JP2000516090A

JP2000516090A - 遺伝子的免疫化のための方法と試薬

Info

Publication number: JP2000516090A
Application number: JP10508902A
Authority: JP
Inventors: ヒュートン，アラン; バーティド，シャーリー，エム．; ユー，イイクイング; ワン，シクン
Original assignee: スローン―ケッタリングインスティチュートフォーキャンサーリサーチ
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-18
Publication date: 2000-12-05
Also published as: US20020072504A1; EP0960204A4; US6294378B1; WO1998004720A1; EP0960204A1; CA2262006A1

Abstract

(57)【要約】発現された抗原を特異的な細胞小器官に向かわせる分類シグナルをコードする遺伝子配列を取り込むＤＮＡワクチンは、免疫提示のためにクラスＩまたはクラスIIＭＨＣ分子への抗原の添加を促進する。これらのワクチンは、タンパク質またはペプチド抗原をコードする遺伝子配列と、発現された抗原を細胞内のＥＲまたはエンドソーム−リソソームコンパートメントに向かわせる分類シグナルとの核酸作成体である。得られる作成体は、リポソームにパッケージングされるか、またはコロイド金粒子上に被覆される裸のＤＮＡワクチンとして使用することができる。この作成体はまた、免疫される生物の細胞中で発現される発現ベクター中で送達される。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子的免疫化のための方法と試薬本出願は、「遺伝子的免疫化」で使用するための改良された試薬、およびより強力な免疫応答を誘発するためにこれらの試薬を使用する遺伝子的免疫化法に関する。免疫応答の作成と制御は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、循環抗体、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の間の相互作用の複雑なシステムの結果である。タンパク質抗原に対する体液性および細胞性免疫応答の誘導には、ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞による抗原の認識を必要とする。この理由は、Ｂリンパ球の増殖と分化を刺激するために、および細胞性免疫のエフェクター細胞（マクロファージおよび細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む）を活性化するために、ヘルパーＴ細胞が必要であるためである。簡単に説明すると、外来抗原はＡＰＣによりプロセシングされ、これにより主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスII分子（ヒト白血球抗原またはヒトのＨＬＡクラスＩおよびクラスIIタンパク質と呼ばれる）に結合した抗原由来ペプチド断片が生成される。ＡＰＣの細胞表面に見いだされるこれらの複合体が、次にＴＨ細胞に提示される。Ｔ細胞によるペプチド −ＭＨＣ複合体の認識は、Ｔ細胞活性化を開始させる刺激である。すなわち、ペプチド−ＭＨＣ複合体のより効率的な提示は、より効率的なＴ細胞活性化につながる。活性化により、サイトカインの分泌、増殖、制御性または細胞溶解性エフェクター機能につながり、これらは、一部は抗原を提示する細胞を排除することにより、すべて免疫につながる。抗原を発現する細胞のＴ細胞性排除は、３つの方法で行われる。第１に体液性応答は、活性化ＴＨ細胞が特異的Ｂ細胞クローンの増殖と分化を刺激して抗体を産生し、これが最終的に抗原ならびに細胞外抗原を発現する細胞を排除する時に起きる。第２に、細胞性応答は、サイトカインがＴ細胞を活性化してＣＴＬに分化させる時に起きる。感染した標的細胞は次に、ＣＴＬにより溶解される。内因性抗原（例えば、ウイルスおよび腫瘍抗原）はクラスＩ限定ＣＴＬを活性化し、これがこれらの細胞内抗原を産生する細胞を溶解する。第３に、非特異的応答は、抗原活性化Ｔ細胞が、炎症性細胞（例えば、抗原に対して特異的ではないマクロファージおよびナチュラルキラー細胞）を動員し活性化するサイトカインを分泌する時に起きる。従って全体的に、Ｔ細胞は、広い免疫応答を動員するのに中心的な役割を果たす。本明細書において、「遺伝子的免疫化」という用語は、ＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド抗原に対する免疫応答を引き起こすためのワクチンとしてのＤＮＡの使用を意味する。裸のＤＮＡの筋肉内投与は、体液性および細胞性免疫応答の両方を誘発することが証明されている。ＤＮＡワクチンが免疫応答を誘発する正確な機構は不明であるが、いくつかの可能性が論じられている。パルドール（Pardoll）ら、「裸のＤＮＡワクチンの免疫学の解明」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３：１６５−１６９（１９９５）を参照されたい。しかしその機構に関係なく、体液性および細胞性免疫を引き起こすＤＮＡワクチンの有効性は、投与後に裸のＤＮＡが発現され、タンパク質またはペプチド生成物が、クラスＩおよびクラスIIタンパク質とともに抗原として提示されることを示す。クラスＩおよびクラスII分子による抗原のプロセシングと提示は、細胞内の異なる小器官中で起きる。具体的には、小胞体（ＥＲ）は、細胞質由来のペプチド抗原がクラスＩ分子へ添加される部位であることが証明されており、エンドソーム／リソソームは、クラスII分子にペプチド抗原が添加される部位であることが証明されている。すなわち、免疫応答の型と免疫応答が生成される程度は、ＥＲやエンドソーム添加部位に達する抗原の量に大きく依存する。従って、最適の免疫応答を与えるために、細胞内の所望の場所内の抗原の蓄積を指令し調節することができることが非常に好ましい。本発明の目的は、特異的細胞小器官内の選択された抗原の移送と安定性を調節することであり、遺伝子的免疫化を増強するためにこの方法を使用することである。本発明のさらなる目的は、発現された抗原を特異的な細胞小器官に向かわせ、免疫提示のためにクラスＩまたはクラスIIＭＨＣ分子への抗原の添加を促進する分類シグナルをコードする遺伝子配列を取り込むＤＮＡワクチンを提供することである。本発明のさらに別の目的は、発現された抗原を特異的な細胞小器官に向かわせ、免疫提示のためにクラスＩまたはクラスIIＭＨＣ分子への抗原の添加を促進する分類シグナル（sorting signal）をコードする遺伝子配列を取り込むＤＮＡワクチンを利用する、遺伝子的免疫化法を提供することである。発明の要約本発明のこれらのおよび他の目的は、タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子配列と、発現された抗原を細胞内のＥＲまたはエンドソームーリソソームコンパートメントに向かわせる分類シグナルとの作成により達成される。得られる作成体は、ＤＮＡワクチンとして有用であり、裸のＤＮＡとして使用でき、リポソーム内にパッケージングされるか、またはコロイド金粒子に被覆することができる。作成体はまた、免疫される生物の細胞内で発現される発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）中で送達される。図面の簡単な説明図１は、オバルブミン／ｇｐ７５融合タンパク質の３つの型を示す。図２は、本発明を使用するＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘導を示す。図３は、本発明を使用するＩｇＧ応答の誘導を示す。図４は、マウスでの腫瘍増殖に及ぼす本発明の遺伝子的免疫化の効果を示す。図５は、本発明に従って核酸作成体を生成する方法を示す。図６は、本発明に従う作成体を含有する３つの異なるプラスミドの作成を示す。図７は、本発明の作成体の免疫化による免疫化により引き起こされた免疫応答をグラフにより示す。発明の詳細な説明本発明において、遺伝子的免疫化法で使用するための核酸作成体が調製され、該作成体は、（ａ）抗原性タンパク質またはペプチドをコードする抗原コード領域；および（ｂ）エンドソーム−リソソームコンパートメントへのタンパク質またはペプチドの細胞内移送、または細胞の小胞体中へのその移送／その中での保持を指令する分類シグナル（sorting signal）として作用するタンパク質またはペプチドをコードする分類領域を含む。本明細書において「核酸作成体」という用語は、この物質は異なる供給源から一緒にスプライスされる成分から産生されるという事実を反映し、そして例えば、抗原決定基および分類シグナル領域の両方を含む、天然に存在するタンパク質をコードするＤＮＡ分子は排除する。本発明の核酸ポリマーの抗原コード領域は、目的のタンパク質またはペプチドの１つまたはそれ以上の所望の抗原決定基をコードするように選択される。すなわち、抗原コード領域は、全タンパク質またはペプチド、またはタンパク質またはペプチドの選択されたエピトープに関連するその免疫原性部分をコードしてもよい。本発明の核酸ポリマーで使用される分類領域は、発現されたタンパク質またはペプチドの、所望の細胞内の位置への細胞内移送を指令するペプチド領域を提供するように選択される。エンドソームへの発現された抗原の細胞内移送を指令する適切な分類シグナルは、以下の分子を含む：ビジャヤサラジ（Vijayasaradhi）ら、「メラノソーム膜タンパク質の細胞内分類およびターゲティング：ヒトブラウン遺伝子座タンパク質ＧＰ７５の分類のためのシグナルの同定」、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ１３０：８０７−８２０（１９９５）に記載のように、シグナル領域を含むヒトｇｐ７５（ブラウン遺伝子座タンパク質）からのシグナル GluAlaAsnGlnProLeuLeuThrAsp；配列番号１シグナル領域を含むヒトチロシナーゼ（アルビノ（albino）遺伝子座タンパク質）からのシグナル GluGluLysGinProLeuLeuMetAsp；配列番号２シグナル領域を含むヒトｇｐ１００（シルバー遺伝子座タンパク質、Ｐｍｅｌ１７）からのシグナル GluAspSerProLeuLeu；および配列番号３シグナル領域を含むヒトＰ−タンパク質（ピンクアイド（pink eyed）遺伝子座）からのシグナル GluAspThrProLeuLeu 配列番号４。発現された抗原の小胞体への細胞内移送（またはその中での保持）を指令するための適切な分類シグナルは、シグナル領域 ProSerArgAspArgSerArgHisAspLysIleHis 配列番号５を含み、これは、小胞体内にウイルス糖タンパク質を保持することが証明されている。ローズ（Rose）ら、「改変細胞質ドメインは、水庖性口内炎ウイルス糖タンパク質の細胞内移送に影響を与える」、Ｃｅｌｌ３４：５１３（１９９３）；バルチド（Bartido）ら、「クラスII提示のための小胞体内でのウイルス糖タンパク質のプロセシング」、Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２２１１１ −２２１９（１９９５）。天然に存在する分類シグナル含有タンパク質またはペプチドの変異体型も、本発明の分類領域として使用することができる。このような変異体は、細胞内の特定のコンパートメント（小胞体、エンドソーム／リソソームを含む）中でタンパク質またはペプチドをより不安定にすることにより、タンパク質またはペプチドの移送を変更することができる。例えば、グリコシル化は、異なる細胞コンパートメント内でのエンドサイトーシス的膜タンパク質を安定化するのに重要な役割を果たすため、発現された抗原／分類シグナル生成物の細胞内移送をより綿密に調節して所望の型の免疫応答を誘導するのに、グリコシル化変異体を使用することができる。ある１つのタンパク質について、一般的には複数のグリコシル化部位があり、各部位は、タンパク質の移送や分解に対するその作用において異なる重要性を有する。例えばマウスｇｐ７５の場合は、５つのＮ−グリコシル化部位があり、その１つはプロテアーゼ消化に対して強い耐性を示し、別の２つは、小胞体からのタンパク質の排出を可能にするのに重要である。他の変異体型（例えば、前記分類シグナル領域を破壊する変異体型）（特に、ＰｒｏＬｅｕＬｅｕモチーフ）もまた、本発明の方法に使用することができる。分類シグナルの野生型配列と同じ配列を有するか、またはこのような野生型の変異体変種、または野生型と同じタンパク質／ペプチド配列をコードするように合成法で作成された作成体または核酸コードの縮重に基づく変異体変種は、本明細書およびその請求の範囲において野生型タンパク質またはペプチド「から得られる」として言及される。適切な変異体の同定は、例えば部位特異的突然変異誘発により所望の変異体を作成し、次に各変異体をモデル系で試験することにより行われる。例えばｇｐ７５の場合は、図１に示す２つの変異体型を、野生型変異体と比較した。「欠失」と表示した分類シグナルペプチドは、Ａｓｎ５１１からＡｓｐ５１７にわたる領域中に導入される欠失変異（これは、分類シグナル領域の欠失を引き起こす）を有する。Ｌ２Ａと呼ぶ分類シグナルペプチドは、１つの塩基の置換（Ｌｅｕ５１４からＡｌａ５１４）により野生型と異なり、これは分類シグナルのＰｒｏＬｅｕＬｅｕモチーフを破壊する。マウス中でｏｖａに対する免疫応答を誘導する能力について図１に示すｏｖａ／ｇｐ７５作成体を試験すると、用いた分類シグナルに依存して異なる結果が得られた。図２と３に示すように、野生型配列を含有する作成体は、はるかに強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示し、変異体配列を含有する作成体は高レベルのＩｇＧ応答を示した。野生型配列を含有する融合タンパク質とＬ２Ａ突然変異を含有する融合タンパク質の両方とも、オバルブミンを発現する腫瘍細胞に対して防御を提供するのに有効であった（図４）。分類シグナルのグリコシル化変異体は同様に調製することができ、発現された融合タンパク質の細胞内の所望の領域への移送を指令する能力について試験することができる。マウスｇｐ７５上の５つの同定されたグリコシル化部位のうちの２つ（Ａｓｎ３０４とＡｓｎ３８５）での突然変異は、見かけ上小胞体内で保持されかつ分解されるタンパク質を産生した。このような突然変異分類シグナルは、ＭＨＣクラスＩ経路のペプチドを選択的に作成するために、本発明に従って融合タンパク質で使用することができる。第３の変異体型（Ａｓｎ３５０）は、野生型と同様の速度でＥＲからゴルジ装置に移送されたが、半減期ははるかに低下しており、エンドソーム中で非常に不安定であった。このような変異体は、ＭＨＣクラスII応答を指令する融合タンパク質中で使用でき、分類シグナルの分解増強は、この経路を介して提示するためにより多くのペプチドを産生する。マウスｇｐ７５のＡｓｎ１８１での突然変異は、移送速度に悪影響を与え、その結果、突然変異タンパク質は、トランスフェクション体のエンドソーム／リソソーム構造中に局在化しゴルジ装置には局在化しない傾向があった。このタイプの分類シグナルを有する融合タンパク質はまた、抗原に対するＭＨＣクラスII応答を指令するのに使用することができる。抗原コード領域および分類領域を一緒にして、コードされる融合タンパク質の正しい折り畳みを確保するために、随時リンカー領域を含有する１つの核酸ポリマーにされる。この方法の１つの適切な技術では、図５の一般的スキームを使用して、最初に別々のＰＣＲ増幅反応を利用して２つの領域（それぞれが一端にリンカーセグメントが結合している）を作成し、次にさらなるＰＣＲ工程で２つの増幅した生成物を融合する。この技術は、リンカーテイリングと呼ぶ。もちろん、他の技術やこの技術の変法を使用してもよい。例えば、抗原コード領域または分類領域がかなり短い場合は、領域を化学的に合成し、連結により他の領域に結合させてもよい。また適切な制限部位を目的の領域中に作成し、次に制限消化および連結を使用して、所望の融合タンパク質をコードする配列を作成してもよい。合成後、抗原コード領域と分類領域の両方を含有する核酸ポリマーを、哺乳動物細胞中で核酸ポリマーの発現に有効なプロモーターと一緒にする。これは、核酸ポリマーを制限エンドヌクレアーゼで消化し、プロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＤＭＶ）プロモーターまたはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター）を含有するプラスミド中にクローン化することにより行われる。得られた作成体を次に、遺伝子的免疫化のための種々のワクチンとして使用する。核酸ポリマーはまた、哺乳動物細胞を形質導入することが知られているプラスミドやウイルスベクター中にクローン化してもよい。これらのベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、およびアデノウイルス関連ベクターがある。プロモーター、抗原コード領域および分類領域を含有する核酸作成体は、直接投与するか、または投与前にリポソーム中にパッケージングするかまたはコロイド金粒子に被覆することができる。リポソーム中にＤＮＡワクチンをパッケージングする技術は当該分野で公知である（例えばムレイ（Murray）ら「遺伝子移送と発現プロトコール」、ヒュマーナプレス（Humana Pres）、クリフトン（Clift on）、ニュージャージー州（１９９１））。同様に金粒子上に裸のＤＮＡを被覆する技術は、ヤング（Yang）、「インビボでの哺乳動物体細胞への遺伝子移送」、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：３３５−３５６（１９９２）に記載されており、ウイルスベクターを使用してタンパク質を発現する技術は、ケー・アドルフ（Adolph，K.）ら、「ウイルスゲノム法」、シーアールシープレス（CRC Press）、フロリダ州（１９９６）に記載されている。本発明の組成物は、好ましくは皮内、皮下または筋肉内に、注入またはガス誘導性粒子衝撃法により投与され、宿主動物中で免疫応答を引き起こすのに有効な量で与えられる。本組成物はまた、エキソビボ（生体外）で、リポソームトランスフェクション、粒子衝撃法またはウイルス感染（同時培養法を含む）を使用して、血液または骨髄由来細胞（ＡＰＣを含む）に投与してもよい。処理された細胞は次に、哺乳動物に再導入され免疫化される。必要な物質の量は各作成体の免疫原性に依存し、あらかじめ予想できるものではないことは理解できるが、ある作成体について適切な投与量を決定する方法は直接的である。具体的には、約０．１μｇから出発して増加する一連の投与量を投与し、例えばＥＬＩＳＡ測定法を使用して抗体力価を測定するか、クロム放出測定法を使用してＣＴＬ応答を検出するか、またはサイトカイン放出測定法を使用してＴＨ応答を検出することにより、生ずる免疫応答を観察する。以下の非限定例により本発明をさらに詳細に例示する。例１本発明の従って核酸作成体の作成を示すために、ニワトリオバルブミンをコードする抗原コード領域とマウスｇｐ７５由来の分類領域とを有する作成体を作成した。この作成体中で、完全長オバルブミンと、分類配列 GluAlaAsnProLeuLeuThrAsp 配列番号１を含有するｇｐ７５のＣ−末端領域のキメラタンパク質を、９アミノ酸のリンカー SerGlyGlySerGlyGlySerGlyGly 配列番号６に結合させる。この作成体は一連のＰＣＲ反応を使用して調製した。まずアミノ酸１〜３８６をコードするオバルブミン遺伝子を、ｐＡｃ−ｎｅｏ−ＯＶＡ（ムーア（Moore ）ら、「抗原プロセシングと提示のクラスＩ経路への可溶性タンパク質の導入」、Ｃｅｌｌ５４：７７７−７８５（１９８８））から、プライマー対５’−ＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣ−３’ 配列番号７および５’−ＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣ−３’ 配列番号８を使用して増幅した。次にｇｐ７５のトランスメンブランおよび細胞質ドメイン（アミノ酸４８８〜５３９）を、ｐＳＶＫ３−ｍｐｇ７５（ビジャヤサラジ（Vi jayasaradhi）ら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３０：８０７−８２０（１９９５））から、プライマー５’−ＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＴＧ−３’ 配列番号９および５’−ＧＧＴＴＧＣＴＴＣＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧ−３’ 配列番号１０を使用して増幅した。これらの２つの増幅からのＰＣＲ産物を精製し、プライマー５’−ＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＡＧＣ−３’（配列番号１１）と５’−ＧＧＴＴＧＣＴＴＣＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧ−３’（配列番号１２）を使用して第２回のＰＣＲを行なった（図５参照）。このＰＣＲの第２相は、ｏｖａとｇｐ７５の分類領域を、その間に設計したリンカーに融合した。すなわち、この作成体は、オバルブミンからの３８６アミノ酸、リンカーからの９アミノ酸およびｇｐ７５からの６０アミノ酸とを含む４５５アミノ酸のタンパク質をコードすることができる１３６５塩基対の組合せ読みとり枠を有する。この作成体をＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化し、図６に別々に示すようにｐＳＶＫ３（ファルマシア／エルケービー社（Pharmacia/LKB Ltd.））、ｐＢＫ−ＣＭＶおよびｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社（Stratagene Inc.））中に別々にクローン化した。これらの作成体を配列決定し、その構造を確認した。ターゲティング誘導突然変異体を作成するために、突然変異体を含むＰＣＲプライマーを合成した。これらは、Ａｓｎ５１１からＡｓｐ５１７変異体の欠失のための５’−ＣＴＣＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＡＴＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＣＧ−３’（配列番号１３）と５’−ＣＧＴＴＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧ−３’ （配列番号１４）である。Ｌｅｕ５１４からＡｌａ５１４変異体の作成のために、プライマー対５’−ＧＡＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＧＣＴＴＣ−３’（配列番号１５）、および５’−ＣＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＴＧＡＴＣＡＣＴＡＴ３’ （配列番号１６）を使用した。これらの作成体を配列決定し、その構造を確認した。例２融合タンパク質の発現ならびにオバルブミン単独の発現を、異なるプロモーター下でコード性ＤＮＡを含有するプラスミドを使用して試験した。リン酸カルシウム沈殿法およびDＥＡＥ−クロロキン法により、マウスＬ細胞またはサルＣＯＳ細胞にＤＮＡを一過性にトランスフェクションした。細胞（１×１０⁵）を８ウェルチャンバースライド（ヌンク社（Nunc，Inc.））に広げ、２４時間インキュベートした。次に公知の標準的リン酸カルシウム沈殿およびＤＥＡＥ法により、細胞を０．５〜１．０μｇのＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を２４〜４８時間増殖させた後、トランスフェクション細胞中のオバルブミンの細胞内局在を測定した。抗原の免疫蛍光染色によりタンパク質を検出した。細胞を冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２％ホルムアルデヒドで固定し、メタノールで−２０℃で透過性を上げ、次にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＯＶＡ−１４（バイオメーカー社（BioMaker Inc.））でインキュベートした。次に抗原の細胞局在を、２次抗体、ＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウス抗体（ダコ社（Dako，Inc.））で染色して視覚化した。ニコン（Nikon）顕微鏡を使用して細胞を観察し、白黒フィルム（ＩＳＯ１００）を使用して写真を撮った。すべての３つのプロモーター（ＳＶ４０、ＣＭＶおよびＲＳＶ）を使用して細胞内にＤＮＡ作成体のトランスフェクション時に、タンパク質オバルブミンまたは融合タンパク質ｇｐ７５−ｏｖａの発現を観察した。さらにｇｐ７５分類領域を含有するプラスミドを細胞内に導入した時、エンドソーム−リソソーム局在化に一致して、局在化した液胞性免疫蛍光染色が観察された。これに対して、ｇｐ７５分類領域の無い対照プラスミドを導入した時、ゴルジ／ＥＲ局在化の染色に典型的なより拡散した細胞質性染色パターンが観察された。すなわち、ｇｐ７５分類領域の取り込みは、エンドサイト−シス経路の液胞コンパートメント中に含有されるタンパク質への分泌経路に運命付けられた、タンパク質（オバルブミン）の細胞内移送を劇的に変化させた。例３遺伝子的免疫化のワクチンとして作用するＯＶＡ／ｇｐ７５融合タンパク質をコードする作成体の能力を試験するために、（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＢａｌｂ／ｃ）Ｆ１マウスを、キアゲン（QIAGEN）イオン交換カラム（キアゲン社（Quiagen In c.））を使用して精製した各ＤＮＡプラスミドで免疫した。ＤＮＡ（ＰＢＳ中の２５％ショ糖溶液１００μｌ中１００μｇ）を、０日と１４日に皮下に注射した。１４日と２８日に血液試料を採取した。ＥＬＩＳＡ測定法を使用して抗体応答を追跡した。ニワトリオバルブミン（シグマ社（Sigma Inc.））を抗原として使用し、９６ウェルプレートに４℃で一晩広げた。次に希釈した血清試料を、プレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、２次抗体（アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ）を加え、プレートを１時間インキュベートした。シグマファースト（Sigma Fast）ｐ−ニトロフェニル基質を添加して、発色させた。３ＮＮａＯＨを加えて反応を停止させた。バイオラッド（Bio-Rad）ＥＩＡリーダー２５５０を使用して、異なるウェル中の吸光度を得た。結果を図７に示す。図から明らかなように、本発明の作成体を使用する遺伝子的免疫化法は、オバルブミンに対する抗体を産生するのに有効であった。ＳＶ４０プロモーターを使用した時に見られるものほど強くはなかったが、異なるプロモーターによる対応するプラスミド作成体も免疫応答を誘発した。例４キアゲン（QIAGEN）イオン交換カラム（キアゲン社（Quiagen Inc.））を使用して精製したＤＮＡプラスミドで、ＣＢＦ１マウスを免疫した。免疫用の小球を調製するために、５０mgの０．９５〜２．６μｍ金粒子（アウラゲン社（Aurage n，Inc.））を０．０５〜０．１Ｍスペルミジンと混合し、この混合物に１００ μｇのプラスミドＤＮＡを加え、ボルテックス混合しながら１．０〜２．５ＭＣａＣｌ₂を滴下して加えた。沈殿後、金／プラスミドＤＮＡ複合体を冷１００％エタノールで３回洗浄した。エタノール７mlを小球に加えて、注入当たり０．５mgの金と１．０μｇのプラスミドＤＮＡのビーズ添加率を達成した。次に金／プラスミドＤＮＡ溶液をプラスチックテフゼル（Tefzel）（登録商標）チューブに滴下し、エタノールを静かに引き出し、チューブに４００ml／分で窒素ガスを吹き付けて乾燥した。チューブを０．５インチの小球に切断し、これらを免疫化に使用した。皮下免疫化のために、すべてのマウスをメトファン（Metofa ne）吸入（ピットマン−ムーア（Pitman-Moore）、ムンデレイン（Mundelein）、イリノイナ州）で麻酔した。腹部の毛をネア（Nair）（登録商標）脱毛クリーム（カーター−ワレス（Carter-Wallace）、ニューヨーク、ニューヨーク州）を用いて除去し、脱毛した腹部の皮膚を免疫化のために露出させた。小球を、ハンドヘルド型のヘリウム誘導性遺伝子銃（アウラゲン社（Auragen Inc.））に入れた。腹部の各象限に金ビーズを１回で入れ、合計で１回の免疫化当たり４回注入して、動物を免疫した。各注入で１μｇのＤＮＡを入れ、従って合計で各免疫当たり１匹のマウス当たり４μｇのＤＮＡを入れた。各小球を１平方インチ当たり４００ポンドのヘリウム圧で腹部皮膚に入れた。インビトロ抗体応答。抗体応答を追跡するために、間接ＥＬＩＳＡ測定法を行なった。ＣＢ６Ｆ１マウスを、遺伝子銃で１週間に１回で４週間異なるプラスミド作成体で免疫し、６週目に追加免疫を行なった。毎週血清試料を採取した。精製したニワトリオバルブミン（シグマ社（Sigma Inc.））を抗原として使用し、９６ウェルプレートにウェル当たり５０μｇを４℃で一晩広げた。次に希釈した血清試料をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、２次抗体（アルカリ性ホスファターゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（シグマ社（Si gma Inc.））を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ファースト（Sigma Fast）ｐ−ニトロフェニルリン酸基質（シグマ社（Sigma Inc.））を添加して、発色させ、３ＮＮａＯＨを加えて反応を停止させた。バイオラッド（Bio-Rad）ＥＩＡリーダー２５５０（バイオラッド社（Bio-Rad Inc.））を使用して、６０５nmの吸光度を得た。完全長オバルブミンを含有する裸のＤＮＡで免疫した陽性対照群は、２週間以内に強い応答を示した（図３）。破壊された（Ｌ２Ａ）かまたは欠失（ｄｅｌ）した分類シグナルを有する変異体もまた、抗体応答を示したが、野生型オバルブミンと比較すると応答は遅れているようであった。興味深いことに、ｏｖａ／ｇｐ７５融合タンパク質は、特定の免疫化プロトコール下では抗体応答を示さなかった。この理由は不明である。しかし、多くの融合タンパク質は、Ｃ−末端の保持シグナルのため、およびＢ細胞により効率的に認識されないために、隠れていると考えられる。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖測定法。異なるＤＮＡ作成体によりＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボプライミングの効率を追跡するために、増殖測定法を行なった。ＣＢ６Ｆ１マウスを遺伝子銃で１週間に１回で２週間遺伝子銃で免疫化し、１４日目にマウスを屠殺した。セレクト（登録商標）プラス（CELLECT^TM PLUS）カラム（バイオテックスラボラトリーズ社（Biotex Laboratories，Inc.））を使用して、プールした脾細胞から、ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。精製したＣＤ４＋Ｔ細胞（３× １０⁵）を、異なる濃度の変性オバルブミンでパルスした同系の投薬を受けていない牌細胞（１×１０⁵）と、３７℃で４日間インキュベートして、インビトロ刺激した。４日目に、各ウェルに１００μCiの³Ｈ−ＴｄＲを加え、１６〜１８時間後ｃｐｍを計測した。増殖応答は、バックグランドを引いた正味ｃｐｍとして表した（図２）。ｏｖａ／ｇｐ７５融合はインビボでＴ細胞を効率的にプライムし、融合タンパク質の内因性プロセシングと提示を示唆していた。さらに、メラノソームターゲティング変異体（Ｌ２ＡとＤｅｌ）はあまりプライムせず、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を刺激するのに融合タンパク質の機能のターゲティングシグナルが必要であることを証明していた。腫瘍防御。ＣＢ６Ｆ１マウスを、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター単独、図１のｏｖａ −ｇｐ７５作成体を含有するベクター、またはｏｖａ／Ｌ２Ａ作成体を含有するベクターで、２週間毎週免疫した。１４日目に、免疫マウスに、完全長オバルブミンでトランスフェクションしたＢ１６黒色腫細胞株である１×１０⁴のＭＯ４黒色腫細胞を皮下注射して抗原刺激を行なった。１日置きに３週間、マウスを腫瘍増殖についてチェックした。「未処理」群（ｎ＝１０）はすべて、２週間以内に触知できる腫瘍を発症した。同様にベクター単独で免疫したマウス（ｎ＝１０）は、１匹を除いてすべて腫瘍を発症した。ｏｖａ／ｇｐ７５融合タンパク質をコードするベクターで免疫したマウス（ｎ＝１０）はいずれも腫瘍を発症せず、Ｌ２Ａ群では１０匹のうち１匹のみが腫瘍を発症した（図４）。この結果は、融合タンパク質作成体による免疫化により誘発される免疫応答は、インビボで腫瘍抗原刺激の防御になることを明確に示している。この方法による免疫が免疫学的記憶を誘導するかどうかを試験するために、融合ＤＮＡで免疫したマウスに、最後の免疫の５週間後に腫瘍ＭＯ４またはＢ１６黒色腫（抗原オバルブミンを発現しないＭＯ４の親黒色腫細胞株）を再度抗原刺激した。少なくとも６週間観察した時、ＭＯ４で抗原刺激した５匹のマウスのいずれも腫瘍を発症せず、Ｂ１６親黒色腫で抗原刺激した５匹のマウスのうちの２匹は、少なくとも６週間腫瘍を発症しなかった。Ｂ１６で抗原刺激した５匹の非免疫マウスのすべては、１０〜１４日以内に腫瘍を発症した。Ｂ１６親腫瘍に対する防御のために分類シグナルが必要であった。変異体分類シグナル（Ｌ２Ａ）を含有するＤＮＡ作成体で免疫した５匹のマウスは、Ｂ１６で抗原刺激した時すべて腫瘍を発症した。変異体分類シグナル（Ｌ２Ａ）を含有する作成体で免疫した４匹のマウスのうちの１匹はＭＯ４腫瘍抗原刺激により腫瘍を発症したため、強力な免疫学的記憶のためにも分類シグナルが必要であった。この実験は、チロシナーゼファミリー分類シグナルを含有するＤＮＡ作成体による免疫は、抗原に対する長期に持続する記憶を提供し、抗原を発現しない腫瘍で腫瘍抗原刺激に対して広い防御を提供することを示す。例５分類シグナルを同定するために、Ｔリンパ球表面糖タンパク質ＣＤ８の細胞外ドメインをコードする抗原コード領域と、ヒトｇｐ７５の細胞質テイル（アミノ酸４９７〜５３７）またはヒトｇｐ７５の細胞質テイルとトランスメンブランドメイン（ＴＭ）（アミノ酸４７７〜５３７）を含有する分類領域とを有する作成体を作成した。これらの作成体を作成するために、ヒト黒色腫ｃＤＮＡライブラリーから完全長２．８kbのＥｃｏＲＩ断片を単離し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）、ビバリー（Beverly）、マサチューセッツ州）で充填反応を行なった後、真核生物発現ベクターｐＣＥＸＶ３（ボウチャード（Bourchard）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：２０２９−２０４２（１９８９））またはｐＳＶＫ３．１（複クローニング部位内のＳａｃＩ断片の欠失により得られるベクターｐＳＶＫ３の誘導体）、またはｐＳＶＫ３（ファルマシアエルケービー（Pharmacia LKB）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）のユニークなＳｍａＩ部位にサブクローニングした。クローン化挿入体の配向を、制限解析により決定し、ジデオキシ鎖停止配列決定法（シーケナーゼキット、ユーエスバイオケミカルズ（US B iochemicals）、クリーブランド、オハイオ州）により、クローニング部位の上流のベクター配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して確認した。マウスＬ細胞繊維芽細胞を、ｇｐ７５ＤＮＡとｐＳＶ２ｎｅｏを含有するプラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションしたクローンを抗生物質Ｇ４１８（１mg/ml；ギブコビーアールエル（Gibco BRL）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）中の増殖について選択し、かつモノクローナル抗体ＴＡ９９（ビジャヤサラジ（Vijayasaradhi）ら、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．１７１：１３７５−１３８０（１９９１））を用いる免疫蛍光染色によりｇｐ７５発現についてスクリーニングした。アメリカンタイプカルチャーコレクションからヒトＣＤ８α ｃＤＮＡを含有するプラスミドＥＢＯ−ｐＣＤ−Ｌｅｕ２を得た（マルゴルスキー（Margolskee ）ら、１９８８）。このプラスミドから２．３kbのＢａｍＨＩ断片を単離し、クレノウ断片で平滑末端とし、発現ベクターｐＳＶＫ３のＳｍａＩ部位にクローン化した。大腸菌（E．coli）ＤＨ５α中の組換えプラスミド内のｃＤＮＡ挿入体の配向を、適切な制限酵素消化により解析し、ＤＮＡ配列決定により確認した。融合タンパク質ＣＤ８／ｇｐ７５（ＴＭ＋Ｃｙｔ）とＣＤ８／ｇｐ７５（Ｃｙｔ）をコードするキメラｃＤＮＡを、以下の方法により作成した。第１に、ＣＤ８のＴＭ／Ｃｙｔジャンクションおよびｇｐ７５のルメナル（lumenal）／ＴＭおよびＴＭ／Ｃｙｔジャンクションまたはその近傍の適切な制限部位を、部位特異的突然変異誘発（クンケル（Kunkel）ら、１９８７）によりムタゲンキット（バイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Lalboratories）、ハーキュリース（Her cules）、カリホルニア州）を使用して作成した。具体的には、突然変異誘発性オリゴヌクレオチド５’−ＴＡＣＴＧＣＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＴＡＴＣＡＧＧＴＡＣＡＣＴＡ− ３配列番号１７（導入した突然変異は、太字で下線を引いて示す）を使用して、プラスミドｐＳＶＫ３中のｇｐ７５ｃＤＮＡのヌクレオチド１５６０（ルメナル（lumenal）／ＴＭジャンクション）にＥｃｏＲＶ制限部位を導入して、変異体ｇｐ７５プラスミドであるｐＳＶｇｐ７５ＲＶを作成した。こうして４７７位のグルタミン酸（アミノ酸は、開始コドンによりコードされるメチオニンから出発して番号を付けた）がアスパラギン酸に変換された。それぞれ、突然変異誘発性オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＧＴＣＴＧＧＣＡＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴ−３’ 配列番号１８、および５’−ＧＴＣＴＴＣＧＧＴＴＣＣＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＧＧＴ−３ ’ 配列番号１９を使用して、ヌクレオチド１６２７（ｇｐ７５ＴＭ／Ｃｙｔジャンクション）とＣＤ８ｃＤＮＡ中のヌクレオチド７０６（ＣＤ８ＴＭ／Ｃｙｔジャンクション）のｇｐ７５ｃＤＮＡにＨｉｎｄIII部位を導入して、変異体プラスミドｐＳＶｇｐ７５ＨとｐＳＶｌｅｕ２Ｈを作成した。こうして、ｇｐ７５の５００位のロイシンがリジンにかつ５０１位のイソロイシンがロイシンに変換され、ＣＤ８中の２０７位のアスパラギンがリジンにかつ２０８位のヒスチジンがプロリンに変換された。まず適切な制限酵素消化により変異体を同定し、シーケナーゼ配列決定キットを使用してプラスミドの関連する領域の配列を決定して確認した。マウス繊維芽細胞中での一過性の発現とモノクローナル抗体ＴＡ９９（抗ｇｐ７５）とＯＫＴ−８（抗ヒトＣＤ８）を用いる免疫蛍光解析は、変異体タンパク質の細胞内染色は、野生型の分布と同一（すなわち、ｇｐ７５の斑点状の細胞質染色とＣＤ８の細胞表面発現）であることを証明した。プラスミドｐＳＶｇｐ７５ＲＶをＥｃｏＲＶとＸｂａＩで消化して、ＴＭ＋Ｃｙｔ配列とベクターの複クローニング部位配列の一部を含むｇｐ７５ｃＤＮＡの３’非翻訳配列を含有する〜１．２kbの断片を作成した；プラスミドｐＳＶｌｅｕ２ＨをＥｃｏＲＶとＸｂａＩで消化し、ＣＤ８ｃＤＮＡのＴＭとＣｙｔ配列が欠如した大きい〜４kbのプラスミドＤＮＡ断片を単離した。１．２kbのＥｃｏＲＶ−Ｘｂａｌｇｐ７５断片を大きいＥｃｏＲＶ−ＸｂａｌｐＳＶｌｅｕ２Ｈ断片と連結して、融合タンパク質ＣＤ８／ｇｐ７５（ＴＭ＋Ｃｙｔ）をコードするプラスミド作成体を作成した。同様に、〜１kbのＨｉｎｄIII−ＸｂａＩｇｐ７５ｃＤＮＡ断片（ｇｐ７５Ｃｙｔと３’非翻訳配列を含有する）、および〜４kbのＨｉｎｄIII−ＸｂａＩＣＤ８ｃＤＮＡプラスミド断片（ＣＤ８の細胞質テイル配列が欠如している）を、それぞれプラスミドｐＳＶｇｐ７５ＨおよびｐＳＶｌｅｕ２Ｈから単離し、連結して融合タンパク質ＣＤ８／ｇｐ７５（Ｃｙｔ）を作成した。少なくとも２つの独立したクローンから、ＣＤ８／ｇｐ７５ジャンクションでプラスミドの領域を配列決定して、読みとり枠の再生を確認した。大規模プラスミド調製物（キアゲン社（Quiagen Inc.）、チャッツワース（Chatsworth）、カリホルニア州）を、キメラプラスミド中の適切な領域で、ｇｐ７５とＣＤ８にユニークな酵素部位の存在について、制限酵素消化によりさらに証明した。ｐＳＶＫ３．１ｇｐ７５を使用して、カルボキシル末端欠失変異体を作成した。ｇｐ７５ｃＤＮＡのヌクレオチド２０００の制限酵素部位ＢｇｌIIは、プラスミドｐＳＶＫ３．１内のユニークな部位である。プラスミドｐＳＶＫ３．１ｇｐ７５（１０μｇ）を、５０μｌの反応液中で４０単位のＢｇｌIIで３７℃で３時間消化して線状化した。線状化した〜６．７kbのＤＮＡを次に、５０μｌの反応液中でＢａｌ３１ヌクレオチド（１単位酵素／μｇＤＮＡ）で３〜４分消化した。消化したＤＮＡを直ちに、フェノール：クロロホルムで抽出してヌクレアーゼを不活性化し除去し、末端をＤＮＡボリメラーゼＩのクレノウ断片により充填して、平滑末端分子の集団を増殖させた（サムブルーク（Sambrook）ら、１９８９）。７５℃で１０分加熱してクレノウ断片を不活性化し、制限部位ＮｈｅＩ（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧ−３’（ファルマシア（Pharmacia））を含有する抑制可能な読みとり枠末端リンカーを、２０μｌの反応液中１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ日で室温で３時間、平滑末端化した端を切り取ったｐＳＶＫ３．１ｇｐ７５ＤＮＡ分子に連結した。連結混合物を使用して、大腸菌（E．coli ）ＤＨ５α株を形質転換した。アンピシリン耐性細菌コロニーを、適切なサイズのプラスミドＤＮＡの存在についてアガロースゲルスロット溶解法により解析した。１５の形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化により解析し、そして部分的に配列決定して、カルボキシ末端から欠失した塩基の数を測定し、末端リンカーの付加を確認した。一過性のトランスフェクション法を開発し、最適化して、突然変異作成体により発現されたｇｐ７５の細胞内分布を試験した。簡単に説明すると、２〜４×１０⁴ＳＫ−ＭＥＬ−２３クローン２２ａ黒色腫細胞およびマウスＬ細胞繊維芽細胞を、８ウェルラボテック（LabTek）チャンバースライドに広げた。細胞をリン酸カルシウム沈降法により１６〜２４時間、プラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、次に発現されたタンパク質を１２〜４８時間蓄積させ、これを免疫蛍光顕微鏡および免疫電子顕微鏡により評価した。免疫蛍光顕微鏡のために、８ウェルガラススライド上の細胞をホルムアルデヒドで固定し、次にメタノールで固定し、ｇｐ７５特異的マウスモノクローナル抗体ＴＡ９９またはＯＫＴ−８で次にＦＩＴＣ−結合抗マウスＩｇＧにより染色した。細胞をニコンオプティフォト（Nikon Optiphot）蛍光顕微鏡下で観察し、コダックエクタクロームフィルムを使用して写真を撮った。免疫電子顕微鏡のために、１0nmの金粒子に直接結合したモノクローナル抗体ＴＡ９９を、免疫電子顕微鏡によるｇｐ７５の局在化のために使用した。既に記載されているように（スミットとトッド（Smit and Todd）、１９８６）コロイド性金を調製し、アレキサンダー（Alexander）ら、１９８５、に従ってモノクローナル抗体ＴＡ９９−銀結合体を調製した。ヒト黒色腫ＳＫ−ＭＥＬ−１９細胞を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．２％グルタルアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中２．３Ｍのショ糖を注入し、次に細胞ペレットを液体窒素中で凍結させた。超薄切片を切り出し、ホルムバー（formvar）−炭素被覆ニッケル格子上に集めた。格子上の切片をＰＢＳ中の０．５％ＢＳΛ中でインキュベートして、非特異タンパク質結合部位をブロックし、次に１０nmの金粒子に結合したモノクローナル抗体ＴＡ９９で染色した。切片の洗浄と染色は、グリフィス（Gr iffiths）ら、１９８３に従って行なった。切片を、Ｊｅｏｌ１００ＣＸ電子顕微鏡で観察した。これらの実験は、ヒトｇｐ７５の３６アミノ酸の細胞質テイルを含む分類領域を有する作成体（トランスメンブラン領域を含むかまたは含まない）から発現したタンパク質は、細胞の傍核（juxtanuclear）領域に局在化され、原形質膜の他の細胞質構造の染色はほとんどまたはまったくないことを証明した。このパターンは、ゴルジ領域内およびゴルジ領域内に存在する後期エンドソームおよびリソソームのような可能な他の小器官中の発現されたタンパク質の局在化を示した。しかし、キメラタンパク質のＣＤ８部分の存在により予測される細胞表面の染色の欠如は、おそらくプロテアーゼリッチなエンドソームおよびリソソーム内のＣＤ８のプロテアーゼ分解の結果である。例６異なる細胞コンパートメント内のエンドサイト−シス的膜タンパク質の安定性の決定における特定のＮ−グリカンの役割を調べた。糖タンパク質のチロシナーゼファミリーは、複数の保存された可能なＮ−結合グリコシル化部位を有する。マウスブラウン遺伝子座タンパク質ｇｐ７５は、ＴＲＰファミリーの原型である。我々は、各Ｎ−結合グリコシル化部位を体系的に除去することにより、ｇｐ７５が異なるコンパートメントを通過する時に、このタンパク質の安定性を維持するのに、ｇｐ７５上のＮ−結合グリコシル化が果たす役割を調べた。完全長マウスｇｐ７５ｃＤＮＡを含有する１．８kbのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＭＴ４プラスミド（東北大学医学部のティー・シバハラ（T．Shibahara）博士から供与された、日本）から単離し、真核生物発現ベクターｐＳＶＫ３．１のユニークなＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、ｐＳＶＫ３．１−ｍｇｐ７５を作成した。ｐＳＶＫ３．１は、複クローニング部位内のＳａｃＩ断片を除去することにより修飾した、ｐＳＶＫ３（ファルマシアエルケービーバイオテクノロジー社（Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）の誘導体である。挿入体の配向を、制限酵素解析により決定し、シーケナーゼキット（ユーエスバイオケミカルズ（US Biochemicals）、クリーブランド、オハイオ州）を使用してＤＮＡ配列決定により確認した。以下のオリゴヌクレオチドを使用して、それぞれアミノ酸９６、１０４、１８１、３０４、３５０および３８５位でＡｓｎからＧｌｎへの突然変異を作成するために、ムタ−ジーンファジミッド（Muta-gene Phagemid）インビトロ突然変異誘発キット（バイオラッド（Bio-Rad）、メルビル（Melvile）、ニューヨーク州）を使用した。ＯＬＸＵ２７：５’−ＣＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＣＴＣＡＧＡＧＧ−３’；配列番号２１ＯＬＸＵ２８：５’−ＧＴＧＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＧＡＴＣＡＴＴＧＣＡＣＴＧＡＣＡ−３’；配列番号２２ＯＬＸＵ２９：５’−ＡＴＡＡＡＣＧＧＡＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＴＴＧＴＧＧＴＧＴ−３’；配列番号２３ＯＬＸＵ３０：５’−ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＣＣＡＧ−３’；配列番号２４ＯＬＸＵ３１：５’−ＡＣＴＧＴＣＴＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＡＡＴＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧ−３’；配列番号２５ＯＬＸＵ３２：５’−ＴＣＣＴＣＣＣＧＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＴＧ−３’；配列番号２６。上記突然変異誘発性プライマーによる突然変異誘発により、それぞれの部位でＡｓｎ（ＡＡＣまたはＡＡＴ）からＧｌｎ（ＣＡＧ）に変換された。得られた突然変異作成体を、ｇｐ７５ｇ１、ｇｐ７５ｇ２、ｇｐ７５ｇ３、ｇｐ７５ｇ４、ｇｐ７５ｇ５、およびｇｐ７５ｇ６と呼んだ。変異体をスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により同定した。マウスＬ細胞繊維芽細胞を、リン酸カルシウム沈殿法を使用して、完全長または変異体ｇｐ７５ｃＤＮＡおよびｐＳＶ２ｎｅｏを含有するプラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション体を、抗生物質ゲネチシン（Gene ticin）（ギブコビーアールエルライフテクノロジーズ（Gibco BRL Life Techno logies）、グランドアイランド（Grand Ilsland）、ニューヨーク州）の５００ μｇ/mlの有効濃度を含有する培地中での増殖について選択した。各トランスフェクション体クローンを，クローニングリング（ベルコ（Bellco）、バインランド（Vineland）、ニュージャージー州）を使用して単離し、モノクローナル抗体ＴＡ９９を用いる免疫蛍光染色によりｇｐ７５発現についてスクリーニングした。我々はまず、変異体ｇｐ７５タンパク質の分子量の差を、未成熟なグリコシル化した野生型ｇｐ７５と比較することにより、どの可能なＮ−結合グリコシル化部位が使用されるかを調べた。異なるｇｐ７５糖タンパク質変異体を発現するトランスフェクション体を、［³⁵Ｓ］メチオニンで１５分間標識し、次にモノクローナル抗体ＴＡ９９で免疫沈降させた。Ｂ１６黒色腫細胞と野生型ｇｐ７５トランスフェクション体は、ｇｐ７５の鋭い７１kDaバンドを示し、ＥＲプロセシングに特徴的な高マンノース糖鎖を有するｇｐ７５の未成熟型を示していた。グリコシル化変異体の中で、ｇｐ７５ｇ２のみが７１ｋＤａバンドとして現れ、他のすべては、６８ｋＤａバンドを示した。１つの高マンオースオリゴ糖鎖は、分子量約３ｋＤａに相当し、変異体ｇｐ７５タンパク質と野生型ｇｐ７５との間の観察された差は、６８ｋＤａ変異体ｇｐ７５分子は、野生型ｇｐ７５より１つ少ない炭水化物鎖を含有するという解釈に一致する。これは、特定の可能なグリコシル化部位の１つの炭水化物鎖の欠如の直接の結果である。すなわち、これらの部位（個々に、ｇｐ７５ｇ１、ｇ３、ｇ４、ｇ５、およびｇ６中で変異している９６、１８１、３０４、３５０、および３８５位のＡｓｎ）は、通常グリコシル化のために使用されると考えられる。これに対して、Ａｓｎ１０４での突然変異（ｇｐ７５ｇ２での突然変異）は、ｇｐ７５ｇ２と野生型ｇｐ７５との間の分子量に何の変化も引き起こさず、これは、通常グリコシル化のために使用されない可能性が高い。マウスｇｐ７５の安定性と移送における各Ｎ−グリカンの個々の役割を評価するために、我々は［³⁵Ｓ］メチオニンによるパルスチェイス代謝標識を行い、次に免疫沈降と、各変異体ｇｐ７５についてのＥｎｄｏＨ消化を行い、このデータを、Ｌ細胞トランスフェクション体中で発現された野生型マウスｇｐ７５のそれと比較した。新たに合成された野生型ｇｐ７５は、１５パルスの最後、および以後の１５分または３０分のチェイス後に、トランスフェクション体中で７０ｋＤａおよび６８ｋＤａバンドのダブレットとして出現した。ＥｎｄｏＨ消化は、バンドを５７および５２ｋＤａコアポリペプチドバンドに減少させ、３０分のチェイスの前に、ＥＲ内に新たに合成されたｇｐ７５が残存することを示していた。３０分のチェイス後から出発して、ｇｐ７５は成熟７２〜７９ｋＤａバンドとして現れ、これは、ＥｎｄｏＨ消化は、すべてのＮ−グリカンを予測されたコアペプチドサイズになるまで除去できなかったため、ＥｎｄｏＨ消化に対して耐性であった。これは、新規合成の３０分後のＥＲまたはｃｉｓ−ゴルジからのｇｐ７５タンパク質のｍｅｄｉａｌ−またはｔｒａｎｓ−ゴルジへの移送およびこれらのコンパートメント内の炭水化物鎖のさらなるプロセシングを示している。７２〜７９ｋＤａのｇｐ７５タンパク質は、以後のチェイス後も変化せず、ｇｐ７５上のグリコシル化の完了を示していた。成熟ｇｐ７５はおそらく、エンドソーム／リソソームにさらに移送されるが、経時変化はこの実験では反映されない。７２〜７９ｋＤａバンドの強度は、チェイス後４時間まで安定であり、成熟タンパク質の半減期４〜８時間を示していた。細胞内安定性ならびにＥＲからゴルジへのタンパク質の移送を反映する上記パルスチェイス実験、その後のモノクローナル抗体ＴＡ９９による免疫沈降およびＥｎｄｏＨ消化は、すべてのグリコシル化変異体について行なった。すべてのグリコシル化変異体の細胞移送と安定性は、３つの分野に分けられる。（１）ｇｐ７５ｇ１およびｇｐ７５ｇ３は、野生型ｇｐ７５と非常によく似た移送パターンを有するようであった；（２）ｇｐ７５ｇ４およびｇｐ７５ｇ６タンパク質は、半減期が１〜４時間でＥｎｄｏＨ感受性のままであり、ＥＲ内での保持と分解を示していた；（３）ｇｐ７５ｇ５は、野生型ｇｐ７５と同様の速度でＥＲからゴルジへ移送されたが、より短い半減期を示した。１５分のパルス標識および３０分のチェイスの最後に、ｇｐ７５ｇ５は、６８ｋＤａとして現れ、これはＥｎｄｏＨに対して感受性であり、５７ｋＤａバンドを与えた。（５２ｋＤａのコアポリペプチドを有する追加の６６ｋＤａバンドは、完全長トランスフェクション体と類似の端を切り取った型である）。１時間のチェイスの最後に、大部分のｇｐ７５ｇ５は、ＥｎｄｏＨ耐性７５ｋＤａバンドに変換され、これは、これがｍｅｄｉａｌ−またはｔｒａｎｓ−ゴルジ移送されプロセシングされて、移送速度は野生型トランスフェクション体と同様であることを証明している。野生型のｇｐ７５と異なり、７５ｋＤａバンドの強度は、１時間のチェイス後に低下した。これは、ｇｐ７５ｇ５の半減期が１〜４時間であり、トランスフェクション体中の野生型ｇｐ７５（Ｔ１／２＝４〜８時間）より短いことを示唆する。３５０位のＮ−結合炭水化物鎖の削除は、タンパク質の安定性に影響を与えたようである。上記データは、ｇｐ７５ｇ５が野生型ｇｐ７５より短い半減期を有することを証明した。細胞質テイル中の移送シグナルは完全であるため、これはゴルジに移送され、おそらくさらにエンドソーム／リソソームに移送されるようであった。ｇｐ７５ｇ５が実際にエンドソーム／リソソームに移送され、このタンパク質の短い半減期がエンドソーム／リソソーム分解によるものかどうかを調べるために、我々は、ＮＨ₄Ｃｌ（酸性条件下でエンドソームまたはリソソームのようなプロテアーゼを阻害するリソソモトロフィック（lysosomotrophic）弱アミン）またはロイペプチン（leupeptin）（主にリソソーム内のプロテアーゼを阻害するセリン／システインプロテアーゼインヒビター）の存在下でパルスチェイス実験を繰り返した。１５分間の標識の最後に、６８ｋＤａの変異体ｇｐ７５バンドを、ＮＨ₄Ｃｌの存在下または非存在下で同等の強度で合成した。ＮＨ₄Ｃｌの非存在下では、ｇｐ７５ｇ５バンドの強度は４時間のチェイスで、０．５時間のチェイスと比較すると顕著に低下した。しかしＮＨ₄Ｃｌの存在下では、ｇｐ７５ｇ５バンドは、４時間のチェイスの最後では、０．５時間のチェイスまたは１５分の標識後と同様の強さであった。この結果は、ＮＨ₄Ｃｌの存在下ではｇｐ７５ｇ５について半減期が４時間以上に延長したことを明瞭に示し、ｇｐ７５ｇ５の短い半減期が、ＮＨ₄Ｃｌ阻害に感受性の酸性コンパートメント中の急速な分解のためであり、これが後期エンドソームまたはリソソームである可能性が高いことを示唆した。同様にロイペプチンの存在下では、ｇｐ７５ｇ５バンドの強度は、４時間のチェイス後に０．５時間のチェイス後と同じであり、このタンパク質の大きな安定化を示していた。これらの結果に基づき、ｇｐ７５ｇ５は、エンドソーム／リソソームに移送され、そこで急速に分解されると結論された。上記結論はまた、ロイペプチンの非存在下および存在下でｇｐ７５ｇ５を発現するトランスフェクション体の免疫蛍光染色によっても確認される。野生型ｇｐ７５トランスフェクション体では、ｇｐ７５は、傍核パッチと末梢の斑点状液胞中に局在化しており、これはゴルジ複合体および後期エンドソーム／リソソームである。傍核パッチはゴルジ装置であり、定常状態におけるゴルジ装置への野生型完全長ｇｐ７５の局在化は、移送中のこのコンパートメント中のｇｐ７５の蓄積とゆっくりした通過を示唆した。ｇｐ７５ｇ５トランスフェクション体の染色は、傍核構造のみを集中的に示し、末梢液胞は見られなかった。末梢液胞の染色の欠如は、定常状態ではエンドソームおよびリソソーム中に検出可能なレベルのｇｐ７５ｇ５が無いことを示した。しかしロイペプチンの存在下でのｇｐ７５ｇ５トランスフェクション体の染色は、ｇｐ７５ｇ５トランスフェクション体の全体的な染色の増強を明らかにし、特に末梢液胞が見えるようになった。これらの末梢液胞は、トランスフェクション体中の野生型ｇｐ７５の位置についての実験に基づき、エンドソームおよびリソソームである可能性が高い。この結果は、エンドソームおよびリソソーム中で、ロイペプチンはｇｐ７５ｇ５変異体タンパク質を安定化させるという考え方を支持する。上記データをまとめると、Ａｓｎ３５０でオリゴ糖鎖を除去するためのこの位置の突然変異は、変異体ｇｐ７５タンパク質を産生し、これは野生型ｇｐ７５よりリソソーム中でタンパク質分解的消化を受けやすく、セリンまたはシステインプロテアーゼが分解過程に関与していることが証明された。この突然変異は、ｇｐ７５の細胞内分類および移送経路を変化させず、ｇｐ７５ｇ５はまだエンドソーム／リソソームに分類された。ｇｐ７５ｇ１とｇｐ７５ｇ３のパルスチェイス実験は、野生型ｇｐ７５と比較してｇｐ７５移送と安定性に非常によく似たパターンを示した。この結果は、Ａｓｎ９６と１８１のＮ−グリカン（ｇｐ７５ｇ１とｇ３で除去した）は、ｇｐ７５の安定性を決定するのに関与していないことを示した。免疫蛍光染色では、ｇｐ７５ｇ１は、野生型ｇｐ７５の局在化と同様に傍核構造および末梢液胞に局在化された。ｇｐ７５ｇ３の染色は、主に見えない傍核パッチを有する核周辺の液胞を示し、主に定常状態でのエンドソームとリソソーム中のｇｐ７５ｇ３の局在化を示唆した。傍核パッチは、おそらくゴルジ複合体または早期エンドソームであるため、この結果は、ゴルジ複合体と早期エンドソームを介して、野生型ｇｐ７５よりｇｐ７５ｇ５の移送速度の増加を示唆する。すなわち、Ａｓｎ１８１のＮ−グリカンは、ゴルジを介する移送速度に関与しているようである。ｇｐ７５ｇ４とｇｐ７５ｇ６のパルスチェイス実験は、野生型ｇｐ７５または他のグリコシル化変異体とは異なるパターンの細胞移送と安定性を示した。１５分のパルス後および４時間までのチェイス後、ｇｐ７５ｇ４およびｇｐ７５ｇ６変異体タンパク質は、ＥｎｄｏＨ消化に感受性の６８ｋＤａのままであり、その強度は１〜４時間のチェイスで低下した。これらのデータは、変異体タンパク質のＥＲ保持と分解を示唆した。モノクローナル抗体ＴＡ９９による免疫蛍光染色では、ｇｐ７５ｇ４は、主に細かい核周辺ネットワーク（ＥＲネットワークを示す）中で弱い拡散した染色のパターンを示し、ｇｐ７５ｇ６は主に凝縮した核周辺パッチ中に局在化し、これはゴルジ装置に一致した。生化学的データおよび染色データを組合せると、ｇｐ７５ｇ４は、ＥＲ中に保持され、ｇｐ７５ｇ６はほとんどｃｉｓ−ゴルジ装置中に保持されるようである。すなわち、Ａｓｎ３０４またはＡｓｎ３８５でのＮ−グリカンの除去は、ＥＲからゴルジへの細胞の移送に影響を与えた。前記の多くの試験により示唆されるように、正しくない折り畳みが保持の機構かも知れない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｐ 37/04 (72)発明者ユー，イイクイングアメリカ合衆国11105 ニューヨーク州アストリア，サーティセブンスストリート 20―16 (72)発明者ワン，シクンアメリカ合衆国10021 ニューヨーク州ニューヨーク，イーストシックスティサードストリートナンバー26エイチ，500

Claims

【特許請求の範囲】 1. 遺伝子的免疫化法で使用するための核酸作成体であって、（ａ）抗原性タンパク質またはペプチドをコードする抗原コード領域；および（ｂ）細胞のエンドソームまたは小胞体へのタンパク質またはペプチドの細胞内移送を指令する分類シグナルとして作用するタンパク質またはペプチドをコードする分類領域を含んでなる上記作成体。 2. 抗原コード領域と分類領域の間に位置するリンカー領域をさらに含む、請求の範囲第１項記載の作成体。 3. 分類領域は、ヒトブラウン遺伝子座タンパク質、ｇｐ７５；ヒトアルビノ（albino）遺伝子座タンパク質、チロシナーゼ；ヒトシルバー遺伝子座タンパク質、Ｐｍｅｌ１７；またはヒトピンクアイド（pink eyed）遺伝子座Ｐ−タンパク質から得られる、請求の範囲第１項または第２項記載の作成体。 4. 分類領域は、少なくともペプチドGluAlaAsnGlnProLeuLeuThrAsp（配列番号１）をコードする、請求の範囲第１項または第２項記載の作成体。 5. 分類領域は、少なくともペプチドGluGluLysGinProLeuLeuMetAsp（配列番号２）をコードする、請求の範囲第１項または第２項記載の作成体。 6. 分類領域は、少なくともペプチドGluAspSerProLeuLeu（配列番号３）をコードする、請求の範囲第１項または第２項記載の作成体。 7. 分類領域は、少なくともペプチドGluAspThrProLeuLeu（配列番号４）をコードする、請求の範囲第１項または第２項記載の作成体。 8. 分類領域は、少なくともペプチドProSerArgAspArgSerArgHisAspLysIleHis （配列番号５）をコードする、請求の範囲第１項または第２項記載の作成体。 9. 分類領域は、対応する野生型分類領域中に存在するグリコシル化部位が改変されている変異体型である、請求の範囲第１項または第２項記載の作成体。 10．哺乳動物細胞中で作成体の発現を可能にするのに有効なプロモーター領域をさらに含む、請求の範囲第１項から第９項までのいずれか１項に記載の作成体。 11．プロモーター領域は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターから選択される、請求の範囲第１０項記載の作成体。 12．請求の範囲第１項から第１１項までのいずれか１項に記載の核酸作成体を含む、遺伝子的免疫化のためのワクチン。 13．核酸作成体はリポソーム内にパッケージングされる、請求の範囲第１２項記載のワクチン。 14．核酸作成体はコロイド金粒子上に被覆される、請求の範囲第１２項記載のワクチン。 15．核酸作成体はウイルス発現ベクター中に取り込まれる、請求の範囲第１２項記載のワクチン。 16．哺乳動物に請求の範囲第１項から第１５項までのいずれか１項に記載の核酸作成体またはワクチンを投与する工程を含む、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導する方法。 17．請求の範囲第１項から第１１項までのいずれか１項に記載の核酸作成体を製造する工程を含む、遺伝子的免疫化のためのワクチンの製造方法。 18．リポソーム担体中に核酸作成体をパッケージングする工程をさらに含む、請求の範囲第１７項記載の方法。 19．コロイド金粒子上に核酸作成体を被覆する工程をさらに含む、請求の範囲第１７項記載の方法。 20．核酸作成体は、ウイルス発現ベクター中に取り込まれる、請求の範囲第１７項記載の方法。