JP2000516097A

JP2000516097A - 製パン特性を向上させた形質転換コムギ

Info

Publication number: JP2000516097A
Application number: JP10510882A
Authority: JP
Inventors: インドラケイ．ヴァジル; ヴィムラヴァジル
Original assignee: ユニバーシティーオブフロリダ
Priority date: 1996-08-22
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2000-12-05
Also published as: EP0927193A1; AU723353B2; AU4073697A; WO1998007747A1; CA2264271A1; NZ334036A; US6252134B1

Abstract

(57)【要約】高分子量グルテニンサブユニット（HMW-GS）含量の増加したトランスジェニック植物で、パンを製造する能力が改善された。形質転換によりHMW-GS 1Ax1を発現するコムギの特異的な例（Bob White種）を提供する。さらに、1Ax1プロモーターの有効な使用法についても記述する。

Description

【発明の詳細な説明】製パン特性を向上させた形質転換コムギ発明の分野本発明は、遺伝的に形質転換されたイネ科植物、特に製パン特性が改善された形質転換コムギに関する。発明の背景パンを製造できるという小麦粉のユニークな特徴は、デンプン質の胚乳に貯蔵されたグルテンタンパク質、特にグルテンおよびパン生地の弾力性を決定するのに重要な高分子量グルテンサブユニット（HMW-GS）の弾力性および伸長性と密接に関連している。栽培品種のコムギの品質は、含まれるHMW-GSの数および組成によって決まる。プロラミンは、穀粒の胚乳中から新しく発見された貯蔵タンパク質の一群である（Shewry，1995）。コムギのプロラミンは、グリアジンおよびグルテニンの二群に分けられる。小麦粉を水と混合してパン生地を作る際に、これらはともに連続的なタンパク性の網目状構造を形成する。グルテンタンパク質は、天然に見いだされる最大のタンパク質分子である（Wrigley，1996）。製パンに重要なパン生地の弾力性（強度）および伸長性（粘凋性）は、それぞれグルテニンおよびグリアジンと密接に関連している。他の穀物の貯蔵タンパク質では見られない、コムギグルテンのこれらのユニークな特徴は、相対分子量が1,000万を超えるに至る、グルテニンポリマーの巨大なサイズと関連があると考えられる（Wrigley，前記）。栽培品種のコムギは、グルテンの弾力性が低い（弱い）ため、他の点では望ましい農学的な特徴を有してはいるが、製造されるパンの品質が落ちる。そのような場合、異なる栽培品種の小麦粉を混合して、製パンに適するようにブレンドすることが必要となる。多くの生化学者および遺伝学者により、製パンに関する小麦粉の品質は、とりわけHMW-GS群のタンパク質によって左右されることが示されてきた。HMW-GSは、高分子量のｘ型および低分子量のｙ型のサブユニットに細分される。ｘ型およびｙ型サブユニットをコードする２つの遺伝子は、固く連鎖したペアとして、４媒体パンコムギの１Ａ，１Ｂおよび１Ｄ染色体に存在し遺伝する（Payne，1987）。このため、栽培品種のコムギはすべて、６種類のHMW -GS遺伝子を含んではいるが、転写されない遺伝子が存在することから、３，４または５種のサブユニットのみが存在する（1Ay遺伝子は、全てのパンコムギ変種で転写されない）。ある栽培品種中に存在するHMW-GSの数および組成は、そのグルテンの品質と密接な関連がある。各HMW-GSは、総抽出タンパク質の約２％を占めるため、HMW-GSは種子の総タンパク質量の10％近くを占める可能性がある（Seilmeie rら,1991;Halfordら,1992）。しかしながら、HMW-GS遺伝子は互いに密接に連鎖しているため、伝統的な交配法によってそれらを操作することは困難である（Fl avellら，1989）。このため、最近コムギの形質転換が成功して(Vasil，1994)HM W-GS遺伝子のコピーを付加的に導入することにより、コムギのグルテンの品質を改良する試みが可能となった（Flavellら，1989；Shewryら，1995）。ごく最近、雑種型HMW-GS Dy10:Dx5の遺伝子構築物を含むトランスジェニック・コムギ（B ob White種）の種子には、内因性のHMW-GS遺伝子のものと同レベルの雑種HMW-GS が貯蔵されていることが示された。Bob Whiteの胚乳には、Ax2^*，Bx7，By9，Dx5 ，およびDy10の５つの雑種HMW-GSが含まれている（BlechlおよびAnderson，1996 ）。このことから、Dx5およびDy10遺伝子がコードする天然のタンパク質と導入されたDy10およびDx5遺伝子により形成された雑種HMW-GSとを区別するために、雑種遺伝子構築を用いることが必要であった。製パンの品質が向上したコムギ、およびそのようなコムギを製造する方法に対する需要は、常に存在する。このため、発現すると製パンの晶質が向上するように、異種性のHMW-GS遺伝子で形質転換し、改良されたコムギを製造することが望ましいと考えられる。発明の簡単な概要本発明は、異種性のHMW-GS遺伝子を用いてコムギを形質転換することにより、製パン特性を向上させたコムギを製造する方法である。本発明は、天然では1Ax1 遺伝子をもたない栽培品種である、コムギのBob White種(Triticum aestivum L. )の幼若な培養胚に、バイオリスティック爆撃法によって、HMW-GS1Ax1遺伝子を導入する例を示している。1Ax1遺伝子は良質な製パンと関連があるが、Bob Whit eを含む（BlechlおよびAnderson,1996）多くの栽培品種には存在しないことが知られている（Halfordら,1992;Payneら、1997）。独立に形質転換された系列から選択した21のうち20が、選択可能なbar遺伝子を、および9つが1Ax1遺伝子を発現していた。異なるトランスジェニック系列間で産生されるHMW-GS 1Ax1タンパク質の量は、総タンパク質の0.6%〜2.3%のばらつきがあり、総HMW-GSタンパク質として最大71%までの増加を示した。トランスジェニック植物は、正常で稔性を有し、メンデルの法則に従ったトランスジーンの分離を示した。HMW-GS 1Ax1の蓄積は一定であり、R3種子世代まで安定であった。これは、5つ以上のHMW-GS遺伝子を発現しているコムギを作り出した最初の例である。驚くべきことに、５つという遺伝子数を超えて付加した異種性遺伝子は、天然の遺伝子発現を抑制することなく発現されることが見出された。従って、本明細書中で例示するように、本発明により、当業者には、コムギの製パン品質に影響を及ぼす所望の異種性HM W-GS遺伝子でコムギを形質転換させることによってHMW-GSの量及び質の双方を予測可能に操作することが可能となる。図面の簡単な説明図１ HMW-GS 1Ax1をコードする遺伝子で形質転換されたコムギ栽培晶種Bob Whiteの R2種子の一つに由来するタンパク質のSDS-PAGE。棒線はHMW-GSサブユニットの位置を示す；矢印は1Ax1サブユニットの位置を示す。上段の数字は、1Ax1遺伝子を発現している9つの独立した形質転換系列に対応する。HMW-GS 1Ax1は形質転換していないBob White種には存在しない（レーンｃ）。46kDa以下のタンパク質は示していない。タンパク質分子量標準を右に示す。図２ 159系列（最も発現量が高いもの）および235系列（最も発現量が低いもの）の一つの種子のタンパク質のSDS-PAGEにより、R1、R2、およびR3の種子においてHM W-GS 1Ax1の蓄積が一定であることを示す。cレーンに示すように、HMW-GS 1Ax1 は形質転換していないBob Whiteには存在しない。タンパク質分子量標準を左に示す。図３ R2においてHMW-GS 1Ax1遺伝子発現がホモ接合となった29系列の７つの種子一粒ずつに由来するタンパク質のSDS-PAGEo棒線はHMW-GSの位置を示す；1Ax1サブユニットの位置は矢印で示している。HMWGS 1Ax1は形質転換していないBob White には存在しない（左から２番目のレーン）。図２と同様に、タンパク質分子量標準を左レーンに示す。図４ 28、31、87、85、25、30、51、および62系列、ならびに形質転換していない対照個体（nc）のゲノムDNA（20μｇ）をXba Iで消化し、1Ax1プローブでハイブリダイズしたサザンブロット法。内因性HMW-GS遺伝子に由来する２つのハイブリダイズするバンドの大きさをkb（右欄）で示す。図５ 235、233、217、および159系列、形質転換していない対照個体（nc）のゲノム DNA、ならびにpHMW1Ax1プラスミドのDNA（pc）をXba Iで消化し（右）、または消化せずに（左）、1Ax1プローブでハイブリダイズしたサザンブロット；消化していない検体では10μｇのDNAを、消化した検体では25μｇのDNAを用いた。内因性HMW-GS遺伝子に由来する２つのハイブリダイズするバンドの大きさをkb（右欄）で示す。発明の詳細な説明胚乳に存在するHMW-GS 1Ax1の量は、パン生地の弾力性/強度と正の相関を示す（Halfordら,1992;Branlard,1987）。HMW-GS遺伝子を慣例的な交配によって操作することは可能ではあるが、これらの遺伝子が強く連鎖しているために、予測不可能であり、困難で、複雑であることが示されている（Flavellら,1989）。本発明により、HMW-GSの質的および量的な変化をもたらす遺伝的な形質転換によって付加的にHMW-GS遺伝子を導入および発現させることにより、コムギの製パン品質を向上させる際の障害を克服することが可能となる。本明細書の実施例で用いているように、1Ax1遺伝子はコムギのBob White種には存在しないため、SDS-PAGE 法によって、形質転換していない対照には存在しない新しく追加されたバンドとして、コムギでのトランスジーンの発現を検出できる。独立に形質転換されてR1 でHMW-GS 1Ax1遺伝子を発現している9つの系列の大多数は、R2の種子抽出物中でも同じ程度の発現を示していた（表２）。独立のトランスジェニック系列において、HMW-GS 1Ax1の量を含む、HMW-GSの蓄積の相対的なレベルの相違は、３世代を通して安定であることが、密度計測法による解析で確認された（表２）。barおよび1Ax1遺伝子は、これらを発現している８つの系列の全てで共分離されていた。このことは、1Ax1およびbarを発現している全ての系列において、組み込みが単一遺伝子座で起こっており、２つの系列（25および87）を除く全てで、これら２つの遺伝子がメンデルの法則に従って遺伝することを示している。穀類のゲノム内へのトランスジーンの組み込みは、複数の遺伝子座にも単一の遺伝子座にも起こることは、すでに記載されている（Christouら、1989；Spencerら、1992；S rivastavaら、1996）。HMW-GS 1Ax1を発現している９つの系列のうち８つのサザンブロットによる解析の結果から、全ての系列において複数コピーの1Ax1トランスジーンが組み込まれていることが示唆される（図４，５）。これまでのところ、8系列が、R2においてホモ接合であることが確認された。全ての系列において、以降の世代においてもトランスジーンの発現は維持されていた。トランスジェニックタンパク質の産生量は、各系列によって異なり、全抽出タンパク質の0.6 〜2.3%であった。導入した1Ax1遺伝子が高レベルで発現したこと、および少なくとも３世代に渡って安定であったことから、コムギおよびその他の穀類の胚乳組織において、トランスジェニックタンパク質を発現させるために天然のHMW-GS遺伝子プロモーターを効果的に用いられることが示唆される。従って、タンパク質をコードする異種性DNA断片を発現させるために1Ax1プロモーターを用いることは、本発明の範囲に含まれている。SDS-PAGE法の密度計測スキャン解析では、正確な定量的データを得られないが、それでも導入したHMW-GS遺伝子の効果を評価するためには有用である。本明細書で示した方法により、1Ax1遺伝子導入後に、全HMW-GSが最大71%まで増加した。驚くべきことに、ほとんどの系列において、トランスジェニックの1Ax1サブユニットの蓄積は、その他のHMW-GSを犠牲にしてはいないことが結果から示された(85および233系列では1Ax1の発現は中程度に過ぎなかったが、それでもその他のHMW-GSを犠牲にしており、全HMW-GS量は形質転換していない対照の範囲内であった)。本発明は、HMVV-GSポリペプチドをコードする遺伝子によって植物を形質転換することを通して、コムギのような植物の製パン特性を増強および増大させるための方法に関する。本発明はまた、HMW-GSトランスジーンまたはその断片もしくは変異体を保有する、形質転換およびトランスジェニック植物、植物材料、および種子に関する。好ましい態様においては、複数のコピーのHMW-GSトランスジーンがゲノムに挿入され、植物細胞において発現される。本発明はまた、本発明に係る植物および種子から調製されるパンなども包含する。このため、これらの開示に従い、当業者は、HMW-GS遺伝子の総数を増加させることが可能であり、これによりHMW-GSの蓄積量を増やすことができ、それが製パン品質を向上させる結果となることは、明らかである。さらに、本発明は、当技術分野において周知の方法で変異遺伝子をコムギおよびその他の植物／穀類に導入することによって、HMW-GSの構造を変化させ、HMW-GSの組成を定型的に操作し、それが製パン品質に影響を与える機会をもたらす。さらに、本明細書の指示に従えば、当技術分野において周知の方法によって、（例えば制限酵素部位で挿入することによって）ヌクレオチドを付加したり、(例えばBal31エキソヌクレアーゼを用いることによって）ヌクレオチドを除去したりすることによりHMW-GS遺伝子を改変することができ、タンパク質をコードする変異体または断片を得ることができる。このように、本明細書の指示に従えば、当業者にとっては、HMW-GS 1Ax1遺伝子または良質の製パンに関するその他のあらゆるHMW-GS遺伝子を、メンデルの遺伝法則に従う単一優性遺伝子として、コムギゲノムに安定に組み込み、発現させ、および継代させうる方法および可能性が提供される。以下の実施例では、特に、天然のHMW-GSプロモーターの制御下において、コムギの栽培品種であるBob Wh iteで、新たに、多量のHMW-GS 1Ax1が産生されることを示す。これらの実施例は、当業者であれば、本明細書の開示に従って適切なHMW-GS遺伝子を導入して形質転換を行うことにより、予測通りおよび定型的に、コムギ胚乳の組成を、ひいては人類および工業的使用に適するように変えることができることを示している。同様にして、トウモロコシ、コメ、およびその他の穀類の組成も、本明細書の指示ならびに既知の形質転換および選択技術に従って、改変することができる。本明細書で特に例示した方法以外の形質転換法も、本発明の方法として用いることができ、それらも本発明の範囲に含まれていることは理解されるべきである。以下に本発明を実施する過程を示す実施例を記述する。これらの実施例を、制限的なものとして解釈すべきではない。特に記載のない限り、全ての百分率は重量で、およびすべての溶媒の混合比は容量で示す。引用した各参照文献に記述されている方法は、特に指定した箇所の参照として、本明細書に組み入れられる。実施例１−コムギの形質転換およびプラスミドバイオリスティック粒子加速装置(PDS1000/He，Bio-Rad)で、既述（Taylorら，1993；Vasilら，1993；Altpeterら，1996；この方法は、参照として本明細書に組み入れられる）に従い、Triticum aestivum L．（Bob White種）の幼若胚に爆撃することにより、形質転換を行った。プラスミドpAHC25およびpHMW1Ax1を約１：１のモル比（各DNAとも5μｌずつ）で混合し、同時に形質転換した。プラスミドpAHC25は、選択可能なbar遺伝子およびGUSレポーター遺伝子（uidA）を、いずれもトウモロコシのユビキチンプロモーター制御下に含んでいる（Vasilら，1 993；Altpeterら，1996；ChristensenおよびQuail，1996）。プラスミドpHMW1Ax 1はコムギのHMw-GS 1Ax1遺伝子を含んでおり、それ自体の胚乳特異的プロモーター（Halfordら，1992）により発現が誘導される。トランスジェニック系列は、既述のビアラフォス含有培地で選択した（Altpeterら，1996）。至適条件以下での爆撃および選択条件のもとで、7650個の胚を用いて（９回の実験により）、全部で21系列の独立したトランスジェニックコムギ系列（うち20系列がPATを発現している）が得られ、全体としての形質転換効率は0.3％であった。実施例２−HMW-GS 1Ax1およびbarの同時形質転換および発現栽培品種のBob Whiteコムギの幼若胚を、pAHC25およびpHMW 1Ax1で同時に形質転換した。ホスフィノトリシンアセチル転移酵素（PAT）活性の測定結果に基づいて、20の独立した形質転換系列を同定した。もう一つの系列（系列85）は、ビアラフォスでの選択では生存したがPAT活性が認められなかった12個体についての別の実験で、サザンブロット解析により同定された（barおよび1Ax1の両方の遺伝子が存在していた）。培養開始後３ヶ月以内に植物を土壌に植え替えた。21 の形質転換系列の各々が完全に稔性を有し、R1の種子を産生した。各系列の成熟したR1の種子８粒から各々総タンパク質を抽出し、トランスジェニックのHMW-GS 1Ax1の蓄積を、SDS-PAGEにより解析した。図１〜３に示したように、HMW-GS 1A x1タンパク質は、対照のBob Whiteの種子には存在しない（対照のレーン）。このことから、トランスジェニックの1Ax1サブユニットが存在することは、標準分子量マーカーと比較して約126kDaに位置するタンパク質のバンドがあることで、９系列で明確に検出できた（これらのうち2系列について、図２に示す）。pHMW 1Ax1と同時に形質転換しPATを発現している20系列のうちで8系列が、1Ax1トランスジーンをも発現しており、同時発現の頻度は40％であった。実施例３−PATの測定選択の後、シリカゲルの薄層クロマトグラフィーで葉の抽出物中のPAT活性を測定することにより（Spencerら，1990、この方法は参照として本明細書に組み入れられる）、一次形質転換体を同定した。ただし、標識には、2.0μｌの[¹⁴C] アセチル-CoA 43.2mCi/mmol（Sigma）を用いた。各検体の、総タンパク量25μｇに相当する反応生成物を用いた。実施例４−タンパク質の解析乳鉢および乳棒を用いて、乾燥した成熟種子を個別に擦り潰し、タンパク質を抽出物の調製を行った。各種子から得た10〜14mgの小麦粉を、200μｌの検体緩衝液（2％SDS、5％β-メルカプトエタノール、0.001％ピロニンＹ、10％グリセロール、0.063M Tris-HCI pH6.8）とともに２分間ボルテックスし、250rpmの回転式振とう器で２時間インキュベートした。抽出物を遠心し（14,000rpm，10分）上清を5分間煮沸してタンパク質を変性させた。タンパク質をSDS-PAGE（Laemm li，1970）で分離した；すなわち、10％（w/v）アクリルアミド、0.8％（w/v）ビスアクリルアミドを含む13cmのゲルに各検体を20〜30μｌずつのせて、抽出タンパク質全てがゲル上にあり、1Ax1のバンドが相互に完全には分離しない他のHM W-GSと分離されるように、色素マーカーの先端がゲル下端に達するまで泳動した。ゲルを先ず色素の入っていない染色液で0.5〜1時間固定した後、クーマシーブリリアントブルーR-250で4〜6時間染色した（Neuhoffら，1988）。5％メタノールおよび7％酢酸水溶液（v/v）中でバックが透明になるまで脱色して、タンパク質のバンドを可視化した。ゲルは7％酢酸水溶液（v/v）中に保存した。染色したゲルをAlpha Innotech（San Leandro，CA）製のIS-1000デジタルイメージングシステムを用いてスキャンした。各レーンおよびピークの値は、バンド間のバックを差し引くことにより補正した。各レーン毎に、約140kDa付近に位置する各HMW-GS 1Ax1のバンドの上端から、バックの強度を決定した。HMW-GS 1Ax1の存在量は、レーンの補正値またはHMW-GSの補正値を基準に算出した。総HMW-GSレベルは、各レーンのタンパク質含量を標準化して算出した。実施例５−DNAの解析 CTAB法（Lassnerら，1989、本方法は参照として本明細書に組み入れられる）を用いて、PAT陽性植物体の葉からゲノムDNAを分離した。精製したDNA(20〜25μ ｇ)をXba Iで消化し、0.8％アガロースゲルで電気泳動して、ハイボンドＮ膜（A mersham）にブロットした。ハイブリダイゼーション用のプローブは、pHMW憎1Ax 1をEcoRIおよびHind IIIで消化して生じる、HMW-GS 1Ax1遺伝子のコーディング領域に由来する2.2kbの断片からなり、ランダムプライマー標識キット（GIBC0-B RL）を用いて作成した。ハイブリダイゼーションは、65℃で24時間行い、オートラジオグラフィーでシグナルを可視化した。実施例６−分離の解析 R1世代におけるトランスジーンbarの分離比を検討するため、21のトランスジェニック系列の各々に由来する成熟胚20粒を、ビアラフォス添加培地：15g/lのショ糖，2.5g/lのゲルライトおよび3mg/lのビアラフォス（オートクレーブした後、濾過滅菌して加えた）を添加した、1/2強度のMS-塩類およびビタミン類、pH 5.8（B3培地）（MurashigeおよびSkoog，1962；本方法は、参照として本明細書に組み入れられる）で発芽させた。以後の各世代について、選択を行わなかった 1Ax1トランスジーンの発現を評価したところ、この遺伝子を発現している系列のみが次世代へと継続した。B3培地でHMW-GS 1Ax1が蓄積する全ての系列のうち、最大12個のR1個体に由来する20個の胚の発芽能を調べたところ、barがホモ接合の系列が、R2の種子から同定された。共分離が起こったかどうかを検討するため、barがホモ接合となった各系列の種子10粒について、個別にSDS-PAGEによりHMW -GS 1Ax1の解析を行った。実施例７−分離の解析、共発現の安定性、およびHMW-GSの蓄積レベル各系列の20個のR1および120〜240個のR2の種子から取り出した成熟胚（6〜12 個体／系列）を、ビアラフォス含有B3培地で発芽させ、以後の世代におけるトランスジーンbar分離および発現について検討し、barがホモ接合となった個体を同定した。16系列の発芽率は、単一の組み込み部位に関するメンデル型分離と、有意な相異はなかった；系列25および87は、メンデル型分離を示さなかった（表１）。系列62および228のR1の個体では、PATの発現が喪失していた。R0ではbar遺伝子を保有してはいるが発現してはいない系列85は、B3培地では発芽しなかった。これまでのところ、R2世代において、PATの発現がホモ接合となった7系列が同定された。これら7系列において1Ax1遺伝子が共発現／分離していることは、SDS-P AGEによる解析で確認された。系列85は、PAT活性は示さないが、HMW-GS 1Ax1を蓄積していることが見いだされた；そのホモ接合の子孫も同定された。２系列（系列87および235）で、トランスジェニックHMW-GS 1Ax1より移動速度の遅い、由来不明の新たなポリペプチド（各々195kDaおよび156kDa）が見られた（図１、２）；このポリペプチドは、後の世代にもまた存在していた。図１（レーン28〜23 5）は、９つの異なる系列間でのHMW-GS 1Ax1の蓄積レベルの違いを示す。ゲルの濃度計測スキャンにより、各系列で産生されるHMW-GS 1Ax1タンパク質の量は、総タンパク量の0.6〜2.3％の範囲でばらつくことが示された（表２）。最も強い発現を示す系列（28、87、159）では、HMW-GS総量の32〜40％をトランスジェニックのHMW-GS 1Ax1が占め、しかも天然のHMW-GSは少しも減少していないため、R 1およびR2の種子のHMW-GSレベルは、形質転換されていない対照の1.53〜1.71倍となり、159系列ではR3の種子も同様であった（表２）。ホモ接合の系列内でのH MW-GS 1Ax1の蓄積は、一様であった（図３）。異なる系列間のHMW-GS 1Ax1の相対量の違いは、以降の世代にわたっておおむね一定であった。 ^aχ²検定による解析の結果、これらの系列に由来するR1の成熟胚の分離比は、３：１から有意にずれてはいなかった（a=0.005）。R2およびR3世代の値は、図１および２に示した２つのゲルの平均値である。^1,2 トランスジェニックHMW-GS 1Ax1のピークをレーン全体の合計値で割った値¹ 、または各レーン内の全てのHMW-GSピークの和²。³ 全てのHMW-GSピーク値の和をタンパク量補正後に対照レーン（形質転換していないBob White）の値で割ったもの。ここに示した値は全て、個々のHMW-GS 1Ax1 、HMW-GSまたは総タンパク質のピークをバックで補正したもの。 n.a.＝解析時に入手不可。実施例８−サザンブロット解析対照の形質転換していないゲノムDNAをXbaＩで消化してサザンブロットし、pH MW 1Ax1プラスミドの全長または小さいコーディング領域のいずれかで作成したプローブを用いてハイブリダイゼーションすると、7.0および9.3kbの、２本の交差反応するバンドが検出された（図４および５の対照のレーン）。制限酵素としてXbaＩを用いたのは、pHMW1Ax1には、コーディング領域の外側に１カ所だけ、X baＩの認識部位が存在するためである。12のトランスジェニック系列（8系列が1 Ax1を発現しており、4系列はbar遺伝子のみを発現しているがpHMW1Ax1プラスミドを同時に形質転換したもの）由来のゲノムDNAでサザンブロットを行った。Xba Iで消化すると、1Ax1を発現している8系列のうち6系列（28、31、85、87、233、 235）が、明確に個別の組み込みパターンを示し（図４、５）、複数のプラスミドのコピーが不規則に挿入および／または短縮されて存在していた。1Ax1を発現しいる系列のうち２系列（159および217）では、内因性のバンドと同じ移動度をもつ7.0kbの濃いバンドが認められたが、これは9.3kbの第２の内因性バンドよりもはるかに濃かった。このことから、複数のコピーが縦列に多数、一続きに存在していることが示唆される。1Ax1を発現していない系列の中で、系列25は、明らかに、1Ax1を発現している系列28および31と同様の組み込みパターンを示した。系列30にはトランスジーンは存在していなかったが、一方で、系列51および62は、陰性対照の個体と非常によく似てはいるが遥かに濃いパターンを示した。ゲノム DNAにトランスジーンが組み込まれていることは、４つの1Ax1発現系列および形質転換していない対照個体１系列の未消化のDNA 1.0μｇをハイブリダイゼーションして比較することにより証明された（図５）。発現系列のハイブリダイゼーション・シグナルは、陰性対照のものより、明らかに濃かった。本明細書で記述した実施例および態様は説明のみが目的であり、当業者はそれらから様々な改変または変化を導き出すと考えられるが、それらは本願の意図および範囲、ならびに添付の請求の範囲に含まれるものであることが、理解されねばならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の段階を含む、製パン特性を向上させる植物を製造する方法：（a）細胞を形質転換して、HMW-GSに由来するタンパク質をコードする異種性D NA断片を保有させる段階；（b）該細胞を、それからトランスジェニック植物が再生される条件下で育成および維持する段階；（c）該トランスジェニック植物を、該DNAが発現し、該植物の細胞における総 HMW-GS量が増加する条件下で育成する段階。２．異種性DNA断片を保有するトランスジェニック植物の、該異種性DNA断片が発現される後代の子孫を回収し育成する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。３．異種性DNA断片が1Ax1プロモーターを含む、請求項１記載の方法。４．DNA断片が1Ax1プロモーターを含む、請求項２記載の方法。５．異種性DNA断片が、1Ax1プロモーターの制御下で発現する、請求項１記載の方法。６．異種性DNA断片が、1Ax1プロモーターの制御下で発現する、請求項２記載の方法。７．植物がコムギである、請求項１記載の方法。８．植物がコムギである、請求項２記載の方法。９．タンパク質をコードする異種性DNA断片を保有するトランスジェニック植物であって、該異種性DNA断片が、1Ax1プロモーターの制御下にあるトランスジェニック植物。１０．コムギである、請求項９記載のトランスジェニック植物。１１．種子、花粉、および植物組織からなる群より選択され、かつ異種性DNA断片を含む、請求項９記載のトランスジェニック植物の一部分。１２．種子である、請求項１１記載の植物の一部分。１３．請求項１２記載の種子から製造される小麦粉。１４．請求項１３記載の小麦粉から製造される食用成分。１５．少なくとも６種の異なるHMVV-GSタンパク質をコードするDNA断片を含むトランスジェニックコムギ細胞であって、該DNA断片の少なくとも６種が発現しているトランスジェニックコムギ細胞。１６．請求項１３記載の細胞を含むトランスジェニックコムギ。１７．種子、花粉、および植物組織からなる群より選択され、かつ請求項１５記載の細胞を含む、請求項１６記載のトランスジェニックコムギの一部分。１８．種子である、請求項１７記載の植物の一部分。１９．請求項１８記載の種子から製造される小麦粉。２０．請求項１９記載の小麦粉から製造される食用成分。