば、ＨＣＧ（絨毛性性腺刺 激ホルモン））を産生するか、ｂｃｒａｂｌ融合遺伝子産物ｔ（９ａ３４；２２ ｑ１１）を有する白血病、または他の染色体転座融合遺伝子を産生する他の細胞 株。 次にパピローマウイルスモデル系を試験する。子宮頚部異形成および子宮頚癌 の治療は、大きな臨床的な問題である。このモデルは、癌およびウイルス感染症 の両方に対する有効性を証明する能力を提供する。Ｅ６およびＥ７遺伝子を発現 するパピローマウイルスの血清型１６または１８で感染した女性は、子宮頚癌を 発症するリスクが高い。 最初の研究は、選択可能な発現プラスミドでトランスフェクションされる細胞 株で行われる（Ｅ６とＥ７を含有するパピローマウイルス１８型の連続的領域お よび５’スプライス部位、ＢＰ、ピリミジン領域および標的の３’スプライス部 位を含有するスプライス領域がクローン化されている、プラスミドｐＲＥＰ４（ ストラタジーン（Stratagene）から入手できる（プラスミド１））により与えら れるヒグロマイシン耐性のような、通常は毒性のある抗生物質の存在下で増殖す る能力）。 トランス−スプライスの証明：上記細胞株は、異なる選択マーカー（例えば、 ｐｃＤＮＡ Ｉ Ｎｅｏ（ストラタジーン（Stratagene））により提供されるＧ ４１８（ネオマイシン）耐性）、および発現プラスミド１により作成されるプレ −治療用ＲＮＡをコードする発現カセットを有する、第２の発現プラスミド（プ ラスミド２）でトランスフェクションされる。前述のように、プレ−ｔｈＲＮＡ 分子は、アンチセンス結合ドメイン（標的プレ−ｍＲＮＡのＢＰＡを阻止する） 、スペーサー領域、分岐点、ピリミジン領域、３’スプライス部位およびマーカ ーもしくは毒素遺伝子、およびスプライス調節配列を有する。トランス−スプラ イスされる遺伝子が毒素遺伝子である場合、これらの細胞はあまり長く生存でき ないと予測される。トランス−スプライスは、マーカータンパク質（マーカー遺 伝子の場合）または毒素の発現により証明される。毒素は、抗体により検出でき るか、またはハイブリッドｍＲＮＡの存在はＲＴ−ＰＣＲにより検出される。 トランスフェクションされた細胞は、エル−デイリー（El-Deiry）ら（Ｃｅｌ ｌ ７５：８１７−８２５、１９９３）の方法に従う増殖阻害測定法により測定 した。細胞を発現プラスミドでトランスフェクションした。コロニーは、Ｇ４１ ８の存在下での増殖に基づいて選択される。細胞を拡張し、３つの群に分け、以 下を含有するプラスミドでトランスフェクションした：ａ）真正毒素遺伝子を有 するプレ−ｔｈＲＮＡに結合する標的（ＰＴＭ２）、ｂ）突然変異したまたはア ンチセンス配向毒素遺伝子を有するプレ−ｔｈＲＮＡ（ＰＴＭ８）、ｃ）挿入体 無し（ｐｃ３．１ベクター対照）、またはｄ）非標的結合（非均一）ＰＴＭであ るＰＴＭ４。増殖阻害は、作成される抗生物質耐性コロニーの数の減少として測 定される。ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ベースのベクターは、標的細胞での トランスフェクション遺伝子の構成的高レベルの発現を可能にする。結果を図７ に示す。まずプラスミド２でそして完全なまたは突然変異した標的プラスミド（ プラスミド１）でトランスフェクションした細胞で始めて、逆実験を行うことが できる。 ２重トランスフェクション実験の簡単な説明：細胞をシャーレに入れ、一定量 のプラスミド１（ヒグロマイシン耐性を有する標的）、通常２μｇのＤＮＡ、お よび種々の濃度のプラスミド２（プレ−ｔｈ−ＲＮＡとＧ４１８耐性を含有する ）でトランスフェクションする。Ｇ４１８および／またはヒグロマイシンで２〜 ３週間インキュベートして耐性コロニーの選択。コロニーをメチレンブルーで染 色し、計測する。 測定結果−理論値： １．対照（トランスフェクション無し）−コロニー無し ２．対照（２μｇのプラスミド１）−２００〜５００コロニー ３．対照（毒素遺伝子［欠失しているかまたは突然変異している］の無い２μｇ のプラスミド２、および２μｇのプラスミド１）−２００〜５００コロニー ４．２μｇのプラスミド１および２μｇのプラスミド２−２０〜５０コロニー ５．２μｇのプラスミド１および２０μｇのプラスミド２−２〜５コロニー 結論：プラスミド２（プレ−ｔｈＲＮＡ分子中に機能性毒素遺伝子を含有する ）は、これらの細胞の増殖を阻害する。 交互トランスフェクション実験の簡単な説明：細胞をシャーレに入れ、種々の 濃度のプラスミド２（プレ−ｔｈ−ＲＮＡとＧ４１８耐性を含有する）でトラン スフェクションする。Ｇ４１８および／またはヒグロマイシンで２〜３週間イン キュベートして耐性コロニーの選択。コロニーをメチレンブルーで染色し、計測 する。 測定結果−理論値： １．対照（トランスフェクション無し）−コロニー無し ２．対照（４μｇのプラスミド１）−２００〜５００コロニー ３．対照（毒素遺伝子［欠失しているかまたは突然変異している］の無い４μｇ のプラスミド２、および４μｇのプラスミド１）−２００〜５００コロニー ４．４μｇのプラスミド１および４μｇのプラスミド２−２０〜５０コロニー ５．４μｇのプラスミド１および２０μｇのプラスミド２−２〜５コロニー 結論：プラスミド２（プレ−ｔｈＲＮＡ分子中に機能性毒素遺伝子を含有する ）は、これらの細胞の増殖を阻害する。 細胞増殖阻害は、毒素の発現の結果であり、２本鎖ＲＮＡが細胞内に存在する 時に予測されるようなサイトカイン（例えばインターフェロン）産生の結果では ないことを証明するために、対照実験を行う。これらの実験において、結合性が なくなるように結合ドメインを変化させるか、フレームシフトナンセンス点突然 変異の挿入、もしくはアンチセンス配向の毒素遺伝子の挿入により発現できなく なるように、毒素遺伝子を突然変異させる（しかし、残りの作製体は変化がない ）。プラスミド１と結合ドメインの無いまたは発現できない毒素遺伝子を有する プラスミド２でトランスフェクションした細胞は、プレ−ｔｈＲＮＡ作製体の無 い細胞と同様に増殖する。 混合細胞実験を行う。これらには、プラスミド１の無い細胞を、プラスミド１ を有する細胞とともにプラスミド２でトランスフェクションする研究を含む。最 終集団は、Ｇ４１８（プラスミド２が与える耐性）の存在下で充分増殖するが、 選択的物質１の存在下では増殖しない（両方のプラスミドを含有する細胞は、ト ランス−スプライスされた毒素により排除される）。隣接する細胞内での毒素の 発現は、標的ではない細胞の生存に影響を与えないことを証明するために、追加 の混合培養を行ってもよい。 例７：動物実験 第１相（マウス） 誘導性プレ−ｔｈＲＮＡプラスミドで形質転換した細胞をマウスに投与する。 これらの細胞は、上記の細胞培養モデルで成長させ、トランス−スプライス可能 な作製体の前で誘導性プロモーターを有する、病気になった動物を得る。次にベ クターを誘導し、毒素を発現させて疾患細胞を死滅させると動物は健康なままで ある。この後者の点は、毒素遺伝子の誘導は全身的な副作用を有さないことを証 明するのに重要である。疾患細胞の一部はまた誘導後まもなく調べて、毒素遺伝 子発現の証拠について抗体で検索し、逆転写ＰＣＲを行ってトランス−スプライ スが起きたことを証明する。長期の生存と可能な毒性についてマウスを追跡する 。無胸腺マウスを使用して、ヒト細胞を増殖させる。あるいは、電気穿孔法また はリポソームによりＰＴＭを投与することもできる。 第２相−治療用概念の証明 この相では、形質転換していない疾患細胞を有する動物を使用する（好ましく は、無胸腺マウス中のヒト細胞）。ベータＨＣＧを発現するヒト膵臓または肺癌 細胞を、前述の実験について開発したＰＴＭとともに使用する。上記細胞モデル で使用したパピローマウイルス１８型の標的領域を含有するヒト子宮頚癌細胞を 使用することができる。ヒト膵臓癌または子宮頚癌を有する無胸腺マウスに、送 達可能な型のプレ−治療用ＲＮＡ作製体を注入する化または電気穿孔を行う。対 照動物には、発現不可能な毒素遺伝子を有するプレ−ｔｈ−ＲＮＡすなわちシャ ム（非標的結合）プレ−ｔｈ−ＲＮＡを投与する。前述のように長期生存と毒性 について動物を調べる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成９年７月１５日（１９９７．７．１５） 【補正内容】 （１） 第２の 工程では、５’エキソンは、ラリアット生成物としてイントロンを放出しながら ３’エキソンに結合する。これらの工程は、小さな核リボヌクレオタンパク質と スプライソソーム（spliceosome）と呼ばれるタンパク質との複合体中で触媒さ れる（ムーア（Moore）ら、Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ）。 エステル交換スプライス反応部位は、５’および３’スプライス部位の周りの 共通配列（consensus sequences）により規定される。５’スプライス部位共通 配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵである（ここで、Ｎ＝任意のヌクレオチド、Ａ＝ア デノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリン、Ｙ＝ピリ ミジン、および／＝スプライス部位である）。ムーア（Moore）ら、Ｔｈｅ Ｒ ＮＡ Ｗｏｒｌｄ。下線を引いたヌクレオチド配列は、ほとんどすべてのプレ− ｍＲＮＡイントロンに対して共通であり、まれに例外的にＧＵの代わりにＧＣが 存在することがある。３’スプライス部位は、３つの異なる配列成分からなる： 分岐点または分岐部位、ポリピリミジン領域、および３’共通配列。これらの成 分は、３’スプライス部位領域をゆるく規定し、これは３’スプライス部位の上 流の１００ヌクレオチドのイントロンを含むこともある。哺乳動物の分岐点共通 配列は、ＹＮＣＵＧＡＣである。下線を引いたＡは、分岐形成の部位である（Ｂ ＰＡ＝分岐点アデノシン）。３’スプライス共通配列は、ＹＡＧ／Ｇである。分 岐点とスプライス部位の間に、通常ポリピリミジン領域があり、これは、効率的 な分岐点利用と３’スプライス部位認識のために哺乳動物系において重要である （アール・ロスシグノ（Roscigno，R.）、エム・ウェイナー（M．Weiner）およ びエム・エー・ガルシアーブランコ（M.A．Garcia-Blanco）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．２６８、１４：１１２２２−１１２２９，１９９３）。分岐点とポリピ リミジン領域の下流の最初のＹＡＧジヌクレオチドは、最も一般的に使用される ３’スプライス部位である。シー・ダブリュー・ジェイ・スミス（Smith，C.W.J ．）、イー・ビー・ポッロ（E.B．Porro）、ジェイ・ジー・パットン（J.G．Pat ton）およびビー・ナダール−ギナンド（B．Nadal-Ginand）（１９８９）Ｎａｔ ｕｒｅ ３４２：２４３−２４７。 シス対トランス−スプライス 通業エキソンは、同じプレ−ｍＲＮＡ中の他のエキソンに結合し（シス−スプ ライス）、他のプレ−ｍＲＮＡ中のエキソンには結合（トランス−スプライス） しない。しかし、相補的配列を使用して、プレ−ｍＲＮＡの半分ずつをつなぐこ とによりインビトロで効率的なトランス−スプライスを観察することが可能であ る。 （２） （１９８６）］。Ｐｏ ｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（エルセビア（Elsevier）、アムステルダム）。長 い相補的配列は、２本鎖の安定性を上昇させるが、非常に長い領域は、わずかに ５〜１０の連続的な塩基を介して複数のｍＲＮＡと相互作用し、こうしてその特 異性を低下させることがある。相補前配列は、その５’末端および／または３’ 末端に、非結合性ＲＮＡまたはＤＮＡ配列または他の核酸類似体または化学基を 有することがある。結合はまた、他の機構、例えば３本鎖らせん形成、およびタ ンパク質−核酸相互作用（例えば、遺伝子プロモーターとＤＮＡの間の相互作用 ）によっても行われる。組織特異的プロモーターの例には、ブリンスター（Brin ster）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３０６：３３２−３３６（１９８３）が記載した免疫 グロブリンプロモーターや、ブッチーニ（Bucchini）ら、ＰＮＡＳ ８３：２５ １１−２５４５（１９８６）が記載したインスリンプロモーターがある。当業者 に公知の結合の他の手段を使用してもよい。 ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン、シュードモナス（Pseudomonas）毒素、シ ガ毒素、およびコレラ毒素のような毒素は、極めて強力である。１つのＤＴの分 子が、細胞質内で酵素的に作用して、細胞を死滅させることができる。エム・ヤ マイズミ（Yamaizumi．M．）、イー・メカダ（E．Mekada）、ティー・ウチダ（ T．Uchida）およびワイ・オカダ（Y．Okada）、Ｃｅｌｌ １５：２４５−２５ ０（１９７８）。これらの毒素は、ＡサブユニットおよびＢサブユニットからな る同様の基本構造を有しているようであり、ここで、Ｂサブユニットは細胞表面 に結合し、細胞へのＡサブユニットの移動を促進し、Ａサブユニットは酵素的毒 素活性を有する。アール・コリア（Collier，R．）とジェイ・コンデル（J．Kon del）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：１４９６−１５０３（１９７１）； およびディー・ギル（Gill．D.）とエー・パッペンハイマー（A．Pappenheimer ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：１４９２−１４９５（１９７１）。ＤＴ のＡサブユニット（ＤＴ−Ａ）は、伸長因子２中のＮＡＤから通常のアミノ酸（ ジプタミド（dipthamide））へのＡＤＰ−リボゾームの移動を触媒する。テイー ・ホンジョー（Honjo，T．）、ワイ・ニシズカ（Y．Nishizuka）およびオー・ハ ヤイシ（O．Hayaishi）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：３５５３−３５５ ５（１９６８）；およびディー・ギル（Gill．D.）、エー・パッペンハイマー（ A．Pappenheimer）、アール・ブラウン（R．Brown）およびジェイ・クルニック （J．Krunick）、Ｊ．ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １ ２９：１−２１（１９６９）。そのような結合は、細胞のタンパク質合成を停止 させ、細胞にとって致死的である。選択された細胞内にＤＴ−Ａを送達するかこ の発現を試みる多くの治療上の方策があり、例えばＤＴ−Ａの遺伝子発現の転写 制御がある。（ディー・エフ・ロビンソン（Robinson，D.F.）、ティー・エィチ ・マクスウェル（T.H．Maxwell）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（６）２：１ ３７−１４５．１９９５：ディー・アール・クック（Cook D.R．） （３） 分岐点アデノシン、スプライソソーム結合部位、ポリピリミジン領域、またはス プライス部位）を覆うかまたは阻止する能力のような特徴により増強される。 ２）スペーサー領域： 治療用ＲＮＡスプライス部位を標的結合ドメインから分離するためのスペーサ ー領域。スペーサー領域は、スプライスされていない治療用ＲＮＡの翻訳を阻止 する停止コドン、および標的へのスプライスを増強する配列のような特徴を有し てもよい。 プレ−治療用分子（ＰＴＭ）のための「安全装置」を、スペーサー、結合ドメ イン、またはＰＴＭ内のいずれかに取り込んでもよい（図１−Ｂ）。これは、比 較的弱い相補性によりＰＴＭの３’スプライス部位および／または５’スプライ ス部位の成分を覆って、非特異的トランス−スプライスを防ぐ、ＰＴＭの領域で ある。ＰＴＭの結合／標的部分のハイブリダイゼーションにより、３’スプライ ス部位が露出し、充分に活性になる（図１−Ｃを参照）。 「安全装置」は、シス−配列の１つまたはそれ以上の相補的区間（または、第 ２の異なる核酸鎖）からなり、ＰＴＭの分岐点片側または両側、ピリミジン領域 、および／または３’スプライス部位（スプライス成分）に弱く結合するか、ま たはスプライス成分自身の一部に結合できる。この「安全装置」結合は、スプラ イス成分が活性になるのを防止するであろう（すなわち、Ｕ２ ｓｎＲＮＰまた は他のスプライス成分が、ＰＴＭスプライス部位認識成分に結合するのを阻止す る）。「安全装置」の結合は、ＰＴＭの標的結合領域が標的プレ−ｍＲＮＡに結 合し、こうしてＰＴＭスプライス成分を露出させ活性化（これらが、標的プレ− ｍＲＮＡにトランス−スプライスされることを可能にする）することにより、破 壊される。 ３）３’スプライス部位および／または５’スプライス部位 これは、分岐点、ピリミジン領域および３’または５’スプライス部位を含有 する。 ４）治療用遺伝子： 標的ｍＲＮＡ内でスプライスされ次に発現されて、細胞の死滅のような治療効 果を現す、１つまたはそれ以上の例えばジフテリア毒素のような治療用遺伝子 （４） マーカー；！＝停止コドン。 ヒスチジンタンパク質マーカーを含有させると、金属キレートクロマトグラフ ィーを使用して検出が可能になり、ＨＳＶタンパク質マーカーは、モノクローナ ル抗体を使用する検出を可能にする。これらの試薬はノバゲン社（Novagen，Inc ．）から入手できる。 ｂ）上記と類似であり、異なる相補的結合領域を有する、標的／阻止に対する最 適化領域を確認するためにかつトランス−スプライス反応を増強するために、標 的分子内でより５’または３’にハイブリダイズするようにシフトしている、追 加のモデルプレ−治療用ＲＮＡ分子が作成される。トランス−スプライスの効率 を上げたり下げたりするために、スプライスを調節する他の配列成分が加えられ る。 例３：インビトロスプライス反応 これらのＤＮＡ配列は、発現プラスミドと宿主にクローン化した。配列は、サ ンガー（Sanger）のジデオキシＤＮＡ配列決定により証明した。ＲＮＡはプラス ミドＤＮＡまたはＰＣＲ増幅した鋳型から作成し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを 使用して転写した。標的またはプレ−ｔｈ−ＲＮＡを［α³²Ｐ］ＵＴＰの存在下 で合成される。完全長プレ−ｍＲＮＡと標的は、ゲル電気泳動により精製される 。エス・エフ・ジャミソン（Jamison，S.F．）、エー・クロウ（A．Crow）、お よびエム・エー・ガルシアーブランコ（M.A．Garcia-Blanco）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌ．１２：４２７９−４２８７（１９９２） ジェイ・ディー・ディグナム（Dignam，J.D.）ら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．１１：１４７５−１４８９、１９８３）の方法を使用して核抽出物を作成 した。インビトロスプライス測定法は、エム・エー・ガルシア−ブランコ（M.A. Garcia-Blanco）、エス・エフ・ジャミソン（Jamison，S.F．）、ピー・エー・ シャープ（P.A．Sharp）（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．３：１８７４−１８８ ６、１９８９）のように行った。スプライス反応物は、種々の時間インキュベー トする。終了後、反応生成物をポリアクリルアミドゲルの電気泳動で分離する。 スプライス複合体は、非変性アクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグ ラフィーで視覚化する。インビトロのスプライス産物は、変性アクリルアミドゲ ルで解析する。ジャミソン（Jamison）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２ ：４２７９−４２８７（１９９２）。 【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 37/06 37/06 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プレ−治療用分子であって、 ａ）標的プレ−ｍＲＮＡに対する結合領域、 ｂ）３’スプライス部位、５’スプライス部位、または３’および５’スプライ ス部位、 ｃ）ＲＮＡとして機能する配列、または治療用タンパク質、有用なタンパク質、 もしくは遺伝子産物をコードする配列、 ｄ）スプライス調節配列、および ｅ）治療用ＲＮＡのスプライスと産生に必要な配列成分、を含む上記分子。 ２．結合は相補性または他の手段により仲介される、請求の範囲第１項記載の分 子。 ３．治療用または有用なタンパク質をコードする配列を含む、請求の範囲第１項 記載の分子。 ４．特定の標的細胞中の機能性の治療用ＲＮＡまたは核酸類似体の産生方法であ って、請求の範囲第１項記載のプレ−治療用分子を投与するか、またはプレ−治 療用分子のｉｎ ｓｉｔｕ発現を起こさせて、ユニークなプレ−ｍＲＮＡまたは プレ−ｍＲＮＡの集団を発現する細胞を標的とし、ここでユニークなプレ−ｍＲ ＮＡは、プレ−治療用ＲＮＡによるトランス−スプライスの基質であり、トラン ス−スプライスは機能性の治療用ＲＮＡを産生する、上記方法。 ５．治療用ＲＮＡは、治療用または有用なタンパク質をコードする配列を含む、 請求の範囲第３項記載の方法。 ６．動物、植物、および下等真核生物よりなる群から選択される被験体に、特定 の標的細胞中の治療用ＲＮＡを提供する方法であって、被験体（被験体は、ユニ ークなプレ−ｍＲＮＡまたはプレ−ｍＲＮＡの集団を発現する細胞を有し、この ユニークなプレ−ｍＲＮＡは、プレ−治療用分子によるトランス−スプライスの 基質であり、トランス−スプライスは機能性の治療用ＲＮＡを産生する）に請求 の範囲第１項のプレ−治療用分子を投与することからなる、上記方法。 ７．動物はヒトである、請求の範囲第６項記載の方法。 ８．治療用ＲＮＡは、治療用または有用なタンパク質をコードする配列を含む、 請求の範囲第６項記載の方法。 ９．分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド核酸、および他の核酸類似体よりなる群 から選択される、請求の範囲第１項記載の分子。 １０．請求の範囲第１項記載の分子と分子を投与するための手段を含むキット。