JP2000516253A - シアニジン組成物並びにそれらの治療的及び診断的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＦｃγＲＩ受容体に結合するためのシアニジン試薬を含んでなる組成物、並びにそれらを用いるための方法及びキットが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 シアニジン組成物並びにそれらの治療的及び診断的使用発明の背景 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）受容体（ＦｃγＲ） ＩｇＧ抗体分子はその特定のコグネイト抗原に対する２個の結合決定基（Ｆａ ｂとして知られている）及びその細胞受容体（ＦｃγＲ；Ｒａｖｅｔｃｈ、Ｊ． Ｖ．及びＪ−Ｐ．Ｋｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ．９：４５７ 中に概説される）に対する１個の結合決定基（Ｆｃ）を有する。ＦＣγＲＩ、Ｆ ＣγＲII及びＦｃγＲIIIと呼ばれる３種類のＦｃγＲがある。ＦｃγＲＩはＩ ｇＧＦｃに対する最も高い親和性を有し、単球及びマクロファージ上に、そして γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）により誘導された場合にヒト好中球上に存 在し、ＩＦＮ−γは単球及びマクロファージ上のＦｃγＲＩ発現も高める（Ｇｕ ｙｒｅ、Ｐ．Ｍ．等、１９８３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．７２：３９ ３）。インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）も単球上のＦｃγＲＩ発現の強力 なアップレギュレーターである（Ｃａｐｓｏｎｉ、Ｆ．等、１９９５、Ｊ．Ｌｅ ｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ ．５８：３５１）。ＦｃγＲＩの好中球発現は顆粒球−コロ ニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ；Ｒｅｐｐ、Ｒ．等、１９９１、Ｂｌｏｏｄ ７８： ８８５）によりほぼ４倍に、そして連鎖球菌咽頭炎中に約３倍に（Ｇｕｙｒｅ、 Ｐ．Ｍ．等、１９９０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８６：１８９２）増 加される。Ｇ−ＣＳＦ刺激は腫瘍細胞の高められた好中球による細胞毒性と関係 する（Ｇｏｓｓｅｌｉｎ、Ｅ．等、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３ ４７７）。 低親和性受容体ＦｃγＲIIの細胞分布はより広範であり、単球及びマクロファ ージに加えて好中球、血小板、Ｂ細胞、Ｔ細胞並びにおそらくマスト細胞及び好 塩基球に広がる。ヒトＦｃγＲIII受容体はマクロファージ及びマクロファージ 細胞系、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄前駆細胞並びに好中球細胞系に限 定される（Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、上記）。 ＦｃγＲを介した細胞と抗体−抗原複合体の相互作用は、抗体依存性細胞障害 、脱顆粒、食作用、並びにリンパ球増殖及び抗体分泌を調節する免疫賦活シグナ ルを初めとする一続きの反応を引き起こす。例えば、ＦｃγＲＩは抗原提示を高 めることに有効であり（Ｖａｌｅｒｉｕｓ、Ｔ．等、１９９３、Ｂｌｏｏｄ ８ ２ ：９３１）、そしてＦｃγＲＩの相補的名称ＣＤ６４はヒト前駆細胞混合物（ ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８⁺；欧州特許出願ＥＰ Ｏ ７０８ ３３６ Ａ２）内の顆粒単 球前駆細胞集団を識別するために用いられている。 さらに、ＦｃγＲＩに結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）はこの受容体の 発現のダウンレギュレーションを引き起こすことが示されており、そして慢性免 疫性血小板減少性紫斑病患者へのこのｍＡｂの投与は臨床的改善をもたらした（ Ｅｒｉｃｓｏｎ、Ｓ．Ｇ．、１９９６、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９２ ：７１８）。１家族の４人の健康なメンバーがＦｃγＲＩを欠いているという発 見は、ＦｃγＲＩ受容体のインビボ機能の分析を複雑にする（Ｃｅｕｐｐｅｎｓ 、Ｊ．Ｌ．１９８８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２：５７１）。ＰＥ−Ｃｙ５での細胞染色 タンデム色素ＰＥ−Ｃｙ５は２つの蛍光色素、Ｒ−フィコエリトリン （ＰＥ）及びＣｙ５．１８．ＯＳｕ（Ｃｙ５；Ｍｕｊｕｍｄａｒ、Ｒ．Ｂ．等、 １９９３、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：１０５）の組み合わせを含んでなる 。ＰＥ−Ｃｙ５は、例えば、抗−ＣＤ３４ｍＡｂに結合したＰＥ−Ｃｙ５でのフ ローサイトメトリー実験のカバー写真が付いた、ＣＤ３４の構造及び生物学を概 説するＢｌｏｏｄの１９９６年１月１日号に記述されたように（Ｋｒａｕｓｅ ＤＳ、等、１９９６、Ｂｌｏｏｄ ８７：１）、一般的にモノクローナル抗体（ ｍＡｂ）に結合して用いられる。 ＰＥ−Ｃｙ５タンデム色素はしばしば３色フローサイトメトリー分析のために他 の色素−ｍＡｂコンジュゲートと共に用いられるので「トリカラー」として知ら れている（Ｗａｇｇｏｎｅｒ ＡＳ、等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔ ｏｍｅｔｒｙ中、ｐ１８５（編集）Ａ．Ｌａｎｄａｙ等、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏ ｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３）。 インビボでＦｃγＲＩに特異的に結合する無毒の分子は様々な診断及び治療用 途に有用である。 発明の要約 一般的に、本発明は白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（白血球 （ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））上のＦｃγＲＩ種のＩｇＧ受容体に特異的に結合す る薬剤に関する。これらの化合物の機能的結合のために、本明細書ではこれらの 組成物の種類をＩｇＧ受容体Ｉリガンド（ＩｇＧ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ ｌｉ ｇａｎｄ）を表す「ＧＲＩＬ」と称する。これらの薬剤はシアニン、イダエイン 、ケラシアニン及びアステリンを例とする天然に存在する植物色素のシアニジン ファミリーのメン バーである。 一つの態様として、本発明は蛍光色素Ｃｙ５．１８．ＯＳｕ（Ｃｙ５と称する ）並びにコンジュゲート及び誘導体を例とするシアニン組成物の種類を特徴とす る。これらの組成物の一般的な特徴はまず機能的であり、それはそれらが単球及 びマクロファージ上に見いだされるＦｃγＲＩ ＩｇＧ受容体に高い親和性及び 特異性で結合することであり、そして好中球上に現れるように誘導することがで きる。第二の特徴は化学構造であり、少なくとも２つの部分で構成することがで き、その一方はシアニンスクシンイミジルエステル組成物種である。一つの態様 として、もう一方はフィコビリソームタンパク質のいずれかから得られ、ＰＥを 例とするが限定するメンバーではない。 別の態様として、本発明はＧＲＩＬ、例えばＣｙ５試薬を例とするシアニン化 合物及び治療薬を含んでなる治療組成物を特徴とし、好ましい態様としてその治 療薬は少なくとも１個のエピトープを含んでなる。一つの態様として、ＧＲＩＬ はＦｃγＲＩへの有用なエピトープの送達を導き、従って、ワクチン及び送達系 の両方である組成物を構成する。エピトープを病原性生物、癌マーカー及びアレ ルギー性物質よりなる広範な群から選択することができる。従って、患者にバク テリア、原生動物、ウイルスまたは真菌のような病原性生物の予防接種をするた めにこれらの化合物を用いることができる。好ましい態様として、ワクチンのエ ピトープはグラム陽性病原体由来、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）またはクロストリジウム・テタ ニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の細胞または分泌エピトープ由来 である。また、本発明はＧＲＩＬ及び癌マーカ ーからのエピトープを含んでなる１つまたはそれより多い型の癌のワクチンも特 徴とし、好ましい態様として癌マーカーはヒトＥＧＦ受容体ファミリー、ムチン ＴＡＧ７２ファミリー及び胎児性癌ファミリーよりなる群から選択される。 別の態様として、本発明はＧＲＩＬ及び化学療法細胞障害性抗がん剤、例えば 、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、アドリアマイシン、タキソール、ノ チルイミン（ｎｏｔｉｒｉｍｉｎｅ）を含んでなる治療組成物、またはＣｙ５試 薬及び放射性核種を含んでなる治療組成物を特徴とする。従って、治療薬はシア ニン、例えばＣｙ５または類似試薬の存在のためにＦｃγＲＩに向けられ、そし て例えば、骨髄性白血病、前骨髄性白血病または白血球粘着不全症の処置のため に有用である。 例えば、特発性血小板減少性紫斑病のような自己免疫疾患の患者を処置する目 的のために、化学療法または放射線療法ＧＲＩＬでＦｃγＲＩ受容体を標的とす る方法は本発明の別の態様である。本発明の薬剤は白血球上に位置するＩｇＧ受 容体を標的とするので、本発明の方法はそのような処置のために患者から取り出 された血液サンプルまたは骨髄サンプルから得られた細胞へのエクスビボでのこ れらの組成物の送達を含み、続いてその血液もしくは骨髄細胞サンプルまたはそ の細胞子孫をその患者に戻す。さらに、インターフェロン、インターロイキンま たはコロニー刺激因子を患者またはエクスビボの血液もしくは骨髄サンプルまた はそのようなサンプルから得られる細胞に投与してもよい。好ましい態様として 、患者はＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０またはＧ−ＣＳＦを投与される。 本発明の別の態様は患者からの血液サンプルまたは骨髄サンプル中のＦｃγＲ Ｉ（ＣＤ６４）を検出及び定量するための組成物及び診断方法 を特徴とし、それはサンプルをＧＲＩＬステインと接触させ、非特異的に結合し た試薬を取り除き、適切な励起波長の光をサンプルに照射し、そして血液サンプ ル中のＦｃγＲＩ保有細胞を示すものとして蛍光を放つ細胞を検出する工程を含 んでなる。好ましくは、少なくとも１つのさらなる色素試薬、例えば、フルオレ セイン試薬またはフィコエリトリン試薬をＧＲＩＬと共に用いる。好ましい態様 として、ＧＲＩＬで染色された細胞をフローサイトメトリーにより分析及び単離 する。別の態様として、ＧＲＩＬで染色された細胞を蛍光顕微鏡法により分析す る。これらの態様では、照射の励起波長は好ましくは約４７５ないし５０５ｎｍ の範囲にある。最も好ましくは、血液中のＦｃγＲＩの数は診断の指標であり、 それは検出方法が診断的に用いられる場合に適切な条件下で測定される。好まし い態様として、この方法は白血球接着不全症または骨髄性もしくは前骨髄性白血 病；感染及び／または炎症の存在の診断として；あるいは治療薬の投与中及び後 の治療をモニターするために用いられる。治療薬は好ましくはインターフェロン 、インターロイキンまたはコロニー刺激因子、特にＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０また はＧ−ＣＳＦである。 さらに別の態様として、本発明は化合物をスクリーニングし、そしてそれらの 中でＦｃγＲＩに結合する候補治療薬を同定する方法を特徴とする。この方法は 細胞の第一サンプルを候補薬剤と接触させ、そして細胞の第二サンプルをコント ロールバッファーと接触させ、次に細胞の第一及び第二の両方のサンプルをＧＲ ＩＬステインで染色することを含んでなる。特異的に結合した色素で細胞の蛍光 を引き起こすために適切な波長でサンプルを照射し、第二サンプルに比較して第 一サンプルの染色 を統計的に有意な程度まで減らす薬剤が可能性のある治療候補であるように、染 色された細胞の指標として蛍光を用いる。この方法は好ましくはこの方法により 可能性のある治療活性を有すると同定された化合物の各々の製薬学的製剤を調合 するさらなる工程も含んでなる。この方法により使用者はＩｇＧ受容体と相互作 用する低分子量薬剤候補を同定することができる。そのような薬剤候補はＦｃγ ＲＩ発現の調節またはＦｃγＲＩへのＦｃ結合の阻害に有用である可能性がある 。 また、本発明はＧＲＩＬステイン、バッファー、容器及び使用説明書を含んで なる、細胞上のＦｃγＲＩをアッセイするためのキットも特徴とする。このキッ トは診断目的のために有用である。本発明により包含される別のキットはＦｃγ ＲＩへのシアニジン及びＣｙ５試薬の吸着を阻止するために有用であり、抗−Ｆ ｃγＲＩ抗体、ＧＲＩＬステイン試薬、バッファー、容器及び使用説明書を含ん でなる。このキットはＦｃγＲＩへのＧＲＩＬ試薬の結合を阻止し、それ故、そ のような試薬を他の細胞表面分子を染色するために用いることができるはずであ る。 本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明及び請求からより明白になる。 図面の簡単な説明 図１は任意の単位の平均蛍光強度として表される、各々ＰＥ−Ｃｙ５が結合さ れたモノクローナル抗体で染色された、単離された血液細胞、Ｕ９３７細胞及び ＦｃＲでトランスフェクトされたIIＡ１．６細胞のフローサイトメトリー分析の 図式表示であり；非染色細胞は断続線（ｉｎｔｅｒｒｕｎｐｔｅｄ ｌｉｎｅｓ ）により表され；ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３及びＣＤ１９に特異的なモノクロー ナル抗体、マウスＩｇＧ１ アイソタイプコンジュゲートで少なくとも５回各実験を実施し；図１ａはコント ロールの提供者から単離された好中球（ＰＭＮ）を示し：図１ｂはＧ−ＣＳＦで ４日間処置した患者から単離されたＰＭＮを示し；図１ｃは示したようにＲＰＭ Ｉ １６４０培地／１０％ＦＣＳ中で培養されるかまたは３００Ｕ／ｍｌのＩＦ Ｎ−γを含むＲＰＭＩ培地中で一晩培養時のＵ９３７単球細胞を示し；図ｌｄは 単離時に染色された単球を示し；図１ｅはＦＩＴＣで標識されたＣＤ１４モノク ローナル抗体に基づくフローサイトメトリーにより単核細胞画分から選び出され た、赤血球の溶解後の全血中の単球を示し：図１ｆはヒトＦｃ７γＲIIａ、ヒト ＦｃγＲIIｂ、ヒトＦｃαＲ（＊で示す）またはヒトＦｃγＲＩでのネズミＢII Ａ１．６細胞トランスフェクタントを示す。 発明の詳細な説明Ｉ．一般に 本発明は特定のタンデム色素試薬がある種類の抗体受容体への特異的高親和性 結合というさらなる特性も有するという発見に関する。抗体は白血球（ｌｅｕｋ ｏｃｙｔｅｓ）（白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓ））により産生さ れ、そして特定の種類の白血球により主として結合される。本明細書に用いられ る「血液」という用語は具体的に未分画の血液だけでなく、いくつかの細胞を得 ることができる血液の画分、例えば、保存されているかもしくはヘパリンのよう な抗凝固剤で処理されている血液サンプル、または血液もしくは骨髄細胞を濃縮 するための遠心分離により得られた濃縮された細胞もしくは骨髄画分もさす。骨 髄及びその細胞成分は成熟血液細胞に分化する血液細胞前駆体及び幹細胞を含有 する。 血液の多数の疾患、例えば白血球粘着不全症（ＬＡＤ）と呼ばれる先天性免疫 不全症及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）として知られている血液癌が特性化され ている。ＬＡＤの先天性遺伝子はリガンド受容体のβサブユニットに影響を与え 、それは欠陥のある食細胞接着をもたらし、頻発するバクテリア及び真菌感染を 引き起こす。ＬＡＤの症状は著しい白血球増加である（１ｍｍ³当たり３０，０ ００−１５０，０００の範囲までの白血球数の上昇、Ｒ．Ｈ．Ｂｕｃｋｌｅｙ、 ＰｒｉｍａｒｙＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ｐ．１ ３５３、１９９３．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中、第三版 、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｍａｊｉｍａ、Ｔ．等、１９９０、Ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ ．１４５：１６９４）。インビトロで培養された急性前骨髄性白血病 細胞ＡＭＬ−Ｍ３は正常細胞または他の白血病の細胞よりかなり顕著にＰＥ−Ｃ ｙ５ステインに結合する（Ａｎｓａｒｉ、Ｍ．Ｑ．等、１９９５、Ｃｙｔｏｍｅ ｔｒｙ ２６：８３）。同様に、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ ）に結合された抗−ＥｃγＲＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて、急性炎 症の患者においてＥｃγＲＩレベルの上昇が観察されている（Ｄａｖｉｓ ＢＨ 、等、１９９５、Ｌａｂ Ｈｅｍａｔｏｌ １：３）。ＧＲＩＬは白血球上のＦ ｃγＲＩに特異的に結合し、そしてモノクローナル抗体より経済的で且つ製造及 び使用することが容易であるので、本発明の方法はこれらの疾患の診断のために 有用である。 さらに、ある種の薬剤での患者の処置、具体的にはＧ−ＣＳＦで処置される（ Ｒｅｐｐ Ｒ、等、１９９１、Ｂｌｏｏｄ ７８：８８５）かまたはＩＦＮ−γ で処置された（Ｇｕｙｒｅ ＰＭ、等、１９８３、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７２：３９３）患者からの細胞は、白血球生産に対す る刺激作用及び増加したＦｃγＲＩレベルを生じる。Ｆγ７ＲＩを刺激するこれ ら及び他の薬剤での診断及び成功した治療の、具体的には長い期間にわたって与 えられる治療プロトコルのモニタリングは本発明の用途として考えられる。この 診断用途は迅速さ、経済性及び患者サンプルの入手しやすさという利点を与える 。必要とされるサンプルは指の刺し傷からの１または数滴の血液であり、そして 必要な装置はある波長でのスライドの照射並びに別の波長での視覚化及び／また は写真撮影のためのフィルターを装備した蛍光顕微鏡である。診療室または外来 診察中を染色、対比染色及びすすぎに当てることができ、短期間内に結果を得る ことができる。 本発明は特に骨髄細胞に物質を送達するためにＦｃγＲＩに対するＧＲＩＬの 親和性を用いることを意図する。可能性のある抗がん剤である細胞障害性物質を 本発明のＧＲＩＬとの会合によるかまたはコンジュゲートとして骨髄細胞に送達 することができ；これらの物質はノチルイミン、アクチノマイシンＤ、マイトマ イシンＣ、アドリアマイシン及タクソールを例とするがそれらに限定されない。 放射性核種はイメージング及び治療用途のために医学的に有用であり、そして放 射のエネルギースペクトル及び放射性核種の半減期に基づいて選択される。ＧＲ ＩＬとの会合による骨髄細胞への送達のために好ましい放射性核種はテクネチウ ム−９３ｍ、テクネチウム−９５ｍ、テクネチウム−９９ｍ、レニウム１８６、 レニウム１８８及びレニウム１８９、並びにヨウ素−１２５及びＩ−１３１を含 むがそれらに限定されない。「結合された」という用語はイオン的または共有結 合的に（すなわち、架橋剤を介して）結合さ れることを意味する。 「治療薬」は受容者に対して生物学的作用を有することができる薬剤を意味す る。好ましい治療薬はワクチンの活性を保有するか、または受容体の発現を調節 することができる。薬剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬）、毒素 （例えば、リシン）、放射性核種（例えば、Ｉ−１３１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ− １８８、Ｙ−９０、Ｂｉ−２１２、Ａｔ−２１１、Ｓｒ−８９、Ｈｏ−１６６、 Ｓｍ−１５３、Ｃｕ−６７及びＣｕ−６４）、ホルモンアンタゴニスト（例えば 、タモキシフェン）、重金属錯体（例えば、シスプラチン）、オリゴヌクレオチ ド（例えば、標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）に結合するアンチセンスオ リゴヌクレオチド）、化学療法ヌクレオチド、ペプチド、非特異的（非抗体）タ ンパク質、ホウ素含有化合物（例えば、カルボラン）、光動的薬剤（ｐｈｏｔｏ ｄｙｎａｍｉｃ ａｇｅｎｔｓ）（例えば、ローダミン１２３）、エネジエン（ ｅｎｅｄｉｙｎｅｓ）（例えば、カリチェアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉ ｎｓ）、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）、ダイネミシン（ｄｙｎ ｅｍｉｃｉｎ）、ネオカルジノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ） 発色団及びケダルシジン（ｋｅｄａｒｃｉｄｉｎ）発色団）並びに転写に基づく 製薬を初めとする付加的活性を与える成分に治療薬を結合することができる。 「癌マーカー」という用語は特定の型の癌細胞の表面と特異的に関係する抗原 をさす。疾病の型と関係し、そして正常組織には見いだされないタンパク質の生 産により多数の型の癌を特性化することができる。これらのタンパク質はしばし ば胚の発生の特定の段階で用いられ、そして正常な成人の生涯中には見られない 。これらのマーカーは癌に対する治 療薬の設計において例えば、抗癌ワクチンのエピトープの供給源として特に有用 である。本発明はＧＲＩＬと適切なエピトープの結合によりＦｃγＲＩに癌特異 的エピトープを送達することを含んでなる。本発明においてエピトープの供給源 として予想される腫瘍マーカーの例は乳癌及び卵巣癌を含み、それらは性ホルモ ンに依存する癌である。乳癌は異常に発現される受容体、例えば、ヒトＥＧＦ様 受容体ファミリー（ＨＥＲ）のもの、例えばＨＥＲ−２、−３及び４を特徴とす ることができる。本発明はＨＥＲ抗原のこれらの態様に限定されない。性ホルモ ンに依存する癌のさらなる例は前立腺癌を含む（Ｓｍｉｔｈ、Ｐ．、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖｅｙｓ 第２３巻：Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ｐｒｏｓｔ ａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ 、Ｉｍｐｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎ ｄ ａｎｄ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒｓ）。正常な哺乳類の胎児の 発生中に神経上皮幹細胞により発現されるネスチンタンパク質は脳腫瘍の大部分 の型を初めとする中枢神経系の腫瘍上にも発現される（ＭｃＫａｙ、Ｄ．Ｇ．Ｒ ｏｎａｌｄ、米国特許第５，３３８，８３９号、８／１６／９４）。それは皮膚 上に見られる黒色腫及び他の組織に転移しているものにも発現され（Ｖ．Ａ．Ｆ ｌｏｒｅｎｅｓ、Ｒ．Ｈｏｌｍ、Ｏ．Ｍｙｋｌｅｂｏｓｔ、Ｕ．Ｌｅｎｄａｈｌ 、Ｏ．Ｆｏｄｓｔａｄ、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３５４−６） 、従って、検出及び処置することが困難である。 本発明の方法の他の腫瘍型はウィルムス腫瘍（Ａ．Ｊ．Ｂｕｃｋｌｅｒ、Ｋ．Ｍ ．Ｃａｌｌ、Ｔ．Ｍ．Ｇｌａｓｅｒ、Ｄ．Ａ．Ｈａｂｅｒ、Ｄ．Ｅ．Ｈｏｕｓｍ ａｎ、Ｃ．Ｙ．Ｉｔｏ、Ｊ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、Ｒｏｓｅ、Ｅ．Ａ．Ｒｏｓｅ 、米国特許第５，３５０，８４０号）、胃 腸癌（Ｒ．Ｆｉｓｈｅｌ等、国際出願ＷＯ９５／１４０８５、０５／２６／９５ ）、化学療法中の多剤耐性の発生を特徴とする癌（Ｊ．Ｍ．Ｃｒｏｏｐ等、米国 特許第５，１９８，３４４号）、並びに分析のために配列を当業者が利用できるＲｂ 、ｒａｓ及びｃ−ｍｙｃのような当業者によく知られている多数の癌遺伝子 のうちの少なくとも１つの存在を特徴とする癌を例とするがそれらに限定されな い。ＴＡＧ７２のようなムチン抗原を発現する腫瘍も、胎児性癌抗原（ＣＥＡ） ファミリーのタンパク質の少なくとも１つを発現する腫瘍と同様に、ワクチンと しての送達のために色素試薬中に混和されるエピトープの適当な供給源である。 ＣＥＡ遺伝子ファミリーは免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーに属する１ ７より多い近縁の遺伝子からなる。このファミリーの抗原を認識する抗体はＣＥ Ａスーパーファミリーの５亜群からのトランスフェクタントとそれらの反応性に 基づいて同定される。これらはａ−ＢＧＰ、ｂ−ＣＧＭ６、ｃ−ＮＣＡ、ｄ−Ｃ ＧＭＩ及びｅ−ＣＥＡ（ＤＡＫＯカタログ、抗−ＣＤ６６ａｂｃｅ）である。 また、抗原は微生物の表面または分泌産物と関係する。「病原体」という用語 は疾患を引き起こす生物を含むことを意味し、そのような疾患は疾病を引き起こ す生物であるバクテリア、ウイルス、真菌及び原生動物の１つまたはそれ以上の 特定の種により引き起こされる。本発明では、病原体はエシェリキア・コリ（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）血清型０１５７：Ｈ７、ヘリコバクター・ピ ロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター・ムステラ エ（Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈ ｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ）及びヘモフィルス・デュクレイ（Ｈ．ｄｕｃｒ ｅｙｉ ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒ ｕｇｉｎｏｓａ ）、シゲラ・ディセンテリア（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔ ｅｒｉａ ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）及びサ ルモネラ・パラチフィ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）のようなグラム陰性バクテリ ア種；マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍ．Ｌｅｐｒａｅ ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ス タヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ） 及びストレプトコッカス．ヘモリティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅ ｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ）のようなグラム陽性バクテリア種；リケッチア（Ｒｉｃｋ ｅｔｔｓｉａ ）及びクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種のような偏性細胞内バ クテリア生物；ＨＩＶ−１及び−２を初めとするがそれらに限定されない、相補 的ＤＮＡを合成するために逆転写酵素を用いるＲＮＡ含有ウイルスであるレトロ ウイルス；ＨＳＶ−Ｉ及び−II、非Ａ非Ｂ非Ｃ肝炎ウイルス、ポックスウイルス 並びに狂犬病ウイルスのような他の病原性ウイルス；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ）及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種のような真菌；クリプトス ポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、赤 痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）及びランブル鞭毛 虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）のような原生動物；並びにニュカッスル 病ウイルスのような動物病原体を例とするがそれらに限定されない。タンパク質 をスクリーニングすることにより、そしてインビトロでペプチドをアッセイする ことによりこれらの生物から独特 なエピトープを得ることは当業者に一般に知られており；多数の例が記述されて おり、そして適切なアミノ酸残基配列をジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）から入 手することができる。 「感染」という用語は当該宿主における病原体の持続及び増殖を含むことを意味 する。感染の存在を診断するために用いられる症状は熱、炎症、痛み、感染の部 位もしくはその近くでの関節及び筋肉の感覚を含むが、これらの症状の１つまた はそれ以上の欠如は当該宿主生物における感染を除外しない。「炎症」という用 語は感染に伴う一組の宿主反応を示し、感染がない場合でも例えば、自己免疫反 応、変性疾患、組織リモデリング疾患、アレルゲンへの露出及び／または他の疾 患の症状として存在することがある。炎症反応はプロテアーゼ、ヒスタミンの放 出を伴う好中球、マスト細胞及び好塩基球の脱顆粒のような細胞プロセス、並び に超酸化物生成、並びにインターフェロン及び腫瘍壊死因子のようなサイトカイ ンの生産及びそれらに対する反応を含む。急性炎症は高められたＣＤ６４発現の ために、ＦＩＴＣで標識された抗−ＣＤ６４ｍＡｂでの白血球の増加した染色と 関係する（Ｄａｖｉｓ、ＢＨ等、上記）。II ．蛍光色素 本発明の組成物、方法及びキットは蛍光用途のための色素、色素試薬及びタン デム色素試薬に関し、本発明はある種のこれらの色素及び試薬がＦｃγＲＩとし て知られているＩｇＧ抗体の受容体の種類に高い親和性及び特異性で結合するこ とを含んでなる。タンデム色素試薬は特定の波長または波長の範囲の光が分子の 片方の成分により吸収され、それが分子励起を経て次に異なる波長の光を出すよ うな（蛍光の特性）、２つまたはそれより多い共有結合的に連結された別個の色 素成分で構成され る。この第一成分により出される光はタンデムのもう一方の成分により実質的に 吸収され、それは次に別の波長の光を出す。これらの特性によりタンダム色素が 多数の蛍光色素の抗体コンジュゲートを用いて細胞型及び細胞構造の位置の同定 のために有用であることが分かっている。 いくつかの一般的に用いられる単一及びタンデム蛍光色素の光スペクトル特性 を表１に示す（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．カタログ、 「Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ」 、８／９５、ｐ．３から修正した形で複製される）。最大光吸光度のピーク、励 起及び発光のパラメーターにより単一の実験または分析において２つまたはそれ より多い蛍光色素を同時に使用することができる（例えば、Ｃｈａｎｇ、Ｔ．Ｗ ．１９９３、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２５６，５４２を参照）。 タンデム蛍光色素抗体コンジュゲートは細胞分離用途（Ｌｏｋｅｎ、Ｍ．Ｒ． 等、１９９２、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１３７，８０９）及び細胞分析のために用 いられ、異なる特異性の抗体に結合された単一色素成分で構成されるフルオレセ インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及び／またはフィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ またはＰＥ；Ｋｒｏｎｉｃｋ、Ｍ．、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ ｏｄｓ ９２：１；及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８５７，４７４、１９８９年８月 １５日）のような１つまたはそれより多い「単純な」蛍光色素と組み合わせて用 いられる。従って、各色素種は異なる細胞成分または分子に特異的な抗体に結合 される。他のものと組み合わせた色素の有用性は光エネルギー相互作用のスペク トルの２つの特徴：（１）各々ＦＩＴＣ及びＰＥと共に用いることができる以下 の表１に挙げたＰＥ−テキサスレッド及びＰＥ−Ｃｙ５ のような、単一の照射波長または狭い帯域の波長により色素分子が励起される程 度；及び（２）独特な色またはピークとして認識できるように他の色素と十分に 異なる波長の光を各励起色素分子が出す程度により決定される。第一の特徴によ り使用者は多重に染色された生物学的サンプルを単一の波長、この例では４８８ ｎｍで照射することができ、そして第二の特徴により使用者は各々特定の細胞型 または構造と関係する異なる色の発光を観察及び記録することができる。 表１．蛍光色素の例 観察及び分析の好ましい方法は光源並びに励起及び発光波長に適切なフィルタ ーを備えた顕微鏡での直接視覚化、並びに顕微鏡に装着したカメラの使用を含む 。この種類の色素試薬で適切に染色された生細胞の細胞分離及び計数のために最 も好ましい本発明の方法はＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）のようなフローサイトメトリ ー装置を用いた単離である。この装置は混合した細胞集団を例えばアルゴンレー ザー光源で４８８ｎｍで照射し、そしてバッファーのような動いている液体中で 検出される各細胞からの発光スペクトルシグナルを用い、発光の収集のための各 種 帯域フィルターを用いて細胞が検出器を通って流れる時に各細胞を分類する（例 えば、Ｌｏｈｍｅｙｅｒ、Ｊ．等、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏ ｄｓ １７２：５９を参照）。この装置は細胞集団を数えて且つ集めることがで き、さらなる分析及び使用のためのデータ及び細胞画分の両方を与える。 フローサイトメトリーは血液及び骨髄中の細胞集団中の異なる種類の細胞を分 離するために幅広く用いられており；白血病及びリンパ腫のタイピングの手段と して、異なる型の白血球を相互に分離するため（Ｈｏｗａｒｄ、Ｍ．等、１９９ ４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．（Ｌｏｎｄｏｎ）４７：１００６；Ｕ．Ｓ．Ｐ． Ｎ．５，２３４，８１６）並びに研究及び治療用途のために、他の細胞型から単 離して除かれた血液幹細胞前駆体画分を得るため（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１３７ ，８０９、１９９２年８月１１日）に特に有用であった。フローサイトメーター は臨床試験所の使用において日常的になってきている。細胞のいくつかのパラメ ーターを同時に測定することができ：前方散乱光は細胞の大きさを測定するため に用いられ；そして二次散乱検出器は細胞細胞質の粒状度に関する情報を与え、 白血球の様々な型を区別するために用いられる。 各々、特定のモノクローナル抗体に結合されている蛍光色素（ｆｌｕｏｒｅｓ ｃｅｎｔ ｄｙｅ） 「蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ）」から出され る蛍光はサイトメーターにより集められる。これらのパラメーターは用いられる モノクローナル抗体−色素コンジュゲートの特異性及び組み合わせにより広範な 用途を生じる。 ＦＩＴＣ、フルオレセインのイソチオシアネート（３’，６’−ジヒドロキシ スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−［９Ｈ］キサ ンテン］−３−オン；Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、第１１版、１９８９、Ｍｅｒｃ ｋ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）に結合された抗体を含んでなる多数 の試薬が利用できる。ＦＩＴＣは３８９ｋＤａの分子量及び４９５ｎｍの吸収極 大を有する蛍光色素である。４８８ｎｍの光によるその励起によりおよそ５２０ ｎｍで最大の蛍光発光を生じる。５３０＋／−１５ｎｍの帯域（ＢＰ）フィルタ ーを用いることによりこの蛍光色素の最適な検出が与えられる。ＦＩＴＣは高量 子収率（吸収から発光蛍光へのエネルギー移動の効率）を有し、そして吸収され た光子の約半分が蛍光として出される。結合相手（例えば、抗体、アビジンまた はストレプトアビジン）当たりのＦＩＴＣ分子の数は通常３ないし５分子の範囲 にある。フルオレセインの二ナトリウム塩は角膜損傷、眼内炎症の場合並びに眼 の血管造影及びコンタクトレンズ装着のために診断的に用いられる。 多数の抗体コンジュゲート試薬の別の蛍光色素成分、ＰＥは紅藻で見いだされ た補助（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）光合成色素であり、それは光合成中に光エネルギ ーをクロロフィルに移すようにインビボで機能する。この２４０ｋＤＡタンパク 質は１分子当たり各々線状テトラピロールの３４のフィコエリトロビリン蛍光色 素を有し、それらは４８８ｎｍの光により励起されると５７６ｎｍのピークの光 を発する。単一レーザーフローサイトメトリー使用には５８５＋／−２１ｎｍＢ Ｐフィルターが最適検出のために用いられる。二重レーザー系で複数色分析を実 施する場合には、用いられている他のコンジュゲートを補整するために検出のよ り厳重な窓、例えば５７５＋／−１３ｎｍＢＰフィルターが必要である。Ｐｈａ ｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ＰＥ製品の 結合化学は抗体または他のタンパク質当たり平均１個のＰＥ分子を生じる。 シアニンはヤグルマソウ（センタウレア・シアヌス（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ ｃ ｙａｎｕｓ ））から単離され、構造的にシアニジンの３，５−ジグルコシドであ り、それは２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３，５，７−トリヒドロキ シ−１−ベンゾピリリウムクロリドであり、バナナから単離された（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、上記）。別のシアニジン誘導体、スミノミザクラから単離された ３−ラムノグリコシドは夜盲症の治療用途を有すると記述されている。コケモモ （ワクシニウム・ミルチルス（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍｙｒｔｉｌｌｕｓ））果 実のアントシアノシドは栄養と薬効のある栄養剤として販売され、ある製造業者 （Ａｍｒｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｕ１ｄｅｒ、ＣＯ）によると、それは血管拡張 を改善し、毛細血管透過性を減少し、血管中のコラーゲンを保護し、酸化防止剤 として作用し、そして炎症過程の制御を補助するために経口で飲まれ、一般視力 、胃裏層、血液脳関門、並びに脚及び腸の静脈を改善する（Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎ ．Ｎｅｗｓ １６（１１）、ｐ．２７、１９９６）。 Ｃｙ５．１８．ＯＳｕとも呼ばれるシアニジン誘導体色素Ｃｙ５は化学構造５ ，５’−ビス−スルホ−１，１’−（ε−カルボキシフェニル）−３，３，３’ ，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−ジスクシンイミジルエステルを 有する（Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ等、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏ ｍｅｔｒｙ中、ｐ．１８５（編集）Ａ．Ｌａｎｄａｙ等、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏ ｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３）。 スルフィドリル基のシアニン色素標識試薬（Ｅｒｎｓｔ、Ｌ．Ａ．等、１９８９ 、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １０：３）及びカルボキシメチルインドシアニンスクシ ンイミジルエステル（Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ、Ｐ．Ｌ．等、１９９０、Ｃｙｔｏｍ ｅｔｒｙ １１：４１８）は記述されており、そして組成物が特許出願（ＵＳＰ Ｎ４，９８１，９７７及び５，２６８，４８６）に請求されており、それらの特 許及び公開の内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。Ｃｙ５の構造 、並びにその合成並びに光の吸収及び発光のスペクトルはＭｕｊｕｍｄａｒ、Ｒ ．Ｂ．、１９９３、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：１０５に示されている。Ｃ ｙ５はスルホインドシアニンスクシンイミジルエステルとして記述され、それら はインドシアニン発蛍光団の芳香族核上に負に荷電したスルホネート基を含有す るアミノ反応性シアニン色素である。このファミリーのＣｙ５メンバーは２個の 置換された環構造を連結する５−炭素の不飽和ポリメチン架橋を特徴とする。６ ３３ｎｍＨｅＮｅレーザー線またはＤｒレーザーの６４７ｎｍ線でＣｙ５を励起 することができる。Ｃｙ５及びその誘導体は光安定性が顕著であり、それはフル オレセインのものに匹敵するかまたはそれより優れている。２５０，０００の吸 光係数（Ｌ／ｍｏｌ ｃｍ）は非常に高い。類似した構造及び合成の方法を有す る関連色素（Ｍｕｊｕｍｄａｒ等、上記）は本明細書では「Ｃｙ５」という表現 の中に包含され、それ故、この表現は一般にシアニン色素標識試薬のスルホイン ドシアニンスクシンイミジルエステル、例えば、（Ｃｙ３として知られている） Ｃｙ３．２９．ＯＳｕ及ひＣｙ７．１８．ＯＨを包含する。Ｃｙ５試薬、Ｃｙ５ コンジュゲート及びＣｙ５誘導体という用語は少なくともＣｙ５成分及び別の分 子の存在を含んでなるコンジュ ゲートを意味する。この基本構造のさらなる新規誘導体、シアニン試薬のスルホ ベンゾインドシアニンスクシンイミジルエステルが記述されており（Ｍｕｊｕｍ ｄａｒ、Ｓ．Ｒ．等、１９９６、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ ７：３５６）、そ れらはＣｙ５及び他のスルホインドシアニンスクシンイミジルエステルの特性を 共有し、そしてＦｃγＲＩに親和性及び特異性を有して結合すると考えられる。 単一の４８８ｎｍアルゴンイオンレーザー線での励起により３色の蛍光を生じ るために、ＰＥとタンデムのＣｙ５で構成されるＣｙ５試薬ＰＥ−Ｃｙ５を用い ることがＷａｇｇｏｎｅｒ等、１９９３、上記中に最適化の条件であるとして記 述されている。テキサスレッドに基づくタンデム色素の主要な問題は一方の成分 の不安定性に起因し、使用中にもう一方の成分のスペクトル中への発光の漏洩を もたらし、そのもう一つの成分の波長またはその近くて光を発するテキサスレッ ド色素を使用する能力を制限している。しかしながら、Ｃｙ５及びその試薬ファ ミリーの色素はテキサスレッドより長い波長の光を発し、その結果、他の色素と 共にＣｙ５を用いることから得られるデータの分析は検出窓の設定及び後の計算 において最小の経路補整を必要とする。コンジュゲートの１分子当たりに結合さ れるＣｙ５分子の数の比率は合成生成物の相対発光波長スペクトルに影響を及ぼ すので、Ｃｙ５試薬の最適形態使用のために考慮すべき事柄はそれらの成分から のＣｙ５試薬の合成の工程を含む。従ってＰＥ−Ｃｙ５では、より多数のＣｙ５ 分子が各ＰＥに最適範囲まで結合されるにつれてＰＥからＣｙ５へのエネルギー 移動の効率が増加し、それを越えると過剰のＣｙ５成分間の消光相互作用が見ら れる。最適比率はＰＥ−Ｃｙ５タンデム色素中の１ＰＥ当たり４ないし８のＣｙ ５である（Ｗａｇｇｏｎｅｒ等、１９９３、上記）。タンデム色素は光感受性で あり、以下の実施例に示すように、暗条件下で色素を保存及び使用し、実験を実 施すると使用中の安定性が改善される。 以前に合成されたタンデム色素のものに比較して、ＰＥ−Ｃｙ５の蛍光の量及び バックグラウンドの欠如により向上したシグナルの大きさのために、それは抗体 −色素コンジュゲートでの細胞分析研究のためのうまくいく分析手段になる。し かしながら、異なる製造業者からの各種ＰＥ−Ｃｙ５製品の骨髄細胞への「非特 異的」結合の少なくとも１つの報告が発表されており（Ｓｔｅｗａｒｔ ＳＪ、 等、上記）、ＰＥ−テキサスレッドコンジュゲートはこの特性を示さないのでそ れはＣｙ５成分に起因すると考えられる。それに反して、Ｔａｋｉｚａｗａ等は 低親和性マウスＩｇＧ受容体ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIへのＰＥ及びそのｍＡ ｂコンジュゲートの結合を報告している（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ 、１９９３、１６２：２６９）。 本発明は以下の実施例に記述するように、Ｃｙ５試薬、例えば、Ｃｙ５、ＰＥ −Ｃｙ５及び抗体コンジュゲート並びに関連試薬の予期せず本質的特異的な結合 親和性を特定し、そしてフローサイトメトリー並びに診断、スクリーニング及び 治療用途のためのこれらの使用方法を提供する。本明細書に使用される「ＰＥ− Ｃｙ５」という用語はフィコエリトリン及びＣｙ５．１８．ＯＳｕで構成される 特定のタンデム色素を示し；「ＰＥ−Ｃｙ５試薬」という用語は例えば抗体への ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート、遺伝子工学による結合タンパク質及びぺプチド（ Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２３３，４０９及び５，４０３，４８４）、アビジン、ビ オチンまたは他の分子の存在を示すがそれらに限定されない。 一般的に、本発明は片方がシアニンスクシンイミジルエステル組成物種の色素 である２成分で構成されるＦｃγＲＩの有用な特異的リガンドを作製することを 意図する。ＦｃγＲＩのこの特異的リガンドをＩｇＧ受容体Ｉリガンドを表す「 ＧＲＩＬ」と称する。本発明のＧＲＩＬの厳密な光吸収、励起及び発光スペクト ルは、診断のような本明細書のいくつかの用途には有用であるが、治療のような 他の用途のために必要な高親和性及び特異性に必須の特性ではない。応用のため のＧＲＩＬの使用分野が蛍光染色を必要とする場合は、ＧＲＩＬは「ＧＲＩＬス テイン」または「ＧＲＩＬ色素」と呼ばれ、そしてそのような組成物で染色され た細胞は「ＧＲＩＬで染色された細胞」のように表される。さらに、フィコブリ ソーム成分及びシアニンスクシンイミジルエステル成分で構成されるＧＲＩＬ新 規組成物で、該タンデム色素が例えば抗体、結合タンパク質、アビジンまたは他 の置換基でさらに置換されるものは本明細書において「ＧＲＩＬ組成物」または 「ＧＲＩＬ試薬」と呼ばれる。III ．抗体及び抗体受容体 ＩｇＧ分子の受容体はＦｃγＲとして知られており、好中球及び好酸球上に誘 導でき、そのうちＦｃγＲＩは単球及びマクロファージ上に見いだされる高親和 性受容体である（Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ ＪＧＩ、等、１９９３、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４：２１５）。低親和性ＩｇＧ受容体は好中球（多形 核好中球、ＰＭＮ）、単球及び血小板上に見いだされるＦｃγＲII並びにマクロ ファージ、ＰＭＮ及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ）上に見いだされるＦｃγＲ IIIである。また、低親和性ＩｇＧ受容体はマスト細胞及びＴ細胞のサブセット 上にも見いだされる（Ｒａｖｅｔｃｈ等、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ．９ ： ４５７）。これらの受容体へのＩｇＧの結合と関係する生物学的機能は食作用、 超酸化物生成、細胞毒性及びメティエーター放出の誘発を含む。ＦｃγＲＩはそ の高親和性のためにインビボでＩｇＧで飽和されているかもしれず、定常状態の 状況を示唆するので、その生物学的役割は完全には決定されていない。連鎖球菌 の感染中のＦｃγＲＩの発現の誘導（Ｇｕｙｒｅ、Ｐ．Ｍ．等、１９９０、Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ．８６：１８９２）、慢性肉芽腫症の患者のＩＦＮ−γ 処置中の誘導、及び健康な個体におけるごくわずかな量から急性炎症中の多数ま での好中球上の誘導（Ｄａｖｉｓ、ＢＨ等、上記）を初めとするデータから、感 染に対する抵抗性における重要な役割が示唆される（Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅ ｌ ＪＧＩ、等、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４；２１５）。 抗体はエピトープとして知られている外来分子の認識の単位に反応して高等動 物の免疫細胞により合成されるタンパク質である。高等動物で典型的に循環して いる抗体分子の集団は、動物がさらされている免疫原の集団に見いだされる多数 の異なるエピトープのいずれかに各々が特異的である多数組の抗体を含んでなる ので、その集団は「ポリクローナル」として知られており、それらの各抗体はそ のコグネイトエピトープに対する特異的親和性を特徴とする。エピトープは最も 小さい抗原性決定基であり、それはタンパク質では６ないし８残基の長さのペプ チドを含んでなる（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、Ｊ．及びＩ．Ｂｅｒｋｏｗｅｒ、（１ ９９３）Ｐａｕｌ、Ｗ．、編集、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ 中、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、ｐ．２４６）。抗体分子のそのコグ ネイトエピトープに対する親和性は低いもの、例えば１ ０^-6Ｍから高いもの、例えば１０^-11Ｍまでである。 本明細書に用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組 成物」という用語は単一分子組成の抗体分子の調製物をさす。モノクローナル抗 体組成物は特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。培養 における細胞の連続増殖により抗体分子の生産を与える技術を用いてモノクロー ナル抗体を調製することができる。これらはＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ により最初に記述されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６ ：４９５−４９７；Ｂｒｏｗｎ等、１９８１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １２７：５ ３９−４６；Ｂｒｏｗｎ等、１９８０、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５：４９ ８０−８３；Ｙｅｈ等、１９７６、ＰＮＡＳ ７６・２９２７−３１；及びＹｅ ｈ等、１９８２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９−７５も参照））並 びにより最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ等、１９８３、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌ ｅ等、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａ ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７− ９６）及びトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術を含むがそれらに限定されない。 「外来」抗原に対する免疫反応は、生物内て発現される「自己」タンパク質及 び他の分子がその生物にとって抗原性または免疫原性ではないという認識を含ん でなる。実際、同級または同族の決定基と「外来」または異種起源の決定基の間 の識別は免疫系の発達中に生物の免疫系の成熟を通して得られる。「自己」に対 する結合決定基を有する抗体を保有する免疫細胞に対する選択の系が起こり、そ の結果、成熟すると免疫系 は生物に生来のタンパク質または他の分子を攻撃しない。しかしながら、「自己 免疫疾患」として知られているある種の異常疾患では、そのような識別が厳正で はなく、内因性構造が免疫系からの攻撃を受ける可能性がある。症状の自己免疫 悪化がある自己免疫疾患及び疾病の例は全身性エリテマトーデス、重症筋無力症 、多発性硬化症及び慢性関節リウマチを含む。（米国ＨＨＳ省、１９９２年デー タによると）米国の約１５０，０００人の患者を冒す一つの自己免疫疾患の特発 性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）は、自己抗原て被覆された血小板を循環から除 く脾臓及び肝臓中のマクロファージに起因する。自己抗体は通例ＩｇＧアイソタ イプを有し（Ｓｃｈｗａｒｚ、Ｒ．Ｓ．、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１９９３、ｐ．１０７５、Ｆｕｎｄ ａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中、第３版、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、編集、 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）、この疾患は連続的な血小板破壊をもたらす。 本発明の組成物の種類はＦｃγＲＩ受容体上の部位に対する結合決定基を含んで なるために、この受容体上の部位に結合することができる。そのために、発明さ れた組成物は細胞表面上のこれらの受容体の数を調節することもでき、さらにこ れらの受容体の機能的部分に結合して抗体結合と競合することができ、従って、 自己免疫疾患の処置のための可能性のある薬剤である。さらに、抗体結合決定基 のＦｖ領域のアミノ酸残基配列データは、この結合部位を含んでなる残基の組の 大きさ、電荷及び形状のようなタンパク質の特徴の３次元モデルを得るための基 礎であり、その結果、受容体に結合する薬剤の部分を合成することができ、この 結合部位に似た薬剤を設計することができる。 抗原の１つの型はアレルゲンである。「アレルゲン］は敏感な患者においてア レルギー性または喘息性反応を引き起こすことができる物質をさす。ある集団の ある割合に感受性反応を引き出すアレルゲンの数は莫大であり、花粉、昆虫毒、 動物鱗屑、チリダニタンパク質、真菌胞子及び薬剤（例えば、ペニシリン）を含 む。天然の動物及び植物アレルゲンの例は以下の属：フェリス（Ｆｅｌｉｓ）（ フェリス・ドメスチカス（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））；カニス（Ｃ ａｎｉｓ ） （カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ） ）；デルマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）（例えば、デ ルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｆａｒｉ ｎａｅ ））；ペリプラネタ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）（例えば、ペリプラネタ ・アメリカナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））；アンブロシ ア（Ａｍｂｒｏｓｉａ）（アンブロシア・アルテミイスフォリア（Ａｍｂｒｏｓ ｉａ ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ ））；ロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）（例えば、 ロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）またはロリウム・マルチ フロラム（Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；クリプトメリア（Ｃｒ ｙｐｔｏｍｅｒｉａ ） （クリプトメリア・ジャポニカ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉ ａ ｊａｐｏｎｉｃａ ））；アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）（アルテ ルナリア・アルテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ））；ア ルナス（Ａｌｎｕｓ）（アルナス・グルチノサ（Ａｌｎｕｓ ｇｕｌｔｉｎｏｓ ａ ））；ベツラ（Ｂｅｔｕｌａ）（ベツラ・ベルコサ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒ ｕｃｏｓａ ））；クエルカス（Ｑｕｅｒｃｕｓ）（クエルカス．アルバ（Ｑｕｅ ｒｃｕｓ ａｌｂａ ））； オレア（Ｏｌｅａ）（オレア・ユーロッパ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａ））：アル テミシア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）（アルテミシア・ブルガリス（Ａｒｔｅｍｉｓ ｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））；プランタゴ（Ｐｌａｎｔａｇｏ）（例えば、プラ ンタゴ・ランセオラタ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ））；パリエ タリア（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）（例えば、パリエタリア・オフィシナリス（Ｐ ａｒｉｅｔａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ ）またはパリエタリア・ジュダイ カ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｊｕｄａｉｃａ））；ブラテラ（Ｂｌａｔｔｅｌｌ ａ ）（例えば、ブラテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃ ａ ））；アピス（Ａｐｉｓ）（例えば、アピス・マルチフロラム（Ａｐｉｓ ｍ ｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ ））；クプレッサス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）（例えば、ク プレッサス・センペルピルンス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎ ｓ ）、クプレッサス・アリゾニカ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ） 及びクプレッサス・マクロカルパ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｍａｃｒｏｃａｒｐａ ））；ジュニペルス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ）（例えば、ジュニペルス・サビノイ デス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、ジュニペルス・ビルギニ アナ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、ジュニペルス・コミュニ ス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）及びジュニペルス・アシェイ（Ｊ ｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ ））；ツヤ（Ｔｈｕｙａ）（例えば、ツヤ・オリ エンタリス（Ｔｈｕｙａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））；カメシパリス（Ｃｈａｍ ａｅｃｙｐａｒｉｓ ）（例えば、カメシパリス・オブツサ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐ ａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ ））；アグロピロン（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）（例えば、 アグロピロン・レペンス （Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｒｅｐｅｎｓ）；セカレ（Ｓｅｃａｌｅ）（例えば、セ カレ・セレアレ） （Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））；トリチカム（Ｔｒｉ ｔｉｃｕｍ ）（例えば、トリチカム・アエスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓ ｔｉｖｕｍ ））；ダクチリス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）（例えば、ダクチリス・グロ メラタ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ））；フェスツカ（Ｆｅｓｔｕ ｃａ ）（例えば、フェスツカ・エラリオル（Ｆｅｓｔｕｃａ ｅｌａｒｉｏｒ） ）；ポア（Ｐｏａ）（例えば、ポア・プラテンシス（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉ ｓ ）またはポア・コンプレッサ（Ｐｏａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ））；アベナ（Ａ ｖｅｎａ ）（例えば、アベナ・サチバ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ））；ホルカ ス（Ｈｏｌｃｕｓ）（例えば、ホルカス・ラナタス（Ｈｏｌｃｕｓ ｌａｎａｔ ｕｓ ））；アントキサンタム（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ）（例えば、アントキ サンタム・オドラタム（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ））；ア レナテラム（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ）（例えば、アレナテラム・エラリウ ス（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ ｅｌａｒｉｕｓ））；アグロスチス（Ａｇｒ ｏｓｔｉｓ ）（例えば、アグロスチス・アルバ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ａｌｂａ） ）；フレウム（Ｐｈｌｅｕｍ）（例えば、フレウム・プラテンス（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ ））；ファラリス（Ｐｈａｌａｒｉｓ）（例えば、ファラリス ・アルンジナセア(Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ)）；パスパルム （Ｐａｓｐａｌｕｍ）（例えば、パスパルム・ノタタム（Ｐａｓｐａｌｕｍ ｎ ｏｔａｔｕｍ ））；ソルギュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ）（例えば、ソルギュム・ハレ ペンシス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ））及びブロマス（Ｂｒｏｍ ｕｓ ）（例えば、ブロマス・ イネルミス（Ｂｒｏｍｕｓ ｉｎｅｒｍｉｓ））に特異的なタンパク質を含む。IV ．製薬学的組成物 本発明の化合物をインビボでの患者への投与のために適当な製薬学的組成物中 に混和することができる。好ましい態様として、製薬学的組成物はＧＲＩＬ、本 発明のＧＲＩＬ組成物または試薬及び製薬学的に許容しうる担体を含んでなる。 本発明のさらに別の態様として、製薬学的組成物を組み合わせ治療により、すな わち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、組み合わせ治療は 少なくとも１つの抗がん剤、１つの抗生物質、１つのワクチンまたは他の通常の 治療と本発明の組成物を含むことができる。 さらに、組織、例えば血液または骨髄の細胞を患者から取り出し、分画し、必 要な場合、細胞数を増やすために培養し、製薬学的に許容しうる担体中ＧＲＩＬ 、例えばＣｙ５試薬でエクスビボで処理し、そして治療のために患者に戻すこと ができる。エクスビボでの培養及び増殖中に、特定の細胞型、例えば、単球もし くは好中球集団またはそのような白血球の幹細胞を選択することができる。さら に、エクスビボでの培養及び増殖中の様々な時点で、エクスビボで培養された細 胞をある種の機能的ＦｃγＲ分子を改変するように薬剤で処理することができる 。薬剤は成長因子、サイトカイン、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子（Ｔ ＮＦ）、顆粒球マクロファージーコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなリ ンホカイン並びにＩＬ−２、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のようなインターロイキ ンを含むがそれらに限定されない。本発明の好ましい薬剤はＩＦＮ−γ、Ｇ−Ｃ ＳＦ及びＩＬ−１０を含む。 本明細書に使用される場合、「製薬学的に許容しうる担体」は生理的に適合す るあらゆる及び全ての溶媒、分散媒質、被覆、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収 遅延剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）等を含む。製薬学的有効物質のためのそのような媒質及び薬剤 の使用は当該技術分野でよく知られている。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内 、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適し ている。投与経路により、酸の作用または化合物を不活性化する可能性のある他 の自然条件から化合物を保護するための材料中に有効化合物を被覆することがで きる。 本明細書に用いられる「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語 句は、通常注射による、腸及び局所的投与以外の投与形態を意味し、限定せずに 、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経 気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射 及び注入を含む。 「製薬学的に許容しうる塩」は親化合物の所望する生物学的活性を保持し、い かなる望まれない毒物学的作用も与えない塩をさす（例えば、Ｂｅｒｇｅ、Ｓ． Ｍ．等、１９７７、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。そのよ うな塩の例は酸付加塩及び塩基付加塩を含む。酸付加塩は塩酸、硝酸、リン酸、 硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等のような無毒の無機酸並びに脂肪 族のモノ−及びジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアル カン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸等のような無毒の有機酸から得 られるものを含む。塩基付加塩はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシ ウム 等のようなアルカリ土類金属及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ− メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレン ジアミン、プロカイン等のような無毒の有機アミンから得られるものを含む。 本発明の組成物を当該技術分野で知られている様々な方法により投与すること ができる。当業者により認識されるように、投与の経路及び形態は所望する結果 により変わる。移植、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を初めとする、 制御放出製剤のような、化合物の迅速な放出を防ぐ担体と共に有効化合物を調製 することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸 、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生物分解可能な生体適 合性のポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製のための多数の方 法は特許を得るかまたは当業者に一般的に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉ ｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ ｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ 、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、編集、Ｍａｒｃｅｌ Ｄ ｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８を参照。 ある投与経路により本発明の化合物を投与するために、その不活性化を防ぐた めの物質で化合物を被覆するかまたはそれと共に化合物を同時投与することが必 要である可能性がある。例えば、適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤 中で化合物を患者に投与することができる。製薬学的に許容しうる希釈剤は食塩 水及びバッファー水溶液を含む。リポソームは水中油中水滴型ＣＧＦエマルジョ ン及び通常のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎ等、１９８４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍ ｕｎｏｌ ．７：２７） を含む。あらゆる通常の媒質または薬剤が有効化合物と配合禁忌でない限り、本 発明の製薬学的組成物におけるその使用が考えられる。 治療組成物は典型的に無菌でそして製造及び保存の条件下で安定でなければな らない。組成物を溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高い薬剤濃度 に適した他の整った構造として配合することができる。担体は例えば、水、エタ ノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエ チレングリコース水等）並びにそれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散 媒質であってもよい。例えば、レチチンのような被覆の使用により、分散液の場 合には必要な粒度の維持により、そして界面活性剤の使用により適切な流動度を 保つことができる。多くの場合で、等張剤、例えば、糖、マンニトールのような ポリアルコール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含有すること が好ましい。吸収を遅らす薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組 成物中に含有することにより注入可能な組成物の持続的な吸収をもたらすことが できる。 必要な場合、上に挙げた成分の一つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必 要な量の有効化合物を混和し、続いて滅菌ミクロ濾過により滅菌した注入可能な 溶液を調製することができる。通例、基本的な分散媒質及び上に挙げたものから の必要な他の成分を含有する滅菌したビヒクル中に有効化合物を混和することに より分散液を調製する。滅菌した注入可能な溶液を調製するための滅菌した粉末 の場合には、調製の好ましい方法は、先に滅菌濾過したその溶液から有効成分及 びあらゆるさらなる所望する成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥（ｆｒｅ ｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である 。 投与量投薬計画は最適の所望する反応（例えば、治療反応）を生じるように調 整される。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかに分けられた投 与量を時間にわたって投与してもよく、または治療状況の緊急により示されるよ うに投与量を比例して減少もしくは増加してもよい。投与の容易さ及び投与量の 均一性のために単位剤形の非経口組成物を配合することが特に好都合である。本 明細書に用いられる単位剤形は処置される患者に単位投与量として適した物理的 に別個の単位をさし；各単位は必要な製薬学的担体と会合して所望する治療効果 を生じるように計算された有効化合物の前以て決定された量を含有する。通例、 １００パーセントのうち、この量は約０．０１パーセントから約９９パーセント までの有効成分、好ましくは約０．１パーセントから約７０パーセントまで、最 も好ましくは約１パーセントから約３０パーセントまでである。本発明の単位剤 形の特定は（ａ）有効化合物の独特な特性及び得られる特定の治療効果並びに（ ｂ）個体の感受性の処置のためにそのような有効化合物を調合することの当該技 術分野に固有の限界により決定され、そしてそれらに直接依存する。 製薬学的に許容しうる酸化防止剤の例は（１）アスコルビン酸、システイン塩 酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような 水溶性酸化防止剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニ ソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子 酸プロピル、α−トコフェロール等のような油溶性酸化防止剤；及び（３）クエ ン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン 酸等のような金属キレート剤を含む。 経皮パッチは体への本治療発明の化合物の制御された送達を与えるという利点 を与える。皮膚を越えた組成物の流入を増すために吸収促進剤（ｅｎｈａｎｃｅ ｒｓ）を用いることもできる。速度制御膜を与えるかまたはポリマーマトリック スもしくはゲル中に組成物を分散させることによりそのような流入の速度を制御 することができる。例えば、米国特許第４，７０８，７１６号及び第５，３７２ ，５７９号に記述された装置を初めとする、電離療法または他の電気的に補助さ れた方法により組成物を経皮的に送達する、パッチを初めとする装置も本発明に 用いることができる。 患者に有毒ではなく、特定の患者、組成物及び投与形態に対して所望する治療 反応を得るために有効な有効成分の量を得るように本発明の製薬学的組成物中の 有効成分の実際の投与量レベルを変えることができる。選択される投与量レベル は用いられる本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活 性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排出の速度、処置の期 間、用いられる特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬剤、化合物及び／ または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康及び前 の病歴並びに医療技術分野でよく知られているような因子を初めとする各種薬物 動態学因子により決まる。 当該技術分野の通常技術を有する医師または獣医は必要な製薬学的組成物の有 効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師または獣医は製薬学 的組成物中に用いられる本発明の組成物の服用量を所望する治療効果を得るため に必要なものより低いレベルで開始し、そして所望する効果が得られるまで投与 量を徐々に増やすことができるはず である。通例、本発明の組成物の適当な日服用量は治療効果を生じるために有効 な最も低い服用量である化合物の量である。そのような有効服用量は通例上記の 因子により決まる。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であることが好ま しく、好ましくは標的の部位の近くに投与される。必要な場合、治療組成物の有 効な日投与量を場合により単位剤形で、一日にわたって適切な間隔で別個に投与 される２、３、４、５、６またはそれより多い副投与量として投与することがで きる。 治療組成物を当該技術分野で知られている医療装置で投与することができる。 例えば、好ましい態様として、本発明の治療組成物を米国特許第５，３９９，１ ６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４ １３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６ ，５５６号に記述された装置のような無針皮下注入装置で投与することができる 。本発明に有用なよく知られている移植物及びモジュールの例は：制御された速 度で薬剤を調合するための移植可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第４， ４８７，６０３号；皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を開示する米国 特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入 ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬剤送達のための 可変流量移植可能注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；複数室 区画を有する浸透性薬剤送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号；及 び浸透性薬剤送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号を含む。これら の特許は引用することにより本明細書に組み込まれる。多数の他のそのような移 植物、送達系及びモジュールが当業者によく知られている。 上記のように、有効化合物が適当に保護される場合、化合物を例えば不活性希 釈剤または吸収できる食用担体と共に経口投与することができる。本明細書に用 いられる場合「製薬学的に許容しる担体」はあらゆるそして全ての溶媒、分散媒 質、リポソーム製剤及び被覆、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延薬剤、並び に他の上に説明したものを含む。経口投与に対して安定である製薬学的有効物質 の配合のためのそのような媒質及び薬剤の使用は当該技術分野でよく知られてい る。あれゆる通常の媒質または薬剤が有効化合物と配合禁忌でない限り、治療組 成物におけるそれらの使用が考えられる。 本発明は以下の実施例によりさらに例示され、それらはさらに制限すると解釈 されるべきではない。本出願の全体にわたって引用される全ての参考文献、係属 中の特許出願及び公開特許の内容は引用することにより本明細書に明白に組み込 まれる。 実施例 材料及び方法の節に記述する以下の方法論を以下に記述するこれらの実施例に わたって用いた。材料及び方法 Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ／Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｅｓｔ ｂｒｏｏｋ、ＭＥ及びＫｅｎｎｅｓａｗ、ＧＡ）から入手した色素−抗体コンジ ュゲート、非結合タンデム色素または他の試薬を使用するための免疫血液学プロ トコルをここに記述する。ヒト末梢血の細胞懸濁液の免疫蛍光染色には、以下の ように細胞を調製し、濃縮した。サンプルが通常または高い白血球数を有する場 合には全血を用い、赤血球を溶解により除いた。低い白血球数を有するサンプル では、以下のよ うにＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ、Ｐｉ ｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）法により赤血球を分離した。ＥＤＴＡ抗凝血剤中に集 められた血液の細胞懸濁液に等容量のＮａＣｌ（０．９％）を添加した。希釈さ れた血液を血液の約半分に等しい容量のＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅを含有す る円錐遠心管の側面に沿ってピペットで移し、管を室温で７００ｇで１５分間遠 心分離した。血漿界面の単核細胞をパスツールピペットで取り出し、集められた 単核細胞の容量と等しい容量のハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）または類似溶液で３回 洗浄し、各洗浄後に４℃で３００ｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引し、各 洗浄後に廃棄し、そして細胞を約１０⁶細胞／ｍｌの濃度に懸濁媒質中に再懸濁 し、穏やかに混合し、そしてトリパンブルーまたは臭化エチジウムを用いて細胞 生存度を測定した(細胞は約８０％生存可能であった)。 直接染色法は蛍光色素に直接結合している一次抗体を用いる。分離された細胞 では、細胞懸濁液（１００μｌ）を２つの管（その一方を自己蛍光のコントロー ルとして用いる）の各々にピペットで移した。結合された色素−モノクローナル 抗体（２０μｌ）を１つの試験管に添加し、それを穏やかに混合した。細胞を暗 所で４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳまたはハンクス培地で２回洗浄し 、そしてフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法での分析の前に１００ないし ５００μｌの固定試薬または１％ホルムアルデヒド中に再懸濁した。蛍光顕微鏡 法には１滴の固定媒質（７０％グリセロール、３０％グリシンバッファーｐＨ８ ．６）を手で添加した。 高い白血球数（１０，０００細胞／ｍｌより多い）の場合の全血での免疫染色 では、血液を等張溶液に希釈して約５，０００白血球／ｍｌ （標準値）を得た。全血１００μｌを試験官中にピペットで移し、色素に結合さ れたモノクローナル抗体溶液２０μｌを試験管に添加し、中身を穏やかに混合し 、暗所で室温で７５分間インキュベートした。次に溶解溶液を添加し、暗所で２ ５℃で５分間インキュベーションを続けた。固定試薬を添加し、細胞を７００ｇ で５分遠心分離し、１００μｌないし５００μｌのＰＢＳまたは１％ホルムアル デヒド中に再懸濁し、そしてそれそれフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法 により分析した。蛍光顕微鏡法には１滴の固定媒質を添加した。 二重標識化には、各々異なる蛍光色素に結合された抗体の混合物で細胞の一次 インキュベーションを実施した。本明細書に記述される組み合わせはＦＩＴＣ／ フィコエリトリンであり；同じ方法がＦＩＴＣ及びＰＥ−Ｃｙ５が結合された抗 体の組み合わせでの染色のために適している。分離された細胞の免疫染色では、 １００μｌの細胞懸濁液を２つの管の各々（それらの一方をコントロールとして 用いる）にピペットで移した。モノクローナル抗体溶液２０μｌを試験官に、そ して２０μｌの食塩水をコントロール管に添加し、管を穏やかに混合し、４℃で ３０分間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはハンク ス培地で２回洗浄し、０．５％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳまたは食塩水 １００ないし５００μｌ中に再懸濁し、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡 法で分析した。蛍光顕微鏡法には１滴の固定媒質を添加した。 全血のサンプルでの免疫蛍光を分析するために、ＥＤＴＡで処理した１００μ ｌの血液を２つの管（１つのコントロール管及び１つの試験管）にピペットで移 し、２０μｌのコンジュゲートモノクローナル抗体溶液 を試験官に、そして２０μｌのＰＢＳをコントロール管に添加し、次に１８０μ ｌのＰＢＳを各管に添加し、中身を穏やかに混合した。管を室温で１５分インキ ュベートし、溶解溶液を添加し、暗所で２５℃で５分インキュベーションを続け た。固定試薬を添加し、細胞を４００ｇで３分遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し 、それぞれフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法での分析のために１００μ ｌないし５００μｌのＰＢＳまたはホルムアルデヒド（１％）中に再懸濁した。 蛍光顕微鏡法には１滴の固定媒質（７０％グリセロール、３０％グリシンバッフ ァーｐＨ８．８）を添加した。 ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ及びＧｌｏｓｔｒｕｐ 、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手した色素−抗体コンジュゲート、非結合タンデム色 素または他の試薬を使用するための免疫血液学プロトコルをここに記述する。抗 凝血剤を含有する試験管中に静脈血を集め、単核細胞を分離媒質での遠心分離に より単離した。あるいは、抗体−色素インキュベーション処置後に赤血球を溶解 した。単核細胞をＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 ＭＤ）またはＰＢＳ、ｐＨ７．２−７．４で２回洗浄した。１００μｌ中に１ｘ １０⁸細胞までを含有する細胞懸濁液を抗体に結合した色素１０μｌまでと混合 し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。（二重抗体及び三重抗体標識コ ンジュゲートもこのプロトコルで用いた）。細胞を２％ウシ血清アルブミンを含 有するＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために適切な液体中に 再懸濁した。また、二重抗体または三重抗体染色を用いるこれらの同じ方法は末 梢血及び骨髄中の未熟骨髄造血を評価するためにも有用である。 ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した色素−抗体 コンジュゲート、非結合タンデム色素または他の試薬を使用するための免疫血液 学プロトコルをここに記述する。細胞を組織から採取し、単一細胞懸濁液を調製 した。赤血球を溶解または密度勾配により除いた。細胞を冷えた洗浄バッファー （ＰＢＳ／０．１％ＮａＮ₃／１．０％ウシ胎仔血清）中で１回洗浄し、３５０ ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを２ｘ１０⁷細胞／ｍｌの濃度（すな わち、５０μｌ当たり１０⁶細胞）に再懸濁した。一次ｍＡｂ（例えば、蛍光色 素が結合されたｍＡｂ）を洗浄バッファー中に前以て決定された最適濃度に希釈 し、５０μｌの容量でＵ底マイクロタイタープレートのウェルに添加した。５０ μｌのｍＡｂ（または陰性コントロールでは５０μｌの洗浄バッファー）を含有 する各ウェルに細胞（１０⁶）を５０μｌで添加し、穏やかにボルテックスする かまたは軽くたたくことにより混合した。プレートを暗所で４℃で２０−４０分 間インキュベートし、３５０ｇで５分間遠心分離し、２００μｌの洗浄バッファ ーで２回（またはビオチンが結合した一次抗体を用いる場合は３回）洗浄した。 各遠心分離後に、ウェルを吸引するかまたはプレートを振って上清を除いた。穏 やかにボルテックスするかまたはプレートを軽くたたくことを用いて次の洗浄ま たは希釈された二次試薬の添加の前にペレットをほぐした。第二工程試薬を必要 とする場合、細胞ペレットを１００μｌの適切な二次試薬（例えば、蛍光色素が 結合されたアビジン、ストレプトアビジン、抗−Ｉｇアロタイプ、抗−Ｉｇアイ ソタイプ、ポリクローナル抗−Ｉｇ）中に再懸濁した。例えば、抗体を洗浄バッ ファー中１００μｌ当たり１μｌに希釈し、ほぐされた細胞ペレットを含有する 各ウェルに添加し、プレー トを暗所で４℃で２０ないし４０分間インキュベートした。細胞を２００μｌの 洗浄バッファーで２回洗浄した。洗浄バッファー（１００μｌ）を用いてフロー サイトメトリーのために適切な管中の０．４ｍｌアリコートの洗浄バッファーに 細胞ペレットを移した（最終濃度０．５ｍｌ中約１０⁶細胞）。染色後できるだ けすぐにフローサイトメーターでのサンプルデータを得た。実施例１．ヒトＰＭＮ及び好中球へのＰＥ−Ｃｙ５モノクローナル抗体コンジュ ゲートの結合、並びにＧ−ＣＳＦ処置の影響 フローサイトメトリーで１４の異なるＰＥ−Ｃｙ５結合モノクローナル抗体の 特性を調べることによりＦｃγＲＩへのＰＥ−Ｃｙ５の特異的結合を観察した。 これらのコンジュゲートは３つの異なる会社（ＤＡＫＯ、Ｇｅｒｔｒｕｐ、Ｄｅ ｎｍａｒｋ及びＣａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｂｒｕ ｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ及びＷｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ並びにＣｏｕｌｔｅ ｒ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬの事業部として；並びにＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により製造され、それらを上に記述した、供給業者により推 奨される方法論に従って用いた。 正常な提供者から単離された単球及び好中球（ＰＭＮ）並びにインビボでＧ− ＣＳＦで処置された患者からのＰＭＮの染色を分析した。意外にも、Ｔ及びＢ細 胞抗原に対するｍＡｂに結合されたこのタンデム色素で構成されるＰＥ−Ｃｙ５ 試薬を用いて単球（図１ｄ）及びＧ−ＣＳＦ−ＰＭＮ（図１ｂ）の両方が発光染 色を示した。任意の単位の細胞の蛍光は正常なＰＭＮの蛍光（図１ａ）に比べて バックグラウンドより１ないし２桁大きいことが見いだされた。ＰＭＮは高レベ ルのＦｃγＲIII（Ｃ Ｄ１６）を発現し、一方、単球及びＧ−ＣＳＦで処理したＰＭＮはＦｃγＲIII に加えてＦｃγＲＩを発現する（Ｖａｎ ｄｅ ＷｉｎｋｅｌＪＧＩ、等、１９ ９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４：２１５；Ｒｅｐｐ Ｒ、等、１９９ １、Ｂｌｏｏｄ ７８：８８５）。従って、他者により以前に見いだされた、異 なる細胞型の中で観察される「非特異的」ＰＥ−Ｃｙ５試薬染色パターンはここ ではＦｃγＲＩ発現を示す細胞と相関することが観察された。実施例２．ＰＭＮ及びＵ９３７単球細胞へのＰＥ−Ｃｙ５モノクローナル抗体コ ンジュゲートの結合に対するγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）処置の影響 ＦｃγＲＩ発現レベルを増加することが知られている条件（Ｇｕｙｒｅ ＰＭ 、等、１９８３、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７２：３９３）のＩＦＮ−γで 一晩培養されたＰＭＮ及びＵ９３７ヒト単球細胞へのＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲー トの結合を評価した。ＰＭＮ及びＵ９３７細胞の両方でのデータから、ＩＦＮ− γでの処置によりＰＥ−Ｃｙ５抗体コンジュゲートの結合が増大されたことが示 される（Ｕ９３７を図１ｃに示す）。ＩＦＮ−γはＰＭＮ上にＦｃγＲＩを誘導 し、そして単球及びマクロファージ上のこの受容体の発現を増加するので、この 結果はＰＥ−Ｃｙ５結合が骨髄細胞上のＦｃγＲＩの発現の存在及ひ量と相関す ることを示す。実施例３．ＦｃγＲＩ、ＦｃγRIIａ、ＦｃγＲIIｂまたはＦｃαＲをコードす る遺伝子でのマウスIIＡ１．６Ｂ細胞のトランスフェクション及びＰＥ−Ｃｙ５ コンジュゲート結合 ＦｃγＲＩへのＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲートの結合の特異性を評価す るために、各トランスフェクタントが１つのＦｃＲ分子型を発現するように作製 された一連のＦｃＲ−トランスフェクタントを試験した。受容体のIIＡ１．６細 胞マウスＢ細胞はＩｇＧ受容体を欠いており；Ａ２０Ｂ細胞リンパ腫（Ｍｏｒｔ ｏｎ、ＨＣ、等、１９９５、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：２９７８１）か ら得られたＩｇＧの異なるヒトＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＣＤ６４；Ｖａｎ Ｖ ｕｇｔ ＭＪ、等、１９９６、Ｂｌｏｏｄ ８７：３５９３；ＦｃγＲｎａ、Ｃ Ｄ３２；ＦｃγＲIIｂ１、ＣＤ３２、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｒｉｋ−Ｏｕｄｉｊ ｋ ＩＥ、等、１９９５、Ｂｌｏｏｄ ８５：２２０２）及びＩｇＡ受容体Ｆｃ αＲ、ＣＤ８９（Ｍｏｒｔｏｎ ＨＣ、等、上記）をコードする遺伝子の各々で サンプルをトランスフェクトした。トランスフェクタントを（ＣＤ３、ＣＤ４ま たはＣＤ８に対する抗体に共有結合的に連結された）異なるＰＥ−Ｃｙ５ｍＡｂ コンジュゲートで染色した。他のトランスフェクタント（ＦｃγＲII、ＦｃγＲ IIIまたはＦｃαＲ）の蛍光強度はＦｃγＲＩを欠いている細胞と同一であった ので、ＦｃγＲＩでトランスフェクトされた細胞のみがＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲ ートの結合を示した（図１ｆ）。 ここではＦｃγＲＩでトランスフェクトされたマウス３Ｔ３細胞で同様なデー タを得た（Ｖａｎ Ｖｕｇｔ ＭＪ、等、１９９６、Ｂｌｏｏｄ ８７：３５９ ３も参照）。ＦｃγＲＩを保有する細胞に対する特異的染色はＦＩＴＣで標識さ れるかまたはＰＥで標識されたｍＡｂでは見られず、それはＦｃγＲＩがこれら の色素の中でＰＥ−Ｃｙ５タンデム蛍光色素のＣｙ５成分中のある部位のみと相 互作用することを示す。マウスＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIはＰＥ色素及びＰＥ 色素コンジュゲート に結合するがＦｃγＲＩは結合しない（Ｔａｋｉｚａｗａ、Ｆ．等、上記）。こ こでは非結合ＰＥ色素がヒトＩｇＧ受容体に結合しないことが観察された（デー タは示さない）。さらに、マウスＦｃ7-ＲＩはＰＥ−Ｃｙ５タンデム色素抗体コ ンジュゲートに特異的に結合するがＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIは結合せず、そ れはヒト受容体で見られたものと同じパターンである。実施例４．ＦｃγＲＩの遺伝子でトランスフェクトされたマウスIIＡ１．６Ｂ細 胞に対する非結合Ｃｙ５色素の結合 上記の実施例はＰＥ−Ｃｙ５及びこのタンデム色素の抗体コンジュゲートがヒ トＦｃγＲＩに特異的に結合することを示すが、しかしながら、ＦｃγＲＩの結 合は非結合ＰＥでは観察されなかった。非結合Ｃｙ５反応性色素（ＤＡＫＯ）の 結合特異性を測定するために、この試薬を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ中に 溶解し、０．０５Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ＮａＮ₃、 １％ＢＳＡ中で１ｍｇ／ｍｌのストック濃度に希釈した。さらに、非結合ＰＥ− Ｃｙ５を同じ一連の実験で用い、ＰＢＳ中１．５ｍｇ／ｍｌのストック濃度に希 釈した。 トランスフェクトされていないIIＡ１．６Ｂ細胞及びヒトＦｃγＲＩの遺伝子 （参考文献、上記を参照）でトランスフェクトされたこれらの細胞、試験当たり ２０μｌ中２ｘ１０⁵細胞を１０μｌのＣｙ５て４℃で１時間染色した。コント ロール細胞ではなくトランスフェクタントのうまくいった染色が１００ｎｇ／ｍ ｌから１ｇ／ｍｌまでの範囲の色素の濃度で観察された。トランスフェクタント の平均蛍光強度はコントロール細胞のものより少なくとも１桁大きかった。また 、３０ｎｇ／ｍ１から１．５μｇ／ｍｌまでの範囲の色素濃度でもコントロール 細胞で はなくトランスフェクタントでＰＥ−Ｃｙ５での細胞の染色が観察された。上に 記述したＰＥ−Ｃｙ５のために適切な励起及び発光波長の帯域フィルターゲート を用いて全ての蛍光実験を実施し、それ故、ＰＥ及びＰＥ−Ｃｙ５と比較して減 少したＣｙ５の活性は４８８ｎｍでのＣｙ５による比較的低い吸収のためである 。この次善の励起にもかかわらず、データからＣｙ５及びＣｙ５タンデム色素誘 導体のＣｙ５部分がＦｃγＲＩに特異性を有して結合することが示される。実施例５．ＰＥ−Ｃｙ５試薬をコグネイトコンジュゲートリガンドに使用するた めのＦｃ７ＲＩへのＰＥ−Ｃｙ５抗体コンジュゲート結合の阻止 ＦｃγＲＩを発現する細胞を２０％のプールしたヒト血清またはＦｃγＲＩ− リガンド−結合領域を阻止するモノクローナルＣＤ６４抗体（ｍＡｂ１９７、Ｖ ａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ ＪＧＪ、等、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａ ｙ １４：２１５）または集合ＩｇＧのいずれかで処理することにより、これら の細胞のＰＥ−Ｃｙ５染色を９０％より大きい程度まで阻止した。代表的なデー タ（図１ｅ）は単球のＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート染色が全血染色アッセイにお いて８０％より大きく減少したことを示す。 ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲートｍＡｂを用いてマクロファージの「非特異的」染 色が観察されており（Ｓｔｅｗａｒｔ ＳＪ、等、上記）、そしてＡＭＬ−ＦＡ ＢＭ３白血病細胞の「高感度且つ特異的染色」も観察された（Ａｎｓａｒｉ Ｍ Ｏ、等、１９９６、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ２６：８１３）。それらの結果はマクロ ファージ上に存在し、そしてＡＭＬ白血病細胞上に発現されるＦｃ７ＲＩへのＰ Ｅ−Ｃｙ５試薬による 特異的高親和性結合のためであることが本発明のデータにより示される。 本発明のデータから、ＩＦＮ−γまたはＧ−ＣＳＦでの治療処置の経過をモニ ターするため、及びより複雑で高価な試薬の代わりに診断法としてＣｙ５試薬を 使用できることが示される。 同等物 当業者は本明細書に記述される本発明の特定の態様の多数の同等物を通常の実 験のみを用いて認識し、または突き止めることができる。そのような同等物は以 下の請求の範囲により包含されると考えられる。

【手続補正書】 【提出日】平成１２年５月１１日（２０００．５．１１） 【補正内容】請求の範囲 『１．病原性生物の成分、癌マーカー、アレルゲン、薬物、放射性核種、ホルモ ン、ホルモンアンタゴニスト、サイトカイン及び核酸からなる群より選ばれる薬 剤に連結されたシアニンスクシンイミジルエステルとフィコビリソームタンパク 質とのコンジュゲートを含んでなる患者のＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）発現細胞に上 記薬剤をターゲッティングするための組成物。 ２．シアニンスクシンイミジルエステルがＣｙ５である請求項１記載の組成物 。 ３．シアニンスクシンイミジルエステルがフィコエリトリンに連結している請 求項１記載の組成物。 ４．患者からの血液サンプル中のＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）の検出方法であって 、 ａ） サンプルを標識されたシアニンスクシンイミジルエステルと接触させ； ｂ） 未結合シアニンスクシンイミジルエステルを取り出し；そして ｃ） 標識を検出する 工程を含んでなる方法。 ５．標識が蛍光標識である請求項４記載の方法。 ６．標識について適当な励起波長の光でサンプルを照射する工程を、さらに含 む請求項４または５記載の方法 。 ７．血液サンプル中のＦｃγＲＩ保有細胞を示すものとして蛍光を放つ細胞を 検出する工程を、さらに含む請求項４〜６のいずれかに記載の 方法。 ８．サンプルをある化合物に連結されたシアニンスクシンイミジルエステルと 接触させることを含んでなるサンプル中のＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）発現細胞に該 化合物をターゲッティングするための方法。 ９．シアニンスクシンイミジルエステルがＣｙ５である請求項８記載の方法。 １０．シアニンスクシンイミジルエステルがフィコエリトリンに連結されてい る請求項８記載の方法。 １１．適当な励起波長の光でサンプルを照射し、未結合シアニンスクシンイミ ジルエステルを除去し、そして蛍光を検出する工程をさらに含んでなる請求項８ 記載の方法。 １２．シアニンスクシンイミジルエステルおよび使用説明書を含んでなる細胞 のＦｃγＲＩを検出するためのキット。 １３．標識および緩衝剤をさらに含む請求項１２記載のキット。 １４．シアニンスクシンイミジルエステルおよび使用説明書を含んでなるＦｃ γＲＩに対する化合物の吸着をブロックするためのキット。 １５．標識および緩衝剤をさらに含む請求項１４記載のキット。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/35 Ａ６１Ｋ 39/35 39/395 39/395 Ｄ Ｎ 45/00 45/00 51/00 Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 7/00 31/04 31/04 31/18 31/18 35/00 35/00 37/06 37/06 37/08 37/08 Ａ６１Ｋ 43/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＧＲＩＬ及び治療薬を含んでなる治療組成物。 ２． ＧＲＩＬがシアニジン試薬である請求の範囲１の組成物。 ３． ＧＲＩＬがＣｙ５試薬である請求の範囲２の組成物。 ４． ＧＲＩＬがＰＥ−Ｃｙ５である請求の範囲３の組成物。 ５． 治療薬が少なくとも１個のエピトープを含んでなる請求の範囲１の組成 物。 ６． エピトープが病原性生物、癌マーカー及びアレルギー性物質よりなる群 から選択される請求の範囲５の組成物。 ７． 病原性生物がバクテリア、原生生物、ウイルスまたは真菌よりなる群か ら選択される請求の範囲６の組成物。 ８． ウイルスがレトロウイルスである請求の範囲７の組成物。 ９． レトロウイルスがＨＩＶである請求の範囲８の組成物。 １０． バクテリアがグラム陽性病原体である請求の範囲７の組成物。 １１． グラム陽性病原体がスタヒロコッカス・アウレウスまたはクロストリ ジウム・テタニである請求の範囲１０の組成物。 １２． 癌マーカーがヒトＥＧＦ受容体ファミリー、ムチンＴＡＧ７２ファミ リー及び胎児性癌ファミリーよりなる群から選択される請求の範囲６の組成物。 １３． アレルゲンがフェリス（Ｆｅｌｉｓ）（フェリス・ドメスチカス（Ｆ ｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ ））；カニス（Ｃａｎｉｓ）（カニス・ファミ リアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））；デルマトファゴイデス（Ｄ ｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ）（例えば、デルマトファゴイデス・ファリナ エ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅ ｓ ｆａｒｉｎａｅ ））；ペリプラネタ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）（例えば、 ペリプラネタ・アメリカナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）） ；アンブロシア（Ａｍｂｒｏｓｉａ）（アンブロシア・アルテミイスフォリア（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ ））；ロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ ）（例えば、ロリウム・ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）またはロリ ウム・マルチフロラム（Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；クリプト メリア（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）（クリプトメリア・ジャポニカ（Ｃｒｙｐｔ ｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ ））；アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ）（アルテルナリア・アルテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔ ａ ））；アルナス（Ａｌｎｕｓ）（アルナス・グルチノサ（Ａｌｎｕｓ ｇｕｌ ｔｉｎｏｓａ ））；ベツラ（Ｂｅｔｕｌａ）（ベツラ・ベルコサ（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ ））；クエルカス（Ｑｕｅｒｃｕｓ）（クエルカス・アル バ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ａｌｂａ））；オレア（Ｏｌｅａ）（オレア・ユ−ロッパ (Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａ)）；アルテミシア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）（アルテミ シア・ブルガリス（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））；プランタゴ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ）（例えば、プランタゴ・ランセオラタ（Ｐｌａｎｔａｇｏｌ ａｎｃｅｏｌａｔａ ））；パリエタリア（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）（例えば、パ リエタリア・オフィシナリス（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ ）またはパリエタリア・ジュダイカ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｊｕｄａｉｃａ） ）；ブラテラ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ）（例えば、ブラテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａ ｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ ））；アピス（Ａｐｉｓ）（例えば、アピス ・マルチフロラム （Ａｐｉｓ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ））；クプレッサス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ）（例えば、クプレッサス・センペルビレンス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐ ｅｒｖｉｒｅｎｓ ）、クプレッサス・アリゾニカ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉ ｚｏｎｉｃａ ）及びクプレッサス．マクロカルパ（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｍａｃ ｒｏｃａｒｐａ ））；ジュニペルス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ）（例えば、ジュニペ ルス・サビノイデス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ）、ジュニペ ルス・ビルギニアナ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、ジュニペ ルス．コミュニス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）及びジュニペルス ．アシェイ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ））；ツヤ（Ｔｈｕｙａ）（例え ば、ツヤ・オリエンタリス(Ｔｈｕｙａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ)）；カメシパリ ス（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ）（例えば、カメシパリス・オブツサ（Ｃｈａ ｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ ））；アグロピロン（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ）（例えば、アグロピロン・レペンス（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｒｅｐｅｎｓ）； セカレ（Ｓｅｃａｌｅ）（例えば、セカレ・セレアレ）（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒ ｅａｌｅ ））；トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（例えば、トリチカム・アエス チバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））；ダクチリス（Ｄａｃｔｙｌ ｉｓ ）（例えば、ダクチリス・グロメラタ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａ ｔａ ））；フェスツカ（Ｆｅｓｔｕｃａ）（例えば、フェスツカ・エラリオル（Ｆｅｓｔｕｃａ ｅｌａｒｉｏｒ ））；ポア（Ｐｏａ）（例えば、ポア・プラテ ンシス（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）またはポア・コンプレツサ（Ｐｏａ ｃ ｏｍｐｒｅｓｓａ ））；アベナ（Ａｖｅｎａ）（例えば、アベナ・サチバ（Ａｖ ｅｎａ ｓａｔｉｖａ ））； ホルカス（Ｈｏｌｃｕｓ）（例えば、ホルカス・ラナタス（Ｈｏｌｃｕｓ ｌａ ｎａｔｕｓ ））；アントキサンタム（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ）（例えば、ア ントキサンタム・オドラタム（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ） ）；アレナテラム（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ）（例えば、アレナテラム・エ ラリウス（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ ｅｌａｒｉｕｓ））；アグロスチス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ）（例えば、アグロスチス・アルバ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ａｌ ｂａ ））；フレウム（Ｐｈｌｅｕｍ）（例えば、フレウム・プラテンス（Ｐｈｌ ｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ ））；ファラリス（Ｐｈａｌａｒｉｓ）（例えば、フ ァラリス・アルンジナセア（Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ））； パスパルム（Ｐａｓｐａｌｕｍ）（例えば、パスパルム・ノタタム（Ｐａｓｐａ ｌｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ ））；ソルギュム（Ｓｏｒｇｈｕｍ）（例えば、ソルギ ュム・ハレペンシス（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ））及びブロマス （Ｂｒｏｍｕｓ）（例えば、ブロマス・イネルミス（Ｂｒｏｍｕｓ ｉｎｅｒｍ ｉｓ ））よりなる群から選択される請求の範囲６の組成物。 １４． 治療薬が化学療法抗がん剤である請求の範囲１の組成物。 １５． 治療薬が放射性核種である請求の範囲１の組成物。 １６． 製薬学的に許容しうる担体中の請求の範囲１の組成物。 １７． 製薬学的に許容しうる担体中の請求の範囲２の組成物。 １８． 請求の範囲１の治療組成物の少なくとも有効量を投与することを含ん でなる、処置を必要とする患者の処置方法。 １９． 患者が自己免疫疾患の患者である請求の範囲１８の方法。 ２０． 患者が特発性血小板減少性紫斑病の患者である請求の範囲１ ９の方法。 ２１． 患者から得られる血液または骨髄サンプルに組成物をエクスビボで投 与する請求の範囲１８の方法。 ２２． 患者にインターフェロン、インターロイキンまたはコロニー刺激因子 も投与する請求の範囲２１の方法。 ２３． 患者にインターフェロン−γ、インターロイキン−１０または顆粒球 −コロニー刺激因子を投与する請求の範囲２２の方法。 ２４． 患者からの血液サンプル中のＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）の検出方法で、 ａ）サンプルをＧＲＩＬ蛍光ステインと接触させ； ｂ）適切な励起波長の光でサンプルを照射し；そして ｃ）血液サンプル中のＦｃγＲＩ保有細胞を示すものとして蛍光を放つ細胞を 検出する 工程を含んでなる方法。 ２５． 少なくとも１つのさらなる色素試薬を用いる請求の範囲２４の方法。 ２６． さらなる色素試薬がフルオレセイン試薬またはフィコエリトリン試薬 である請求の範囲２５の方法。 ２７． ＧＲＩＬで染色された細胞をフローサイトメトリーにより分析及び単 離する請求の範囲２４の方法。 ２８． ＧＲＩＬで染色された細胞を蛍光顕微鏡法により分析する請求の範囲 ２４の方法。 ２９． ＧＲＩＬがＣｙ５試薬である請求の範囲２８の方法。 ３０． 励起波長が約４７５ないし５０５ｎｍである請求の範囲２９ の方法。 ３１． 血液細胞が診断を必要とするヒト患者から得られる請求の範囲２４の 方法。 ３２． 診断を必要とする患者の、ＦｃγＲＩ保有細胞を示す血液中の蛍光細 胞の数を正常被験者の血液中の蛍光細胞の数と比較する請求の範囲２４の方法。 ３３． 方法が白血球粘着不全症または白血病の診断として用いられる請求の 範囲３２の方法。 ３４． 白血病が骨髄性白血病または急性前骨髄性白血病である請求の範囲３ ３の方法。 ３５． 方法が感染及び／または炎症の存在の診断として用いられる請求の範 囲３２の方法。 ３６． 診断が治療薬の投与後の治療をモニターするためである請求の範囲２ ４の方法。 ３７． 治療薬がインターフェロン、インターロイキン及びコロニー刺激因子 よりなる群から選択される請求の範囲３２の方法。 ３８． インターフェロンがＩＦＮ−γである請求の範囲３７の方法。 ３９． インターロイキンがＩＬ−１０である請求の範囲３７の方法。 ４０． コロニー刺激因子がＧ−ＣＳＦである請求の範囲３７の方法。 ４１． ＦｃγＲＩを保有する細胞上のＦｃγＲＩに結合する治療薬の同定方 法で、 （ａ）細胞の第一サンプルを候補薬剤と接触させ； （ｂ）細胞の第二サンプルをコントロールバッファーと接触させ； （ｃ）細胞の第一及び第二サンプルをＧＲＩＬステインで染色し； （ｄ）結合した色素で細胞の蛍光を引き起こすために適切な波長で細胞を照射 し；そして （ｅ）染色された細胞の指標として蛍光を測定し、その場合に、第二サンプル に比較して第一サンプルの染色を統計的に有意な程度に減少する薬剤が可能性の ある治療候補である ことを含んでなる方法。 ４２． 可能性のある治療活性を有すると同定された１つまたはそれより多い 化合物の製薬学的製剤を配合するさらなる工程（ｆ）を含んでなる請求の範囲４ １の方法。 ４３． ＧＲＩＬステイン、バッファー、容器及び使用説明書を含んでなる、 細胞上のＦｃγＲＩをアッセイするためのキット。 ４４． 抗−ＦｃγＲＩ抗体、ＧＲＩＬ、バッファー、容器及び使用説明書を 含んでなる、ＦｃγＲＩへの化合物の吸着を阻止するためのキット。