JP2000516443A

JP2000516443A - ヒトネトリン―１

Info

Publication number: JP2000516443A
Application number: JP09538190A
Authority: JP
Inventors: スイマー，カンダス; シャイアン，アン; レオナルド，デイビッド; シャン，ユアン; ケネディ，ティモシー; セラフィニ，タイト; テシール―レイビン，マーク
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1997-04-19
Publication date: 2000-12-12
Also published as: AU706565B2; EP0904283A1; EP0904283B1; EP0904283A4; CA2250263C; CA2250263A1; DE69734199D1; ATE304549T1; WO1997040064A1; DE69734199T2; AU2675297A; US6218526B1; US5824775A

Abstract

(57)【要約】特定のネトリンタンパク質、ネトリンタンパク質をコードする核酸、およびネトリン遺伝子にハイブリダイズ可能なハイブリダイゼーション試薬、プローブ、およびプライマー、ならびに望ましくない細胞増殖に関連する疾患の診断または処置において有用な薬理的物質のリード化合物のために化学的ライブラリーをスクリーニングするための方法が提供される。例示的なスクリーニングは、組換え体ネトリンタンパク質、天然の細胞内ネトリン結合標的、および候補薬理的物質を含む混合物を形成する工程；上記候補薬理的物質が存在しなければ、上記ネトリンタンパクが上記結合標的と選択的に結合する条件下で混合物をインキュベートする工程；および上記ネトリンタンパク質の上記結合標的への特異的結合の存在または非存在を検出する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトネトリン-1発明の分野本発明の分野はヒトネトリンタンパク質および遺伝子である。背景神経系の発達において、軸索は、それらの標的に達する常同性経路に沿ってかなりの距離を投射する。軸索の成長および誘導は、これらの経路に沿って、細胞表面および細胞外マトリックスの手がかり(cues)の認識に部分的に依存する。そのような神経細胞成長および誘導の手がかりの同定は、神経生物学の重要なカギである。いつ成長するべきか、どこへ成長するべきか、そしていつ成長を止めるべきかをニューロンに伝える(tell)化合物がある。そのような化合物の医学的適用は非常に大きく、そして神経成長再生能の調節、神経退行性疾患の処置、および遺伝的神経性欠損のマッピング（例えば、診断）を含む。数十年の集中的研究により、化学誘引物質および忌避物質、標識経路、細胞接着分子などを含む種々の仮説は、誘導の説明を呼び出した(invoked)。N-CAMやＮカドヘリンのような分子は、軸索成長に対して有利な基質を提供し、そして特定の感覚性軸索はNGFおよびNGF様因子に反応し得ると報告された。最近の報告は、交連軸索成長のパターンおよび配向に影響する拡散性の走化性分子の存在を示唆する。関連文献 Ishiiら,(1992)Neuron 9，873-881はC．elegans由来の遺伝子、unc-6が、開示されるネトリンと配列類似性を有することを開示する。Serafiniら，(1994)Cell 78，409-424およびKennedyら，(1994)Cell 78，425-435の５頁、１段に関連する脊椎動物のネトリンが記載される。研究はまた、1994年８月16日（火曜日）の The New York Times，Section B7において報告され、そしてより最近（1995年５月19日）では、Science 268，971-973に記載された（その中に引用された参考文献もまた参照のこと）。発明の要旨本発明はヒトネトリンタンパク質および遺伝子に関する方法および組成物を提供する。ネトリンは神経軸索誘導に天然に関与する、タンパク質である。本組成物は、特定のネトリンタンパクをコードする核酸、そして特定のネトリン遺伝子にハイブリダイズし得るハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーを含む。ネトリンタンパク質は、神経軸索成長の調節における特定の使用を見出す。開示される組成物はまた、化学ライブラリーを軸索の成長および配向性の制御因子についてスクリーニングすることにおいて、遺伝子マッピングにおいて、ネトリン遺伝子に対するプローブとして、遺伝的神経性疾患に対する診断試薬として、ならびに神経性疾患治療の開発のための特定の細胞系および動物系の産生における種々の使用を見出す。発明の詳細な説明本発明はヒトネトリン-1タンパク質および遺伝子に関する方法および組成物を提供する。それは、本タンパク質を同定、精製、特徴付け、そして生産するための方法および組成物、および本核酸を同定、特徴付け、クローン化、発現、本核酸の発現の阻害、および増幅するための方法および組成物を包含する。本タンパクは、開示されるネトリンcDNA配列の不完全な翻訳物または対応する概念的な翻訳物の欠失変異体（翻訳物および欠失変異体は本明細書中で記載されるヒトネトリン-1結合活性および特異性を有する）であり得る。ネトリンは、精製され、部分的に純粋であるかまたは純粋であり、そして代表的には組換え的に生成される。「単離された」タンパク質は、例えば、その天然の状態で付随する少なくともいくつかの物質を併わない；所定のサンプル中の総タンパク質重量の少なくとも約0.5%、好ましくは少なくとも約2%、より好ましくは少なくとも約10%を通常構成し、そして精製タンパク質は、与えられたサンプル中の総タンパク質重量の少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは約99%を構成する。広範な種々の分子と生化学的方法は、本組成物を生成および発現するために利用可能である（例えば、Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Sambrookら,Co ld Spring Harbor Laboratory)，Current Protocols in Molecular Biology（Au subelら編、Greene Publ．Assoc.，Wiley-Interscience，NYを参照するか、さもなくば当該分野で公知である）。開示されるネトリン組成物は、ヒトネトリン-1特異抗体を産生するために、インサイチュまたはインビボでの軸索成長または誘引を調節するためなどに使用され得る。インビボ適用のために、組成物は血液または滑液のような保持された生理的液体へ添加される。CNS投与のために、種々の技術が、脳血管関門を横切る治療剤の移行を促進するために有用である。これは、手術または注射による破壊、CNS血管上皮細胞間の接着接合を一過性に開く薬物、およびそのような細胞を通っての移行を促進する化合物を含む。ネトリンはまた、直接注射または点滴、局所に、例えばエアロゾルを介しての気管内／経鼻投与、眼内へ、または移植物（例えば、線維（例えば、コラーゲン）、浸透圧ポンプ、適切に形質転換された細胞を含む移植片など）内／上で受け入れられ得る。投与の特定の方法は、治療的タンパク質を被覆化、包埋化、またはコラーゲン線維、タンパク質ポリマーなどのような誘導体線維化する工程を包含する。他の有用なアプローチは、Ottoら，(1989)J Neuroscience Resarch 22，83-91およびOttoおよびUnsicker(1990)J Neuroscience 10，1912-1921に記載される。通常、投与量は経験的に決定され、典型的にはレシピエントの１kg当たり約10〜1000μｇの範囲内であり、そして濃度は投与量内に一般に約50〜500μｇ/mlである。通常の量で存在する安定剤、殺菌剤などのような他の添加剤が含まれ得る。本発明は、膜結合ネトリンレセプターおよびネトリン特異的抗体ならびに天然および合成化学薬品ライブラリーのスクリーニングにより同定された結合因子のような単離された結合標的を含むネトリン特異的結合因子、そしてそのような因子の同定および作製の方法、そしてそれらの診断上、治療上および薬学的開発上での使用を提供する。通常、結合因子のネトリン特異性は結合平衡定数によってい示される。そのような因子は特定のネトリンに選択的に、すなわち平衡定数が少なくとも約10⁷M^-1、好ましくは少なくとも約10⁸M^-1、より好ましくは少なくとも約10⁹M^-1で結合し得る。広範な種々の細胞ベースのまたは無細胞系アッセイを使用してネトリン特異的結合を実証し得る；インビトロで迅速な無細胞系アッセイ（例えば、ネトリン−細胞／タンパク質結合の調節または阻害）、イムノアッセイなどが好ましい。本発明はまた、本タンパクをコードする核酸を提供する。核酸はネトリン発現ベクターの一部であり得、そして発現およびスクリーニングのための組換え細胞、機能研究（例えば、神経性疾患または障害に対する候補薬の効力）のためのトランスジェニック動物等、および開示されるネトリンcDNA特異的配列を有する核酸ハイブリダイゼーションプローブおよび複製／増幅プライマーに組み込まれ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、他のネトリン遺伝子存在中で、プローブが対応するネトリン遺伝子および対応するネトリン遺伝子のみに特異的にハイブリダイズすることを可能にするのに十分に対応するネトリン遺伝子に共通または相補的である配列を含む。従って、本プローブおよびプライマーは開示された cDNAに比類なく特異的である。ネトリン遺伝子配列の100連続的(continuous)塩基以上を有するハイブリダイゼーションプローブは、通常、対応するネトリンcD NAにハイブリダイズし、65℃の温度で0.2×SSC(0.9M食塩／0.09Mクエン酸ナトリウム)および0.1%SDS緩衝液の減少された最終洗浄ストリンジェンシーにおいて結合したままであることが可能である。本核酸は単離される、これは、核酸が天然のクロモソーム上で結合されるヌクレオチド以外のヌクレオチドに結合された配列を含むことを意味し、そして所定の画分中に存在する総核酸重量の、通常少なくとも約0.5%、好ましくは少なくとも約２%、そしてより好ましくは少なくとも約5％を構成することを意味する。純粋な核酸は、所定の画分中に存在する総核酸重量の,少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%を構成する。本核酸は、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマー、治療的核酸などとしての使用；ネトリン遺伝子および遺伝子転写産物の存在を検出することにおける使用（例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)プローブは、臨床および研究室サンプル内の、野生型および変異ネトリン対立遺伝子の同定に使用する）、他のネトリンをコードする核酸を検出または増幅することにおける使用、および遺伝子治療適用（例えば、標的化ネトリン翻訳物の細胞内発現を阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド）における使用を含む広範な種々の適用を見出す。本発明は、ネトリン機能を模倣するか、または調節することが可能な薬剤（例えば生理活性ネトリン欠失変異体およびネトリンペプチド）のための薬理的薬剤またはリード化合物を同定する効率的な方法を提供する。広範な種々のスクリーニングが使用され得る；例えば、細胞ベースのアッセイはネトリン機能をモニターするために使用され得、そしてインビトロ結合アッセイはネトリン特異的結合剤を同定するために使用され得る。Kennedyら,(1994)Cell 78，425-435は、特に都合の良いCOS細胞ベースのネトリン発現アッセイを記載する。好ましい方法は、リード化合物の天然および合成化学ライブラリーの、自動化され、対費用効果が高く、高い処理能力のスクリーニングに従う。同定された試薬は、動物およびヒトでの試行のために製薬産業内における使用を見出す；例えば、試薬は、薬学的開発のために活性を最適化し、そして毒性を最小化するために誘導化され、そしてインビトロおよびインビボでのアッセイで再スクリーニングされ得る。実施例ヒトネトリン-1（配列番号２）およびcDNA（配列番号１）本発明者らは、Serafiniら，(1974)Cell 78:409-424に記載のように、ニワトリネトリン１およびネトリン２cDNAを単離した。ニワトリネトリン１およびネトリン２cDNA配列に基づき、本発明者らは縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、そしてこれらのプライマーをマウスcDNAライブラリーからマウスネトリン１をコードするcDNAを増幅するのに使用した。次いで、本発明者らは、手引き書のようにニワトリおよびマウスネトリン配列において保存されたアミノ酸配列を用いて構築された縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ヒトネトリンcD NAを単離した。 PCRの出発材料は100ngのヒトゲノムDNAである。２回のPCR増幅を使用した。最初の回は、以下のプログラムおよび条件を使用した：１、94℃ 30秒；２、50℃4 5秒；３、72℃１分;４、1へ、30回；５、4℃；６、終了。：２回目のPCR増幅では、ネステッド(nested)PCRならびに以下の条件およびプログラムを使用した：１、94℃１分；２、42℃１分；３、72℃まで５秒毎に１℃の増加；４、72℃ ３分間；５、１へ、２回；６、94℃１分間；７、46℃１分間；８、72℃まで６秒毎に１℃の増加；９、72℃２分；10、６へ、７回；11、94℃１分間；12、55℃１分間；13、72℃２分；14、11へ、24回；15、94℃１分間；16、55℃１分間;17、7 2℃10分間；18、４℃；19、終了。PCR産物をサブクローン化し、そしてヒトネトリン配列に対応するインサートを含む個々のクローンを、GrunsteinおよびHogne ss screen(Sambrook，1989)を用いて単離した。³²Pは、マウスネトリン-１cDNA クローンの一部をテンプレートして用いてPCRを行い、プローブへ取り込ませた。フィルターの最後の洗浄は、1×SSCおよび0.1%SDS、65℃での低いストリンジェンシーであった(Sambrookら、1989)。このスクリーニングによって、約140塩基対のヒトネトリンcDNAクローンを単離した。このcDNAフラグメントを使用して、ヒト胎児脳cDNAライブラリー(Stratagene cat#936206)からのより長いヒトネトリンcDNAを単離した。約140塩基対ヒトネトリンcDNAをテンプレートとして使用して、そして³²PをPCRを用いてヒトネトリンcDNAプローブへ取り込ませた。高いストリンジェンシー(Sambrookら，1989)で1×10⁶のクローンをスクリーニングした。これは、単一の約７kbのネトリンcDNAを同定した(HBC-1,1995年６月７日、プラスミドHN-1、受託番号97204としてATCCに受託された)。配列分析により、7kb HBC-1クローンのEcoRIサブクローンが、ヒトネトリン-1 のスプライシング変異体に対応することを決定した。配列の最初の1086塩基対は、マウスネトリン-1と高い相同性を示し、そして残りの626塩基対は非常に相違していた。潜在的なスプライス供与部位をネトリンと相違した配列との接合部に同定した。ヒトネトリン-1の3'末端に相当するクローンを、逆転写およびヒト配列の999位の5'プライマーおよびマウスネトリン配列の最後の15塩基対に対する3 '末端により縮重プライマーを用いるPCRを使用して単離した。３つのさらなる独立したクローンをPCR反応産物の配列を確かめるために単離した。この新しいクローンとHBC-1 Ecoクローンとの間の重複領域は46塩基対で、そして配列において同一である。重複を確認するために、ヒトネトリン-1配列の818位での5'プライマーおよび1582位での3'プライマー用いて、さらなるクローンを単離した。これらのプライマーを用いて単離した２つの独立したクローンはcDNAの構造を確かにする。最後に、Ｃ末端５アミノ酸をコードする配列を確認した。プライマーを、ニワトリとマウスネトリン-1との間で保存された3'非翻訳領域内の領域に対して設計した。PCR産物を、このプライマーおよびヒト配列の1568位での5'プライマーを用いて生成し、そして配列を確認した。 RT-PCR手順は以下のようであった：胎児脳RNA（19〜23週）をClontechより購入した。RT-PCRを、Perkin ElmerからのGeneAmp熱安定性rTth逆転写酵素RNA PCR キットを使用して行った。ホットスタート技術を使用して、総容量7.2μｌ中に、30pmolの縮重プライマーdeg-1、μｌの10×rTth逆転写酵素緩衝液(Perkin Elm er)および水と共に50ngのRNAを混合することによって、変性させた；この混合物を、95℃で２分間加熱し、続いて70℃で５分間インキュベートした。反応物を60 ℃まで冷却し、そして逆転写を、１μｌの10mM MnCl₂、１μｌのrTth DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer，2.5U)、および10mM dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP各々0.2μｌを含む混合液を添加することによって開始した。60℃のインキュベーションを５分間続け、続いて65℃および70℃での２つの５分間インキュベートを続けた。次いで、反応物を氷上で冷却した。ヒトネトリン-1フラグメントをPCRによって増幅するために、２μｌのDMSO、３μｌの25mM MgCl₂、４μｌの10×キレート緩衝液(Perkin Elmer)および34.5μ ｌの水を含む混合液を、逆転写反応に添加した。30pmolのヒトネトリン特異的プライマー、h-net-5'999(0.5μｌ)は混合液に添加し、そしてPCRをMJ ResearchPT C-200 Peltier Thermal Cyclerにおいて、「計算された(culculated)」温度制御法および以下の条件を用いて実行した：１）95℃２分間；２）55℃25秒間；３） 95℃10秒間；４）工程２〜３を34回繰り返す；５）60℃７分間；６）４℃に保つ。反応物をゲル電気泳動により分析し、そしてナイロンメンブレンへ移した。ネトリン特異的産物を、マウスネトリンの1342位から1875位の配列に対応するマウスネトリンプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにより検出した。クロスハイブリダイズフラグメント（約850bpに移動している）に相当するアガ口ースのプラグ(plug)を、パスツールピペットにより抜き取り、そして以下のように再増幅した：アガロースプラグを、49μｌの総容量中、1.25μｌのホルムアミド、５μｌの10×PCR緩衝液II(Perkin Elmer),５μｌの25mM MgCl₂、30pmolのヒトネトリン特異的プライマーh-net-5'999、30pmolの縮重ネトリンプライマーdeg-1、 5U AmpliTaq DNA Polymerase(Perkin Elmer)、および滅菌水を含む反応混合液と組み合わせた。PCRを、MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cyclerにおいて、「ブロック(Block)」温度制御法および以下の条件を用いて実行した。：１）9 5℃２分間；２）50℃１分間；３）75℃１分30秒間；４）95℃20秒間;５）工程２〜４を39回繰り返す；６）75℃10分間；７）４℃に保つ。反応物をゲル電気泳動により分析し、そして約850bpのDNAのバンドをBloRad P rep-A-Geneシステムを用いて精製し、TAクローニングベクター(InVitroGen)と連結し、DH5αコンピテント細菌細胞中に形質転換した。コロニーを、コロニーPCR により正確なサイズインサートについて分析し、100μｇ/mlのアンピシリンを含むLB培地中で、37℃で一晩増殖させ、そしてDNAをQiagen Tip-100カラムを用いて、培養液から調製した。インサートを制限消化によって確認し、そして配列を ABI377自動シーケンサーを用いて決定した(generated)。ヒトネトリン-1クローンの最後の15ヌクレオチドを確認するために、クローンの3'末端を、既知の配列に対する5'プライマーおよびマウスネトリン-１クローンの3'非翻訳領域内の配列の3'プライマーを用いて、第一鎖cDNAから増幅した。最初に、cDNAを、Michael Frohmanによって「cDNA末端の迅速な増幅」（PCR Pri mer:A Laboratory Manual，C.W．DieffenbachおよびG.S．Dveksler編、Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，1995）に記載されたように、「3'末端cDNA増幅」の項(388-389頁)に記載のプロトコル、および１μｇの胎児脳ポリA＋RNA(Clon tech)を用いて合成した。１μｌの希釈cDNAを、67mM Tris HCl,(pH9.0)、6.7mM 塩化マグネシウム、16.6mM硫安、0.17mg/mI BSA、10%DMSO、1.5mM各dNTP、30pmo l 5'プライマー「h-net 5'1449」および30pmol 3'プライマー「m-net 3'UT2238 」を含む50μｌの反応中で増幅した。プライマー「h-net 5'1449」は、ヒトネトリン-1クローン内の1449位で始まる配列に対応する。プライマー「m-net 3'UT22 38」はマウスネトリン-1の3'非翻訳領域の配列（5'末端にXba1I限部位配列の付加を有する）に対応する。１μｌのTaqDNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)を、0.5 μｌのTaqStart抗体(ClonTech)および2.5μｌのTaqStart抗体希釈緩衝液とともに組み合わされ、室温で10分間インキュベートし、そしてPCR反応混合液に添加した。反応を、MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cyclerにおいて、「計算された」温度制御法および下記の条件を用いて増幅した；１）95℃２分間；２） 62℃30秒間；３）57℃30秒間；４）52℃10秒間；５）72℃40分間；６）94℃10秒間；７）62℃１分間；８）72℃３分間；９）工程６〜８を４回繰り返す；10）94 ℃10秒間；11）57℃１分間；12）72℃３分間；13）工程10〜12を４回繰り返す； 14）94℃10秒間；15）52℃１分間；16）72℃３分間；17）工程14〜16を24回繰り返す；18）75℃10分間；19）４℃に保つ。反応物をTEで1:20に希釈し、そして１μｌを、67mM Tris HCl(pH9.0)、6.7mM 塩化マグネシウム、16.6mM硫安、0.17mg/ml BSA、10%DMSO、1.5mM各dNTP、30pmo l 5'プライマー「h-net 5'1702」、30pmol 3'プライマー「m-net 3'UT2238」および0.25μｌのTaq DNAポリメラーゼを含む50μｌの反応物中で再増幅した。プライマー「m-net 5'1702」は、ヒトネトリン-1クローン内の1568位で始まる配列に対応する。反応物を、MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cyclerにおいて、「計算された」温度制御法および下記の条件を用いて増幅した；１）95℃２分間；２）94℃10秒間；３）58℃１分間；４）72℃３分間；５）工程２〜４を４回繰り返す；６）94℃10秒；７）54℃45秒；８）72℃３分；９）工程6-8を４回繰り返す；10）94℃10秒間；11）50℃30秒間；12）72℃３分間；13）工程10〜12を 24回繰り返す；14）75℃５分間；および15）４℃に保つ。反応物をゲル電気泳動により分析し、そして530bpの生成物はPrep-A-Geneシステム(BioRad)を用いてゲルより単離した。生成物をpCR2.1(InVitroGen)中に14℃ で一晩連結した。形質転換体を100μｇ/mlのアンピシリンを含むLB培地内で一晩培養し、そしてDNAをEasy Puer Plasmid Preps(Super Mini，Primm Labs)を用いて培養物から精製した。DNA配列をABI 377自動シーケンサーを用いて決定した(g enerated)。 3'末端配列を確認するために、ヒトネトリンの3'末端にかかる２つのさらなるフラグメントを、m-net 5'1702プライマーおよびヒトネトリン-1の3'非翻訳領域中の配列に対応するh-net3'1959を3'プライマーに用いるPCRにより生成した。これらのプライマーを用いる増幅は、２連の反応において約390塩基対の産物を生成した。フラグメントを、MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cyclerにおいて「計算された」温度制御法および以下の条件を用いて増幅した；１）95℃２分間；２）94℃10秒間；３）58℃１分間；４）72℃３分間；５）工程２〜４を４回繰り返す；６）94℃10秒間；７）54℃45秒間；８）72℃３分間；９）工程６〜８を４回繰り返す；10）94℃10秒間；11）50℃30秒間；12）72℃３分間；13）工程 10〜12を19回繰り返す；14）75℃５分間；そして15）４℃に保つ。反応物を、それらのサイズを確認するためにゲル電気泳動により分析し、ABI 377自動化シーケンサーを用いて直接配列決定した。本明細書中に引用する全ての出版物および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の出版物または特許出願が具体的にまたは個々に参考文献として援用されることが示されるかのように、本明細書中で参考文献として援用される。前記発明が、理解の明快さのために例示および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく特定の変更および改正がなされ得ることは、本発明の教示に照らして、当業者に容易に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２５ＣＡ６１Ｋ 45/00 45/00 (72)発明者スイマー，カンダスアメリカ合衆国マサチューセッツ 02139，ケンブリッジ，ワンケンダールスクエア（番地なし），ビルディング 600 (72)発明者シャイアン，アンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02139，ケンブリッジ，ワンケンダールスクエア（番地なし），ビルディング 600 (72)発明者レオナルド，デイビッドアメリカ合衆国カリフォルニア 94143, サンフランシスコ，ディパートメントオブアナトミーエス―1479（番地なし），ユニバーシティオブカリフォルニア内 (72)発明者シャン，ユアンアメリカ合衆国カリフォルニア 94143, サンフランシスコ，ディパートメントオブアナトミーエス―1479（番地なし），ユニバーシティオブカリフォルニア内 (72)発明者ケネディ，ティモシーアメリカ合衆国カリフォルニア 94143, サンフランシスコ，ディパートメントオブアナトミーエス―1479（番地なし），ユニバーシティオブカリフォルニア内 (72)発明者セラフィニ，タイトアメリカ合衆国カリフォルニア 94143, サンフランシスコ，ディパートメントオブアナトミーエス―1479（番地なし），ユニバーシティオブカリフォルニア内 (72)発明者テシール―レイビン，マークアメリカ合衆国カリフォルニア 94143, サンフランシスコ，ディパートメントオブアナトミーエス―1479（番地なし），ユニバーシティオブカリフォルニア内

Claims

【特許請求の範囲】１、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたネトリン。２、単離されたヒトネトリン-1。３、請求項１に記載のネトリンをコードする、単離された核酸。４、配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項３に記載の単離された核酸。５、請求項４に記載の核酸と該核酸と特異的にハイブリダイズするに十分な相補性を有する、単離されたハイブリダイゼーションプローブ。６、ニューロンの増殖、分化または形態を調節する方法であって、該方法は請求項１に記載の組成物を該ニューロンに接触させる工程を包含する、方法。７、ニューロンの増殖、分化または形態を調節する方法であって、該方法は前記プローブが内在性ヒトネトリンコード遺伝子または該ニューロンにおける転写物とハイブリダイズする条件下で、請求項５に記載の組成物と該ニューロンを接触させる工程を包含する、方法。８、核酸を含むサンプル内のヒトネトリン遺伝子の存在を決定する方法であって、該方法は、該サンプルを請求項５に記載のプローブと接触させる工程、および該プローブの該核酸との特異的ハイブリダイゼーションの存在を検出する工程を包含する、方法。９、サンプル中の配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトネトリンの存在を決定する方法であって、該方法は該サンプルを該ネトリンを特異的に結合する因子を接触させる工程、および該因子の該ネトリンとの特異的結合の存在を検出する工程を包含する、方法。１０、候補薬物をスクリーニングする方法であって、該方法は以下の工程：請求項１に記載のネトリンおよびネトリン結合標的を含む混合液と見込みのある因子を、該見込みのある因子が存在しなければ、該ネトリンおよび該ネトリン結合標的が第１の結合を有する条件下で接触させる工程；該ネトリンと該ネトリン結合標的との間の第２の結合を検出する工程；該第１および第２の結合を比較する工程；ここで、該第１と第２の結合との間の差異が、該ネトリンと該ネトリン結合標的との相互作用を調節するリード薬学的化合物のような該見込みのある因子を同定する工程、を包含する、方法。