JP2000516462A

JP2000516462A - 改変されたトマト斑紋ジェミニウイルスコート蛋白質遺伝子

Info

Publication number: JP2000516462A
Application number: JP10509008A
Authority: JP
Inventors: ジェーンイー．ポルストン; アーネストハイバート; アーメドアボージッド
Original assignee: ユニバーシティーオブフロリダ
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2000-12-12
Also published as: AU4045997A; CA2261561A1; WO1998004724A1; EP0917584A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ジェミニウイルス感染に対する抵抗性を植物に付与する改変された植物ウイルス遺伝子に関する。トマト斑紋ジェミニウイルスの改変されたAV1遺伝子を適切な発現ベクター中にクローニングし、それによってタバコに形質転換を施した。改変された遺伝子の発現により、それが発現した植物にはウイルス感染に対する抵抗性が付与された。本発明はさらに、植物に対してウイルス抵抗性を付与するための方法に関する。また、本発明は、植物にウイルス抵抗性を付与する改変されたコート蛋白質遺伝子およびそれらの断片にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】改変されたトマト斑紋ジェミニウイルスコート蛋白質遺伝子本発明は、米国農務省CSRSCBAG助成金第92-34135-7456号による政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。関連出願に関する相互参照本出願は、1995年7月26日に提出された米国特許仮出願第60/022,680号の利益を請求するものである。発明の背景ジェミニウイルスは、熱帯地域でのトマト生産における制限因子である。地球上のこの地域では、トマトの病原体として少なくとも7つの異なるジェミニウイルスが同定されている（トマト斑紋、ジャガイモ黄色モザイクウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルス、トマト黄色モザイクウイルス、トマトリーフクランプルウイルス、トウガラシフアステコ（pepper huasteco）ウイルス、および地中海地域から新たに持ち込まれたトマトイエローリーフカールウイルス）。これらのウイルスは果実の数および大きさを抑えることによって収量を低下させる。それらが存在すると、媒介動物の個体数を抑えるための殺虫剤の使用量が増えるために管理コストが増し、そのため利潤が減る。地球上のこの地域の多くでは、これらのウイルスを抑制するための確実な手段が存在しない。米国および欧州で生産されたトマト交配種を用いるトマト輸出産業では、ウイルスを保持するコナジラミの個体数を減らすために化学的駆除が定期的に行われる。この手法の有効性は、数々の因子によって大きく異なる。一般には殺虫剤によってウイルスの出現率は低下すると思われるが、しばしば、この低下の程度は不十分である。多量の殺虫剤が使用された農地でウイルスに感染した植物が多く認められることは決して稀ではない。その該当例の1つが、フロリダでのトマト生産に関して重大な問題になっているトマト斑紋ジェミニウイルス（TMoV）である（Polstonら、1996，Plant Disea se 80：印刷中）。このウイルスはフロリダのトマト農地において高率に感染を引き起こしており、他の3つの州およびプエルトリコにおける疫病の原因でもある（Polstonら、1995）。本ウイルスの宿主域は狭く、トマトからトマトに伝染し、主に古い農地のトマトから新しい農地のものに伝染する。現在の駆除方法は、浸透性殺虫剤を約8週間使用した後に、シーズン（15〜18週のシーズン）が終わるまで種々の殺虫剤の葉面処理を行うことである。殺虫剤の頻回使用に伴うコスト、および1つの駆除手段のみへの依存は、ジェミニウイルスに対する抵抗性のあるトマト品種を用いることによって大きく軽減しうると考えられる。TYLCVに対する抵抗性を有する品種は数多いが、この抵抗性の範囲は狭く、他のジェミニウイルスに対する効果はほとんどまたは全くない。理想的には、多くのジェミニウイルスに対する免疫を付与する1つの遺伝子または複数の遺伝子が必要とされる。これにより、種子を扱う企業は、極めて多岐にわたる地域で育成させうるさまざまな園芸上の特質を有する品種に、1つの遺伝子または複数の遺伝子を導入することが可能になると思われる。植物ウイルスのコート蛋白質は、ウイルスの病原性において多くの機能的役割を果たしており、多くの場合には媒介動物による伝播に関与する。TMoVのような二裂型（bipartite）ジェミニウイルスのコート蛋白質は、ウイルスのコナジラミによる伝播およびウイルスによる疫病の発生に必要である。ジェミニウイルスのコート蛋白質は、ウイルスの全身移行（systemic virus movement）にも一定の役割を果たしており（Poomaら、1996）、複数の核移行シグナルを有する。コート蛋白質のドメインにはこれらの機能が含まれるが、まだマッピングはされていない。その他の研究（例えば、媒介動物による伝播と、アミノ末端付近の保存されたAsp-Ala-Gly残基にマッピングされるポティウイルス（potyviruses）のコート蛋白質との関連に関するもの）に基づくと、ウイルスコート蛋白質または他のウイルス蛋白質の機能の多くは蛋白質の露出表面付近のアミノ酸残基にマッピングされる。蛋白質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかの末端残基はしばしば蛋白質の露出表面付近に認められ、このことは機能性ドメインを有することを意味する。現在までに、従来の由来による遺伝子には、ジェミニウイルスに対する広範なスペクトルを付与することが判明しているものはない。病原体に由来する抵抗性を用いることは、ウイルスに対する抵抗性を付与する遺伝子の同定に成果を上げている手法である。ウイルス配列またはウイルス配列の改変物は、植物染色体に挿入された際にウイルス感染過程を妨げることが示されている。このことは多くの植物ウイルスファミリーに関して示されている。ポティウイルス科（Potyviri dae）ファミリーに属するウイルスに由来する改変されたコート蛋白質遺伝子で、特にカルボキシ末端に切断部を有するものは、ポティウイルスに対する優れた抵抗性を付与することが明らかになっている。この抵抗性は、構成的に産生された場合にそれらの配列に対して植物が何らかの特異的な反応を起こす原因となる、mRNAのレベルで生じていると思われる。それらの特異的な反応は、それらの植物に接種された際には、ポティウイルスに対する抵抗性を付与する。しかし、ジェミニウイルス由来のどの遺伝子を抵抗性を得るために用いることができるかについてはほとんど不明である。抵抗性または耐性を得るためのジェミニウイルスの使用に関する他の報告には、本発明者らの研究室からの移行蛋白質（movement protein）遺伝子（Duanら、 1996，The Plant Cell、投稿中）、TMoVのrep遺伝子に対する特定の変異（私信による、J．Stout，Seminis Seed Co.）、トマトゴールデンモザイクウイルスのアンチセンスrep遺伝子（Dayら、1991）、アフリカキャッサバモザイクウイルスのA成分（A component）のサブゲノム配列（Stanleyら、1990）がある。ジェミニウイルスコート蛋白質の使用に関してこれまでに発表された報告は1件に過ぎない。すなわち、イスラエル由来のコナジラミ伝播性ウイルスであるトマトイエローリーフカールウイルスから得られた非改変型コート蛋白質遺伝子によるトマトの形質転換が行われている（Kunikら、1994）。形質転換を受けたこれらの植物は、感受性反応、または症状を遅れて発現した後に回復するという2つの様式のいずれか一方の反応を示したと報告されている。回復した植物は反復接種に応じて抵抗性の増加を呈したが、有効レベルの抵抗性には達しなかった。発明の概要本発明は一部には、改変遺伝子による形質転換がなされた植物においてTMoVに対する抵抗性を誘導するために有用な改変遺伝子を得ることを目的として、TMoV の遺伝子を改変する方法に関する。本発明の1つの目的は、TMoVおよび他のジェミニウイルスに対する抵抗性を誘導するために用いうるTMoVの遺伝子を同定することである。タバコ（Nicotiana tabacum）でTMoVによる感染に対する抵抗性を誘発するための、改変されたコート蛋白質配列の評価が例示される。また、本発明は、タバコおよびトマトに、タバコモザイクトバモウイルスおよびトマト斑紋ジェミニウイルスの感染に対する抵抗性に加えて、他の関連したジェミニウイルスの感染に対する抵抗性をも付与する、改変された植物ウイルス遺伝子にも関する。トマト斑紋ジェミニウイルスの改変されたAVI遺伝子を適切な発現ベクター中にサブクローニングし、それによってタバコに形質転換を施した。改変された遺伝子の発現により、それが発現した植物にはウイルス感染に対する抵抗性が付与された。本発明はさらに、植物に対してウイルス抵抗性を付与するための方法に関する。また、本発明は、植物に対してウイルス抵抗性を付与する改変されたコート蛋白質遺伝子およびそれらの断片にも関する。本発明のさらなる1つの局面は、ウイルス抵抗性が高められた新規なトランスジェニック植物に関する。本発明のその他の目的および利点は、完全な発明の開示の概観および添付した請求の範囲から明らかになると思われる。図面の簡単な説明図1は、バイナリーベクターpBI121中に構築されるTMoV改変コート蛋白質（AV1 ）の模式図である。TMoVの改変されたコート蛋白質遺伝子は制限酵素を用いて切断した。コート蛋白質配列断片を、キュウリモザイクウイルス（CMV）コート蛋白質の5'非翻訳領域（リーダー配列）と連結させた。この結果得られたCMVコート蛋白質（AV1）は、プロメガ（Promega）社のpGEMEXベクター中にて、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、およびアグロバクテリウムT iプラスミドのノパリン合成酵素遺伝子（NOS-ter）由来のポリアデニル化シグナルに隣接している。結果として得られたカセットを切断し、選択用のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NTP II）遺伝子およびレポーター遺伝子β-グルクロニダーゼ（GUS）を含むバイナリーベクターpBI121中に挿入した。図2は、PCR増幅およびアガロースゲル電気泳動による、タバコ形質転換体（T₀ ）における導入遺伝子の存在の決定である。トランスジェニックタバコ系統からのCMV:TMoV AV1配列の増幅産物のサイズは275bpであると評価された。レーンは左から右の順で以下の通りである：レーン1：M=１KBラダーサイズマーカー。レーン2〜11：CMV:AV1配列を含むpBI121による形質転換を受けたT₀タバコ。レーン12：pBI121のみによる形質転換を受けたT₀タバコ。図3は、トマト斑紋ウイルス（TMoV）の改変されたコート蛋白質（AV1）配列を含む形質転換体（T₁世代）に由来する転写物のノーザンブロット分析である。ホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲルにおける電気泳動によって全RNAを分離した。RNAをナイロン膜に移行させ、TMoVコート蛋白質配列から作製した³²P標識 DNAプローブとハイブリダイズさせた。ゲル中での植物リボソームRNA 26Sおよび 18Sの位置を図示している。矢印はほぼ1.0kbの転写物の位置を示している。レーンは形質転換を受けたタバコからの全RNAであり、左から右の順に以下の通りである；レーン1：バイナリーベクターpBI121のみによる系統T₁-cp0。レーン2〜7：pBI121-AV1による系統T₁-cp7。レーン8〜9：pBI121-AV1による系統T₁-cp9。レーン10〜11：pBI121-AV1による系統T₁-cp6。レーン12〜13：pBI121-AV1による系統T₁-cp2。図4は、改変されたTMoVコート蛋白質をコードするヌクレオチド配列である。ヌクレオチド1〜55はキュウリモザイクウイルスのリーダー配列であり、ヌクレオチド56〜890は改変されたコート蛋白質をコードする。図5は、図4のヌクレオチド配列によってコードされる、導出されたアミノ酸配列である。発明の詳細な説明本発明は、植物において発現された際にその植物に植物病原体の感染に対する抵抗性を付与する、改変された植物ウイルス遺伝子に関する。1つの態様において、改変されたウイルス遺伝子は、コート蛋白質をコードするジェミニウイルスのAV1遺伝子である。ウイルスコート蛋白質などの移行蛋白質の機能の1つには、宿主の成分との相互作用が含まれる。おそらく種々の異なるウイルスが、細胞間移行のために同一の宿主成分を用いていると思われる。このため、正常なウイルス -宿主成分間相互作用を妨げることによって、広範なスペクトルを有するウイルス抵抗性がもたらされると考えられる。他のウイルス造伝子、特にウイルスの複製に関与するものは、高度にウイルス特異的な傾向があり、このため、このレベルでのあらゆる干渉によって得られるウイルス抵抗性のスペクトルは狭い。本発明の適用は、植物における広範なスペクトルを有するウイルス抵抗性を有利に提供する。本発明は、本発明の改変されたコート蛋白質またはその変種もしくは断片をコードするポリヌクレオチド分子にも関する。本発明の1つの例示される態様では、TMoVコート蛋白質のアミノ末端にある10アミノ酸残基が除去された。このポリヌクレオチド分子は、図4に示されたヌクレオチドまたはその縮重変種を含む。この改変により、そのコアが無傷のままであって、依然としてビリオンを形成する能力を有すると思われるコート蛋白質が提供される。また、本発明は、例えばジェミニウイルスなどの植物病原体による感染に対する抵抗性を植物に付与するための方法にも関する。本方法は、それが発現された際にその植物にウイルス感染に対する抵抗性を付与するように、改変された植物ウイルスによって植物に形質転換を施すことを含む。1つの態様において、改変された植物遺伝子は、図5に示された配列またはその断片を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。 1つの態様において、本発明の方法を、例えばトマト斑紋ジェミニウイルス、キャベツリーフカールジェミニウイルス、ジャガイモ黄色モザイクウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルス、トマト黄色モザイクウイルス、トマトリーフクランプルウイルス、トウガラシフアステコウイルス、トマトイエローリーフカールウイルスおよびその他のものを含む、トバモウイルスならびにジェミニウイルスなどのウイルスに対する抵抗性を植物に付与するために用いることができる。本発明はさらに、適した宿主内で発現しうる本発明の改変コート蛋白質またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列が挿入されたベクターを含む、組み換えポリヌクレオチド配列に関する。したがって、本ベクターは、新規なコート蛋白質および／または実質的に同じ性質を有するこの蛋白質の断片をコードする。具体的には、ベクターはプラスミド、ファージDNAまたはそれらの誘導物もしくは断片、またはプラスミドおよびファージDNAならびに酵母プラスミドの混合物から選びうる。改変されたコート蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、任意の望ましい植物用の発現または組込みベクター中への挿入に適合した制限末端を有するポリヌクレオチドの切り出しが可能な、市販されているpUCベクターまたはpGEMベクターなどのベクターの複数のクローニング部位に挿入することができる。この目的には、ウイルス遺伝子プロモーターなどの強力なプロモーターが本発明のポリヌクレオチドのコード配列と機能的に結合されている任意のベクターを用いうると思われる。例えば、カリフラワーモザイクウイルスの強力な35S プロモーターをこの目的に用いることができる。その他の既知の植物発現ベクターをこの目的に用いることもできる。また、本発明は、適した宿主内で発現しうる望ましい蛋白質またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列が挿入されたベクターを含む組み換えポリヌクレオチド配列による感染、形質転換またはトランスフェクションを受けた宿主にも関する。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は適したベクター中に挿入され、この組み換えベクターは、植物細胞内にその遺伝子を導入しうる細菌または他の宿主へと形質転換によって導入することができる。挿入されたポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が、改変されたコート蛋白質および／または実質的に同じ性質を有するこの蛋白質の断片をコードすることを特徴とする。本発明による組み換えポリヌクレオチド分子による感染、形質転換またはトランスフェクションを受け、それ故にこの蛋白質またはその断片を発現することが可能な多くの適した宿主には、大腸菌、枯草菌などのグラム陰性またはグラム陽性の細菌、昆虫細胞、植物細胞および酵母細胞などがある。例示される1つの態様では、コンピテントアグロバクテリウム細胞がこの目的に用いられ、組換えベクターを保持するアグロバクテリウムに植物切片が曝露される。遺伝子が効率的に取り込まれたことを確かめるために選択培地中で植物細胞を再生させることが好ましく、これに続いて再生した植物を生存のために最適化された条件下で育成する。または、バイオリスティック法によって植物細胞に組換えベクターを導入することもできる（Carrer，1995）。本発明は、本発明の改変されたコート蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物および植物組織にも関する。また、本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド分子によってコードされる改変されたコート蛋白質ならびにその断片および変種にも関する。例えば、位置指定突然変異誘発、Bal31による消化、およびN末端から最大約50アミノ酸残基までの削除を含む、コート蛋白質のN末端の任意の改変は、コート蛋白質のコアが無傷のままであるという点で同様の効果を有すると思われる。本発明は他のジェミニウイルスにも適用しうるが、これは本明細書の教示により、当業者に周知の標準的な植物形質転換法を用いて、任意のジェミニウイルスのコート蛋白質遺伝子に対する同様の改変によって抵抗性を付与するために有用な改変遺伝子が作製されると思われるためである。当業者には、本明細書に記載されたコート蛋白質を作製するには、遺伝暗号の縮重性に基づいて、多くの異なるヌクレオチド配列を用いうることが理解されると思われる。したがって、本明細書に記載された改変コート蛋白質をコードする任意のヌクレオチド配列は本発明および添付した請求の範囲に含まれる。また、本明細書に記載された通り、改変されたコート蛋白質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド断片も、このような断片が本明細書に記載された方法において植物のウイルス感染に対する抵抗性を高めうる限りにおいて、本発明の1つの局面である。このようなポリヌクレオチドは、当業者に周知の技法によって容易かつ定型的に作製することができる。例えば、一定時間にわたって完全長DNAのBal31エキソヌクレアーゼ消化を行い、続いてその結果として得られた断片の発現および定型的なスクリーニングを行うこと（Weiら、1983）は、そのポリヌクレオチドによる形質転換を受けた植物にウイルス感染に対する抵抗性を付与する能力を有する、本発明の改変されたコート蛋白質のポリヌクレオチド断片を容易に同定するために用いることができる。本発明のポリヌクレオチドには、例示される配列に変異を含む変異配列（vari ant sequence）も含まれる。これらの変異には、その変異配列が、その変異配列による形質転換を受けた植物にウイルス感染に対する抵抗性を誘導する能力を有する改変されたコート蛋白質をコードする限りにおいて、例えばヌクレオチドの置換、挿入および欠失が含まれる。当業者は、本発明の変異ポリヌクレオチド配列を容易に調製および使用することができる。本明細書で開示されるアミノ酸配列は、アミノ酸残基に関する標準的な1文字略号に基づく。本開示に引用された参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。以下は、本発明を実践するための材料、方法および手順を、最良の態様を含めて例示する実施例である。これらの実施例は、例示のみを目的としており、限定的なものとはみなされるべきでない。実施例1：改変されたTMoVコート蛋白質遺伝子の形質転換カセットの作製 TMoVのコート蛋白質に対して、蛋白質のN末端をコードする領域に改変を加えた。TMoVのA成分のクローン（Abouzidら、1992）から、制限酵素NcoIを5'末端（ nt 355）に用い、XbaIを3'末端（nt 1192）に用いて、TMoVの5'末端にある30個のヌクレオチド（nt）を削除した。NcoI制限酵素適合配列が末端に位置するキュウリモザイクウイルス（CMV）コート蛋白質の5'非翻訳領域（リーダー配列）（C orne 11 UniversityのD．Gonsalvesによって調製されたクローンから入手）を増幅し、NcoI部位でTMoVコート蛋白質遺伝子と連結させた。構築物を図1に示す。改変されたTMoVコート蛋白質配列を有するCMVリーダー配列からなる連結された構築物を、植物構成性発現ベクターとしての役割を果たすとともに、カリフラワーモザイクウイルス35S遺伝子の調節要素、選択用のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子、およびレポーター遺伝子β-グルクロニダーゼ（GUS）を含むプラスミドpBI121（CLONTEC HLaboratories，Palo Alto，CA）中に連結させた。改変されたコート蛋白質の配列を有するこのバイナリー発現プラスミドを、形質転換を容易にするために、大腸菌からアグロバクテリウムLB4404株（CLON TECH Laboratories）に移行させた。実施例2：タバコの形質転換改変されたTMoVコート蛋白質を有するアグロバクテリウムツメファシエンス（ A．tumefaciens）を用いてタバコ（N．tabacum）「クサンシ（Xanthi）」のリーフディスクに形質変換を施し、ホーシュ（Horsch）ら（1985）の方法に従って、 MS塩、スクロース（30g／l）、ビタミンB5（1ml／l）、インドール-3-酢酸（0 .3mg／l）、2iP、N6-[2-イソペンテニル]アデニン（10mg／l）、カナマイシン（ 100mg／l）およびメフォキシン（mefoxin）（200mg／l）からなる培地上で苗条を再生させた。続いて、形質転換を受けた苗条を100μｇ／lのカナマイシンを含む無植物ホルモン培地上に植え付け、土壌に切り替えた。実施例3：PCR増幅による導入遺伝子の検出導入遺伝子（CMV:TMoV-AVI）の増幅のために選択されたプライマーは、キュウリモザイクウイルス（CMV）コート蛋白質の5'非翻訳領域に対する特異的プライマー（EH55、5'-GTTAGTTGTTCACCT-3'）およびトマト斑紋ウイルス（TMoV）コート蛋白質（AV1）に対する内部特異的プライマー（EH82、5'-CCTTACCGATATGTGA-3 '）とした。PCR反応はバイオメトラ（Biometra）社のサーモサイクラーを用いて以下の通りに実施した：94℃2分間、45℃2分間および72℃3分間を35サイクル。最後に72℃で10分間のDNA伸長サイクルを行って増幅を終了した。実施例4：サザンおよびノーザンブロット分析タバコ葉組織からのDNA抽出 DNAは、ソニ（Soni）およびマレー（Murray）（19 94）による方法の変法によって単離した。シダモザイクジェミニウイルスDNAによるアグロインオキュレーションを受けた（agro-inoculated）形質転換体の葉または形質転換体のリーフディスクから採取した組織（0.2〜0.5g）を、液体窒素中で乳鉢および乳棒にて粉砕して微粉末にした。この粉末を1.5mlの抽出緩衝液（50mM Tris，pH8.0，10mM EDTA，2％ SDS，100mM LiClおよび10μｇ／mlのプロテイナーゼK）によってホモジネート化した。混合物を15〜30分撹拌し、続いて600rpm、5分間の遠心処理を行った。上清に等容積のイソプロパノールを添加し、1000rpmで5分間の遠心処理によって核酸を沈殿させ、20μｇ／mlのRNアーゼを含む0.5mlのTE（10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA）中に再懸濁した。37℃で30分間インキュベートした後に、混合物をフェノール：クロロホルム-イソアミルアルコール（25：24：1）によって1回抽出し、クロロホルムによって1回抽出した。1／3倍量の容積の7.5M酢酸アンモニウムおよび等容積のイソプロパノールによって核酸を沈殿させ、続いてH₂O中に再懸濁した。再懸濁したDNAをPCRおよびサザンブロット分析に用いた。サザンブロットサザンブロットは標準的な手順に従って得た。タバコ葉組織からのRNA抽出コッシオロン（Cocciolone）およびコーン（Cone ）（1993）に基づき、デュアン（Duan）らが改変した（1996）方法によって全RN Aを単離した。若齢タバコ葉組織（0.2g）を、液体窒素中で乳鉢および乳棒にて粉砕して微粉末にした。この粉末を1.0mlの抽出緩衝液（7M尿素、0.35 NaCl，50 mMTris，pH8.0，20mM EDTA，1％サルコシル）によってホモジネート化した。混合物をフェノール：クロロホルム-イソアミルアルコール（25:24:1）によって1 回、さらにクロロホルム-イソアミルアルコール（24：1）によって1回抽出し、続いて600rpmで5分間の遠心処理を行った。水相に等容積のイソプロパノールを添加し、混合物を氷上で5分間冷却することによって重い核酸を沈殿させた。-20 ℃で1時間インキュベートした後に、14,000rpm、10分間の遠心処理にかけることによって可溶性画分からRNAを得た。ペレットを70％エタノールで洗い、TE（10m MTris，pH8.0，1mM EDTA）0.4ml中に再懸濁し、クロロホルム-イソアミルアルコールによって抽出した。0.1倍量の容積の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の容積の 100％エタノールを添加することによってRNAを水相から沈殿させた。ノーザンブロット全DNAをTAE緩衝液中での0.9％アガロースゲルにおける電気泳動にかけ、アルカリ性移行溶液（0.4M NaOH，0.6NaCl）を用いてナイロン膜に移行させた。全RNAを、ホルムアルデヒドを含むMOPS緩衝液中での1.0％アガロースゲルにおける電気泳動にかけ、10×SSC溶液を用いてナイロン膜に移行させた。プローブは、Prime-a-Gene（登録商標）標識キット（Promega）を用いて、TMo V AV1 DNAおよびSiMV DNAのA成分にランダムプライミングがなされた³²P標識を行うことによって作製した。ブロットのハイブリダイゼーション（65℃で一晩）は、サムブルック（Sambrook）ら（1989）に従って、6×SSC、5×デンハルト溶液および0.5％ SDS、0.1mg／mlサケ精子DNA中にて行った。ブロットはブレア（B lair）ら（1995）に従って洗浄した。実施例5：ウエスタン免疫ブロット分析トランスジェニックタバコにおけるTMoVの改変されたコート蛋白質の発現を、滅菌水による1.5％SDS中で若齢葉組織を粉砕し、続いて1容積の組織抽出液を1容積のレムリ解離緩衝液（Laemmli，1970）と混合することによって検討した。混合物を2分間煮沸し、サンプルを10％SDS-PAGEにかけた。蛋白質をBio-Rad Mini- PR OTEAN II中での電気泳動にかけ、Bio-RadTrans-Blot（登録商標）電気泳動移行槽（Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA）を用いて、分離された蛋白質をニトロセルロース膜に移行させた。化学発光検出システムWestern-Light（Tropix，I nc.，Bedford，MA）および以前に記載された手順（Cancinoら、1995）を用いて、免疫ブロットを、大腸菌内で発現されたTMoVのコート蛋白質に対して調製されたポリクローン抗血清（Abouzidら、未発表）、およびヤギ抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ結合物によって標識した。実施例6：タバコリーフディスクへのSiMVの接種 100μｇ／mlのカナマイシンを含むMS発根培地上でT₀系統の種子を個別に発芽させ、子孫（T₁）のリーフディスクにSiMV DNA（Abouzidら、1995）によるアグロインオキュレーションを行った（Klinkenbergら、1989）。実施例7：コナジラミを用いてのタバコへのTMoVの接種 100μｇ／mlのカナマイシンを含むMS発根培地上でT₀系統の種子を個別に発芽させ、その結果得られたT₁子孫を、コナジラミ接種のために土壌に移植した。4 〜6葉期の実生に、TMoVに感染させて30℃の成長室で育てたトマト株で養ったコナジラミを接種した。30℃の成長室においた0.25m³の遮蔽ケージ中にコナジラミ成虫を1株あたり20匹の濃度で添加した。コナジラミのタバコ実生に対する接種可能期間（inoculation access period）は5日間とした。接種された植物に殺虫性石鹸を噴霧することにより、接種可能期間を終了させた。実施例8:TMoVを接種されたタバコの評価接種後にはほぼ30日毎に症状を評価した。接種70日後の時点でのTMoVの全身感染（systemic infection）に関する、B成分に対するドットスポットハイブリダイゼーションおよび／またはPCRプライマーによる分析のために、最も若齢の葉からサンプルを採取した。接種100日後に再度サンプルを採取し、PCRを用いてTM oVによる全身感染に関して検討した。プローブを用いるドットスポットハイブリダイゼーションは、高緊縮条件下で行い、クローン化されたTMoV B成分を含む（ Polstonら、1993）。ウイルスDNAの増幅は、B成分は増幅するがA成分は増幅しない縮重プライマー（pBL1v2042およびpCRc154）を用いて行った（Rogasら、1993 ）。増幅手順ではまず94℃、5分間の変性を行い、続いて以下を35サイクル行った：50℃ 1分間のアニーリング、72℃3分間の伸長および94℃1分間の変性。実施例9：タバコ形質変換体の分析 CMVリーダー配列およびコート蛋白質に対するプライマーを用いるT₀タバコ形質転換体のPCR増幅から、CMV（リーダー配列）および改変されたTMoV AVI配列の両方による形質転換を受けたタバコは10株であったことが示された（図2）。さらに、対照として、1つの系統がpBI121のみによって首尾よく形質転換を受けた。形質転換を受けた植物を土壌に移す前に各株からサンプルを採取し、形質転換効率に関するGUSアッセイ、導入遺伝子の存在に関するサザンブロット法、および改変されたコート蛋白質の発現に関するウエスタンブロット法によって検討した。検討したすべての形質転換株はGUS遺伝子を有することが明らかになった。サザンブロット分析から、植物ゲノム中に導入遺伝子の多コピーが存在することが示された。実施例10：改変されたコート蛋白質のmRNAの存在ウイルスを接種されていない選択されたタバコ形質転換体（T₁世代）のノーザンブロット分析では、ほぼ1.0kbのサイズの転写物が1つのみ認められた（図3）。これが予想されるCMVリーダー-コート蛋白質転写物よりも大きかった（1.0kb に対して0.9kb）のは、転写物中にpBI121のNOS-ter配列（260bp）が存在するためと考えられる。実施例11：改変されたコート蛋白質の発現化学発光検出システムを用いる標準的なウエスタンブロット手順では、いずれの形質転換体においても改変されたコート蛋白質の発現は検出されなかった。これは恐らく、アミノ末端が改変されたコート蛋白質の不安定性のため、または発現レベルが検出感度を下回ったためと考えられる。実施例12：コナジラミによるタバコへのTMoVの接種 10系統のT₀タバコ株のうち8系統からのT₁子孫に対して、コナジラミによってT MoVを接種した。接種70日後の時点での植物株の分析（表1）の結果、系統内に分離はみられるものの、検討したすべての系統で感染率は対照（T₁-cp0）よりも低いことが明らかになった。いずれのアッセイで測定した場合にも、全体的には、症状の発現とウイルスDNAの存在との間には良好な一致が認められたが、これはドットスポットハイブリダイゼーションおよびPCR分析の結果の間に良好な一致がみられたためである。本発明者らには、TMoVの複製レベルが非常に低いためにPC Rによる検出は可能であるがドットスポットハイブリダイゼーションによる検出は行えないといったケースは見いだせなかった。TMoVに対する抵抗性の割合は系統によって異なった。2つの系統T₁-cp10およびT₁-cp11では、初回接種から100日後にも感染した植物はなかった。系統間のばらつきは、導入遺伝子のコピー数、導入遺伝子の位置、および／または抵抗性および感受性を有する植物株の分離比に対するそれらの影響によると考えられる。感染率は一般に時間の経過に伴って徐々に増加した。これは一部には、初回接種に用いたコナジラミの卵から発生したコナジラミによる断続的な接種が原因であると考えられる。全体的には、PCRによって評価した導入遺伝子の存在と、初回接種から100日後の時点でのTMoVによる全身感染に対する免疫との間には良好な一致が認められた（表2）。これには系統間で差があり、いくつかの系統（T₁- cp4、T₁-cp10およびT₁-cp11）では90〜100％の相関が認められた。実施例13：アグロインオキュレーションによる抵抗性に関するトランスジェニックタバコの評価本発明者らは、予備試験において、TMoVと密接に関連したジェミニウイルスの 1つであるシダモザイクウイルス（SiMV）（Abouzidら、1995）のDNA複製に対するTMoV抵抗性トランスジェニックタバコの影響を検討した。本発明者らは、インビトロでのリーフディスクアグロインオキュレーションアッセイ（K1inkenberg ら、1989）を行った。トランスジェニックT₀株のT₁子孫10〜15株からのリーフディスクに対して、SiMVのクローン化されたゲノム（DNA AおよびDNA B）（Abouzi dら、未発表）の頭-尾型二量体（head-tail dimer）を保持するアグロバクテリウムの混合培養物を接種し、ウイルスDNAの複製を抑制するそれらの能力をアッセイした。アグロインオキュレーションから10日後に、形質転換を受けたリーフディスクのDNA抽出物を用いてウイルスDNAに関するアッセイを行った。SiMVのDN AAプローブ（完全長）を用いたサザンブロットのハイブリダイゼーションの後に、1本鎖（ss）SiMVゲノムDNAが存在したこと、およびその複製中間体が接種されたウイルス感受性のリーフディスクにおいてocおよびscを形成したことから、Si MV DNAがアグロバクテリウムTiプラスミドから放出され、接種された組織中で複製されたことが示された。タバコトランスジェニック系統におけるウイルスDNAの量はさまざまであった。1つのトランスジェニック系統で検出されたSiMV DNAは極めて微量であった。改変されたTMoVコート蛋白質遺伝子に関してトランスジェニックであるタバコは、植物株全体において、TMoVによる全身感染に対する抵抗性を示した。導入遺伝子の存在は症状抑制およびTMoVによる初回接種から60日後に生じた葉におけるウイルスDNAの検出不能性と相関した。改変されたTMoVコート蛋白質遺伝子に関してトランスジェニックである1つのタバコ系統は、リーフディスクアッセイにおいてシダモサイクジェミニウイルスの複製を抑制した。改変されたTMoVコート蛋白質遺伝子による形質転換を受けた植物はmRNA転写物を生じることが示されたが、ウエスタンブロット法では改変されたコート蛋白質の発現は検出されなかった。改変されたTMoVコート蛋白質遺伝子は、本明細書の教示により、ジェミニウイルスに対する抵抗性を獲得させる上で有用である。上記の記載および実施例は、本発明の作成および使用の方法に関する詳細を最良の態様を含めて提供しているが、その明らかな変種および機能的等価物は本発明の一部であってそれ故に以下の請求の範囲に含まれるとみなされるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ハイバートアーネストアメリカ合衆国フロリダ州ゲインズビル 36ステラースエヌ．ダブリュ. 2201 (72)発明者アボージッドアーメドアメリカ合衆国フロリダ州ゲインズビル 20スアベニューエス．ダブリュ. 3520 ＃１

Claims

【特許請求の範囲】 1．改変された植物ウイルスコート蛋白質をコードするポリヌクレオチドによって植物を形質転換させることを含む、植物へ植物ウイルス感染に対する増強された抵抗性を付与するための方法であって、該ポリヌクレオチドが該植物に植物ウイルス感染に対する抵抗性を付与する方法。 2．ポリヌクレオチドが、図4に示されたヌクレオチド配列またはその縮重性の断片もしくは変異体を含む、請求項1記載の方法。 3．ポリヌクレオチドが図4に示されたヌクレオチド配列の56位〜890位のヌクレオチドまたはその縮重性の断片もしくは変異体を含む、請求項1記載の方法。 4．改変された植物ウイルスコート蛋白質をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドを有する植物に増強されたウイルス抵抗性を付与するポリヌクレオチド。 5．図4に示されたヌクレオチド配列またはその縮重性の断片もしくは変異体を含む、請求項4記載のポリヌクレオチド。 6．図4に示されたヌクレオチド配列の56位〜890位のヌクレオチドまたはその縮重性の断片もしくは変異体を含む、請求項4記載のポリヌクレオチド。 7．改変された植物ウイルスコート蛋白質であって、該蛋白質を発現している植物に増強されたウイルス抵抗性を付与する能力を有するコート蛋白質。 8．図5に示されたアミノ酸配列またはその断片もしくは変異体を含む、請求項7 記載の改変された植物ウイルスコート蛋白質。 9．図4に示されたヌクレオチド配列の56位〜890位のヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列またはその断片もしくは変異体を含む、請求項7記載の改変された植物ウイルスコート蛋白質。 10．ウイルス感染に対する抵抗性が高められたトランスジェニック植物または植物組織であって、該植物が請求項7記載の改変された植物ウイルスコート蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関してトランスジェニックであるトランスジェニック植物または植物組織。 11．請求項4記載のポリヌクレオチドによって形質転換された細胞。