JP2000516086A - ヒト・サイモシンβ１５遺伝子、蛋白質およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明者らは、今回、ヒトがサイモシンβファミリーの新規蛋白質をコードする遺伝子を有することを発見した。この新規蛋白質はサイモシンβ１５といい、サイモシンβファミリーの他のメンバーと同様にＧ−アクチンに結合しそれを隔離する能力を有するが、他のメンバーについて知られているのとは異なり、前立腺癌腫細胞における細胞移動性を直接的に調節する。本発明は、ヒト・サイモシンβ１５遺伝子をコードする単離されたｃＤＮＡ（配列番号：１）に向けられ、推定アミノ酸配列（配列番号：２）を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト・サイモシンβ１５遺伝子、蛋白質およびその使用 この研究は、承認番号ＣＡ３７３９３のナショナル・インスティテューツ・オ ブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ） によって部分的援助を受けた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。 発明の背景 本発明は、新規な遺伝子、蛋白質、および癌、特に転移性癌を診断し治療する 方法も含むそれらの使用を提供する。 ほとんどの真核生物細胞（赤血球細胞および成人筋肉は例外）は高濃度、すな わち〜２５０μモル／ｌまでのモノマーアクチンを含んでいる。かかるアクチン がいかにして細胞質で重合されないままでいるのか、細胞生物学において問題で あった（Ｎａｃｈｍｉａｒ、Ｖ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ Ｃｅ ｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ細胞生物学における現在の意見、１９９３、５：５６）。 当初アクチン隔離蛋白質であると考えられていたプロフィリンは、観察されたモ ノマーアクチンの相当部を超えるに十分な量は存在しない。最近、アクチン隔 離性５ｋＤペプチドがヒト血小板中に高濃度で発見され（Ｓａｆｅｒら、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９０ ８７：２５３６−２５４０ ）、元来は胸腺ホルモン、サイモシンβ₄（Ｔβ₄）であると考えられる（Ｄ．Ｓ ａｆｅｒ、Ｊ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｒｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ、１９９２、１３ ：２６９−２７１）、すでに知られているペプチド（Ｓａｆｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６８：４０２９−４０３２）と同一であること が示された。Ｔβ₄およびアクチンの相互作用の詳細な動態研究（Ｗｅｂｅｒら 、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２、３１：６１７９−６１８５）は、他の 研究（Ｙｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９３、２６８：５０２−５０９ およびＣａｓｓｉｍｅｌｄｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９２、１１９ ：１２６１−１２７０）と共に、Ｔβ₄およびＴβ₁₀は主にＧ−アクチン緩衝体 として機能するという仮説を支持している。未公開のデータ（Ｅ．Ｈａｎｎａｐ ｐｅｌ）は、該機能をいくつかの他のβサイモシンまで拡大している。また、Ｔ β₄はアクチンによるヌクレオチド交換を阻害し、他方、プロフィリンは交換の 速度を増大させることが示されている（Ｃｏｌｄｓｃｇｍｉｄｔ −Ｃｌｅｒｍｏｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９２、３：１０１ ５−１０２５）。 調べられた全ての脊椎動物は、１つの、しばしば２つのβ−サイモシンを含有 する。かくして、β−サイモシンファミリーのメンバーは全ての種で重要である と信じられている。３つの新しいファミリーメンバー（Ｌｏｗら、Ａｒｃｈ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９２、２９３：３２−３９およびＳｃｈ ｍｉｄ，Ｂ．博士、チュービンゲン大学、１９８９）が、パーチ、ニジマスおよ びウニ、つまり第１の非脊椎動物源で見い出された。配列はよく保存されており 、これは、アクチン隔離が恐らくは全てのβ−サイモシンの特性であることを示 唆している。しかしながら、Ｔβ₄が発見され、その配列がまず１９８１年に決 定されたとき（Ｌｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９ ８１、７８：１１６２−１１６６）、２つの細胞外機能を示唆するデータが提示 された（Ｌｏｗら、前掲、およびＲｅｂａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８１、２ １４：６９９−６７１）。２つの最近の論文は、Ｔβ₄のアミノ末端に由来して いるであろうテトラペプチドの異なる予測されない影響を示している。 いくつかの報告は、転写または翻訳レベルにおけるＴβ₄またはＴβ₁₀合成の 調節を示している。インターフェロン誘導性遺伝子（Ｃａｓｓｉｍｅｌｄｓら、 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９２、１１９：１２６１−１２７０）およびＳ ａｎｄｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９２、８ ９：４６７８−４６８２）はヒトＴβ₄のｃＤＮＡと同一であり、ヒトにおいて はＴβ₄につきいくつかの遺伝子がある（Ｃｌａｕｓｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９１、９：７５−１８０およびＧｏｍｅｚ−Ｍａｒｑｕｅｚら、Ｊ．Ｉｍｍ ｉｎｏｌ．、１９８９、１４３：２７４０−２７４４）。 特にヒトにおいて、β−サイモシンファミリーの新しいメンバーを特定するこ とが望まれている。 ＢａｏおよびＺｅｔｔｅｒは、米国癌研究学会の年次会合（１９９５年、３月 １８−２２日）で提出されたアブストラクトにおいて、低転移性変異体では発現 しないが、高転移性ラット腫瘍細胞系で発現される、新規ｍＲＮＡの分別発現を 報告した。ｃＤＮＡが単離され、ラット・サイモシンβ₄に対して６８％同一性 の蛋白質をコードしていることが報告された。しかしながら、ヌクレオチド配列 および推定アミノ酸配列は報告 されなかった。 発明の概要 本発明者らは、命回、ヒトが、サイモシンβファミリーの新規蛋白質をコード する遺伝子を有することを見い出した。ここでサイモシンβ１５と称するこの新 規蛋白質は、サイモシンβファミリーの他のメンバーと同様にＧ−アクチンに結 合しそれを隔離するが、他のメンバーについて知られているのとは異なって、前 立腺癌腫細胞において細胞運動性も直接的に調節する。本発明者らはヒト・サイ モシンβ１５遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号：１）を単離し、アミノ酸配列（配列 番号：２）を推定した。本発明者らは、非睾丸細胞におけるサイモシンβ１５遺 伝子の増強された転写体（ｍＲＮＡ）および発現が、前立腺、肺、黒色腫および 乳癌、特に転移性癌のごとき多数の癌における病気状態と高い相関性を有するこ とを示した。従って、非睾丸組織における転写体または遺伝子産物の増強された レベルの発見は、診断方法のみならず特定の癌の予後方法で使用することができ る。 本発明は、配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するサイモシンβ１５をコー ドする単離された核酸（ポリヌクレオチド） またはそのユニークな断片を提供する。「ユニークな断片」という用語は、サイ モシンファミリーの他のメンバーには存在しないがサイモシンβ１５（配列番号 ：２）には存在する配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）を含有する本発明 のヌクレオチド配列またはポリペプチドをいう。これは、ストリンジェントな条 件下でのその断片のハイブリダイゼーションプロフィールが、それがサイモシン ファミリーの他のメンバーにハイブリダイズしないような場合に測定できる。か かる断片は図３から確認することができる。ユニークな断片の好ましいセットは 、配列番号：２のアミノ酸７ないし１２、配列番号：２のアミノ酸２１ないし２ ４および配列番号：２のアミノ酸３６ないし４５をコードするポリヌクレオチド を含有するものである。好ましくは、ユニークなヌクレオチド配列断片は長さが １０ないし６０ヌクレオチド、より好ましくは２０ないし５０ヌクレオチド、最 も好ましくは３０ないし５０ヌクレオチドである。好ましくは、ユニークなポリ ペプチド配列は長さが４ないし２０アミノ酸、より好ましくは６ないし１５アミ ノ酸、最も好ましくは６ないし１０アミノ酸である。 本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態またはＤＮＡの形 態であり得るもので、そのＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡおよび合成ＤＮ Ａを含む。該ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってよく、もし一本鎖であればコ ーディング鎖または非コーディング鎖（アンチセンス）であり得る。成熟ポリペ プチドをコードするコーディング配列は配列番号：１に示した配列と同一であっ てよく、あるいは遺伝暗号の冗長または縮重の結果である、コーディング配列が 配列番号：１のＤＮＡと同一の蛋白質をコードする、異なるコーディング鎖であ ってもよい。 ポリヌクレオチドは、配列番号：１に示したコーディング配列の天然に生じる 対立遺伝子変異体であるコーディング配列を有し得る。当該分野で知られている ごとく、対立遺伝子変異体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を 有し得るもので、コードされた蛋白質の機能を実質的に改変しないポリヌクレオ チド配列の別の形態である。 また、本発明は、前記ポリヌクレオチド、特に配列番号：１のユニークな部分 に厳密な条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドセグメントを 提供する。該セグメントは、好ましくは、少なくとも１０のヌクレオチドを含む 。本明細書で用いる「厳密な条件」という用語は、配列間で少なくとも ９５％、好ましくは少なくとも９７％同一性がある場合にのみハイブリダイゼー ションが起こることを意味する。これらの単離されたセグメントは、核酸増幅技 術、例えばＰＣＲで用いて、サイモシンβ１５をコードするポリヌクレオチドを 同定し及び／又は単離することができる。 本明細書で用いる、配列番号：１と「実質的に同一の」ポリヌクレオチドは、 配列番号：１に対して少なくとも９０％相同性、好ましくは少なくとも９５％相 同性、最も好ましくは９９％相同性を持つものである。この理由は、かかる配列 は多数の哺乳動物種でサイモシンβ１５をコードできるというものである。 本発明は、さらに、配列番号：１のアミノ酸配列を有する単離され精製された ヒト・サイモシンβ１５、ならびに例えば配列番号：２のアミノ酸７ないし１２ 、配列番号：２のアミノ酸２１ないし２４および配列番号：２のアミノ酸３６な いし４５を含めたかかるユニークな断片を含むポリペプチドを提供する。 本発明のさらにもう１つの観点において、ヒト・サイモシンβ１５に選択的に 結合する単離された抗体または抗体断片が提供される。該抗体断片は、例えば、 Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片を含む。該抗体は一本鎖抗体 、ヒト化抗体ま たはキメラ抗体であってよい。 「単離された」という用語は、該物質がその元の環境（例えば、もしそれが天 然に生じるものであれば天然環境）から取り出されたことを意味する。例えば、 生きている動物に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは 単離されたではないが、天然系に共存在する物質のいくらかまたは全てから分離 された、同一のポリヌクレオチドもしくはＤＮＡまたはポリペプチドは単離され たである。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であり得るか及び／又はか かるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得るもので、か かるベクターまたは組成物がその天然環境の一部でない点で依然として単離され たである。 また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクタ ーで遺伝子工学的に操作された宿主細胞および組換え技術による本発明のポリペ プチドの生産に関する。 本発明は、さらに、ヒト・サイモシンβ１５の活性または生産を抑制する化合 物の有効量を、ヒト・サイモシンβ１５を発現する腫瘍性細胞に投与することに よって該細胞を治療する方法を提供する。好ましくは、該化合物はヒト・サイモ シンβ１５ 遺伝子の発現に妨害する。かかる化合物は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレ オチド、リボザイム、一本鎖抗体およびその断片を含む抗体を含む。 図面の記載 図１Ａおよび１Ｂは、分別ｍＲＮＡ表示およびＤｕｎｎｉｎｇ Ｒ−３３２７ ラット前立腺の腺癌変異体のノーザン分析を示す。ＡＴ２．１（レーン１）、Ａ Ｔ３．１（レーン２）およびＡＴ６．１（レーン３）細胞からの全ＲＮＡを逆転 写し、［α３５−Ｓ］ｄＡＴＰの存在下で、プセイマーセット、Ｔ₁₁ＡＧおよび １０量体ＡＧＧＧＡＡＣＧＡＧ（配列番号：３）でのＰＣＲによって増幅した。 該ＰＣＲ断片は６％ポリアクリルアミドゲル上に示され、オートラジオグラフィ ーに付された。分別発現されたバンドは矢印によって示される。Ｂ．サイモシン β１５遺伝子のノーザンブロット分析。２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡをＤｕｎｎｉ ｎｇ Ｒ−３３２７変異体ＡＴ２．１（レーン１）、ＡＴ３．１（レーン２）、 ＡＴ６．１（レーン３）およびＭａｔＬｙｌｕ（ケーン４）から単離し、１．１ ％ホルムアルデヒド−アガロースゲルで分画し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜 （Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、ランダム起点（Ｇｒｉｌｌｏｎ， Ｃ．、ＦＥＢＳ １９９０、２７４：３０−３４）³²Ｐ−標識Ｔβ１５ｃＤＮＡ 断片とハイブリダイズさせた。同一ブロットをラットβ−アクチンプローブとハ イブリダイズさせて、同等量のＲＮＡが各レーンに負荷されたことを証明した。 図２はＴβ１５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）および予測さ れるアミノ酸配列（配列番号：２） （一文字記号）である。ヌクレオチドおよ びアミノ酸の配列数は当該配列の右側に示す。翻訳開始コドンＡＴＧには下線を 施し、終止コドンＴＡＡは星印でマークした。推定アクチン結合性領域には下線 を施した。これらの配列データは受入番号Ｕ２５６８４下でＧｅｎＢａｎｋから 入手できる。 図３は、推定Ｔβ１５蛋白質配列および他のβサイモシンのイソ形態の整列を 示す。アミノ酸同一領域は黒色の箱形中の白色文字によって表す。箱にいれなか った黒色文字は同一でない領域に対応する。ドットは整列を最適化するために配 列に導入されたギャップに対応する。 図４は種々のラット組織におけるＴβ１５の発現を示す。多数組織ブロットは Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。該ブロットをＴβ１５ ｃＤＮＡプローブとハ イブリダイズさせた。ラッ トＧＡＰＤＨは負荷対照である。 図５Ａおよび５Ｂは、前立腺の腺癌患者でのＴβ１５についてのアンチセンス リボプローブとのその場ハイブリダイゼーションを示す。図５Ａは腫瘍における 分別発現を示す。小さな矢印は陽性染色を示す。大きな矢印は陰性染色を示す。 図５Ｂは、ほとんど分化していない侵入性前立腺癌腫において、単一細胞侵入性 ストローマが強い染色を示すことを示す（矢印）。 図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃはアクチンの重合に対するＴβ１５の効果を示す。 図６Ａ．３μＭのピレン−標識Ｇ−アタチンを、種々の量のＧＳＴ−Ｔβ１５ 融合ペプチド（Ｖ）、ＧＳＴ−Ｔβ１５（Ａ）またはＧＳＴ単独（Ｏ）の存在下 で重合させた。重合の最終的な程度はピレン−標識アクチンの最終レベルから決 定した（蛍光）。全ての溶液は５．５ｍＭトリス、ｐＨ７．６、１６７μＭ Ｃ ａＣｌ₂、０．５ｍＭグルタチオン、１６７μＭ ＤＴＴおよび４２０μＭ Ａ ＴＰを含有するものであった。重合は２ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１５０ｍＭ Ｋ Ｃｌの添加によって誘導した。誤差棒は融合蛋白質の別の希釈からなされた二連 の測定の範囲を示す。 図６Ｂ．２μＭのピレン−標識Ｇ−アクチンを、サイモシンによってＧＳＴか ら開裂された種々の量のモノマーＴβ１５の存在下で重合させた。重合の相対的 速度は、重合の初期相における蛍光増加の最大速度から導いた。 図６Ｃ．アクチン組立の最終程度は、サイモシンＧＳＴ融合ペプチドで使用し たのと同一の方法によって測定した。実験条件は図６Ｂに記載したのと同一であ る。 図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、トランスフェクトされた対照およびＴβ１５トラ ンスフェクトのＤｕｎｎｉｎｇ Ｒ−３３２７変異体の血清刺激移動およびそれ らの増殖速度を示す。トランスフェクトされたベクター対照（○、▽）およびＴ β１５アンチセンス（●、▼）トランスフェクトのＡＴ３．１細胞クローン。図 ７Ｂ．トランスフェクトされたベクター対照（○、▽）およびＴβ１５センスト ランスフェクトの（●、▼）ＡＴ２．１細胞クローン。データは平均±ＳＥ（ｎ ＝４）として表す。図７Ｃ．トランスフェクトされた対照およびＴβ１５（セン スまたはアンチセンス）トランスフェクトのＤｕｎｎｉｎｇ Ｒ−３３２７クロ ーンの増殖曲線。ベクター対照トランスフェクトのＡＴ２．１（○）、Ｔβ１５ センストランスフェクトのＡＴ ２．１（●）、ベクター対照トランスフェクトのＡＴ３．１（▽）およびＴβ１ ５アンチセンストランスフェクトのＡＴ３．１（▼）を、１２−ウェルプレート 中、１０％ＦＢＳおよび２５０ｎＭデキサメタゾンを含むＲＰＭＩ １６４０に て初期１０⁴細胞／ウェルで平板培養した。細胞を収穫し、示した時点で計数し た。点は平均±ＳＥ（ｎ＝３）を表す。 図８Ａおよび８Ｂはサイモシンβ−ＧＳＴ融合蛋白質のウェスタン分析を示す 。図８ＡはＧＳＴ−β融合蛋白質のクーマシー染色である。図８Ｂは、アフィニ ティー精製した抗−Ｔβ１５Ｃ末端ペプチド抗体でのＧＳＴ−Ｔβ融合蛋白質の ウェスタン分析である。レーン１：ＧＳＴ−Ｔβ４；レーン２：ＧＳＴ−Ｔβ１ ５；レーン３：ＧＳＴのみ。 図９は、マウス肺腫瘍細胞ＬＡ−４：マウス肺腺腫細胞系；Ｍ２７およびＨ５ ９：マウスＬｅｗｉｓ肺腺癌細胞系に由来する転移性変異体におけるサイモシン β１５のノーザン分析を示す。ノーザンブロット分析は、プローブがＭ２７細胞 におけるサイモシンβ１５ｍＲＮＡ発現、Ｈ５９細胞におけるより少ない発現を 検出したが、ＬＡ−４細胞では発現を検出しなかったことを明らかにした。 図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄは、アフィニティー精製したサイモシ ンβ１５に対するポリクローナル抗体でのヒト前立腺癌腫の免疫組織化学的染色 を示す。Ａ．非悪性前立腺上皮（大きな矢印）およびハイグレード前立腺上皮内 新形成（ＰＩＮ）（小さな矢印）。Ｂ．異種免疫染色を示す中程度に分化した前 立腺癌腫（小さな矢印、陽性；大きな矢印、陰性）。Ｃ．ほとんど分化していな い前立腺癌腫。Ｄ．強い染色を示す単一細胞侵入性ストローマ。 図１１はラット前立腺細胞系からのＲＴ−ＰＣＲ増幅されたβサイモシンの１ ．４％アガロースゲル電気泳動である。レーン１、弱い転移性ＡＴ２．１；レー ン２、３および４、高度に転移性のＡＴ３．１、ＡＴ６．１およびＭａｔ Ｌｙ ｌｕ；レーン５および６、非転移性ＮｂＥおよびＭＣ２；レーン７、弱い転移性 のＦｂ２。β−アクチンＰＣＲは各試料の内部対照として使用した。 発明の詳細な記載 変動する転移能を示す細胞系のよく特徴付けられたシリーズはＤｕｎｎｉｎｇ ラット前立腺癌腫から開発されている（Ｉｓｓａｃｓら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ９ 、２６１−２８１および Ｂｕｓｓｅｂａｋｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２、２９１６−２９２２ （１９９２）。Ｃｏｆｆｅｙおよび同僚は、以前に、Ｄｕｎｎｉｎｇ細胞系にお いて細胞移動性および転移能の間の直接的相関性を示した（Ｍｏｈｌｅｒら、Ｃ ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８、４３１２−４３１７（１９８８）、Ｐａｒｏｎら 、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、１２５４−１２５８（ １９８９）およびＭｏｈｌｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．１２ 、５３−６７（１９９３））。本発明者らは、分別ｍＲＮＡディスプレイを用い 、Ｄｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌腫に由来する貧弱な転移性のおよび高度に転移 性の細胞系における遺伝子発現を比較した。これらの実験の結果は、アクチン− 結合性分子であるサイモシンβ１５のサイモシンベータファミリーの新規なメン バーの発現を明らかとした。この情報を用い、本発明者らは、ヒト・サイモシン β１５をコードするｃＤＮＡを単離し、配列決定した。 サイモシンβファミリーのメンバーはＧ−アクチンに結合しそれを隔離するこ とが示されているが、それらは細胞移動性を変化させることは以前には示されて いない。しかしながら、本 発明者らの実験により、この新しいメンバー、サイモシンβ１５が前立腺癌腫細 胞において細胞移動性を直接的に調節することが明らかとなる。本発明者らは、 サイモシンβ１５の発現が、貧弱な転移性のおよび非転移性の系に対して高度に 転移性の前立腺癌細胞で上昇調節させることを示した。さらに、サイモシンβ１ ５は、正常ヒト前立腺では発現されなかったが、ヒト前立腺癌腫被検体では発現 された。理論に拘束されるつもりはないが、これは、β１５が転移性形質転換の プロセスで役割を演じていることを示す。 本発明は配列番号：２の推定アミノ酸配列を有するサイモシンβ１５の一部ま たは全てをコードするポリヌクレオチド配列またはユニークなその断片を提供す る。ヒト・サイモシンβ１５のヌクレオチド配列は配列番号：１に記載する。 また、本発明の配列は、所望ならば、制限部位を供するように設計できる。こ れは、コードされたサイモシンβ１５のペプチド配列に影響しないように行うこ とができるか、あるいは、最終産物が所望のペプチド特性を有するものであれば 、所望または必要ないずれかの程度影響してもよい。 サイモシンβ１５またはそのユニークな断片を発現させるこ とが望まれる場合、いずれの適当な系を使用することもできる。適当なベクター の一般的性質、発現ベクターおよび構築は当業者に明らかであろう。 適当な発現ベクターはファージまたはプラスミドに基づくことかでき、その双 方はしばしば他の宿主のために作成することもできるが、これらは一般に宿主特 異的である。他の適当なベクターはコスミドおよびレトロウイルス、ならびに他 のビヒクルを含み、これらは所与の系につき特異的であるかまたは特異的でなく てもよい。発現の調節に必須及び／又は有用である、認識、プロモーター、オペ レーター、インデューサー、ターミネーターおよび他の配列のごとき制御配列は 、当業者に容易に明らかであり、あるいは天然サイモシンβ１５または使用され るベクターが有しているか、あるいは適当ないずれかの他の源に由来するもので あってもよい。ベクターはいずれかの適当な方法で修飾または作成することがで きる。 ヌクレオチド配列の正しい調製は、例えば、ＳａｎｇｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−７（１９７７）の方法によって 確認できる。 本発明のサイモシンβ１５をコードするｃＤＮＡ断片は適当 なベクターに容易に挿入することができる。典型的には、受容ベクターは挿入の 容易性のために適当な制限部位を有するが、リーディングフレームおよび挿入の 方向につき不確実性をもたらすかも知れないが、例えば、平滑末端連結を使用す ることもできる。かかる場合、発現につき形質転換体をテストするのは勿論であ り、その６つのうち１つは正しいリーディングフレームを有するはずである。適 当なベクターは、望まれる発現系によって、当業者はもちろん選択することがで きよう。 適当な生物、または好ましくはＨｅＬａのごとき真核生物細胞系を、得られた プラスミドで形質転換し、要すればアンピシリンでまたは他の適当な手段によっ て形質転換体を選択し、必要であればトリプトファンまたは（インドール酢酸の ごとき）他の適当なプロモーター−インデューサーを添加することによって、所 望のサイモシンβ１５を発現させることができる。発現の程度はＳＤＳポリアク リルアミドゲル−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる（Ｌｅｍｅｌ ｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０））。 培養等を増殖させ形質転換する適当な方法は、便利に、例えば、Ｍａｎｉａｔ ｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ、Ｍａｎｉａｔｉｓら（編）、Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））に説明さ れている。 サイモシンβ１５またはそのペプチドの生産に有用な培養は、適切には、いず れかの生きている細胞であり得るもので、原核生物発現系から真核生物発現系ま で変化させることができる。１つの好ましい原核生物系は、その操作の容易性の ため、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のそれである。しかしながら、真核生物蛋白 質につき、哺乳動物細胞系のごときより高等生物の系を用いることもできる。一 過性発現のための現在の好ましい細胞系はＨｅＬａおよびＣｏｓ細胞系である。 他の発現系はチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系およびバクロウイ ルス系を含む。 使用できる他の発現系はストレプトマイセス属菌、例えば、サッカロマイセス 種、特にストレプトマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のごと き酵母を含む。一般に、操作者が何を必要としているかに応じて、所望のいずれ かの系も使用することができる。適当な系を用いて遺伝物質を増幅させることも できるが、一般に、ＤＮＡの増幅のみが必要な場合、この 目的にイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いるのが便利である。 ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質およびペプチドを検出するための当該分野でよく知ら れている標準的検出技術をサイモシンβ１５またはその転写体を検出するのに容 易に適用して、癌、特に転移性ガンを診断し、あるいは初代腫瘍が特定の転移性 相に達したか否かを確認することができる。 １つのかかる技術、免疫組織化学において、抗−サイモシンβ１５抗体を用い て、生体切片試料においてサイモシンβ１５を検出することができる。 また、抗−サイモシンβ１５抗体は、イメージング目的で用いて、例えば、腫 瘍転移を検出することもできる。適当な標識は放射性同位体、ヨウ素（¹²⁵Ｉ、^{1 21} Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウム（¹¹²Ｉ ｎ）およびテクネチウム（^99mＴｃ）、フルオレセインおよびローダミンのごと き蛍光標識、およびビオチンを含む。 しかしながら、イン・ビボのイメージング目的では、状況はより制限的となる 。というのは、抗体はそれ自体体外からは検出できず、従って検出を可能とする には標識せねばならず、あるいは修飾せねばならないからである。この目的のた めのマー カーは、抗体との結合を実質的に妨害しないが外部検出を可能とするいずれのも のであってもよい。適当なマーカーは、Ｘ−ラジオグラフィー、ＮＭＲまたはＭ ＩＲによって検出できるものを含む。Ｘ−ラジオグラフィー技術については、適 当なマーカーは、例えば、バリウムまたはセシウムのごとき、検出可能な放射線 を放出するが、患者に対して明らかに有害でないいずれの放射性同位体も含む。 ＮＭＲおよびＭＩＲについての適当なマーカーは、一般に、例えば、関連ハイブ リドーマのための栄養素の適当な標識によって抗体に取り込まれる、ジュートリ ウムのごとき検出可能な特徴的スピンを持つものを含む。 イン・ビボのイメージング方法の場合において、放射性同位体（例えば、¹³¹ Ｉ、¹¹²Ｉｎ、^99mＴｃ）、放射線不透明物質、または核磁気共鳴によって検出可 能な物質のごとき、適当な検出可能イメージング部位で標識されている抗体また は抗体断片を、調べるべき（ヒトのごとき）対象に（例えば、非経口、皮下また は腹腔内に）導入する。診断イメージを生じるのに必要なイメージング部分の量 は、対象のサイズおよび使用するイメージング系により決定される。放射性同位 体部位の場合においては、ヒト対象では、注入する放射性の量は、通常、約 ５ないし２０ミリキュリーのテクネチウム−９９ｍの範囲であろう。標識された 抗体または抗体断片は、次いで、サイモシンβ１５を含有する細胞の位置に優先 的に蓄積するであろう。標識した抗体または抗体断片は、次いで、公知の技術を 用いて検出できる。 抗体はサイモシンβ１５のペプチドまたは全分子いずれかに対して生起し得る 。かかるペプチドは、ＫＬＨのごときキャリター蛋白質と共に動物系に提示され るか、あるいは十分に長ければ、例えば、２５アミノ酸残基ではキャリターなし でもよい。好ましいペプチドは、配列番号：２のアミノ酸７ないし１２、配列番 号：２のアミノ酸２１ないし２４および配列番号：２のアミノ酸３６ないし４５ のごとき、サイモシンβ１５に対してユニークな領域を含む。 上記技術によって生成されたポリクローナル抗体は直接使用できるか、あるい は適当な抗体産生細胞を動物から単離し、公知の方法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ ｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：７９５（１９７５））によってハイブリ ドーマを形成するのに使用できる。適当なハイブリドーマの選択は当業者に明ら かであり、得られた抗体は適当なアッセイで用いて、サイ モシンβ１５を同定することができる。 また、本発明によって、抗体またはそれらの同等物を癌の治療または予防に使 用することもできる。適当な用量の抗体の投与は、サイモシンβ１５の生産をブ ロックし、またはその有効活性をブロックするように働くことができ、これはそ の中で悪性増殖を治療すべき決定的時間枠を供することができよう。 いずれの所与のケースにおいても何が実際に転移に導くかは知られていないの で、予防は病気の非常に初期の段階においてでも適切であり得る。したがって、 癌が診断されれば直ぐに抗体またはそれらの同等物あるいはサイモシンβ１５活 性を妨害する因子の投与を行うことが有効であろう。そして、必要な限り、好ま しくは病気の脅威が取り除かれるまで、治療を継続する。かかる治療はある種の 癌、例えば前立腺の発生の高い危険性のある個体において予防的に用いることも できる。 治療の方法は、抗体に適当なトキシンを結合させることを含み、それにより腫 瘍の領域を標的化する。かかるトキシンは、当該分野でよく知られており、毒性 放射性同位体、重金属、酵素および補体アクチベーター、ならびに細胞当たりた だ１または２分子のレベルにて作用できるリシンのごとき天然トキシン であり得る。また、かかる技術を用いて、例えば癌を治療するのに使用できる適 切な生理活性化合物の局所化用量を送達する技術を使用することも可能であろう 。 本発明に従い診断または治療適用に使用される抗体は、適切にはモノクローナ ルまたはポリクローナルであってよい。これらの抗体同等物は、例えば、Ｆａｂ 、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのごとき抗体のＦａｂ’断片；イディオ トープ；アロトープ融合の結果物（動物抗体の認識領域をヒト抗体の適切な領域 に融合して患者における免疫応答を回避する）を含むことができる。一本鎖抗体 を用いることもできる。他の適当な修飾及び／又は薬剤は当業者に明らかであろ う。 キメラおよびヒト化抗体も本発明の範囲内のものである。キメラおよびヒト化 抗体は、対応する非キメラ抗体よりもヒト対象において免疫原性が低いであろう 。例えば非ヒト可変領域およびヒト定常領域よりなるキメラおよびヒト化抗体を 作成する種々のアプローチは記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、６８５１（１９８５）；Ｔ ａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４、４５２（１９８５）、Ｃａｂｉｌ１ｙら 、米国特許第 ４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎ ａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開ＥＰ １７１４９６；欧州特許公開 ０１７３４ ９４、英国特許ＧＢ ２１７７０９６Ｂ参照。さらに、キメラ抗体は、可変領域 の一部、特に抗原結合ドメインの保存されたフレームワーク領域がヒト起源であ って超可変領域のみが非ヒト起源であるようにさらに「ヒト化」することができ る。かかる改変免疫グロブリン分子は当該分野で公知のいくつかの技術のうちい ずれかによって作成することもでき（例えば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０、７３０８−７３１２（１９８３）；Ｋｏｚｂ ｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４、７２７９（１９８３）；Ｏｌ ｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２、３−１６（１９８２））、好 ましくはＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３またはＥＰ ０２３９４００の技術に 従って作成される。ヒト化抗体は、例えば、Ｓｃｏｔｇｅｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ、 ２ Ｈｏｌｌｙ Ｒｏａｄ、Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、英国 により商業的に生産することができる。 サイモシンβ１５に対して反応性である特異的抗体または抗 体断片を生成させるもう１つの方法は、本発明の蛋白質またはそのペプチド断片 を用いて、免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードするファージ発現ラリ ブラリーをスクリーニングすることである。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領 域およびＶ領域誘導体はファージ発現ラリブラリーを用いて細菌中で発現させる ことができる。例えば、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４−５４６（ １９８９）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６、１２７５−１２８１（１９ ８９）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８、５５２−５４ ４（１９９０）参照。 抗体は多数の方法によって投与することができる。１つの好ましい方法はＰＣ Ｔ ＷＯ９４／０２６１０にＭａｒａｓｃｏおよびＨａｓｅｌｔｉｎｅによって 記載されており、これらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。この方 法は、抗体、この場合はサイモシンβ１５抗体、をコードする遺伝子の細胞内送 達を開示している。好ましくは、一本鎖サイモシンβ１５抗体をコードする遺伝 子が使用されるであろう。該抗体は、好ましくは、核極所化配列、例えばＰｒｏ −Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（配列番号：４） ［Ｌａｗｆｏｒｄら、Ｃｅｌｌ ４６（１９８６）］；Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ −Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号：５）［Ｓｔａｎｔｏｎら、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：１７７２（１９８６）］、 Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ（配列番号：６）［Ｈａｒｌｏｗら、 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６０５（１９８５）；核のためのＡｒｇ− Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号：７）、を有する。好ましくは、ＳＶ４０の 核極所化シグナルが使用される。この方法によって、サイモシンβ１５抗体を細 胞内で発現させることができ、これは所望の細胞でサイモシンβ１５機能をブロ ックすることができる。 サイモシンβ１５を阻害するのに抗体を使用するのに加え、他の形態の阻害剤 を使用することもできる。サイモシンβ１５の阻害剤は製造することができ、こ れらは一般的には酵素活性によって影響される基質の領域に対応する。かかる阻 害剤は基質および切断産物の間の凍結（ｆｒｏｚｅｎ）中間体に対応するのが好 ましいが、結合部位の立体障害バージョン、またはそれ自体がサイモシンβ１５ に不可逆的に結合する結合部位のバージョンを供することもできる。他の適当な 阻害剤は当業者に 明らかであろう。 また、本発明は、サイモシンβ１５の発現を改変することによる癌の治療を提 供する。これは、例えば当該蛋白質に対する特異的抗体を指示させるなど、サイ モシンβ１５生産を妨害することによって行うことができ、この抗体はさらに修 飾して所望の結果を達成することができる。サイモシンβ１５受容体をブロック することもでき、そのいくらかは、例えば、抗体または合成ペプチドであり得る 必要な結合剤の位置決定によってより容易に達成することもできる。 サイモシンβ１５遺伝子発現は、ゲノミックＤＮＡ上のプロモーターのごとき 部位をブロックすることによるように、より直接的に加減することもできる。 本発明が患者に例えば抗体を投与することを提供する場合、これは、これはい ずれの適当な経路によってもよい。もし腫瘍が依然として局所的である、あるい はそのように診断されれば、投与の適当な方法は当該部位への直接注射である。 また、投与は、皮下、筋肉内、静脈内および皮膚内注射を含めた注射によること もできる。 処方は、投与経路に適し、当業者に明らかであろういすれの ものであってもよい。処方は、生理食塩水のごとき適当な担体を含有することが でき、また、増量剤、他の医薬製剤、アジュバントおよびいずれかの他の適当な 医薬成分を含むこともできる。カテーテルはもう１つの好ましい投与形態である 。 また、サイモシンβ１５発現をアンチセンス技術の使用によってイン・ビボに て阻害することもできる。アンチセンス技術を用いて、三重らせん形成またはア ンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通じて遺伝子発現を制御することができ、両 方法はポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。サイモ シンβ１５をコードする核酸分子に相補的なアンチセンス核酸分子は、本発明に よって提供されるサイモシンβ１５をコードする単離された核酸に基づいて設計 することができる。アンチセンス核酸分子は、ワトソンおよびクリックの塩基対 合則に従って構築された、核酸のコーディング鎖に相補的で、例えば、ｍＲＮＡ 配列に相補的で、当該核酸のコーディング鎖に水素結合できる核酸配列を含むこ とができる。ｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列はｍＲＮＡのコーディ ング領域に相補的であり得るもので、あるいはｍＲＮＡの５’または３’非翻訳 領域に相補的であり得る。さらに、アンチセンス核酸は、 ｍＲＮＡをコードする遺伝子の調節領域、例えば、転写開始配列または調節エレ メントに対して配列が相補的であり得る。好ましくは、開始コドンに先行するま たはそれにわたる、あるいはｍＲＮＡの３’非翻訳領域における領域に相補的な アンチセンス核酸を用いる。アンチセンス核酸は配列番号：１に示されたヌクレ オチド配列に基づいて設計することができる。示された核酸のコーディングもし くは非翻訳領域の配列に相補的な配列を有する核酸が設計される。別法として、 アンチセンス核酸は、本発明の単離された核酸を用いてゲノミックＤＮＡラリブ ラリーをスクリーニングすることによって同定できるβ１５遺伝子の配列に基づ いて設計することができる。例えば、重要な調節エレメントの配列は標準的な技 術によって決定することができ、該調節エレメントに対してアンチセンスである 配列を設計できる。 本発明のアンチセンス核酸およびオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の手 法を用い、化学合成および酵素連結反応を用いて構築することができる。該アン チセンス核酸およびオリゴヌクレオチドは、天然に生じるヌクレオチドまたは分 子の生物学的安定性を増大させるかまたはアンチセンスおよびセンス核 酸の間で形成される二重体の物理的安定性を増大させるように設計した種々に修 飾されたヌクレオチドを用い化学的に合成でき、例えば、ホスホロチオエート誘 導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。別法として、ア ンチセンス核酸およびオリゴヌクレオチドは、核酸がアンチセンス向きにサブク ローンされた発現ベクター（すなわち、挿入された核酸から転写された核酸は注 目する標的核酸に対してアンチセンス向きである）を用いて生物化学的に生成さ せることができる。アンチセンス発現ベクターは、高効率調節領域の制御下でア ンチセンス核酸が生成される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイ ルスの形態で細胞に導入され、その活性はベクターが導入された細胞タイプによ って決定される。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の議論について は、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ Ｈ．ら、遺伝子解析のための分子ツールとしてのアン チセンスＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔ ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６参照。 さらに、リボザイムを用いて、サイモシンβ１５のイン・ビ ボ発現を阻害することができる。例えば、本発明の核酸をさらに用いて、サイモ シンβ１５ｍＲＮＡ転写体のごときβ１５蛋白質をコードする一本鎖核酸を切断 できるリボザイムを設計することができる。本発明の核酸の配列（例えば、配列 番号：１）に基づいて、サイモシンβ１５をコードするｍＲＮＡにつき特異性を 有するリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ（リボザイム）を設計すること ができる。例えば、活性部位の塩基配列がサイモシンβ１５コーディングｍＲＮ Ａ中で切断されるべき塩基配列に対応するテトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮ Ａの誘導体を構築すことができる。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７ ，０７１号；Ｃｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号参照。別法として、 本発明の核酸を用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を 有する触媒ＲＮＡを選択することができよう。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およ びＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１、１４１１−１４１８（ １９８３）参照。 本発明のポリヌクレオチドおよび抗体を用いる癌の診断および予後の方法は同 時係属出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／６６４，８５７に記載されており、ここに出 典明示してその開示を本明 細書の一部とみなす。 前記および後記引用の全ての文献はここに出典明示してその開示を本明細書の 一部とみなす。 以下の実施例は本発明を説明するために提示し、断じて本発明を限定する意図 のものではない。 実施例 方法 細胞培養 Ｄｕｎｎｉｎｇ Ｒ３３２７ラット前立腺の腺癌細胞に由来する、貧弱に転移 性のＡＴ２．１サブ系および高度に転移性のＡＴ３．１、ＡＴ６．１およびＭａ ｔ ｌｙｌｕサブ系（Ｊ．Ｉｓｓａｃｓ博士、ジョーンズ・ホプキンス大学から 提供される）を、５％ ＣＯ₂、９５％空気の雰囲気下、３７℃にて、１０％胎 児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ） 、１％グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｒｖｉｎｇ Ｓｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１％グルタミン／ペニシリン／ストレプト マイシン（Ｉｒｖｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ） および２５０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＤ）を補足したＲＰＭＩ １ ６４０培地でイン・ビトロにて維持した。 ＲＮＡの単離およびノーザンブロット分析 ７０％密集の細胞を収穫し、ＲＮＡ単離に付した。全ＲＮＡは、酸グアニジウ ムチオシアネート／フェノール／クロロホルム抽出手法によって調製した。（Ｃ ｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 、１６７、１５７−１５９（１９８７））。ポリ（Ａ）ＲＮＡは、ポリ（Ａ）Ｑ ｕｉｃｋ ｍＲＮＡ単離キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃ Ａ）またはＭｉｃｒｏ Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用い、全ＲＮＡから単離し、２０ μｇの全ＲＮＡまたは２μｇのｍＲＮＡを変性ホルムアルデヒドアガロースゲル （１．１％）でサイズ分画し、製造業者の手法に従い、０．０５Ｍ ＮａＯＨ緩 衝液中でキャピラリーブロッティングすることによってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ⁺膜（ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈ ｔｓ、ＩＬ）に移した。ノーザンブロットフィルターを、１００μｇ／ｍｌ変性 サケ精子ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有する ５×デンハルト、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ溶液中、 ４２℃で３時間プレハイブリダイズさせ、続いてランダム起点ＤＮＡ標識キット （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，Ｉｎｄｉ ａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用い、［アルファ−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎ ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）で標識した変性 プローブを添加して新鮮なプレハイブリダイゼーション溶液中で一晩ハイブリダ イズさせた。フィルターを、０．２×ＳＳＣ；０．１％ ＳＤＳの最終ストリン ジェンシーまでストリンジェンシーを増大させて、５５℃で洗浄した。オートラ ジオグラフィーは、増感スクリーンを含むＫｏｄａｋ Ｘ−Ｏｍａｔフイルムを 用い、−８０℃で２日間にわたって行った。再プロービングには、０．５％ＳＤ Ｓ水中で１０分間沸騰させるブロットによって元のプローブを取り出した。 ｍＲＮＡ分別表示 １０％胎児ウシ血清および２５０ｎＭデキサメタゾンを補足したＲＰＭＩ培地 中で７０％密集まで増殖させたＡＴ２．１、ＡＴ３．１およびＡＴ６．１細胞か らの全ＲＮＡのＤＮａｓｅＩ消化した２μｇを、３５℃にて、プライマーとして の２．５ μＭのＴ １１ ＡＧおよび２０μＭのｄＮＴＰの存在下で、３００ユニットの ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で６０分間逆転写させた。９５℃ における５分間の逆転写酵素の熱不活化の後、２μｌの試料を、［α−³⁵Ｓ］ｄ ＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）の存在下、Ｔ１１ ＡＧプ ライマーおよび任意の１０量体でのＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲパラメータ ーは３０秒間の９４℃、１分間の４２℃、および３０秒間の７２℃の４０サイク ル、続いて７２℃における５分間の伸長であった。ＰＣＲ産物を６％ポリアクリ ルアミドゲルで分画し、オートラジオグラフィーで可視化した。分別発現された バンドを乾燥ゲルから切り出し、プライマーの対応するセットを用いるＰＣＲに よって再増幅した。再増幅したＰＣＲ断片をノーザンブロット分析のためのプロ ーブとして用いた。 ｃＤＮＡラリブラリースクリーニング 培養中のＡＴ３．１から得られたポリアデニル化［ポリ（Ａ）⁺］ＲＮＡを用 い、オリゴ（ｄＴ）起点ｃＤＮＡラリブラリーを、ラムダｇｔ１０ベクター（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ）中に構築した。該ラリブラリーを、鋳型として分別表示から単 離した３４３塩 基対ＡＴ３．１ｃＤＮＡを用い、ＰＣＲによって生じた³²Ｐ−標識プローブでス クリーニングした。フィルターを、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有 する５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ溶液中、６５℃で一晩プローブとハイブリダ イズさせた。０．２×生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）および０．１％ ＳＤＳでの６５℃における高ストリンジェンシーにて洗浄した。陽性クローンの インサートを、ＥｃｏＲＩ酵素でλｇｔ１０ベクターから切り出し、ｐｂｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋／−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンし、Ｓｅ ｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０配列決定キット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて配列決定した。 ＲＴ−ＰＣＲ分析 各細胞系からの全ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲ Ｌ、Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で消化した。ＤＮａｓｅ Ｉ消化の５μｇ の全ＲＮＡを、ｃＤＮＡサイクリングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて 逆転写させた。逆転写混合物をＳＰｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ３００（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で精製した。 １０μｌの精製ｃＤＮＡを、各々、Ｔβ１５順方向プライマー：５’−ＴＡＴＣ ＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＧ−３’（配列番号：８）および逆方 向プライマー：５’−ＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＴＣＡＧＧＧＴ−３ ’（配列番号：９）；Ｔβ４順方向プライマー：５’−ＡＣＴＣＴＣＡＡＴＴＣ ＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＣ−３’（配列番号：１０）、逆方向プライマー：５ ’−ＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＣＴＣＴＣＣＴＴＧ−３’（配列番号 ：１１）；およびＴβ１０順方向プライマー：５’−ＡＴＡＡＴＡＴＣＣＣＴＧ ＧＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧ−３’（配列番号：１２）、逆方向プライマー：５’ −ＧＡＧＴＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣ−３’（配列番号：１３ ）のプライマーセットで増幅した。ＰＣＲ増幅は、５０μｌの鉱油（Ｓｉｇｍａ ）を重層した、１ｍＭのｄＮＴＰ、５０ピコモルの各プライマーおよび２．５Ｕ のＴａｑポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ）を含む５０μｌのＰＣＲ反応緩衝液（５０ ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス［ｐＨ８．５］、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中 で行った。ＰＣＲプロフィールは３０秒間の９４℃；３０秒間の６０℃；および ２分間の７２℃の３０サイクルであった。ＲＴ−ＰＣＴの対照実験 は、同一試料からのアリコートを用いて行い、β−アクチン遺伝子（Ｃｌｏｎｔ ｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）に対するプライマーで増幅した。増幅産物 は１．４％アガロースゲルで分離した。 イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション 真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に挿入されたＴβ １５ ｃＤＮＡを鋳型としておよびジゴキシゲニンＲＮＡ標識キット（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）を用いて、アンチセ ンスおよびセンスＴβ１５ ｍＲＮＡを調製した。ホルマリン−固定したパラフ ィン−埋没切片を脱蝋し、再水和させ、１００ｍＭトリス、５０ｍＭ ＥＤＴＡ 緩衝液（ｐＨ８）中にて３７℃で８分間、プロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ） で消化した。ハイブリダイゼーションは、液体カバーグラス下の切片当たり、１ ００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオンしたホルムアミド、 ４×ＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸、１％ＳＤＳ、および変性ニシン精子ＤＮ Ａ（４００μｇ／ｍｌ））中の１０ｐＭジゴキシゲニン標識リボプローブを用い 、自動装置（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）にて、４２℃で６０分間行った。ポストハイブリダイゼー ション洗浄の最高ストリンジェンシーは０．１×ＳＳＣ中での１５分間の４５℃ におけるものであった。結合したジゴキシゲニン標識プローブは、抗−ジゴキシ ゲニンアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートによって検出し、ニトロブルー テトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ ＮＢＴ−ＢＣＩＰ）発色反応によって可視化した。切片をヌクレアーファースト レッドで逆染色した。 ＧＳＴ−Ｔβ融合蛋白質の発現 Ｔβ１５およびＴβ４の全コーディング領域を含有するＰＣＲ生成のＤＮＡ断 片を、真核生物発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａ ｔａｗａｙ，ＮＪ）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位にインフレーム連結した。該 ｐＧＥＸ−Ｔβ融合体を、０．１ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド と３時間インキュベートすることによってエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αで発現させた。細胞を遠心によって回収し、洗 浄し、０．１５μ／ｍｌアプロチニンおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するリン酸 緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させ、音波処理によって溶解 させた。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加し た後、無傷細胞および夾雑物を遠心によって除去した。上清をＰＢＳ中のグルタ チオン−アガロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の５０％（ｖ／ｖ）スラリーとイン キュベートした。ビーズを過剰のＰＢＳで洗浄し、カラムに注いだ後、融合蛋白 質を５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１０ｍＭ還元グルタチオン（Ｓ ｉｇｍａ）を含有する溶液で溶出させた。 アクチン結合実験 ピレン−標識Ｇ−アクチンは従前に記載されているごとくに調製した（Ｋｏｕ ｙａｍａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４、３３−３８（１９８１）） 。重合の最終程度は従前に記載されているごとくにピレン−標識アクチンの蛍光 の最終レベルから決定した（Ｊａｎｍｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｔｒｙ２４、３ ７１４−３７２３（１９８５））。 トランスフェクション Ｔβ１５ ｃＤＮＡを、構成的ヒト・サイトメガロウイルスプロモーターに対 してセンスまたはアンチセンスいずれかの向きにてｐｃＤＮＡ３にクローン化し 、リポフェクチン（ＧＥＢ ＣＯ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて細胞にトランスフェク トした。個々の安定なトランスフェクタントを、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含有する培地中で選択した。対照トランスフェクション はＴβ１５を欠くｐｃＤＮＡ３で行った。 細胞移動性 トランスフェクタントの移動は従前に記載されているごとくにマルチウェルチ ャンバーアッセイを用いて実験した（Ｋｕｎｄａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３０、７２５（１９９５））。４８−ウェル化学走性チャンバーに、１１．５ μｇ／ｍｌフィブロネクチン（Ｃａｐｐｌｅ Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃ ａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を含有するＰＢＳでプレコートした８−μｍ多孔度の ポリカルボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｐｌｅａｓ ａｎｔｏｎ，ＣＡ）を重ねた。下方ウェル中の胎児ウシ血清に向かう上方ウェル 中に入れた５，０００細胞の移動は、３７℃における４時間のインキュベーショ ンに続いてアッセイした。フィルターの上側から細胞を取り出したのち、フィル ターを通過し、下側に接着した細胞をホルマリン中で固定し、ＰＢＳで洗浄し、 ギル（Ｇｉｌｌ） のトリプル強度ヘマトキシリン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔ ｏｎ，ＰＡ）で染色し、光学顕微鏡下で計数した。 ポリクローナル抗体の生成 ３８０ｍｌの０．１２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させたサイモシ ンβ１５の１１カルボキシル末端アミノ酸を表す０．２５ｍｇの合成オリゴペプ チド（ＩＱＱＥＫＥＹＮＱＲＳ）を、１．０ｍｇのキイホールリンペットヘモシ アニン（Ｓｉｇｍａ）を含有する反応容器にピペットで入れた。次いで、２０μ ｌの２５％水性グルタルアルデヒド溶液を添加した。温和な撹拌、室温での最初 の３時間および次いでの４℃での１２時間の後、反応混合物を０．１５Ｍ Ｎａ Ｃｌで１００μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。次いで、希釈された混合物を免 疫化に使用し、ニュージランド白色ウサギを、ＣＦＡで乳化したＫＬＨコンジュ ゲートとしてのサイモシンβ１５の３０μｇのＣ−末端ペプチドで免疫化した。 最初のブースター注射は最初の免疫化の６週間後に与え、他方、引き続いてのブ ースター注射は３週間間隔で与えた。生成血液が第５ブーストの２週間後に得ら れた。抗血清を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４） にてＣ−末端ペプチドコンジュゲーテッドＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂカ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で精製した。カラムを０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ ｍＭトリス（ｐＨ７．４）で十分洗浄した後、カラムを０．２Ｍグリシン、０． ２ＭＮａＣｌ、ｐＨ２．０で溶出させた。溶出した画分の純度および特異性はウ ェスタン分析によって調べた。 ウェスタン分析 ＧＳＴ−Ｔβ融合蛋白質を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動させ 、ニトロセルロース膜（０．２ｍｍ、Ｓｃｈｉｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅ ｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｔ ＢＳ−Ｔ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水中、５％無脂肪乾燥乳とでインキュ ベートし、続いて１：１０００希釈したアフィニティー精製抗Ｔβ１５のＣ−末 端ペプチド抗体と共に１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次 いで、ブロットをホースラディッシュペルオキシダーゼ複合抗ウサギＩｇＧ抗体 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）と共に４０分間インキュベートし、特異的抗 体反応を増強された化学ルミネセンス検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．） によって検出した。 免疫組織化学染色 イムノペルオキシダーゼＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ，ＣＡ）を用いて、ヒト前立腺癌切片を実験した。略言すると、５μｍの組織切 片をキシレン中で脱パラフィン化し、グレードアルコール中で再水和させ、メタ ノール中の３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ）によって内因性ペルオキシダーゼにつ き３０分間ブロックした。該切片を正常ヤギ血清で３０分間処理し、次いで、室 温にて１：１００（ｖ／ｖ）希釈にてアフィニティー精製抗Ｔβ１５のＣ−末端 ペプチド抗体と共に２時間インキュベートし、続いてビオチン化ヤギ抗−ウサギ ＩｇＧ抗体と共に３０分間インキュベートした。予め形成されたＡＢＣ複合体と の３０分間のインキュベーション後、特異的に結合した抗体を、ペルオキシダー ゼ基質、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）を用い ることによって可視化した。切片をギルのヘマトキシリンで逆染色した。 結果 Ｔβ１５のクローニング 本発明者らは、Ｄｕｎｎｉｎｇラット腫瘍；弱く転移性の貧 弱な移動性の系ＡＴ２．１および高度に転移性で高度に移動性の系ＡＴ３．１お よびＡＴ６．１の３種の変異体について、ｍＲＮＡ分別表示分析（Ｌｉａｎｇ， Ｐ．およびＰａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７．９６７−９７１ （１９９２））によって遺伝子発現を比較した。分別表示（図１Ａ）によってよ り移動性のＡＴ３．１およびＡＴ６．１系で検出された１つのバンドは、ノーザ ン（ＲＮＡ）分析によって、ＡＴ３．１、ＡＴ６．１ならびに関連ＭａｔＬｙｌ ｕ細胞系においてほぼ４２０ヌクレオチドの過剰発現されたｍＲＮＡを表すこと が確認されたが、貧弱な移動性のＡＴ２．１（図１Ｂ）では発現されなかった。 当該遺伝子はノーザン分析によって特徴付けられた他のラット前立腺細胞系（非 転移性）では発現されなかった（データは示さず）。 この遺伝子の全長相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得るために、プローブとして分 別表示からの元々クローン化されたｃＤＮＡを用い、ＡＴ３．１ｃＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングした。４１２塩基対インサートを持つ陽性クローンを単 離したが、これは４５アミノ酸の蛋白質をコードする単一オープンリーディング フレームを含有し、計算された分子量は５３０４で あった（図２）。該クローンのインサートのサイズはノーザン分析で観察された 転写体の分子サイズとほぼ同一であり、これは、該クローンが全長遺伝子配列を 含有することを示唆した。ＧｅｎｅｂａｎｋおよびＥＭＢＬ ＤＮＡデータベー スに対するコンピューターによる相同性サーチは、該新規遺伝子がラットサイモ シンβ４およびβ１０と４９％のヌクレオチド配列相同性を有することを明らか とした。クローン化遺伝子の推定アミノ酸配列をサイモシンβファミリーのメン バー（Ｍｉｈｅｌｉｃ,Ｍ．およびＶｏｅｌｔｅｒ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ６、１−１３（１９９４）とを整列させると、サイモシンβ４との６８％相同性 、サイモシンβ１０との６２％相同性およびβ９、β１１およびβ１２との６０ ％相同性が示された（図３）。結果は、本発明者らが、ラット前立腺癌腫細胞か ら今回サイモシンβ１５と命名した新規βサイモシンをクローン化したことを示 した。 サイモシンβ１５蛋白質配列のヒドロパシー分析は、明らかな膜貫通または膜 会合領域を見いだせず、また、アミノ末端シグナル配列も見いだせなかった。該 蛋白質は高度に親水性であり、推定等電点は５．１４であって、サイモシンβフ ァミリー の全てのメンバーに共通の領域を含有する。例えば、従前に研究されている全て のβ−サイモシンファミリーメンバーはアミノ末端からの推定アクチン結合性領 域（ＬＫＫＴＥＴ）１６残基を有する（Ｖａｎｃｏｍｐｅｒｎｏｌｌｅら、ＥＭ ＢＯ Ｊ．１１、４７３９−４７４６（１９９２）、Ｔｒｏｙｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．１５、２０１−２１０（１９９６））。サイモシンβ１５もかかる領域を有 するが、グルタミン酸残基がアスパラギン残基によって置き換えられてＬＫＫＴ ＮＴを形成する（図３）。サイモシンβファミリーのメンバー間で一致していな い主たる領域は、カルボキシル末端で起こり、およびサイモシンβ１５配列は他 のファミリーメンバーと同様にこの領域で有意な相同性を示さない。 β−サイモシンファミリーのメンバーは、独立して、異なる組織で発現され得 る（Ｌｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、２３３４７−２３３５３（１ ９９１）、Ｖｏｉｓｉｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６４、１０９−１２０ （１９９５））。サイモシンβ１５はテストした前立腺癌腫細胞系で分別発現さ れるが、これらの細胞系の全ては、ＲＴ−ＰＣＲ分析によると、同等レベルのサ イモシンβ４およびβ１０を発現 した（図１１）。サイモシンβ１５ ｍＲＮＡの組織分布をラットの主要な器官 で調べた。心臓、脳、肺、牌臓、肝臓、骨格筋および腎臓ではサイモシンβ１５ の発現は検出されず、他方、睾丸では高い発現が見い出された（図４）。サイモ シンβ１５ｃＤＮＡプローブでのＡＴ２．１およびＡＴ３．１細胞からのＨｉｎ ｄＩＩＩ−、ＥｃｏＲＩ−およびＰＳｔＩ−制限ＤＮＡのサザーン（ＤＮＡ）分 析により、腫瘍細胞にサイモシンβ１５遺伝子の正味の構造改変がないことがわ かった（データは示さず）。これらの結果は、サイモシンファミリーの新規メン バーは、転移性ラット前立腺癌腫細胞系で上昇調節させる一方で、他のサイモシ ンβ１５メンバー（β４およびβ１０）の発現は変化しないままであることを示 している。 ＲＴ−ＰＣＲによるヒト・サイモシンβ１５のクローニング ヒト前立腺癌腫細胞系ＰＣ−３からの５μｇのＤＮａｓｅＩ消化した全ＲＮＡ を、ｃＤＮＡサイクリングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した 。逆転写混合物をＳｐｉｎカラム３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ，ＮＹ）で精製した。１０μｌの精製ｃＤＮＡ反応物を、サイモシンβ１ ５配列の外方端部にアニールするように設計したプラ イマーＦ１（５’−ＴＡＴＣＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＧ−３’ ）（配列番号：８）およびＲ１（５’−ＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＴ ＣＡＧＧＧＴ−３’）（配列番号：９）で増幅した。ＰＣＲ増幅は、５０μｌの 鉱油（Ｓｉｇｍａ）と重ねた、１ｍＭのｄＮＴＰ、５０ピコモルの各プライマー および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含む５０μｌの ＰＣＲ反応緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中で行った。ＰＣＲプロフィールは３０秒間の９４℃；３０ 秒間の６０℃；および２分間の７２℃の３０サイクルであった。ＲＴ−ＰＣＲの 対照実験は同一試料からのアリコートを用いて行い、β−アクチン遺伝子に対す るプライマーで増幅した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。増 幅産物は１．６％アガロースケルで分離した。増幅されたＰＣＲ産物は、ＴＡク ローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、 ｐＣＲに連結させ、次いで、ＤＮＡ配列決定した。サイモシンβ１５プライマー によつて増幅したヒト前立腺癌腫細胞のＰＣＲ産物は、驚くべきことに、ラット 前立腺癌腫細胞から得られたサイモシンβ１５配列と１００％ 同一であった。 ヒト前立腺癌におけるＴβ１５ ｍＲＮＡの発現 このサイモシンファミリーメンバーがヒト前立腺癌で発現され得るか否かを決 定するために、本発明者らは、サイモシンβ１５についての順方向および逆方向 プライマーでのＲＴ−ＰＣＲによってヒト前立腺癌腫細胞系ＰＣ−３を調べた。 該ＰＣ−３細胞は低レベルのサイモシンβ１５発現を示した。増幅されたＰＣＲ 産物のＤＮＡ配列はラット・サイモシンβ１５配列と１００％同一であった。本 発明者らは、サイモシンβ１５プローブを用い、種々の程度の前立腺癌腫を持つ 患者からの試料につきイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション実験を行った。 組織切片は、同一試料についての正常および悪性要素の直接比較を可能とした。 腫瘍細胞塊内またはその回りのストローマ要素、該腫瘍に隣接した非悪性前立腺 上皮はサイモシンβ１５アンチセンスプローブてのバックグラウンドハイブリダ イゼーションをほとんど示さなかった。対照的に、特異的腫瘍細胞島は、アンチ センスでプローブした場合（図５Ａ、小さい矢印）、強い特異的サイモシンβ１ ５シグナルを呈したが、センスＲＮＡプローブでプローブした場合は呈さなかっ た（データは示さ ず）。陽性島における腫瘍細胞のほとんど全てはサイモシンβ１５ ｍＲＮＡを 発現し、全ての患者の被検体が陽性ではなく、単一前立腺における全ての島が陽 性ではなかった（図５Ａ、大きい矢印）。陰性腫瘍細胞の大部分は非侵入性イン ・サイチュ癌腫にあり、他方、高度に侵入性の腫瘍は一貫して陽性であった（図 ５Ｂ）。このように、新規なβサイモシンは、転移性ラット前立腺癌腫で最初に 検出され、ヒト前立腺癌で上昇調節される。 アクチン重合に対するＴβ１５の効果 サイモシンβ１５は推定アクチン−結合ドメインを保持するので、本発明者ら は、組換え融合蛋白質を用いてアクチン重合に対するその効果をテストした。図 ６Ａに示された結果は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／サ イモシンβ１５融合蛋白質が、ＧＳＴ／サイモシンβ４融合蛋白質と同等または それよりもわずかに大きくピレン−誘導体化アクチンモノマーの重合を阻害する ことを明らかとし、これは、これらの２つの蛋白質が同様のアクチン−隔離特性 を有することを示唆する。同様の結果が、サイモシンβ１５をトロンビンでＧＳ Ｔ−融合蛋白質から開裂し、引き続いてアクチン重合の速度お よび程度を阻害するその能力につき分析した場合に得られた（図６ＢおよびＣ） 。遊離およびＧＳＴ−融合サイモシンβ１５間のアクチンについての見掛けの親 和性の差は、アクチンにより強く結合するか、あるいは成長するフィラメントの 端部に結合し、それにより、全アクチンに対して低モル比で重合を阻害する２つ のアクチンモノマー結合性部位とで複合体を形成する融合ペプチドのＧＳＴ−媒 介重合に関連するようである。かかる効果の１つの例はアクトビンジンによるア クチン組立の強い遅延であり、これはサイモシン様アクチン結合性部位のダイマ ーとして機能するようである（Ｂｕｂｂら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４、 ３９２１−３９２６（１９９５））。 細胞移動性に対するＴβ１５の効果 サイモシンβ１５発現が細胞移動性に対して効果を有するか否かを判断するた めに、本発明者らは、構成的ヒト・サイトメガロウイルスプロモーターによって 駆動されるアンチセンス向きにサイモシンβ１５遺伝子を含有する真核生物発現 ベクター（ｐｃＤＮＡ３）で高度に移動性のＡｔ３．１細胞をトランスフェクト した。選択（Ｇ４１８）培地で増殖するトランスフェクトされた細胞を、鎖−特 異的ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ） 増幅（Ｚｈｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２、４２８０−４２８５（１９９ ２））によって、サイモシンβ１５遺伝子のアンチセンス転写体の発現につき調 べた。胎児ウシ血清を移動刺激として用いる、マルチウェルＢｏｙｄｅｎチャン バー装置（Ｂｏｙｄｅｎ，Ｓ．Ｖ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １１５、４５３− ４６６（１９６２））を用いる細胞移動性の分析は、アンチセンス転写体の発現 を示したトランスフェクタントの移動性がベクターのみの対照に対して有意に減 少することを示した（図７Ａ）。アンチセンス転写体を発現しなかった２つのア ンチセンストランスフェクトクローンはどのような細胞移動性の速度の減少も示 さなかった（データは示さず）。さらなる実験において、センスサイモシンβ１ ５構築体でトランスフェクトし、ノーザン分析によってサイモシンβ１５を発現 することが確認された貧弱に移動性のＡＴ２．１細胞は、それらのベクター対照 に対して有意に減少した刺激移動性を有することが示された（図７Ｂ）。センス およびアンチセンス両サイモシンβ１５トランスフェクタントは対照に対して同 様速度の細胞増殖を示し、これは、異なる細胞事象についての異なる特異性を示 唆する（図７Ｃ）。結果は、高度に移動性のＡｔ３．１および ＡＴ６．１Ｄｕｎｎｉｎｇ腫瘍細胞系で上昇調節されるサイモシンβ１５が、癌 転移性の重要な構成である細胞移動性の陽性レギュレーターであることを示す。 前立腺癌腫におけるＴβ１５の免疫組織化学的検出 サイモシンβ１５の１１Ｃ−末端アミノ酸を表すペプチドに対してポリクロー ナル抗体を生起させた。合成したペプチドを担体のキイホールリンペットヘモシ アニン（ＫＬＨ）と結合させ、ウサギに注射した。Ｃ−末端ペプチド結合ＣＮＢ ｒ−活性化セファロース４Ｂカラムで抗血清をアフィニティー精製した。精製し た抗体の特異性をテストするために、本発明者らは、アフィニティー精製した抗 Ｃ−末端抗体でＧＳＴ／サイモシンβ融合蛋白質のウェスタン分析を行った。精 製抗体は、ＧＳＴ−サイモシンβ１５融合蛋白質と強く反応したが、ＧＳＴ−サ イモシンβ４とは交差反応せず、ＧＳＴ単独とは交差反応せず（図８）、その特 異性を示している。 本発明者らは、ヒト前立腺癌腫の免疫組織化学的実験のためにアフィニティー 精製ポリクローナルサイモシンβ１５抗体を使用した。結果を以下の表１にまと める。サイモシンβ１５免疫染色は新形成前立腺での上皮細胞で観察されたが、 正常前立 腺では、およびストローマ細胞では観察されなかった（図１０Ａ、大きい矢印） 。調べた悪性上皮の内、貧弱に分化した前立腺癌腫は最も広範囲で強いサイモシ ンβ１５免疫反応を示し（図１０Ｃ）、続いて中程度に分化した前立腺癌腫であ り、全ての癌腫がサイモシンβ１５を発現するというのではなく、部分的な陽性 を示している（図１０Ｂ）。あるケースではハイグレード前立腺上皮内新形成（ ＰＩＮ）はサイモシンβ１５免疫染色を示したが、その程度は低かった（図１０ Ａ、小さな矢印）。貧弱に分化した侵入性癌腫において、単一細胞侵入ストロー マは強い染色を示した（図１０Ｄ）。サイモシンβ１５の発現はグレアソングレ ードの前立腺癌腫によく相関している。 表１ ヒト前立腺癌腫におけるサイモシンβ１５の発現 （ＢＰＨ−良性前立腺過形成；Ｃａ−癌腫） ａ．陽性を示す１０％未満の細胞 ｂ．陽性を示す細胞の３０−７０％で不均一に染色 ｃ．陽性を示す細胞の７５−１００％で均一に染色 サイモシンβ１５が他の種類の癌細胞で発現され得るか否かを判断するために 、本発明者らはノーザン分析によってマウス肺癌腫細胞系をテストした。結果は 、転移性細胞系Ｍ２７およびＨ５９におけるサイモシンβ１５発現を示したが、 非転移性細胞系ＬＡ−４における発現は示さなかった（図９）。 考察 転移段階への進行は前立腺癌腫からの移動性に直接相関している。従って、転 移性進行の初期診断、防止または治療はこの病気のより効果的制御に導くであろ う。Ｄｕｎｎｉｎｇ Ｒ−３３２７ラット前立腺の腺癌モデルは、種々の転移性 能力を持ついくつかのサブ系を提供し、その全てはオリジナルの自然発生腫瘍に 由来するもので、前立腺癌転移に至る段階を研究する機会を提供する（Ｍｏｈｌ ｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．１２、５３−６７、１９９３およ びｐｉｅｎｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ １１、２５５−２６３（１ ９ ８３））。Ｄｕｎｎｉｎｇ細胞内で遺伝子発現を比較することによって、本発明 者らは、サイモシンβファミリーの新規メンバーであるサイモシンβ１５をクロ ーン化し、これは高度に転移性の前立腺癌で発現されるか、非転移性または弱転 移性細胞では発現されない。関連するファミリーメンバーのサイモシンβ４およ びβ１０はテストした細胞系の全てで同等に発現され、従って、それらの発現は 増大する転移可能性によっては変化しない。 サイモシンβ１５はＧ−アクチンに結合し、アクチン重合を遅延させる。高度 に移動性の前立腺癌細胞系はサイモシンβ１５の高レベル発現を示したので、本 発明者らは、Ｄｕｎｎｉｎｇラット癌腫細胞系へのサイモシンβ１５トランスフ ェクションが細胞移動性に影響し得るか否かをテストした。本発明者らの結果は 、センスもしくはアンチセンスサイモシンβ１５構築体のラット前立腺癌腫細胞 へのトランスフェクションが刺激細胞移動を有意に変調できること、すなわち以 前β−サイモシンに関連付けられていなかった特性を明らかに示している。癌で は、結合組織を通じての悪性腫瘍細胞の増強された移動性は、転移段階に向けて の進行に対する主要な寄与である。転移への順に おいて、腫瘍細胞は最初に一次腫瘍からバラバラにされ、結合組織および毛細血 管壁を通って二次部位に移動しなければならない。従って、悪性前立腺癌腫細胞 におけるサイモシンβ１５発現の増加は、転移に向けての腫瘍進行の重要な変化 を媒介すると考えられ、サイモシンβ１５のその発現は癌悪性性の診断および予 後についての有用なマーカーである。 細胞移動性は、典型的には、協調された組立崩壊および皮質アクチンネットワ ークの再形成と関連付けられる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５１、１２３３−１２３６（１９９１）、Ｈａｕｇｗｉｔｚら、Ｃｅｌｌ ７９ 、３０３−３１４（１９９４）およびＳｔｏｓｓｅｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０ 、１０８６−１０９４（１９９３））。サイモシンのアクチン結合機能の活性化 または増強された発現は、従って、このプロセスの脱重合を増強することによっ て移動性を刺激し得る。アクチン重合を遅らせるよう作用する分子が細胞移動性 を刺激し得るという知見は、ジクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ）細胞におけるアクチンキャッピング蛋白質の過剰発現は細胞移動性の増大した 速度に至ることを示すＨｕｇら（Ｈｕｇら、Ｃｅｌｌ ８１、５９１−６００（ １９９５）） の最近の知見と合致する。アクチン脱重合および増大した移動性の間の関係につ いての知見も、サイモシンβ１５の上昇調節が転移段階への前立腺癌腫の進行に おいて重要なステップを表し得るという本発明者の仮説を支持する。 より高度に転移性のラット前立腺癌細胞系において上昇調節されるサイモシン β１５がヒト前立腺癌においても上昇調節されるという知見は興味深い。現在、 ＰＳＡ発現のごとき前立腺癌のための最良のマーカーは前立腺癌の初期検出で最 も有用である。しかしなから、それらマーカーは非転移性腫瘍と転移性腫瘍との いかなる区別もしない。 その好ましい実施形態を含め、本発明を詳細に記載してきた。しかしながら、 当業者ならば、この開示を考慮すると、請求の範囲に記載された発明の精神およ び範囲を逸脱することなくその修飾および改良をなすことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/18 Ｃ０７Ｋ 14/18 14/47 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト・サイモシンβ１５に選択的に結合する単離された抗体または抗体断片 。 ２．該断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖ断片である請求項１ 記載の抗体断片。 ３．該抗体が一本鎖抗体である請求項１記載の抗体。 ４．該抗体がヒト化されている請求項１記載の抗体。 ５．該抗体または抗体断片が検出可能に標識されている請求項１記載の抗体また は抗体断片。 ６．配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する単離され精製されたヒト・ サイモシンβ１５。 ７．配列番号：２のアミノ酸７ないし１２、配列番号：２のアミノ酸２１ないし ２４および配列番号：２のアミノ酸３６ないし４５よりなる群から選択されるペ プチドを含む単離され精製されたポリペプチド。 ８．配列番号：２のアミノ酸配列を含むヒト・サイモシンβ１５をコードする単 離されたポリヌクレオチド。 ９．配列番号：２のアミノ酸７ないし１２、配列番号：２のア ミノ酸２１ないし２４および配列番号：２のアミノ酸３９ないし４４よりなる群 から選択されるペプチドを含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレ オチド。 １０．該ポリヌタレオチドがＤＮＡである請求項８または９記載のポリヌクレオ チド。 １１．該ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである請求項８または９記載のポリヌクレ オチド。 １２．該ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項８または９記載のポリヌクレオ チド。 １３．配列番号：１のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドま たはそれに対する相補体。 １４．配列番号：１のヌクレオチド９８−２３２のヌクレオチド配列を有するヒ ト・サイモシンβ１５をコードする単離されたポリヌクレオチド。 １５．請求項１３または１４のＤＮＡを含有する組換えベクター。 １６．請求項１５記載のベクターを含有する宿主細胞。 １７．ヒト・サイモシンβ１５を発現する新形成細胞に、ヒト・サイモシンβ１ ５の活性または生産を抑制する化合物の有効量 を投与することを特徴とする該細胞を処置する方法。 １８．該化合物がヒト・サイモシンβ１５遺伝子の発現を妨害するものである請 求項１７記載の方法。 １９．該遺伝子の発現がアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによっ て阻害される請求項１８記載の方法。 ２０．該化合物が抗体またはその断片または一本鎖抗体である請求項１７記載の 方法。 ２１．少なくとも１０のヌクレオチドを含み、配列番号：１に記載されたヌクレ オチド配列を有するＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズす る単離されたヌクレオチドセグメント。