JP2000516472A

JP2000516472A - 組織特異的遺伝子発現を与える自己複製型エピソーム性発現ベクター

Info

Publication number: JP2000516472A
Application number: JP10510501A
Authority: JP
Inventors: アントニウ，マイケル; ゲラドゥスフロスフェルト，フランクリン
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1997-08-18
Publication date: 2000-12-12
Also published as: DE69704206T2; PT918874E; WO1998007876A2; AU4020997A; WO1998007876A3; DE69704206D1; EP0918874A2; ES2157084T3; EP0918874B1; GR3035838T3; DK0918874T3; CA2263796A1; ATE199570T1; AU725474B2

Abstract

(57)【要約】自己複製、長期間の組織特異的遺伝子発現のための遺伝子座制御領域(LCR)含有エピソーム性発現ベクター、目的の遺伝子の持続性組織特異的発現が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】組織特異的遺伝子発現を与える自己複製型エピソーム性発現ベクター発明の一般的な分野本発明は、宿主細胞における目的の遺伝子を発現するための安定な自己複製型エピソーム性発現ベクターに関する。発明の背景宿主細胞における外来遺伝子の発現は、一般に、遺伝子移入ベクターを用いて遺伝子を宿主細胞中に移入することによって達成される。遺伝子移入ベクターは、当該分野において入手可能であり、そして例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターを含む。多くの移入ベクターは、完全な遺伝子移入ベクターではないにせよ、少なくとも移入される遺伝子を、宿主細胞の染色体中に組み込むことによって作動するが、非取込み移入ベクターは当該分野において公知である。形質移入した遺伝子構築物の安定な取込みの効率は、一般に非常に不効率である(１：10³〜10⁶)。ウイルスベクターベース遺伝子移入を用いることの不利益は、ベクターが収容し得る量の遺伝子物質が、ウイルスの遺伝子パッケージング限界によって限定されることである。挿入された遺伝子物質の大きなフラグメントを含む遺伝子移入ベクターは、実用価値を有するのに十分に高い力価で生成することが困難である。従って、ウイルスベースベクター（例えば、安定な遺伝子移入に悪影響を及ぼすことのない遺伝子調節エレメント）中にさらなる遺伝子物質を含ませることは困難である。遺伝子座調節領域（Locus Control Region）(LCR)（Grosveldら、Cell 51:975 -985(1987)）(Dominant Activator Sequence、遺伝子座活性化領域（Locus Acti vating Resion）、またはDominant Control Regionとしてもまた公知)は、宿主細胞の染色体中に組み込まれた連結遺伝子に対して、組織特異的な組込み部位非依存性コピー数依存性発現を与える。LCRは、元来は、ヒトグロビン遺伝子系において発見され、それは、トランスジェニックマウスの組織中の宿主細胞、またはマウス赤白血病(MEL)細胞の染色体中に組み込まれる場合、強い位置効果を示した（例えば、Magramら、Nature 315:338-340(1985);Townesら、EMBO J．4:1 715-1723(1985);Kolliasら、Cell 46:89-94(1986);Antoniouら、EMBO J．7:377- 384(1988))を参照のこと。位置効果は、LCRがそのような導入遺伝子に直接連結された場合、克服された（Grosveldら、前出）。他のLCRは、赤血球組織における遺伝子発現を促進するβ-グロビンLCR(βLCR)、およびＴ細胞における遺伝子発現を促進するCD2 LCR（例えば、Greavesら、Cell 56:979(1989)，欧州特許出願EP-A-O 668 357）、マクロファージ特異的リゾチームLCR（Boniferら、(1985 ，1990)）、およびクラスII MHC LCR（Carsonら、Nucleic Acids Res．21，9:20 65-2072(1993)）を含むと同定されている。本発明の目的は、宿主細胞中に存在する場合、ベクター中に運ばれる目的の遺伝子の安定かつ組織に制限される発現を与える安定な遺伝子移入系を提供することである。発明の要旨本発明は、目的の遺伝子が、特定の組織型の細胞における遺伝子の発現のために挿入される自己複製型LCR含有エピソーム性発現ベクターを提供する。従って、本発明は、組織に制限される様式で、宿主細胞における目的の遺伝子を発現するための自己複製型エピソーム性DNA発現ベクターを含み、そのベクターは以下：（ａ）組織の特定の型の細胞におけるDNA発現ベクターの複製を指向し得る複製起点；および（ｂ）LCRまたはその成分であって、それらは、目的の遺伝子に作動可能に連結され、そして宿主細胞中に存在する場合、組織に制限される様式で遺伝子の発現を指向する、LCRまたはその成分を含む。本発明に従ったベクターはまた、クローニング部位中に挿入され、そしてLCR に作動可能に連結される目的の遺伝子を含み得る。用語「遺伝子」は、発現され得る任意のDNA配列を定義するために使用される。目的の遺伝子は、外来または異種の遺伝子、すなわち宿主細胞のゲノムDNA中に通常見出されないか、またはその宿主細胞において正常に発現されない遺伝子であり得る。目的の遺伝子はまた、人工DNA配列であり得る。目的の遺伝子の組織に制限される発現は、適切なLCRまたはその成分もしくは部分（それは、目的の遺伝子に対して組織型特異的発現を与える）を用いて、目的のベクターにおいて媒介される。本明細書中で使用される「遺伝子座制御領域」(LCR)は、真核生物の宿主細胞の組織特異的遺伝子座から得られ、そして目的の遺伝子に連結され、そして宿主細胞の染色体中に組み込まれる場合、目的の遺伝子に対して、組織特異的組込み部位非依存性（位置非依存性）コピー数依存性発現を与える遺伝子エレメントとして定義される。本発明に従って有用であるLCRは、染色体DNA中に組み込まれる場合、これらの特徴を有し、そして本発明に従った自己複製型エピソーム性ベクター中に存在する場合、連結される遺伝子の組織型に制限される発現を与える能力を保持する。LCRの「成分」は、遺伝子に連結され、そして自己複製型エピソーム性ベクター中に組み込まれる場合、組織に制限される遺伝子もまた与えるLC Rの一部をいう。LCRは、それが、天然の染色体状況における１つ以上のDNase I 過感受性部位と関連し、そして本発明に従って有用なLCRの成分はまた、少なくとも１つのDNase I過感受性部位を有するという点で、構造的に同定され得る。本明細書中において「エンハンサー」は、自己複製型エピソーム性ベクター上に存在する場合連結される遺伝子の転写のレベルを増加させるが、ベクター上に存在する場合組織特異的遺伝子発現を与えない遺伝子エレメントとして定義される。ベクターが、組織特異的発現を与えるLCRの成分を含み、そして少なくとも１つのDNase I過感受性部位を含むことは好ましい。ヒトβ-グロビンLCRにおいて、LCRの好ましい成分は、本質的にHS3からなり；また好ましくは、部位HS2を除くヒトβ-グロビンLCRであり；また好ましくは、部位HS2なしで、部位HS3および HS4の集まりである。本発明はまた、組織に制限される様式で、宿主細胞において目的の遺伝子を発現するための自己複製型エピソーム性DNA発現系を含む１対のベクターを含み、その１対のベクターは以下を含む：以下を含む第１のベクター：（ａ）複製起点；（ｂ）LCRまたはその成分であって、それらは目的の遺伝子に作動可能に連結され、そして宿主細胞中に存在する場合、組織に制限される様式で、遺伝子の発現を指向する、LCRまたはその成分；（ｃ）目的の遺伝子のためのクローニング部位；ならびに以下を含む第２のベクター：（ｄ）複製起点；および（ｅ）複製タンパク質をコードする配列であって、その複製タンパク質は、複製起点の複製のために必要である、配列。別の実施態様において、目的の遺伝子およびウイルスの複製遺伝子がいくつかの同じ細胞において発現されるように、第２のベクターはまたLCRを含み得、それは、第１のベクター上に存在するものと同じLCRであり得るか、または第１のL CRと同じかもしくは少なくとも重複する組織特異性を特定する異なるLCRであり得る。赤血球に制限される遺伝子発現のために、β-グロビン遺伝子座由来のβ-グロビンLCRが使用されることは好ましい。本明細書中で使用される「赤血球」は、赤血球系統の細胞をいう。Ｔ細胞に制限される遺伝子発現のために、CD2遺伝子座由来のCD2 LCR、またはエピソーム性状況においてＴ細胞に制限される遺伝子発現を指向する少なくとも１つのDNase I過感受性部位を含むLCRの成分が使用されることは好ましい。クラスII MHC関連細胞に制限される遺伝子発現のために、クラスII MHC LCR、またはエピソーム性状況においてMHC関連細胞に制限される遺伝子発現を指向する少なくとも１つのDNase I過感受性部位を含むLCRの成分が使用されることは好ましい。マクロファージ細胞に制限される遺伝子発現のために、マクロファージ／リゾチームLCR、またはエピソーム性状況においてマクロファージ細胞に制限される遺伝子発現を指向する少なくとも１つのDNase I過感受性部位を含むLCRの成分が使用されることは好ましい。用語「エピソーム性ベクター」は、直線状または環状であり得、そして通常形態が二本鎖である核酸ベクターをいう。本発明に従ったベクターは、一般に、１ kb〜1,000kbのサイズ範囲内であり、好ましいサイズ範囲はおよそ５kb〜100kbである。用語「自己複製型」、「安定に維持された」、および「持続性」は、本明細書中で以下のように定義される。本発明のベクターの自己複製型機能は、ベクターが、ゲノムDNA複製から独立して細胞において安定に維持されること、および細胞におけるベクターのコピー数における有意な消失なしで、すなわち所定の細胞分割間の前駆細胞におけるベクター分子の平均約50％より多い消失なしで、３つ以上の細胞分割間に前駆細胞において持続することを可能にする。この自己複製型機能は、ウイルスの複製起点を用いること、および特定のウイルス複製開始点によって媒介される複製のために必要とされる１つ以上のウイルスの複製因子を提供することによって提供される。複製起点および、必要ならば任意の複製因子は、種々のウイルス（エプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトおよびウシパピローマウイルス、ならびにパポバウイルスBKを含む）から使用され得る。好ましい実施態様において、ウイルスの複製起点は、EBVのoripであり、そして複製タンパク質の因子は、トランス作用性EBNA-1タンパク質である。EBNA-1は、OriPを有する同じエピソーム性発現ベクター上、または細胞中、もしくは宿主細胞のゲノムDNA中のEBNA-1遺伝子由来の別のベクター上のEBNA-1遺伝子の発現によって提供され得る。好ましい実施態様において、ウイルス複製因子をコードする遺伝子は、自己複製型エピソーム性ベクター上、すわなち目的の遺伝子を有する同じベクター、または1対のベクターの別のベクターのいずれかの上に存在し得、そしてLCRに作動可能に連結され得る。本明細書中で使用される「連結される」は、目的の遺伝子および／またはウイルス複製因子をコードする遺伝子ならびにLCRが、同じベクター中に含まれ、従って同じDNA上にシスで存在するシス連結をいい、そして「作動可能に連結される」は、目的の遺伝子および／またはウイルス複製遺伝子が、LCRを介して組織に制限される発現に供すシス連結をいう。必要に応じて、転写ターミネーターは、目的のベクター中、好ましくはLCRまたはその成分間に、および目的の遺伝子のプロモーター、またはベクター上に存在し得る他のプロモーター由来のこれらの遺伝子の所望されない転写を防ぐためのウイルス複製タンパク質をコードする遺伝子中に導入され得る。あるいは、転写ターミネーターは、LCRの上流および目的の遺伝子またはウイルス複製遺伝子の下流に導入され得る。本発明のエピソーム性発現ベクターは、DNA分子を細胞に送達するために使用される種々の方法のいずれかによって、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達され得る。ベクターはまた、単独、または身体内の細胞への送達を増強する薬学的組成物の形態で送達され得る。好ましい実施態様において、本発明のベクターは、遺伝子治療において、身体内の特定の罹患した組織（腫瘍組織を含む）の細胞中の治療的に有用なタンパク質を発現するために使用される。本発明のベクターはまた、インビトロの特定の組織型の細胞中の治療的に有用なタンパク質を発現するために使用される。本発明の別の実施態様において、本明細書中に記載のベクターを使用して、外来または異種の遺伝子が、LCRまたはその成分によって指向され、ベクター中に組み込まれるような特定の組織型においてのみ発現される、トランスジェニック動物の型を生成する。ベクターの自己複製機能は、ベクターが、トランスジェニック動物の前駆体を通過することを確実にする。そのようなトランスジェニック動物は、ヒトの臨床的処置前の、組織特異的遺伝子発現の信頼性および効率性を試験する際に特に有用である。本発明の別の実施態様において、エピソーム性DNA発現ベクターに含まれ、目的の遺伝子に作動可能に連結され、そして宿主細胞中に存在する場合、組織に制限される様式で遺伝子の発現を指向するLCRまたはその成分を同定するための方法で以下： i．LCRまたはその成分を、LCRが取り込まれた場合に活性である細胞株中に、そしてまた、LCRが取り込まれた場合に不活性である細胞株中に、マーカー遺伝子に操作可能に連結した候補LCRまたはその成分を含むエピソーム性ベクターをトランスフェクトすることにより試験する工程；および ii．取り込まれた場合LCRが活性である細胞株においてのみ活性であるLCRまたはそれらの成分を同定する工程、を包含する方法が提供される。本発明のさらなる特徴および利点は、以下の図面、記載、および請求の範囲に見い出される。図面の簡単な説明図１は、EBVに基づく自己複製型発現ベクターp220.2の模式図である。p220.2 は、8952bpのプラスミドで、これは、EBNA-1、OriPおよびハイグロマイシン耐性をコードする。これは、143およびHeLa細胞におけるプラスミドとして複製する。この構築物におけるEBNA-1は、pBR322配列中に配置される未知のプロモーターを除去されている。EBNA-1の上流に挿入されたDNAは、EBNA-1の発現を除去するようである。bp１-35はpBR322である。bp36-2646は、EBV EBNA-1 107567-110176 のBamHI-PvuIIフラグントである（Baerら、Nature、310:207-211、1984）。BamH I部位は、HindIII部位に連結された平滑末端であった。bp2647-4826は、BstEII 部位に平滑末端連結されたEBV OriP 7333-9516 SphI-SstII部位である（Sugden ら、MCB、5:410-413、1985）。bp4827-5460は、HSV TK調節領域である（McKnigh t,NAR,8:5949-5964,1980）。bp6488-6747は、NaeI部位に毒性のないpBR322へ連結されたHSV TK PvuIIフラグメントである。この部位は、クローニングにおいて欠失する。bp5461-6487は、HSV TK配列中のSmaIおよびBgIII部位へ平滑末端連結されたHPH遺伝子（GritzおよびDavies、Gene,25:179-188,1983）のBamHIフラグメントである。bp6748-8952は、pBR322の毒性のないベクター（pBR322において1 .1kbが欠失する）である。これは、アンピシリン耐性を与える（LuskyおよびBot chan,Nature 293:79-81,1981）。pUC12からのポリリンカー（SmaI-HaeIIIフラグメント）は、HSV TK配列中のNarI部位に挿入されている。(/)は、平滑末端連結を示す。図２は、レポータ遺伝子構築物を示す： a）5’HpaI部位（815位）からEcoRV部位（1685位）へとプラスミドGSE1758中のポリＡ付加部位を過ぎて延びるβグロビン遺伝子（Talbotら、EMBO J．9:2169 -2178,(1990)）は、4.1kb EcoRVフラグメントとして取り出され、そしてp220.2 のポリリンカー中の平滑末端SaII部位に挿入される（図１）。このクローンイング工程は、多数の余分の制限部位（独特なSaII部位を含む）をβグロビン遺伝子の5’にもたらす。図３は、βグロビンLCR過感受性部位構築物を示す。２つ以上の過感受性部位を含む構築物は、野生型βグロビン遺伝子座の部位の順序に一致するように設計された。SalIリンカーは、5’末端および3’末端の両方に添加され、これはDNA をp220.2レポーターベクター中のβグロビン遺伝子の上流の独特なSalI部位へとクローニングされることを可能にする（図２）。図４は、以下を示す： a）βグロビンLCR由来のHS成分の種々の組合せに作動可能に連結されたヒトβグロビンレポーター遺伝子を含む自己複製型エピソーム性発現ベクターでトランスフェクトしたK562細胞由来のRNAのSIヌクレアーゼ分析のオートラジオグラム。レーンβ1（βグロビン遺伝子単独）、レーン２β１および２（βグロビン遺伝子に作動可能に連結されたHS2）、レーン３β１および２（βグロビン遺伝子に作動可能に連結されたHS３）、レーン４β１および２（βグロビン遺伝子に作動可能に連結されたHS４）、レーン４β１および２（βグロビン遺伝子に作動可能に連結されたSH４）、レーン23β１および２（βグロビン遺伝子に作動可能に連結されたHS2/HS3の組合せ）、レーン34β１および２（βグロビン遺伝子に作動可能に連結されたHS3/HS4の組合せ）、レーン24β１および２（βグロビン遺伝子に作動可能に連結されたHS2/HS4の組合せ）、レーン234β１および２（βグロビン遺伝子に作動可能に連結されたHS2/HS3/HS4の組合せ）。レーン＋γは、ネガティブコントロールとしてのトランスフェクトされていないK562細胞であり、そしてレーン＋βは、ポジティブコントロールとして作用するβグロビン遺伝子とβLCRとの組合せでトランスフェクトされたMEL細胞をいう。すべてのレーンは、独立したトランスフェクションである。 b）S1保護フラグメントを含むβグロビン遺伝子の5’領域由来の末端標識されたDNAプローブを模式的に示す。図５は、本明細書中に記載される構築物を含むK562またはHeLa細胞由来のRNA ブロットのオートラジオグラムを示す。パネルＡ：レーンＭは、pBR322サイズマーカーのHlnf1消化物である；レーンＰは、ポジティブコントロールとしてのヒトβグロビン遺伝子で安定にトランスフェクトされたMEL細胞由来のRNAである；レーンβは、ヒトβグロビン遺伝子単独である；レーン2βは、βグロビンLCR H S2の制御下にあるヒトβグロビン遺伝子である；レーン3βは、βグロビンLCR H S3の制御下にあるヒトβグロビン遺伝子である；そして、レーン5βは、βグロビンLCR HS2、βグロビンLCR HS3、およびβグロビンLCR HS4の制御下にあるヒトβグロビン遺伝子である；ならびにレーンＮは、ネガティブコントロールとしてのトランスフェクトされていないK562細胞である。パネルＢにおいて、レーンは、レーンＮがネガティブコントロールとしてトランスフェクトされていないHe La細胞であることを除いてパネルＡにおいて示されるのと同一である。図６は、βグロビンLCR由来のHS成分の種々の組合せに作動可能に連結されたヒトβグロビンレポーター遺伝子を含む自己複製型エピソーム性発現ベクターでトランスフェクトしたK562細胞由来のRNAのSIヌクレアーゼ分析のオートラジオグラムを示す。レーンＭは、マーカーである；レーンβはβグロビン遺伝子単独である；レーン２βは、βグロビンLCR HS2である；レーン３βは、βグロビンL CR HS３である；レーン４βは、βグロビンLCR HS４である；レーン23βは、β グロビンLCR HS2およびHS3である；レーン34βは、βグロビンLCR HS3およびHS4 である；レーン24βは、βグロビンLCR HS2およびHS4である；レーン234βは、 βグロビンLCR HS2、HS3およびHS4である；レーン234βiは、安定な成分としてのβグロビンLCR HS2、HS3およびHS4構築物である；レーンβiは、安定な成分としてのβグロビン遺伝子単独である；レーンＮは、ネガティブコントロールとしてのトランスフェクトされていないK562細胞であり；ならびにレーンＰは、ポジティブコントロールとしてのヒトβグロビン遺伝子で安定にトランスフェクトされたトランスフェクトされていないMEL細胞である。すべてのレーンは、独立したトランスフェクションである。発明の詳細な説明本明細書中で参照するすべての参考文献の内容は、参考として援用される。本発明は、遺伝子座制御領域またはその成分が、目的の遺伝子の組織に限定された発現を特定するための目的の遺伝子を含む、安定な、自己複製型のエピソーム性ベクターにおいて使用され得るという発見に基づく。宿主細胞においてLCRを含むエピソーム性ベクターの安定な維持は、宿主細胞染色体および複製起点因子に非依存性のエピソーム性DNAを開始し、そして複製するために操作可能である複製起点を使用することにより達成される。本発明に従う有用な複製起点および複製因子真核生物細胞において異種遺伝子を発現するためのプラスミドベクターは、１つ以上の真核生物ウイルス（例えば、エプスタインバーウイルス、ヒトパポバウイルスBK、アデノウイルスに基づくベクター、ならびにウシおよびヒトのパピローマウイルス）のゲノムDNAの一部を使用して作製されてきた。本発明のエピソーム性ベクターは、複製起点（ori）（これは、自己複製するようなベクターに必要である）をコードするウイルスゲノムDNAの一部を含み、従って宿主細胞中において数世代にわたって存続する。さらに、本発明のエピソーム性ベクターはまた、複製に必要とされるウイルスタンパク質（すなわち、レプリケータータンパク質）をコードする１つ以上の遺伝子を含み得る。必要に応じて、複製開始に役立つレプリケータータンパク質は、本発明の自己複製型エピソーム性発現ベクターを含む宿主細胞において別のDNA分子（例えば、別のベクターまたは宿主ゲノムDNA）上でトランスに発現され得る。本発明の好ましい自己複製型エピソーム性LCR含有発現ベクターは、ウイルス配列を含まない。このウイルス配列は、コアまたはキャプシドタンパク質をコードするウイルスゲノムDNAの領域（これは、全長ウイルスゲノムDNA分子中に存在し得る感染性ウイルス粒子またはウイルス発ガン性配列を産生する）のような、真核生物宿主細胞における長期の安定な維持には必要とされない。本明細書中において、用語「安定な維持」とは、本発明の自己複製型エピソーム性発現ベクターの、連続的な選択を行わずに、ベクターのコピー数の有意な消失（例えば、＞50％）なしに、２世代、そして好ましくは５世代以上、非分裂細胞もしくは分裂細胞の子孫細胞において存続するかまたは維持される能力をいう。最も好ましいベクターは、10〜15世代またはそれを越える細胞世代にわたって維持される。対照的に、宿主細胞中のプラスミドの「一過性」または「短期の」維持は、ベクターが、安定な様式で宿主細胞中で複製し、そして分離することができないことをいう；すなわち、このベクターは、１または２世代後に消失するか、あるいは連続する世代間で＞51％のコピー数消失を経験する。本発明のいくつかの代表的な自己複製型LCR含有エピソーム性ベクターは、さらに以下に記載される。自己複製機能は、１つ以上の哺乳動物配列（例えば、Wo hlgemuthらにより記載される、1996、Gene Therapy 3:503;Vosら、1995,Jour.Ce ll.Biol.追補21A、433；およびSunら、1994、Nature Genetics 8:33に記載されるような）により、必要に応じて核保持のために必要とされ得る１つ以上の配列と組み合わせて別に提供され得る。自己複製機能を提供するための哺乳動物配列、特にヒト配列の使用の利点は、毒性特性または発ガン性特性を有し得る余分な活性化因子を必要としないことである。本発明は、いかなる複製起点にもエピソーム性ベクターにも限定されないが、エピソーム性ベクターにおけるLCRの組織限定制御の組合せを包含することが当業者には理解される。１．本発明に従う有用なエプスタインバーウイルスに基づく自己複製型エピソーム性発現ベクター。エプスタインバーウイルス（EBV）由来の潜在性起源oriPは、Yatesら、Proc.N atl,Acad.Sci.USA 81:3806-3810(1984)；Yatesら、Nature 313:812-815(1985)； Krysanら、Mol.Cell.Biol.9:1026-1033(1989)；Jamesら、Gene 86:233-239(1990 )、PetersonおよびLegerski,Gene 107:279-284(1991)；ならびにPanら、Som.Cel l Molec.Genet.18:163-177(1992)に記載されている。本発明に従う有用なEBVに基づくエピソーム性ベクターは、EBVの2.61kbフラグメントに含まれるEBVのoriP 領域（図１を参照のこと）およびEBVの2.18kbフラグメントに含まれるEBNA-1遺伝子（図１を参照のこと）を含む。EBVのoriPおよびEBNA-1遺伝子を有するベクターの１つは、図１に示される。図１に示されるベクターはまた、培養物において安定にトランスフェクトされた真核生物細胞の選択のための抗生物質耐性遺伝子、目的の遺伝子の挿入のためのポリリンカークローニング部位、および細菌性宿主細胞中のベクターDNAの産生のためのpBR322の一部を含む。 oriPを含むベクターのエピソーム性複製をトランスに支持するために唯一必要とされるウイルス性遺伝子産物であるEBNA-1タンパク質は、oriPを含む同一のエピソーム性発現ベクター上に提供され得る（例えば、Jamesら、前出；Peterson およびLegerski、前出；Panら、前出を参照のこと）。トランスでのウイルスプラスミドの複製を支持するために必要とされることが知られているEBNA-1のような任意のタンパク質に関して、この遺伝子はまた、本発明のエピソーム性発現ベクターを含む宿主細胞中の別のDNA分子（例えば、異なるDNAベクターまたは宿主ゲノムDNA）上で発現され得ることが理解される。２．本発明に従う有用なパピローマウイルスに基づく、自己複製型、エピソーム性、発現ベクター。本発明のエピソーム性発現ベクターはまた、ウイルスのパピローマファミリー（これは、ウシパピローマウイルス（BPV）およびヒトパピローマウイルス(HPV) を含むがこれらに限定されない）の複製機能に基づき得る。BPVおよびHPVは、哺乳動物細胞中で安定に維持されるプラスミドとして存続する。BPVおよびHPVによりコードされるトランスに作用する因子（すなわちE1およびE2）はまた、最小の複製起点を解する多くの細胞型における複製を媒介するために必要とされそして充分であるものとして同定されている（Ustavら、EMBO J．10.449-457(1991)；U stavら、EMBO J.10:4231-4329,(1991)；Ustavら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8 98-902(1993)）。本発明に従う有用なエピソーム性ベクターは、Piirsooら、EMBO J.,15:1(1996 )およびWO 94/12629に記載されるBPV-Iベクター系である。Piirsooらに記載されるBPV-Iベクター系は、BPV-1複製起点（最小の起点エレメントおよび染色体外の維持エレメント）を有するプラスミド、および必要に応じてE1遺伝子およびE1遺伝子を含む。BPV-1 E1およびE2遺伝子は、BPVエピソーム性ベクターの安定な維持に必要とされる。これらの因子は、プラスミドが細胞周期の状態には非依存的に細胞あたり30コピー数までの安定なコピー数に複製されることを確実にする。従って、遺伝子構築物は分裂細胞および非分裂細胞の両方で安定に存続する。これは、造血幹細胞およびより複雑な（committed）前駆細胞のような細胞における遺伝子構築物の維持を可能にする。 BPV複製起点は60塩基対（bp）DNAフラグメント内の上流調節領域の3'末端（ヌクレオチド（nt）7914〜7927）に位置付けられている。これはE1複製因子および E2複製因子の結合部位を含む。HPVの最少複製起点はまた、HPVのURRフラグメント（nt 7022〜7927）に特徴付けられ、そして位置付けられる（例えば、Chiang ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:5799-5803(1992)を参照のこと）。本明細書中で用いられる「E1」とは、BPVサブタイプ１のヌクレオチド（nt）8 49〜2663によって、もしくはHPVのサブタイプ11のnt 832〜2779によってコードされるタンパク質、他のパピローマウイルスの等価なE1タンパク質、またはパピローマウイルスE1タンパク質の機能的なフラグメントもしくは変異体（すなわち、E1の複製特性を有するE1のフラグメントもしくは変異体）を意味する。本明細書中で用いられる「E2」とは、BPVサブタイプ１のnt 2594〜3837によって、もしくはHPVサブタイプ11のnt 2723〜3823によってコードされるタンパク質、他のパピローマウイルスの等価なE2タンパク質またはパピローマウイルスE2タンパク質の機能的なフラグメントもしくは変異体（すなわち、E2の複製特性を有するフラグメントもしくは変異体）を意味する。「ミニ染色体維持エレメント」（MME）とは、パピローマウイルス複製に必須なウイルスタンパク質またはヒトタンパク質が結合するパピローマウイルスゲノムの染色体外維持エレメントを意味する。この領域は、Piirsooら（前出）によって記載されるように宿主細胞中でパピローマウイルスMOの安定なエピソーム性維持に必須である。好ましくは、MMEは、転写アクチベーターE2の複数の結合部位を含む配列である。BPV中のMMEは、最少の約６つの連続的なE2結合部位を含み、そして約10の連続的なE2結合部位で最適な安定な維持を与える上流調節領域内に位置するBPVの領域として本明細書中で定義される。E2結合部位９は、以下で記載されるように、この部位についての好ましい配列であり、ここで連続部位は、約４〜10ヌクレオチド、最適には６ヌクレオチドのスペーサーによって分離される。E1およびE2は、さらにWO 94/12629およびPiirsooら（前出）に記載されるように、プラスミドにシスまたはトランスのいずれかで提供され得る。「E2結合部位」とは、E2タンパク質が結合するパピローマウイルス二本鎖DNA の最少の配列を意味する。E2結合部位は、配列5’ACCGTTGCCGGT 3'を含み得、これはBPV-1 URRの高親和性E2結合部位９である；あるいは、E2結合部位は結合部位９の置換を含み得、この置換はURR内に見出され、そして一般的なE2結合配列5 ’ACCN6GGT 3'内に含まれる。１つ以上の転写アクチベーターE2結合部位は、ほとんどのパピローマウイルスにおいて、BPVおよびHPVにおいてのように上流調節領域に位置付けられる。本発明による、さらに有用なベクターは、（WO 94/12629に記載される）BPV遺伝子地図上の6959〜7945/1〜470の間のBPVの領域を含み得る。この領域は複製起点、目的の遺伝子に作動可能に連結される第１のプロモーター、E1遺伝子の転写を駆動する第２のプロモーターに作動可能に連結されるBPV E1遺伝子；およびE2 遺伝子の転写を駆動する第３のプロモーターと作動可能に連結されるBPV E2遺伝子を含む。 BPV由来のE1およびE2は、BPV起点または多くのHPVサブタイプの起点を含むベクターを複製する（Chiangら（前出））。HPV由来のE1およびE2は、BPV起点および多くのHPVサブタイプの起点を介してベクターを複製する（Chiangら（前出））。本発明の全てのベクターについて、本発明のBPVベースのエピソーム性発現ベクターは、宿主細胞の２〜５以上の分裂の間持続する。３．本発明の有用なパポーバウイルスベース、自己複製、エピソーム性発現ベクター。本発明のベクターはまた、ヒトパポーバウイルスBKゲノムDNA分子から得られ得る。例えば、BKウイルスゲノムは制限酵素EcoRIおよびBamHIで消化され得、ベクターに安定な維持を与え得るBKウイルス複製起点配列を含む５キロベース（kb ）を生成し得る（例えば、De BenedettiおよびRhoads、Nucleic Acids Res．19: 1925(1991)を参照のこと。これはBKウイルスの3.2kbフラグメントであり得る(Co operおよびMiron、Human Gene Therapy 4:557(1993))。４．複製起点因子発現の調節。上記のように、本発明のベクターは、宿主細胞中のベクターの安定な維持のために必要なトランス作用ウイルス複製因子をコードする１つ以上の遺伝子を含み得る。調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、LCR（これらはレプリケーター遺伝子の発現を駆動する））は、同一であってもよいし異っていてもよく、そして例えば、Ｂ細胞で表れる腫瘍に対して（Ｂ細胞に対して免疫グロブリン重鎖プロモーター／エンハンサーおよび血球発現についてはIg重鎖プロモーターまたはIg軽鎖プロモーター）、または特定されない細胞型で存在する腫瘍に対してLCRと同一または重複した組織特異性を提供し得、そしてさらに遍在性に発現する遺伝子由来（例えば、ホスフォグリセロールキナーゼ、IE-CMV、RSV-LT R、またはDHFR遺伝子由来）のプロモーターを含み得る。エピソーム性ベクターの複製起点に関してレプリケーター遺伝子の配置は、ウイルスゲノムのこれらの配列の天然の配向を模倣してもよいし、種々の他の配向を想定し得、それらの選択は当業者に明らかである。 EBVベースのエピソーム性ベクターにおいて、複製因子をコードするウイルス遺伝子の転写は相対的に弱いプロモーターの制御下に置かれることがしばしば好ましい。例えば、EBNA-1をコードする遺伝子の発現は、多くの細胞にとって毒性であり得、そして／または遺伝子がCMVプロモーター（周知の相対的に強い真核生物プロモーター）を使用して発現される場合ベクター配列において望ましくない再配列を生じ得る。対照的に、相対的に弱い真核生物プロモーター配列を使用するEBNA-1遺伝子の発現は、EBNA-1が宿主細胞中で所望のレベル（すなわち、培養物中の細胞に非毒性であるレベル）のベクター複製を維持するように機能することを可能にする。本発明のベクターに有用なこのような相対的に弱いプロモーター配列は、細菌性プラスミドpBR322の配列の一部およびチミジンキナーゼ（tk ）プロモーターに見出される。パピローマウイルスベースのベクターにおけるE1発現およびE2発現について好ましいプロモーターは、チミジンキナーゼプロモーター、SV40初期プロモーター、CMVプロモーター、およびSRαプロモーターを含む。５ベクターDNAの生産本発明の別の実施態様において、ベクターが作製される。これは本発明よる使用のために十分なDNAを生成するために本発明のベクターを含む細胞を培養する工程を包含する。このような生産は下等真核生物細胞（例えば、酵母もしくは昆虫）または原核生物細胞（例えば、細菌細胞（例えば、E．coliまたはSalmonell a）で行われることが特に好ましい。従って、本発明の、ベクターは酵母、昆虫の複製起点、もしくは細菌性起点（例えば、pBR322複製起点）、ならびにベクターを含む細胞の選別のための選択マーカーをコードする１つ以上の遺伝子（例えば、カナマイシン耐性をコードする遺伝子）、および／またはLacZのようなマーカー遺伝子をさらに含むことが好ましい。本発明の有用な組織特異的遺伝子発現を提供するためのLCR、およびそれらの成分本発明は、安定な自己複製エピソーム性ベクターとベクターに含まれる遺伝子の組織型制限発現のための遺伝子座調節領域またはそれらの成分との組み合わせを意図する。いずれか１つの理論に縛られることなく、ゲノムDNA状況において、LCRは特異的な組織型の細胞におけるクロマチンの通常はきつく巻き付けられた構造の開口を促進し、それによって組織特異的様式で開口クロマチンの領域の遺伝子の転写を可能にすると考えられている。さらに、LCRは、それらが結合された遺伝子の上流に位置していようと下流に位置していようと、そして遺伝子についての配向に係わらず組織制限遺伝子発現を与え得る。本発明によるエピソーム性ベクターに有用なLCRは、結合された遺伝子に関して上流もしくは下流または任意の配向で配置され得る。本発明の前には、染色体状況ではなくエピソーム性状況において存在する場合 LCRが組織制限遺伝子発現を与え得るか否か知られていなかった。さらに、ベクターの一過性トランスフェクションにおいて、LCR成分は、LCR成分が古典的なエンハンサーエレメントを含まなければ、発現を増大させないと理解されていた（ Tuanら、1989、Proc．Nat．Aca．Sci 86:2544）。自己複製において、本明細書中で記載されるエピソーム性発現ベクター、LCR 、またはそれらの成分はベクター上に存在する選択された遺伝子に作動可能に連結され、その結果遺伝子発現は、LCRまたはその成分が機能することが公知である特定の組織型の細胞においてのみ生じる。機構によって制限されることは望まないが、本明細書中で記載される自己複製ベクターは、LCRまたはその成分がLCR またはその成分が連結される配列を開口し、そして／または、次いで、配列の転写を促進し得る宿主細胞の天然のクロマチンの高次構造と類似の高次構造で安定に維持されるようである。一般に、LCRもしくは成分またはその成分の組み合わせのいずれが、外来遺伝子の組織特異的発現を媒介するために使用され得るかどうかが、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたLCRまたはその成分を含む自己複製エピソーム性ベクターを使用して容易にアッセイされる。組織特異的様式でのレポーター遺伝子の発現は、標準的な方法を使用して、そしてLCRが特異的である組織型の細胞におけるレポーター遺伝子発現と異なる組織型の細胞におけるレポーター遺伝子発現とを比較することによってアッセイされ得る。種々のレポーター遺伝子およびレポーター遺伝子を含むベクターが市販されている。これは、プロモーター機能および／またはエンハンサー機能を試験するために使用され得る。当該分野で使用される標準的なレポーター遺伝子は、β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするCAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子系、およびアルカリホファターゼをコードする遺伝子を含む（例えば、Jamesら、（前出）；PetersonおよびLegerski、（前出）；Pan ら、（前出）を参照のこと）。例えば、β-グロビンLCRは、β-グロビン遺伝子座の胎児グロビン遺伝子の上流に位置するDNaseI高感度部位（すなわち、HS1、HS2、HS3、およびHS4）を含む DNAフラグメントである、十分に規定されている部分を含む；このような部位およびそれらの検出は、Tuanら、前出、1985）に記載される。HS2、HS3、およびHS 4成分の組み合わせが本発明によるエピソーム性ベクターにおいて使用される場合、HS2を含むLCR成分の組み合わせは赤血球細胞において外来遺伝子の組織特異的発現を与えないことを発見した；同様に、HS2とHS3の組み合わせは組織特異的発現を与えないことを発見した。しかし、H3成分単独は、以下の実施例において示されるように結合された遺伝子の組織特的発現を与えるに効果的であること；しかし、エンハンサーであることが公知であるHS2成分は、唯一のLCR成分としてエピソーム性ベクター上に存在する場合この活性を有しないこともまた発見した。エピソーム性β-グロビンLCRにおけるHS2の非存在は組織特異的遺伝子発現を生じることが本発明によって意図される。本発明の有用なさらなるLCRは、Ｔ細胞における遺伝子発現を促進するCD2 LCR （例えば、Greavesら（前出）を参照のこと）、マクロファージ特異的リゾチームLCR（Boniferら（前出））、およびクラスII MHC LCR（Carsonら（前出））を含むが、これらに限定されない。当業者は、エピソーム上に存在する場合、組織特異的遺伝子発現を与えるβ- グロビンLCR成分、および他のこのようなLCRまたはそれらの成分を見出すための方法を同定する本開示の利点、ならびに当該分野で利用可能な技術を使用して、エピソーム性ベクター上に存在する場合組織特異的遺伝子発現を与えるさらなる LCRまたはそれらの成分を同定し得る。本発明に従って（すなわち、エピソームの状況において）有用であるLCRの成分を同定するために、当業者は、候補LCR成分およびマーカー遺伝子を含むエピソーム性ベクターを、LCRが活性である（すなわち、ゲノムへ組み込まれた場合、活性である（特定の細胞株））細胞株へ、そしてまたLCRが不活性である（すなわち、ゲノムへ組み込まれた場合、不活性である（非特定の細胞株））ことが知られる細胞株へ、各LCRまたはその成分（すなわち、LCRのDNase I高感受性部位）を個々にトランスフェクトすることによって試験し得る。安定なエピソームについて選択した後に、LCR成分が、非特定の細胞株において活性である場合（すなわち、LCR成分が（βグロビンLCRのHS2のように）組織特異的でないことを示す場合）、LCR成分は、本発明による有用な候補LCR成分としては除外される。非特定の細胞株において活性でないが、特定の細胞株において活性であるLCR成分は、安定なエピソームの状況において組織特異性を与える点で本発明に従って有用である。次いで、本発明に従って有用であると示されるLCR成分は、潜在的に増強されたレベルの組織特異的発現を与えるために組み合わされ、そしてともに使用され得る。必要に応じて、１つ以上の転写ターミネーターはまた、本発明のベクターに組み込まれて、その発現が特定のLCRまたはその成分の排他的な制御下におかれた遺伝子を介して進行し得る（すなわち、転写読み通し(readthough)）ベクター内の他の既知のプロモーター配列もしくは潜在的プロモーター配列からの望ましくない転写を妨げ得る。そのような有用な転写ターミネーターの一例はβグロビンターミネーターであるが、他の真核生物転写ターミネーターもまた、本明細書中に記載のベクターにおいて使用され得る。好ましくは、転写ターミネーターは、 LCRまたはその成分と、LCRが作動可能に連結される遺伝子のプロモーターとの間に配置される。目的の非相同遺伝子または外来遺伝子の選択本発明のベクターは、特定の組織タイプの細胞における非相同遺伝子または外来遺伝子の発現において特に有用である。エピソーム性ベクターに組み込まれ得る治療的核酸配列の例としては、以下が挙げられる。治療的に有用な核酸配列としては、レセプター、酵素、リガンド、調節因子、および構造タンパク質をコードする配列が挙げられる。治療的な核酸配列としてはまた、核タンパク質、細胞質タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜会合タンパク質、血清タンパク質、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、および寄生生物抗原をコードする配列が挙げられる。本発明に従って有用な核酸配列としてはまた、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、リンタンパク質、および核酸（例えば、RNAまたはアンチセンス核酸）をコードする配列が挙げられる。本発明のエピソーム性ベクターを用いて発現され得るタンパク質またはポリペプチドとしては、ホルモン、成長因子、酵素、凝固因子、アポリポタンパク質、レセプター、薬物、オンコジーン、腫瘍抗原、腫瘍サプレッサー、ウイルス抗原、寄生生物抗原、および細菌抗原が挙げられる。これらの化合物の特定の例としては、プロインスリン、成長ホルモン、アンドロゲンレセプター、インスリン様成長因子I、インスリン様成長因子II、インスリン様成長因子結合タンパク質、上皮細胞成長因子、TGF-α、TGF-β、PDGF 、血管形成因子（酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、およびアンジオゲニン）、マトリックスタンパク質（IV型コラーゲン、VII型コラーゲン、ラミニン）フェニルアラニン水酸化酵素、チロシン水酸化酵素、オンコジーン(ras、fos、myc、erb、src、sis、jun)、E6またはE7形質転換配列、p53タンパク質、Rb遺伝子産物、サイトカインレセプター、Il-1、IL-6、IL-8、ウイルスキャプシドタンパク質、および免疫学的応答を誘導するために使用され得るウイルス、細菌、寄生生物由来のタンパク質、ならびに体内で有用な有意性のある他のタンパク質が挙げられる。取り込まれ得る遺伝子は、取り込まれるべきタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸配列の有効性によって限定されるのみである。当業者は、より多くのタンパク質およびポリペプチドが、同定されるにつれて、それらがエピソーム性ベクターに組み込まれ得、そして動物またはヒトの組織において発現され得ることを容易に認識する。本発明のベクターはまた、例えば、遺伝子産物の用量を増大させるために宿主細胞（すなわち、ネイティブな遺伝子または相同遺伝子）において既に発現されている遺伝子を発現するために使用され得る。しかし、相同遺伝子の発現が、細胞内でのその過剰発現によって、LCR、またはその成分による制御に供され得ない調節を解除された発現を生じ得ることに留意すべきである。ベクター送達本明細書中に記載の自己複製型LCR（またはその成分）含有エピソーム発現ベクターの送達のための多数の技術が公知であり、そして本発明に従って有用である。その技術には、核酸縮合剤、電気穿孔法、石綿との複合体化、ポリブレン、 DEAEセルロース、デキストラン、リポソーム、リポポリアミン、ポリオルニチン、粒子ボンバードメント、および直接の微量注入の使用が含まれる(Kucherlapat iおよびSkoultchi，Crit.Rev.Biochem．16:349-379(1984);Keownら，Methods En zymol．185:527(1990)によって総説される)。本発明のベクターは、ウイルスまたは非ウイルス手段の送達を介して、宿主細胞に非特異的か、または特異的に（すなわち、宿主細胞の指定されたサブセットに）送達され得る。ウイルス起源の好ましい送達方法には、ウイルスパッケージングシグナル（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびパポーバウイルスのパッケージングシグナル）が本発明のベクターに対するトランスフェクションレシピエントとしてその中に操作されたウイルス粒子産生パッケージング細胞株が含まれる。好ましい非ウイルスベース遺伝子送達手段および方法がまた、本発明において使用され得、そして、核酸縮合ペプチド、リポソーム内へのカプセル化、そしてエクスビボでの細胞のトランスフェクション、それに続くトランスフェクト細胞の再移植または投与を含み得る。ウイルス外被タンパク質のアミノ酸配列由来の種々のペプチドが、ポリリジン DNA複合体と同時投与された場合に遺伝子導入において使用され、（Plankら，J. Biol.Chem．269:12918-12924(1994)）；Trubetskoyら，Bioconjugate Chem．3: 323-327(1992);WO 91/17773；WO 92/19287;およびMackら，Am.J.Med.Sci．307:1 38-143(1994))、このことは陽イオン脂質とのポリリジン結合体の同時縮合は、遺伝子導入効率における改善を導き得ることを示唆する。PCT公開番号WO 95/026 98は、陽イオン脂質遺伝子導入の効率の増大を試みるためのウイルス成分の使用を開示する。本発明において有用な核酸縮合剤としては、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、陽イオン性ペプチド、およびポリリジンが挙げられる。スペルミン誘導体は、スペルミンの類似体および誘導体をいい、そして国際公開番号WO 93/18 759(1993年９月30日公開)に示される化合物を含む。ジスルフィド結合を使用して、送達ビヒクルのペプチド成分が連結されている（Cottenら，Meth．Enzymol．217:618-644(1992));Trubetskoyら(前出)もまた参照のこと）。 DNA構築物を細胞へ送達するための送達ビヒクルは当該分野で公知であり、そして、例えば、WuおよびWu，J.Biol.Chem．263:14621(1988);Wilsonら，J.Biol. Chem．267:963-967(1992);ならびに米国特許番号5,166,320号に記載のように、細胞表面レセプターに特異的であるDNA/ポリカチオン複合体を含む。本発明に従うベクターの送達は、核酸縮合ペプチドを使用して意図される。核酸構築物の縮合、それゆえ核酸の細胞への送達に特に有用である核酸縮合ペプチドは、以下の一般式のアミノ酸配列を含む、 NH₂-A-(X₁X₂Y₁Y₂)_nX₃X₄-(Z₁Z₂Z₃Z₄)-(X₅X₆Y₃Y₄)_mX₇X₈BCOOH ここで、X_1-8のそれぞれは、独立して側鎖に正に荷電した基を有するアミノ酸であり；ここで、Y_1-4のそれぞれは、独立してαヘリックス形成を促進する天然に存在するアミノ酸であり；ここで、Z_1-4のそれぞれは、独立して安定化されたターン構造を形成するに高い傾向を有する少なくとも３つのアミノ酸を有する天然に存在するアミノ酸であり；ここで、Aはアミノ末端セリン残基またはトレオニン残基であり；ここで、Bは任意のアミノ酸であり；そして、ここでn=２〜４およびm=2である。他のペプチドは、X_1-8のそれぞれが、独立してリジン、アルギニン、2,4-ジアミノ-酪酸、またはオルニチンであり；ここで、Y_1-4のそれぞれが、独立してグルタミン酸、アラニン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、トリプトファン、またはヒスチジンであり；ここで、Z_1-4のそれぞれが、独立してアスパラギン、グリシン、プロリン、セリン、およびアスパラギン酸であり；ここで、Bはアラニン、グルタミン酸、またはシステインのいずれか１つであるものである。エクスビボまたはインビボのいずれかで核酸の細胞への送達に関与する本発明のこの実施態様において有用なペプチドが、１つ以上の内在性セリン残基、トレオニン残基、またはシステイン残基を、好ましくは選択されたリガンドに結合するように曝露され、従ってαヘリックスの正に荷電した（核酸起源の）表面ではない配列中の位置において含み得ることを本発明に従って意図される。ペプチド内での選択された反応性アミノ酸残基のこの配置は、核酸に接触するペプチドの表面に接触しないように配向されて、選択および規定された安定性を有する結合によって他の機能的ペプチドとこのペプチドとの結合を可能にする、。システインは、チオール側鎖を介して、他の反応性チオール基（ジスルフィドを介して）、アルキル化官能基（チオエステル結合を形成するため）、または他のチオール反応性基（例えば、マレイミド誘導体）を含む化合物への特異的結合を可能にする。この一般配列内にあるペプチドは、以下を含む。従って、核酸の送達に有用な核酸縮合ペプチドは、以下:１）ヘリックス形成アミノ酸、２）核酸の主溝に接触する繰り返し三次元構造、３）定量のための適切な発色団、および４）補助的機能的ドメインを形成するリガンドの領域特異的結合のための多数の「ハンドル」（すなわち、反応部位）、を含み得る。核酸縮合ペプチドはまた、核酸を縮合する能力を有する配列として本明細書中で同定されたH1の部分（以下の配列I、IIもしくはIII）または他のヒトヒストン由来の配列（以下の配列IV）を含み得る。それゆえ、核酸縮合ペプチドは、全配列長が17残基より上である以下の３つのコンセンサス配列の直線的組合せを含み得る：配列I:-K-K-X-P-K-K-Y-Z-B-P-A-J- ここで：Kはリジンであり、Pはプロリンであり；Aはアラニンであり；Xはセリン、トレオニン、またはプロリンであり；Yはアラニンまたはバリンであり；Zはアラニン、トレオニン、またはプロリンであり；Bはリジン、アラニン、トレオニン、またはバリンであり；そしてJはアラニンまたはバリンである。配列II:-X-K-S-P-A-K-A-K-A- ここで：Xはアラニンまたはバリンであり；Kはリジンであり；Sはセリンであり；Pはプロリンであり；そして、Aはアラニンである。配列III:-X-Y-V-K-P-K-A-A-K-Z-K-B- ここで：Xはリジンまたはアルギニンであり；Yはアラニンまたはトレオニンであり；Zはプロリン、アラニン、またはセリンであり；Bはリジン、トレオニン、またはバリンであり；Kはリジンであり；Pはプロリンであり；Aはアラニンである。配列IV -A-B-C-D-E-F-G-H-I-J-K- ここで：Aは好ましくはリジンまたはトレオニンであり；Bは好ましくはグリシンまたはグルタミンであり；Cは好ましくはグリシンであるが、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはセリンでもあり得；Dは好ましくはグリシンであるが、リジン、バリン、グルタミン、またはトレオニンでもあり得；Eは好ましくはリジンまたはアラニンであり；Fは好ましくはアラニンまたはリジンであり；Gは好ましくはアルギニンであるが、バリンまたはイソロイシンでもあり得る；Hは好ましくはアラニンであるが、トレオニン、ヒスチジン、またはプロリンでもあり得る；Iは好ましくはリジン、アルギニン、またはグルタミンである；Jはアラニンまたはアルギニンである；そして、Kは好ましくはリジンまたはグルタミンである。好ましいコンセンサス配列は： -K-G-G-G-K-A-R-A-K-A-K- である。そのようなペプチドの１つはNBC1であり、以下のような構造を示す： NH₂-[SV40 NLS]-[配列I]-[配II]-[配列III]-[SV40 NLS]-[配列I]-C-COOH、ここで-C-はシステインであり；ここでSV40 NLSは配列 Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gln；および、配列である。本発明の他のこのような核酸縮合ペプチドは、以下の一般配列に含まれるアミノ酸配列を有する： NH₂-X-(Y)_n-C-COOH，ここでXは存在しないかまたはセリンもしくはトレオニンのいずれかであり；Yは、上記に定義されたように、配列I、II、またはIIIのいずれかであり；nは２〜６であり；そしてCはシステインである。他のこのようなペプチドは、以下の構造および配列を有する：NBC2は、構造： NH₂-[配列III]-[SV40 NLS1]-[配列I]-C-COOH(ここで、-C-はシステインである) を有する。 NBC8は、構造：NH₂-[配列I]-[配列I]-C-COOH(ここで、-C-はシステインである )を有する。 NBC9は、構造：NH₂-[配列I]-[配列I]-[配列I]-C-COOH(ここで、-C-はシステインである)を有する。 NBC10は、構造：NH₂-[配列I]-[配列I]-[配列I]-[配列I]-C-COOH(ここで、-C- はシステインである)を有する；これらのアミノ酸配列は、以下の通りである：上記のように、低い多分散指標(polydispersion index；PDI)を有する核酸縮合ペプチドは、本発明に従う核酸の細胞への送達に有用である。このようなペプチドのPDIは、エレクトロスプレー質量分析法によるそのペプチドの分析から算出され得る。この方法は、各成分の正確な質量を0.001％以内で与える。本発明において有用なペプチド調製物のPDI値は、1.0〜1.100の範囲内である。本発明において特に有用であるペプチド調製物は、1.01未満のPDIを有し、そして1.001 未満のPDIさえ有する。第１の核酸縮合ペプチドは、８〜24個の正に荷電したアミノ酸側鎖を含み得る；例えば、正に荷電したアミノ酸側鎖の数は、12〜18の範囲であり得る。特定の哺乳動物細胞タイプを標的化し得る合成ウイルス様粒子における正電荷 /負電荷の比は、その核酸中の１リン酸残基あたり0.5〜３の範囲内である；したがって、この比はまた、0.8〜1.2の範囲内であり得る。標的化する細胞タイプに関して限定されない合成ウイルス様粒子における正電荷/負電荷の比は、その核酸中の１リン酸残基あたり0.5〜５の範囲内であり、したがってまた1.2〜２の範囲内であり得る。官能基が、本発明に従うベクターの送達に有用なペプチドに結合され得る。これらの官能基には、特定の細胞タイプを標的化するリガンド(例えば、モノクローナル抗体、インスリン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、または糖 )が含まれ得る。したがって、リガンドは、非特異的様式で、または細胞タイプに関して限定される特異的様式で細胞を標的化し得る。官能基はまた、脂質(例えば、パルミトイル、オレイル、またはステアロイル) ；中性親水性ポリマー(例えば、ポリエリレングリコール(PEG)、またはポリビニルピロリジン(PVP))；融合性(fusogenic)ペプチド(例えば、インフルエンザウイルスのHAペプチド)；またはリコンビナーゼもしくはインテグラーゼを含み得る。官能基はまた、核局在化配列(NLS)のような細胞内輸送タンパク質を含み得る。送達に特に好ましい(すなわち、第２の官能基が、核酸縮合ペプチドと直接結合した第１の官能基に共有結合される)実施態様において、第１の官能基は、脂質またはPEGのような中性親水性ポリマーの１つを含み得、そして第２の官能基は、細胞表面レセプターを標的化するリガンドを含み得る。例えば、第１の官能基が脂質を含む場合、第２の官能基は、細胞レセプターを標的化するリガンドを含み得る。第１の官能基がPEGを含む場合、第２の官能基は、細胞レセプターを標的化するリガンドを含み得る。リガンドは、例えば、糖部分、またはその細胞レセプターが細胞タイプに限定されるリガンドの１つであり得、したがって、標的細胞集団は、細胞タイプに関して限定されなくてもよいし、または限定されてもよい。あるいは、第１の官能基が脂質を含む場合、第２の官能基はPEGを含み得る。上記の核酸縮合ペプチド/ベクターDNA組成物を、以下の通りに調製し得る。組成物を、核酸およびペプチド調製物が、等容量の同じ緩衝液(通常、0.15M〜1.0M NaCl；25mM HEPES，pH7.4)中に調製されるように処方する。縮合ペプチド調製物を、0.1容量/分の速度で添加される間、核酸は振盪またはボルテックスする。複合体を、標的細胞への添加の前または被験体への投与の前に、少なくとも30分間室温で放置し、そして４℃で保存し得る。この粒子を遠心分離し、凝集物質を除去する。細胞標的化のための上記のDNA/ポリカチオン複合体に加えて、核酸を含有する細胞標的化リポソームを調製する方法は、先行技術において公知である。リポソームは、細胞膜を形成する脂質と類似の様式で配置した脂質から構成される中空の球状小胞である。これらは、水溶性化合物を捕捉するための内部水性空間を有し、そしてサイズが、直径0.05ミクロン〜数ミクロンの範囲である。いくつかの研究により、リポソームは核酸を細胞に送達し得ること、およびその核酸は生物学的に活性のままであることが示されている。例えば、本来研究ツールとして設計されたリポソーム送達ビヒクル(Lipofecti n)は、インタクトなmRNA分子を細胞に送達し、対応するタンパク質の産生を生じることが示された。リポソームはいくつかの利点を提供する：これらは、組成が非毒性および生分解性であり；これらは長い循環半減期を示し；そして組織への標的化のために、認識分子がその表面に容易に付着され得る。最後に、リポソームベースの薬剤( 液体懸濁物または凍結乾燥物としてのいずれか)の費用効率の高い製造は、受容可能な薬物送達系としてのこの技術の実行可能性を示している。標的化リポソームの例は、免疫リポソームである。リポソームは、例えば、リポソーム表面上へのタンパク質(例えば、免疫グロブリン)の吸着；リポソーム膜の形成(例えば、超音波処理、界面活性剤透析または逆相エバポレーションによる)の間のそのリポソーム膜へのネイティブなタンパク質の組込み；リポソーム膜中に組み込まれた反応性化合物へのタンパク質の(直接またはスペーサー基を介する)共有結合；リポソーム形成の間の、または予め形成したリポソームとのインキュベーションによる、改変タンパク質の非共有性疎水性結合；および間接的な結合(リポソームへのポリマーを介した免疫グロブリンタンパク質の共有結合を含む)によって調製される(Torchilin，V.P．CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carr ier Systems，2(1)を参照のこと)。核酸−リガンド複合体とレセプターとの結合は、レセプター媒介エンドサイトーシスによるその核酸の取り込みを容易にする。アデノウイルスキャプシド(これは、エンドソームを自然に崩壊させ、それにより細胞質中に物質を放出させる)に結合させた核酸−リガンド複合体は、細胞内リソゾームによるこの複合体の分解を回避するために使用され得る(例えば、C urielら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8850(1991)；Cristianoら、Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 90:2122-2126(1993)を参照のこと)。レセプター媒介核酸取り込みは、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞へ核酸を導入するために使用され得、そしてさらに、核酸が、目的の標的細胞に選択的に発現するレセプターに結合するリガンドの使用により、特定の細胞タイプに選択的に標的化され得るか、または標的細胞タイプに関して非選択性であり得るというさらなる特徴を有する。送達ビヒクルの種々の成分の正確な化学量論比は、初期の免疫応答の大きさ、送達の効率、および細胞への特異的標的化の程度を制御するために変更され得る。細胞への非特異的送達の場合、細胞表面レセプターを標的化する非特異的リガンドが使用され得る；特異的送達の場合、特定のサブセットの細胞を標的化するリガンドが使用され得る。例えば、可溶性DNA/ポリリジン複合体が作成され得る (Liら、Biochem.J．12:1763(1973))。アシアロ糖タンパク質を付されたポリリジン複合体は、インビトロでDNAを肝細胞に標的化するために使用されている(WuおよびWu、J.Biol.Chem．262:4429(1987)；米国特許第5,166,320号)。ラクトシル化ポリリジン(Midouxら、Nucleic Acids Res．21:871-878(1993))およびガラクトシル化ヒストン(Chenら、Human Gene Therapy 5:429-435(1994))は、プラスミドDNAを、レクチンレセプターを有する細胞に標的化するために使用され、ポリリジンに結合したインスリン(Rosenkrantzら、Exp.Cell Res．199:323-329(1992 ))は、プラスミドDNAを、インスリンレセプターを有する細胞に標的化するために使用されている。モノクローナル抗体は、DNAを特定の細胞タイプに標的化するために使用されている(Machyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8027-8031(1988 )；Trubetskovら、前出、ならびにWO 91/17773およびW0 92/19287)。好ましい実施態様において、リガンドは、本発明のベクターを特定タイプの組織の細胞に標的化するための送達ビヒクルに含まれる。好ましくは、リガンドは、特定タイプの組織の細胞表面に発現するエピトープに特異的である。特定のガン組織について、好ましいリガンドには、抗体またはそのフラグメント、例えば、結腸ガンに発現するCanAgのCA242ドメインを認識するモノクローナル抗体C242 (Lindholmら、Int.Arch.Allergy Appl.Immunol．71:171-181(1983)およびLarson ら、Int.J.Cancer 42:877-882(1983))；乳ガン細胞により発現される多形性上皮ムチン(PEM)を認識するモノクローナル抗体SM3(Burchellら、Cancer Research 4 7:5476-5482(1983))、およびヒトグリア腫瘍の上皮成長因子レセプターに見出されるが、正常組織には見出されない新規エピトープを認識するモノクローナル抗体(Moscatelloら、Cancer Res．55:5536-5539(1995))が含まれる。さらに、成長因子もまた、肺瘍を標的化するために使用され得る。例えば、上皮成長因子(EGF )レセプターは、肺ガン細胞に過剰発現し、したがってEGFは、送達ビヒクルを肺ガンに標的化するためのリガンドとして使用され得る(Cristianoら、Cancer Gen e Therapy 3:4-10(1996))。さらに、特定の可溶性巨大分子が、特定の腫瘍タイプの受動的腫瘍標的化のために使用され得る。多くの固形脛瘍は、巨大分子に対して高透過性である血管系を有する。この理由は明確には理解されていないが、結果は、このような腫瘍は循環する巨大分子を選択的に蓄積し得るということである。亢進した透過性および保持の効果(EPR効果)は、SMANCS(スチレン/マレイン酸−無水物−ネオカルチノスタチン；現在、日本において、肝ガンの処置に正規に臨床的に使用されている)の作用機構を構成すると考えられる。抗ガン活性について研究中である別のクラスの結合体は、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー−アントラサイクリン結合体である(Seymour，L.、CritiCal Reviews in Therapeuti c Drug Carrier Systems 9(2):135-187(1992))。したがって、スチレン/マレイン酸−無水物を含むポリマーまたはN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマーは、本発明の送達ビヒクルを標的化するためのリガンドとして使用され得る。薬学的組成物および治療的使用本発明の薬学的組成物は、疾患を処置するためか、または特定組織の細胞に有利なタンパク質もしくは機能を提供するための治療について、本発明の自己複製型エピソーム性ベクターまたは送達組成物を、所望であれば、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合して含み得る。本発明の自己複製型エピソーム性LCR含有ベクターまたは本発明のベクターを含む組成物もしくは送達ビヒクルは、筋肉内、静脈内、エアロゾル、経口(錠剤または丸剤形態)、局所的、全身的、眼、坐剤として、腹腔内および/または鞘内を含む経路を介して、ならびに腫瘍塊へのベクターDNAもしくは送達ビヒクルの直接注入により投与され得る。正確な投薬療法は、もちろん、個々の患者に関して個々の医師によって決定される必要があり、これは、目的の遺伝子により発現されるタンパク質の正確な性質、および処置のために標的化される組織のタイプによって制御される。投薬はまた、疾患適応および投与経路に依存する。有利なことに、本発明のベクターは、特定組織の細胞においてのみ、すなわち、LCRまたはその成分が機能的である組織の宿主細胞においてのみ、選択された遺伝子の長期間発現を提供するように設計される。したがって、このような宿主細胞において、処置の持続時間は、一般に、継続的であるか、または細胞が死滅するまでである。用量の数は、疾患および臨床試験からの効力データに依存する。本発明に従う効果的な遺伝子治療のために送達されるベクターDNAの量は、体重１kgあたり約50ng〜1000μｇの間のベクターDNAの範囲であり、そして好ましくは、体重１kgあたり約１〜100μｇの間のベクターDNAの範囲である。インビボでの細胞取り込みのためにエピソーム性ベクターを哺乳動物に投与することは、本発明によれば好ましいが、本明細書に記載されたベクターは、エクスビボアプローチを利用して投与され得る。このアプローチにより、細胞は、動物から取り出され、特定のLCRもしくはその成分の制御下に選択された遺伝子を含むエピソーム性ベクターで形質導入され、次いで動物に再移植される。例えば、肝臓は、エクスビボアプローチにより、動物から肝細胞を取り出し、選択されたタンパク質をコードする遺伝子もしくは治療的核酸を含むエピソーム性ベクターでその肝細胞をインビトロで形質導入し、そして形質導入した肝細胞を動物に再移植する(例えば、Chowdhuryら、Science 254:1802-1805，1991によりウサギについて、またはWilson、Hum.Gene Ther．3:179-222，1992によりヒトにおいて記載されたように)ことによって利用され得る。このような方法はまた、本発明の発現ベクターを循環系もしくはリンパ系における種々の細胞集団(例えば、赤血球、Ｔ細胞、およびＢ細胞)に送達するために有効であり得る。組織特異性の試験または遺伝子療法の有効性のためのトランスジェニック動物本発明の別の実施態様では、本発明の自己複製型エピソーム性LCR含有ベクターを用いる組織特異性および/または遺伝子療法の有効性を決定するための哺乳動物モデルが提供される。この哺乳動物モデルは、その細胞が本発明のベクターを含むトランスジェニック動物を包含する。トランスジェニックマウス(Gordon ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:7380(1980)； Harbersら、Nature 293:54 0(1981)；Wagnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:5016(1981)；およびWagne rら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:6376(1981)、ヒツジ、ブタ、ニワトリ(Ha mmerら、Nature 315:680(1985)を参照のこと)などを作成する方法は、当該技術分野で周知であり、そして本発明による使用に考慮される。このような動物は、ヒトにおける臨床試験の前の試験を可能にする。例えば、トランスジェニック動物は、腫瘍または腫瘍が発生する性向を有し得る。Stewartら、Int．J．Cancer 53:1023(1993)は、Ｔ細胞腫瘍を有するトランスジェニックマウスを記載している。Teitzら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90 :2910(1993)は、横紋筋肉腫およびインスリン産生性膵臓ランゲルハンス島肺瘍を有するトランスジェニックマウスを記載している。腫瘍細胞においてのみ発現されるべき選択された遺伝子を含むエピソーム性ベクターは、これらの腫瘍を保持する任意のマウスから卵子中に導入され、LCR、またはその成分が、選択された遺伝子の発現を腫瘍細胞に厳密に制限するか否かを決定し、そしてまた、このような腫瘍細胞中の選択された遺伝子を発現する結果を測定するための動物モデルを作成し得る。本発明の自己複製型のLCR含有エピソーム性ベクターを含むトランスジェニック動物はまた、組織特異的様式で目的のタンパク質の長期間産生のために用いられ得る；例えば、βグロビンLCRまたはHS３と４との組合せまたはHS3単独を用いるトランスジェニック動物の赤血球細胞におけるヒトグロビンの産生、あるいは LCRマクロファージ/リゾチームLCRを用いるトランスジェニック動物のミルク中の目的のタンパク質の産生。以下の実施例は例示により提供され、そして本発明をいかなる様式においても制限する意図はない。本発明のいくつかの代表的な構築物の調製、試験および分析を以下に詳細に記載する。当業者は、異なるエピソーム性ベクター、異なるLC R、またはその成分、および異なる目的の遺伝子を用いて、本発明の他のベクターの調製および試験のために、これらの手順を適合し得る。実施例１試験遺伝子構築物およびベクター系の調製１．EBVベクター本発明による有用な１つのEBVを基礎にするベクターはp220.2ベクターである( 図１)。このp220.2ベクターは、(i)EBV由来のOriPおよびEBNA-1遺伝子、(ii)安定なトランスフェクトされた真核生物組織培養細胞の選択のためのハイグロマイシン耐性遺伝子、(iii)試験遺伝子のためのポリリンカークローニング部位および(iv)真核生物細胞中のEBNA-1遺伝子の発現を駆動する弱い真核生物プロモーター配列を含むpBR322ベクター骨格を含む。２．レポーター遺伝子 LCR活性を評価するために用いられるレポーター遺伝子(図２)は、ヒトβグロビン：815塩基対(bp)5'および1685 bp 3'フランキング配列を有する4.1 kb Hpal -EcoRVフラグメント；(Fritschら、Cell 19:959-972(1980)；Lawnら、Cell 19:9 59-972(1980))に由来した。このレポーター遺伝子を、平滑末端連結により、p220.2の特有のポリリンカー HindIII部位中に別にクローン化した(図２)。３．βグロビンLCR試験構築物３つのβグロビンLCR成分は、DNase１過感受性部位HS2、HS3およびHS4である( Collisら、EMBO J．9:223-240(1990))。これら成分は、1.5−２kbフラグメントとして、個々に、または２つまたは３つの部位の組合せ(以下を参照)で、p220 .2のSalI部位中に、βグロビンまたはγH2Kレポーター遺伝子の上流にクローン化した(図３)。実施例２組織培養細胞の安定なトランスフェクションの分析 EBVを基礎にするベクターは、霊長類細胞またはヒト細胞における自己複製型エピソームとして最も安定である。従って、βグロビンLCR試験遺伝子構築物の安定なトランスフェクションは、ヒト骨髄性白血病細胞株K562(LozzioおよびLoz zio、Blood 45:321-334(1975))中で実施した。この細胞株は、胚(ε)および胎児 (γ)パターンのグロビン遺伝子発現(Andersonら、Int．J．Cancer 23:143-147(1 979))を示し、そして先にβグロビンLCR機能を評価するために首尾良く用いられている(Blom van Assendelftら、Cell 56.969-977(1989))。１．トランスフェクション方法 K562細胞(10⁷)を、Antoniou、1991に記載されるように、960μＦ、および300V に設定したBio Rad Gene Pulser(BioRad、Hercules、CA)を用い、50μｇのスーパーコイル試験構築物DNAを用いたエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。各エレクトロポレーションしたサンプルを、安定なトランスフェクトされた細胞の２つの独立のプールを生成するために、２つの75cm²組織培養フラスコに等分した。ハイグロマイシンＢ(250μｇ/ml)を、エレクトロポレーションの24時間後に添加し、そしてその後この濃度で維持した。非トランスフェクト細胞の細胞死は、７−10日後(約１０の細胞分裂に相当)に明らかであり、そしてトランスフェクト細胞のコンフルエントフラスコがその７日後に得られた。２．トランスフェクト細胞からのRNAおよびDNA調製 (i)総RNAを、３M LiClおよび６M尿素(AuffreyおよびRougeon、Eur．J．Biochem. 107:303-314(1980))の存在下の選択的沈殿により調製した。 (ii)総ゲノムDNAは、単離された核から調製した。細胞(〜２×10⁷)を、RSB(10mM Tris-HCl pH7.5，10mM NaCl，3mM MgCl₂)プラス0.1％NP40中で破壊した後、遠心分離により核をペレット化した。次いで、核を、TNE(150mM Tris-HCl，pH7. 5，100mM NaCl，5mM EDTA)、１％SDSおよび50μｇ/mlプロテイナーゼＫ中に再懸濁することにより溶解し、そして55℃で一晩インキュベートした。次いで、等容量のフェノール/クロロホルム(１：１)で１回抽出し、そして0.7容量のイソプロパノールを用いて水相からDNAを沈殿させた。得られるDNA沈殿物を、溶液から巻き取り、70％エタノール中で１回洗浄し、そして200μl(7)TE(10mM Tris-Cl．0. 1mM EDTA，pH8.0)中に溶解した。３．試験遺伝子の発現の分析トランスフェクトされた遺伝子の発現は、βグロビン(Antoniouら、(1988))またはγH2K遺伝子の5'領域からの末端標識DNAプローブを用いるSI-ヌクレアーゼ保護アッセイ(Antoniouら、Human Genetic Disease Analysis．A Practical App roach(第２版)(1993))により評価した。これらのプローブは、正確な野生型のキャップ部位からの開始により生じたこれらの転写物のみを検出する(図４および図５、下のパネル)。内部標準として、すべてのサンプルは、遺伝子の3'末端からのプローブを用いて内因性γグロビンmRNAについて同時にアッセイした(図４、下のパネル)。４．トランスフェクトされたDNAのエピソームの状態とコピー数の評価 (ａ)エピソームの状態単離された核からの総DNA(10μｇ)をPvulおよびDpnI(６単位)で一晩消化し、そして0.6％アガロースゲル上の電気泳動により分離し、そしてMagnacharge Plu sナイロントランスファーメンブレン上にサザンブロットした。DpnI消化は、残りの細菌由来プラスミドDNAが破壊されることを確実にする。次いで、このブロットを、ニックトランスレーションにより³²Ｐで標識されたp220.2ベクターでプローブした。エピソームの形態にあるトランスフェクトされたDNAは、試験構築物のサイズに依存して、12−17.5kbの線状分子として現れる。 (b)エピソームコピー数同量のDNAを、EcoRIおよびDpnIで消化し、そして上記のようにサザンブロットした。このブロットを、βグロビン遺伝子のイントロンIIにまたがる920bpのBam HI-EcoRIフラグメントでプローブした。これにより、３コピーの内因性βグロビン遺伝子からの5.5kbフラグメントおよびトランスフェクトされた構築物からの 7.2−12.7kbフラグメントを検出した。実施例３１．βグロビンレポート遺伝子構築物の発現分析図４(上のパネル)は、トランスフェクトされた遺伝子構築物の発現に対する、 S1ヌクレアーゼ保護アッセイによるRNAの分析からのオートラジオグラムを示す。部位は、EBVを基礎にする自己複製型エピソーム性発現ベクターp220.2中のβ グロビン遺伝子に連結され、そしてK562細胞中に安定にトランスフェクトされた。総RNAを、プローブの混合物を用いるS1ヌクレアーゼ保護アッセイにより分析し、移入遺伝子からのβグロビン5'mRNAおよび内部対照として作用する内因的に発現したγグロビンmRNA(3'γ)の両方を同時に検出した。図４中の結果の定量化は、Phosphorimager(Molecular Dynamics)によるもので、そして表１に要約する。この実験では、βグロビン遺伝子単独ではほとんどまたはまったく発現が見られなかった(自己複製型エピソーム性ベクターではLCR成分は存在しない)(レーン β１)。HS2またはHS4のいずれかを含むベクターは、少ない程度のみ発現が改良された(レーン２βおよび４β)。対照的に、HS3(レーン３β)単独を含むベクターは、HS2またはHS4単独のいずれかを含むベクターより10倍より多い発現レベルを与えた。HS3を含むベクターを用いて得た発現のレベルは、HS2/HS3の組合せを含むベクター(レーン23β)またはHS3/HS4の組合せを含むベクター(レーン34β) で得られた発現レベルに匹敵した。HS2/HS4ベクター(レーン24β)は、２部位構築物の最も弱い転写活性を与えた。最も高い転写レベルは、すべての３つのβグロビンLCRエレメント(HS2、3、4)の組合せを含むベクターを用いて得られた(レーン234β)。このレベルは、HS3単独またはHS2/HS3およびS3/HS4 ２部位構築物の少なくとも約２倍の大きさであった。この実験を繰り返し、そしてその結果を図６に示す。この繰り返された実験の結果は、βグロビン遺伝子単独ではK562細胞中で発現し得ないことを再び示した (レーンβ)。βLCR HS2(レーン２β)またはHS3(レーンβ３)のいずれかの添加は、匹敵する程度まで発現の有意な増加を与えた。HS4(レーンβ４)は、βグロビン遺伝子単独の発現を超えて発現を改変しなかった。２つのβLCR HS部位の組み合わせ(レーン23β、34βおよび24β)はすべて、HS部位単独のいずれの発現をも超える増加した発現を示した。３つのHS部位のすべての組み合わせ(レーン234β) は、前に見られるように最高レベルの発現を与えた。図６中の結果は、図４中に示される結果を本質的に確認し、そしてHS2単独を用いた発現を示す。表１：K562細胞中の自己複製型EBVを基礎にするエピソーム性ベクター中のβLCR の制御下のヒトβグロビンの発現。この表は、Molecular Dynamics phosphorimagerを用いる自己複製型のEBVを基礎にするベクターp220.2(図３)中の、ヒトβグロビン遺伝子単独(β-１)または βLCRのDNaseI過感受性(HS)部位の異なる組み合わせの制御下のいずれかで安定にトランスフェクトされたK562細胞からのRNAの、図４中に示されるS1ヌクレアーゼ保護アッセイの定量化を示す。実施例４ EBVを基礎にする自己複製型エピソーム性ベクターp220.2(図２および３を参照のこと)中の、単独(β)またはβLCR HS2(２β)、HS3(３β)およびHS2、3および4 (5β)の制御下のいずれかのヒトβグロビン遺伝子を、エレクトロポレーションにより(本文を参照のこと)、K562(パネルＡ)およびHeLa(パネルＢ)細胞中に安定にトランスフェクトした。スーパーコイルプラスミドDNA(50μｇ)を、２×10⁷細胞と混合し、そしてBio Rad Gene Pulser setを用い、300Vで960μＦのシングルパルスエレクトロポレーションにかけて送達した。安定にトランスフェクトした細胞を250μｇのハイグロマイシンで選択した。総RNAを、生成され、そして末端標識されたDNAプローブを用いるS1ヌクレアーゼ保護アッセイにより移入遺伝子発現について分析された安定にトランスフェクトされたプールから抽出した。トランスフェクトされた遺伝子からのβグロビンmRNAは、図４に示されるように同じ5'プローブ(５'β)を用いて検出した。207ヌクレオチド(5'γ)の保護されたフラグメントを与える５'エクソンIIプローブを用いたγグロビンmRNAの検出は、K 562細胞中で内部対照として作用した。構成的にかつ遍在して発現されたhnRNPA2 に対するmRNAは、HeLa細胞由来サンプル中の内部対照としてプローブされた(122 ヌクレオチドS1保護フラグメントＡ２を与える)。結果を図５に示す。この結果は、HS3単独を保持するエピソーム性ベクターが組織特異的に、すなわちK562細胞では発現するが、HeLa細胞中では発現しないことを示し、その一方、HS2単独を保持するか、またはHS2、3および4を保持するエピソーム性ベクターは、K562およびHeLa細胞の両方で発現するので、組織特異的に発現しないことを示す。従って、エピソーム性ベクター中のHS2の存在は、目的の遺伝子の発現をもたらすが、組織特異的様式ではなく、その一方、HS3単独の存在(すなわちHS2 の非存在下)は、目的の遺伝子の組織特異的様式発現をもたらす。従って、HS2のような古典的エンハンサーは(そのコア内のNF-E2/AP-1ダイマー結合部位に局在化される)、(Tuanら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:2554-2558(1989)；Neyら、Genes Dev．4:993-1006(1990a)；およびNeyら、Nuc．Acids Res.18:6011-6017 (1990b))、組織特異性を規定するLCRまたはLCR成分から、前者が本発明による組織特異的転写を与える能力がないことにより区別可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．組織に制限される様式で、宿主細胞中の目的の遺伝子を発現するための自己複製型エピソーム性DNA発現ベクターであって、該ベクターは以下：（ａ）自己複製型の複製起点；および（ｂ）LCRまたはその成分であって、それは、目的の遺伝子に作動可能に連結され、そして宿主細胞中に存在する場合、組織に制限される様式で該遺伝子の発現を指向する、LCRまたはその成分、を含む、ベクター。２．LCRまたはその成分に作動可能に連結された目的の遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター。３．前記LCRの成分が、本質的にHS3からなるβ-グロビンLCRの成分である、請求項２に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター。４．前記LCRまたはその成分が、部位HS2を除く前記β-グロビンLCRまたはその成分である、請求項２に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター５．前記LCRの成分が、本質的にHS3およびHS4からなるβ-グロビンLCRの成分である、請求項２に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター。６．前記複製起点がウイルスの複製起点である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の自己複製型エピソーム性DNAベクター。７．前記ウイルスの複製起点がエプスタインバーウイルス由来の複製起点である、請求項６に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター。８．宿主細胞において該発現ベクターの複製のために必要とされる複製因子をコードする配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター。９．前記複製因子をコードする前記配列が、エプスタインバーウイルスのEBNA-1 をコードする配列、パピローマウイルスのE1をコードする配列、およびパピローマウイルスのE2をコードする配列からなる群より選択される、請求項８に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター。１０．前記発現ベクターで安定にトランスフェクトされた培養物中の細胞を選択するための抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター。１１．前記LCRと目的の遺伝子との間に置かれ、それらの間の転写を妨げるように作用する真核生物の転写終結配列をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター。１２．組織に制限される様式で、宿主細胞において目的の遺伝子を発現するための自己複製型エピソーム性DNA発現系を含む、１対のベクターであって、該１つのベクターは以下：ｉ．（ａ）複製起点；（ｂ）LCRまたはその成分であって、それは、目的の遺伝子に作動可能に連結され、そして宿主細胞中に存在する場合、組織に制限される様式で、該遺伝子の発現を指向する、LCRまたはその成分；および（ｃ）目的の遺伝子のためのクローニング部位；を含む第１のベクター；ならびにｉｉ．（ａ）複製起点；および（ｂ）複製タンパク質をコードする配列であって、該複製タンパク質は、該複製起点の複製のために必要とされる、配列；を含む第２のベクター、を含む、１対のベクター。１３．LCRまたはその成分に作動可能に連結される目的の遺伝子をさらに含む、請求項１２に記載の１対のベクター。１４．前記LCRの成分が、本質的にHS3からなる前記β-グロビンLCRの成分である、請求項１２または請求項１３に記載の１対のベクター。１５．前記LCRまたはその成分が、部位HS2を除く前記β-グロビンLCRまたはその成分である、請求項１２または請求項１３に記載の１対のベクター。１６．前記LCRの成分が、本質的にHS3およびHS4からなるβ-グロビンLCRの成分である、請求項１２または請求項１３に記載の１対のベクター。１７．前記複製起点がウイルスの複製起点である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の１対のベクター。１８．前記ウイルスの複製起点がエプスタインバーウイルス由来である、請求項１７に記載の１対のベクター。１９．前記複製因子をコードする前記配列が、エプスタインバーウイルスのEBNA -1をコードする配列、パピローマウイルスのE1をコードする配列、およびパピローマウイルスのE2をコードする配列からなる群より選択される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の１対のベクター。２０．前記各第１のベクターおよび第２のベクターが、該発現ベクターで安定にトランスフェクトされた培養物中の細胞を選択するための抗生物質耐性遺伝子を個々にさらに含む、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の１対のベクター。２１．前記第１のベクターが、前記LCRと、目的の遺伝子のためのクローニング部位との間に置かれる真核生物転写終結配列をさらに含む、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の１対のベクター。２２．特定の組織型の細胞における目的の遺伝子を発現するための方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の自己複製型エピソーム性DNA発現ベクター、または請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の１対のベクターを、哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。２３．培養物における宿主細胞中の目的の遺伝子の持続性組織特異的発現を得る方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の１対のベクターでトランスフェクト宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。２４．請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発現ベクター、または請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の１対のベクターを含む細胞を含む、トランスジェニック動物。２５．エピソーム性DNA発現ベクター中に含まれ、目的の遺伝子に作動可能に連結され、そして宿主細胞中に存在する場合、組織に限定される様式で該遺伝子の発現を指向するLCRまたはその成分を同定するための方法であって、以下：ｉ．該LCRが組み込まれる場合活性である細胞株中、また該LCRが組み込まれる場合不活性である細胞株中に、マーカー遺伝子に作動可能に連結される候補LC Rまたはその成分を含むエピソーム性ベクターをトランスフェクトすることによって、該LCRまたはその成分を試験する工程；およびｉｉ．該LCRが組み込まれる場合活性である細胞株において活性のみである該LCR またはその成分を同定する工程、を包含する、方法。