JP2000515514A - 放射性金属元素結合ペプチドの類似化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 診断および治療方法で用いるために、ペプチドに結合する新規の金属元素結合リガンドが開示されている。このリガンドをもつペプチドは、ペプチドを合成する過程のいずれかの時点で、リガンドの導入と環化を行なうことのできる方法を用いて作出することができる。このようなペプチド誘導体を、特定のペプチドレセプターに強く結合するそれらの能力を保持しつつ、レニウムまたはテクネチウムの同位元素などの放射性金属元素で直ちに標識する。

Description

【発明の詳細な説明】 放射性金属元素結合ペプチドの類似化合物 発明の背景 本発明は、ペプチド鎖に連結した１個以上のアミノ酸側鎖またはセグメントが 、放射性核種を含む金属元素イオンに緊密に結合することができるキレート部位 を含んでいる、生物学的に有用な環状および非環状のペプチドの誘導体を提供す る。標識されたペプチドは、レセプターや抗原などの特定のインビボの標的に金 属元素を輸送し、放射線診断用の画像化、治療、および放射線治療に有用である 。このペプチドを調製するための新しい方法も提供されている。 放射性標識されたペプチドは、ペプチドホルモンレセプターが過剰発現すると いう特徴をもつヒトのさまざまな疾病状態の診断および治療において有用である 。すなわち、例えば、放射性標識されたＬＨＲＨ（黄体形成ホルモン放出ホルモ ン）とソマトスタチンの放射性標識した類似化合物が、ＬＨＲＨホルモンレセプ ターが細胞表面で過剰に発現するという特徴をもつホルモン感受性腫瘍に選択的 に結合することが示されている。同様に、¹²³Ｉ血管作用性腸管ペプチド（ＶＩ Ｐ）、⁹⁹ｍＴｃ−Ｐ８２９、¹¹¹Ｉｎ−ＤＴＰＡオクトレオチド、および¹¹¹Ｉｎ −ビスＭＳＨ−ＤＴＰＡなどのペプチドホルモン類似体を用いて、それぞれ、Ｖ ＩＰレセプター、ソマトスタチンレセプター、ソマトスタチンレセプター、およ びメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）レセプターを過剰発現させるヒト腫瘍が 画像化されている。Virgoliniら、Engl．J．Med．169巻：1116頁（1994年）；Vi rgoliniら、J．Nucl．Med．36巻：1732頁，（1995年）；Lister-Jamesら、J．Nu cl．Med.，36巻，91頁，#370，1995年 学会抄録；Pearsonら、J．Med．Chem．3 9巻：1361頁，（1996年）；Krenningら、J．Nucl．Med．33巻：652頁，（1992年 ） ；およびWraightら、Brit．J．Radiol．65巻：112頁，（1992年）を参照のこと 。 チロシンを含むペプチドの多くは、既知の方法によって¹²⁵Ｉで標識し、レセ プター結合実験に用いることができる。例えば、放射性リガンドとして¹²⁵Ｉ− ［Ｔｙｒ¹⁰］−ＶＩＰを用いて、広範なタイプの癌におけるインビトロでのＶＩ Ｐレセプターのアップレギュレーションの発生が研究されている。Reubi，Nucl ．Med．36巻：1846頁（1995年）を参照のこと。乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓 癌、子宮内膜癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌、ＳＣＬＣ、星状細胞腫、グリア芽腫 、髄膜腫、褐色細胞腫、リンパ腫、神経芽腫、腺腫、およびＧＥＦの腫瘍を含む 、広範なタイプの癌において、ＶＩＰレセプターが検出された。また、ヨウ素化 されたＶＩＰ類似体である¹²³Ｉ−［Ｔｙｒ¹⁰］−ＶＩＰを用いて、ヒトにおけ るＶＩＰレセプターに富む腫瘍が画像化されてきた。Virgoliniら、前記参照。 しかし、放射性ヨウ素を、診断及び治療に利用するためインビボで用いること には、明らかな不都合がある。インビボで最も有用な¹²³Ｉは、非常に高価（４ ５．３０ドル／ｍＣｉ）で、サイクロトロンで製造しなければならない。さらに 、この同位元素の半減期は、僅か１３．２時間であるため、放射性ヨウ素化した 画像化剤を使用すべき場所に、地理的に近接したところで製造される必要がある 。診断および治療で用いるためには、それぞれ、^99mＴｃ、¹⁸⁸Ｒｅなど、これ以 外の放射性同位元素が好ましい。例えば、^99mＴｃは、高価ではなく（０．５ド ル／ｍＣｉ）、容易に利用することができ（原子炉の産物である⁹⁹Ｍｏから、発 生機の中で製造される）、ガンマ線カメラで画像化するために理想的なガンマ線 の放射エネルギーをもっている。 ^99mＴｃおよび¹⁸⁸Ｒｅなどの放射性金属元素をペプチドに直接結合させる残基 を、直接に含むか、またはそれの導入を許すペプチドがある。例えば、ソマトス タチンは、還元されると、^99mＴｃに直接結合することができる、スルフヒドリ ル基を含むシステイン側鎖を２つ提供するジスルフィド結合を持っている。米国 特 許第５，２２５，１８０号を参照のこと。また、国際公開公報第９４／２８９４ ２号、国際公開公報第９３／２１９６２号、および国際公開公報第９４／２３７ ５８号も参照のこと。しかし、この型の複合体は、不均質で不安定な傾向にあり 、臨床的な有用性には制限がある。その上、この態様における解離したスルフヒ ドリル基を使用することは、ペプチドを標識するために用いることのできる放射 性金属元素を、解離したＳ−Ｈ基に緊密に結合する放射性金属元素だけに制限す ることになる。さらに、この方法には、金属元素がアミノ酸側鎖に直接結合する とペプチドの構造に大きく影響する可能性があり、これによって、化合物のレセ プター結合特性が有害な方向に変化するという問題がある。 ほとんどのペプチドは、金属元素が結合するアミノ酸配列モチーフをもたず、 また、前記したようなさまざまな理由で、そのようなモチーフの導入を可能にす るような適当な配列の変更も受けつけない。したがって、ペプチドが放射性金属 元素を結合できるようにする手段をペプチドに導入する必要がある。好ましい方 法は、単一の明確で、安定した複合体が形成されるように、ペプチドの特定の部 位に金属結合リガンドを付加させることである。金属元素を結合させるために用 いられるリガンドは、しばしば、窒素、硫黄、リン、および酸素など、金属元素 に強い親和性をもつ、さまざまなヘテロ原子を含んでいる。 キレート化合物は、従来、ペプチド部分とキレート部分を独立に合成した後、 共有結合によって、ペプチド、またはペプチド類似体のＮ末端に付加させられて きた。例えば、Mainaらは、ソマトスタチン類似体のＮ末端にテトラ・アミン・ キレート化因子を結合させて、ペプチドを^99mＴｃで標識することを説明してい る。J．Nucl．Biol．Med．38巻，452頁（1994年）を参照のこと。しかし、ペプ チドのＮ末端が、そのレセプター結合特性に重要な役割を果たしているときには 、このようにして結合することは望ましくない。したがって、この方法を適用す るには、ペプチドのＮ末端が、ペプチドの結合特性に有害な影響を与えることな く、（通 常は、立体的に巨大な）キレート化因子を受け入れる必要があるということによ る制約がある。 あるいは、キレート化因子は、特定のアミノ酸残基を含む部位選択的な反応と いう方法によって、ペプチド側鎖の中に導入されてきた。例えば、ＬＨＲＨの６ 番目の位置のリシン残基は、キレート基によって直接アシル化されてきた。Baja sz，Sら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86巻:6313頁（1989年）を参照のこと。 この方法は、一つ以上の側鎖がキレート因子と反応する可能性があるとき、また は、ペプチド配列が、このような方法で誘導体化することのできるアミノ酸を含 んでいないときには、利用できる化学的な選択性を持たないことによる制約を受 ける。さらに、この方法には、多座配位のリガンドを用いるときにも制約を受け ることがある。単一のリガンド分子が、複数のペプチド分子と反応して、かなり の量の架橋産物が生じることがある。 Dunn T.J．らが、国際公開公報第９４／２６２９４号で説明しているように、 トリスアミノ酸によって、キレート化因子がペプチドの側鎖上に導入されている 。この方法は、ペプチドを環化する方法を提示していない。この研究で記述され ているリガンドを導入するために用いられた側鎖保護基は、一般的に、ペプチド アミド環状化に用いられる保護基と同じものである。Felixら、Int．J．Peptide Protein Res．32巻:441頁（1988年）。 完全に保護されたＢＡＴ（ビスアミノチオール）キレート化因子が合成されて 、リシン残基の側鎖に結合されて、その後、ペプチドの中に取り込まれた。Ｄｅ ａｎら、国際公開公報第９３／２５２４４号を参照のこと。これらの完全な保護 された前駆体は、非常に時間がかかり、高価で、調製に手間がかかる。このよう な前駆体を調製するのは困難で高価なため、この方法は、金属元素をもつ標的因 子を設計するのに必要な、さまざまなリンカーに付着したリガンドの多様な配列 を調製するのには適さない。 この問題を解決する可能性がある方法は、ペプチド鎖の特定の位置に、キレー ト化因子部分を選択的に結合させる保護基法を用いることである。しかし、ペプ チドのアミノ酸側鎖に存在するさまざまな化学反応性が、保護基の部位特異的な 脱保護における充分な選択性を発揮することを困難にしている。また、これまで 、この選択性の欠如によって、ペプチドの中の二つ以上の異なった官能基を、例 えば、環状ペプチドの中のこれらの基を結合させるために選択的に脱保護しよう とする努力が阻まれてきた。 Edwardsら、J．Med．Chem．37巻:3749頁（1994年）は、樹脂上に環状のジスル フィドを集合させてから、そのままのリガンド（ＤＴＰＡ）を付加させるフラグ メント法を開示している。この方法によって、既知のソマトスタチン標的因子Ｄ ＴＰＡ−オクトレオチドが作り出される。この方法は、既知の化合物を調製する ために特別に設計されたものである。しかし、より典型的な状況では、特定の標 的への結合を最適化するために、さまざまな標識ペプチドが必要とされる。した がって、このような状況では、多数のリガンドを集合させ、最もよく集合して断 片となったものを、ペプチド配列のさまざまな位置で環化することもできる配列 の望ましい位置に置くことができる、より広範な方法を必要とする。 金属元素に選択的に結合することのできるペプチドを合成するために、さらに 考慮すべきことには、ペプチドの構造に対するキレート化合物の効果が含まれる 。効率的なレセプターの結合には、通常、ペプチドが特定の構造をとる必要があ るが、ほとんどのペプチドは、構造的に非常に変化しやすい。ペプチドが、特定 の構造をとることができるか否かは、共有的に結合したキレート部分の抗かを含 む、電荷と親水性／疎水性の相互作用によって影響を受ける。ペプチドがとるこ とのできる構造を限定すること、好ましくは、活性のある構造に固定することに よって、ペプチドレセプターの親和性と選択性を高めることが可能である。この ことは、環状ペプチドを調製することによって、しばしば、最も容易に実現され る。 環状ペプチドには、さらに、プロテアーゼに対する抵抗性が向上するという利点 があり、そのため、しばしば、対応する直鎖状ペプチドよりも長い生物学的な半 減期を示す。 ペプチドは、ジスルフィド結合、スルフィド結合、および、特に、Ｎ末端およ びＣ末端、またはアミノ酸側鎖のカルボキシ官能基とアミノ官能基との間でのラ クタム形成など、さまざまな方法によって環化することができる。しかし、ペプ チド鎖内の官能性が過多であるということは、一般的に、最短のペプチド以外の 全てのペプチドにとって、２つの望ましい官能基の間で選択的な結合を行なわせ ることは非常に難しいことを意味している。 このように、レセプターに対する高度の親和性によって特異的に結合する能力 を保持しながら、金属イオンをキレートすることができる環状ペプチドが非常に 望ましいことは明らかである。ペプチド鎖の中の予め決められた位置に、キレー トする部分を付加する方法をもつことと、ペプチド鎖の中の２つの予め選ばれた 位置の間で環状ペプチドを選択的に形成させる方法をもつことも望ましい。さら に、ペプチド合成過程の望ましい段階で、キレートする部分をペプチドに結合さ せることのできる方法を利用できることも望ましい。 発明の概要 このように、ペプチドレセプターへの特異的に結合する能力を保持しながら、 放射性核種に結合することのできるペプチドを提供することが本発明の目的であ る。さらに、ペプチドレセプターへの特異的に結合する能力を保持しながら、放 射性核種に結合することのできるペプチドを調製し、放射性標識する方法を提供 することも本発明の目的である。なお、さらに、腫瘍、感染性病変、心筋梗塞、 血栓、アテローム硬化斑、または正常な器官もしくは組織を画像化もしくは治療 するために、放射性標識したペプチドを用いる診断方法と治療方法を提供するこ とが本発明の目的である。 前記の本発明の目的を達成するにあたって、本発明の一つの側面にしたがって 、放射性金属元素結合部分を含むペプチドで、該結合部分が、次の構造式Ｉを含 むペプチドが提供されていた： ここで、Ｒ¹、Ｒ²、またはＲ³の少なくとも一つがＨであれば、Ｒ¹、Ｒ²、お よびＲ³は、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、シクロアルキル 基、置換されたシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、置換 されたアリール基、ヘテロアリール基、置換されたヘテロアリール基、アルカリ ール基、および、ペプチド合成の状態では除去することができる保護基からなる 群より独立に選択される。Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、およびＲ¹⁰は独立に 、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、アリール基、および置換さ れたアリール基からなる群より選択されるか、または、選択的には、Ｒ⁴とＲ⁶が 、直接的な結合を形成する。Ｒ⁸とＲ⁹が一緒に、またはＲ⁷とＲ⁹が一緒に、シク ロアルキル環、または置換されたシクロアルキル環を形成してもよく、ＮＲ¹⁰は 、該ペプチドのＮ末端に位置するか、または、該ペプチドのアミノ酸側鎖の上に 存在している。 本発明の好ましい態様においては、Ｒ¹がＨ、Ｒ³がＨ、Ｒ⁴がＨであるか、ま たは、Ｒ⁴とＲ⁶が一緒になって直接的な結合を形成している。別の好ましい態様 においては、Ｒ²は、低級アルキル基であるか、または、置換された、もしくは 置換されていないフェニル基であり、または、より好ましくは、メチル基か、ま たはフェニル基である。別の好ましい態様においては、Ｒ⁸とＲ⁹はメチル基であ る。 本発明のもう１つの側面によると、さらに、ペプチドは、結合した金属元素を 含む。好ましい態様において、この金属元素は、^99mＴｃ、¹⁸⁶Ｒｅ、または¹⁸⁸ Ｒｅである。 本発明のさらにもう１つの側面によると、金属元素をキレートする組成物を調 製する方法で、結合部分が上に示されている構造をもっている放射性金属元素結 合部分をもつペプチドの溶液をスズイオンと接触させ、続いて、この溶液を放射 性核種に接触させてから、放射性標識されたペプチドを回収する方法が提供され ている。この方法の好ましい態様において、放射性核種は、¹⁸⁸Ｒｅ−もしくは^{1 86} Ｒｅ−過レニウム酸塩、または⁹⁹Ｔｃ−過テクネチウム酸塩である。 さらにもう１つの本発明の側面によると、腫瘍、感染性病変、心筋梗塞、血栓 、アテローム硬化斑、または正常な器官もしくは組織を画像化する方法で、放射 性標識されたペプチドを、ペプチドが上で示されている構造をもつ放射性金属元 素結合部分を含むとき、ペプチド溶液をスズイオンと接触させてから、該溶液を 放射性核種に接触させて、放射性標識されたペプチドを回収することによって調 製して、放射性標識されたペプチドを、人間の患者に、薬学的に許容できる担体 とともに投与し、該放射性標識ペプチドが局在して、非標的のバックグランドが きれいになるのに十分な時間を置いてから、該放射性標識ペプチドを付加した部 位を、外部にある画像化カメラによって検出する方法が提供されている。 本発明の別の側面によると、（Ｃｈｅ１）が、上記の構造をもっ放射性金属元 素結合部分であるときに、 (Che1)γAbuNleDHF_dRWK-NH₂、 (Che1)γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNS1LN-NH₂、 KPRRPYTDNYTRLRK(Che1)QMAVKKYLNSILN-NH₂、 (Che1)γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂、 (Che1)γAbuYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂、 HSDAVFTDNYTRLRK(Che1)QMAVKKYLNSILN-NH₂、 <GHWSYK(Che1)LRPG-NH₂、<GHYSLK(Che1)WKPG-NH₂、 AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、 (Che1)γAbuSYSNleDHF_dRWK-NH₂、(Che1)γAbuNleDHF_dRWK-NH₂、 (Che1)NleDHF_dRWK-NH₂、 Ac-HSDAVFTENYTKLRK(Che1)QNleAAKKYLNDLKKGGT-NH₂、 (Che1)γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂、 (Che1)γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂、 (Che1)γAbuNleDHF_dRWK-NH₂ ^c、<GHWSYK(Che1)LRPG-NH₂、 <GHYSLK(Che1)WKPG-NH₂、AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、 <GHYSLK(Che1)WKPG-NH₂、<GHYSLK(Che1)WKPG-NH₂、 Nal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)WKPG-NH₂、<GHWSYK_d(Che1)LRPG-NH₂、 AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、 AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、 AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、<GHWSYK(Che1)LRPG-NH₂、 AcK(Che1)F_d CFW_dKTCT-OH、AcK(Che1)DF_d CFW_dKTCT-OH、 AcK(Che1)F_d CFW_dKTCT-ol、AcK(Che1)DF_d CFW_dKTCT-ol、 (Che1)DF_d CFW_dKTCT-OH、K(Che1)DF_d CFW_dKTCT-ol、 K(Che1)KKF_d CFW_dKTCT-ol、K(Che1)KDF_d CFW_dKTCT-OH、 K(Che1)DSF_d CFW_dKTCT-OH、K(Che1)DF_d CFW_dKTCT-OH、 K(Che1)DF_d CFW_dKTCD-NH₂、K(Che1)DF_d CFW_dKTCT-NH₂、 K(Che1)KDF_d CFW_dKTCT-NHNH₂、AcK(Che1)F_d CFW_dKTCT-NHNH₂、 K(Che1)F_d CFW_dKTCT-ol、およびF_d CFW_dKTCTK(Che1)-NH₂、 からなる群より選択される構造をもつペプチドが提供されている。 この他の、本発明の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らか になるはずである。しかし、この詳細な説明から、本発明の意図と範囲の中で、 さまざまな変更と修正ができることが当業者に明らかになるため、詳細な説明と 特異的な実施例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、例示のためだけに 与えられいると理解されるべきである。 詳細な説明 本発明は、ペプチド、環状ペプチド、およびペプチド類似化合物に共有結合で きる新規のキレート化部分を提供する。このキレート化部分は、ペプチド、環状 ペプチド、およびペプチド類似化合物を、金属元素、特に放射性金属元素に安定 して結合させる。これらのキレート化因子、ペプチド、およびペプチド類似化合 物を調製する方法も提供されている。このペプチド、およびペプチド類似化合物 は、固相法、または液相法によって合成されるペプチドの中に、金属元素キレー ト化因子を部位特異的に導入することによって調製される。キレート化部分は、 ペプチド鎖の中のアミノ酸の、アミド基をもつ側鎖に付加されているか、または 、ペプチドのＮ末端に付加されている。本発明に係るペプチドには、ＬＨＲＨの 環状金属元素結合類似体、血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、ヘレグリンズ（ ｅｒｂＢ結合ペプチド）α、β₁、β₂、およびβ₃、メラノトロピン（α−ＭＳ Ｈ）、ソマトスタチン、カルシトニン、上皮成長因子、ゴナドトロピン放出ホル モン、ヘレグリンズ成長ホルモン放出ホルモン、ダイノルフィン、カルシトニン 遺伝子関連ペプチド、バソトシン、メソトニン、副腎皮質刺激ホルモン、コルチ コトロピン、ゴナドトロピン、プロラクチン、バソプレシン、オキシトシン、Ｐ 物質、Ｋ物質、およびアンギオテンシンが含まれるが、これらに限定はされない 。 キレート化部分は、次の一般式で表すことができる。ここで、Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキ ル基、シクロアルキル基、置換されたシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル 基、アリール基、置換されたアリール基、ヘテロアリール基、置換されたヘテロ アリール基、アルカリール基、および、ペプチド合成の状態では除去することが できる保護基からなる群より独立に選択される。Ｒ¹、Ｒ²、またはＲ³の少なく とも一つはＨでなければならない。Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、およびＲ¹⁰ は、独立に、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、アリール基、お よび置換されたアリール基からなる群より選択される。Ｒ⁴とＲ⁶は、一緒に、直 接結合を形成することもでき、また、Ｒ⁸とＲ⁹が一緒に、またはＲ⁷とＲ⁹が一緒 に、シクロアルキル環、または置換されたシクロアルキル環を形成することがで きる。ＮＲ¹⁰は、キレート化因子が付加される、該ペプチドのＮ末端に存在する か、または、該ペプチドのアミノ酸側鎖の上に存在している。Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³ま たはＲ⁶が、ヘテロ原子に置換される官能基を持っているときには、さらに別の ペプチド結合反応を行なうために、このヘテロ原子を用いることもできる。 低級アルキル基の例には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピ ル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチ ル基、ｉ−ペンチル基、およびｎ−ヘキシル基のような、直鎖または分枝状のＣ₁ −Ｃ₆アルキル基が含まれるが、これらに限定はされない。シクロアルキル基に は、シクロヘキシル基などのＣ₃−Ｃ₆シクロアルキル基が含まれる。ヘテロシク ロアルキル基には、テトラヒドロフラン、テトラヒトロピラン、ピロリジン、お よびピペレジンが含まれる。ヘテロアリール基には、ピロリル基、フラニル基、 チエニル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、オキサゾリルチオ基、チアゾリ ル基、ピラゾリル基、ピロリジニル基、ピリジニル基、ピリミジニル基、モルホ リニル基、およびピペリジニル基が含まれる。アリール基には、フェニル基、α −ナフチル基、またはβ−ナフチル基などのＣ₆−Ｃ₁₂アリール基が含まれる。 アルカリール基には、フェニルＣ₁−Ｃ₆アルキル基などの、Ｃ₆−Ｃ₁₂アリー ルＣ₁−Ｃ₆アルキル基、または、ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロ ピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、α−もしくはβ−ナフチルメ チル基、ナフチルエチル基、ナフチルプロピル基、ナフチルブチル基、またはナ フチルペンチル基などの、α−もしくはβ−ナフチルＣ₁−Ｃ₆アルキル基が含ま れる。 置換基の例には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基などのＣ₁ −Ｃ₆アルコキシ基、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基な どのＣ₁−Ｃ₆アルキルチオ基、例えば、ベンジルオキシ基のようなフェニルＣ₁ −Ｃ₆アルコキシ基などの、Ｃ₆−Ｃ₁₂アリールＣ₁−Ｃ₆アルコキシ基、例えば、 ベンジルチオ基などの、フェニルＣ₁−Ｃ₆アルキルチオ基、アミノ基、例えば、 メチルアミノ基、エチルアミノ基のようなＣ₁−Ｃ₆アルキルアミノ基などの、置 換されたアミノ基、ベンジル基などのフェニルＣ₁−Ｃ₆アルキル基のような、Ｃ₆ −Ｃ₁₂アリールＣ₁−Ｃ₆アルキル基、シクロヘキシル基などのＣ₃−Ｃ₈シクロ アルキル基、およびシクロヘキシメチル基などのＣ₃−Ｃ₈シクロアルキルＣ₁− Ｃ₆アルキル基が含まれる。 本発明の好ましい態様には、Ｒ²がＨ、メチル基、またはフェニル基であり、 Ｒ⁸およびＲ⁹がメチル基である化合物が含まれる。この他の好ましい態様は、Ｒ¹ 、Ｒ³、Ｒ⁵、Ｒ⁷、およびＲ¹⁰がＨの場合である。 このペプチドは、いずれかのアミノ官能基が選択的に脱保護されているかもし れない、特異的に保護されたビス−アミノ酸誘導体を用いて合成することができ る。常法のペプチド結合法によるペプチド合成過程で、伸長しているペプチド鎖 の中に、これらの誘導体を導入する。そして、アミノ官能基の一つを脱保護し、 続いて、キレート化分子の全部、または一部を結合させるか、または、ペプチド 合成を続けるために、さらに、アミノ酸残基を付加させる。従来のアミドバック ボーンをもつペプチドを作出するよう、α−アミノ基で結合させるか、または、 アミドバックボーンが側鎖構造によって中断されているペプチドを産生するため に、側鎖のアミノ基で結合させて、ペプチド合成を続けることができる。あるい は、解離したアミノ官能基を用いて、ペプチドのいずれかの位置にある反応性の 官能基と環状化して、それによって、環状ペプチドを産生することができる。当 業者には、適当なビス−アミノ酸は、一見して明らかであり、リシン、オルニチ ン、および２，３−ジアミノプロピオン酸（アミノ−セリン）が含まれる。ある いは、樹脂に結合しているペプチドの、脱保護したＮ末端にキレート化部分を結 合させることによって、ペプチド合成の最後にキレート化部分を導入することも できる。キレート化部分は、保護された形態にしても、脱保護された形態にして も、完全なユニットとして付加するか、または、完全なキレート化構造を構築す るような段階的方法で合成することができる。 本発明において用いられるビス−アミノ酸は、一般的に、化学式：ＺＨＮ−Ｃ Ｈ（−Ｒ−ＮＨＹ）−ＣＯ₂Ｈで表される。但し、Ｒは、Ｘが、Ｏ、Ｓ、または Ｎのヘテロ原子で、ｎ＝１〜２０のときに、（ＣＨ₂）_n、または（ＣＨ₂）_n−Ｘ −（ＣＨ₂）_nである。あるいは、ＣＨ₂基の水素原子を、低級アルキル基、置換 された低級アルキル基もしくはアルケニル基、または、シクロヘキサン、ベンゼ ン、およびピペルミジンなどの、環状もしくはヘテロ環状環、または、当業者に 周知の、その他の基によって置換することができる。置換基Ｚ及びＹは、それぞ れ独立に、Ｈ、Ｎ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、アリール基、 または置換されたアリール基とすることができる。 ペプチド合成を続けた場合、キレート化部分を導入するために、ペプチド合成 過程のいかなるところにおいても、ビス−アミノ酸の第２のアミノ基を選択的に 脱保護することができる。ペプチドに結合させる前に、完全なキレート化部分を 合成するか、または、連続的に、ペプチドに分節を結合させて、完全なキレート 化部分を合成することができる。全部のペプチド／キレート化因子構造の組み立 てが完成したら、切断、脱保護、および精製によって、望ましいペプチド誘導体 が作出される。そして、放射線診断及び放射線治療への応用で用いるために、こ の誘導体を放射性金属元素で標識する。 あるいは、全部または一部のキレート化分子が、まず、脱保護されたアミノ酸 基に結合する場合には、第２段階は、その他のアミノ基を脱保護して、ペプチド 合成を継続させることである。この段階で、一部のキレート化分子だけがペプチ ドに結合するのであれば、適当な脱保護と結合反応によるペプチド鎖合成の最中 、またはその後のいかなる時点でも、キレート化因子の合成を完了させることが できる。切断、脱保護、および精製の最終段階で、再び、純粋なペプチド誘導体 が得られるので、これを、前記のように放射性標識する。 樹脂から切断する前に、キレート化因子をペプチドに付加すると、ＤＴＰＡ− 二無水物などの活性化された多座配位のキレート化因子が用いられたときでも、 架橋された産物の形成が減少する結果になる。 ペプチド配列の特定の位置において、２つの親和性のある官能基部分を選択的 に脱保護し、続いて、この親和性のある部分の間を環化することによって、環状 ペプチドの調製が行なわれる。Ｎ末端とＣ末端の間、末端と、ペプチド配列内の 中間にある官能基との間、または中間にある２つの官能基の間など、ペプチド配 列のいずれの２つの部位の間でも環化を行なうことができる。液相、または固相 のペプチド合成のいずれかを用いて、環化を行なうことができるが、好ましくは 、固相技術を用いて実施される。 最終的な脱保護反応の前に、ペプチド合成過程のいずれの時点でも、脱保護と 環化を行なうことができる。例えば、環化する前に、全体を保護したペプチド配 列を調製するか、または、保護されたペプチド中間体について環化を行なって、 その後、合成を完成することができる。同様に、金属元素キレート化部分の全部 または一部をペプチドに結合させる前か後に、環化を行なうことができる。光学 的に切断可能な樹脂、または、当業者に既知の別の樹脂を、固相ペプチド合成機 で用いると、固相担体から保護されたペプチドを解離させることもでき、続いて 、液相で選択的な脱保護と環化を行なうことができる。あるいは、樹脂から切断 する前に、環化すべき側鎖を選択的に脱保護し、液相中で環化を行なうことがで きる。 環化反応を含むが、それに限定されない、ペプチドのＣ末端に関わる反応を、 上記した態様で、樹脂から保護されたペプチドを解離させることによって行なう ことができる。あるいは、伸長中のペプチド鎖を、ある残基の側鎖、および、適 当に保護されたＣ末端のカルボキシ基によって、樹脂に付着させることができる 。Ｃ末端のカルボキシ基との反応が望ましいときには、それを選択的に脱保護し て、反応を進めるようにする。環化反応の場合には、Ｃ末端の脱保護は、親和性 のある反応基を脱保護する前、途中、または後に行なうことができる。 放射性金属元素をキレートする、本発明のペプチドは、血液、および、その他 の体液ならびに組織の中で、放射性核種を安定して保持する。本方法における試 薬と条件の両者とも、先行する技術よりも大幅に簡易化されており、標識された ペプチドは、テクネチウム、またはレニウム標識を用いた放射線診断と放射線治 療に応用するのに、特に適している。 上に概述した方法によって、ペプチド配列のどこかに放射性金属元素結合部分 を設けることができる。直接に、またはスペーサー基によって、アミノ酸側鎖上 にキレート化部分を設置することには、ペプチドのバックボーンから金属元素複 合体を空間的に離しておくことができ、それによって、ペプチドの構造に対する 金属元素複合体の効果を最小にできるという、さらなる利点がある。また、これ によって、必要ならば、ペプチドのＮ末端をペプチドの環化に用いることができ るようになる。 ペプチドの構造が、電荷、および親水性／疎水性の相互作用によって大きく影 響を受けることが知られているため、ペプチドに用いるべきキレート化リガンド を設計するときには、これらの変数を考慮することが重要である。さまざまな電 荷と親水性をもち、さまざまな長さスペーサー基をもつ、さまざまなキレート複 合体を調製、試験して、標的選択性、薬物動力学、およびキレート安定性の最適 な組合せを示す金属元素複合ペプチドを選択する。当業者は、このような試験が 当技術分野において日常的な作業であると認識していよう。 本発明の放射性標識ペプチドは、高いレセプター密度と、ペプチドに対する高 い親和性とを示す、病気の細胞、または組織に対して特異的に結合する。放射性 核種の放射活性によって、腫瘍、または病気の組織の診断、および／または治療 が可能になる。また、本発明には、有効用量の本発明の放射性標識ペプチドを少 なくとも一つ、例えば、Remingtonの薬剤科学；薬物レセプターとレセプター理 論（Pharmaceutical Science;Drug Receptor and Receptor Theory;18巻.，Mack Publishing株式会社Easton，PA 1990年）に記載されているような薬学的に許容 できる滅菌された賦形剤とともに含む薬学的組成物も含まれる。また、本発明に は、臨床環境において用いるのに便利で簡易な、ペプチドを標識するためのキッ トも含まれる。 Ａ．キレート化部分を組み込んだ直鎖状ペプチド類の設計及び合成 （ｉ）一般 本発明のペプチド類は、少なくとも１個のチオール又はチオカルボニル基の存 在を特徴とする放射性金属キレート化アミノ酸誘導体類と、さらに第三級アミン 、ヒドラゾン、又は第二級アミンもしくはヒドラジンのいずれかとして存在する 少なくとも１個の窒素とを含有している。金属イオンを堅固かつ優先的に結合で きる多座配位子を形成するために、硫黄及び窒素原子が適切に配置されている。 多座配位子はさらに、ペプチドの残りからキレート化金属を分離するのに役立つ ス ペーサー基を含有することもできる。好ましくは、金属イオンは還元放射性核種 であり、好ましい実施態様では^99mＴＣ、¹⁸⁶Ｒｅ、又は¹⁸⁸Ｒｅである。 本発明はさらに、ペプチド配列のどこかの個所で他の金属のための配位子を配 置するための方法を提供する。これらの配位子には例えばＤＴＰＡを無傷で、又 は断片として導入できる。この方法を用いると、ペプチド標的配列中に医学的に 重要なＩｎ、Ｇａ、Ｙ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、及びＬｕ を含むがそれらに限定されないその他の金属に対する配位子を配置できる。 本方法は、ペプチド合成に対して適切に保護されたあらゆる金属キレート又は キレート断片の導入を可能にする。本方法はさらに又、それが合成の最後に導入 される限りにおいて、ペプチド配列のどの個所にも配置できる塩基感受性配位子 誘導体類を導入するための方法も提供する。１つの例は、次の配位子断片トリチ ル−Ｓ−ＣＯＣＨ₂Ｎ（Ｂｏｃ）ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈを使用してリシンの側鎖へ付加さ れた配位子の合成である。Ｓ−トリチルエーテルは塩基に対して高感度であろう から、合成における余り早期にペプチド上にこの配位子断片を配置するのは不可 能であろう。 本発明の各キレート化部分は、有機合成の分野の当業者にはよく知られている 方法によって調製できる。キレート化部分はアミノ、ヒドラジノ又はヒドラジド 官能基と活性化カルボキシル基との縮合、ヒドラジン類とアルデヒド類との結合 、又はアミン類とアルデヒド類との間の還元アミン化反応のような単純な結合又 は縮合反応によって連結されているサブユニット類から構築する。本書で使用さ れている用語「縮合」は、キレート化部分のサブユニット類を一緒に結合する反 応を含んでいることが意図されているので、従って縮合反応の伝統的定義に一致 する反応に加えて還元アミン化のような反応を含んでいる。 縮合反応の後に、サブユニット上の追加の官能基類は追加の縮合反応が可能に なるように保護を除去することができる。例えば、遊離カルボキシル基と保護さ れたアミノ官能基とを持っている第２サブユニットは、より大きな適切に保護さ れた金属結合配位子の断片を産生するために第１サブユニット上でアミノ、ヒド ラジノ、又はヒドラジド官能基と一緒に縮合することができる。第２サブユニッ ト成分上のアミノ官能基はその後保護を除去して、さらに第３サブユニットに結 合させることができる。本書で使用されている用語「断片」は、金属結合配位子 の全部又は一部を含んでいるサブユニット又はサブユニットのアッセンブリーを 含んでいることが意図されている。 そうした縮合反応のためにカルボキシル基を活性化する方法は、有機合成及び ペプチド合成の分野における当業者にはよく知られており、活性エステル類及び カルボジイミド及びホスホリルアジド結合剤の使用を含んでいる。官能基の反応 性がサブユニットを結合するために使用される反応又はペプチド鎖の合成のため に使用される反応と不適合である場合は、サブユニット上の官能基を保護するた めに適切な保護剤を使用する。メルカプト、アミノおよびカルボン酸官能基に対 する保護基は技術分野においてよく知られている。例えば、Greeneの有機合成に おける保護基（PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTESIS;Wiley Interscience， NY，1981年）を参照。キレートを構成するために使用されるサブユニットは、技 術分野においてよく知られている方法によって容易に調製するか、又は例えばア ドヴァンスト・ケムテック社（Advanced ChemTech，Lexington，KY）、ミリゲン 社（Milligen，Burlington，MA）、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems，Foster City，CA）、又はアルドリッヒ・ケミカル社（Aldrich Che mical Corp.，Milwaukee，WI）のような供給業者から市販で入手できる。 キレート試薬サブユニットを一緒に結合するために使用する縮合反応は，ペプ チド合成の前に、又はペプチド配列の合成中のどちらかに実施できる。ペプチド 合成の前にアミノ酸誘導体をそのサブユニットから集合させる場合は、α−アミ ノ及びα−カルボキシル官能基を引き続いて選択的保護除去及びペプチド合成を 行うためのこれらの官能性の活性化と適合する方法で適切に保護しなければなら ない。そうした保護基の例は技術分野においてよく知られているが、アミノのた めの保護基には、フルオレンメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオ キシカルボニル（Ｃｂｚ）、ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、アリルオキシカル ボニル（ａｌｏｃ）、４−メトキシトリチル（ｍｔｔ）、及び１−（４，４−ジ メチル−２，６−ジオキソシクロヘクス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）基が 含まれている。カルボキシルの保護基にはメチル（Ｍｅ）、ベンジル（Ｂｎ）、 ‘ブチル（‘Ｂｕ）、及びアリルエステル類が含まれている。 アミノ及びカルボキシルの保護基は、他の基の存在下では各々から選択的に保 護を除去できるように選択しなければならない。そうした保護部分は直交性であ ると言われる。直交性保護基が使用される要件は、例えばベンジルエステルとし て保護されたカルボキシル基の存在下では、アミノ官能基を保護するためのＣｂ ｚ基の使用を前もって排除する。上記のGreeneを参照。好ましい実施態様では、 α−アミノ基はＦｍｏｃ基として、α−カルボキシル基はメチルエステルとして 保護される。本発明の化合物において使用されるチオール保護基は、タンパク質 の活性を実質的に変化させずにペプチドの存在下で遊離スルフヒドリルを再生す る温和な条件下で容易に除去されるあらゆる有機基又は無機基であってよい。適 切な保護基は上記のGreene、１９３−２１７頁に列挙されている。適切な保護基 の例には、置換又は非置換トリチル基類、チオールエステル類、チオカルバメー ト類及びジスルフィド類が含まれている。好ましい実施態様では、チオール保護 基はトリチル基又は４−メトキシトリチル基である。当業者は、チオール基を保 護する、又は保護を除去する方法に熟達している。例えば、安息香酸チオエステ ル類はヒドロキシルアミンを使用して温和かつ選択的条件下で保護を除去するこ とができる。保護されたキレート化部分の集合が完了すると、α−カルボキシ官 能基の保護が除去され、ペプチド合成の従来型方法を用いてペプチド鎖のアミノ 末 端へ結合させられる。Bodanszkyらのペプチド合成の実践（THE PRACTICE OF PEP TIDE SYNTHESIS，Springer Verlag，Heidelberg，1984年）参照。 ペプチド合成中に金属キレート化アミノ酸誘導体がのそのサブユニットから集 合させられる場合は、ペプチド鎖は従来型液相法によって、又は好ましくは誘導 体が組み込まれる個所まで固相合成法によって集合させる。個別に保護されたビ ス−アミノ酸はその後ペプチド鎖のアミノ末端へ結合させる。引き続いて誘導体 中のアミノ基の１つから選択的に保護を除去すると、ペプチド合成又はキレート 試薬合成のどちらかの継続が可能になる。 最初にα−アミノ官能基の保護を除去する場合は、残っているアミノ酸残基の 全部又は一部をその後従来型方法でペプチド鎖に結合させる。その後で誘導体の 側鎖アミノ官能基の保護を除去し、上記のようにキレート化部分が集合させる。 その後に完全ペプチドの保護を除去し、標準方法によって精製する。 最初に側鎖アミノ官能基の保護を除去する場合は、その後キレート化部分の全 部又は一部を上記のように集合させ、その後にα−アミノ基の保護の除去を行う 。ペプチド合成は上記のと同様の従来型方法で完了する。 ペプチド合成が完了したら、完全に保護されたペプチドの保護を除去して精製 する。合成ペプチド類から保護を除去して精製する方法は技術においてよく知ら れている。例えば、上記のBodanszkyを参照。ペプチドが固相法によって合成し た場合は、ペプチドはさらに合成のための固相担体として使用した樹脂から開裂 させなければならない。この開裂を達成するための方法も又技術においてよく知 られている。本発明のペプチド類のような合成ペプチド類を精製するための方法 も又当業者にはよく知られている。そうした方法には、例えば、イオン交換クロ マトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、及び逆相高速液体クロマトグラ フィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が含まれる。本発明の好ましい実施態様では、ペプチ ドは予備スケールのオクタデシルシラン（ＣＩＢ）シリカカラムパッキンを用い 、 ０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶解させたアセトニトリルの勾配を用 いて溶離させるＲＰ−ＨＰＬＣによって精製する。ペプチドの純度は、分析的Ｒ Ｐ−ＨＰＬＣ又はキャピラリー電気泳動法のような標準方法によって確認できる 。ペプチドの同一性は、ＮＭＲ分光検査法、又は本発明の好ましい実施態様では 質量スペクトロメトリーによって確認できる。 上述のように、キレート化部分が適切な受容体へのペプチド結合を妨害しない ことが重要である。受容体結合に有害な影響を及ぼさずに置換できるペプチド内 の残基の測定は、各連続残基が例えばアラニンと置換される一連のペプチド類を 調製すること（「アラニンスキャン」）によって、系統立った簡単な方法で実行 できる。その後、アラニン置換ペプチド類を生物学的活性についてスクリーニン グする。最新のペプチド合成機はこの方法で極めて簡単にペプチド類の合成を行 うので、当業者にとっては極めて多数のペプチド類をスクリーニングすることは 日常の作業である。そうしたアラニン置換を含有しているペプチド内の高い受容 体結合親和性の保持は、置換アミノ酸が受容体結合にとって余り重要ではないこ とを意味しており、金属結合残基を置換できる位置を示している。その後はこれ らの位置の各々でキレート試薬が配置されているペプチド類を合成することは簡 単で、日常のスクリーニングによってキレート試薬にとっての至適位置を確認で きる。 上述のように、本発明の方法を使用すると、金属結合配位子を含有している極 めて多数のペプチド類を調製することができる。クレームされた発明の方法を使 用して金属キレート化ペプチド類を調製する追加の方法は当業者には明白になる であろう。本発明をさらに詳細に例示するために、これらの方法を使用する特異 的適用を下記に記載するが、これらの実施例は単に例示的なものであって、本発 明の適用の範囲を制限することを意図していないことは理解されるであろう。 （ii）キレート化部分の調製 好ましい実施態様では、キレート試薬はチオール基と一緒にチオセミカルバジ ド又はチオセミカルバゾン基を含有しており、下記の一般式Ｉによって表すこと ができる： ここで、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は独立してＨ、低級アルキル、置換低級アルキル、シ クロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、置換ア リール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル及びペプチド合成の 条件下で除去できる保護基からなる基から選択される。Ｒ¹、Ｒ²、又はＲ³のう ちの少なくとも１つはＨでなければならない。Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹及 びＲ¹⁰は独立してＨ、低級アルキル、置換低級アルキル、アミド及び置換アミド からなる基から選択される。Ｒ⁴及びＲ⁶は又一緒に任意で直接結合を形成してい てもよく、Ｒ⁸及びＲ⁹、又はＲ⁷及びＲ⁹は一緒にシクロアルキル又は置換シクロ アルキル環を形成していてもよい。ＮＲ¹⁰は、キレート試薬が付加されているペ プチドのＮ−末端に位置しているか、又はペプチドのアミノ酸側鎖上に位置して いる。Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁵又はＲ⁶がヘテロ原子置換官能基を持っている場合は、ヘテ ロ原子は又追加のペプチド結合反応を実施するために使用されてもよい。 本発明を実施するためにキレート化部分による金属結合のメカニズムを理解す ることは必要ではないが、いかなる理論を結びつけることを願わなくとも、金属 は2個の硫黄原子プラス2個の窒素原子によってキレート試薬へ結合されると考え られている。金属結合性窒素類はβ−チオール含有アミノ酸のα−窒素とチオカ ルボニル基に遠位のチオカルバジド／チオカルバゾン窒素であると仮説が立てら れている。金属が還元放射性過レニウム酸塩又は還元放射性下テクネチウム酸塩 である場合は、2個の硫黄原子及び2個の窒素原子が金属上の4つの配位位置を提 供する。 これらの化合物は有機合成の分野においてよく知られているによって調製する ことができる。そこで、例えば式Iを有する化合物は、保護された、又は保護さ れていないβ−チオール含有側鎖（「システイン型アミノ酸」）を有するα−カ ルボキシル保護アミノ酸部分とカルボキシル含有チオセミカルバゾン又はチオセ ミカルバジド部分との間のアミド結合によって調製できる。この結合は、カルボ ジイミド媒介結合のようなよく知られている方法を使用して実施できる。アミノ 酸からα−カルボキシル基の保護を除去するとキレート化部分がペプチドのアミ ノ側鎖又はアミノ末端へアミド結合することが可能になる。或いは又、側鎖を含 有しているβ−チオールを有するＮ−及びＳ−保護システイン型アミノ酸は最初 にペプチドへ結合させ、その後にＮ−の保護を除去し、さらにカルボキシル含有 チオセミカルバゾン又はチオセミカルバジド成分へアミド結合させてもよい。 システイン型アミノ酸はアミノ酸合成の標準方法によって調製できる。α−炭 素での立体配置は（Ｒ）又は（Ｓ）であってよく、又はアミノ酸はブドウ酸であ ってよい。同様に、β−炭素での立体配置は、非対称的に置換された場合は（Ｒ ）、（Ｓ）であるか、（Ｒ／Ｓ）であってよい。アミノ酸は、標準方法を用いて その後の結合反応のために保護する。 チオセミカルバゾン類は、セミカルバジド類とカルボニル化合物との縮合によ って調製できる。例えばホウ水素化ナトリウムを用いてチオセミカルバゾン類を 還元させると、置換チオセミカルバジド類が生じる。好ましい実施態様では、チ オセミカルバジドはグリオキシル酸と反応して対応するチオセミカルバゾンを形 成するが、これを任意で還元させると置換チオセミカルバジドが形成される。 多数のチオセミカルバジド類は、例えばアルドリッヒ社（Aldrich Chemical C ompany，Milwaukee，WI）から市販で入手できる。その他のチオセミカルバジド 類は、ヒドラジンと例えばイドチオシアン酸塩との反応によって調製できる。非 対称的に置換されたヒドラジン類もまた市販で入手できるか、又はアミンをニト ロサミンへニトロ化し、その後にヒドラジンへ還元することによって調製できる 。イソチオシアン酸塩はアミンとチオホスゲンとの反応によって調製できる。そ の他のチオセミカルバジド類の調製方法は当業者にはよく知られている。 一部の例では、チオセミカルバジド類はシステイン型アミノ酸への結合のため に使用される溶媒類への溶解性が低いことが発見されている。そうした場合は、 チオセミカルバゾンを使用し、その後にペプチドへ結合させることによって結合 を実施できる。次に、チオセミカルバゾンは水酸化ホウ素ナトリウムまたは他の 適切な還元剤を用いて還元され得る。チオセミカルバジドが直接使用できるほど 十分に溶解性の場合は、結合の前に最初にα−窒素を保護しなければならない。 適切な保護基は技術においてよく知られており、Ｂｏｃ及びＣｂｚ基が含まれる 。 （iii）直鎖状ＶＩＰ受容体標的物質 天然に発生するＶＩＰは下記の配列を有している： ＨＳＤＡＶＦＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮ−ＮＨ₂ アラニンスキャンによって、アラニンとの置換が受容体結合に大きな影響を及 ぼさない数個の残基が判明した。これらの残基には、Ｌｙｓ−15、Ｇｌｎ−１６ 、Ｖａｌ−１９、Ｌｙｓ−２１、Ａｓｎ−24、Ｓｅｒ−25及びＮ及びＣ末端が含 まれる。これらの場所は本発明に記載の金属結合配位子を付着させる可能性があ る部位である。 これらの場所での金属結合配位子の付着に基づくキレート誘導体類には、リシ ン又は他のビス−アミノ酸残基の側鎖アミンによって薬作用発生団へ直接に、又 はスペーサー基によって付着させられている金属結合成分を含む誘導体類が含ま れるが、これらに限定されない。この一般構造を持つ特異的キレート誘導体類に は下記が含まれるが、これらに限定されない： MaGCγAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂ AcCGCHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂ KPRRPYTDNYTRLRK(PtscGC)QMAVKKYLNSILN-NH₂ MaGCγAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂ AcCGCVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂ MaGCγAbuYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂ HSDAVFTDNYTRLRK(PtscGC)QMAVKKYLNSILN-NH₂ HSDAVFTDNYTRLRK(Dtpa)QMAVKKYLNSILN-NH₂ HSDAVFTDNYTRLRK(AGC)QMAVKKYLNSILN-NH₂ ここで、Ｍａはメルカプト酢酸であり、 ＰｔｓｃＧは2−（4−フェニル−3−チオセミカルバジジル）酢酸もしくはＰ ｈＮＨＣＳＮＨＮＨＣＨ₂ＣＯ₂Ｈであり、 γＡｂｕはγ−アミノブチル酸であり、及び Ｋ（ＰｔｓｃＧＣ）においては、括弧は封入されたアミノ酸類がリシンのεア ミンへ付着させられており、付着した第１アミノ酸が、その後にＰｔｓｃＧの続 くＣであることを意味している。 上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と 置換できる。 （iv）直鎖ＬＨＲＨ受容体標的物質 天然に発生するＬＨＲＨは、<GHWSYGLRPG-NH₂（ここで、＜Ｇはピログルタミ ン酸(pyroglutamic acid)である）という配列を有している。さらに、次の二環 式ペプチド AcNal_dCpa_dW_d(cyc1o4-10)D(cyclo5-8)ER_dLKPDap-NH₂ （ここで、Ｗ_dはアミノ酸のＤ異性体が使用されていることを示しており、Ｎａ ｌ は２−ナフチルアラニンであり、Ｃｐａは４−クロロフェニルアラニンであり、 Ｄａｐは２，３−ジアミノプロピオン酸である）がＬＨＲＨ受容体に結合するこ とはよく知られている。Bienstockら，J．Med．Chem．36:3265（1993）を参照。 さらに又、ＬＨＲＨの第６位の側鎖が極めて塊状耐性であることも知られている 。Barbacciら，J．Biol．Chem．270:9585（1995）を参照。この場所は、本発明 に記載の金属結合配位子を付着させる可能性がある部位である。 この位置での金属結合配位子の付着に基づく直鎖状キレート誘導体類には、リ シン又は他のビス−アミノ酸残基の側鎖アミンによって薬作用発生団へ直接に、 又はスペーサー基によって付着させられている金属結合成分を含む誘導体類が含 まれるが、これらに限定されない。この一般構造を持つ特異的キレート誘導体類 には下記が含まれるが、これらに限定されない。 <GHWSYK(MaGC)LRPG-NH₂ <GHYSLK(MaGC)WKPG-NH₂ <GHWSYK(Ma-azaGC)LRPG-NH₂ <GHYSLK(PtscGC)WKPG-NH₂ <GHYSLK(PtscGDap)WKPG-NH₂ <GHWSYK_d(MaGC)LRPG-NH₂ <GHYSLK(azaGC)WKPG-NH₂ <GHWSYK(iEGC)LRPG-NH₂ <GHWSYK_d(MtaGC_a)LRPG-NH₂ <GHWSYK(iECiD)WKPG-NH₂ <GHYSLK(DiGlyGDap)WKPG-NH₂ <GHYSLK(iDGDap)WKPG-NH₂ <GHWSYK(MtaGC)LRPG-NH₂ <GHWSK(MaGC)W_dLRPG-NH₂ <GHWSYK_d(MtaGDap)LRPG-NH₂ <GHWSYK_d(PtscGC)LRPG-NH₂ <GHWSYK_d(E)LRPG-NH₂ <GHWSYK_d(MtscGC)LRPG-NH₂ <GHWSYK_d(Mta(hgss)GDap)LPG-NH₂ AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(MaGC)LRPA_d-NH₂ Nal_dCpa_dW_dSRK_d(PtscGC)LRPA_d-NH₂ AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(MaFC)LRPA_d-NH₂ AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(azaGFC)LRPA_d-NH₂ ここで、 ＜Ｇはピログルタミン酸であり、 Ｍａはメルカプト酢酸であり、 ａｚａＧはアザグリシンもしくはＨ₂ＮＮＨＣＨ₂ＣＯ₂Ｈであり、 ＰｔｓｃＧは2−（4−フェニル−3−チオセミカルバジジル）酢酸もしくはＰ ｈＮＨＣＳＮＨＮＨＣＨ₂ＣＯ₂Ｈであり、 Ｄａｐは２，３−ジアミノプロピオン酸であり、 ｉＤは側鎖カルボキシル基によって結合させられたアスパラギン酸であり、 ｉＥは側鎖アミノ酸基によって結合させられたグルタミン酸であり、 ＤｉＧｌｙはＨＯＯＣＣＨ₂ＮＨＣＨ²ＣＯＯ−であり、 Ｍｔａ（ｈｇｓｓ）はＳ−（２，５−ジヒドロキシフェニル−Ｓ−メチル）ス ルホニウムアセチルであり、 Ｃ_aはＡｃｍ保護システインであり、 Ｍｔａはメルカプト酢酸のメチルチオエステルであり、 Ｎａｌは２−ナフチルアラニンであり、 Ｃｐａは４−クロロフェニルアラニンであり、 Ｋ_dでは、下付き文字ｄはＤ異性体が使用されたことを意味しており、 Ｋ（ＭａＧＣ）では、括弧は封入されたアミノ酸類がリシンのεアミンへ付着 させられており、付着した第1アミノ酸が、その後にＧが続いてＭａで終わるＣ であることを意味している。 さらに、これらのペプチド類と放射性金属との錯体を調製できる。そうした錯 体には下記が含まれる： <GHWSYK(MaGC)LRPG-NH₂ ReO <GHYSLK(MaGC)WKPG-NH₂ ReO <GHYSLK_d(MaGC)LRPG-NH₂ReO 上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と 置換できる。 （ｖ）直鎖状α−ＭＳＨ受容体標的物質 天然に発生するα−ＭＳＨは下記の配列を有している： Ａｃ−ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ₂ 以前に、環状ペプチドＮｌｅＤＨＦ_dＲＷＫ−ＮＨ₂（ここで、Ｎｌｅはノルロ イシンであり、Ｆ_dはＤ−Ｐｈｅを表している）がα−ＭＳＨ受容体に対して高 い親和性を有しており、インビボにおいて比較的に安定性であることは証明され ている。Al-Obeidiら，J．Amer．CHem．Soc．111巻:3413頁（1989年）；Haskell -Luevanoら、J．Med．Chem．39巻:432頁（1996年）を参照。下線の引かれた部分 は、それらがペプチドの環化部分内の残基であり、さらに環状構造の末端である こと、つまりペプチドがアスパラギン酸およびリシンの側鎖からアミド結合によ って環化されていることを示している。 これらのよく知られているα−ＭＳＨ受容体結合ペプチド類の構造をベースと する直鎖状キレート誘導体類には、直接に、又はγ−アミノブチル酸（γ−Ａｂ ｕ）のようなスペーサー基によってペプチドのＮ−末端へ付着させられているキ レート誘導体類が含まれるが、これらに限定されない。この一般構造を持つ特異 的キレート誘導体類には下記が含まれるが、これらに限定されない： MaGCγAbuSYSNleDHF_dRWK-NH₂、及び MaGCγAbuSYSNleDHF_dRnWK-NH₂ ここで、γ−Ａｂｕはγ−アミノブチル酸であり、Ｒ_nｗはニトロ化されたア ルギニン残基である。 上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と 置換できる。 Ｂ． キレート化アミノ酸誘導体類を結合した環状ペプチド類の設計及び合成 （ｉ）一般 環状金属キレート試薬／ペプチド錯体を調製するプロセスは、ペプチド鎖合成 中又は合成後のある時点に環化を実行すること以外は、上記の直鎖状ペプチド類 について記載したプロセスに類似している。環化は、ペプチド末端又はアミノ酸 側鎖のようなペプチド上のいずれか２個の官能基間で行うことができる。環化は 、ジスルフィドもしくはスルフィド形成によって、又は好ましくはラクタム形成 によって達成できる。部位選択的環化には、ペプチド上の２個の官能基から保護 を選択的に除去することが必要である。ラクタム形成のためには、これは他のア ミノ及びカルボキシル保護基の存在下で保護を除去できるアミノ及びカルボキシ ル保護基を使用することが必要である。この作業は、これらの他の保護基間で選 択的保護除去が達成されることをペプチド合成がさらに必要とする場合にはより 困難になる。したがって、そうした高度に洗練された保護基戦略はこれまでは実 際に達成することは困難なことが証明されていた。 本発明の方法は、環化およびペプチドへのキレート試薬成分の結合の両方をペ プチド合成中のあらゆる時点に達成すること可能にする。適切な保護基の使用に よって、望ましいあらゆる順番でペプチドの合成、配位子の集合及びペプチドの 環化を達成することが可能である。このアプローチは、ペプチドを樹脂から分離 して環化する固相法又は環状ペプチドの合成後に溶液中で配位子を付着させる方 法より効果的である。 本発明の方法は液相においても使用できるが、好ましくは全自動固相ペプチド 合成機を使用して実施する。マルチ−ウェル全自動合成機を使用すると、キレー ト試薬成分の付着点又は環化部位が相違する極めて多量のペプチド類を同時に調 製することが可能である。ペプチド類を含有している配位子の保護は除去されて いるがまだ固相に付着しているこれらのいわゆる「組合せライブラリー」は、適 切な金属と反応して錯体類を形成することができ、その後に適切な生物活性アッ セイでスクリーニングして受容体結合及び安定性に関する最高に望ましい特徴を 有する化合物を選択できる。 組合せ合成は、「分割（split）」合成又は「平行（parallel）」合成によっ て実施できる。分割合成では、ビーズへ結合させた合成ペプチド中間物を各連続 ステップにおいて次のアミノ酸付加のために相違するグループに分ける。各ステ ップ後、次の反応のためにビーズを相違するグループに分ける。平行合成では、 相違する化合物を例えばペプチド合成機のウェルのような相違する反応容器内で 合成する。分割合成は少量ずつ多種類の化合物を生じさせるが、他方平行合成は 少ない種類の大量の化合物を生じさせる。 組合せ合成はさらに、個々の各化合物をスクリーニングステップにおいて同定 できるように何らかの方法で標識することを必要とする。この目的で化合物を標 識する種々の手段は技術において知られている。例えば、ガスクロマトグラフィ ーによって同定できる標識として不活性ハロゲン化芳香族化合物類が使用される 。これにより引用することにより全体が本明細書に組み込まれているBorman、Ch em．Eng．News 74巻：29頁（1996年）を参照。 本発明の好ましい実施態様では、環化はラクタム形成によって達成される。最 も好ましくは、アミノ官能基はａｌｏｃ基を使用して保護され、カルボキシル官 能基はアリルエステルとして保護される。これによりアリル基(allyl)に対する 求核剤の存在下でＰｄ（ＰＰＨ₃）₄を使用してアミノ官能基とカルボキシ官能基 の保護を同時に除去することが可能になる。典型的に使用される求核剤は水素化 トリ−ｎ−ブチルスズ（ⁿＢｕ₃ＳｎＨ）である。 本発明の以前に、アミン類がＰｄ^O触媒作用下でアリルイオン類と反応するで あろうことは知られていた。例えば、Roosら，J．Org．Chem．60巻:1733頁（195 5年）及びHeck，有機合成におけるパラジウム試薬類（PALLADIUM REAGENTS IN O RGANIC SYNTHESES，Academic Press，1995年，122〜131頁を参照。本発明の発明 者らは、新たに保護を除去されたアミノ官能基がアリル基によってアルキル化さ れる副反応が生じるので、アリル保護アミノ及びカルボキシル官能基から同時に 保護を除去することに関する問題を惹起することを発見した。しかし、Ｐｄ触媒 ａｌｏｃ開裂反応中におけるアリルスカベンジャー（捕捉剤）としてのピペリジ ン付加が望ましくない副反応を抑制することが発見された。これは、望ましくな いＮ⁴−アリルリシンの形成を大きく減少させながら、例えばアスパラギン酸お よびリシン側鎖の選択的及び同時の保護除去を可能にした。当業者であれば、他 の第一級又は第二級アミン類もまた適切なアリルスカベンジャーであることを認 識するであろう。 この方法は、Ｆｍｏｃをベースにしたペプチド合成と適合性であるため有用か つ有益である。これは、Ａｌｏｃ側鎖保護に加えてＢｏｃ又はＦｍｏｃ両方の側 鎖保護を使用できるＨＭＰ及びＰＡＭ樹脂上での環状ペプチド類の調製を可能に する。この技術はさらに、ペプチド鎖のいずれかの個所のアミノ酸の側鎖へ付加 された金属結合配位子を含有している環状ペプチド類の合成を可能にする。そこ で３個の直交窒素保護基を使用する。１番目はＦｍｏｃ又はＢｏｃのようなペプ チド鎖を作り上げるためのもの、２番目は４−メチルトリチル（ｍｔｔ）又は１ − （４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘクス−１−イリデン）エチル（ Ｄｄｅ）のようなビスアミノ酸の側鎖へ金属結合配位子を付着させるためのもの 、そして、３番目はＡｌｏｃのような側鎖−側鎖環化を達成するためのものであ る。Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、’Ｂｕ及びベンジル基のようなその他の保護基は、ペプチ ド合成が終了するまで保護が除去されない他の側鎖アミノ及びカルボキシル官能 基を保護するために使用できる。これらの保護基の組合せは、固相ペプチド合成 のためのＲｉｎｋ、Ｗａｎｇ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ＰＡＭ及びＨＭＰタイプ の樹脂類の使用を可能にする。樹脂からのペプチド類の開裂はトリフルオロ酢酸 （Ｆｍｏｃをベースとする合成）又はＨＦ又はトリメチルシリルトリフルオロメ タンスルホン酸塩（Ｂｏｃをベースとする合成）を用いて遂行できる。 本発明の環状ペプチド類は残基数４〜１００の長さで、５個までの金属キレー ト化基を有している。これらのペプチド類は長さがアミノ酸数２〜６０の環化領 域を含有でき、さらに１個以上の環状部分を含有できる。 環化は、ラクタム端を形成するためには好ましくはアミノとカルボキシアミノ 酸側鎖との間であるが、ラクタム架橋を形成するための側鎖アミンとカルボキシ 末端との間でも、ラクタム架橋を形成するための側鎖酸とＮ末端アミンとの間で も、ジスルフィド架橋を形成するためのチオール間でも、ヒドラジドを形成する ためのヒドラジンとエステルとの間でも、ヒドラゾンを形成するためのヒドラジ ンとアルデヒドとの間でも、スルフィドを形成するためのチオールと適切な離脱 基との間でも、又はエーテルを形成するためのヒドロキシル基と別の適切な離脱 基との間でもよい。化合物中に１以上の環状領域が存在するときは、環状領域に おける架橋は同一タイプであっても相違するタイプであってもよい。 環状ジスルフィドを形成しなければならない場合は、好ましくは、重要なペプ チドはチオール上のＡｃｍ保護及びアミノ側鎖上のａｌｏｃ保護を用いて合成す る。ａｌｏｃを開裂させ、キレート化配位子をペプチドに結合させる。その後Ａ ｃｍ基を開裂させ、タリウムトリフルオロ酢酸塩を用いてジスルフィドを環化さ せる。或いは又、チオール類はＳ−トリチル基を用いて保護でき、環化を樹脂か らの開裂後に溶液中で実施することができる。 環状スルフィドの調製は、例えばアミン側鎖上に存在するαハロアミド官能基 上へチオールを環化させることによって達成できる。従って、例えばペプチドは Ｎ末端上のＦｍｏｃ保護及びチオール上のＳ−トリチル保護を用いて合成するこ とができる。その後ａｌｏｃ保護リシン側鎖の保護を除去し、キレート試薬を上 記のようにリシンに結合させる。Ｆｍｏｃは開裂させ、塩化クロロアセチル又は 等価の試薬と反応させる。例えば光開裂性のBromo Wang樹脂（Wang、J．Org．Ch em．41巻:3258頁（1976年））のような酸安定性樹脂を使用した場合は、チオー ル保護を除去し、ペプチドを樹脂上で環化させる。 側鎖残基間の環状スルフィド類は、２つの独立に保護されたアミノ側鎖での選 択的保護除去を可能にするペプチドのＮ末端上の適切な保護基を用いて調製する 。例えば、Ｎ末端はアセチルもしくはＢｏｃ基として保護することができ、側鎖 はＦｍｏｃ及びａｌｏｃ基として保護できる。ペプチド合成後、１個のアミノ酸 側鎖（例えば、Ｆｍｏｃ）の保護を選択的に除去し、上記のようにキレート化部 分と結合させる。その後もう１つのアミノ酸側鎖（例えばａｌｏｃ又はＤｄｅ） の保護を除去し、ハロアセチル又はマレイミドのようなスルフィド求電子剤に結 合させる。重要な硫黄上の保護基を開裂させ、塩基触媒を使用して樹脂上で環化 を実施する。或いは又、ペプチドを開裂でき、環化を溶液中で実行することがで きる。 上述のように、本発明の方法を使用すると多種多様な環状ペプチド類を調製で きる。本書にクレームされた方法を使用して環状金属キレート化ペプチド類を調 製する追加の方法は当業者には明白であろう。本発明を詳細に例示するために、 これらの方法を使用する特異的適用を下記で述べるが、これらの実施例は単に例 示的なものであり、本発明の適用範囲を制限することが意図されていないことは 理解されるであろう。 （ii）環状α−ＭＳＨ受容体標的物質 天然に発生するα−ＭＳＨは配列Ａｃ−ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ−ＮＨ₂ を有している。以前に、環状ペプチドＮｌｅＤＨＦ_dＲＷＫ−ＮＨ₂（Ｎｌｅはノ ルロイシン、Ｆ_dはＤ−Ｐｈｅを意味している）がα−ＭＳＨ受容体に高い親和 性を有しており、インビボで相当に安定性であることは証明されている。Ao-Obe idiら，J．Amer．Chem．Soc．111巻:3413頁（1989年）；Haskell-Luevanaら，J ．Med．Chem．39巻:432頁（1996年）を参照。下線が引かれた部分は、それらが ペプチドの環化部分内の残基である、さらに環状構造の末端であることを意味し ているので、つまりペプチドはアスパラギン酸およびリシンの側鎖からのアミド 結合によって環化されている。この環状構造は本発明に記載の標識ペプチド類を 構築するための基礎として使用されている。 既知のα−ＭＳＨ受容体結合配位子の構造を基礎とする環状キレート誘導体類 には、直接に、又はγ−アミノブチル酸（γ−Ａｂｕ）のようなスペーサー基に よってのいずれかでペプチドのＮ−末端へ付着させられているキレート誘導体を 有するものが含まれる。この一般構造を持つ特異的キレート誘導体類には下記が 含まれるが、これらに限定されない。 MaGCγAbuNleDHF_dRWK-NH₂ PtscGCNleDHF_dRWK-NH₂ AcCGCNleDHF_dRWK-NH₂ DTPA-NleDHF_dRWK-NH₂ ここで、 Ｍａはメルカプト酢酸であり、 γＡｂｕはγ−アミノブチル酸であり、 ＰｔｓｃＧは２−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸であり、 及び ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸である。 上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と 置換できる。 （iii）環状ＶＩＰ受容体標的物質 天然に発生するＶＩＰは下記の配列を有している： HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂ 天然ＶＩＰは溶液中でらせん構造を形成すると考えられている。Mussoら，Bio chemistry 27：8174（1988）を参照。推定上のらせん構造は、らせん構造によっ て空間的近傍に配置された残基の側鎖による分子内環化によって安定化させるこ とができる。その例には下記が含まれる： Ac-HSDAVFTENYTKLRKQNeAAKKYLNDLKKGGT-NH₂ Ac-HSDAVFTDNYTKLRKQNleAVKKYLNSVLT-NH₂ （ここで、Ｎｌｅはノルロイシンである）。O‘Donnellら，J．Pharm．Exp．T her．270巻：1282頁；米国特許第４，８２２.，８９０号；Bolin、欧州特許出願 第０５３６７４１Ａ２号を参照。下線が引かれた部分はそれらがペプチドの環化 部分内の残基である、さらに環状構造の末端であることを意味しているので、つ まりペプチドはアスパラギン酸とリシンの側鎖間のアミド結合によって環化され ている。この環状構造は本発明に記載の標識ペプチド類を構築するための基礎と して使用されている。 これらの構造を基礎とする環状キレート誘導体類は、直接に、又はスペーサー 基によってリシンの側鎖アミンもしくはその他のビス−アミノ酸残基によって薬 作用団へ付着させられた金属結合成分を有する誘導体類が含まれるが、これらに 限定されない。この一般構造を持つ特異的キレート誘導体類には下記が含まれる が、これらに限定されない： Ac-HSDAVFTENYTRLRK(PtscGC)QNleAAKKYLNDLKKGGT-NH₂ （ここで、ＰｔｓｃＧは2−（4−フェニル−3−チオセミカルバジジル）酢酸 である）、及び Ac-HSDAVFTENYTRLRK(DPTA)QNleAAKKYLNDLKKGGT-NH₂ （ここで、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ作酸である） 上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と 置換できる。 このように一般的に説明された本発明は、例示のために提供されていて本発明 を限定することは意図されていない下記の実施例を参照することによってより容 易に理解されるであろう。 実施例 実施例１：ＮｃｘＡｌｌｏｃ−Ｎ⁴−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシンの合成 Ｎ⁴−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン（１０．００ｇ、２７．１ｍｍｏｌ、１００ｍｏ ｌ％、Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）をジオキサン（１００ ｍｌ）及びＮａ₂ＣＯ₃（１Ｍ、３３ｍｌ）の混合液中に懸濁させ、乳濁液を形成 させた。ジオキサン（１０ｍｌ）にクロロギ酸アリル（３．２ｍｌ、３０．２ｍ ｍｏｌｌ、ｍｏｌ％）を添加し、この溶液を１０分間かけてＮ⁴−Ｆｍｏｃ−Ｌ −リシンの懸濁液に滴下法で添加した。炭酸ナトリウム（１Ｍ、２０ｍｌ）を２ 回に分けて添加し、さらに追加量のクロロギ酸アリル（０．３ｍｌ）を添加した 。この反応液を室温で１６時間攪拌した。還元圧力下で揮発性溶媒を取り除き、 残留物をジエチルエーテル（５０ｍｌ）を用いて洗浄した。残留液をその後ＨＣ ｌ（１Ｍ）を用いて酸化させ、酢酸エチル（２×１５０ｍｌ）を用いて抽出した 。有機相を結合し、飽和ＮａＣｌ（５０ｍｌ）を用いて洗浄し、Ｎａ₂Ｓｏ₄の上 を通して乾燥させ、還元圧力下で蒸発させて粗油性生成物（１６ｇ）を入手した 。この粗生成物をエーテル（１００ｍｌ）中に溶解させ、形成した白色固体をろ 過 によって取り除いた。還元圧力下でろ液から溶媒を除去すると粘性の青色がかっ た黄色の油（８．３４ｇ、収率６８％）が得られ、これは最終的にはガラス様固 体を形成した。 実施例２：２−（トリフェニルメチルメルカプト）アセチルヒドラジンの合成 ２−（トリフェニルメチルメルカプト）酢酸（２０．３５ｇ、６０．９ｍｍｏ ｌ、１００ｍｏｌ％）を無水ＴＨＦ（１５０ｍｌ）中に溶解させ、氷水浴中で冷 却した。ｔ−ブチルカルバゼート（８．６１ｇ、６５．１ｍｍｏｌ、１０７ｍｏ ｌ％）を反応溶液に添加し、その後ジイソプロピルカルボジイミド（１０．０ｍ ｌ、６３．９ｍｍｏｌ、１０５ｍｏｌ％）を添加した。この反応液を緩徐に室温 まで加温し、２８時間攪拌した。反応混合液をろ過して形成した白色沈殿物を取 り除き、還元圧力下で溶媒を除去することによってろ液を白色泡となるまで濃縮 した。この物質をクロロホルム（７５ｍｌ）に溶解させた。その後酢酸（７５ｍ ｌ）を添加し、さらに酸フッ化ホウ素エーテレート（１０．０ｍｌ、８１ｍｍｏ ｌ、１３４ｍｏｌ％）を添加した。この反応液を室温で６時間攪拌し、その後酢 酸ナトリウム（３０ｇ）を含有している水（２００ｍｌ）中に反応混合液を注入 することによってクエンチした。この混合液をクロロホルム（２×１００ｍｌ） を用いて抽出した。有機相を結合し、飽和ＮａＣｌ（１５０ｍｌ）を用いて洗浄 し、Ｎａ₂Ｓｏ₄の上を通して乾燥させ、ろ化した。還元圧力下で溶媒を除去して 、青色がかった金色の油を入手したところ、放置すると固体化した。この固体を １：１ジエチルエーテル／ヘキサン（２００ｍｌ）中に懸濁させ、ろ化によって 収集した。その固体を追加量の１：１ジエチルエーテル／ヘキサン（１００ｍｌ ）を用いて洗浄して乾燥させると、ＥＳＭＳ ＭＨ⁺（計算値：３４９、実測値 ：３４９）を有する所望の生成物（１５．４４ｇ、収率７３％）を入手できた。 実施例３：Ｎβ−［２−（トリフェニルメチルチオ）アセチル］アザグリシン の合成 グリオキシル酸一水化物（Ｏ．５９ｇ、６．４１ｍｍｏｌ、１１０ｍｏｌ％） をメタノール（２０ml）中に溶解させ、２−（トリフェニルメチルメルカプト） アセチルヒドラジド（２．０３ｇ、５．８２ｍｍｏｌ、１００ｍｏｌ％）を添加 した。この濁った反応混合液にジオキサン（２０ｍｌ）を添加し、反応液を室温 で１８時間攪拌した。ホウ水素化ナトリウム（１．７６ｇ）をこの反応混合液に 添加し、３０分後、さらに異なる量のホウ水素化ナトリウム（０．６０ｇ）を添 加した。この反応液を室温で３時間撹拌し、その後反応混合液をＨＣｌ（１Ｍ、 ６０ｍｌ）内に注入することによってクエンチした。この混合液を酢酸エチル（ ２×５０ｍｌ）を用いて抽出した。有機相を結合し、飽和ＮａＣｌ（４０ｍｌ） を用いて洗浄し、Ｎａ₂Ｓｏ₄の上を通して乾燥させ、ろ化し、ロータリーエバポ レーター上で還元圧力下で濃縮し、ＥＳＭＳ ＭＨ⁺（計算値：４０７、実測値 ：４０７）を有する固体（２．５ｇ）を入手した。 実施例４：Ｎα−Ｂｏｃ−Ｎβ−［２−（トリフェニルメチルチオ）アセチル ］アザグリシン Ｎβ−［２−（トリフェニルメチルチオ）アセチル］アザグリシン（２．３９ ｇ、５．８９ｍｍｏｌ、１００ｍｏｌ％）をジオキサン（５０ｍｌ）中に溶解さ せた。この反応溶液に二炭酸ジ−ｔ−ブチル（ＢＯＣ）₂Ｏ（２．０７ｇ、９． ４８ｍｍｏｌ、１６１ｍｏｌ％）を添加し、さらにＮａ₂Ｃｏ₃（１Ｍ、１５ｍｌ ）を添加した。この混合液を室温で１５分間攪拌し、その後追加量のＮａ₂Ｃｏ₃ （１Ｍ、１０ｍｌ）及び（ＢＯＣ）₂Ｏ（１．４１ｇ）を添加した。この溶液を 室温で１８時間攪拌し、その後ＮａＯＨ（６Ｍ、３ｍｌ）及びＢＯＣ）₂Ｏ（１ ．４ｇ）と１時間反応させた。粗反応混合液をその後クエン酸（１Ｍ）を用いて ｐＨ３へ酸化させ、酢酸エチル（２００ｍｌ）を用いて抽出した。有機相を飽和 塩化ナトリウム溶液（６０ｍｌ）を用いて洗浄し、Ｎａ₂Ｓｏ₄の上を通して乾燥 させ、 ろ化し、還元圧力下で濃縮して粗生成物を入手した。この粗生成物をエーテル中 に溶解させ、ヘキサンを用いて希釈して１：１混合液を入手したところ、白色沈 殿物が形成された。白色個体をろ化によって収集し、ＥＳＭＳ ＭＨ⁺（計算値 ：５０７、実測値：５０７）を有する所望の生成物（１．４８ｇ、収率５０％） を入手した。 実施例５：２−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸の合成 ４−フェニル−３−チオセミカルバジド（６．０２ｇ、３６ｍｍｏｌ、１００ ｍｏｌ％）をメタノール（４Ｏｍｌ）中に懸濁させた。グリオキシル酸一水化物 （３．３２ｇ、３６．１ｍｍｏｌ、１００ｍｏｌ％）を添加し、反応液を室温で ２時間攪拌した。ホウ化水素ナトリウム（１．５０ｇ）を注意深く添加し、反応 混合液を極めて力強く泡立たせた。この反応混合液を室温で１時間攪拌し、その 後ＮａＢＨ₄（０．６６ｇ）を添加し、さらに氷酢酸（６ｍｌ）を添加した。１ ５分後、ＮａＢＨ₄（１．０８ｇ）を添加し、さらに反応液を室温で１５分間撹 拌した。その後追加量のＮａＢＨ₄（１．６６ｇ）を添加し、反応液を室温で３ 児間攪拌して、ＨＣｌ（１Ｍ、２００ｍｌ）を用いてクエンチした。この混合液 をその後酢酸エチル（２×１５０ｍｌ）を用いて抽出した。有機相を結合し、飽 和ＮａＣｌ（１００ｍｌ）を用いて洗浄し、Ｎａ₂Ｓｏ₄の上を通して乾燥させ、 ろ化し、還元圧力下で溶媒を除去してＥＳＭＳ陰イオンモード Ｍ−Ｈ⁺（計算 値：２２４、実測値：２２４）を有する黄色の固体（９．０３ｇ）を入手した。 実施例６：Ｎβ−Ｂｏｃ−２（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢 酸の合成 ２（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸（８．９３ｇ）３７．９ ｍｍｏｌ、１００ｍｏｌ％）及び（ＢＯＣ）₂Ｏ（９．１０ｇ）をジオキサン（ １００ｍｌ）中に溶解させた。炭酸ナトリウム（１Ｍ、５０ｍｌ）及び水（５０ ｍｌ）を添加し、その混合液を室温で５時間攪拌した。水酸化ナトリウム（１Ｍ 、 ４０ｍｌ）及び追加量の（ＢＯＣ）₂Ｏ（６．２１ｇ）を添加し、その反応液を 室温で一晩かけて攪拌した。その反応液をクエン酸（１Ｍ）を用いてクエンチし 、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）を用いて抽出した。有機相を結合し、飽和Ｎａ Ｃｌ（５０ｍｌ）を用いて洗浄し、Ｎａ₂Ｓｏ₄の上を通して乾燥させ、ろ化した 。ろ液を還元圧力下で濃縮してゴム状固体（１９ｇ）を入手した。この粗個体を エーテル中に懸濁させ、ろ化によって白色個体を収集した。この固体をエーテル （１００ｍｌ）を用いて洗浄し、ＥＳＭＳ ＭＨ⁺（計算値：３２６、実測値： ３２６）を有する所望の生成物（３．１７ｇ）を入手した。 実施例７：Ｎα−（トリフェニルメチルスルフェニル）−Ｎβ−（Ｂｏｃ）ア ザグリシンの合成 ｔ−ブチルカルバゼートをメタノールに溶解させたグリオキシル酸一水化物を 用いて凝縮させた。この粗ヒドラゾンをその後１０％Ｐｄ／Ｃ上での接触水素化 によって還元させた。この生成物をその後ジオキサン及び塩基と一緒に混合し、 塩化トリフェニルメタンスルフェニルのジオキサン溶液を滴下法で添加した。そ の結果、所望のＮα−（トリフェニルメチルスルフェニル）−Ｎβ−（Ｂｏｃ） アザグリシン（２５ｇ）を入手した。 実施例８：Ａｌｌｏｃ及びＦｍｏｃ保護基を使用したペプチド類の固相ペプチ ド合成 固相ペプチド合成法は３９６型と同一方法で窒素圧下で作動するように修正し たＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ ３４８型ペプチド合成機を使用して０ ．０５０ｍｍｏｌの規模で実施した。窒素保護のためにはアリルオキシカルボニ ル（ａｌｏｃ）及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を 使用し、結合のためにカルボキシル基を活性化させるためにジイソプロピルカル ボジイミド（ＤＩＣ）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を使用した 。Ｃ末端アミド基のためにはＲｉｎｋ、Ｐａｌ、及びＴｎｅｔａＧｅｌ Ｓ Ｒ ａ ｍ、Ｃ末端酸基のためにはＷａｎｇ、２−クロロトリチル、又はＴｅｎｔａＧｅ ｌ Ｓ ＰＨＢのような種々の樹脂を使用した。 金属結合キレート化部分を導入するため及び／又は選択的の保護を除去された アミノ酸側鎖による環化を可能にするために、個別に保護されたビス−アミノ酸 をペプチド合成に使用した。選択された個別に保護されたビス−アミノ酸誘導体 類は、α−Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（ε−Ｆｍｏｃ）ＯＨ及びα−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ ε−Ａｌｏｃ）ＯＨであった。α−Ａｌｏｃ−Ｌｙｓ（ε−Ｆｍｏｃ）ＯＨ誘導 体は、日常のＦｍｏｃ法を使用して側鎖上に配位子片を導入することを可能にし た。 ａｌｏｃ基をジクロロメタン（３×２ｍｌ分別）を用いて樹脂結合ペプチドを 洗浄することによって手動モードで機械上で開裂させ、その後テトラキストリフ ェニルホスフィンパラジウム［０］（１０ｍｇ）を含有する溶液（２ｍｌ）及び 酢酸（０．１ｍｌ）と一緒に樹脂を混合した。その後塩化トリブチルスズ（０． ３ｍｌ）を添加し、混合液を１時間ボルテックスミキサーにかけた。その後反応 セルを空にし、樹脂をジクロロメタン（３×２ｍｌ）を用いて洗浄し、その後標 準Ｆｍｏｃ合成を再開した。２３：３：１の割合のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ） 、アニソール及びエタンジチオール溶液を用いて１〜３時間かけてペプチドを樹 脂から開裂させた。粗開裂混合液をその後エーテル内に注入して粗ペプチドを沈 殿させ、これを適切な勾配の水に溶解させたＴＦＡ（０．１％）及び／又はアセ トニトリル（９０％）及び水（１０％）に溶解させたＴＦＡ（０．１％）を用い て溶出するWaters Delta Pak，Prep Pak C-18カートリッジシステムを使用する 逆相ＨＰＬＣによって精製した。所望の精製ペプチド類を含有するフラクション を収集し、還元圧力下で揮発性溶媒を除去してペプチドの水溶液を入手し、これ をその後凍結乾燥した。その後凍結乾燥性生物のサンプルを生成物の実測質量が 所望のペプチドの計算値と一致していることを確認するためにエレクトロスプレ ー （electrospray）質量分析法（ＥＳＭＳ）又は高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ ＭＳ）を受けさせるために送付した。 下記の表は上記の方法によって合成されたペプチド配列の一部を示している。 ^a ＨＰＬＣ法［保持時間：分］溶媒Ａは水に溶解させた０．１％トリフルオロ 酢酸、溶媒Ｂは９０：１０アセトニトリル／水に溶解させた０．１％トリフルオ ロ酢酸である。溶媒流速は、１０分間は３ｍｌ／分、その後５分間は５ｍｌ／分 である。勾配は、１０分間は０〜１００％Ｂ、その後５分間は１００％Ｂである 。^b エレクトロスプレー質量分析法による数値（ＭＨ⁺）。^c 下線の引かれた配列は、側鎖官能基を連結する環状アミドとして環化されて いる。 表の中で使用された略語の意味： ＜Ｇ：ピログルタミン酸 ＰｔｓｃＧｃ：２−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸もしく はＰｈＮＨＣＳＮＨＮＨＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ Ｍａ：メルカプト酢酸 ａｚａＧ：アザグリシンもしくはＨ₂ＮＮＨＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ Ｄａｐ：２，３−ジアミノプロピオン酸 γＡｂｕ：γ−アミノブチル酸 Ｎａｌ：２−ナフチルアラニン Ｃｐａ：４−クロロフェニルアラニン Ｋ_d：下付き文字ｄは、Ｄ異性体が使用されたことを意味している。 Ｋ（ＭａＧＣ）：括弧は封入されたアミノ酸類がリシンのεアミンへ付着させ られており、付着した第１アミノ酸が、その後にＧが続いてＭａで終わるＣであ ることを意味している。 ｉＤ：イソアスパラギン酸 ｉＥ：イソグルタミン酸 これらの方法で合成されるその他のペプチドには下記のようなものがが含まれ る。 配列の下線の引かれた部分は環状である。 ＴｓｃＧは、３−チオセミカルバゾニルグリオキシル、つまりＨ₂ＮＣＳＮＨ ＮＣＨＣＯ−である。 ＭｔｓｃＧは、４−メチル−３−チオセミカルバゾニルグリオキシル、つまり ＣＨ₃ＮＨＣＳＮＨＣＨＣＯ−である。 Ｍａは、メルカプトアセチル：ＨＳＣＨ₂ＣＯ−である。 括弧内に挙げられている基は、括弧の左のアミノ酸側鎖に付着させられている 。 実施例９：キレート化部分を含有している環状ＭＳＨ類似化合物の調製 環状ペプチド類を合成する方法を、ホルモン（αＭＳＨ）類似化合物ＭＡＧＣ γ−ＡｂｕＮｌｅＤＨＦ_dＲＷＫ−ＮＨ₂を刺激する環状α−メラノサイトを調製 することによって証明したが、下線の引かれた部分はペプチド配列がアスパラギ ン酸及びリシン側鎖を通してラクタムとして環化されていることを意味している 。環化のために使用される残基類はａｌｏｃ基（リシンのため）及びアリルエス テル（アスパラギン酸塩のため）として側鎖を保護した。ペプチドは上記のよう にポリスチレンをベースとするＲｉｎｋアミド樹脂上でＦｍｏｃ化学を使用して 構築した。 アリル及びａｌｏｃの保護除去は、まず最初にアリルスカベンジャーとしての ピペリジンの不在下でＰｄ（ＰＰｈ₃）₄、酢酸及びＢｕ₃ＳｎＨを用いて実施し た。側鎖保護基の開裂後、樹脂を洗浄し、部分的に保護されたペプチドをFelix ら，Int．J．Peptide Protein Res．32巻：441頁（1988年）に記載された方法を 使用して環化させた。その後ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して混合生成物 からの唯一の清潔なペプチドとしてＮ−アリル置換環状アミドを単離した。 ａｌｏｃ開裂反応をその後アリルスカベンジャーとしてのピペリジンの添加に よって修正した。 ａｌｏｃ及びアリル基の開裂には、０．５ｍｌの氷酢酸、１０ｍｌのジクロロ メタン、０．０５６３ｇのテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ ０）に加えてアリルスカベンジャーとして１．０ｍｌのピペリジンを使用した。 ペプチド合成機上の各ウェルはＲｉｎｋ樹脂上に０．０５ｍｍｏｌのペプチドを 含有しており、これを室温で１時間、ボルテックスミキサーにかけながら０．３ ｍｌ／ウェルの水素化トリブチルスズを用いて処理した。側鎖保護基の開裂後、 樹脂を２×２ｍｌ／ウェルのジクロロメタン、２×１ｍｌ／ウェルのメタノール 、２×１ｍｌ／のジイソプロピルエチルアミン及び３×１ｍｌ／ウェルのＮＭＰ を用いて洗浄した。その後ペプチド側鎖を上記のＦｅｌｉｘの方法によって結合 させた（ＢＯＰ及びＤＩＥＡを用いて１５時間）。ペプチドを開裂させ、上記の 通りに精製して所望の１３０２のＥＳＭＳ ＭＨ＋を有する純粋ペプチドを入手 した。Ｎ−アリル化副生成物は痕跡量しか所見されなかった。 実施例１０：^99mＴｃを用いた放射標識化 ^99mＴｃ−グルセプタート錯体を形成するために、Ｇｌｕｃｏｓｃａｎ（Ｄｕ ｐｏｎｔ社製）バィアルを１ｍｌの生理食塩水に溶解させた２．１８ｍＣｉのＮ ａＴｃＯ₄を用いて復元した。＜ＧＨＷＳＹＫ（ＭａＧＣ）ＬＲＰＧアミド（Ｉ ＭＰ３）は上記の通りに調製した。^99mＴｃ−ＩＭＰ３は、３６０μｌ（８７４ μＣｉ）の^99mＴｃ−グルセプタートを生理食塩水に溶解させた６４０μｌのペ プチドと一緒に混合することによって調製した。最初に形成された沈殿物は７５ ℃で１５分間加熱すると消失した。Ｈ₂Ｏ：ＥｔｏＨ：ＮＨ₄ＯＨ混合液（５：２ ：１）において展開させたインスタントＴＬＣ（ＩＴＬＣ）ストリップは、コロ イドとしての起源時の６．２％の活性を示した。ＨＰＬＣは、６．９５分間のＲ Ｔ（保持時間）を用いてペプチドへ結合した１００％の活性を示したが、他方非 標識ペプチドは同−ＨＰＬＣ条件下（逆相Ｃ−１８カラム、流速３ｍｌ／分での １０分間における０〜１００％の勾配）で６．４分間で溶出された。ＨＰＬＣカ ラムからの回収は注入された活性の８５％であった。 ^99mＴｃ標識化のためにＩＭＰ３を下記に示す量で作製して凍結乾燥した： IMP3( μｇ) Sn( μｇ) αDG/Sn 1. 250 23 14 2. 100 23 14 3. 250 15 14 ここで、αＤＧはα−Ｄ−グルコヘプトネートである。凍結乾燥バイアルは生 理食塩水中に溶解させた−９００μμＣｉのＮａＴｃＯ₄を用いて復元した。全 バイアル中で混濁が観察された。これらのバイアルを７５℃で１５分間加熱した が、混濁は持続した。コロイドについてのＩＴＬＣ分析は、バイアル１、２及び ３各々について起源時の１４、２１及び９％のコロイド活性を証明した。 ^99mＴｃ標識化中の沈殿析出を防止するために、凍結乾燥バイアル中のＳｎ（ Ｉ Ｉ）に対するα−Ｄ−グルコヘプトネート（αＤＧ）及び酒石酸塩の比率を変更 した。下記に示す比率の酒石酸塩及びαＤＧ比を有する下記のバイアルを作製し 、凍結乾燥した（２５μｇのＳｎ（ＩＩ）を含む２５０μｇのＩＭＰ３）。これ らのバイアルを１ｍｌの生理食塩水に溶解させた−５００μＣｉのＮａＴｃＯ₄ を用いて復元した。観察カラムに観察値が示される。７５℃で１５分間加熱した 後で、室温で１５分後にＩＴＬＣストリップを展開させた。 酒石酸塩／Ｓｎ ｐＨ 観察所見 コロイド,RTコロイド、75℃ １． 50 5.3 沈殿 ２． 100 5.3 沈殿 ３． 500 5.3 沈殿、混合すると透明 17% 2.4% αＤＧ／Ｓｎ ｐＨ 観察所見 コロイド,RTコロイド、75℃ ４． 25 5.3 沈殿 ５． 50 5.3 沈殿 ６． 100 5.3 混濁 ７． 500 5.3 わずかに混濁 25% 3.5% ８． 1000 5.3 透明 3.3% 3.1% 上記のプロトコルをバイアル３、７及び８について繰り返し、７５℃で１５分間 加熱後にはコロイド活性が各々５．３、３．８及び４．６％であると測定された 。逆相ＨＰＬＣカラム上で７分間のＲＴで単一広域ピークが観察された。 生理食塩水単独には溶解性の不良なペプチド類の溶解度はエタノール又は２− ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのような溶解剤の添加によって上 昇する。 テクネチウム９９を用いての他のペプチド類の標識化からの結果は下記の表に 示されている。 表中で使用された略語は上記の実施例８と同一である。室温での標識化によっ て形成された錯体と加熱によって形成された錯体のＨＰＬＣ保持時間の変化は、 金属の結合における変化を意味している。 ^a 室温で１５分間の反応（保持時間：分）。 ^b 沸騰水中での１５分間の加熱後。 ^c 加熱後にピーク形状及び保持時間において有意な変化 ^d ピーク形状及び保持時間に変化なし。有意差なし。 ^e 多数のピーク。 また別の標識化法において、過テクネチウム酸塩を添加する前に標識化キット 内にペプチドの希釈液（３０μ／ｍｌ）を作製した。最終溶液は総量１．５ｍｌ 中にペプチド、１０％ヒドロキシプロピノレβシクロデキストリン（ＨＰＣＤ） 、２００ｍＭグルコヘプトネート２１ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．３）、２ｍｇ の ２００ｍＭグルコヘプトネート２１ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．３）、２ｍｇの アスコルビン酸及び１００ｐｇの塩化第一スズを含有していた。他のフォーミュ レーションでは、１５％ＨＰＣＤ、２００ｍＭグルコヘプトネート、及び２１ｍ Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．６）を含有する緩衝液中にペプチドに比較して２等量 のスズイオンを添加した。 実施例１１：ＩＭＰ−３¹⁸⁸Ｒｅの放射標識化 ＩＭＰ３（＜ＧＨＷＳＹＫ（ＭａＧＣ）ＬＲＰＧアミド）を上記の通りに合成 した。ＩＭＰ３は、ＡがＨ₂Ｏ中の０．１％ＴＦＡであり、Ｂが９０％ＣＨ３Ｃ Ｎ、０．１％ＴＦＡであるときに、流速３ｍｌ／分、１０分での０〜１００％Ｂ の勾配を使用する逆相Ｃ−１８カラム上で６．４分の保持時間を有している。 ＩＭＰ３を１ｍｇ及び２５０μｇの量で４５０μｇのＳｎ（ＩＩ）及びα−Ｄ −グルコヘプトネートと１：１７．５の比で作製して凍結乾燥した。ＩＭＰ３（ １ｍｇ及び２５０μｇ）の凍結乾燥させたバイアルを生理食塩水に溶解させた６ １７及び５７８μＣｉのＮａＲｅＯ４を用いて復元した。これらのバイアルを７ ５℃で１５分間加熱した。上記の条件下でのＨＰＬＣ分析は、どちらのバイアル についても７．０分の保持時間で単一ピークを示した。溶離液を収集し、γ計数 器上で計数した。１ｍｇバイアルについては、活性の回収率は８８％であったが 、２５０μｇのバイアルについての回収率は７７％であった。Ｈ₂Ｏ：ＥｔＯＨ ：ＮＨ₄ＯＨ（５：２：１）上で展開させたＩＴＬＣストリップ上のコロイド分 析は、１ｍｇ及び２５０μｇのバイアル各々に付いて起源時の活性の１．４及び １．２％を示した。 室温での¹⁸⁸Ｒｅの標識化は７５℃におけるようには良好に進行しなかった。 室温ではペプチド内にはほんの数パーセントの活性（５％）しか組み込まれず、 残りの活性は空のカラムに溶離した（１．２分）。 実施例１２：インビトロレセプター結合アッセイ 放射性金属標識ＬＨＲＨ類似化合物を試験するために、ヒト乳腺癌細胞系ＭＣ Ｆ−７、ＳＫ−ＢＲ−３、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使用した。標識ＶＩＰ類 似化合物を試験するためにはＨＴ２９細胞を使用した。全細胞系はAmerican Typ e Culture Collection，Rockville，MDから購入した。細胞は５％胎児ウシ血清 、５％定義ウマ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１ ００μｇ／ｍｌ）、及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補給したＤＭＥＭ中で増殖 させた。細胞は日常的にトリプシン及び０．２％ＥＤＴＡを用いて剥離した後に 継代接種した。 非標識ＬＨＲＨ類似ペプチド類の特異性は競合的細胞結合アッセイによって測 定する。標的細胞は新鮮培地を用いて洗浄し、５×１０⁵ｃｅｌｌ／ｍｌとなる ように調整する。９６ウェルマイクロタイタープレート上の１ウェル毎に１００ μｌの細胞懸濁液（１００μｌ）を添加する。細胞を付着させ、その後¹²⁵Ｉ− ＬＨＲＨ（Amersham Life Science，Arlington Heights，IL，2,000Ci/mmol）の 存在下で相違する濃度のペプチド類を用いて処理する。攪拌しながら室温での２ 時間の培養後、細胞を２回洗浄し、細胞に結び付いている放射能を計数し、標識 ＬＨ−ＲＨの結合へ５０％阻害を惹起するペプチドの濃度を比較する。 受容体結合定数を決定するために、放射標識ＬＨＲＨの連続希釈液を９６ウェ ルプレート内の５×１０⁵ｃｅｌｌｓを用いて培養する。特異的に結合したペプ チドを測定できるように、すべてのアッセイは高濃度の非標識ＬＨＲＨを添加し て、又は添加せずに３回ずつ実施する。室温での２時間の培養後、細胞を洗浄し て計数する。平衡関連定数Ｋ_a及び１ｃｅｌｌ毎の受容体部位総数をＳｃａｔｃ ｈａｒｄ分析法によって測定する。 ＶＩＰ類似化合物及びそれらの金属錯体を試験するためにはVirgoliniら，Can cer Res．54巻：690頁（1994年）によって報告されているプロトコルを使用する 。手短に述べると、１２５１ ＶＩＰを結合緩衝溶液中に溶解させた被験ペプチ ド とペプチドの濃度を上昇させながら混合し、その後に各溶液を４８ウェル培養プ レート中のＨＴ２９細胞へ添加する。各濃度は３回ずつ試験する。細胞を４℃で ２時間培養し、その後氷温結合緩衝液を用いて３回洗浄する。これらの細胞をそ の後５分間かけて２Ｍ ＮａＯＨを用いて溶解させ、ウェル内の液体を綿棒で取 り除く。綿棒上の活性はガンマ計数器を用いて計数する。 本発明について上記の代表的実施態様を参照しながら広範囲に開示かつ例示し てきた。当業者であれば本発明の精神及び範囲から逸脱せずに本発明に様々な変 更を加えることが可能であることを認識するであろう。放射性金属結合ペプチド 類に関する主題はさらに、引用することによりその開示の全体が本明細書に組み 入れられている同時系属出願の米国特許出願第０８／４７４，５５５号にも記載 されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．放射性金属元素結合部分を含むペプチドにおいて、該結合部分が、次の構 造式： を含み、ここで、Ｒ¹、Ｒ²、またはＲ³の少なくとも一つがＨであることを条件 として、Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³が、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキ ル基、シクロアルキル基、置換されたシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル 基、アリール基、置換されたアリール基、ヘテロアリール基、置換されたヘテロ アリール基、アルカリル基、および、ペプチド合成条件下で除去することができ る保護基からなる群より独立に選択され、 Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、およびＲ¹⁰が、Ｈ、低級アルキル基、置換さ れた低級アルキル基、アリール基、および置換されたアリール基からなる群より 独立に選択されるか、または、選択的には、Ｒ⁴とＲ⁶が、直接的な結合を形成し 、また、Ｒ⁸とＲ⁹が一緒に、またはＲ⁷とＲ⁹が一緒に、シクロアルキル環、また は置換されたシクロアルキル環を形成することができ、また、 ＮＲ¹⁰が、該ペプチドのＮ末端に位置するか、または、該ペプチドのアミノ酸 側鎖の上に存在しているペプチド。 ２．Ｒ¹がＨである、請求項１記載のペプチド。 ３．Ｒ³がＨである、請求項１記載のペプチド。 ４．Ｒ⁴がＨである、請求項１記載のペプチド。 ５．Ｒ⁴とＲ⁶が、一緒に直接的な結合を形成する、請求項１記載のペプチド。 ６．Ｒ⁵がＨである、請求項５記載のペプチド。 ７．ＮＲ¹⁰が、該ペプチドのＮ末端に位置している、請求項１記載のペプチド 。 ８．ＮＲ¹⁰が、該ペプチドのアミノ酸側鎖上に存在している、請求項１記載の ペプチド。 ９．Ｒ²が、低級アルキル基、または置換された、もしくは非置換のフェニル 基である、請求項２記載のペプチド。 １０．Ｒ²がＨである、請求項９記載のペプチド。 １１．Ｒ³がＨである、請求項１０記載のペプチド。 １２．Ｒ⁴とＲ⁶が、一緒に直接的な結合を形成する、請求項１１記載のペプチ ド。 １３．Ｒ³がＨである、請求項１２記載のペプチド。 １４．Ｒ⁷、Ｒ⁸、およびＲ⁹のそれぞれがＨである、請求項13記載のぺプチド 。 １５．Ｒ²がフェニル基である、請求項１４記載のペプチド。 １６．Ｒ²がメチル基である、請求項１４記載のペプチド。 １７．Ｒ⁸およびＲ⁹がメチル基である、請求項１記載のペプチド。 １８．さらに、結合した金属元素を含む、請求項１記載のペプチド。 １９．該金属元素が、^99mＴｃ、¹⁸⁶Ｒｅ、および¹⁸⁸Ｒｅからなる群より選択 される、請求項１８記載のペプチド。 ２０．金属元素をキレートする組成物を調製する方法において、放射性金属元 素結合部分を含むペプチド溶液をスズイオンと接触させ、該結合部分が、構造式 を含み、ここで、Ｒ¹、Ｒ²、またはＲ³の少なくとも一つがＨであることを条件 として、Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³が、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキ ル基、シクロアルキル基、置換されたシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル 基、アリール基、置換されたアリール基、ヘテロアリール基、置換されたヘテロ アリール基、アルカリル基、および、ペプチド合成条件下で除去することができ る保護基からなる群より独立に選択され、 Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、およびＲ¹⁰が、Ｈ、低級アルキル基、置換さ れた低級アルキル基、アリール基、および置換されたアリール基からなる群より 独立に選択されるか、または、選択的には、Ｒ⁴とＲ⁶が、直接的な結合を形成し 、また、Ｒ⁸とＲ⁹が一緒に、またはＲ⁷とＲ⁹が一緒に、シクロアルキル環、また は置換されたシクロアルキル環を形成することができ、また、 ＮＲ¹⁰が、該ペプチドのＮ末端に位置するか、または、該ペプチドのアミノ酸 側鎖の上に存在しており、 さらに、該溶液を、放射性核種に接触させて、放射性標識されたペプチドを回 収する方法。 ２１．該金属元素が、^99mＴｃ、¹⁸⁶Ｒｅ、および¹⁸⁸Ｒｅからなる群より選択 される、請求項２０記載の方法。 ２２．腫瘍、感染性病変、心筋梗塞、血栓、アテローム硬化斑、または正常な 器官もしくは組織を画像化する方法において、放射性標識されたペプチドを、薬 学的に許容できる担体とともに、人間の患者に投与し、該放射性標識ペプチドが 局在して、非標的のバックグランドがきれいになるのに十分な時間を置いてから 、該放射性標識ペプチドが付着した部位を、外部にある画像化カメラによって検 出し、 該放射性標識ペプチドが、スズイオンをもつペプチド溶液と接触させることに よって調製され、該ペプチドが、構造式 を含む放射性金属元素結合部分を含み、ここで、Ｒ¹、Ｒ²、またはＲ³の少なく とも一つがＨであれば、Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³が、Ｈ、低級アルキル基、置換さ れた低級アルキル基、シクロアルキル基、置換されたシクロアルキル基、ヘテロ シクロアルキル基、アリール基、置換されたアリール基、ヘテロアリール基、置 換されたヘテロアリール基、アルカリル基、および、ペプチド合成条件下では除 去することができる保護基からなる群より独立に選択され、 Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、およびＲ¹⁰が、Ｈ、低級アルキル基、置換さ れた低級アルキル基、アリール基、および置換されたアリール基からなる群より 独立に選択されるか、または、選択的には、Ｒ⁴とＲ⁶が、直接的な結合を形成し 、また、Ｒ⁸とＲ⁹が一緒に、またはＲ⁷とＲ⁹が一緒に、シクロアルキル環、また は置換されたシクロアルキル環を形成することができ、また、 ＮＲ¹⁰が、該ペプチドのＮ末端に位置するか、または、該ペプチドのアミノ酸 側鎖の上に存在しており、 さらに、該溶液を、放射性核種に接触させて、放射性標識されたペプチドを回 収する方法。 ２３．該ペプチドが、 (Che1)γAbuNleDHF_dRWK-NH₂、 (Che1)γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂、 KPRRPYTDNYTRLRK(Che1)QMAVKKYLNSILN-NH₂、 (Che1)γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂、 (Che1)γAbuYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂、 HSDAVFTDNYTRLRK(Che1)QMAVKKYLNSILN-NH₂、 <GHWSYK(Che1)LRPG-NH₂、<GHYSLK(Che1)WKPG-NH₂、 AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、 (Che1)γAbuSYSNleDHF_dRWK-NH₂、(Che1)γAbuNleDHF_dRWK-NH₂、 (Che1)NleDHF_dRWK-NH₂、 Ac-HSDAVFTENYTKLRK(Che1)QNleAAKKYLNDLKKGGT-NH₂、 (Che1)γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂、 (Che1)γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH₂、 (Che1)γAbuNleDHF_dRWK-NH₂ ^c、<GHWSYK(Che1)LRPG-NH₂、 <GHYSLK(Che1)WKPG-NH₂、AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、 <GHYSLK(Che1)WKPG-NH₂、<GHYSLK(Che1)WKPG-NH₂、 Nal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)WKPG-NH₂、<GHWSYK_d(Che1)LRPG-NH₂、 AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、 AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、 AcNal_dCpa_dW_dSRK_d(Che1)LRPA_d-NH₂、<GHWSYK(Che1)LRPG-NH₂、 AcK(Che1)F_d CFW_dKTCT-OH、AcK(Che1)DF_d CFW_dKTCT-OH、 AcK(Che1)F_d CFW_dKTCT-ol、AcK(Che1)DF_d CFW_dKTCT-ol、 (Che1)DF_d CFW_dKTCT-OH、K(Che1)DF_d CFW_dKTCT-ol、 K(Che1)KKF_d CFW_dKTCT-ol、K(Che1)KDF_d CFW_dKTCT-OH、 K(Che1)DSF_d CFW_dKTCT-OH、K(Che1)DF_d CFW_dKTCT-OH、 K(Che1)DF_d CFW_dKTCD-NH₂、K(Che1)DF_d CFW_dKTCT-NH₂、 K(Che1)KDF_d CFW_dKTCT-NHNH₂、AcK(Che1)F_d CFW_dKTCT-NHNH₂、 K(Che1)F_d CFW_dKTCT-ol、およびF_d CFW_dKTCTK(Che1)-NH₂、 からなる群より選択され、ここで、（Ｃｈｅ１）が、該放射性金属元素結合部分 である、請求項１記載のペプチド。