JP2000515374A - 二つの共刺激経路を同時にブロックできる可溶性分子を用いたｔ細胞寛容の誘導 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトリンパ球の表面に置かれるヒトＣＤ４０抗原および少なくともヒトＣＤ８６抗原に結合することが可能な可溶性分子のほか、この分子を生成することが可能なベクター、及びＴ細胞寛容の誘導におけるその分子の使用を提供する。この分子は特に抗体であり、ＣＤ４０およびＣＤ８０とＣＤ８６との両方に結合することが可能な三特異的ジアボディー、ヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合することのできる二特異的ジアボディー、あるいはＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することのできる三特異的トリアボディーである。

Description

【発明の詳細な説明】 二つの共刺激経路を同時にブロックできる可溶性分子を用いた Ｔ細胞寛容の誘導 発明の分野 本発明は免疫系が関与する疾患の治療方法に関する。特に、本発明は、移植片 拒絶、自己免疫疾患、またはＴ細胞依存免疫応答が治療用分子またはキャリヤー （遺伝子治療ビヒクル等）に対して作られる場合等のＴ細胞仲介免疫応答を妨げ る方法に関する。 発明の背景Ｔ細胞の活性化： Ｔ細胞の活性化は抗原提示細胞（ＡＰＣ）との複数の相互作用を必要とするこ とが知られている。ＴｃＲ−ＣＤ３複合体は、抗原誘導活性化において、特異的 抗原が適当なＭＨＣ分子に関連して認識される認識機能、および認識結果が血漿 膜を通って伝えられるシグナル機構の二つの機能を有する。しかし、増殖と成熟 をイフェクター細胞に誘導するために、Ｔ細胞はＴｃＲ−ＣＤ３複合体により仲 介されるものに加えて第二シグナルを必要とする。この共刺激シグナルは、通常 はＡＰＣの細胞表面により提供される。共刺激シグナルの不存在化でのＴｃＲ／ ＭＨＣ−ペプチド相互作用後の細胞間シグナルは、Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細 胞非反応性として知られるＴ細胞不活化をもたらす。ＡＰＣ上に公知リガンドを 有するＴ細胞の細胞表面に存在する幾つかのアクセサリー 分子は、Ｔ細胞活性化で共刺激シグナルを提供することに関連している。Ｂ７−ＣＤ２８共刺激経路： 完全Ｔ細胞活性化をもたらす最善の候補共刺激シグナルはＡＰＣ上のＢ７共刺 激分子に対するＴ細胞上のＣＤ２８の相互作用により作られる。インビトロ研究 はＣＤ２８共刺激経路によるシグナルはアネルギーの誘導を妨げうることを示し ている。 現在まで、Ｂ７ファミリーの二メンバーである当初はＢ７／ＢＢ１と名付けら れたＢ７．１（ＣＤ８０）、およびＢ７０またはＢ７．２（ＣＤ８６）と名付け られた第二Ｂ７分子が分子的にクローン化され、機能的に特性付けられている。 ＣＤ８０は４５〜６５ｋＤａの見掛け分子質量を有する単量体トランスメンブラ ン糖タンパク質であり、ＣＤ２８のように免疫グロブリンスーパーファミリーの メンバーである（Freeman et al.，J．Immunol．143:2714(1989)）。最初に、Ｃ Ｄ８０分子の発現は、ＩＦＮ−γで刺激された活性化Ｂ細胞と単球に制限されて いることが報告された（Freedman et al.，Cell Immunol．137:429(1991)）。さ らに最近、ＣＤ８０発現は培養末梢血液樹枝状細胞（Young et al.，J．Clin．I nvest．90:229(1992)）およびインビトロ活性化Ｔ細胞（Azuma et al.，J．Exp ．Med．177:845(1993)）にも発見されている。ＣＤ８６は約７０ＫＤａの見掛け 分子質量を有するトランスメンブラン糖タンパク質であり、免疫グロブリンスー パーファミリーのメンバーでもある（Freeman et al.，Science 262:909(1993); Azuma et al.，Nature 366:76(1993)）。 ＣＤ８６分子は、細胞表面発現の誘導が速く思え、それが新しく単離された単球 上に存在することを除けば、ＣＤ８０に非常に類似する分散パターンを有するよ うに思える。 ＣＤ８０のみをブロックすることはＴ細胞活性化の部分的な抑制をもたらすこ とが文献から明らかである。アロ抗原を発現する単球によるＴ細胞の活性化は主 にＣＤ８６共刺激に依存する。刺激細胞として単球を用いるＭＬＣの間、 抗ＣＤ８６Ｍａｂだけが増殖応答を強く阻害するが完全には阻害することはでき なかった。しかし、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（ＣＤ８０とＣＤ８６に結合することので きる、ヒトＩｇＧに結合したヒトＣＴＬＡ４の細胞外領域［ＣＨ２とＣＨ３領域 ］からなる可溶性融合タンパク質）のみ、または抗ＣＤ８０＋抗ＣＤ８６Ｍａｂ ｓの組み合わせが最大阻害を示した。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ共刺激経路： 上記の概説された文献データから、ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８による共刺 激がブロックされているときに他の共刺激分子がＴ細胞の活性に非常に重要性を 持ちうるように思える。そうした一つの代用共刺激経路はＡＰＣ上のＣＤ４０と Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌとの相互作用により調節される。ＣＤ４０分子はタイプＩ のトランスメンブランタンパク質のＴＮＦレセプターファミリーに属する。この 遺伝子ファミリーのメンバーとして、ＴＮＦについて２レセプター；低親和性神 経成長因子レセプター；Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ２７；ＣＤ３０および；ＣＤ９５ が挙げられ、これらはシステインに富む細胞外領域中の配列相同性により特性付 けられる（Armitage et al.，Current 0pinion in Immunology 6:407(1994)）。 興味深いことに、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーの関する公知のリガン ドは同じく非常に均一的であり、ＴＮＦ／ＣＤ４０Ｌ遺伝子ファミリーと名付け られたもう一つの遺伝子ファミリーを形成している。ＴＮＦ−αは可溶性サイト カインであるが、それは膜に会合した分子として最初に合成される。ＴＮＦ／Ｃ Ｄ４０ＬレセプターファミリーのメンバーのほとんどはタイプＩＩのトランスメ ンブランタンパク質である。 ＣＤ４０はＢ細胞活性化における機能が最もよく知られている。この分子はす べてのＢ細胞上で構成的に発現される。ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用は精製さ れたＢ細胞の増殖を促進でき、サイトカイン類と組み合せて免疫グロブリン産生 を仲介することができる。最近の研究はＣＤ４０分子の分布は最初に仮定された ようには制限されていないことを示している。新しく単離されたヒト 単球は調節可能な低いレベルのＣＤ４０分子を発現し、これはＩＦＮ−γの存在 下での培養により上昇するように調節できる（Alderson et al.，J．Exp．Med． 178:669(1993)）。ＣＤ４０による単球の刺激は、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α等 の前炎症サイトカイン類、酸化窒素等の毒性のあるフリーラジカル中間体の分泌 およびＢ７共刺激分子の上昇調節をもたらす。末梢血液から単離されたヒト樹枝 状細胞（ＤＣ）もＣＤ４０分子を発現できる（Caux et al.，J．Exp．Med．180: 263(1994)）ＤＣ上のＣＤ４０のリゲーションはインビトロで培養された場合に これら細胞の向上生存性をもたらす。さらに、単球の場合と同じように、ＤＣの 刺激はＩＬ−１およびＴＮＦ−α等の前炎症サイトカイン類の分泌およびＣＤ８ ０／８６共刺激分子の上昇調節をもたらす。 上記のすべての観察は、活性化Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ分子は、免疫炎症応答に 関与する多様な種類の細胞上に発現されるＣＤ４０のリゲーションにより刺激効 果を仲介する重要なイフェクター分子であることを明らかに示している。しかし 、ＣＤ４０Ｌ分子はＴ細胞それ自体の共刺激をもたらすシグナルを受け取ること ができるとの実験的な証拠も存在する。ヒトＴ細胞に対する抗ＣＤ３モノクロー ナル抗体を、その細胞表面上のＦｃレセプターと結合することにより提示するこ とのできるマウスＰ８１５細胞を用いて、ＣＤ４０をトランスフェクトしたＰ８ １５細胞は、小さな休止ヒトＴ細胞の増殖とＣＴＬ活性を実質的に誘導すること ができることが示された（Cayabyab et al.，J．Immunol．152:1523(1994)）。 これはＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用が明らかに両方向性であることを示してい る。ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８をブロックした後の延長した移植片生存度： いくつかの現在のインビボモデルが、延長した移植片受容性の誘導がＣＤ８０ ／ＣＤ８６−ＣＤ２８経路の中断により可能であることを示した。マウスにおけ る異種間のヒト膵島移植直後のＣＴＬＡ−４による処置は長期の移植片生存度を もたらした（Lenschow et al.，Science 257:789(1992)）。しかし、 完全にミスマッチしたラット心臓同種移植片の９０％は、ＣＴＬＡ−４Ｉｇで７ 日間腹腔内（ＩＰ）処置されたラットで拒絶された（Turka et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 89:11102(1992)）。移植時には静脈内（ＩＶ）で、次に２〜 １２日目では隔日で腹腔内処置で投与されたＣＴＬＡ−４Ｉｇはマウスの心臓同 種移植片生存度を延長させたが、主要皮膚移植片の生存度を延長することはでき なかった（Pearson et al.，Transplantation 57:1701(1994)）。ＣＴＬＡ−４ ＩｇによるＣＤ２８経路のブロックは、コントロールと比較して、ラットでの小 腸移植片生存度の顕著な延長をもたらしたが、すべての移植片は１５日後には拒 絶された（Pescovitz et al.，Transplant Proc．26:1618(1994)）。最後に、Ｃ ＴＬＡ−４Ｉｇによる処置は完全な同種間骨髄の受容動物において致死的なネズ ミＧＶＨＤを減少させ、移植後３ヶ月以上生き延びるマウスの６３％までの生存 度を有意に延長させた（Blazar et al.，Blood 83:3815(1994)）。ＣＴＬＡ−４ Ｉｇ単独でインビトロおよびインビボでアネルギーを誘導することができないこ とは、ＡＰＣ上の他のアクセサリー分子からのシグナルと組み合せたＴＣＲトリ ガーにより誘導された持続性IＬ−２産生によりほとんど説明することができよ う。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌをブロックした後の延長した移植片生存度： 最近の研究はＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路をブロックすることは移植モデルにお いて強く免疫抑制的であることも示した。同種間の小リンパ球またはＴ細胞除去 の小リンパ球、プラスマウスＣＤ４０Ｌに対する抗体との組み合せ処置は、主要 または小さい組織適合性座が異なる４０匹の受容動物のうち３７匹で膵島同種移 植片の無限の生存を可能とした（Parker et al.，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 9 2:9560(1995)）。これらの実験から、おそらくＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用の 効果的ブロックが同種間反応性ホストＴ細胞による小休止リンパ球に対する共刺 激分子の誘導の妨げを引き起こしたと結論された。もう一つの最近の研究におい て、移植時にマウスＣＤ４０Ｌへブロック性Ｍａｂを投与 することはネーティブおよび感作ホストにおいて完全に異なるネズミ心臓同種移 植片の生存を顕著に延長したことが示された。しかし、抗ＣＤ４０Ｌ治療は手術 後５日目まで延期された場合、抗ＣＤ４０Ｌは移植片生存を延長させることはな かった。この研究から、抗ＣＤ４０Ｌ治療は主にエフェクター機能のためのＴ細 胞援助に干渉することにより同種移植片拒絶を阻害したと結論された。ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌのブロック後の慢性 的拒絶の兆候のない同種移植片の長期受容： 二つの主要なＴ細胞共刺激経路のいずれかをブロックすることにより、ＣＤ８ ０／８６−ＣＤ２８のみ、またはＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌのみでは高く免疫原性同 種移植片の不確定な移植を可能とするには不十分である。しかし、最近、ＣＤ８ ０／ＣＤ８６−ＣＤ２８およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路のブロックはインビト ロおよびインビボで効果的にＴ細胞クローナル膨張を抑え、完全な同種間の皮膚 移植片の長期生存を促進し、主に血管形成心臓同種移植片の慢性血管拒絶の発達 を阻害することが最近しめされた（Larsen et al.，Nature 381:434(1996)）。 血管形成ネズミ心臓同種移植片モデルにおいて、ＣＴＬＡ４−Ｉｇのみで処置さ れたＣ３ＨＪ受容動物（平均生存時間（ＭＳＴ）５０ｄ）、抗ＣＤ４０Ｌ Ｍａ ｂのみで処置された動物（ＭＳＴ ７０ｄ）、またはその組合せで処置された動 物（ＭＳＴ＞７０ｄ）のすべてが未処置コントロール（ＭＳＴ１２ｄ）と比較し てＢＡＬＢ／ｃ心臓同種移植片の延長した生存度を示した。興味深いことに、移 植後５８〜６２日目に組織を調たときに、顕著な違いが明らかであった。ＣＴＬ Ａ４−Ｉｇ−処置マウスからの同種移植片は広範なリンパ球浸透、間質繊維症、 および激しい心臓動脈内膜肥大および繊維症を示し、すべてが慢性拒絶プロセス の明らかな兆候であった。抗ＣＤ４０Ｌ処置受容動物はリンパ球浸透および間質 繊維症が軽かったが、慢性拒絶の内膜血管病の特性も有した。対照的に、ＣＤ８ ０／８６−ＣＤ２８およびＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ経路が同時にブロックされマウ スからの同種移植片は、実質および血 管が正常なＢＡＬＢ／ｃ心臓に見られるものと事実上区別されなかった。本発明で提出される問題： 免疫学的寛容に関する現在の概念は、アネルギーが、所謂共刺激シグナルの不 存在下で、ＴｃＲ／ＭＨＣペプチド相互作用後の細胞間シグナルの結果であるこ とを支持する。上記のように、ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８共刺激経路および ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０共刺激経路の両方がＴ細胞の活性化に重要であり、アネル ギーの防止に役割を果たす。ＴｃＲ／ＣＤ３複合物によるＴ細胞の刺激はＣＤ４ ０Ｌの低く一時的な発現をもたらす。ＴｃＲ／ＣＤ３およびＣＤ８０／ＣＤ８６ −ＣＤ２８の共刺激によるＴ細胞の刺激はＣＤ４０Ｌ分子の強く、延長した発現 をもたらすことが以前に示されている。ＣＤ８６の低いレベルは多様なＡＰＣ集 団上に構成的に発見することができる。さらに、ＣＤ４０によるＡＰＣの刺激は ＣＤ８０とＣＤ８６を上昇調節する最大のシグナルの一つである。同様に、ＣＤ ４０Ｌの低いレベルは、完全な共刺激なしでさえも抗原の最初の遭遇（ＴｃＲ／ ＣＤ３活性化）後にＴ細胞上に発現される。このＣＤ４０Ｌ発現はＣＤ４０によ るＡＰＣからのシグナルを受け取るのみならず、ＣＤ８６の発現を向上させ、最 も重要にはＣＤ８０発現を上昇調節するＡＰＣを刺激することもできる。同時に 、専門的ＡＰＣ上の低いレベルのＣＤ８６発現はＴ細胞アネルギーの誘導を妨げ ることができ、ＣＤ８０とＣＤ８６発現の上昇調節はサイトカイン類を分泌させ 、ＣＤ４０Ｌ発現を向上させるようにＴ細胞を強く刺激する。したがって、これ らの二つの相互作用（ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０およびＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２ ８）がＴ細胞仲介免疫応答の開始と増幅に関連していると本発明者らにより結論 される。これは免疫応答の最適応答のために顕著な意味を有する。なぜならば、 ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用をブロックすることのみがＣＤ８０／ＣＤ８６− ＣＤ２８によるＴ細胞の活性化を完全には妨げず、ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２ ８相互作用をブロックすることのみがＡＰＣ集団のエフェクター機能の活性化を 完全には妨げないからである。 これらの発見から、最適免疫抑制のために、ＣＤ８０／ＣＤ８６−ＣＤ２８およ びＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用は同時にブロックする必要はないと結論される 。 しかし、これが単一の医薬剤により達成できることは明らかではない。なぜな らば、そのような薬剤は現在利用できないからである。上記のインビボ実験にお いて、マウスＣＤ４０Ｌに対するモノクローナル抗体の組合せをＣＴＬＡ４−Ｉ ｇと組み合せて用いてＣＤ８０およびＣＤ８６の両方をブロックした。しかし、 ＣＴＬＡ４−Ｉｇと抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体のリガンド結合領域を組み 合せることによる単一薬剤の生成はＴ細胞とＡＰＣの架橋をもたらすだろう。こ れはＴ細胞の活性化を疑いもなくもたらし、これは所望の効果とはまさに反対で ある。さらに、上記で挙げた刊行物のすべてはＣＤ８０およびＣＤ８６の両方を ブロックすることはそれぞれを別々にブロックするよりも良好な免疫抑制をもた らすことを明らかに示唆している。また、ＣＤ８０とＣＤ８６の両方をブロック することのみがＴ細胞アネルギーをもたらしうることが示されている。したがっ て、拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と組み合わせて、ＣＤ８６のみのブロ ックは、ＣＤ８０がブロックされていないことにもかかわらずＴ細胞アネルギー をもたらすことを発見することは驚くべきことであった。これは、ＣＤ４０とＣ Ｄ８６分子の両方に結合し、ブロックする能力を有する医薬分子からなる本発明 を導いた。 発明の要約 本発明は、専門のＡＰＣ上に低い量で発現される、ＣＤ４０に結合する拮抗性 分子およびＣＤ８６に結合する拮抗性分子の分子的組合せがＴ細胞の活性化を潜 在的に阻害することができ、Ｔ細胞アネルギーさえもたらすとの発見に基づく。 したがって、この組合せは、Ｔ細胞の活性化が関与する疾患の予防およ び治療に用いることができる。 したがって、本発明の第一の目的は抗原提示細胞の表面上に置かれているヒト ＣＤ４０およびＣＤ８６抗原に結合可能な単一の可溶性分子の治療効果量からな る医薬組成物を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、患者において移植片拒絶、多硬化症、乾せん、リ ュウマチ性関節炎、および全身紅斑性狼そう等のＴ細胞媒介疾患の治療方法を提 供することであり、該方法は、薬学的に許容される賦形剤中の、抗原提示細胞の 表面上に位置するヒトＣＤ４０およびＣＤ８６抗原に結合することのできる単一 の可溶性リガンドの治療効果量を、それらの治療が必要な患者に投与することか らなる。 この治療で用いられる好適な医薬組成物は、ＣＤ４０またはその断片に対する 薬学活性拮抗性モノクローナル、およびＣＤ８６、ＣＴＬＡ−Ｉｇ分子またはそ の断片に対するモノクローナル抗体等の薬学活性拮抗性ＣＤ８６リガンドの組合 せを包含する単一のタンパク質である。 さらに好ましい医薬組成物はＣＤ４０またはその断片に対する薬学活性拮抗性 モノクローナル抗体および薬学活性抗ＣＤ８６モノクローナル抗体Ｆｕｎ−１（ Nozawa et al.，J．Pathol．169:309(1993)）またはその薬学活性のある断片の 組合せを包含する単一タンパク質である。 発明の詳細な説明 ここに記載される発明は、以前に発表された研究および係属中の特許出願を参 考にしたものである。上記または下記で挙げられるこれらのすべての刊行物およ び出願は文献の援用により編入される。本発明は添付の請求の範囲に定義されて いる。 ここに記載の抗原に結合できる分子とは、典型的には抗体を意味するが限定 されない。特定の結合能力を有する他の分子、例えばリガンドも含まれる。 ここで用いられる「抗体」との用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル 抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単一鎖抗体、およびその断片、例えばＦａｂ、 Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、および親抗体の抗原結合機能を保持するそれ以外の断片 を意味する。 ここで用いられる「モノクローナル抗体」との用語は、均一抗体集団を有する 抗体組成物を意味する。この用語は種または抗体の源に関して限定されるもので はなく、それが作られた方法により限定を意図されるものでもない。この用語は 全免疫グロブリンならびにおよびその断片、例えばＦ_ab、Ｆ_(ab')2、Ｆ_v、およ び抗体の抗原結合機能を保持するそれ以外のものを意味する。どの哺乳種のモノ クローナル抗体も本発明で用いることができる。 ここで用いられる「キメラ抗体」は、免疫グロブリンの定常部がヒト免疫グロ ブリン配列に由来することを意味する。 ここに用いられている「ヒト化抗体」とは、免疫グロブリンの枠組みの少なく とも一部がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。 ここに用いられている「単一鎖抗体またはＳｃＦｖ」との用語は、結合性抗体 の結合領域（重鎖および軽鎖の両方）を決定し、結合機能の保存を可能とする結 合部分を供給することにより調製された抗体を意味する。これは、本質的には、 抗体に結合するために必要な可変領域の部分のみを有する、ラジカルの省略され た抗体を形成する。単一鎖抗体の測定と構築はＬａｄｎｅｒらの米国特許第４， ９４６，７７８号に記載されている。 ここに用いられている「二特異的ジアボディー」とは、二つの異なる結合特異 性を有する二つの一本鎖抗体断片が共に折りたたまれて二つの単一鎖抗体断片の 組合された結合特異性を有する一分子を形成する単一の分子を意味する。 ここに用いられている「二特異的トリアボディー」とは、一特異性の二つの単 一鎖抗体断片が別の特異性の単一鎖抗体断片とともに折りたたまれて、二つ の異なる単一鎖抗体断片の組合された結合特異性を有する一分子を形成する単一 の分子を意味する。 ここに用いられている「三特異的トリアボディー」とは、異なる結合特異性を 有する三つの異なる単一鎖抗体が共に折りたたまれて三つの単一鎖抗体断片の組 合された結合特異性を有する一分子を形成する単一の分子を意味する。 ここに用いられている「ＣＤ８０」、「ＣＤ８６」、「ＣＤ４０」および「Ｃ Ｄ４０Ｌ」との用語は上記で広範に論じたヒト表面分子を意味する。免疫目的の ために、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ抗原は当分野で知られ ている技術により調製してよい。ヒトＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＣＤ ４０Ｌに対する抗体は当分野において知られている。本発明は既に詳細に説明し たような抗体のための新しい利用を意図する。 ここに用いられている「ＣＴＬＡ４−Ｉｇ」との用語は、ヒトＩｇＧに結合さ せたヒトＬＴＬＡ４の細胞外領域［ＣＨ２およびＣＨ３領域］からなる可溶性融 合タンパク質を意味する（Linsley et al.，J．Exp．Med．174:561(1991)）。 本発明で用いられている「複合体」および「融合タンパク質」との用語は抗原 提示細胞の表面に置かれているヒトＣＤ４０およびＣＤ８６抗原に結合可能な二 つの可溶性リガンド間の結合タイプからの結果を意味し、該結合は当分野で公知 の治術によりもたらすことができる。そのような技術としては公知の化学的操作 の利用による化学的結合、または二つの可溶性分子の組換えＤＮＡ技術による単 一鎖分子への融合が挙げられる。 ここに用いられている「拮抗性」との用語は、可溶性リガンドが標的細胞の膜 上の置かれた抗原に結合する能力を意味し、ここで該結合は、天然リガンドによ る該標的の活性化を導く細胞間シグナルトランスダクションの防止をもたらす該 抗原の天然リガンドの結合を妨げる。細胞表面上に置かれたヒトＣＤ４０分子に 結合できる拮抗性分子抗体がＡｌｄｅｒｓｏｎら（J．Exp．Med．198 (1993)，669）により記載されている。 ここに用いられている「非刺激性拮抗性」との用語は、細胞表面上に置かれた 抗原に結合する可溶性リガンドの能力を意味し、該結合は、天然のリガンドによ り誘導された標的細胞の活性化を導く細胞間シグナルトランスダクションの防止 をもたらす該抗原の天然リガンドの結合を妨げ、さらに該結合それ自体が該細胞 の活性化を導く細胞間シグナルトランスダクションをもたらさない。細胞表面上 に置かれたヒトＣＤ４０分子に結合できる非刺激拮抗性モノクローナル抗体はＷ Ｏ ９４／０１５４７に記載されている。 ここに用いられている「架橋」との用語は、細胞上に発現された単一または複 数のリガンドの結合の結果として二細胞の物理的相互作用を意味し、ここで該結 合は細胞の活性化を導く細胞間シグナルトランスダクションをもたらす。 本発明の医薬組成物は、同種間移植片拒絶を妨げ、異種間移植片拒絶を妨げ、 自己免疫疾患を治療し、または治療用分子または治療用キャリヤー（遺伝子治療 ベクター等）に対するＴ細胞依存性免疫応答の誘導を防止するために治療効果の ある濃度で投与される。この目標を達成するために、活性分子は当技術で知られ ている多様な許容性のある賦形剤を用いて処方してもよい。典型的には、医薬組 成物は静脈内または腹腔内のいずれかで注射により投与される。この投与を達成 するための方法は当業者に公知である。局所または経口により投与してもよい組 成物を得ることができ、または粘膜を経た透過が可能である組成物を得ることが できる。 ヒトへの投与前に、処方物を医薬組成物に添加してもよい。液体処方物が望ま しい。例えば、これらの処方物としてはオイル、ポリマー、ビタミン、炭水化物 、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、または増量剤が挙げられる 。好ましくは、炭水化物としては糖または糖アルコール、例えば単糖類、二糖類 または多糖類、または水溶性グルカン類が挙げられる。糖類またはグルカン類と しては、フラクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、 マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、シュクロース、デキストラ ン、プルラン、デキストリン、アルファおよびベータシクロデキストリン、可溶 性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース、ま たはそれらの混合物を挙げることができる。シュクロースが最も好ましい。「糖 アルコール」は−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素と定義され、ガラシトール 、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、 およびアラビトールが挙げられる。マンニトールが望ましい。上記のこれらの糖 類および糖アルコールは単独または組み合せて用いてもよい。糖または糖アルコ ールは水性調製物に可溶性であるかぎり使用される量に一定の制限は存在しない 。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％、 さらに好ましくは２．０ｗ／ｖ％〜６．０ｗ／ｖ％である。好ましくは、アミノ 酸として左旋（Ｌ）型のカルニチン、アルギニン、およびベタインが挙げられる ；しかし、他のアミノ酸を添加してもよい。好適なポリマーとしては、２，００ ０と３，０００の間の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）また は３，０００と５，０００の間の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ ＰＥＧ）が挙げられる。凍結乾燥前または再構成後の溶液中のｐＨ変化を最小化 するために組成物中に緩衝液を使用することも好ましい。大体はどのような生理 的緩衝液を用いてもよいが、クエン酸、リン酸、コハク酸およびグルタミン酸緩 衝液またはそれらの混合物が望ましい。最も好ましいのはクエン酸緩衝液である 。好ましくは、その濃度は０．０１〜０．３モルである。処方物に添加すること のできる界面活性剤はＥＰ−Ａ ２７０，７９９および２６８，１１０に示され ている。 さらに、結合分子はポリマーへの共有複合化により化学修飾して、例えばそれ らの循環半減期を増加させることができる。好ましいポリマー、およびそれらを ペプチドに結合する方法は、文献の援用により全文がここに編入される米国特許 第４，７６６，１０６号、４，１７９，３３７号、４，４９５，２８５ 号、および４，６０９，５４６号に示されている。好適なポリマーはポリオキシ エチル化ポリオール類およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ は室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒ（式中、Ｒ は水素であるか、またはアルキルまたはアルカノール基等の保護基であってよい ）を有する。好ましくは、保護基は１〜８炭素を有し、好ましくはメチルである 。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１〜１，０００、より好ましくは２〜５ ００である。ＰＥＧは１０００〜４０，０００、より好ましくは２０００〜２０ ，０００、最も好ましくは３，０００〜１２，０００の好ましい平均分子量を有 する。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも一つの水酸基を有し、より好ましくは、 それは末端水酸基である。阻害剤上のフリーのアミノ基と反応するように活性化 されるのが好ましいのがこの水酸基である。水溶性ポリオキシエチル化ポリオー ル類も本発明に有用である。それらには、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポ リオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等が ある。ＰＯＧが好ましい。一つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグ リセロール骨格は、例えば動物およびヒト中のモノ、ジ、トリグリセリド中に天 然に存在するものと同じ骨格であるためである。したがって、この枝別れは体内 の外来剤として必ずしも見なされないだろう。ＰＯＧはＰＥＧと同じ範囲の好ま しい分子量を有する。ＯＰＧに関する構造はＫｎａｕｆら（J．Bio．Chem．263: 15064，1988）に示されており、ＯＰＧ／ＩＬ−２複合体の議論が米国特許第４ ，７６６，１０６号に見られる（前記の二文献は援用によりその全内容をここに 編入する）。 上記のように、本発明の医薬組成物は、同種間移植片拒絶を妨げ、異種間移植 片拒絶を妨げ、または自己免疫疾患を治療するために用いられる。投与の好まし い経路は非経口である。非経口投与において、本発明の組成物は薬学的に許容さ れる非経口ビヒクルに組み合せて溶液、懸濁液またはエマルジョン等の単位投与 可能形で配合されよう。そのようなビヒクルは内在的に非毒性であり、 非治療的である。そのようなビヒクルの実例は塩溶液、リンガー溶液、デキトロ ース溶液、およびハンクス溶液である。固定化オイルおよびオレイン酸エチル等 の非水性ビヒクルを用いてもよい。好適なビヒクルは塩溶液中の５％デキストロ ースである。ビヒクルは、緩衝液および保存剤等の等張性および化学安定性を高 める物質など少量の添加物を含有してよい。 投与量と投与方法はそれぞれの場合に基づく。一般的に、組成物は０．１ｍｇ ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの量で与えられるように投与される。好ましくは、それ は一回で投与される量として与えられる。連続的な点滴を用いてもよい。そのよ うな場合、医薬組成物を０．０５〜１ｍｇ／ｋｇ／時間の投与量で注入してよい 。 以下、本発明は特に有利な実施態様を示す下記実施例により詳細に説明する。 ただし、これらの実施態様は説明するためのものであって本発明を決して限定す るものではないことに注意されたい。 図面の簡単な説明 図１は、ジアボディー構築物での最初の工程、Ｖ領域の交換の模式図を示す。 図２は、ジアボディー構築の第二工程であるリンカーの交換の模式図を示す。 図３は、抗ＣＤ４０／抗ＣＤ８６ジアボディーのクローニングに適用された方 法の模式図を示す。 図４は、ＣＤ８６−ＩｇおよびＣＤ４０−Ｉｇ抗原に同時に結合するジアボデ ィー能を示すＢＩＡ核センソグラムを示す。最初の洗浄後の応答と注入後の標準 化されたシグナルとの違いからわかるように、６５３７応答単位（ＲＵ）ＣＤ８ ６−Ｉｇを含有する表面上でｔ＝１１０（秒）で注入された細胞質分画から、１ ３００ＲＵジアボディーがｔ＝２３０（秒）で捕捉された。ｔ＝３６０（秒）で 、ＣＤ４０−Ｉｇは１２０秒間注入された。ＣＤ８６−Ｉｇに対す る一つの結合領域で阻止されたジアボディーはＣＤ４０−Ｉｇに対する他の領域 と反応して５５０ＲＵ捕捉抗原を生じた（ｔ＝４８０（秒）での第二洗浄間のシ グナルとｔ＝３６０（秒）での第二洗浄前のシグナルの違い）。 図５は、Ｔ細胞がアロ原性単球で刺激されたＴ細胞活性化実験の結果を示す。 Ｔ細胞活性化はＣＤ８０およびＣＤ８６を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇまたは拮抗性抗Ｃ Ｄ−４０モノクローナル抗体Ｍ３のみによりブロックすることにより部分的に阻 害されるが、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ３ が組み合わされた場合にはほとんど完全にブロックされる。 図６は、Ｔ細胞が一次刺激中にブロック剤の存在下にアロ原性単球により刺激 され、ブロック剤の不存在下での再刺激中に増殖能力について分析したＴ細胞再 刺激実験の結果を示す。ＣＴＬＡ４−Ｉｇのみの存在は僅かにアロ抗原に特異的 な低い応答性をもたらす一方で、ＣＴＬＡ４−ＩｇとＣｓＡまたは拮抗性抗ＣＤ ４０モノクローナル抗体Ｍ１３との組合せはＴ細胞非反応性をもたらす。コント ロールの第三のアロ抗原を発現する単球に対するＴ細胞応答は影響されない。黒 く塗ったバーは一次培養に用いられたアロ抗原に対するＴ細胞応答であり、白抜 きのバーは第三のアロ抗原を発現する単球に対するＴ細胞応答を示す。 図７は、Ｔ細胞が一次刺激中、ブロック剤の存在下にアロ原性ＰＢＭＣにより 刺激され、ブロック剤の不存在下での再刺激中に増殖能力について分析したＴ細 胞再刺激実験の結果を示す。ＣＤ４０に対する拮抗性モノクローナル抗体および ＣＤ８６に対する拮抗性モノクローナル抗体の存在は、ＣＤ８０に対する拮抗性 モノクローナル抗体がある場合もない場合も、アロ抗原に特異的なＴ細胞非反応 性をもたらす。ＣＤ４０のみに対する拮抗性モノクローナル抗体の存在、または ＣＤ８０のみに対する拮抗性モノクローナル抗体と組合せた場合は、Ｔ細胞の部 分的な不活化をもたらす。 実施例材料と方法： ＣＤ４０とＣＤ８６細胞外領域Ｉｇ融合タンパク質 幾つかの実験でリンパ球細胞表面レセプターおよびヒトＩｇＧのＦｃ−領域の 融合タンパク質を用いた。発表されたｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲ増幅により作 られた細胞表面レセプターの細胞外領域をコードする核酸配列配列を、Ｅｌｌｉ ｓｏｎら（NAR 10:4071(1982)）による配列に基づくヒトＩｇＧ１のＣＨ１／ヒ ンジ−ＣＨ３領域（Ｆｃ）に対して融合させることにより、これらの細胞外領域 （ＥＤ）融合タンパク質（ＥＤ−Ｉｇ融合タンパク質）を作った。ＥＤ−Ｉｇ融 合タンパク質をＳｆ９昆虫細胞に発現させてならし培地として用いるか、または プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによる精製後に用いた 。細胞系と培養条件 Ｂ細胞系ＪＹを、Ｔ７５培養フラスコ中（コスタール、ケンブリッジ、マサチ ューセッツ州、米国）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血 清（ＦＣＳ）（ヒクローン、ロガン、ユタ州、米国）を加えたＩｓｃｏｖｅの改 良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で通常通り培養した。細胞を３７℃および５％ ＣＯ２で、湿度調整インキュベーターで培養した。毎週、細胞を分けた（１／２ ０〜１／１００）。細胞系を保存するために、５〜１０×１０６細胞／ｍｌの２ ０％ ＦＣＳおよび１０％のＤＭＳＯを補ったハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳ Ｓ）を含有するアンプルを作り、これを液体窒素中で保存した。リンパ球の単離および刺激 末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心法に より健康な提供者からのヘパリン化血液から単離し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、 ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およ び５％熱不活化同原血漿を補ったＲＰＭＩ １６４０（ギブコ、ペイスレ イ、英国）からなる完全培地中に再懸濁した。基本的にはＺｕｐｏら（Eur．J． Immunol．21:351(1991)）に記載されたように、ＰＢＭＣをＡＥＴ処理ヒッジ赤 血球細胞によるロゼット形成およびＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度グラジエ ントによるＥ−ロゼット細胞の除去、さらにその後の単球の冷凝集によって、単 球の豊富な調製物を調製した。Ｔ細胞は、単球、Ｂ細胞およびＮＫ細胞をＬｙｍ ｐｈｏ−Ｋｗｉｋ Ｔ（ワンラムダ、ロスアンゼルス、カリフォルニア州、米国 ）を、製造業者の指示にしたがって除去することによりＰＢＭＣ調製物からさら に精製した。 豊富な単球および精製Ｔ細胞を用いた一次混合リンパ球培養のために、９６ウ エルプレート中、２００ｍｌ完全培地中の０．５〜１×１０６／ｍｌの精製Ｔ細 胞と０．１〜０．２×１０６／単球を６日間、１〜１０μｇ／ｍｌの範囲濃度の ブロック剤の存在または不存在化に培養した。培養時間の最後の８時間、細胞を １ｍＣｉ［３Ｈ］−チミジン（アマルシャムインターナショナル、アマルシャム 、英国）でパルスをかけた。細胞をＳｋａｔｒｏｎ自動細胞ハーべスターを用い てガラス濾過フィルター上に集め、紙の上の放射活性を液体シンチレーションカ ウンターでカウントした。再刺激実験のために、Ｔ細胞（０．５〜１×１０６／ ｍｌ）および同一の提供者からの単球（０．１〜０．２×１０６／ｍｌ）を６日 間、１〜１０μｇ／ｍｌの範囲濃度のブロック剤の存在下または不存在下および ４００ｎｇ／ｍｌ濃度のシクロポリンＡ（ＣｓＡ）の存在下または不存在下で２ ４ウエルのプレート中、１ｍｌの完全培地で６日間培養した。６日後、残ってい る細胞を集め、ブロック剤の不存在下での３日間の再刺激前にさらに２日間培養 した。Ｔ細胞増殖は主要混合リンパ球培養に関して既に記載したように決定した 。 混合リンパ球培養は非分離ＰＢＭＣを用いても行った。これらの実験において 、応答細胞としての新しいＰＢＭＣ（１×１０６／ｍｌ）、およびヒトＩＬ−４ （２０μｇ／ｍｌ）およびヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００Ｕ／ｍｌ）（０．１ ×１０６／ｍｌ）により前活性化させたＰＢＭＣを１〜１０μｇ／ｍｌの範囲濃 度のブロック剤の存在下または不存在下で、２４ウエルプレート中、１ｍｌの完 全培養物中で６日間培養した。６日後、残っている細胞を集めて、ブロック剤の 不存在下で３日間刺激細胞としてヒトＩＬ−４（２０μｇ／ｍｌ）およびヒトＧ Ｍ−ＣＳＦ（１００Ｕ／ｍｌ）（０．１×１０６／ｍｌ）で前活性化させた同一 のＰＢＭＣでアロ反応性Ｔ細胞を再刺激する前に、さらに３日間培養した。Ｔ細 胞増殖は上記のように［３Ｈ］チミジン取込みにより検定した。ポリメラーゼチェインリアクション ＤＮＡ断片を増幅するために、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ） を行った。典型的なＰＣＲ混合物は、０〜１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ ＫＣ ｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０ ０、それぞれ０．０２５ｍＭ ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌプライマー／１００μｌ 反応混合物、１〜１０００ｎｇ ＤＮＡ／１００μｌ反応混合物および２．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼを含有した。反応をパーキンエルマーサーモサイクラー（パ ーキンエルマー社、ノルワーク、コネチカット州）を用いて行った。標準的なＰ ＣＲはＤＮＡを変性させるために９５℃で２〜５分の一工程後に、９５℃で１分 間、５５℃で１分間および７２℃で１〜４分間の２０〜４０サイクルからなった 。最終工程後に伸長工程を７２℃で７分間行った。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ） 細胞（０．１〜０．２×１０６／試料）を２０分間、４℃で、特異的モノクロ ーナル抗体（０．１〜１ｍｇ／試料）とともにインキュベートした。ＦＡＣｓ緩 衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％ＢＳＡ、０．１％ ＮａＮ３）による洗浄後、 細胞をさらに２０分間４℃で、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ） またはフィコエリチン（ＰＥ）に複合させたヤギ抗マウス抗体とともにインキュ ベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、最後に０．５％パラホルムアルデ ヒドを含有するＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣスキャンフロー サイトメーター（ベクトンデッキンソン）を用いて分析した。モノクローナル抗 体の特異的な結合は任意の単位で平均蛍光強度として示される。類似の方法を用 いて、一本鎖抗体を発現するファージ粒子を調べるために用いた。この場合、検 出は非複合ヒツジ抗Ｍ１３抗体（ファルマシアＡＢ、アップサラ、スウェーデン ）を用いることにより行い、その後の洗浄後に、ロバ抗ヒツジ複合ＦＩＴＣ（シ グマケミカル社、セントルイス、ミズリー州、米国）とともにインキュベーショ ンした。同様に、類似の方法を用いてジアボディーとトリアボディー構築物の生 物学的活性を示した。これらの実験において、検出は細胞をジアボディーまたは トリアボディー構築物とインキュベーションした後にＥＤ−Ｉｇ融合タンパク質 の一つとインキュベーションし、その後にＦＩＴＣ複合抗ヒトＩｇＧ抗血清とイ ンキュベーションすることにより行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析 発現された構築物を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット 分析を行った。簡単に説明すると、試料を０．８％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）および１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）中で５分間沸騰させた。次に 、試料を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ； ２時間、１００Ｖ）で泳動した。電気泳動後、ゲルをニトロセルロースフィルタ ーに電気ブロットするか、または１０％メタノールおよび１０％酢酸中の０．１ ％クマシーブルーで染色した。電気ブロットは２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ Ｈ８．３）、１９２ｍＭグリシンおよび１０％メタノール中で１時間、１００Ｖ 、４℃で行った。ブロット後、ニトロセルロースフイルターをＰＢＳ−Ｔｗｅｅ ｎ（０．０５％）中で１時間室温にて１％ＢＳＡでブロックした。次に、該ブロ ットを室温、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、検出用抗ｍｙｃ抗体とともにインキュベー トした。第二抗体（パーオキシダーゼで標識したもの）とのインキュベーション 後、該ブロットを４−クロロ−ナフトールにより染色した。ＢＩＡ核分析 ファルマシアバイオセンサー２０００を用いて分析を行った。ＣＭチップを０ ．２Ｍ ＥＤＣ／０．０５Ｍ ＮＨＳで５分間活性化した。次に、リガンドの結合 を１０ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ５．０）中で５分間（０．１ｍｇ／ｍｌのＩｇ構築 物）行った。この後、ＰＢＳ緩衝液中の多様な濃度のＳｃＦｖ、Ｍａｂまたはジ ア／トリアボディー構築物をかけた。ジア／トリアボディー構築物の場合、チッ プを洗浄した後に第二Ｉｇ構築物をかけた。センサー表面を０．１ＭのＮａＯＨ で再生した。 実施例１ ヒトＣＤ４０およびＣＤ８６に対するモノクローナル抗体からの単一鎖抗体断 片を発現するファージの生成： 抗ＣＤ４０モノクローナル抗体５Ｄ１２の一本鎖抗体断片（ＳｃＦｖ）の生成 のために、ＶＨとＶＬ領域の両方をＰＣＲで増幅した後に第二アッセンブリＰＣ Ｒを行って両領域を結合した。この目的のために、４プライマーを設計した（配 列番号１〜４）。配列番号１は、クローニング目的のＨｉｄＩＩＩおよびＳｆｉ Ｉ制限部位およびその後の５Ｄ１２の５'ＶＨ領域にアニーリングする縮重配列 を有する。配列番号２はＶＨ領域の３'部分の縮重配列およびその後の（（Ｇｌ ｙ）４Ｓｅｒ）３リンカーおよびＶＬ領域の５'部分をコードする配列を有する 。配列番号３はＶＬ領域の５'部分に対する相同性を有する縮重プライマーであ り、一方、最後のプライマー（配列番号４）はＮｏｔＩ制限部位を有し、ＶＬ領 域の３'部分にアニールする。簡単に記載すれば、これらのプライマーを用いて 、モノクローナル抗体５Ｄ１２のＶＨおよびＶＬ領域を別個にＰＣＲ増幅した。 このＰＣＲ反応用の鋳型として、我々は５Ｄ１２のＶＨまたはＶＬ領域を有する プラスミドを用いた（ＶＨ：配列番号５およびＶＬ：配列番号６）。このＰＣＲ 工程で得られたｃＤＮＡをゲル精製し、アッセンブ リーＰＣＲに用いて（（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ）３リンカーによりＶ領域の結合を行 った。次に、得られた単一鎖５Ｄ１２構築物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮ ｏｔＩで消化した後に、ｐＧＥＭ−１３Ｚｆ（プロメガ、マジソン、米国）中で 連結を行った。この連結物でＤＨ５αを形質転換し、これをＬＢプレートに塗布 した。幾つかのクローンの配列決定により、正しい５Ｄ１２ ＳｃＦｖクローン が発見された（配列番号７）。 ヒトＣＤ８６と反応性のあるＳｃＦｖの生成のために、我々は５Ｄ１２として 示された同じプライマーを用いた。抗ＣＤ８６モノクローナル抗体Ｆｕｎ−１の ＳｃＦｖの生成の全工程がヒトＣＤ４０と反応性のある５Ｄ１２ ＳｃＦｖにつ いて上記したように行った。Ｆｕｎ−１のＶ領域（ＶＨ：配列番号８；ＶＬ：配 列番号９）を抗ＣＤ８６ ＳｃＦｖ構築物（配列番号１０）を得るための鋳型と して用いた。 実施例２ヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合可能な二特異的ジアボディー分子の構築 ： 抗ＣＤ４０ ＳｃＦｖおよび抗ＣＤ８６ ＳｃＦｖ中の柔軟性リンカー配列を１ ５残基から５残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）まで短くすることにより、および異なる抗 原認識を有する二つの一本鎖Ｆｖ断片からの可変重鎖領域と軽鎖領域を交差させ て対とすることにより二特異的二価分子を作った。この構築は三段階で行われた 。軽鎖可変断片を抗ＣＤ８６（ａＣＤ８６）および抗ＣＤ４０（ａＣＤ４０）か らのＳｃＦｖ構築物中で、5'末端に位置する制限酵素部位（ＶＬの塩基番号７〜 １２のＳａｃｌ）および軽鎖可変遺伝子の３'部分のちょうど外側の制限酵素部 位（ＮｏｔＩ）を用いることにより交換した（図１を参照されたい）。それに続 く工程で、キミラ構築物ＶＨ−ａＣＤ８６／１５ＡＡ−リンカー／ＶＬ−ａＣＤ ４０（７．２／１５／４０でコード）およびＶＨ−ａＣ Ｄ４０／１５ＡＡ−リンカー／ＶＬ−ａＣＤ８６（４０／１５／７．２でコード ）の１５残基リンカーを、ＶＨの３'部分に置かれた部位（抗ＣＤ４０ ＶＨの塩 基番号３３５または抗ＣＤ８６ＶＨの３７１からリンカー配列の番号＋２までの Ｂｓｕ３６１）およびＶＬ末端の５'部分（両ＶＬの塩基番号７〜１２のＳａｃ ｌ）（図２を参照されたい）。最後に両キメラカセットを、二シトロン発現ベク ターカセットを有するベクターｐＵＣ１９ファブソール（ｐＵＣ１１９ＨＩｓ６ ｍｙｃＸｂａ（Low et al.，J．Mol．Biol．260:359(1996)）に類似するが、イ ンビトロ変異誘発により検出されたベクター骨格中にすべてのＡｐａＩＩ部位を 有するｐＵＣ１１９誘導体）中で組み合せた。最初に、ａＣＤ８６／５ＡＡ−リ ンカー／ａＣＤ４０構築物を、制限部位ＳｆｉＩとＮｏｔＩを用いてｐＵＣ１１ ９ファブソールにクローニングした。次に、ａＣＤ４０／５ＡＡ−リンカー／ａ ＣＤ８６のＳｃＦｖカセットを、５'−ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＣＡ ＣＡＧ Ｇ ＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧ−３'（配列番号１１）および ５'−ＣＧＴ ＧＡＧ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＧＧ ＣＧＣ ＧＣＣ ＴＴＡ ＴＴＡ ＣＣ Ｇ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＴＴ ＧＧＴ ＧＣＣ−３'（配列番号１２） を用いて増幅した。これらのプライマーは、ＡｐａＬＩ部位およびＡｓｃＩ部位 をそれぞれ含む（下線部）。増幅されたＰＣＲ断片はＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩ で消化し、ａＣＤ８６／５ＡＡ−リンカー／ａＣＤ４０構築物を含むｐＵＣ１１ ９ファブソールプラスミド中で連結した。両ＳｃＦｖカセットを有するジアボデ ィー産生クローンを同定し、組換えジアボディー分子（ｐＵＣ１１９−ファブソ ール−ＣＤ４０／ＣＤ８６）（５Ｄ１２ＶＨ＋ＦＵＮＶＬ：配列番号１３；ＦＵ ＮＶＨ＋５Ｄ１２ＶＬ：配列番号２２）の発現のために用いた。 抗原提示細胞上のヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合することのできる、 拮抗性抗ＣＤ４０Ｍａｂｓおよび拮抗性抗ＣＤ８６ Ｍａｂ Ｆｕｎ−１に基づく 二特異的ジアボディー分子を得るための全クローニング方法を図３に示す。 同じ操作を、抗原提示細胞上のヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ８０およびヒトＣＤ８６ 分子に結合することのできる、ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方と反応性のある拮 抗性抗ＣＤ４０ Ｍａｂｓおよび拮抗性Ｍａｂｓに基づく二特異的ジアボディー 分子の生成のためにも用いられる。 実施例３ヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合可能な二特異性ジアボディー分子の発現 、単離および特性付け： ヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合可能な二特異性ジアデフィー分子の産 生のために、上記の実施例２に記載のａＣＤ８６／ａＣＤ４０−ビシストロン発 現カセットを有するプラスミドを用いた。５０ｍｌの２ＹＴ培地（１００μｇ／ ｍｌアンピシリン、０．１％グルコース）に飽和培養物（３０℃で１６時間生育 させたもの）を接種した（１ｖ／ｖ％）。３０℃での５時間の生育後および６０ ０ｎｍで０．９の光学密度を有する培地を用いて、ジアボディー産生を、ＩＰＴ Ｇを１ｍＭの濃度まで加えることにより誘導した。培養を２０℃で４時間続け、 １５ｍｌ培養物からの細胞をペレット化した（室温、１１００*ｇで１０分間） 。上清および細胞をさらに処理するまで−２０℃で保存した。残った３５ｍｌの 培養物を２０℃でさらに１６時間生育させた。細胞を上記のようにペレット化し た。細胞質フラクションは、細胞を０．５３ｍｌの冷ＴＥＳ緩衝液（２０ｍＭト リスＨＣｌ；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５Ｍシュクロース、ｐＨ８．０）に再 懸濁することにより調製した。その混合物を２時間氷中でインキュベートし、次 に０．５９ｍｌの冷却３倍希釈ＴＥＳを加えて、インキュベーションを３０分間 延長した。スフェロプラストを１５分間１１００*ｇ、４℃で遠心し、細胞質タ ンパク質を含有する上清を集めた。ペレットフラクションを０．７５ｍｌのＴＥ Ｓ／ＭｇＳＯ４（ＴＥＳ緩衝液；１５ｍＭ ＭｇＳＯ４）に再懸濁し、３０分間 氷上でインキュベートした。スフェロ プラストを１５分間１１００*ｇ）４℃で遠心し、上清を最初の上清フラクショ ンに加えた。全細胞質フラクションを再び清澄化し（４℃で、１０００*ｇで１ ５分間）、ＰＢＳに対して透析した。すべてのフラクションをＰＡＧＥ、および 検出用抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロットで分析した。ＳｃＦｖの最 大濃度は４時間の誘導後培養物から調製された細胞質フラクションに見られ、あ る程度は２０時間誘導された培養物の培地フラクション中に見られた。産生され たジアボディーの機能性はＢＩＡ核中で調べられた。精製ＣＤ８６−ＩｇはＣＭ チップの表面に固定化されて、結合タンパク質の６５００ＲＵ（応答単位）を与 えた。細胞質フラクションの１２０秒間の１０μｌ／分での注入により約１２０ ０ＲＵジアボディーの捕捉をもたらした。次に、ＣＤ４０−Ｉｇを、さらに５４ ０ＲＵ抗原の結合をもたらすジアボディーと同じ条件下で注入した。この実験は ＣＤ４０およびＣＤ８６と同時に結合する産生ジアボディー分子の能力を示した （図４を参照されたい）。 実施例４ヒトＣＤ４０およびＣＤ８６またはヒトＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結 合可能な二特異的および三特異的トリアボディー分子の構築： 二特異的および三特異的トリアボディー分子の構築は、リンカーを除去しなけ ればならなかった（ゼロ残基リンカー）以外は上記ジアボディーについて記載し た方法と同じである。これは、インビトロ変異誘発により、一本鎖ファージミド DＮＡおよび該変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて行われた。ヒトＣ Ｄ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する拮抗性モノクロナール抗体のＳｃＦｖ 構築物を用いて、（ｉ）ＶＨαＣＤ４０／０／ＶＬαＣＤ８０−ＶＨαＣＤ８０ ／０／ＶＬαＣＤ８６−ＶＨαＣＤ８６／０／ＶＬαＣＤ４０および（ｉｉ）Ｖ ＨαＣＤ４０／０／ＶＬαＣＤ８６−ＶＨαＣＤ８６／０／ＶＬαＣＤ８０−Ｖ ＨαＣＤ８０／０／ＶＬαＣＤ４０の少なくとも二つの遺伝子 構築物が可能である。５ＡＡリンカーを有する二特異的ジアボディーについて上 記に記載されたよように、構築物中のＶＨ−およびＶＬ−領域を交換し、ＶＨ領 域を交換するためにＳｆＩおよびＢｓｕ３６ＩおよびＶＬ領域を交換するために ＳｃＩおよびＮｏｔＩを用いて上記の方法を適用することによりすべてのＶＨ／ ＶＬ組み合わせが作られる。次に、３つのＳｃＦｖ−カセットを、トリシストロ ンｍＲＮＡをコードする単一の発現モジュール中にクローン化する。このＤＮＡ はオリゴ指令インビトロ変異誘発用鋳型として用いて、１〜３のＶＨ−ＶＬ対中 の５残基リンカーを除去する。作られる多様なトリアボディーはＳｃFv領域の他 の向きによる結合特性およびリンカー長さで異なってよい。３つのＳｃＦｖカセ ットのうち一つのみには前に記載のタグ配列が設けられている。トリアボディー 形成を誘導し、安定性を保持するために、システイン残基をＣ末端にまたはＶ領 域内に付加することによりジスルフィド橋を導入することができる。 実施例５ ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することのできるヒトＣＴＬＡ４の細 胞外領域にＣ末端残基により連結された拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体か らなる融合分子の構築： 概念的治療剤はＣＤ８０およびＣＤ８６の両方に対するＣＴＬＡ４の高い親和 性と特異性を拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体に組み合せた融合タンパク質 である。この融合分子は、ヒトＣＴＬＡ４（ＣＴＬＡ４ＥＤ）の細胞外領域が柔 軟性のあるリンカーによりＣ末端に結合させた完全抗ＣＤモノクローナル抗体と して安定で活性のある形で作られる。Ｆｃ部分をＣＴＬＡ４の細胞外領域に結合 させた抗ＣＤ４０抗体の構築をその後のＰＣＲとクローニング工程により行う。 オリゴヌクレオチド５'ＧＣＧ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＡＧ Ｇ ＧＴ ＣＣＣ ＣＧＣ３'（配列番号１４）および５'ＡＧＡ Ｔ ＴＴ ＧＧＧ ＣＴＣ ＡＡＣ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＡＣ３'（配列番号１５） を用いて、抗ＣＤ４０のＶＨおよびＣＨＩ領域をリーダー配列とともに増幅する 。この後に、オリゴヌクレオチド５'ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＴＴ ＧＡ Ｇ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＣＴ３'（配列番号１６）および５'ＧＣＧＣ ＧＡＡ ＴＴ Ｃ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＣＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ３'（配列番号１７）を用いて、ヒトＩｇＧのＣＨ ２とＣＨ３領域の増幅を行う。プライマーの除去後、第二ＰＣＲを行って両ＰＣ Ｒ産物を組み合せて完全長５Ｄ１２重鎖を得る。得られたＰＣＲ産物をゲルで精 製し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅクローニングキットを用いてＰＣＲ Ｓｃｒｉｐｔ にクローニングした。簡単に記載すれば、ＰＣＲ産物をＴ４リガーゼおよびＳｒ ｆＩと一緒にプラスミドとともに１時間室温でインキュベートし、その後、その 全試料でＸＩｌＢｌｕｅ大腸菌細胞を形質転換する。細胞を、１００μｇ／ｍｌ のアンピシリン、２０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧおよび２０μｇ／ｍｌのＸｇａｌを 含有するＬＢプレートに塗布する。３７℃でのインキュベーション後、挿入物を 有する推定の白いクローンを分析する。挿入物を含有するクローンをＭ１３とＭ １３リバースプライマーを用いるサイクル配列決定により分析する。正確な配列 を確認した後、抗ＣＤ４０重鎖を、ｐ１０プロモーター後の２シストロンバキュ ロウイルス発現プラスミドｐＡｃＵＷ５１（ファルミンゲン）のＥｃｏＲＩ制限 部位を用いてクローニングした。こうして得られた構築物は、後部にＣＴＬＡ４ ＥＤ部分がクローニングされた柔軟性のある（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーをＣ 末端に既に有する。したがって、ＣＴＬＡ４ＥＤ部分を、オリゴヌクレオチド５ 'ＧＣＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＡ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＡＧ ＣＣＴ Ｇ３'（配列番号１８）および５'ＧＣＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣ ＣＴＡ ＧＴＣ ＡＧＡ ＡＴＣ ＴＧＧ ＧＣＡ ＣＧＧ ＴＴＣ３'（配列番号１９）を用いるＰ ＣＲにより増幅し、ゲルで 精製し、ＮｏｔＩクローニング部位を用いる５Ｄ１２の重鎖の後部にクローニン グする。この工程の配列分析による確認後、軽鎖をクローニングする。これは、 ヒトＣＬ領域に結合させた５Ｄ１２のＶＬ領域を既に有したプラスミドを用いて 行う。よって、オリゴヌクレオチド５'ＧＣＧＣ ＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＣＣ ＧＣ３'（配列番号２０）および５'ＧＣＧＣ Ｇ ＧＡＴＣＣ ＣＴＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣ３'（配 列番号２１）を用いて、５Ｄ１２の軽鎖を増幅して、構築されたｐＡｃＵＷ５１ 発現プラスミドに、ポリヘドリンプロモーター後部のＢａｍＨＩクローニング部 位を用いてクローニングする。ＤＮＡ配列分析後に正しいクローンが得られる。 この確認後、５Ｄ１２−ＣＴＬＡ４ＥＤ構築物を有する発現プラスミドを、ファ ルミンゲンのバキュロゴールドトランスフェクションシステムを用いて、ウイル スＡｃＮＰＶ野生型ＤＮＡとともにＳｆ９昆虫細胞に導入する。組換えウイルス をプラーク精製し、発現カセットの統合性をＰＣＲおよびサイクル配列決定によ りチェックする。タンパク質産生のために、昆虫細胞を使用する。これらの細胞 は血清を含まない培地に生育でき、不均一タンパク質の最もよく知られている分 泌物である。融合タンパク質はＳ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡアフィニティクロ マトグラフィー（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８）により無血清なら し培地から精製される。二量体化の程度を評価するために、純度をＳＤＳ−ＰＡ ＧＥおよびウエスタンブロットにより、還元下および非還元下によりチェックす る。 実施例６ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０および／またはＣＤ８０／８６−ＣＤ２８経路のブロック のＴ細胞活性化に対する効果： ＣＤ８０／８６経路のブロックはＴ細胞活性化の阻害をもたらすことが示され ている（Van Good et al.，Res．In Immunol．146:183(1995)に概説されて いる）。しかし、多くの環境下においてはＣＤ８０／８６相互作用がＴ細胞活性 化の完全な阻止をもたらさない。これは図５により具体的に示され、ここでは精 製Ｔ細胞が、材料と方法で既に詳細に示したようにアロ単球で刺激される。（Ｃ Ｄ８０とＣＤ８６の両方をブロックする）ＣＴＬＡ４−Ｉｇの添加のみがアロ特 異的Ｔ細胞の部分的阻害をもたらす。驚くべきことに、拮抗性抗ＣＤ４０モノク ローナル抗体Ｍ３も、ＣＴＬＡ４−Ｉｇと同じ程度までＴ細胞活性化の部分的阻 害をもたらした。さらに驚くべきことには、拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗 体Ｍ３のＣＴＬＡ４−Ｉｇとの組合せはＴ細胞活性化のほとんど完全な阻止をも たらした。 ＣｓＡと組合された場合のＣＤ８０／８６のブロックは、抗原に特異的なＴ細 胞非応答性をもたらすことも示されている（Van Good et al.，Res．In Immunol ．146:183(1995)に概説されている）。これは、混合リンパ球培養で示されてお り、ブロック剤をアロ抗原による一次刺激中に加えた後に、短い休止期間を設け 、その後ブロック剤の不存在下に同一のアロ抗原により再刺激する。図６は、ア ロ原性単球で刺激された精製ヒトＴ細胞へのＣＴＬＡ４−Ｉｇ単独の添加ではな くＣＴＬＡ４−ＩｇプラスＣｓＡの添加がアロ抗原特異的なＴ細胞非反応性（黒 塗りのバー）をもたらすことを実際に示している。関連性のない第三のアロ抗原 を発現する単球に対する応答は変わらない（白抜きのバー）。また、図６はアロ 原性単球で刺激された精製ヒトＴ細胞へのＣＴＬＡ４−Ｉｇプラス抗ＣＤ４０モ ノクローナル抗体Ｍ３の添加のみがアロ抗原特異的なＴ細胞非反応性（黒塗りの バー）をもたらすことも示している。再度、関連性のない第三のアロ抗原を発現 する単球は変わらないので（白抜きのバー）、最初にの培養のアロ抗原に対する この非応答性は特異的である。 もう一対の実験において（図７）、ＣＤ４０のブロックと拮抗性抗ＣＤ４０モ ノクローナル抗体５Ｄ１２との組合せおよびＣＤＣＤ８０とＣＤ８６の拮抗性モ ノクローナル抗体との組合せが、方法と材料のセクションで既に詳細に説 明したように、ＰＢＭＣを用いるＭＬＣ実験で調べた場合にアロ抗原特異的Ｔ細 胞非応答性をもたらすことが示されている。驚くべきことに、抗ＣＤ４０モノク ローナル抗体が、ＣＤ８０共刺激レセプターをブロックすることなしに拮抗性抗 ＣＤ８６モノクローナル抗体に組み合せた場合にもアロ抗原特異的Ｔ細胞非応答 性が誘導された。対照的に、ＣＤ８６レセプターをブロックすることなく、抗Ｃ Ｄ４０モノクローナル抗体および抗ＣＤ８０モノクローナル抗体との組合せのみ が、拮抗性抗ＣＤ４０モノクローナル抗体単独と同じレベルまでＴ細胞低応答性 をもたらした。これは驚くべきことであった。なぜならば、ＣＤ８０とＣＤ８６ の両方のブロックはそのいずれか単独によるよりもさら完全な阻害を常にもたら すことが広く示されたからである。これは、ＣＤ８６−ＣＤ２８の共刺激相互作 用のブロックが、上記実施例で記載されたような一つの治療分子とのＣＤ４０Ｌ −ＣＤ４０共刺激相互作用のブロックとともに、Ｔ細胞仲介疾患の免疫治療のた めに強い潜在力を有することを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 19/02 25/00 25/00 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 16/46 16/46 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトリンパ球の表面に置かれているヒトＣＤ４０抗原および少なくともヒト ＣＤ８６抗原に結合することが可能な可溶性分子。 ２．ＣＤ４０に対する抗原結合部位およびＣＤ８６に対する抗原結合部位を有す る抗体である請求項１記載の可溶性結合分子。 ３．特にＣＤ４０に対する抗体の抗原結合部位およびＣＤ８０およびＣＤ８６に 架橋反応性の抗体の抗原結合部位を含むことにより、ＣＤ４０およびＣＤ８０と ＣＤ８６との両方に結合することが可能な三特異的ジアボディーである請求項２ 記載の抗体分子。 ４．特にＣＤ４０に対する抗体の抗原結合部位およびＣＤ８６に対する抗体の抗 原結合部位を含むことにより、ヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ８６に結合すること のできる二特異的ジアボディーである請求項２記載の抗体分子。 ５．特にＣＤ４０に対する抗体の抗原結合部位、ＣＤ８０に対する抗体の抗原結 合部位およびＣＤ８６に対する抗体の抗原結合部位を含むことにより、ＣＤ４０ 、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することのできる三特異的トリアボディーであ る請求項２に記載の抗体分子。 ６．ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外領域により少なくともＣＤ８６に結合することの できる請求項１または３記載の可溶性結合分子。 ７．ＣＤ８６に対する抗体が抗体Ｆｕｎ−１である請求項４または５記載の抗体 。 ８．ＣＤ４０に対する抗体がＣＤ４０に対する拮抗性抗体である請求項２〜７の いずれか一項に記載の抗体。 ９．ＣＤ４０に対する抗体がＣＤ４０に対する非刺激拮抗性抗体である請求項２ 〜７のいずれか１項に記載の抗体。 １０．宿主細胞中で抗体分子を発現することのできる調節配列に作動可能に結合 された、請求項１〜９のいずれか１項に記載の結合分子断片をコードする核酸配 列を有する組換えベクター。 １１．請求項９記載のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。 １２．宿主細胞を培養し、培養培地から結合分子を単離することからなる、ヒト ＣＤ４０抗原および少なくともヒトＣＤ８６抗原に結合することのできる組換え 分子を作る方法。 １３．請求項１〜９のいずれか１項に記載の治療効果量の結合分子および薬学的 に許容されるキャリヤーを含有する、Ｔ細胞寛容誘導のための医薬組成物。 １４．請求項１〜９のいずれか１項に記載の治療効果量の医薬組成物を治療が必 要な患者に投与することからなる、Ｔ細胞仲介免疫応答を治療する方法。 １５．請求項１３記載の治療効果量の医薬組成物を治療が必要な患者に投与す ることからなる、同種移植片拒絶を妨げる方法。 １６．請求項１３記載の治療効果量の医薬組成物を治療が必要な患者に投与する ことからなる、異種移植片拒絶を妨げる方法。 １７．請求項１３記載の治療効果量の医薬組成物を治療が必要な患者に投与する ことからなる、Ｔ細胞寛容を誘導するための方法。 １８．請求項１３記載の治療効果量の医薬組成物を治療が必要な患者に投与する ことからなる、同種移植片または異種移植片寛容を誘導するための方法。 １９．請求項１３記載の治療効果量の医薬組成物を治療が必要な患者に投与する ことからなる、リュウマチ性関節炎、多硬化症および乾せん等の自己免疫疾患を 予防または治療するための方法。 ２０．請求項１３記載の治療効果量の医薬組成物を治療が必要な患者に投与する ことからなる、遺伝子治療ベクターまたはビヒクルに対するＴ細胞仲介免疫応答 を治療する方法。 ２１．請求項１３記載の治療効果量の医薬組成物を治療が必要な患者に投与する ことからなる、治療用分子に対するＴ細胞仲介免疫応答を治療する方法。