JP2000516129A

JP2000516129A - コアセルベーションによるイオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアの調製

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Publication number: JP2000516129A
Application number: JP10504153A
Authority: JP
Inventors: アンドリアノフ，アレグザンダー，ケイ．; チェン，ジァンピン
Original assignee: ヴァイラスリサーチインスティチュート
Priority date: 1996-07-02
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 2000-12-05
Also published as: EP0954573B1; US5807757A; CN1226927A; WO1998000531A1; AU3309797A; CA2258286A1; AR008253A1; DE69733436D1; AU722765B2; EP0954573A4; ATE296878T1; EP0954573A1; ES2244000T3; ZA975508B

Abstract

(57)【要約】ポリホスファゼンマイクロスフェアがコアセルベーションにより生産されるポリホスファゼンマイクロスフェアの調製方法。一つの実施例において、ポリホスファゼンを含む溶液がグループＩ元素の塩（例えば塩化ナトリウム塩など）の一価イオンの塩を含む溶液などの脱水剤と混合されて、ポリホスファゼンコアセルベート顕微小滴を含む分散液を形成する。分散液は次いでグループII元素の塩（例えば塩化カルシウムなど）の多価イオンの塩を含む溶液と混合されて、ポリホスファゼンマイクロスフェアの懸濁液を形成する。ポリホスファゼンマイクロスフェアは次いで懸濁液から回収される。このような方法は制御された粒度分布を持つマイクロスフェアを高収率で得ることを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】コアセルベーションによるイオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアの調製この発明はポリホスファゼンマイクロスフェアの調製に関する。より詳細には、この発明はポリホスファゼンのコアセルベーション（液滴形成）によるポリホスファゼンマイクロスフェアの調製に関する。水溶性ポリマーおよび重合体ヒドロゲル、例えぱポリホスファゼンヒドロゲルなどは抗原を粘膜面に送達するためにまた粘膜面での抗原の調節放出のため、あるいは注射のために抗原をマイクロカプセル化するのに使用される。このようなカプセル化抗原はまた経口あるいは鼻腔内投与することができる。ポリホスファゼンマイクロスフェアはさまざまな予防薬およびもしくは治療薬のための薬用担体として使用される。例えばポリホスファゼンマイクロスフェアは抗原性補強剤として役立ち、これによりそのようなマイクロスフェアは細胞、細菌、ウイルス粒子、あるいはそれらの部分から誘導されるようなさまざまな抗原のいずれかを含み、その抗原はタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、あるいはそれらの組合せであり、これらは動物、例えば哺乳類、鳥類あるいは魚類に免疫原性応答を引き出す。一般にカプセル化抗原はポリホスファゼン溶液と混合され、ポリホスファゼンおよび抗原の微粒子が形成され、またポリホスファゼンはイオンあるいは共有結合で架橋され安定した生物分解性微粒子を形成する。微粒子は胃腸管粘膜内層などの粘膜面に付着し、抗原が時間と共に放出されるにつれて抗原の細網内皮細胞による吸収を増加する。ポリホスファゼンはポリイオンあるいは塩化カルシウムなどの二価陽イオンでイオン架橋される。高分子電解質ヒドロゲルマイクロスフェアを含む合成ポリマーマイクロスフェアの調製法はこれまでに記載されてきた。しかしこれらの方法は有機溶媒および界面活性剤の使用を必要とする。このような方法の例はボーム、他に発行された合衆国特許番号４，９４８，５８６号に記載されている。ヒドロゲルマイクロスフェアあるいはナノ粒子は天然高分子電解質、例えばゼラチンおよび何らかの合成高分子電解質を用いて単純なコアセルベーション法で水溶液で調製することができる。高濃度の塩あるいは温度上昇がコアセルベート形成を誘導するために使用された。しかしこれらの方法に基づくマイクロスフェア調製は液体あるいは固体形態内で水不溶性「コア」物質、例えば油、パラフィンあるいは水不溶性薬剤の使用を必要とする（ディージー、他、マイクロカプセル化および関連製剤法．ニューヨーク、マーセル・デッカー，インコーポレイテッド、６１−９５ページ（１９８４）；ラプカ、他に発行された合衆国特許番号４，６２２，２４４号）。ポリマーに富んだコアセルベート小滴は分散水不溶性コア物質の表面に沈着し次いで合体して被覆を形成し、次いでそれは通常化学的手段により架橋結合する。コーエン、他に発行された合衆国特許番号５，１４９，５４３号はイオン架橋ポリホスファゼンヒドロゲルマイクロスフェアがポリホスファゼン水溶液を多価陽イオンを含む溶液内に噴霧することにより調製できることを教示する。この方法は次いでミクロンサイズ範囲でマイクロスフェアを生産するよう修飾された（ペイン、他、粘膜免疫学における進歩、メステッキ、他、編。ニューヨーク、プレナム・プレス、１４７５−１４８０ページ（１９９５））。しかしこの方法は複雑な噴霧装置を必要とし、またマイクロスフェア粒度分布を制御しとりわけミクロン範囲のサイズを持つマイクロスフェアを高収率で獲得しかつ狭い粒度分布を達成することは難しい。コーエン、他の特許は更にイオン架橋ポリホスファゼンヒドロゲルマイクロスフェアが一価イオンの存在下で不安定でありそれをｐＨ７．５の過剰水性塩化カリウムで処理するとイオン架橋の切断を生ずることを教示する。食塩加リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でのマイクロスフェアの分解も観察された（ベイノー、他、バイオテクノロジー、９巻、４６８−４７１ページ（１９９１））。オールコック．他、合衆国特許番号５，０５３４５１号もまた塩化カリウムの存在下でイオン架橋の切断を教示する。アクセロス、他、高分子、２７巻、２２号、６５９４ −６６０２ページ（１９９５）は塩化ナトリウムなどの一価塩が多価金属での高分子電解質のイオン架橋により形成されたヒドロゲルを溶解しあるいは沈澱させることを論証する。従って、この発明の目的は、温度上昇、有機溶媒、水不溶性コア物質、あるいは複雑な製造装置を使用せずに、制御されたマイクロスフェア粒度分布を持つイオン架橋ポリホスファゼンヒドロゲルマイクロスフェアを生産する方法を提供することである。このような方法では、ポリホスファゼンを含む溶液は一価イオンの塩を用いて水溶性コアセルセルベーションを受ける。この発明のも一つの目的は生物学的材料をマイクロスフェア調製前のポリホスファゼン溶液かあるいは調製されたポリホスファゼンマイクロスフェアのいずれかと混合することにより生物学的材料をカプセル化する方法を提供する。この発明の一つの見地に従って、ポリホスファゼンマイクロフェアを生産する一つの方法が提供される。このような方法では、ポリホスファゼンを含む溶液はコアセルベーションを受ける。ここで使用される「コアセルベーション」という用語は高分子溶液を２種の混和しない液相に分離させることを意味する。一つの相は高分子に濃縮された密なコアセルベート相（液滴相）であり、他の相はポリマー欠失相である。コアセルベーションはポリマーの分子脱水の結果であり、温度変化、非溶媒の追加、あるいは微小塩の追加（単純コアセルベーション）により誘導され、あるいはも一つのポリマーの追加より誘導されてインターポリマ一複合体を形成する（複合コアセルベーション）。コアセルベートは液晶および中間相として記載され、ミセルなどのようなより高度の構造的順序を持つ他のシステムよりも流体である。このようなシステムは力学的平衡にあり、条件の変化は一相システムの改質あるいは羊毛状塊もしくは沈澱物の形成のいずれかを生じる（バージェス、化学および生物学における高分子複合体、ドゥービン、他編、ベルリン、シュプリンガー−フェルラーク、２８５−３００ページ（１９９４））。コアセルベーションを用いてマイクロスフェアを製造する方法の利点は、それが有機溶媒、加熱、複雑な製造装置、例えば噴霧装置などの使用を避け、エアロゾルの生成を排除することにある。この方法は、高度に再生可能であり、噴霧法と比べて改良されより狭いマイクロスフェア粒子分布を持つマイクロスフェアを生成する。噴霧法で得られるマイクロスフェアとは逆に、コアセルベーションマイクロスフェアはより大きなサイズの凝集塊あるいは無定形沈澱物の有意な量を含まない。この結果はワクチン送達のためのマイクロスフェア調製にとって重要である。何故ならＭ細胞によるこれらマイクロスフェアの取り込みは１０μｍあるいはそれ以下の径を持つ粒子に限定されるからである（ペイン、他、１９９５）。コアセルベーション法の更なる利点はそれが成分の濃度を単に変更するだけでマイクロスフェアの大きさを制御できるということにある。一つの実施例において、ポリホスファゼンマイクロスフェアはポリホスファゼン高分子電解質を含む溶液を一価イオンの塩を含む溶液と混合してコアセルベート小滴を形成することにより生産される。この分散液は次いで多価イオンの塩を含む溶液と混合され、これによりマイクロスフェアは安定する。もし望まなければ、ポリホスファゼンマイクロスフェアは次いで分散液から回収される。ポリホスファゼンは交互に並ぶ単結合および二重結合により分離された交互に並ぶリンおよび窒素よりなるバックボーンを持つポリマーである。各リン原子は２個のぶらさがる基（「Ｒ」）に共有結合する。ポリホスファゼンの反復単位は下記の一般式を持つ。ここでｎは整数である。置換基（「Ｒ」）はポリマー内で変化できるさまざまな種類の成分の一つであることができ、必ずしもそれに限定されないが、脂肪族、アリル、アラルキル、アルカリル、カルボン酸、複素環式芳香族、グルコースを含む炭水化物、ヘテロアルキル、ハロゲン、アルキルアミノ−を含む（脂肪族）アミノ、ヘテロアラルキル、ジアルキルアミノ−、アリルアミノ−、ジアリルアミノ−、アルキルアリルアミノ−を含むジ（脂肪族）アミノ−：必ずしもそれに限定されないが、−オキシフェニルＣＯ₂Ｈ、−オキシフェニルＳＯ₃Ｈ、−オキシフェニルヒドロキシルおよび−オキシフェニルＰＯ₃Ｈを含む−オキシアリル：−オキシアルキル、 −オキシ（脂肪族）ＣＯ₂Ｈ、−オキシ（脂肪族）ＳＯ₃Ｈ、−オキシ（脂肪族）ＰＯ₃Ｈを含む−オキシ脂肪族、および−オキシ（アルキル）ヒドロキシルを含む−オキシ（脂肪族）ヒドロキシル：−オキシアルカリル、−オキシアラルキル、−チオアリル：−チオアルキル、−チオアルカリル、 −チオアラルキル、を含む−チオ脂肪族、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−（アリルあるいは脂肪族）、−Ｏ−［（ＣＨ₂）_xＯ］_y−（ＣＨ₂）、−Ｏ−［（ＣＨ₂）_xＯ］_y（ＣＨ₂）_xＮＨ（ＣＨ₂）_xＳＯ₃Ｈ、および−Ｏ−［（ＣＨ₂）_xＯ］_y−（アリルあるいは脂肪族）を含み、ここでｘは１−８でありｙは１乃至２０の整数である。この基は酸素、硫黄、窒素、あるいは炭素の原子を通じてリン原子に結合することができる。一般にポリホスファゼンが１個以上の型のぶらさがり基を持つ時に、この基はポリマー全体でランダムに変化し、またポリホスファゼンはかくしてランダムコポリマーとなる。リンは２個の類似の基、あるいは２個の異なった基と結合できる。２個もしくはそれ以上のぶらさがり基を持つポリホスファゼンはポリ（ジクロロホスファゼン）を望ましい求核試薬あるいは複数の求核試薬と望ましい割合で反応させて生産することができる。ポリホスファゼンのぶらさがり基の生成割合はポリマーを生産するのに使用される出発原料の割合、求核試薬置換反応が行われる温度、および使用される溶媒システムを含む多くの因子で決定されるであろう。一方で生成ポリマーにある基の正確な置換パターンを決定することは非常に難しいが、ポリマーにある基の割合は従来の技術に習熟した人にとっては容易に決定できる。ホスファゼン高分子電解質はポリホスファゼンに陰イオン、陽イオン、あるいは両親媒性を付与するイオン化あるいはイオン化可能ぶらさがり基を含むポリホスファゼンとしてここで定義される。イオン基は塩、あるいは選択肢として少なくとも部分的に解離しているあるいは解離できる酸あるいは塩基の形態をとることができる。いずれかの薬剤許容一価陽イオンは必ずしもそれに限定されないが、ナトリウム、カリウム、およびアンモニウムを含む塩の対イオンとして使用することができる。ホスファゼン高分子電解質はまた非イオン側基を含むことができる。ホスファゼン高分子電解質は使用条件により生物分解性あるいは非生物分解性にすることができる。イオン化あるいはイオン化可能ぶらさがり基は望ましくは使用条件の下で加水分解を受けない。望ましいホスファゼン高分子電解質はポリアニオンであり、カルボン酸、スルホン酸、ヒドロキシル、あるいはリン酸成分を含むぶらさがり基を含む。一方で酸性基は通常非加水分解能ぶらさがり基にあるが、それは選択肢としてあるいは組合せとして加水分解能基に位置することもできる。側鎖としてカルボン酸基を持つホスファゼン高分子電解質の例は下記の式で示される。ここでｎは整数、望ましくは１０乃至３００，０００の整数、また望ましくは１，０００乃至３０，０００の整数である。このポリマーは化学名ポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン］あるいは、選択肢として、ポリ［ビス（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＰＰ）を有する。ホスファゼン高分子電解質は身体の遠位部位、例えば脾臓でのポリマー分子の偶発的付着および累積を防ぐために望ましくは生物分解性のものである。ここで使用される生物分解性という用語は、望ましい適用で一度約２５℃−３７℃の温度でｐＨ６−８の生理溶液に露出されると、許容できる期間内、典型的には約５年以内およびもっと望ましくは約１年以内に分解するポリマーを意味する。ホスファゼン高分子電解質を含むポリホスファゼンは従来の技術に習熟した人に公知の方法に従って広範囲の化学試薬あるいは試薬の混合物と共にポリ（ジクロロホスファゼン）の高分子求核試薬置換反応により調製することができる。望ましくは、ホスファゼン高分子電解質はポリ（ジクロロホスファゼン）を塩素を置換する適切な１個もしくは複数の求核試薬と反応させることにより作れる。ポリマー内の加水分解能側鎖の非加水分解能側鎖に対する望ましい割合はポリ（ジクロロホスファゼン）と反応する対応する求核試薬の量および必要とされる反応条件を調節するとにより得られる。望ましいポリホスファゼンは１，０００個以上、より望ましくは約５００，０００個から約１，５００，０００個の分子量を有する。ポリホスファゼンは、例えば食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、無機あるいは有機緩衝液などの適切な溶液、もしくは例えばタンパク質、抗原、あるいはこれらの混合物など生物学的材料の水溶液に含まれる。ポリホスファゼンはいずれかの濃度、ｐＨ、およびイオン強度、望ましくは約０．０１％から約１．５％濃度、および７から８までのｐＨでの溶液に存在する。ポリホスファゼン溶液は、一価イオンの少なくとも一つの塩、例えばグループＩ元素の塩、例えばナトリウムあるいはリチウム塩などを含む溶液と混合される。使用される一価イオンの他の塩は必ずしもそれに限定されないが、アンモニウム塩を含む。一つの実施例において、一価イオンの塩はグループＩ元素の塩である。望ましくは、グループＩ元素の塩、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、あるいはリン酸ナトリウムなどのナトリウム塩である。望ましくは、ナトリウム塩は塩化ナトリウム、すなわちＮａＣｌである。一価イオンの塩は、いずれかの濃度およびｐＨ、望ましくは約０．１％から約４０％の濃度および７から８までのｐＨでの溶液に存在する。ポリホスファゼン溶液および一価イオンの塩を含む溶液との生成混合液はコアセルベート相の形成を可能にするのに十分な時間に耐えることを許される。すなわち、ポリホスファゼンのコアセルベート顕微小滴はこの混合液で形成される。かなりの量の顕微小滴が混合液内で形成された後、混合液は多価イオンの少なくとも１個の塩、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、あるいはカドミウムなどを含む溶液に加えられる。一つの実施例において、多価イオンはカルシウム塩、例えば塩化カルシウム、臭化カルシウムあるいは酢酸カルシウムである。望ましくは、カルシウム塩は塩化カルシウム、すなわちＣａＣｌ₂である。多価イオンの塩はいずれかの濃度およびｐＨ、望ましくは約１％から約２５％および７から８までのｐＨの溶液に存在する。溶液内のＣａ²⁺イオンは架橋剤として役立ち、これによりマイクロスフェアがカルシウム塩を含む溶液と接触した時マイクロスフェアは安定する。一価イオンの塩および多価イオンの塩を含む生成溶液内でのポリホスファゼンマイクロスフェアの懸濁液は安定したマイクロスフェアの懸濁液を形成するのに十分な時間攪拌される。もし望ましければ、次いでマイクロスフェアは従来の技術に習熟した人に公知の手段、例えば遠心分離により懸濁液から回収される。も一つの実施例において、マイクロスフェアはポリホスファゼンの水溶性インターポリマー複合体、および静電気、水素、あるいは疎水性相互作用により水溶性インターポリマー複合体を形成できるも一つの水溶性ポリマーを調製することにより形成される。一つの実施例において、このようなポリマーはポリ（酸化エチレン−酸化プロピレン）である。インターポリマー複合体は沈殿を起こさないいずれかの分子比率、いずれかのｐＨ、いずれかのイオン強度で、またいずれかの温度で、望ましくは７から８のｐＨでまた室温で形成することができる。コアセルベーションの誘導は次いでインターポリマー複合体コアセルベート小滴を形成するために前に述べられたような一価イオンの溶液の追加により実行される。顕微小滴は次いでマイクロスフェアを含む分散液を前に記載した多価イオンの塩を含む溶液に加えることにより安定する。コアセルベーションによるポリホスファゼンマイクロスフェアの調製はミクロン範囲（量で９０微分パーセントおよび数で９５微分パーセントまで）での大きさを持つ増加収率のポリホスファゼンマイクロスフェアの回収、および精緻な装置を使うことなく必要とあれば他の大きさのマイクロスフェアの生産を可能にする。前記に記載したように、コアセルベーションにより形成されたマイクロスフェアはさまざま予防薬あるいは治療薬の担体として使用される。一つの実施例において、マイクロスフェアは動物における免疫応答を引き出すことができる抗原などのような生物学的材料の担体として使用される。抗原は細胞、細菌、ウイルス粒子、あるいはそれらの組合せなどから誘導される。抗原はタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、あるいはそれらの組合せから誘導され、それらは哺乳類、鳥類、および魚類などの動物で免疫応答を引き出すことができる。免疫応答は体液免疫応答あるいは細胞媒介免疫応答である。免疫応答が指向する材料が抗原性の乏しいものである場合には、例えばいくつかの商業的に利用できる試薬キットを持つ標準共有結合技術を用いてアルブミンなどの担体あるいはハプテンに接合される。一つの実施例において、マイクロスフェアは核酸が発現される粘膜面に抗原をコード化する核酸配列を送達するために使用される。ポリホスファゼンマイクロスフェアに含まれる抗原の特殊な例は、必ずしもそれに限定されないが、インフルエンザタンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、およびＡ型ならびにＢ型肝炎タンパク質などのウイルスタンパク質；またロタウイルス、麻疹、おたふく風邪、風疹およびポリオなどから誘導される抗原：グラム陰性細菌細胞壁などの細菌タンパク質およびリポ多糖類：およびインフルエンザ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、ならびに淋菌などから誘導される抗原を含む。一般に抗原はマイクロスフェア全体に抗原が分散するようにコアセルベーションの前にポリマー溶液と混合される。抗原を含むマイクロスフェアは、非経口（静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内等）、経口、あるいは膜内外もしくは粘膜内投与を含む免疫応答を引き出す従来の技術に習熟した人に公知のいずれかの方法によりワクチンとして投与される。望ましくはワクチンは粘膜内に投与される。粘膜面の送達のルートとしての限定されない例は鼻腔内(あるいは一般に鼻腔関連リンパ系組織内)、呼吸器、膣および直腸である。用量は負荷される抗原により、またマイクロスフェア抗原投与で引き出される抗体の力価に基づく各抗原の投与のため用量およびスケジュールを濾過する標準技術により決定される。この発明は、これから図面と関連して説明される。ここで、図１はＰＣＰＰおよび塩化ナトリウムの混合により形成されるコアセルベーションシステムのための状態図であり、ここで塩化ナトリウムの濃度はポリマー濃度に対しプロットされる。図２はポリホスファゼンマイクロスフェアの調製の概略図である。図３はコアセルベーションおよび噴霧方法により調製される量および数によるマイクロスフェア径の微分パーセントのグラフである。図４はコアセルベーション法により調製されるイオン架橋ＰＣＰＰマイクロスフェアの電子顕微鏡写真である。図５は異なった濃度の塩に対する塩化ナトリウムでコアセルベート小滴を定温放置した時間毎のイオン架橋ＰＣＰＰマイクロスフェアの平均粒子サイズ経のグラフである。図６は異なった濃度の塩化カルシウムで調製されたイオン架橋ＰＣＰＰマイクロスフェアの量および数によるマイクロスフェアの微分パーセントのグラフである。図７は異なった濃度のＰＣＰＰで調製されたイオン架橋ＰＣＰＰマイクロスフェアの量および数によるマイクロスフェア径の微分パーセントのグラフである。この発明はこれから下記の実施例と関連して説明されるであろう。しかしこの発明の範囲はそれにより限定されることを意図するものではない。実施例１ポリホスファゼンコアセルベート小滴の調製コアセルベートシステムを形成するポリホスファゼン水溶液の能力はＰＣＰＰおよび塩化ナトリウムを用いて実証された。ＰＣＰＰ（分子量１０⁶ｇ／ｍｏｌ）が等量の０．２５％水酸化ナトリウム溶液に溶解され次いで脱イオン水で希釈され０．０１％−１．１１％（ｐＨ７．４）の濃度の範囲にある溶液が調製された。塩化ナトリウム水溶液も２−３０％の濃度の範囲で同様に調製された。ポリマー溶液が次いで塩化ナトリウム溶液と０．４ｍｌ：０．７４ｍｌの比率で混合され振動により攪拌された。溶液つまり分散液はコアセルベート小滴あるいは沈殿物の存在を確認するために顕微鏡で検査された。次いでポリマー濃度に対し混合液内での塩化ナトリウムの濃度をプロットすることにより状態図が固定された（図１）。この図は３種の主要な区域−コアセルベート、沈殿物、および均一溶液の領域を含む。実施例２イオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアの調製ＰＣＰＰのイオン架橋マイクロスフェアが、まずポリホスファゼン水溶液を塩化ナトリウム水溶液で液滴形成し次いで生成混合液を図２で示されるように塩化カルシウムの水溶液で処理することにより調製された。ＰＣＰＰ（分子量１．１ ×１０⁶ｇ／ｍｏｌ）の０．２％ＰＢＳ溶液４ｍｌと６．２％塩化ナトリウム水溶液７．４ｍｌが混合され、振動され６分間あるいは約４−６μｍの平均サイズを持つコアセルベート小滴が形成されるまで定温放置された。得られたコアセルベート分散液は次いで８．８％塩化カルシウム水溶液８００ｍｌ内に注がれた。懸濁液は磁気攪拌機を用いて２０分攪拌され次いでマイクロスフェアが遠心分離（３００ｒｐｍ、１０分）により分離された。マイクロスフェアは脱イオン水で洗浄され、同一条件で遠心分離により収集され、室温で貯蔵された。得られたマイクロスフェアは光学顕微鏡で検査した時球形をしており、無定形沈殿物は検出されなかった。数および量による粒子粒度分布はコールターＬＳ１００粒子測定器で分析され、せまい粒子粒度分布を示した。１０μｍ以下のマイクロスフェアの割合は９０％（量）および９９．７％（数）である（図３）。乾燥マイクロスフェアの電子顕微鏡写真は更にマイクロスフェアの均一粒度分布および球形を明らかにした（図４）。比較実験において、ＰＣＰＰの２．５％ＰＢＳ溶液が無菌大気平方インチ当り３５ポンドの下で超音波噴霧ノズル（ニューヨーク、ファーミングデール、メドソニック、インコーポレイテッド）にポンプで注入され、顕微小滴噴霧を生成し、それが７．５％塩化カルシウム溶液に衝突しそこで顕微小滴がカルシウムにより架橋されマイクロスフェアを形成した。マイクロスフェアは塩化カルシウム溶液で３０分定温放置され、遠心分離（２６０Ｏｒｐｍ，１５分）で収集され、脱イオン水で洗浄されまた同一条件で遠心分離により収集された。顕微鏡による観察はいくらか不規則の形状の無定形ポリマー凝集体と共に球状マイクロスフェアの存在を明らかにした。これらの結果はコールターＬＳ粒子測定器によるマイクロスフェア分散液の分析により確認された。サイズ幅１−１０μｍでの数によるマイクロスフェアの微分パーセントは比較的高い（７５％）けれども、量により計算された同一サイズ幅でのマイクロスフェアの割合は低く（１０％）これは大きな粒子の存在を示している（図３）。これらの粒子は光学顕微鏡での試験の下で無定形沈殿物として視覚的に検出できる。ＰＣＰＰの濃度および空気圧等のパラメーターの変化はマイクロスフェアのサイズの著しい変化なしで大きな量の無定形凝集体を典型的に形成した。かくしてマイクロスフェア調製のためのコアセルベーション方法の使用は無定形凝集体を形成することなく細い粒度分布のマイクロスフェアを生産することとなる。これまでの業績はＭ−細胞による粒子状材料の取り入れが１０μｍ以下の径を持つ粒子に限定され（ペイン、他１９９５）有効なワクチン送達担体の調製のためにはマイクロスフェア粒度分布を危険なものにすることを示している。かくして１０μｍ以下のサイズを持つマイクロスフェアのパーセントを噴霧法の１０％からコアセルベーションにより９０％にまで増加させることは事実上標的細胞まで送達できる材料を著しく増加させることになる。実施例３多様なサイズのイオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアの調製イオン架橋ＰＣＰＰマイクロスフェアのサイズに対する塩化ナトリウムの濃度および塩化ナトリウムの定温放置時間の作用が調査された。一連の０．２％ＰＣＰＰ（分子量１．１×１０⁶ｇ／ｍｏｌ）溶液が調製され、次いで０．４ｍｌ：０．７４ｍｌの割合で塩化ナトリウムの６．２％水溶液で液滴形成された。コアセルベーション工程は次いで８．８％塩化カルシウム４００ｍｌでポリマー顕微小滴の架橋により異なった時点で停止され、マイクロスフェアは実施例２に記載されたように分離され粒子サイズが分析された。得られたマイクロスフェアの平均径は次いで塩化ナトリウムでの定温放置時間に対してプロットされた（図５）。塩化ナトリウムに対する異なった濃度（４％，５．５％および７％）で得られた運動曲線も同じく図５で示される。これらの条件下で無定形沈殿物の形成は顕微鏡視察では検出されなかった。この結果は、マイクロスフェアのサイズが塩化ナトリウムの濃度および定温放置時間を変えることにより効果的に調節できることを示している。実施例４塩化カルシウム濃度の作用塩化カルシウム濃度のマイクロスフェア粒度分布に対する作用が実施例３の通りコアセルベート調製のための同一条件を用いて研究され、但し６．２％の濃度の１種のみの塩化ナトリウム溶液が使用された。コアセルベートシステムは異なった濃度の塩化カルシウム溶液（１％、９％および１５％）４００ｍｌで混合されて架橋された。マイクロスフェアは分離されその粒度分布は実施例３で記載された通り分析された。結果（図６）は広い範囲の塩化カルシウム濃度のものがそのサイズに影響を与えることなくマイクロスフェアを調製するために使用できることを示している。実施例５ポリマー濃度の作用０．０７％、０．２％および１％の濃度を持つＰＣＰＰ溶液が調製され、次いでマイクロスフェアが獲得され実施例３と同じ方法（塩化ナトリウムの濃度は６．２％であった）を用いて分析された。図７から見られるように、ポリマー濃度を増加させてもマイクロスフェア径の増加はほんの僅かであった。実施例６インフルエンザ抗原を含むイオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアの調製インフルエンザ抗原を含むＰＣＰＰのマイクロスフェアがポリホスファゼン− インフルエンザ抗原水溶液を塩化ナトリウム水溶液で液滴形成し、次いで図２で示されたように生成混合液を塩化カルシウムの水溶液で処理することで調製された。０．２％のＰＢＳ内ＰＣＰＰ溶液（分子量１．１×１０⁶ｇ／ｍｏｌ）６４ｍｌがＰＢＳ内インフルエンザ抗原溶液（２ｍｇ／ｍｌ）０．２５ｍｌと混合され、次いで６．２％塩化ナトリウム水溶液１１８ｍｌが加えられ、振動され、室温で６分あるいは平均サイズ約４−６μｍを持つコアセルベート小滴が形成されるまで定温放置された。コアセルベート分散液は８．８％塩化カルシウム水溶液１０リットルに注がれた。懸濁液は磁気攪拌機で２０分攪拌され次いでマイクロスフェアは遠心分離（３００ｒｐｍ、１０分）により分離された。マイクロスフェアは脱イオン水で洗浄され遠心分離で収集された。１０μｍ以下のサイスのマイクロスフェアのパーセントは７５（量）および９９（数）でなった。抗原カプセル化の効率はマイクロスフェアを沸騰水で加熱し、次いでゲル電気泳動で放出された変性タンパク質の量を測定することで決定された。カプセル化効率は９４％であった。実施例７ＦＩＴＣ−ＢＳＡのカプセル化０．２％のＰＣＰＰ（分子量＝１．１×１０⁶ｍｏｌ／ｇ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５ｍｌがＦＩＴＣ−ＢＳＡの０．５％水溶液１ｍｌと混合された。この溶液に６．２％塩化ナトリウム９．２５ｍｌが滴状に加えられ、混合液は振動された。定温放置２０分後あるいはかなりの量のマイクロスフェアが観察された時、コアセルベートは８．８％の塩化カルシウム１リットルにゆっくり注がれ１０分攪拌された。得られたマイクロスフェアは実施例３に記載されたように分離された。マイクロスフェアは黒ずんだ粒子に見え、形は球状で蛍光顕微鏡による検査では蛍光を発した。粒子粒度分析は数で９０％の粒子が１４．５μｍより小さく、また量で５０％のものが９．３μｍより小さいことを示した。実施例８イオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアの凍結乾燥マイクロスフェアはコアセルベーション工程で調製され、実施例２に記載の通り分離された。マイクロスフェア懸濁液は次いで３２時間凍結乾燥され、得られた乾燥材料は脱イオン水に再分散された。粒子粒度分析はマイクロスフェア粒度分布で著しい変化を明らかにしなかった。実施例９塩化リチウムを用いるマイクロスフェアの調製０．２％のＰＣＰＰのＰＢＳ溶液０．８ｍｌおよび４０％の塩化リチウム水溶液が混合され、振動され、室温で５分あるいは平均サイズ約４〜６μｍのコアセルベート小滴が形成された。次いで獲得されたコアセルベート分散液は８．８％の塩化カルシウム水溶液４００ｍｌに注がれた。マイクロスフェアは分離され、その粒度分布が実施例３に記載された通り分析された。粒子サイズ分析は数で９０％の粒子が６．６μｍより小さく、量で７５％が１２．４μｍより小さいことを明らかにした。実施例１０ＰＣＰＰ−ポリ（酸化エチレン−酸化プロピレン）インターポリマー複合体を用いるマイクロスフェアの調製水溶性インターポリマー複合体が０．５％ＰＣＰＰ水溶液０．２５ｍｌと１０％ポリ（酸化エチレン−酸化プロピレン）（モル比３：１、分子量１３，３００ｇ／ｍｏｌ）の水溶液０．０１９ｍｌを混合することにより調製された。得られた溶液は次いで１０％塩化ナトリウム水溶液０．１ｍｌに加えられ、次いで１５％塩化カルシウム水溶液で架橋された。マイクロスフェアは実施例３に記載された通り分離され、光学顕微鏡による検査では形は球状に見えた。この明細書で引用されたすべての特許、公開情報（公開特許出願を含む）、データベースアクセス番号、および寄託アクセス番号の開示はあたかもそれぞれのそのような個別特許、公開情報、データベースアクセス番号および寄託アクセス番号が特異的かつ個別的に引用例にとり込まれるべきであると指示されるかのように同じ範囲でその全体を引用例で特異的にここでとりこまれている。しかしこの発明の範囲は前記の特異的な実施例に限定されるべきでないことは理解されるべきである。この発明は特に記載されたもの以外にも実施されしかも以下の請求の範囲内にあることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ 39/00 39/05 39/05 39/08 39/08 39/095 39/095 39/102 39/102 39/13 39/13 39/15 39/15 39/165 39/165 39/20 39/20 39/21 39/21 39/245 39/245 39/29 39/29 47/34 47/34 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/14 31/14 31/16 31/16 31/18 31/18 31/20 31/20 31/22 31/22 Ｃ０７Ｋ 17/08 Ｃ０７Ｋ 17/08 Ｃ０８Ｌ 85/02 Ｃ０８Ｌ 85/02 Ｃ１２Ｎ 11/08 Ｃ１２Ｎ 11/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チェン，ジァンピンアメリカ合衆国，02173 マサチューセッツ，レキシントン，フランシスロード５

Claims

【特許請求の範囲】１．イオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアを生産する一つの方法であって、（ａ）水溶性ポリホスファゼン高分子電解質を含む水溶液を一価イオンの塩を含む溶液と混合してポリホスファゼンコアセルベート顕微小滴を含む分散液を形成し、（ｂ）前記分散液を多価イオンの塩を含む溶液と混合してポリホスファゼンマイクロスフェアの懸濁液を形成する、ことを含むイオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアを生産する方法。２．請求の範囲第１項記載の方法であって、更に（ｃ）前記イオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアを前記懸濁液から回収する、ことを含むことを特徴とする方法。３．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記一価イオンの塩がグループＩ元素の塩であることを特徴とする方法。４．請求の範囲第３項記載の方法であって、ここで前記グループＩ元素がナトリウムであることを特徴とする方法。５．請求の範囲第４項記載の方法であって、ここで前記一価イオンの塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする方法。６．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記多価イオンの塩がカルシウム塩であることを特徴とする方法。７．請求の範囲第６項記載の方法であって、ここで多価イオンの塩が塩化カルシウムであることを特徴とする方法。８．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記ポリホスファゼン高分子電解質がポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン］であることを特徴とする方法。９．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記マイクロスフェアが約１乃至約１０μｍの径を持つことを特徴とする方法。１０．イオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアを生産する一つの方法であって、（ａ）水溶性ポリホスファゼン高分子電解質を含む水溶液を水溶性ポリマーを含む溶液と混合して前記ポリホスファゼン高分子電解質および前記水溶性ポリマーの水溶性インターポリマー複合体を形成し、（ｂ）前記インターポリマー複合体を一価イオンの塩を含む溶液と混合して前記インターポリマー複合体のポリホスファゼンコアセルベート顕微小滴を含む分散液を形成し、（ｃ）前記分散液を多価イオンの塩を含む溶液と混合して前記インターポリマー複合体のマイクロスフェアの懸濁液を形成する。ことを含むイオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアを生産する方法。１１．請求の範囲第１０項記載の方法であって、更に（ｄ）前記マイクロスフェアを前記懸濁液から回収する、ことを含むことを特徴とする方法。１２．請求の範囲第１０項記載の方法であって、ここで水溶性ポリマーがポリ（酸化エチレン−酸化プロピレン）であることを特徴とする方法。１３．生物学的材料を含むイオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアを生産する一つの方法であって、（ａ）水溶性ポリホスファゼン高分子分解質および生物学的材料を含む水溶液を一価イオンの塩を含む溶液と混合してコアセルベート顕微小滴を含む分散液を形成し、（ｂ）前記分散液を多価イオンの塩を含む溶液と混合して生物学的材料を含む前記イオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアの懸濁液を形成する、ことを特徴とするイオン架橋ポリホスファゼンマイクロスフェアを生産する方法。１４．請求の範囲第１３項記載の方法であって、更に（ｃ）前記マイクロスフェアを前記懸濁液から回収する、ことを含むことを特徴とする方法。１５．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ここで前記一価イオンの塩がグループＩ元素の塩であることを特徴とする方法。１６．請求の範囲第１５項記載の方法であって、ここで前記グループＩ元素がナトリウムであることを特徴とする方法。１７．請求の範囲第１６項記載の方法であって、ここで前記一価イオンの塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする方法。１８．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ここで前記多価イオンの塩がカルシウム塩であることを特徴とする方法。１９．請求の範囲第１８項記載の方法であって、ここで前記多価イオンの塩が塩化カルシウムであることを特徴とする方法。２０．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ここで前記ポリホスファゼン高分子電解質がポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン］であることを特徴とする方法。２１．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ここで前記マイクロスフェアが約１から約１０μｍまでの径を持つことを特徴とする方法。２２．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ここで前記生物学的材料がタンパク質、生物活性合成化合物、核酸、多糖類、および抗原よりなるグループから選択されることを特徴とする方法。２３．請求の範囲第２２項記載の方法であって、ここで前記生物学的材料が抗原であることを特徴とする方法。２４．請求の範囲第２３項記載の方法であって、ここで前記抗原がロタウイルス、麻疹、おたふく風邪、風疹、ポリオ、Ａ型およびＢ型肝炎、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザ菌、破傷風菌、インフルエンザ、ジフテリア菌、および淋菌よりなるグループから誘導されることを特徴とする方法。