JP2000515541A

JP2000515541A - 殺虫性細菌

Info

Publication number: JP2000515541A
Application number: JP10507765A
Authority: JP
Inventors: ラグニ，アドリアノ; バレンテイニ，フエデリコ; フリドレンダー，ベルトルド
Original assignee: バイオ・インテグレイテイド・テクノロジー・エス・アール・エル
Priority date: 1996-08-06
Filing date: 1997-07-21
Publication date: 2000-11-21
Also published as: AU3556097A; EP0823215A1; EP0923294A1; CA2262557A1; WO1998005212A1

Abstract

(57)【要約】種ホトラブダス・ルミネッセンス（Photorhabdus lumin escens）に属する新規な細菌が提供されるが、この細菌は、線虫感染ベクターによって運ばれるこれらの細菌に依存しない殺虫活性を保持している。生または不活化Ｐ．ルミネッセンス細胞、ならびにそのような細胞の断片および殺虫性Ｐ．ルミネッセンス細菌の培養物の上澄液が、本発明によって、植物の昆虫侵襲を処置するための殺虫剤として使用される。

Description

【発明の詳細な説明】殺虫性細菌発明の分野本発明は、一般に、殺虫剤の分野にあり、そして作物の昆虫による侵襲（ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ）を防除するための調製物および方法に関する。より具体的には、本発明は、有効成分が、殺虫性細菌、細菌の死細胞もしくはその成分であるような調製物および方法を提供する。さらに、本発明は、殺虫活性を保持する新規な細菌に関する。発明の背景昆虫による作物の侵襲は、作物収量の低下の主要原因である。化学殺虫剤が、そのような侵襲を防除するために、数十年間、使用されてきたけれども、今日では、そのような化学薬品の使用に関連する環境上の危険性のために、生物学的な防除手段へと移行する傾向が増大しつつある。種ホトラブダス（Photorhabdus）の細菌は、それらの昆虫宿主を殺傷する効果をもつ感染を伴う、昆虫への感染能を有している。ホトラブダス細菌は、線虫類によって保持され、そしてそれらの感染生活環は、感染ベクターとしての線虫類の使用を必要とする。事実、ホトラブダス感染は、線虫宿主に依存することが、当該技術分野で信じられてきた。したがって、殺虫剤としてホトラブダスを保持する線虫類を使用することが示唆された（Bedding，R.A．and Miller，L.A．Env ．Entomol．10:449-453，1981）。発明の概要本発明によれば、驚くべきことに、従来信じられてきたこととは反対に、ある種のホトラブダス・ルミネッセンス（Photorhabdus luminesce ns ）（Ｐ．ルミネッセンス；また、キセノラブダス・ルミネッセンス（Xenorhab dus luminescens ）として知られている）細菌は、感染ベクターとして線虫キャリヤーに依存することなく、昆虫に感染する能力をもっていることが見い出された。本発明によって、数種の新規Ｐ．ルミネッセンス菌株が単離され、純粋形態で得られ、そして殺虫剤として著しく効果があることが分かった。そのような細菌は、時々、本明細書で「殺虫性細菌」として言及されるが、それらは、農業または園芸において作物の昆虫侵襲を防除するために使用できるであろう。さらに、本発明によって、殺虫活性は、また、少なくとも部分的には、不活化された細菌細胞によっても保持される、すなわち、殺虫活性は、必ずしも、殺虫性細菌の生存には依存しないことが見い出された。なお、さらに、少なくともある一定の殺虫活性は、また、破壊された不活化殺虫性細菌によって、ならびに殺虫性細菌の培養物から得られる上澄液によっても発現されることが見い出された。上澄液中の有効成分は、プロテアーゼに曝露された後の活性の損失または部分的損失によって証明されるように、タンパク質またはタンパク質性物質であろう。かくして、本発明は、その態様の１つでは、ｉ．殺虫活性が感染ベクターとして線虫を必要とせずに発現される、種ホトラブダス・ルミネッセンスに属する殺虫活性をもつ細菌； ii．不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞； iii．不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞の断片；および iv．Ｐ．ルミネッセンス細胞の培養物の上澄液、その殺虫活性を保持している画分、または該細胞から得られる殺虫性のある活性物質からなる群から選ばれる有効成分の殺虫性のある有効量を含んでなる、殺虫性組成物を提供する。本発明の文脈上、殺虫活性をもつ細菌は、昆虫に感染し、そしてその死、その成長の阻害、その運動性への影響などを引き起こすことができる細菌を指すために使用される。そのような殺虫活性の最終結果は、植物または作物の昆虫による侵襲という阻害に対する軽減である。本発明の殺虫性細菌は、殺虫活性が、また、線虫ベクターなしにそれだけで適用されても発現されるという点で独特である。また、本発明によって、該有効成分の有効量を、植物、またはそれらの環境に投与することを含む、植物の昆虫侵襲の処置のための方法が提供される。本発明の文脈上、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、急性の侵襲の処置、ならびにそれが発生する前に昆虫侵襲を予防することを意図する処置の両方を包含すると理解されねばならない。細菌は、植物の地上部分ならびにその地面のいずれにも、また両方に投与することができる。投与は、噴霧によって、灌水をとおしての組成物の送達によって、ならびに乾燥粒子もしくは粉末形態における組成物の投与によって行われる。組成物は、該有効成分だけでも、また他の殺虫性微生物または化学殺虫剤のような１種以上の付加的殺虫剤との組み合わせでも、両場合とも適切なキャリヤーとともに含有することができる。そのようなキャリヤーは、技術上既知のどんなものでも、例えば、天然または再生無機物質、賦形剤、分散剤、湿潤剤、増粘剤、結合剤もしくは肥料でもよい。また、本発明は、さらなるその態様では、種Ｐ．ルミネッセンスの新規な殺虫性細菌の純粋培養物を提供する。特に好適なものは、ここで「ＸＰ０１」と名付けられた、本発明により純化された新菌株に属する細菌である。ＸＰ０１菌株は、１９９６年７月２３日、ＣＮＣＭ受理番号Ｉ−１７６１として、the Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ），I nstitut Pasteur，25，rue du Dr．Roux，Pa 保持するＰ．ルミネッセンスの他の菌株もまた、本発明により使用することができると考えられるであろう。処置のためには、該有効成分の有効量が、植物、植物の部分の上に適用されるか、または植物の環境中、特に土壌中に導入される。有効量は、大部分の昆虫の死を惹起するのに十分な該有効成分の量、昆虫の活性レベルを低下するのに有効な量、昆虫の平均体重を減退するのに有効な量、昆虫の全体量を減退するのに有効な量などと理解されるべきである。該有効成分が、昆虫による侵襲の予防のために使用される場合は、その有効量は、植物または植物作物に対して損害を与えるであろう集団を形成する昆虫類の発生を阻止するのに有効である量であろう。該有効成分は、多くの投与方式において急性または予防的処置のいずれにおいて適用されてもよい。例えば、該有効成分は、灌水と混合され、かくして、灌水をとおして植物の地上部分または土壌のいずれにも（灌水形式に応じて）適用できる。その他の例は、該有効成分を含有する液状製剤が、特に地上の植物部分に、例えば慣用の噴霧器を用いて噴霧されてもよい。その他の例は、該有効成分が、植え付け後の植物の昆虫の侵襲を予防する目的で、土壌、例えばポットの土壌と混合されてもよい。さらなる例では、植物の部分、特に種子が、該有効成分を含有する溶液で含浸される。また、有効成分は、作物の収穫後の保護のために使用することができるが、それは、収穫前でも後でも、有効成分により作物を噴霧するか、または含浸することによって達成できる。当業者によって評価されるように、該有効成分の処置法は、防除されるべき昆虫の種類、処置されるべき植物の性質、細菌を含有する組成物の適用方法などに応じて変わるであろう。ある場合には、単回処置で、十分であろうし、一方、他の場合には、寄生された植物は、ある期間中、組成物の反復適用によって処置される必要があるであろう。また、処置中の投与される有効成分の用量は、上記および他のファクターに応じて変わるであろう。本発明の細菌は、殺虫性細菌を保持している線虫とともにインキュベートされた昆虫の幼虫の死骸から分離することによって得ることができる。幼虫の死骸から得られた血リンパが、細菌コロニーが増殖する適切な培地で培養され、次いで、単一細菌コロニーが、選択され、そして純化される。殺虫性細菌は、種々な時間の間、適切な増殖培地における発酵によって大量に得るために培養される。発酵後収穫され、大量の選択された細菌を含有している発酵ブロスは、以後、「発酵物」と呼ばれるであろう。該活性薬剤は、特に鱗翅類、例えばマメストラ・ブラッシカエ（Mamestra bra ssicae ）、スポドプテラ・リットラリス（Spodoptera littoralis）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Helicoverpa armigera）、アグロチス・イプシロン（Agroti s ipsilon ）、スコチア・セゲタム（Scotia segetum）およびロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）に対して効果的であることが分かった。本発明は、さらに、次に示す実施例および付属の図面において記述される若干の特定の実施態様によって、具体的に説明されるであろう。図面の説明付加された図面において示される図は、Ｐ．ルミネッセンスＸＰ０１細菌の種々の希釈液から得られた異なる調製物の殺虫活性が試験された、実験の結果のグラフ表示である。試験された効果は、調製物の投与後５日目に、５日齢のマメストラ・ブラッシカエ幼虫の体重変化であった（最初の幼虫の体重は、平均６．３３ｍｇ）。調製物が得られたＰ．ルミネッセンス発酵物は、１９時間培養物であった。種々のサンプルが次のように試験された：サンプルＡ１９：塩基性リンゲル液（ｐＨ９）において３回洗浄されたＸＰ０１発酵物からの細胞；サンプルＢ１９：酸性リンゲル液（ｐＨ５）において３回洗浄されたＸＰ０１発酵物からの細胞；サンプルＣ１９：中性リンゲル液（ｐＨ７）において３回洗浄されたＸＰ０１発酵物からの細胞；サンプルＤ１９：２２ミクロンのフィルターにより濾過されたＸＰ０１発酵物の上澄液；サンプルＥ１９：無処理の全ＸＰ０１培養物。サンプルＦ１９：２５℃で１９時間インキュベートされたＸＰ０１細胞を含まないＲ５培地。実施例以下の一定の実施例では、種々の昆虫類に対する殺虫活性は、試験された調製物とともにインキュベートされた新生幼虫の死滅率スコア（％）を測定することによって決定された。処理された幼虫のスコアされた死滅率は、次のようなＡｂｂｏｔｔの式を用いて、無処置の対照幼虫の死滅率を考慮して捕正された。例１ホトラブダス・ルミネッセンスＸＰ０１のＸＰ０１菌株を、次のようにガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）の幼虫から分離した：ｉ．Ｇ．メロネラの最終齢幼虫１０匹を、湿った濾紙をおいたペトリ皿内に入れ、ヘテロラブヂチス・ベクテリオホラ（Heterorhabditis bacteriophora）株のＤａｕｅｒＪｕｖｅｎｉｌｅｓ約１５００を添加した。次いで、幼虫と線虫を含有しているペトリ皿を、２５℃の暗所でインキュベートした。 ii．昆虫の死の直後（インキュベーション約２日後）、死骸を、７０％メタノールを入れたペトリ皿で、５分間洗浄し、次いで、滅菌脱塩水中で洗った。 iii.各昆虫の死骸を、鋏と針を用いて開いた。各死骸からの血リンパの１滴を栄養寒天平板上に滅菌ループを用いて塗布した。 iv．栄養寒天平板を、暗所で２５℃４８時間培養した。増殖したコロニーの形態学的観察の後、単一のＰ．ルミネッセンスのコロニーを選択し、ＮＢＴＡ、ＭｃＣｏｎｋｅｙおよび栄養寒天平板上に塗布した。ｖ．汚染菌を避け、そしてホトラブダスの単一コロニーの選択を確実に行うために、上記段階ｉｖに記されたようなコロニーの継代培養を、数回繰り返した。Ｐ．ルミネッセンスの新規菌株の純粋培養物が得られた。「ＸＰ０１」と命名されたそのような培養物の１つを、１９９６年７月２３日に、the Collec tion Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託し、受理番号Ｉ−１７６０を得た。例２ＸＰ０１発酵物の連続希釈液を、希釈剤としての脱塩水および全培養物を用いて調製し、そして各希釈液を、マメストラ・ブラッシカエ新生幼虫とともにインキュベートした。幼虫の死滅率を、２７℃でのインキュベーション４日後にスコアした。結果を、次の表１に示す：表１数段階の希釈度における、マメストラ・ブラッシカエの新生幼虫に対する生細菌懸濁液の殺虫効果上記表１に見られるように、ＸＰ０１発酵物は、新生幼虫の％死滅率によって測定されるようなＭ．ブラッシカエの新生幼虫に対する殺虫活性を示した。例３２５℃においてＲ５培地で発酵されたＸＰ０１発酵物のサンプルを、発酵開始後１９，２４および４０時間に採取した。１９時間目に採取されたサンプルの一部を、１５０００ｒｐｍで５分間、卓上遠心器において遠心し、次いで、上澄液を、細菌ペレットから分離した。１９時間発酵物からのペレットを、６サンプルに分けた：サンプルＡ１９：塩基性リンゲル液（ｐＨ９）で３回洗浄した；サンプルＢ１９：酸性リンゲル液（ｐＨ５）で３回洗浄した；サンプルＣ１９：中性リンゲル液（ｐＨ７）で３回洗浄した；サンプルＤ１９：上澄液を、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して、懸濁液から細菌細胞を除去した；サンプルＥ１９：元の発酵物（全細菌培養物）；サンプルＦ１９：２５℃で１９時間インキュベートされたＸＰ０１培養物を含まないＲ５培地。サンプルを、例２と同様に、５日齢のマメストラ・ブラッシカエ幼虫に対してバイオアッセイした。６日間インキュベートした後、死滅率をスコアし、そして生存している幼虫の各用量群を、体重測定し、幼虫の平均体重を算出した。図に見られるように、サンプルＡ１９，Ｂ１９，Ｃ１９およびＥ１９で処理した幼虫の体重における減少が、測定されたが、それは、サンプルの希釈度に逆比例した。サンプルＤ１９およびＦ１９を用いては、減少は観察されなかった。１９時間発酵物（サンプルＥ１９）、２４時間発酵物（サンプルＥ２４）および４０時間発酵物（サンプルＥ４０）を、上記のように新生マメストラ・ブラッシカエに対してバイオアッセイし、死滅率を６日後にスコアし、そして致死希釈度（ＬｅｔｈａｌＤｉｌｕｔｉｏｎＲａｔｅ）５０％（ＬＤＲ５０）を、プロビット解析（ｐｒｏｂｉｔａｎａｌｙｓｉｓ）によって計算するか、またはグラフの補間法によって評価した。下記表２〜４に見られるように、ＸＰ０１全培養物の殺虫活性は、培養物の発酵時間によって影響されず、そして１９，２４または４０時間発酵された培養物間には有意な差異はなかった。表２（新生幼虫−１９時間）数段階の希釈度における、マメストラ・ブラッシカエの新生幼虫に対する生細菌懸濁液（培養１９時間後に収穫）の殺虫効果表３（新生幼虫−２４時間）数段階の希釈度における、マメストラ・ブラッシカエの新生幼虫に対する生細菌懸濁液（培養２４時間後に収穫）の殺虫効果表４Ｃ−（新生幼虫−４０時間）数段階の希釈度における、マメストラ・ブラッシカエの新生幼虫に対する生細菌懸濁液（培養１９時間後に収穫）の殺虫効果異なる調製物に対する近似ＬＤＲ５０は、次のとおりであった：Ｅ１９−約１：１７．２希釈液Ｅ２４−約１：１８．５希釈液Ｅ４０−約１：１８．２希釈液例４ＸＰ０１発酵物の殺虫活性を、４種の異なる鱗翅類の新生幼虫に対して試験した：（Ｓ．リットラリス、Ｈ．アルミゲラ、Ａ．イプシロン、およびＳ．セゲタム）。各々、２４時間ＸＰ０１発酵物６ｍｌを含有する数サンプルを調製した。希釈および無希釈サンプルを、４種の鱗翅類の新生幼虫とともにインキュベートした。下記表５〜８に見られるように、ＸＰ０１発酵物は、４種の鱗翅類に対して殺虫活性を示した。表５（スポドプテラ・リットラリス新生幼虫）４段階の希釈度における、スポドプテラ・リットラリスの新生幼虫に対する生細菌懸濁液の殺虫効果表６（アグロチス・イプシロン新生幼虫）４段階の希釈度における、アグロチス・イプシロンの新生幼虫に対する生細菌懸濁液の殺虫効果表７（ヘリコベルパ・アルミゲラ新生幼虫）４段階の希釈度における、ヘリコベルパ・アルミゲラの新生幼虫に対する生細菌懸濁液の殺虫効果表８（セコチア・セゲタム新生幼虫）４段階の希釈度における、セコチア・セゲタムの新生幼虫に対する生細菌懸濁液の殺虫効果例５Ｒ５培地において２５℃で２４時間発酵されたＸＰ０１の発酵物を得て、次のサンプルを調製した：サンプルＡ：未処理の発酵物；サンプルＢ：細菌を含有しないが、２５℃で２４時間インキュベートされたＲ５培地；サンプルＣ：２２ミクロンフィルターを通して濾過された発酵物の上澄液；サンプルＤ：等張液で３回洗浄され、次いで等張液に再懸濁された発酵物の細菌ペレット；サンプルＥ：ｐＨ４．５の培地に再懸濁されたＤと同様の細菌ペレット；サンプルＦ：脱塩水；サンプルＧ：乳鉢において液体窒素中乳棒で粉砕された発酵物の細菌ペレット；サンプルＨ：乳鉢において液体窒素中乳棒で粉砕された全細菌培養物の再懸濁ペレット（サンプルＧ）の、２２ミクロンフィルターで濾過された上澄液。すべての上記サンプルを、２７℃で５日間、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫とともにインキュベートした。結果を、次の表９および下記表１０のプロビット解析に示す。表９に見られるように、検出された最高殺虫活性は、全ＸＰ０１培養物の活性であった。２２ミクロンフィルターで濾過された全細菌培養物の上澄液（サンプルＣ）は、これらの新生幼虫に対する殺虫活性を示さなかった。これに対して液体窒素処理によってやや損傷された細胞の細菌細胞ペレットから調製された上澄液（サンプルＨ）は、殺虫活性を示した。このことは、細菌細胞が、細胞損傷によって上澄液中に漏出する殺虫成分を含有している可能性を支持する。表９数段階の希釈度における、マメストラ・ブラッシカエの新生幼虫に対する生細菌懸濁液およびいくつかの誘導物の殺虫効果表１０表９の結果のプロビット解析処理Ｈの評価ＬＤＲ５０＝．８９限界（ｌｉｍｉｔ）：.７〜１.５例６ＸＰ０１細菌の全細菌培養物の殺虫活性を、Ｈ．アルミゲラの新生幼虫に対して試験した。ＸＰ０１培養物は、Ｒ５培地において２５℃で２４時間発酵され、そして発酵物から、次のサンプルを調製した：サンプル１：細菌ペレットを調製し、そして脱塩水６０ｍｌに再懸濁して、２時間、浸透圧ショックに曝した。サンプル２：ＸＰ０１発酵物のペレットを、５０℃で９時間乾燥し、等張液に再懸濁し、そして音波処理して細胞壁を破壊した。サンプル３：発酵物のペレットを、サンプル３について記載のように処理したが、再懸濁がｐＨ４．５の酸性溶液である点が異なる。サンプル４：元の発酵物を、Ｈ．アルミゲラの新生幼虫に対して、８用量バイオアッセイにおいて試験した。サンプル１〜３からの結果を、次の表１１に示し、そしてサンプル４の結果を以下の表１３に示した。プロビット解析を、それぞれ、表１２と１４に示した。表１１８段階の希釈度における、マメストラ・ブラシッカエの新生幼虫に対する生細菌懸濁液からの処理サンプルの殺虫活性表１２表１１の結果のプロビット解析表１３８段階の希釈度における、ヘリコベルパ・アルミゲラの新生幼虫に対する生細菌懸濁液の殺虫効果表１４表１３の結果のプロビット解析表１１に見られるように、ＸＰ０１細胞培養物は、試験された組成物（サンプル１，２，３）の希釈に相関して、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対する殺虫活性を示す。表１３に見られるように、８−用量バイオアッセイに使用されたＸＰ０１全培養物は、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対する同じ細菌の殺虫活性とは程度が異なるけれども、Ｈ．アルミゲラの新生幼虫に対する殺虫活性を示した（サンプル４）。例７ホルマリンによって不活化されたＸＰ０１細胞の、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対する殺虫活性を試験した。ＸＰ０１を、Ｒ５培地において２５℃で発酵させ、発酵物のサンプルを採取し、次のように処理した：サンプルＡ：未処理発酵物。サンプルＢ：３０％（ｖ／ｖ）ホルマリン３μｌ／ｍｌにより処理された発酵物。サンプルＣ：３０％（ｖ／ｖ）ホルマリン６μｌ／ｍｌにより処理された発酵物。これらのサンプルの活性を、次のような対照調製物に比較して試験した。対照Ａ：脱イオン水。対照Ｂ：３０％（ｖ／ｖ）ホルマリン３μｌ／ｍｌを含む脱イオン水。対照Ｃ：３０％（ｖ／ｖ）ホルマリン６μｌ／ｍｌを含む脱イオン水。ホルマリンの殺菌効力を調整するために、サンプルＡ，ＢおよびＣからの細胞を、３種の栄養寒天平板に塗布し、それを、２５℃で２日間暗所で培養した。この試験で、すべての細菌細胞がホルマリンによって死滅されたことが確認された。上記対照およびサンプルを、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対するバイオアッセイで試験した。表１５に総括された結果は、ホルマリンによって不活化されたＸＰ０１細胞が、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対する殺虫活性を維持していることを示している。表１５例８Ｌ．ボトラナの新生幼虫に対するＸＰ０１発酵物の殺虫活性を、次のように試験した：ＸＰ０１培養物を、Ｒ５培地において２５℃で２４時間発酵させ、その後、発酵物のサンプルを採取し、Ｌ．ボトラナ新生幼虫に対する１−用量バイオアッセイに使用した。下記表１６に見られるように、ＸＰ０１の全培養物は、Ｌ．ボトラナの新生幼虫に対する殺虫活性を示した。表１６例９Ｍ．ブラッシカエ、Ｈ．アルミゲラ、Ａ．イプシロン、Ｓ．セゲタム、Ｓ．リットラリス、Ｌ．ボトラナの新生幼虫に対するＸＰ０５およびＸＰ９８の全培養物の殺虫活性を試験し、そして同じ種類の幼虫に対するＸＰ０１の全培養物の殺虫活性と比較した。「ＸＰ０５」と命名された細菌菌株は、菌株ＸＰ０１に関する例１の記述のように、スタイネルネマ・フェルチエ（Steinernema feltiae）株、ＵＫのＤａｕｅｒＪｕｖｅｎｉｌｅｓによって感染されたガレリア・メロネラ幼虫の血リンパから分離された。また、細菌ＸＰ９８は、同様に、スタイネルネマ種（Steine rnema sp.）株９８のＤａｕｅｒＪｕｖｅｎｉｌｅｓによって感染されたガレリア・メロネラ幼虫の血リンパから分離された。ＸＰ０１，ＸＰ０５、ＸＰ９８は、Ｒ５培地において２５℃で２４時間発酵させた。発酵物を収穫し、そしてＭ．ブラッシカエ、Ｈ．アルミゲラ、Ａ．イプシロン、Ｓ．セゲタム、Ｓ．リットラリス、Ｌ．ボトラナの新生幼虫に対する１−用量バイオアッセイにおいていかなる希釈もなしに使用した。結果を、次の表１７〜２２に示した。表１７Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対する１−用量バイオアッセイ表１８Ｈ．アルミゲラの新生幼虫に対する１−用量バイオアッセイ表１９Ｌ．ボトラナの新生幼虫に対する１−用量バイオアッセイ表２０Ａ．イプシロンの新生幼虫に対する１−用量バイオアッセイ表２１Ｓ．セゲタムの新生幼虫に対する１−用量バイオアッセイ表２２Ｓ．リットラリスの新生幼虫に対する１−用量バイオアッセイ表１７〜２２に見られるように、６種の鱗翅類の種に対するＸＰ０１の殺虫活性が明確であるのに対して、ＸＰ０５およびＸＰ９８菌株は、６種の鱗翅類の種に対して低い活性をもっている。例１０Ｒ５培地において２４時間２５℃で発酵させたＸＰ０１の全培養物を、９０００ｒｐｍで２０分間遠心して濃縮した。得られた濃縮物を凍結乾燥してＸＰ０１発酵ブロスの工業的粉末（ＴｅｃｈｎｉｃａｌＰｏｗｄｅｒ）を製造した。次のサンプルを調製した：サンプルＡ：Ｒ５培地において２４時間２５℃で発酵させたＸＰ０１の全培養物。サンプルＢ：脱塩水中、濃度０．００２８ｇ／ｍｌで再懸濁されたＴｅｃｈｎｉｃａｌＰｏｗｄｅｒの懸濁液。すべての上記サンプルを、２７℃で５日間、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫とともにインキュベートした。結果を、次の表２３に示す：表２３数段階の希釈度における、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対する生細菌懸濁液およびその工業的粉末の殺虫効果上記表２３に見られるように、ＸＰ０１のＴｅｃｈｎｉｃａｌＰｏｗｄｅｒは殺虫活性をもっている。このことは、細菌菌株ＸＰ０１が、昆虫防除に使用できる殺虫成分を含有しているという説を支持する。例１１ＸＰ０１の工業的粉末の懸濁液からの上澄液の殺虫活性を、Ｍ．ブラッシカエ（鱗翅類）の新生幼虫に対して試験した。ＸＰ０１の工業的粉末の懸濁液（０．００２８ｇ／脱塩水１ｍｌ）を、３０分間撹拌した。その上澄液を回収し、そして２２ミクロンフィルターで濾過した。次のサンプルを調製した：サンプルＡ：Ｒ５培地において２４時間２５℃で発酵させたＸＰ０１の全培養物。サンプルＢ：２２ミクロンフィルターで濾過された再懸濁ＴｅｃｈｎｉｃａｌＰｏｗｄｅｒの上澄液。すべての上記サンプルを、２７℃で５日間、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫とともにインキュベートした。結果を、次の表２４に示す：表２４数段階の希釈度における、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対する生細菌懸濁液およびＸＰ０１の工業的粉末からの上澄液の殺虫効果上記表２４に見られるように、ＸＰ０１の工業的粉末の上澄液は殺虫活性をもち、それは、殺虫成分が２２ミクロンより小さいことを示している。例１２ＸＰ０１の全培養物の殺虫活性を、Ｍ．ブラッシカエ（鱗翅類）の新生幼虫に対して、浸漬−葉アッセイにおいて試験した。Ｒ５培地において２５℃２４時間発酵させたＸＰ０１の全培養物の数種の希釈液を、プラスチックカップ内にいれた。キャベツ葉ディスクを、各希釈液に５秒間浸漬し、次いで、それらを風乾した。０．０２％の界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＣＳ−７を各溶液に含有させた。処理した葉のディスクを、２０℃で５日間、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫とともにインキュベートした。結果を、下記表２５に示す。表２５数段階の希釈度における、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対する生細菌懸濁液の葉−浸漬アッセイにおける殺虫効果上記表２５に見られるように、ＸＰ０１の全培養物は、葉の表面に適用された場合でも殺虫活性をもつ。例１３ＸＰ０１の工業的粉末の懸濁液の殺虫活性に及ぼす２種のプロテアーゼ消化の影響を試験した。１００ｍＭＴＲＩＳ溶液ｐＨ７．５中ＸＰ０１の工業的粉末懸濁液（濃度、０．００２８ｇ／ｍｌ脱塩水）から、次のサンプルを調製した：サンプルＡ：１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．５中、ストレプトミセス・ケスピトサス（Streptomyces caespitosus）からのプロテアーゼ１ｍｌ溶液を添加したＸＰ０１懸濁液９ｍｌ（最終プロテアーゼ濃度、０．００２８ｇ／ｍｌ）。サンプルＢ：１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．５中、ウシ膵臓からのプロテアーゼ１ｍｌ溶液を添加したＸＰ０１懸濁液９ｍｌ（最終プロテアーゼ濃度、０．００２８ｇ／ｍｌ）。サンプルＣ：１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．５の１ｍｌ溶液を添加したＸＰ０１懸濁液９ｍｌ。全上記サンプルを、３７℃で４時間インキュベートした。タンパク質分解消化を調べるために、ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥを、インキュベートされたサンプルおよび無処理ＸＰ０１懸濁液を用いて行った。全上記サンプルを、２７℃で５日間、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫とともにインキュベートした。上記サンプルに対応する付加的な対照を次のように試験した：対照Ａ：１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．５中、ストレプトミセス・ケスピトサスからのプロテアーゼ溶液（プロテアーゼ濃度、０．００２８ｇ／ｍｌ）。対照Ｂ：１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．５中、ウシ膵臓からのプロテアーゼ溶液（プロテアーゼ濃度、０．００２８ｇ／ｍｌ）。対照Ｃ：１００ｍＭＴＲＩＳｐＨ７．５溶液。結果を、下記表２６に示す：表２６数段階の希釈度における、Ｍ．ブラッシカエの新生幼虫に対するプロテアーゼ処理されたＸＰ０１の工業的粉末懸濁液の殺虫効果上記表２６に見られるように、ウシ膵臓からのプロテアーゼは、ＸＰ０１の殺虫活性を劇的に低下した。このことは、ＸＰ０１調製物中の有効成分が、ウシ膵臓プロテアーゼによっては、甚だしく損傷されるが、Ｓ．ケスピトサスのプロテアーゼによっては損傷が少ないタンパク質である可能性を指摘している。

【手続補正書】特許法１８４条の８第１項【提出日】平成１０年９月１０日（１９９８．９．１０）【補正内容】請求の範囲１．ｉ．殺虫活性が感染ベクターとして線虫を必要とせずに発現される、種Ｐ．ルミネッセンスに属する殺虫活性をもつ細菌； ii．不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞および； iii.不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞の断片、または該細胞から得られる殺虫性のある活性物質：からなる群から選ばれる有効成分の殺虫性のある有効量を含んでなる、殺虫性組成物。２．生きている殺虫性細菌を含む、請求の範囲１記載の殺虫性組成物。３．不活化された細菌細胞、その断片、またはそれらから得られる物質を含む、請求の範囲１記載の殺虫性組成物。４．該細胞から得られるタンパク質性物質を含む、請求の範囲３記載の殺虫性組成物。５．Ｐ．ルミネッセンス細菌が、菌株ＸＰ０１、ＣＮＣＭＩ−１７６０の特性をもつ、請求の範囲１〜４のいずれか１つに記載の組成物。６．ｉ．殺虫活性が感染ベクターとして線虫を必要とせずに発現される、種Ｐ．ルミネッセンスに属する殺虫活性をもつ細菌； ii．不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞および； iii.不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞の断片、または該細胞から得られる殺虫性のある活性物質：からなる群から選ばれる、有効成分の有効量を、植物またはそれらの環境に投与することを含む、植物の昆虫侵襲の処置方法。７．該有効成分が、植物の地上部分に投与される、請求の範囲６記載の方法。８．該有効成分が、土壌に投与される、請求の範囲６記載の方法。９．有効成分が、生細菌細胞を含む、請求の範囲６〜８のいずれか１つの方法。１０．有効成分が、不活化された細菌細胞、そのような活性化された細胞の断片、または該細胞から得られる物質を含む、請求の範囲６〜８のいずれか１つに記載の方法。１１．細菌が、菌株ＸＰ０１、ＣＮＣＭＩ−１７６０の特性をもつ、請求の範囲６〜１０のいずれか１つに記載の方法。１２．種Ｐ．ルミネッセンスに属し、そして感染ベクターとして線虫を必要とせずに、昆虫へ感染し、殺虫活性を及ぼすその能力によって発現される殺虫活性をもつ、細菌の純粋培養物。１３．該細菌が、菌株ＸＰ０１、ＣＮＣＭＩ−１７６０の特性をもつ、請求の範囲１２に記載の純粋培養物。１４．菌株ＸＰ０１、ＣＮＣＭＩ−１７６０の細菌。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フリドレンダー，ベルトルドイスラエル・96428エルサレム・ジヨセフチヤクミイストリート27／４

Claims

【特許請求の範囲】１．ｉ．殺虫活性が感染ベクターとして線虫を必要とせずに発現される、種Ｐ．ルミネッセンスに属する殺虫活性をもつ細菌； ii．不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞； iii.不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞の断片；および iv．Ｐ．ルミネッセンス細胞の培養物の上澄液、その殺虫活性を保持している画分、または該細胞から得られる殺虫性のある活性物質：からなる群から選ばれる有効成分の殺虫性のある有効量を含んでなる、殺虫性組成物。２．生きている殺虫性細菌を含む、請求の範囲１記載の殺虫性組成物。３．不活化された細菌細胞、その断片、それらから得られる物質または殺虫性細菌の培養物の上澄液を含む、請求の範囲１記載の殺虫性組成物。４．該細胞から得られるタンパク質性物質を含む、請求の範囲３記載の殺虫性組成物。５．Ｐ．ルミネッセンス細菌が、菌株ＸＰ０１、ＣＮＣＭＩ−１７６０の特性をもつ、請求の範囲１〜４のいずれか１つに記載の組成物。６．ｉ．殺虫活性が感染ベクターとして線虫を必要とせずに発現される、種Ｐ．ルミネッセンスに属する殺虫活性をもつ細菌； ii．不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞； iii.不活化されたＰ．ルミネッセンス細胞の断片；および iv．Ｐ．ルミネッセンス細胞の培養物の上澄液、またはその殺虫活性を保持している画分、または該細胞から得られる殺虫性のある活性物質；からなる群から選ばれる、有効成分の有効量を、植物またはそれらの環境に投与することを含む、植物の昆虫侵襲の処置方法。７．該有効成分が、植物の地上部分に投与される、請求の範囲６記載の方法。８．該有効成分が、土壌に投与される、請求の範囲６記載の方法。９．有効成分が、生細菌細胞を含む、請求の範囲６〜８のいずれか１つの方法。１０．有効成分が、不活化された細菌細胞、そのような活性化された細胞の断片、該細胞から得られる物質、または殺虫性細菌が増殖した上澄液を含む、請求の範囲６〜８のいずれか１つに記載の方法。１１．細菌が、菌株ＸＰ０１、ＣＮＣＭＩ−１７６０の特性をもつ、請求の範囲６〜１０のいずれか１つに記載の方法。１２．種Ｐ．ルミネッセンスに属し、そして感染ベクターとして線虫を必要とせずに、昆虫へ感染し、殺虫活性を及ぼすその能力によって発現される殺虫活性をもつ、細菌の純粋培養物。１３．該細菌が、菌株ＸＰ０１、ＣＮＣＭＩ−１７６０の特性をもつ、請求の範囲１２に記載の純粋培養物。１４．菌株ＸＰ０１、ＣＮＣＭＩ−１７６０の細菌。