JP2000516576A - エストロゲン―アンドロゲン―プロゲスチンの組み合わせによる医薬品としての経口避妊薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 経口避妊薬のための方法および組成物を開示する。本発明のある組成物は、より若年の使用者が避妊薬を摂取できるように、アンドロゲン、好ましくはメチルテストステロンを含み、経口避妊薬の使用による骨ミネラル密度への副作用を防御している。

Description

【発明の詳細な説明】 エストロゲン−アンドロゲン−プロゲスチンの組み合わせによる 医薬品としての経口避妊薬 発明の背景 １．発明の分野 本発明には、一般的には、医薬品製剤の分野、特に経口避妊薬の分野に関する 。特に、本発明は、若年の経口避妊薬使用者での骨組織質量ピーク(peak bone m ass)の蓄積の分野に提供される。 ２．関連技術の説明 合衆国では、ティーンエージの妊娠が比較的高率であるため、小児科および思 春期産婦人科医は、不本意な妊娠を避けるため、若年女性に何らかの形の避妊を 行うように、時折、忠告している（Ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ Ｒｅ ｐｏｒｔ、１９９５）。青春期女性の間で最も一般的な避妊方法は、経口避妊薬 であり、性的活性人口のおおよそ４６％が摂取している。その結果、すべての閉 経前女性（＜４４歳）のおおよそ半数が、経口避妊薬を潜在的に服用しているが 、彼らの骨格は、まだ成熟状態にあり、約３０−３５歳で到達する骨組織質量の ピーク状態に到達していない。骨組織質量ピークとは、最大の骨密度に到達する ポイントを説明する用語である。婦人では、骨密度は、約３０−３５歳まで増加 し、その後、生命の続く限り、徐々に減少する。このピークは、骨組織質量ピー クとして知られている。骨密度は、晩年に減少するので、骨粗鬆症または骨折が より起こりやすくなる。それ故、ピークを可能な限り高くすることによって、こ の問題に先手を打つことが重要である。 エストロゲンは、閉経前女性の骨密度を維持するために必要であるが、アンド ロゲンの役割またはその組み合わせ効果は不透明である。低投与量のエストロゲ ンは、潜在的骨組織増殖プロモーターであり、女子には多分主な成長刺激(growt h stimulus)を提供するが、少年では、エストロゲンは、テストステロンと共に 成長刺激(growth spurt)に含まれるであろう（Ｋｕｌｉｎ、１９９１）。しかし ながら、最近のいくつかの証拠から、アンドロゲンが男性と同様に女性でも骨の 構築および維持に重要な役割を果たすと考えられる。思春期の間、アンドロゲン は骨組織の成長および骨組織質量ピークに影響するが、思春期後の青春期および 早期成人期の間は、アンドロゲンは、骨組織質量の維持にもかかわる。骨組織質 量ピークは３０−３５歳に得られる（Ｒｅｃｋｅｒら、１９９２）が、思春期の 間に、１５％の女性が大人の身長をおよび４８％の女性が大人の骨格質量に到達 する。 不幸なことに、経口避妊薬治療は、卵巣摘出と同様に、アンドロゲンレベルの 有意な減少の原因となり、それ故、経口避妊薬は、女性の多毛症を治療するため にも一般的に用いられる（Ｃａｒｒら、１９９５）。アンドロゲン過多症(hyper androgenemia)の若年女性は、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および全テストステロ ンに対する遊離テストステロンの比率（ｆＴ）／Ｔのレベルの上昇を、そして、 性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）の血清レベルの減少を、示す。低投与量 経口避妊薬は、ホルモン不均衡およびアンドロゲン過多を減少させる（Ｙａｍａ ｍｏｔｏおよびＯｋａｄａ、１９９４：ＲｏｓｅｎｆｉｅｌｄおよびＬｕｃｋｙ 、１９９３）。興味あることに、経口避妊薬療法は、アンドロゲン過多の女性の 血清Ａ、ＴおよびｆＴをより低くするのみならず、エストラジオール（Ｅ₂）レ ベルもまた、経口避妊薬療法で減少する。 排卵阻害に用いられた初期の経口活性ステロイドの内、あるものは、最初から エストロゲン活性を持っており、いくつかのプロゲスチン製剤は、エストロゲン で汚染されていたことが後に分かった。このことは、エストロゲンがプロゲスチ ンの抑制効果を強化することを示唆しており、２つの混合物が一般的に使用され るようになった。プロゲステロン薬剤を用いることによる排卵阻害の包括的研究 は、Ｒｏｃｋ、ＰｉｎｃｕｓおよびＧａｒｃｉａによって開始された。排卵を、 所望の期間、強い抑制性で、所望通りに妨害できることが、研究から分かった（ Ｒｏｃｋら、１９５７；Ｐｉｎｃｕｓ、１９６０）。用いられた化合物は、１９ −ノルテストステロンの誘導体であり、月経周期の５日から２５日に経口て与 えられた（月経初日を１日とする）。 経口避妊薬の最も一般的な型は、組み合わせ製剤であり、エストロゲンおよび プロゲスチンの両方を含んでいる。これらの製剤を用いた実験から、それら避妊 薬は、９９から１００％有効であることが示されてた。さらに、可逆性避妊薬に よるこの方法は、今までに考案された中で最も有効である。また、その他のステ ロイド避妊薬の修飾も試みられて、成功している。エストロゲンを１４から１６ 日間摂取し、そしてエストロゲンおよびプロゲスチンの組み合わせを５または６ 日間摂取する、連続製剤は、経口避妊薬として約９８から９９％の成功が得られ た。しかしながら、報告から、子宮内膜癌の発生率の増加および効率の低さが示 唆されたため、この型の連続製剤は、マーケットから除去された。連続製剤は、 エストロゲンおよび月の周期の間に変化する比較的少量のプロゲスチンを含む生 成物によって取って代わられた。連続製剤の経口避妊薬の二相および三相の調合 物を、表１に列挙している。これらの製剤は、与える全ホルモン量を低くする試 みが開発されて、その結果、副作用の発生率および厳しさが減少した。 経口避妊薬の使用と骨格の健康状態との関係は、数多くのヒトでの研究で試験 された。Ｔｕｐｐｕｒａｉｎｅｎら（１９９４）は、周閉経期の女性（４８−６ ０歳）でのＢＭＤへの経口避妊薬の使用の影響について研究している。女性の２ ９％は、かつて経口避妊薬の使用者であった。経口避妊薬使用者（ｎ＝９３９） は、非使用者（ｎ＝２２８３）よりわずかに高い（しかしながら統計上有意の） 腰椎ＢＭＤが認められた。最も多くの被験者を用いた研究（ｔｈｅ Ｏｒａｌ Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｃｏｌ ｌｅｇｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒｓ、ｎ＝４６，０ ００の女性）が１９６８年から１９９０年の間に行われ、既婚女性または既婚女 性として暮らしている女性の、経口避妊薬の使用とそれに続いて起こる（頭蓋骨 、肋骨および多発性骨折を除外した）最初の骨折の発生率の関係について試験し た（Ｄｏｏｐｅｒら、１９９３）。年齢、出産経歴、タバコの喫煙歴、および社 会経済的クラスを調整した後、かつて経口避妊薬を用いたことのある女性は、一 度も経口避妊薬を用いたことのない女性と比較して、有意でより高い危険率で骨 折が起こる［相対危険率(relative risk)１．２０］ことが分かった。従って、 こ の非常に大規模な予想研究から、経口避妊薬の使用が長期にわたって骨格の健康 を増進せず、骨折危険率の点から有害でさえある可能性がある、と考えられる。 ヒトでの研究の大部分が、閉経後の年齢に相当する年齢範囲の女性母集団を用 いており、まだ骨組織質量ピークに到達していない「より若年の女性」に焦点を 合わせた研究は、わずかである。１５６人の２０−３０歳の閉経前女性を用いた 経年研究で、Ｒｅｃｋｅｒら（１９９２）は、経口避妊薬の使用と全身骨組織質 量との間に肯定的な関連を見出したが、脊椎骨（Ｌ２−Ｌ４）または前腕骨の質 量との関連は見出されなかった。Ｌｉｎｄｓａｙら（１９８６）は、２種類の交 差区分研究からの結果を報告しており、その一つは、２５から３５歳の間の５７ 人の健康な閉経期前女性を含み、そのうち２４人は、以前に経口避妊薬（ノルゲ ストレルと共に３０または５０ｍｇのエチニルエステラジオール）を、６ヶ月よ り多くの期間、摂取したことがあった。被験者の内、研究期間に経口避妊薬を摂 取した人は誰もいなかった。経口避妊薬の使用経験は、脊椎骨でのＢＭＤ増加と 関連したが、橈骨のＢＭＤとの関連性はなかった。第二の交差区分研究では、２ ４人の年齢を調整した対照と比較して、１４人の閉経後女性において脊椎骨ＢＭ Ｄと経口避妊薬の使用との間に関連性は認められなかった。 ２４−３５歳の６０人の女性の交差区分研究において、Ｋａｎｄｅｒｓら（１ ９８４）は、経口避妊薬使用者（５ヶ月以上の使用者）が非使用者より有意に高 い脊椎ＢＭＤを持つことを、見出した。ＧｏｌｄｓｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｔ ｏｎ（１９７５）は、１９６９年と１９７０年に行われた大規模な交差区分研究 で、女性の異なる母集団間での経口避妊薬の使用と末梢橈骨ミネラルとの関係を 試験したが、この時、年齢２０−２９歳の経口避妊薬使用者の大多数がメストラ ノールを摂取しており（ｎ＝２１９）、比較的わずかな人数がエチニルエストラ ジオールを摂取していた（ｎ＝４７）。高投与量のメストラノールの使用（＞１ ００ｍｇ／日）は、橈骨質量の増加と関連するが、これに対して、エチニルエス テラジオールの使用（５０または１００ｍｇ／日）と橈骨質量は、白人女性（ｎ ＝６５）では関連性を示さず、黒人女性（ｎ＝１１）においては消極的にではあ るが関連性を示した。 Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１９８９）は、１１２人の２１−５２歳（平均年齢＝ ３４．１歳）の閉経期前女性では、経口避妊薬の使用と脊椎骨を含む様々な部位 の骨密度の間に、関連性を認めなかった。しかしながら、１７２人の年齢２８− ６８歳（平均年齢＝５３．４歳）の閉経後女性では、これらと同部位の骨密度と 経口避妊薬の使用との間に、積極的な関連性が認められた。Ｍａｚｅｓｓおよび Ｂａｒｄｅｎ（１９９１）は、年齢２０−３９歳の健康な女性２００−３００人 での研究においては、経口避妊薬の使用と脊椎、橈骨、または大腿骨頸のＢＭＤ との間に関連性を認めなかった。最近、Ｈａｎｓｅｎ（１９９４）は、２４９人 の年齢２１から５０歳（そのうち１７人は年齢＜３０歳であった）の閉経期前の 健康な女性について研究し、数多くの骨格部位の骨密度と経口避妊薬の使用との 関連性を報告していないが、最近になって経口避妊薬使用者は非使用者と比較し てＢＧＲが有意に減少（＜３２％）していることが認められた。 最近の研究では、経口避妊薬を用いている若年女性の脊椎骨密度は、時間を経 ても増えなかった（Ｃａｒｒら、１９９５）。彼女らの報告された年齢（平均年 齢２６±１歳）およびＲｅｃｋｅｒら（１９９２）によって報告された逆行系列 (regression lines)を用いると、この研究でのほとんどの女性の骨組織質量は、 研究期間の間増加し、正の均衡に帰するはずである。また、Ｔｅｅｇａｒｄｅｎ ら（１９９５）は、年齢１８から３１歳の女性の経口避妊薬使用と活用との間の 関連性について研究した。驚くべきことに、６ヶ月後、経口避妊薬を活用および 使用していた女性では、有意な量の脊椎骨組織ミネラル密度（ＢＭＤ）が損失し たが、これに対して、経口避妊薬を活用および摂取しなかった女性では、有意な 量の脊椎骨ＢＭＤが得られた。ホルモンの血清濃度は、報告されていない（Ｔｅ ｅｇａｒｄｅｎら、１９９５）。これらの結果から、重大な結果が示唆される。 経口避妊薬を活用および摂取する若年女性が、思春期および若年成人年齢（年齢 １５から３０歳）の間に骨組織を獲得することができなければ、彼女らは、期待 される骨組織質量ピークより低い骨組織質量ピークを獲得するのみであろう。そ れ故、年齢に関連する閉経後の骨組織の損失は、骨組織質量により大きな影響を 持ち、人生のより早い時期に、骨折閾(fracture threshold)に達するであろう。 それ故、特に１０歳代および２０歳代の女性には、望まれない妊娠の防御に有 効であり正常な骨組織質量ピークの獲得をも可能にする経口避妊薬が、即座に必 要とされる。 発明の要約 本発明は、経口避妊薬の新規組成物および方法としての一般常識について説明 することができるであろう。本発明のこれらの組成物および方法は、経口避妊薬 の若年使用者に付随して起こる骨の減少を緩和するためにいくつかの調合物の中 にアンドロゲンを含むような、経口避妊薬の以前の方法以上の改良を提洪する。 エストロゲンを含む経口避妊薬の若年使用者が、経口避妊薬非使用者が到達する ことのできる骨組織質量ピーク（約３０−３５歳）での骨組織ミネラル化のレベ ルと同様の高さに到達することができないことは、本発明者による重要な発見で ある。この影響は、晩年の骨粗鬆症または骨折のような問題を導くであろう。さ らに、経口避妊薬調合物、特に骨組織質量ピークに未だ到達していない女性に用 いられる調合物にアンドロゲンを付加すると、この影響に対抗できることが、本 発明者によって発見された。それでもなお、本調合物を任意の年齢の経口避妊薬 使用者に用いると、より自然なエストロゲン／アンドロゲン平衡を復元すること ができる。 本発明は、経口避妊薬使用者の骨組織増大の損失を減少させるに有効な量のエ ストロゲンおよびプロゲスチンおよびアンドロゲンを含む避妊薬調剤品としての 、ある広範囲の態様について、記述されて良い。アンドロゲンは、経口避妊薬調 剤品での使用に適当なこの技術分野で既知の任意のアンドロゲンであり、好まし くはテストステロンであり、より好ましくはメチルテストステロンであることが できる。近年入手可能な典型的アンドロゲンを表２に示している。経口避妊薬に 適応できる任意のこれらの調合物は本発明の実施に有用であろうと、理解される 。また、移植またはボーラス注射のような任意のその他の型で投与される、エス トロゲン／プロゲスチンを含むアンドロゲンの使用もまた、添付クレイムに包含 されるであろうと、理解される。 投薬量の判定は、産児制限調合物内のアンドロゲンの存在に対する被験者の生 理反応に依存し、処方する医師によってモニターされるであろう。例えば、競技 者のようなある被験者らでは、例えば、彼らの血清テストステロンレベルに影響 を与えないことが要求されるであろう。それ故、医師らは、例えば、経口避妊薬 調合物内に含まれるテストステロンの適正レベルを決定するために、約３ヶ月毎 にしばらくの間、血清テストステロンをモニターすることもできる。避妊薬調合 物は、３種類またはそれより多くのアンドロゲンレベルで入手可能であり、医者 は経口避妊薬の使用者の血清テストステロンレベルの変化に依存してより高いま たはより低いアンドロゲン調合物を処方するであろうと、期待される。思春期の 年齢から約３０から３５歳までの女性がエストロゲンおよびプロゲスチン含有の 経口避妊薬を使用すると、骨組織蓄積のある種の減少が起こるであろうことは、 本発明の発見である。本組成物は、骨組織の蓄積を強化するか、またはその他の 言葉で言えば、この年齢のグループの女性が経口避妊薬を使用することに関連す る負の影響を緩和するであろう。任意のそのような強化または緩和は、正常な骨 組織質量ピークに到連していない場合でさえ、以前の技術以上の改良を示す。そ れでもなお、本発明の目的は、経口避妊薬使用者が、正常に近い、または一層正 常な骨組織付随物および骨組織質量ピークを回復することである。 本発明のある調合物は、約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテストステロ ン／毎日の投与量を含むであろう。調合物は、例えば、０．２、０．３、０．４ 、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３ 、１．４または１．５ｍｇのメチルテストステロン／毎日の投与量を含むことが できる。用語「約」０．２から１．５ｍｇの使用とは、この範囲の外側のわずか な投与量もまた、有効かつ安全であることができ、そのような調合物もまた、本 発明のクレイムの範囲内に包含される。好ましくは、メチルテストステロンを含 む調剤物は、月経周期の間に自然に起こるテストステロンレベルの増加に合わせ て、月経周期８−１３日の間に投与される。例えば、テストステロンおよびエス トロゲンレベルは両方共、この正常周期の期間、増加することが知られている。 また、組成物に含まれるアンドロゲンまたはテストステロンは、妊娠を防ぐため に、エストロゲンおよびプロゲスチンを含むことが好ましい。好ましくは、プロ ゲスチンは、約０．０５０ｍｇ／毎日の投与量の濃度で存在するレボノルゲスト レルであり、エストロゲンは、約０．０３ｍｇ／毎日の投与量の濃度で存在する エチニ ルエストラジオールである。 本発明の実施態様は、月経周期の約８日から約１３日まで毎日投与される、レ ボノルゲストレルおよびエチニルエステラジオールと共にメチルテストステロン を含む第一の組成物を含む、経口避妊薬調剤品として、記載することができる。 また、避妊薬製剤は、第一の組成物の投与に続く１４日から約１８日まで毎日投 与されるレボノルゲストレルおよびエチニルエステラジオールを含む第二の組成 物を含む。また、製剤は、第二の組成物の投与に続いて、約１９日から約２８日 までの月経周期に毎日投与されるレボノルゲストレルおよびエチニルエステラジ オールを含む第三の組成物を含む物と定義することができる。この製剤は、さら に、月経周期の１−７日の間に摂取されるプラシーボ組成物を含むことができる 。好ましくは、組成物は、第一組成物を８−１３日に、第二組成物を１４−１８ 日に、そして第三組成物を１９−２８日に、摂取すると理解される。しかしなが ら、投与のタイミングは、これらの調合物を投与するのに最良の時間であると理 解され、本発明の範囲および精神を侵すことなくわずかに変化させることもでき る。さらに、第一組成物は、約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテストステ ロン／毎日の投与量、および０．０５ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０ ３ｍｇのエチニルエステラジオール／毎日の投与量を含むと定義することができ る。第二組成物は、好ましくは、約０．０７５ｍｇのレボノルゲルトレルおよび 約０．０４ｍｇのエチニルエステラジオール／毎日の投与量と定義することがで きる。第三製剤は、さらに、約０．１２５ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０ ．０３ｍｇのエチニルエストラジオール／毎日の投与量と定義することができる 。 また、本発明は、約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテストステロン、約 ０．０５ｍｇのレボノルゲストレル、および約０．０３ｍｇのエチニルエステラ ジオール／毎日の投与量を含む経口避妊薬組成物としてのある実施態様について 、説明することができる。ある実施態様では、本発明は、以下に記載する２８の 錠剤：６つの錠剤は、約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテストステロン、 約０．０５ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３ｍｇのエチニルエステラ ジオールを含み：５つの錠剤は、約０．０７５ｍｇのレボノルゲストレルおよび 約０．０４ｍｇのエチニルエステラジオールを含み；１０の錠剤は、約０．１２ ５ ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３ｍｇのエチニルエステラジオールを 含み；および、さらに組成物は約７つのプラシーボ錠剤を含むことができる：と して調合された経口避妊薬組成物として説明することができる。本明細書中に記 載された任意の組成物のプラシーボ錠剤は、経口避妊薬使用者の食餌に加えられ る、鉄、カルシウム、ビタミン、ミネラルまたはその他の有益な付加物を含むこ とができると、理解される。 エストロゲンを含む経口避妊薬を摂取している骨組織質量がピークに達してな い被験者の骨組織の蓄積を強化する方法もまた、本発明の実施態様である。方法 は、経口避妊薬と組み合わせて被験者にアンドロゲンを投与することを含む。方 法の好ましい実施態様では、アンドロゲンは、月経周期の８−１３日に、約０． ２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテストステロン／日として投与される。また、 本発明は、被験者の妊娠を防ぐ方法について説明している。方法は、月経周期８ −１３日に、毎日、約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテストステロン、約 ０．０５ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３ｍｇのエチニルエステラジ オール、次いで、月経周期１４−１８日に、毎日、約０．０５ｍｇのレボノルゲ ストレルおよび約０．０４ｍｇのエチニルエステラジオール、さらに、月経周期 １９−２８日に、毎日、約０．１２５ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０ ３ｍｇのエチニルエステラジオールを含む調合物を被験者に投与することを含む 。 本発明の実施態様は、月経周期の１−７日に毎日摂取されるプラシーボ組成物 を含む７つの錠剤の第一組成物を含む、一ヶ月の経口避妊薬のパックとして、説 明することができる。また、一ヶ月の経口避妊薬パックには、月経周期の８−１ ３日に毎日摂取される約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテストステロン、 約０．０５０ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエス テラジオールを含む６つの錠剤の第二組成物も含まれる。さらに、一ヶ月の経口 避妊薬パックは、月経周期１４−１８日に毎日摂取される約０．０７５ｍｇのレ ボノルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む５ つの錠剤の第三の組成物を含むと定義することができる。経口避妊薬のパックは 、月経周期の１９−２８日に毎日摂取される約０．１２５ｍｇのレボノルゲスト レルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む１０の錠剤の第 四 の組成物を含むことができる。さらに、一ヶ月のパックは、２８の区画を含むデ ィスペンサーを含み、それぞれの区画には、経口避妊薬組成物が含まれる。典型 的ディスペンサーは、決められた順序に従って、一日に一錠を摂取される２８の ピルに提供されるであろう。例示的ディスペンサーは、合衆国特許第４，１６５ ，７０９号、合衆国特許第４，８０７，７５７号、合衆国特許第３，６７８，８ ８４号または合衆国特許第３，６５１，９２７号（そのそれぞれをここに参照と して採用する）に記載されているそれらである。 その他の実施態様では、本発明は、月経周期の１−７日に毎日供収されるプラ シーボ組成物を含む７つの錠剤の第一組成物を含む一ヶ月の経口避妊薬パックを 含む。また、一ヶ月の経口避妊薬のパックは、月経周期の８−１３日に毎日摂取 される約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテストステロン、約０．０５０ｍ ｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを 含む６つの錠剤の第二組成物を含む。さらに、一ヶ月の経口避妊薬のパックは、 月経周期１４−１８日に毎日摂取される約０．０７５ｍｇのレボノルゲストレル 、約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールおよび約０．２ｍｇから約０． ５ｍｇのメチルテストステロンを含む５つの錠剤の第三組成物を含むと、定義す ることができる。経口避妊薬パックは、月経周期１９−２８日に毎日摂取される 約０．１２５ｍｇのレボノルゲストレル、約０．０３０ｍｇのエチニルエステラ ジオール、および約０．２ｍｇから約０．５ｍｇのメチルテストステロンを含む １０の錠剤の第四組成物を含むことができる。さらに、一ヶ月のパックは、２８ の区画を含むディスペンサーを含み、それぞれの区画には、一つの経口避妊薬組 成物が含まれる。 別に定義しない限り、ここに用いられているすべての技術用語および科学用語 は、本発明が属する当業者が一般的に理解するのと同じ意味を持つ。本明細書中 に記載の方法および物質と同様または等価の任意の方法および物質は、本発明の 実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および物質をここに記載 する。 本発明の詳細な説明 本発明は、不本意な妊娠を防ぐ経口避妊薬を提供し、避妊薬の若年使用者の骨 組織質量の蓄積を正常にし、その結果、それらの使用者は、適正な骨組織質量ピ ークに到達することができる。次いで、本発明は、骨組織質量ピークへの到達前 にエストロゲン／プロゲスチン経口避妊薬を使用した結果としてのより低い骨組 織質量ピークによる晩年の骨粗鬆症の危険性の増加を含む、エストロゲン／プロ ゲスチン経口避妊薬と関連するある種の副作用を防ぐ、安全で有効な経口避妊薬 を提供する。本発明は、３０歳より若い使用者に最も有益であろう経口避妊薬の 組成物を提供するが、組成物はまた、すべての閉経期前女性の妊娠を防ぐために も有効であろう。 本発明は、経口避妊薬がヒト以外の若い雌の霊長類の骨組織の適当な蓄積を妨 害し、この影響が内因性のアンドロゲンレベルの抑制による可能性があると言う 、発見から考えられた。この動物での研究から、同様の副作用が、若年女性（年 齢１５−３０歳）に起こり、しかも同じメカニズム（アンドロゲンレベルの抑制 ）によることが、強く示唆された。骨組織の蓄積の減少は、最高の骨組織質量ピ ークへの到達を妨害し、従って、晩年の骨粗鬆症の危険性を増加させる。若年女 性の骨組織質量の蓄積が乏しいと言う問題は、目下のところ、エストロゲンおよ びプロゲスチンを含む標準の経口避妊薬製剤を原因としている。本発明の組成物 は、エストロゲンおよびプロゲスチンに加えてアンドロゲンを含み、従って、正 常な骨組織の成長を可能にするユニークな長所および正常な骨組織質量ピークへ の到達を提供する。 エストロゲン／プロゲスチン経口避妊薬製剤および投薬（量判定） 経口避妊薬として現在用いられているいくつかの調合物を表１に列挙している 。組み合わせ製剤は、０．０２ｍｇから０．０５ｍｇのエチニルエステラジオー ルまたはメストラノールおよび様々な量のプロゲスチンを含み、２１日間摂取さ れる。次のコースは、最終投薬後７日または次の月経開始後５日に開始される。 エチニルエストラジオールは、メストラノールの効能のおおよそ２倍の効能であ ることは、特記に値する。 二相(biphasic)および三相(triphasic)の連続した相をなす、連続製剤(sequen tial preparation)を調合する。二相製剤と共に、固定服用量のエストロゲンお よびプロゲスチンの組み合わせを１０日間摂取し、次いで、異なる固定服用量の エストロゲンおよびプロゲスチンの組み合わせを１１日間摂取する。周期的投与 を再開する前、ピルを７日間中断する。三相製剤は、錠剤の三セットに同じまた は異なる量のエストロゲンおよび変化する量のプロゲスチンを含む。特定の調合 による、それぞれのセットを５−１０日間摂取する。投与２１日後、サイクルを 再開する前、薬物治療を７日間中断する。 表１．いくつかの経口避妊薬組成物およびその投与量 ¹ 用いられたプロゲスチンの中で、ノルゲストレルは幾分アンドロゲン性であ るが、その他は、最小のアンドロゲン活性を持つのみである。² 組み合わせ錠剤を２１日間摂取し、７日間休む。これらの製剤は、エストロ ゲン含有量を増加させるために列挙している。³ これらの製剤は、同じまたは異なる量のエストロゲンおよび変化する量のプ ロゲスチンを含む、固定服用量錠剤を含む。二相製剤では、第一の錠剤のセット を１０日間摂取し、第二の錠剤セットを１１日間、次いで薬物治療を７日間休む 。三相製剤では、それぞれの錠剤セットを三相連続で５−１０日間摂取し、次い で７日間薬物治療を休む。⁴ 「ミニピル」は、毎日連続的に摂取する。⁵ ジエチルスチルベストロールは、性交後７２時間内に、２５ｍｇの投与量で 、毎日二回、５日間摂取する。 多くの避妊薬製剤は、使用者が日にちを数えるのを助ける便利なカレンダー様 容器に分配される。３週間の処置と非処置の１週間を提供するようにパッケージ 内に７つのブランクピルを取り入れることによって、いくつかは計数の必要がな いようにしている。月経の開始時または終了時にかかわらず、ピルを毎日摂取す る。鉄は、いくつかの製剤内の「ブランク」ピル内に含まれる。 「ミニピル」（例えば、０．３５ｍｇのノルエチンドロンを含む、ＭＩＣＲＯ ＮＯＲおよびＮＯＲ−ＱＤ、ならびに７５μｇのノルゲストレルを含む０ＶＲＥ ＴＴＥ）を、毎日連続して摂取する。ミニピルは影響が少なく、それらを投与し ている間だけ妊娠が可能であるため、患者は、４５−６０日より多くの間、無月 経である場合には、患者は「ミニピル」を中断しなければならない。同様に、患 者が１つまたはそれより多くのピルを抜かし、かつ４５日より多くの間、無月経 であるならば、彼らは同様の評値を受けねばならない。 アンドロゲンの製造および服用量判定 臨床使用に有効なアンドロゲンのいくつかの非経口および経口の調合物を表２ に要約している。アンドロゲン療法は、主に、二次性徴の発達および／または維 持に用いられた。アンドロゲンは、筋肉内製剤を通して投与されるが、また、経 口で投与することもできる。本発明のアンドロゲンには、限定するつもりはない が、経口避妊薬組成物への使用に適当である表２に列挙したそれらが含まれる。 表２骨へのアンドロゲンの効果 任意の特定の理論に制限されるわけではないが、経口避妊薬の使用が若年女性 の骨組織質量のより低いピークを導くメカニズムは、以下の理由に基づくと考え られる。卵巣から生成される開始ステロイドは、テストステロン（Ｔ）およびエ ステラジオール（Ｅ₂）を末梢に誘導するアンドロスタンジオン（Ａ）である。 血清ＴおよびＡは、卵巣摘出後減少（５０％）するため、有意な割合の循環アン ドロゲンは、卵巣から派生すると考えられる（Ａｄａｓｈｉ、１９９４；Ｈｕｇ ｈｅｓら、１９９１）。 ａ） インビトロでの細胞的証拠 アンドロゲンレセプターは、造骨細胞様細胞内で同定され（Ｃｏｌｖａｒｄら 、１９８９：Ｗｉｒｅｎら、１９９５）、骨細胞内のカルシウムチャンネルを調 節することができる（ＴａｋｅｕｃｈｉおよびＧｕｇｇｉｎｏ、１９９５）。さ らに、アンドロゲンは、造骨細胞の分化および増殖を刺激する（Ｋａｓｐｅｒｋ ら、１９９０）。 ｂ） 動物モデルでの骨のアンドロゲン効果の証拠 アンドロゲンは、男性と同様に女性の骨の構築および維持に役割を果たすと考 えられる。抗−アンドロゲン薬剤であるｆｌｕｔａｍｉｄｅは、生殖線および副 腎の両方からのアンドロゲンへの応答を阻害する。Ｆｌｕｔａｍｉｄｅを（１５ ｍｇ／ｋｇ体重を経口で毎日）与えられた完全な雌のラットでは、オステオペニ ア（骨減少）が誘導された。完全な卵巣を持つ雌ラットの骨の代謝回転は、骨格 の⁴⁵Ｃａ変化で測定したところ、影響を受けており、このことは、ｆｌｕｔａｍ ｉｄｅの仲介するアンドロゲン欠乏による骨組織非薄化が主に骨形成の減少を原 因としていることを示唆している（ＧｏｕｌｄｉｎｇおよびＧｏｌｄ、１９９３ ）。最近、これらの知見は、純粋な非ステロイド抗−アンドロゲン（Ｃａｓｏｄ ｅｘ^R）を毎日３週間の間与えられた完全な雌のラットで再生された。骨幹端の 骨体積および骨の縦方向の成長は、ベヒクルで処置した完全な雌と類似していた 。しかしながら、Ｃａｓｏｄｅｘ^Rで処埋したラットで骨の形成速度が有意に減 少す ることは、動力学的組織音波測定によって示された（Ｆｌａｎａｇａｎら、１９ ９５）。 アンドロステンジオンを卵巣摘出したラットに与え、骨の代謝回転を減少させ ることにより卵巣摘出誘導骨粗鬆症を防いだ場合、アンドロゲンによる骨への直 接的効果が起こった（Ｌｅａら、１９９５）。老年の卵巣摘出したラットでは、 ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を試験した。なぜなら、テストステロンに似 たＤＨＴは、アンドロゲンレセプターと結合するが、テストステロンとは異なっ て、ＤＨＴはエストロゲンと芳香化できないからである。ＤＨＴおよびエステラ ジオールは両方とも、より老年の卵巣摘出ラットにおいて、卵巣摘出誘導の骨粗 鬆症に対する防御を提供する（Ｖａｎｉｎら、１９９５）。 滑らかな脱毛後すぐの白色の尾を持つ雌鹿へのステロイド性抗アンドロゲン酢 酸シプロテロンの筋肉内投与は、（ａ）血漿中のテストステロンレベルの劇的な 減少、（ｂ）十分にミネラル化した枝角をもつ雄鹿での成熟前の抜け落ち、そし て、（ｃ）結果として抜け落ちを妨害する不完全にミネラル化した枝角内の骨組 織再構築活性の再生：を誘導する（Ｂｕｂｅｎｉｋら、１９８７）。 雌ザルのホルモン操作は雌ザルの体の組成および骨組織のミネラル状態に影響 を与える（Ｊａｙｏら、１９８９）。プラスチック移植片によるホルモン治療の １年後、完全にプラシーボで処置したサルは、Ａ＋エストロン［Ｅ₁］を受けた 完全なサルまたはテストステロンを受けたサルより、より低い腰椎骨棘および全 骨格の骨組織質量を持っていた。テストステロン処理したサルは他の２つのグル ープと比較して体重が明らかに増加したが、アンドロゲン処置したグループは両 方共、脛骨強度および皮質密度が明らかに増加した（ＫａｓｒａおよびＧｒｙｎ ｐａｓ、１９９５）。 ｃ） 女性の骨組織へのアンドロゲン効果の証拠 女性の骨組織状態への充分なアンドロゲン刺激の必要性についての直接的証拠 が、最近Ｓｐａｉｎに記載されたアンドロゲンに無感覚な女性の例によって、示 された。年齢１７歳の女性は、低い骨密度と上昇したアンドロゲンレベルを持っ ていた。医者は、若年女性をエストロゲンで処置するが、彼女のエストロゲン療 法への応答の欠如は、思春期後でさえアンドロゲン刺激が重要であることを示唆 している（Ｍｕｎｏｚ−Ｔｏｒｒｅｓら、１９９５）。Ｄａｎｉｅｌら（１９９ ２）は、年齢２０−３５歳の若年女性に於けるタバコ喫煙の影響（２５人の喫煙 者、２７人の非喫煙者）について研究した。骨組織ミネラル密度は、グループ間 で違いはなかったが、両グループ共、ＳＨＢＧおよび遊離アンドロゲン指数（Ｔ ／ＳＨＢＧ）が骨密度の変化に有意に貢献した（ｐ＜０．０５）。 思春期の黒人女性は、思春期の白人女性より、より多い骨組織質量、および、 より高い血清テストステロンのレベルを持っている（Ｗｒｉｇｈｔら、１９９５ ）。より年配の黒人女性で研究したところ、骨組織質量は、より年配の白人女性 と比較して、より多かった。この年配のクループでは、体組織質量指数（ｋｇ／ ｍ²）およびＥ₁は、アンドロゲンでなく、骨組織質量と関連した。それぞれの人 種内では、骨組織質量は、血清Ｅ₁の濃度の増加と共に、直線的に増加した（Ｃ ａｕｌｅｙら、１９９４）。さらに、より年配の白人女性では、全テストステロ ン（Ｔ）ではなく遊離テストステロン（ｆＴ）のレベルが、背骨、腰および手首 の骨組織密度と関連していた（Ｇｒｅｅｎｄａｌｅら、１９９５）。このように 、年齢に依存する生物学的に活性なｆＴのレベルは、骨組織質量と良く相互作用 する。 早期の研究では、小柱骨密度は、年齢２１−４８歳の範囲の女性では血清Ａと のみ明らかに相関した（Ｂｕｃｈａｎａｎら、１９８８）。正常な血清アンドロ ゲンレベルを持つ女性では、皮質骨密度は、血清の全Ｔおよび生物学的に活性な ｆＴと相関した。理論上は、この皮質骨質量の増加は、晩年の骨折の防御を手助 けするはずである。内因性アンドロゲンは、骨密度の同化促進効果(anabolic ef fect)を持ち、小柱の骨密度（脊椎）は、アンドロゲン過剰の女性では有意に増 加した（Ｂｕｃｈａｎａｎら、１９８８）。相互作用は、閉経前女性では、性ホ ルモン−結合グロブリン(sex hormone-binding globulin)（ＳＨＢＧ）、硫酸ジ ヒドロエピアンドロステロン(dihydroepiandrosterone sulfate)（ＤＨＥＡＳ） 、アンドロゲンおよび骨組織質量間に認められた（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、１９９ ３）。遊離テストステロンは、すべての測定部位で骨組織質量と最も矛盾なく相 関するアンドロゲンであった。それ故、閉経前女性では、アンドロゲンは骨組織 質量と 関連するすることが、明らかであるらしい。 ｄ） 閉経前のサルおよび女性の骨への経口避妊薬の影響の証拠 骨密度および骨代謝の血清マーカーへの経口避妊薬療法の影響を決定するため に、本発明者らは、若い成体の雌ザルの予想される縦の研究に着手した。２０７ の完全なサルを２つのグループに分け、薬剤を含まない（対照）かまたは三相の 経口避妊薬レジメン（Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^R）を含むかのいずれかのアテローム 発生食を与えた。 骨密度および血清の骨バイオマーカーの測定を処理前および処理後周期的に行 った。処理前に目に見える有意の差異は認められなかった。両グループの動物共 、研究中、骨質量ピークに達していなかったと考えられる、骨ミネラル密度(bon e mineral density)（ＢＭＤ）を得た。Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^Rで処理した動物は 、研究経過の間中、対照の動物より腰椎骨ミネラルが少なく、結果として、２０ ヶ月では、対照と有意に異なる腰椎骨ミネラル密度であった。繰り返し測定した 縦データ分析から、全身の骨ミネラル含有量(bone mineral content)（ＢＭＣ） は、腰椎ＢＭＣと同様に、未処理の完全対照と比較してＴｒｉｐｈａｓｉｌ^R− 処理動物では、処理１０および２０ヶ月で、有意により低いことが、示された。 血清アルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase)（ＡＬＰ）レベルは、Ｔ ｒｉｐｈａｓｉｌ^Rグループでは著しく減少したが、これに対して血清酸性ホス ファターゼ(acid phosphatase)（ＡＣＰ）およびカルシウムは、より少ない範囲 で減少した。結果から、骨質量ピークに到達していない若い成体の雌ザルの三相 経口避妊薬療法は、骨の代謝回転速度を減少させることによって、正味の骨増殖 を阻害すると考えられ、結果として、これらの動物により低い骨質量ピークを生 ずるであろう影響が示唆される。 これらの知見を説明する一つのメカニズムは、骨吸収と骨形成の平衡が、形成 が吸収より少ないように変化したこと、である。事実、経口避妊薬処理は、骨形 成のマーカー（血清ＡＬＰ）を４０％減少させる原因となったが、これに対して 吸収マーカーの変化はずっと少なかった（ＡＣＰでは１０−１５％が減少し、そ してＴＲＡＰへの影響は最少であった）。このように、経口避妊薬療法は、これ らの若い動物の正味の骨増殖が未処理の雌の周期と比較して少なくなるように、 骨吸収より骨形成を減少させるであろう。 さらなる説明は、骨が充分に維持されないであろう骨代謝回転速度の上または 下に最適窓があるという考えと関係する。サルの卵巣摘出は、結果として骨の代 謝回転速度を上昇させる。女性と同様に、酢酸メドロキシプロゲステロンでエス トロゲン置換治療を行ったかまたは行わなかった卵巣摘出動物の治療は、結果と して、未処理の対照と比較した場合、脊椎のＢＭＣおよびＢＭＤの増加に伴って 、骨吸収および骨形成のマーカーが減少する。 発明者らの経口避妊薬の研究から、骨質量ピークに達する前の若いサルの骨代 謝回転の減少は、また、異なる環境下での骨ミネラル蓄積の減少と平行すること が示唆される。周閉経期および閉経後の女性では、骨の代謝回転速度の増加に伴 って、骨の損失が起こり、さらに、エストロゲン置換療法は、骨の回転速度を減 少させることによって、この骨の損失を阻害することができる。 経口避妊薬を摂取した周閉経期女性では、血清のオステオカルシン(osteocalc in)（骨のｇｌａタンパク質［ＢＧＰ］）は変わらなかったが、ヒドロキシプロ リンの尿排出が減少し、そして、それは脊椎動物ＢＭＤの有意の増加（ｐ＜０． ００１）と平行していた（Ｇａｍｂａｃｃｉａｎｉら、１９９４）。しかしなが ら、健康な閉経前の思春期の女性および動物では、骨の代謝回転速度の減少は、 正常な状態と比較して骨のミネラル蓄積の正味の減少によって起こり、結果とし て低い骨質量ピークを導くであろう。 一年間の予想研究において、２０μｇのエチニルエストラジオール＋０．１５ ０ｍｇのデソゲストリルを含む経口避妊薬の骨代謝への影響を、年齢２０−３０ 歳の１９人の女性で研究した。骨密度は、試験の終わりで、わずかではあるが有 意ではない増加を示した。尿中のヒドロキシプロリン対クレアチニン比率および 血清ＡＬＰレベルは、両方共、有意の減少を示した。結果から、経口避妊薬を用 いている若年婦人では、骨の吸収は減少したが、末梢橈骨の骨密度は、有意に増 加しなかった、と考えられる（Ｍａｉｓら、１９９３）。 本研究の開始時の動物の平均年齢は、歯列より６歳であると評価された。これ は、この種での成長期の終結のおおよその時間であるが、９歳で到達する骨質量 ピークの前である（Ｊａｙｏら、１９９４）。女性は、１０歳代初期には性的に は成熟しているが、骨質量ピークで表される骨格的成熟には、年齢約３０歳まで は、到達していない（Ｒｅｃｋｅｒら、１９９２）。骨格的成熟と言う点から、 これらのサルは、年齢１５および３０歳の間め女性に相当するであろう。このよ うに、結果から、骨質量ピークにすでに到達した状態でないが、成熟に近い骨格 への経口避妊薬の影響が示される。しかしながら、体幹の長さの測定では、治療 グループの間では有意に変化しないため、骨の代謝回転の抑制および骨のミネラ ル蓄積の間の関係は、単に、動物がまだ成長していると言う事実によるものであ るとは、考えられない。 薬理学的組成物 本発明に従って調合されたピルは、増量剤、結合剤として、および色コード目 的で提供される成分を含むことができると、理解される。これらの成分は、現在 では経口避妊薬調合物中で共通して用いられており、限定するつもりわけではな いが、ラクトース、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ポビドン、ステアリン 酸マグネシウム、ステアリン酸、コロイド二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメ チルセルロース、ポリエチレングリコール、および、一つまたはそれより多くの 以下の染料：ＦＤ＆Ｃ Ｂｌｕｅ Ｎｏ．１ Ｌａｋｅ、ＦＤ＆Ｃ Ｂｌｕｅ Ｎｏ．２ Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ Ｌａｋｅ、Ｄ＆Ｃ Ｇｒｅｅｎ Ｎｏ．５、Ｄ ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．１０、ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．６、または 、ＦＤ＆Ｃ Ｒｅｄ Ｎｏ．３：を含むことができる。もちろん、これらは、例 としての増量剤および染料のみであるが、当業者らは、その他の不活性成分を本 発明の調合物の製造に用いることができることを、認識しているであろう。 アンドロゲンによる副作用は、より高投与量で経験させることができる。患者 および医者によって容易に認知され検出される初期の副作用には、座瘡および多 毛症が含まれ、このことは両方共、投与量の減少が考慮されるべきであることを 意味している。これらの症状は、早期に検出すれば、容易に逆行させることがで きる。進行した多毛症、変声、筋肉量の変化等は、早期検出およびそれに応じた 投与量の調整に応じて避けうる、より進行したアンドロゲン過剰による副作用で ある。副作用を最少にするために、骨質量の蓄積に有益に作用する最小有効投与 量は、１．２５ｍｇ／日の範囲であると、考えられる。しかしながら、個々のケ ースでは、開業医が必要と考える、より多いまたはより少ない投与量を要求する ことができると考えられる。 ここに示された任意の調合物は、一ヶ月の供給用にデザインされたディスペン サー内に供給される。代表的なディスペンサーは、２８ピルを提供し、決められ た順序で１日に一回、摂取されるであろう。模範的ディスペンサーは、合衆国特 許第４，１６５，７０９号、合衆国特許第４，８０７，７５７号、合衆国特許第 ３，６７８，８８４号、または、合衆国特許第３，６５１，９２７号（そのそれ ぞれをここに参照として採用する）に記載されたそれらである。ディスペンサー または調剤手段は、それだけで自然に、本発明を構築するものではなく、任意の ディスペンサーとは、個々のパッケージ内にピルを分けて、決められた順序で一 回に一錠のピルを分配する手段を提供することを意味し、そうすることによって 、任意の特定の日に摂取されるピルが好ましいものであることが、使用者にも分 かるであろう。また、一ヶ月またはそれより多い毎月のディスペンサーは、例え ば、生成物の情報および／または使用説明書を含ませることもできる、厚紙の箱 のような、箱の中に含まれるであろう。ディスペンサーはまた、産児制限用のピ ルディスペンサーと瞬時に同一と見なすことのできない、装飾型の箱内に含ませ ることもできる。 動物研究の方法論 雌ザルは、骨代謝へのホルモンの影響を試験するための良好な動物モデルとし て提供される。サルは、女性の月経周期と長さおよびホルモン変化が類似した月 経周期を持つ（Ｍａｈｏｎｅｙ、１９７０）。さらに、卵巣摘出したマカークザ ルは、閉経後の女性に認められる骨変化とよく似た方向で、エストロゲン置換治 療に応じて、骨変化を受ける（Ｊｅｒｏｍｅら、１９９４）。試行を通して、骨 密度、骨代謝回転の血清および尿中マーカー、血清中の性ホルモン、血漿脂質、 体重および重量分布、血圧、ならびに骨の構造および形態を測定した。試行の最 後に、サルはすべて解剖され、骨組織パラメーターおよび冠状動脈アテローム性 動脈硬化症（ＣＡＡ）の程度について、グループ毎に比較した。この種の予想試 行は、その侵略的性質、損失および抑制不可能な変化からくる複雑性故に、ヒト では行うことができない。 試行では、雌のマカークザルを３つのクループに分けた： グループ１＝ 完全な未処置の対照（ＣＯＮＴＲＯＬ） グループ２＝ 経口避妊薬−Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^R p.o.,ＯＣで処置 Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^R（女性での投与量）： １− ７日、ホルモンを与えず； ８−１３日、０．０３ｍｇエチニルエステラジオール および０．０７５ｍｇレボノルゲストレル； １４−１８日、０．０４ｍｇエチニルエステラジオール および０．０７５ｍｇレボノルゲストレル； １９−２８日、０．０３ｍｇエチニルエステラジオール および０．０１２５ｍｇレボノルゲストレル。 グループ３＝ 経口避妊薬−Ｔｒｉｐａｓｈｉｌ^R＋三相メチルテストステロン （ＭＴ）（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ，Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｔｏｎ，ＮＨ）で処置 Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^R＋ＭＴ（女性での投与量）： １− ７日、ホルモンを与えず； ８−１３日、０．０３ｍｇエチニルエステラジオール 、 ０．０５ｍｇレボノルゲストレル、 および０．４０ｍｇのＭＴ； １４−１８日、０．０４ｍｇエチルエステラジオール、 ０．０７５ｍｇレボノルゲストレル、 および０．６０ｍｇのＭＴ； １９−２８日、０．０３ｍｇエチニルエステラジオール 、 ０．１２５ｍｇレボノルゲストレル、 および０．４０ｍｇのＭＴ 動物の獲得および初期データ １００匹の若年成体（６−８歳）の雌ザルを、ジャカルタ、インドネシアから 購入し輸入した。実験食を与えている間に、法律の要求に従って、動物を検疫し た。一ヶ月の基準線期間の間に、インビボで骨のデンシトメトリーおよびラジオ グラフを用いて、骨の異常を検出した、。骨格異常または開いたままの骨端を持 つ動物を交換した。人体計測法（体重および体幹長）、骨デンシトメトリー、血 清の化学、および血漿脂質の結果に基づいて、（上記のように）サルを３つグル ープが釣り合うようにサルを割り当てた。クループ間の同等性は、基準線データ を用いて確かめた。処理後２４ヶ月、すべての動物を死体解剖し、骨の構造的変 化および強度変化ならびにＣＡＡについて、研究グループを比較した。 基準線および処置１２ヶ月後に蛍光色素で標識した後、組織形態学的分析を行 うため、腸骨生検を採集した。血液および尿を、０、１、３、６、１２、１８お よび２４ヶ月に、採集した。骨代謝回転の血清および尿中のバイオマーカーを、 すべての時間点で測定した。サルの腰椎骨、股関節部および全身を１、６、１２ および２４ヶ月に測定した。血液を０、６、１２、１８および２４ヶ月に測定し 、ＬＤＬ分子量の測定は、１２ヶ月に行った。身体測定（体重、体幹長等）を６ ヶ月毎（ＤＥＸＡ走査時間）に行った。 任意の２つのグループ間の平均値の予想された差異を検出するための最少のサ ンプルサイズを決定するために、統計的力価計算（ＤｕｐｏｎｔおよびＰｌｕｍ ｍｅｒ、１９９０）を行った。骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の変動制の概算、組織 形態計測（骨体積／全体積％［ＣｎＢＶ％］）によって評価される骨構造、骨代 謝の血清マーカー（アルカリホスファターゼ、ＡＬＰ）およびＣＡＡ初期領域を 、本研究から計算した。以下の表３には、一次終了点での、調整したグループの 大きさ（ｎ）、検出可能な差異、力価、および二面的レベルの意義について、列 挙している。 表３．一次的終了点のデータ ５％の年間死亡率（本研究に基づいて、そして処置２４ヶ月後、最初７５匹の サルから６７匹が生きている）を考慮して、処置２年後、９０匹の動物が得られ るように、１００匹のサルを３つの処置グループに任意抽出した。研究者らは、 臨床的に適切であり、表３に上記した研究の終点に基づいて生物学的にもっとも らしく、最近のチアザイド研究での研究者らの知見に基づいて合理的である、と 考えられる、検出可能な差異を標的とした（Ｊａｙｏら、１９９５）。 維持および食餌組織 移動および社会的相互作用を制限しない、屋内の檻（２．０ｘ３．２ｘ２．５ ｍ）の中で４または５匹のサルのグループで、サルを収容した。自動吸水装置に よって、水を無制限に供給した。程良いアテローム発生半精製食をサルに与えた 。食餌は、脂肪から４３％のカロリーおよび０．３０ｍｇのコレステロール／Ｃ ａｌを含んでいた。この食餌は、一般的に、約２００−４００ｍｇ／ｄｌの全血 漿コレステロール濃度を誘導すると期待される。食餌は、カルシウム（Ｃａ）対 リン（Ｐ）比率が１．０（Ｃａ ２０７ｍｇおよびＰ ２０６ｍｇ／１００ｇの 食餌）であり、食餌１ｇ中に２．５ＩＵのビタミンＤ₃を含んでいる。ビタミン Ｄ₃量およびＣａ／Ｒ比率は、この種では適当である。食餌は、以前にＣＭＣＲ Ｃで用いられた（Ｊａｙｏら、１９９５）。研究を通して、Ａｍｉｎａｌ Ｃａ ｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ機関によって確立されたガイドライ ン、国家および中央政府の法律、およびＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌ ｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓの基準に従った。 Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^R（エチニルエステラジオール［ＥＥ］およびレボノルゲ ストレル［ＬＮＧ］）を、グループ２の食餌組成物に加え、Ｔｒａｐｈａｓｉｌ^R ＋ＭＴをグループ３のこの食餌に加えた。適当な薬剤投与量を、食餌に加え、 上記のように月の処方された日に食餌させる。対照グループ（グループ１）は、 ２８日周期を通してホルモンを加えていない基本食を与えられた。 スクリーニングおよびサンプリング 検疫期間に次いですぐ、サルは３０日の基準線期間に入った。この月の間、骨 代謝回転マーカーの分析、血漿脂質およびホルモン定量のために、血液および尿 を収集した。血液および尿収集のために、動物に鎮静剤を飲ませた（塩酸ケタミ ン、１５ｍｇ／ｋｇ）。サルの正常な卵巣機能は、検疫期間の月経周期に従って 、およびその後膣スワブによって、定量した。脊椎サイズ、欠陥スコアおよび病 理学的スクリーニングのために、ラジオグラフを取った。ＢＭＣおよびＢＭＤは ＤＥＸＡによって測定した。ＢＷ、体幹長、しわ、ならびに、体幹および付属器 官周辺を含む身体測定を、行った。これらを測定した後、比較しうる骨のミネラ ル状態、人体測定学的測定、血清中の骨バイオマーカー、および脂質プロフィー ルを持つ、３つの研究グループに、動物を割り当てた。 処置 対照の完全なサルはそれらの食物中に混合された薬物処置を受けなかった。グ ループ２の動物は、２４ヶ月の間、ＴｒｉｐｈａｓｉｌＲ（Ｗｙｅｔｈ−Ａｒｅ ｒｓｔ、三相経口避妊薬）を与えられた完全なサルからなっていた。グループ３ のサルは、Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^R＋三相のメチルテストステロンを２４ヶ月間与 えられた完全体であった。経口配達システムは、これが女性によって使用される 経路であるために、および肝臓が薬剤代謝に影響を与えることができるために、 選択された。動物は病気の臨床サインをしつかりとモニターされ、もし必要であ れば、すべてのグループへの食餌中に追加された。三相のメチルテストステロン 調合物は、雌ザルの性周期を通して認められるホルモンの正常な周期的レベル（ テストステロン／エチニルエステラジオール比率）に基づいて、選択された （Ｗｉｌｓｏｎら、１９８２）。選択されたＭＴ投与は、性周期中のＴと類似し たアンドロゲン的刺激を提供するはずである。閉経後の女性に有効な薬剤調合物 中に存在するより高い投与量（ＥｓｔｒａｔｅｓｔＲ、Ｓｏｌｖａｙ Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＧＡ）は、閉経前の若々しい女性 での好ましくない副作用の原因になりうる（Ｈｉｃｋｏｃｋら、１９９３；Ｗａ ｔｔｓら、１９９５）。 一般的健康プロフィール センターへの到着時に行われた、最初の身体試験は、それぞれの動物の健康お よび状態の情報を提供した。必要であれば、全血液の計数および微分、全血清タ ンパク質、アルブミン、血清グルコース、尿素、窒素、クレアチニン、カルシウ ムおよびリン酸を含む、血液学的および臨床的化学パラメーターを測定した。必 要に応じて、尿分析および糞便サンプルを試験した。雌マカークザルの正常な参 考値をセットで確立した。全血液の計数は、自動細胞カウンター（Ｃｏｕｎｌｔ ｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍ₄３０、Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）で行い、白血球の微 分もまた、行われた。ＣＢＣｓ、肝機能検査、全血清タンパク質レベルおよびグ ルコースは、研究期間を通して、測定された。 身体測定 体重（ｋｇ）および胸骨上切痕から恥骨結合までの体幹長（ＴＬ、ｃｍ）を用 いて、身体質量インデックス（ＢＭＩ＝ＢＷ／［ＴＬ／１００］２）を計算した 。三頭、皮膜下、suprailiac、腹、大腿中央、midscapular、および胸部筋肉層 の厚さ（ｍｍ）を測定した。また、ウエスト、ヒップ、腿および上腕の周囲（ｃ ｍ）を測定した（Ｓｈｉｖｅｌｙら、１９８７）。 骨のデンシトメトリー 腰椎（Ｌ２−Ｌ４）、全サル、および股関節の骨のミネラル含有量ならびに骨 密度の測定は、前述の方法（Ｊａｙｏら、１９９１）を用いて、塩酸ケタミン（ １５ｍｇ／ｋｇ、i.m.）およびアセプロマジンマレエート(acepromazine male ate)（０．１５ｍｇ／ｋｇ、i.m.）の筋肉内麻酔下、インビボで行なわれた。骨 密度は、グループ割り当ての基本方針を提供し、ヒトでの臨床試行からの類似の データとの結果の比較を可能にする。ＤＥＸＡスキャンを、基準線ならびに６、 １２、１８および２４ヶ月に行った。 血清および尿中の骨のバイオマーカー 組織形態計測によって、骨の代謝回転、特に吸収、の真の、そして多様な動的 測定を得ることは難しい。血清および尿中バイオマーカーは、侵襲性外科手術を 行うことなく、形成および吸収を測定する経済的で実際的な唯一の方法を提供す る。血清および尿中の骨バイオマーカーを、基準線ならびに１、３、６、１２、 １８および２４ヶ月にアッセイした。血清の全ＡＬＰ（骨形成）、ＡＣＰおよび 酒石酸塩耐性ＡＣＰ（ＴＲＡＰ、骨吸収）、カルシウムおよびリンを、Ｃｏｂａ ｓ Ｆａｒａ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を用いて、測定した（Ｃａｒｌｓｏｎら 、１９９２；Ｊａｙｏら、１９９５；Ｊｅｒｏｍｅら、１９９４）。血清ＢＧＰ （骨の代謝回転）アッセイを、確立されたラジオイムノアッセイを用いて、行っ た。骨の吸収を、ＦＤＡ−認可Ｎ−テロペプチドコラーゲン排出マーカー（Ｏｓ ｔｅｏｍａｒｋ^R，Ｏｓｔｅｘ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて、測定した。 閉経後の女性のコラーゲンＩ型架橋Ｎ−テロペプチドは、６週間のエストロゲン 置換治療によって、閉経前女性に認められるレベルに減少する（Ｈａｎｓｏｎら 、１９９２）。 ホルモンアッセイ テストステロン、遊離テストステロン、メチルテストステロン、エストロン、 エステラジオール、エチニルエステラジオール、性ホルモン結合グロブリン、お よびアンドロステンジオンの血漿濃度を、Ｙｅｒｋｅｒｓ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒのアッセイラボラトリーで確 立された方法によって、測定した。ＭＴを測定し、配達システムの効力および（ もしあれば）Ｔへの転換について試験した。 血漿脂質 全血漿のコレステロール、トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロール分析（ Ｊａｙｏら、１９９４）を、Ｃｏｂａｓ Ｆａｒａ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎ ａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を 用い、酵素技術によって行った。ＬＤＬ分子量および分画もまた、測定された。 血圧測定および心電図 動物を鎮静させた間に、血圧を測定した。動物を、彼らの右側を上に横たえ、 上腕が体の縦軸にほぼ垂直になるまで、右腕を頭方向に伸ばした。上腕周囲を、 肩と肘の中間で測定し、適切なサイズカットを行った。心収縮期血圧、弛緩期血 圧および心臓速度の３つの測定を行った（Ｃａｓｔｒｏら、１９８１）。これら の測定値の平均を記録した。収縮期、弛緩期、および平均動脈圧および心臓速度 を侵襲することなく測定するためのオシロメーター技術を用いた、Ｄｉｎａｍａ ｐ Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ａｄｕｌｔ／Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ａｎｄ Ｎｅｏｎａ ｔａｌ Ｖｉｔａｌ ｓｉｇｎｓ Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｍｏｄｅｌ ８１００）で 、血庫を測定した。この装置は、主観的判断を削除して、血圧および速度を算定 する（Ｃｏｒｂｅｔｔら、１９８１）。Ｍｅｄｉｃａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇｒｅ ｅｎｄａｌｅ，ＮＹ）Ｃａｒｄｉｏｍａｔｉｃ心電計（Ｍｏｄｅｌ ＭＳＣ２０ ００１）を、心臓病専門医の評備に用いた。心電図は動物を背面横臥させた状態 で取り、標準誘導（Ｉ、II、III、ＡＶＲ、ＡＶＬ、ＡＶＦ）および３種類の胸 部誘導（Ｖ−１、Ｖ−４、Ｖ−６）を記録した。 組織形態計測のための骨の収集およびプロセシング 蛍光色素標識化 ： 骨の組織形態計測は、インビボで骨を探求する蛍光色素標識の投与前に、必要 とされる。サルに、１日、次いで残りの１４日に無菌の静脈内注射を行い、２１ 日に二度目の標識注射を行った。７−１０日後、生検または剖検サンプルを採取 した。以下の骨探求蛍光色素の一つを、３つの骨収集時間点のそれぞれで、すべ てのサルに用いた：カルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ）、キシリノールオレンジ（９ ０ｍｇ／ｋｇ）、または塩酸デメクロシクリン（２０ｍｇ／ｋｇ）。もちろんこ れらは、蛍光色素の例であるのみであり、当業者らは、その他の蛍光色素を用い ることもできる。 この型の適用は、測定される動力学的パラメーターを考慮している（Ｊｅｒｏ ｍｅら、１９９４；Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９２）。測定された骨形成速度のあ る程度の違いは、これらの標識の取り込み率の差によって、異なる時点で起こる であろう（ＧｏｏｄｗｉｎおよびＪｅｒｏｍｅ，１９８７）。それぞれの時点で 同じ蛍光色素を与えることによって、単一の時間点でのグループ間比較での変動 性は減少するが、標識の取り込みでの変動の可能性は、時間を通しての変化の分 析で考慮される。異なる蛍光色素標識を用いると、先の骨のミネラル化活性の認 識が可能になるのに対して、標識間の距離およびその範囲の測定は、骨形成速度 の計算を可能にする。 腸骨生検 ： ２つの腸骨稜(crest)生検を、個々の動物から、片側から一つずつ、収集した 。得られたデータに基づいて（表１０）、卵巣摘出動物は、ホルモン置換動物の おおよそ二倍の網状組織の骨代謝回転速度を持ち、結果として年ごとに腸骨稜網 状骨の５０−１００％が置換された。存在する骨の大部分は、一年の間隔の間に 形成されるので、腸骨生検の組織形態計測分析を一年間隔で行うと、網状骨内の 機能変化の特徴付けが可能になる。左の腸骨稜生検を基準線として、そして処理 開始後一年に右の回腸から、無菌状態で集めた。サルの腸骨生検用に発見者らに よって開発された方法では、皮質骨および網状骨が、分析用の適当な骨の領域お よびその周辺と共に、提供される（ＧｏｏｄｗｉｎおよびＪｅｒｏｍｅ、１９８ ７）。 骨の組織学的プロセシング ： 組織形態計測：組織形態計測分析のための腸骨生検および剖検の骨の標本を、 ７０％エタノールで固定し、プロセシングし、メチルメタクリレート／ジブチル フタレー中に包埋し、そして以下の方法の片方または両方で切片化した：１） ＬＫＢ Ｍａｃｒｏｔｏｍｅ ｓｌｅｄｇｅ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅまたはＪｕｎ ｇ Ｓｕｐｅｒｃｕｔ ｒｏｔａｒｙ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅで５−１０μｍに切 片化し、アルカリトルイジンブルーで染色しないかあるいは染色して、またはＶ ｏｎ Ｋｏｓｓａ法で修飾して、マウントする；か、または、２）Ｉｓｏｍｅｔ ｓａｗ（Ｂｕｅｈｌｅｒ，Ｌａｋｅ Ｂｌｕｆｆ，ＩＬ）を用いて１００−１ ２５μｍに切片化し、Ｆａｘｉｔｒｏｎ ｃａｂｉｎｅｔ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐ ａｃｋａｒｄ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）内でマイクロラジオグラフィーを取 り、および／または、ガラススライドに置き、磨き、そして表面をｖｏｎ Ｋｏ ｓｓａの方法論によって染色する。 免疫細胞化学 ： 選択された剖検標本は、抗原性を維持するために、新たに 調製した冷４％パラホルムアルデセド中で固定し、以下の２つの方法の片方また は両方で処理した：１）（脱石灰化していない）メチルメタクリレート内に包埋 する：かまたは、２）１％ ＥＤＴＡ中で脱石灰化し、パラフィン包埋し、そし て免疫細胞化学的または原位置でのハイブリダイゼーション研究のために連続的 に切片化した。発明者らは、骨関連タンパク質の存在および／または生成の評価 を可能にする確実な技術を開発した（Ｔｕｌｌｉら、１９９２：Ｃａｒｌｓｏｎ ら、１９９３）。 複数の骨膜の榎準的組織形態測定 ： 本研究は、Ｐａｒｆｉｔｔら（１９８７ａ）に記載された方法の修飾法を用い る。用いられた測定および省略は、ＡＳＢＭＲ標準命名法（Ｐａｒｆｉｔｔら、 １９８７ｂ）を基準にした。構造的および動的パラメーターは、骨膜（Ｐｓ）、 Ｃｌｏｐｔｏｎ Ｈａｖｅｒｓの記載した種々の骨構造（Ｈ）、軟骨（Ｅｃ）、 および網状（Ｃｎ）の骨膜について、別々に誘導した。また、骨体積を、Ｈ＋Ｅ ｃおよび結合したすべての（Ｔｔ）膜について計算した。この分析は、主に、骨 での動的（機能的）変化の分析に価値があり、骨のマクロ−およびミクロ−建築 的変化への皮質−骨内膜および網状膜の相対寄与の評価を可能にする。この方法 を用いると、実験的操作から、結果として生じる構造変化への異なる膜の相対寄 与を決定することが可能である。この分析に含まれうるさらなるパラメーターは 、浸食深度および壁厚測定であり、リモデリングサイクル当たりの骨平衡および 活性化頻度を測定する（Ｃｏｈｅｎ−Ｓｏｌａｌら、１９９１）。この分析は、 時間を浪費し、自動化された方法の補助としてでさえ、骨当たり一切片が実行で きるのみである。 複数の骨切片の自動組織形態計測分析 ： 大腿骨頸、大腿骨骨幹、腰椎および遠位橈骨の複数の横断切片をＩｓｏｍｅｔ ｓａｗで切断し、表面を染色し、および／またはマイクロラジオグラフィーを 撮り、そしてＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを装備した Ａｐｐｌｅ Ｐｏｗｅｒ ＰＣを用いて分析した。マイクロラジオグラフィーを 撮るかまたはｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色した切片は、カラ−カメラて得られた灰色 薄片の像の閏閾化(thresholding)によって、骨と骨髄を容易に識別することがで きる充分な高さの明暗を持つ。閾値化された灰色薄片像を、測定を迅速に得るこ とのできる（黒と白の像として表すことのできる）二元的小片マップに変換した 。 剖検および組織の収集 ２４ヶ月にＤＥＸＡスキャニングを行った後、動物を剖検ラボラトリーに送る ために、さらに塩酸ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で鎮静させた。ペントバル ビタールナトリウム（１３ｍｇ／ｋｇ体重）を、静脈内に投与し、外科麻酔した 。リンゲル溶液輸液を、左心室内に挿入した１８ゲージの針を通して、開始する 。５ｍｌ（３２５ｍｇ）のペントバルビタールナトリウムの静脈内注射で、安楽 死させた。腹部下大動脈を１ｃｍ縦切開すると、心臓血管システムからの血液ド レナージが可能になる。心臓および主な血管を切開し、１００ｍｍ／Ｈｇ圧力下 で１時間、１０％の中性バッファー化ホルマリン（ＮＢＦ）で灌流調製した。心 臓、大動脈および頸動脈および腸骨動脈を注意深く自由に切開し、さらに調製す るまで、液侵を１０％ＮＢＦ中で固定した。頭蓋内動脈を含む脳を取り除き、液 侵を２０％ＮＢＦ中で固定した。主要器官システムのすべてを全体的に試験した 。生殖、内分泌、心臓血管およびその他の柔組織を収集し、４％パラホルムアル デヒ ド中で固定し、および／そして液体窒素ですばやく凍結し、そして注意深く処埋 による変化を評価した。 柔組織を死体から取り除いた後、エキソビボで、両方の大腿頭を高分解能のＤ ＥＸＡによってスキャニングすると、大腿頭、ウオード三角および中央骨幹（皮 質骨）を含む、ＢＭＣの部位による差が描かれる。両上腕骨、右大腿骨、および ３および４の腰椎を対で、湿潤（リンゲル溶液または食塩水）ゲージ内で表面を 覆い、見分けられるようにタグを付け、適当に標識したＺｉｐｌｏｃ^Rバック内 に入れ、−２０℃で凍結し、さらなる研究に必要な時に用いた。 組織形態計測分析のために、左撓骨および２および５の腰椎および６から９ま での胸椎を７０％エタノール中で固定した。ＤＥＸＡスキャニングのために左大 腿骨を１０％ＮＢＦ中に置き、７０％エタノール中に移した。関節軟骨および肋 軟骨下の関節炎を評値するために、両膝を１０％ＮＢＦ、後に７０％エタノール 中で固定した。（背面弓および横突起を取り除いた後）Ｉｓｏｍｅｔ ｓｏｗを 用いて胸骨分節および胸椎１３を縦切片化（厚さ１−３ｍｍ）し、冷４％パラホ ルムアルデヒドで固定した。２４時間後、これらの切片を４０％エタノールに移 した。スワブを免疫細胞化学用に加工処理し（Ｔｕｌｌｉら、１９９２）、原位 置でハイブリダイゼーションした。 生体力学試験 凍結した骨を、生体力学骨折試験および骨強度分析に供した。機械的試験には 、大腿骨頸部の剪段試験、上腕骨中央骨幹部の三点屈曲、および椎骨疲労が含ま れる。 冠状動脈アテローム性動脈硬化症の評価 冠状動脈アテローム性動脈硬化症の範囲および重さを研究するために、動脈の 長軸に垂直に１５断片（それぞれの長さ３ｍｍ）に切断した。これらの内の５断 片は、左回旋からの、５断片は左全面下行からの、５断片は右冠状動脈からの、 一連の断片であった。エタノール濃度を増加させて、組織断片を脱水し、パラフ ィン内に包埋した。２切片（５μｍ）をそれぞれの断片から切り出し、ヘマトキ シリンおよびエオシン、またはＶｅｒｈｏｅｆｆ−ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色の いずれかで染色し、形態計測学的に評価した。Ｖｅｒｈｏｅｆｆ−ｖａｎ Ｇｉ ｅｓｏｎ染色した動脈切片を、デジタイザー(digitizer)プレート上、投射顕微 鏡を用いて、投影した。手づかみ筆状突起およびコンピューター装備のデジタイ ザーを用いて、動脈成分を透写した。 内膜領域、内弾性板の単位長当たりの内膜領域、内弾性膜内領域、および冠状 動脈管腔領域の測定を行った。内膜領域は、内弾性板およびそれぞれの冠状動脈 切片の板表面の間の領域をデジタイズ(digitize)することによって、測定した。 積分法を、内膜領域の計算に用いた。内膜領域はプラークサイズを描いている。 内弾性板の単位長当たりの内膜領域を得るために、内弾性板の長さで内膜領域を 割った。この測定は、冠状動脈の得られた切片の平均内膜厚に関する情報を提供 する。内弾性板（周囲）の長さを用いて、領域を計算した。この測定は、動脈サ イズを特徴付ける。外弾性板領域を測定することができるが、その正確な位置の 判定は、内弾性板の位置ほどは明確ではない。２つの測定値は、高い相関性を持 ち、このことから、内弾性板を、サイズメジャーとして用いた。 柔組織評価 その他の全柔組織切片は、ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、そして ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、評価した。 データの分析および解釈 統計学的方法 変動（ＡＮＯＶＡ）または共変（ＡＮＣＯＶＡ）の繰り返し測定分析を用いる か、または適当なノンパラメトリック法によって、組織形態計測、デンシトメト リー、ならびに血清および尿中の化学測定のような、順々のサンプリングによっ て得られた値を分析した。任意の２つのデータ点の比較に興昧が持たれるところ で、適当なパラメトリック（ｔ−統計値）またはノンパラメトリック（Ｍａｎｎ −ＷｈｉｔｎｅｙまたはＷｉｌｃｏｎｘｏｎ）試験を用いた。回帰および相関モ デル（パラメトリックおよびノンパラメトリック）を用いて、例えば、形態組織 計測および吸収計測測定の間の相互作用の様な、変数間の関連性を試験した。直 線的および曲線的回帰分析を用いて、時間当たりの変化の速度を試験した。表さ れたすべてのパラメトリック分析には、ＳｏｋａｌおよびＲｏｈｌｆ（１９８１ ）の方法を用い、ノンパラメトリック分析には、Ｓｉｅｇｅｌ（１９５６）の方 法を用いた。 以下の実施例は、本発明の好まし実施態様を説明するために含まれる。本技術 は、本発明の実施にあたって良く機能するように発明者らが発見し示された技術 に従って、その実施に関して好ましいモデルを構築するように考察することので きる、実施例内に開示されることを、当業者らは認識すべきである。しかしなが ら、本開示にかんがみて、開示される具体的実施態様で多くの変化を作り出すこ とができ、本発明の精神および範囲から離れることなく同様のまたは類似の結果 を得ることができることを、当業者らは認識している。 実施例１ 霊長類における経口避妊薬の骨代謝への影響 動物 ２０７匹の雌カニクイザル(ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ)(Ｍａｃ ａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ)は、避妊薬ステロイド（Ｔｒｉｐｈａｓｉ １^R）の閉経前使用がＣＡＡの進行および外科的閉経後の卵巣摘出に影響を及ぼ すか否かを決定するために設計された、比較臨床試験の一部であった。動物の（ 歯列で評価した）平均年齢は、おおよそ６年であり、グループ間の有意な差（ｐ ＞０．４０）はなかった。２０７匹の動物を、１０３匹の未処置動物（対照）お よび１０４の経口避妊薬（Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^R）処置−動物の２つの処置グル ープのどちらかに、ランダムに配分した。歪度を減少させ、グループ間変動を等 しくすることが必要であれば、ここに示したデータを変形させ、変動分析（ＡＮ ＯＶＡ）および共変の繰り返し測定分析（ＡＮＣＯＶＡ）にかけた。示したすべ ての データは、非変形データの平均値±ＳＥＭで表す。繰り返し測定ＡＮＯＣＯＶＡ によって、０、１０および２０ヶ月の骨の縦のデンシトメトリーデータを分析し た。０ヶ月のデータ（基準線）を用いて、処理前の変化を調整した。 薬剤投与：雌カニクイザルは、平均女性のおおよそ１７％のカロリー（服用量 ）または約３０６カロリー／日、を消費する。経口避妊薬投与量は、１２０カロ リー／ｋｇ体重（または平均の成人女性で１８００カロリー／日）の概算された カロリー摂取に基づいたヒトでの投与量に近くなるように計算され、食餌に混合 して与えられた。従って、Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^Rで処置されたサルには、４種類 の別々の食餌調合物（１−７日、ホルモンを含まず；８−１３日、０．０３ｍｇ のエチニルエステラジオールおよび０．０５ｍｇのレボノルゲストレル；１４− １８日、０．０４ｍｇエチニルエステラジオールおよび０．０７５ｍｇレボノル ゲストレル；１９−２８日、０．０３ｍｇエチルエステラジオールおよび０．１ ２５ｍレボノルゲストレル）を与えた。 食餌は、０．５５ＩＵビタミンＤ₃／カロリー（１６８ＩＵ／日）、１．７５ ｍｇカルシウム／カロリー（５３５ｍｇ／日）、および１．４９ｍｇリン／カロ リー（４５６ｍｇ／日）（カルシウム／リン比率１．１７）を含んでいた。カル シウム摂取のこのレベルは、１８００カロリー／日を消費する女性では、３１４ ７ｍｇカルシウム／日と換算されるこの量は、若年女性に推奨されるカルシウム 摂取（１０００ｍｇ／日）（Ｋａｎｄｅｒｓら、１９８８）の＞３倍であり、閉 経後女性に推奨される１５００ｍｇ／日のカルシウム摂取の２倍より多い。食餌 中のビタミンＤ₃のレベルは、女性に推奨される毎日の投与量の約２倍に相当す る。 骨デンシトメトリー：腰椎（Ｌ２−Ｌ４）の骨ミネラル含有量（ＢＭＣｓｐ、 ｇ）および密度（ＢＭＤｓｐ、ｇ／ｃｍ²）ならびに全身の骨ミネラル含有量（ ＢＭＣｗ、ｇ）を、Ｎｏｒｌａｎｄ ＸＲ２６ ｄｕａｌ−ｅｎｅｒｇｙ Ｘ− ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｅｒ（ＤＥＸＡ；Ｎｏｒｌａｎｄ，Ｆｔ．Ａ ｔｋｉｎｓｏｎ，ＷＩ）で測定した。２０７匹の動物を、０時間および処置１ ０ヶ月後にそれぞれ−回、スキャニングし、さらに、これらの内１８８匹は、処 置２０ヶ月後にスキャニングした。ＢＭＣｓｐは、どの時点でもグループ間に有 意の差異はなかった。ＢＭＤｓｐは、０時間ではグループ間に有意の差はなかっ たが、１０ヶ月ではＴｒｉｐｈａｓｉｌＲグループは有意により低くなり（ｐ＜ ０．０５）、処置２０ヶ月後も有意により低いままであった。ＢＭＣｓｐおよび ＢＭＤｓｐは両方とも時間と共に増加するが、グループＸ時間の相互関係は有意 であり、このことは、処置グループが時間を通して差別的に変化することを示唆 している。 Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^R動物では、未処理対照と比較して、時間を通してＢＭＣ ｓｐおよびＢＭＤｓｐの増加がより少なかった。また、ＢＭＣｗは、両グループ 共、時間と共に増加し、また、グループＸ時間の相互関係は有意であった。Ｔｒ ｉｐｈａｓｉｌ^R動物は、処置１０ヶ月後、対照より少ないＢＭＣｗが得られた 。 血清バイオマーカー；骨代謝の循環マーカーを評備するために、血清を処置前 および処置中５ヶ月間隔で規則的に収集した。サンプリングは、ホルモン養生法 の２１日に行った。血清ＡＬＰ（Ｕ／Ｌ）、ＡＣＰ（Ｕ／Ｌ）、ＴＲＡＰ（Ｕ／ Ｌ）、カルシウム（Ｃａ²⁺、ｍｇ／ｄｌ）および無機リン酸（Ｐｉ、ｍｇ／ｄｌ ）を、Ｃｏｂａｓ Ｆａｒａ １１自動分析装置使用プロトコールおよびＲｏｃ ｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ（Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ） から供給された試薬を用いて、定量した。血清ＡＬＰレベルは、Ｔｒｉｐｈａｓ ｉｌ^Rグループでは、基準値と比較して約４３％減少したが、これに対してコン トロールグループでは、基準値と比較してわずかに減少（１２％）したのみであ る。研究の経過の間、Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^R−処置動物での血清ＡＬＰ活性は、 コントロールグループでの血清ＡＬＰ活性のおおよそ５５−６０％であった。血 清ＡＣＰおよびＣａ²⁺もまた、ＴｒｉｐｈａｓｉｌＲ動物では有意により低かっ たが、これに対してＴＲＡＰへの有意な処置効果は認めらず、血清Ｐｉレベルで は循環効果が認められた。結果として、Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^Rグループは、骨吸 収（ＡＣＰ）および骨形成（ＡＬＰ）の血清マーカーが減少していた。 血清アンドロゲンレベル；経口避妊薬の使用は、２０−３０％（ｐ＜０．０１ ）の血清ＤＨＥＡＳおよびＡの時間依存性抑制、および３０−３５％（ｐ＜０． ０１）の全Ｔおよび６０％（ｐ＜０．０１）のｆＴレベルの有意の減少の原因と なるが、これに対して、ＳＨＢＧは、１１−２１日に２００−２４０％（ｐ＜０ ．０１）に増加した。この結果は、アンドロゲンレベルおよび周辺アンドロゲン 代謝が徹底的に抑制されることを示している（Ｗｉｅｇｒａｔｚら、１９９５： Ｋｕｈｎｚら、１９９４）。 サルでの研究では、血清を１０および２０ヶ月に収集し、全Ｔ、ＡおよびＤＨ ＥＡＳを測定した。表４に示すように、Ｔｒｉｐｈａｓｉｌ^Rグループは、コン トロールグループよりアンドロゲンの血清レベルがおおよそ半分である。 表４．閉経前のサルの血清アンドロゲン濃度（平均値±ＳＥＭ） 人体計測定およびデンシトメトリー測定 様々な時間点での２つの処置グループの人体計測およびデンシトメトリー測定 （平均±ＳＥＭ）を、表５に示している。表５に示したように、グループ当たり の観察数は、０および１０ヶ月の時点でのデンシトメトリーデータは２０７動物 から得られ、２０ヶ月の時点では１８８動物から得られた様に、研究中時間と共 に減少した。このような理由から、各々の時点では始めに別々に分析される。体 重、体幹長、ＢＭＣｗおよびＢＭＣｓは、どの時間点でもグループ間での有意な 差はなかった。ＢＭＤｓは、０時間ではグループ間に有意な差はなかったが、１ ０ヶ月では避妊薬グループで有意により低くなり、処置２０ヶ月後でも有意に低 いままであった。 表５ プラシーボ（ＣＯＮＴＲＯＬ）または避妊薬（ＣＯＮＴＲＡＣＥＰＴＩＶＥ）を 摂取した、２０７匹（０および１０ヶ月）および１８８匹（２０ヶ月）の完全な 雌カニクイマカークザルの身体計測およびデンシトメトリーデータの個々の時点 での比較の変数分析および変数分析（ＡＮＯＶＡ）。値は、平均値±ｓ．e． 第三の時間点（２０ヶ月）では、観察数が減少したので、データは、０および １０ヶ月データの変数の２ｘ２分析で分析した。長期間の影響を試験するために 、すべての３種類の時点のすべてを２ｘ３ＡＮＯＶＡで、または処置前測定で調 整した１０および２０ヶ月での測定を２ｘ２ＡＮＣＯＶＡで分析した。 これらの変数の０および１０ヶ月でのＡＮＯＶＡの繰り返し測定からの結果を 表６に示している。基準値ではグループ間に差のない体重は、食事時間と共に両 グループで有意に増加した。体幹長へのグループまたは時間の影響は、最初１０ ヶ月を通して認められなかった。腰椎（Ｌ２−Ｌ４）ＢＭＣおよびＢＭＤは両方 とも時間と共に増加したが、グループｘ時間の相互作用は有意であり、このこと から、処置グループによって時間と共に差別的に変化することが示唆される。経 口避妊薬処置動物は、非処置グループと比較して、時間の経過と共に腰椎のＢＭ ＣおよびＢＭＤのより少ない増加を示した。全身ＢＭＣはまた、両グループとも 時間と共に増加し、また、グループｘ時間の相互作用は有意であった。避妊薬− 処置動物は、処置１０ヶ月後、コントロールよりより少ないＢＭＣが得られた。 表６ プラシーボ（ＣＯＮＴＲＯＬ）または避妊薬（ＣＯＮＴＲＡＣＥＰＴＩＶＥ）を 摂取した、０ヶ月（基準線）および処置１０ヶ月後の２０７匹の完全な雌カニク イマカークザルの身体計測およびデンシトメトリーデータ測定についての変化の 繰り返し測定分析。 １、１０および２０ヶ月の長さの身体計測および骨デンシトメトリーデーター を、繰り返し測定（ＡＮＣＯＶＡ）によって分析した。０ヶ月（基準線）からの データを用いて、処置前偏差を調整した。３つの時点のすべてで評備を受ける動 物からのデータのそれぞれの平均および標準偏差を、ＡＮＣＯＶＡ統計および調 整した細胞平均（表７および８）と共に示している。値は、不完全データを排除 したため、表５に示した値からはわずかに変化している。最初１０ヶ月にわたっ て有意の増加した体重は、その後の１０ヶ月にわたっては変化せず、グループま たはグループｘ時間の相互作用は、示されなかった（表７）。体幹長は、両グル ープ共非常にわずかな増加によって証明されるように時間を通して増加したが、 クループまたはグループｘ時間の相互作用は、認められなかった。 表７ ０、１０および２０ヶ月の時点からの完全な人体計測データについての 変化¹および共変²の繰り返し測定分析（グループ平均±ｓｅｍ） ¹［非共変］、グループｐ＝０．０６；時間ｐ＝０．００； クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．９８ ²［共変＝０ヶ月のＢＷ］、グループｐ＝０．７５；時間ｐ＝０．５９： クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．９２ ¹［非共変］、グループｐ＝０．２６；時間ｐ＝０．００； クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．４０ ²［共変＝０ヶ月のＢＷ］、グループｐ＝０．１７；時間ｐ＝０．０１： クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．８６ 処置前（０時間）の差異を調整した後、グループ、時間、およびグループｘ時 間の影響が、腰椎骨ミネラル含有量および密度に、有意に認められた（表８）。 脊椎ＢＭＣおよびＢＭＣは、０−１０ヶ月の間、両グループで増加したが、１０ −２０ヶ月の間に起こった増加はこれよりは非常により少なかった。避妊薬処置 した動物は、コントロールと比較して骨の形成速度が減少し、結果として、処置 １０および２０ヶ月では、より低い脊椎ＢＭＣおよびＢＭＣが得られた。また、 グループ、時間、およびグループＸ時間の有意な相互作用も、全身ＢＭＣで認め られた。全身ＢＭＣは、最初の１０ヶ月にわたって、コントロールおよび避妊薬 処置動物の両方で有意に増加し、次の１０ヶ月ではコントロールグループでわず かに増加したが、避妊薬グループではわずかに減少した。 表８ ０、１０および２０ヶ月の時点からの完全な骨デンシトメトリーデータについて の変数および共変の繰り返し測定分析（グループ平均値±ｓｅｍ）。 （共変分析によって調整した平均値を括弧［］内に示している。） ¹［非共変］、グループＰ＝０．７８：時間Ｐ＝０．００； クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．９８ ²［共変＝０ヶ月のＢＭＣ（脊椎）体幹長］、 グループｐ＝０．００：時間ｐ＝０．００： クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．００ ¹［非共変］、グループＰ＝０．１２：時間Ｐ＝０．００； クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．００ ²［共変＝０ヶ月のＢＭＤ（脊椎）、ＢＭＣ（脊椎）］、 グループｐ＝０．００；時間ｐ＝０．００： クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．００ ¹［非共変］、グループＰ＝０．６１；時間Ｐ＝０．００； クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．００ ²［共変＝０ヶ月のＢＭＣ（全身）、ＢＭＣ（脊椎）］、 グループｐ＝０．００；時間ｐ＝０．７１： クループｘ時間の相互作用ｐ＝０．００骨のバイオマーカー 血清バイオマーカーの分析結果を表９に示している。観察数が時間により変化 するため、グループの比較は、それぞれの個々の時間点で行われた。血清アルカ リホスファターゼレベルは、避妊薬グループの処置前（時間０）値と比較して約 ４３％減少したが、対照グループでは処置前の値と比較してわずかに減少した（ １２％）のみである。処置過程の間、避妊薬処置動物の血清アルカリホスファタ ーゼ活性は、対照グループで認められた値のおおよそ５５−６０％であった。血 清酸性ホスファターゼおよびカルシウムもまた、避妊薬グループでは有意に低か ったが、酒石酸耐性酸性ホスファターゼまたは血清リン酸レベルには一貫した影 響は認められなかった。このように、避妊薬グループでは、骨吸収（酸性ホスフ ァターゼ）および骨形成（アルカリホスファターゼ）の血清マーカーが減少した 。 上記の生化学的知見から、経口避妊薬処置は、これら動物の骨代謝回転を全体 的に減少させる原因となると、考えられる。エストロゲン置換治療は、卵巣摘出 したサルの全体の代謝回転速度を減少することにより、骨密度を保存すると考え られるため、骨の代謝回転速度の減少は、通常、骨ミネラルの保存と関連する。 しかしながら、この場合では、経口避妊薬処置が、コントロール動物と比較して 網状骨のミネラル密度への明らかな負の影響と共に、骨代謝回転のバイオマーカ ーを結果として減少させた。 長期間の経口避妊薬処置が網状骨の蓄積を減少させ、まだ骨が蓄積しつつある 若年の雌ザルの骨質量ピークを結果として低くすることが、これらデータは示し ている。 表９：血清バイオマーカーデータの個々の時点比較ので変数分析 実施例２ 閉経後のザルへのエストロゲンの影響：骨の組織学および生体力学 本実施例は、閉経後ザルでの研究からの組織形態計測データを示している。骨の組織形態計測 エストロゲン−欠損の卵巣摘出ザルと同様に、処置されていない卵巣摘出女性 では、骨の代謝回転が増加する場合の正味の影響は骨の損失である。以前の報告 では、血清マーカーおよび組織形態計測データの間に良好な相互作用が示された （Ｊｅｒｏｍｅら、１９９４）。処置１１ヶ月後のサルの腸骨および腰椎骨の網 状骨で卵巣摘出後に起こる構造変化を研究した（Ｊａｙｏら、１９９５）。動物 は、左右両側の卵巣を摘出され、３グループ：１）未処理（ＯＶＸ）、２）エス トロゲン置換治療を受けた（ＥＲＴ）、および３）ＥＲＴ＋チアザイド利尿剤治 療を受けた（ＥＲＴ＋ＴＺ）：に分けた。表１０は、腸骨網状骨の組織形態計測 の情報を提供している。 表１０ ＯＶＸ，ＯＶＸ＋ＥＲＴ、およびＥＲＴ＋ＴＺのサルの腸骨網状骨の構造的組織 形態計測（平均値±ＳＥＭ、Ｊａｙｏら、１９９５から引用した） 卵巣摘出から２５ヶ月後のサルの脊椎網状（腰椎）骨の中央矢状縫合切片で、 構造変化が証明された（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９２；Ｊｅｒｏｍｅら、１９９ ４）。脊椎網状骨体積および小柱厚に有意の差異が認められたが、小柱数または グループ間の分離に有意な差異は認められなかった（表１１）。 表１１ 卵巣摘出した（ＯＶＸ）、ＯＶＸ＋１７−βエステラジオール（ＥＲＴ）および ＯＶＳ＋１７−βエステラジオール＋プロゲステロン−処置した（ＥＲＴ＋Ｐ） カニクイサルの脊椎網状骨の構造的および動的組織形態計測 （Ｊｅｒｏｍｅら、１９９４、引用した）。 ^*p<0.05対ＯＶＸおよびＥＲＴ †p<0.05対OVX ‡p<1.0対ERT 要約すると、血清バイオマーカーおよび形態組織計測データから、骨形成速度 は、サルの外科手術による閉経後著しく増加し、また、骨の代謝回転は、一般的 には、少なくとも２年間上昇したままであることが、示された。この機能的変化 は、格子構造の骨の構築上の変化によって成し遂られ、そして構造的エレメント を損失させる方向に傾き、また、構造的エレメントの損失と一致する。構造的エ レメントを損失する成り行きを試験するために、卵巣摘出動物の骨の骨折を起こ す原因となるために必要とされる生体力学的力を試験した。骨の生体力学的試験 手術３０ヶ月後のＩＮＴおよびＯＶＸのマカークザルから収集したケイ骨を収 集し、凍結し、Ｉｎｓｔｒｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｙｓ ｔｅｍ（ＫａｓｒａおよびＧｒｙｎｐａｓ、１９９２）を用いて試験した。軸中 央を非破壊的３点屈曲試験にかけて、弾性係数を決定し、次いで、破壊的ねじれ 試験にかけて、煎断係数および破壊的前煎断ストレスを測定した。また、軸中央 の交差部分領域も、測定した。交差部分領域は、グループ間に差異はなかったが 、その他のパラメーターはすべて、ＩＮＴ動物と比較してＯＶＸ動物で有意に低 く（ｐ＜０．０５）、このことは、骨の力学的性質が閉経後弱くなり、脆弱性が 増すことを示している（表１２）。 表１２ 外科手術３０ヶ月後の完全な（ＩＮＴ）および卵巣摘出した（ＯＶＸ）カニクイ マカークザルの脛骨の力学的性質（平均値±ＳＤ、２尾のｔ−テスト） 骨の生体力学的性質へのアンドロゲンの影響を、完全な雌ザル（ＩＮＴ）、ア ンドロステンジオン＋Ｅ₁（ＡＮＤＲＯ）で処置した完全なサル、およびテスト ステロン（ＴＥＳＴＯ）で処置した完全なサルで、評価した（Ａｄａｍｓら、１ ９９５；ＫａｓｒａおよびＧｒｙｎｐａｓ、１９９５）。この研究に於いて、Ｔ ＥＳＴＯサルは、卓越した生理学的レベル（Ｔ）を受け取り、雄ザルと類似の血 液レベル（Ｔ）および雄の身体的組成をもそれらに与えた。大腿頭からのコアサ ンプルについて研究し、その結果を表１３に示している。 表１３ 処置後３０ヶ月のＩＮＴ、ＡＮＤＲＯおよびＴＥＳＴＯカニクイマカークザルの 大腿柱骨の力学的性質（平均値±ｓｄ、ｎ＝１２／グループ）。Ｋａｓｒａｒａ 、１９９５から引用した。共通のシンボルは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５ ）。 大腿骨もまた、生物力学的に試験し、ＴＥＳＴＯグループは、より強く、より 頑丈で、より堅い大腿骨を持っていた（ＫａｓｒａおよびＧｒｙｎｐａｓ、１９ ９５）。 これらの骨の研究から、外科的閉経後のマカークザルの骨格変化は、閉経後の 女性に起こるそれらと類似しており、骨代謝回転の増加、骨質量の減少、網状骨 微小構造の変化、および骨強度の歩み寄りを含むと、考えられる。これらの変化 は、プロゲスチンを伴うかまたは伴わないＥＲＴによって防止される。閉経前の サルでは、骨強度は、より強く密集した骨を持つＴ処理動物と共に、アンドロゲ ン処理動物において増加する。 実施例３ 閉経前のサルでのアテローム性動脈硬化症に関する研究 完全な雌のカニクイマカークザルへのＣＡＡへの経口避妊薬の影響が研究され ている（Ｃｌaｒｋｓｏｎら、１９９０）。この研究では、若年成体の雌のカニ クイマカークザルは、アテローム発生性食餌を摂取し、３つのグループ：対照グ ループ；エチニルエステラジオールおよびノルゲストレルを与えられたグループ ：および、エステラジオールおよびエチノジオール二酢酸を与えられたその他の グループ：に分けた。避妊薬調合物は両方共、ＨＤＬコレステロールを低くした 。しかしながら、ＣＡＡの範囲は、両方の避妊薬によってより小さくなった。 発明者らは、食餌で誘導したアテローム性動脈硬化症にかかった雌ザルでの実 験的に誘導された偽半陰陽の影響について研究した（Ａｄａｍｓら、１９９５） 。３０ヶ月後、ＣＡＡは、未処理ＩＮＴ動物と比較してＴＥＳＴＯ動物では、お およそ二倍の広範さである（ｐ＜０．０５）が、これに対して、ＡＮＤＲＯ処理 は、アテローム性動脈硬化症の程度に影響を与えなかった。Ｔのアテローム発生 効果は、血清のリポタンパク質の危険変数に依存しなかった。アテローム性動脈 硬化症の程度は、ＴＥＳＴＯサルでより大きく、血管運動活性は、ＩＮＴサルの それと同様であった。エチニルエステラジオール治療にメチルテストステロン（ ＭＴ）を加えた場合、外科手術による閉経後サルの動脈血管運動が改善されない ことを、研究者らは発見した。ＭＴ療法は、動脈壁へのエチニルエステラジオー ルの有益な影響を抑制しないであろう。 実施例４ 以下のような、２８の錠剤を含む経口避妊薬調合物：月経周期の８−１３日に 連続して摂取される、０．０３ｍｇのエチニルエステラジオール、０．０５ｍｇ のレボノルゲストレルおよび０．２５ｍｇのメチルテストステロンを含む６つの 錠剤；月経周期の１４−１８日に連続して摂取される、約０．０７５ｍｇのレボ ノルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む５つ の錠剤；月経周期の１９−２８日に連続して摂取される、約０．１２５ｍｇのレ ボノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む１ ０の錠剤；および、月経周期の１−７日に摂取される経口避妊薬ホルモンを含ま ない７つのプラシーボ錠剤。 実施例５ 以下のような、２８の錠剤を含む経口避妊薬調合物：月経周期の８−１３日に 連続して摂取される、０．０３ｍｇのエチニルエステラジオール、０．０５ｍｇ のレボノルゲストレルおよび０．３ｍｇのメチルテストステロンを含む６つの錠 剤：月経周期の１４−１８日に連続して摂取される、約０．０７５ｍｇのレボノ ルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む５つの 錠剤；月経周期の１９−２８日に連続して摂取される、約０．１２５ｍｇのレボ ノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む１０ の錠削；および、月経周期の１−７日に摂取される経口避妊薬ホルモンを含まな い７つのプラシーボ錠剤。 実施例６ 以下のような、２８の錠剤を含む経口避妊薬調合物：月経周期の８−１３日に 連続して摂取される、０．０３ｍｇのエチニルエステラジオール、０．０５ｍｇ のレボノルゲストレルおよび０．５ｍｇのメチルテストステロンを含む６つの錠 剤；月経周期の１４−１８日に連続して摂取される、約０．０７５ｍｇのレボノ ルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む５つの 錠剤；月経周期の１９−２８日に連続して摂取される、約０．１２５ｍｇのレボ ノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む１０ の錠剤；および、月経周期の１−７日に摂取される経口避妊薬ホルモンを含まな い７つのプラシーボ錠剤。 実施例７ 以下のような、２８の錠剤を含む経口避妊薬調合物：月経周期の８−１３日に 連続して摂取される、０．０３ｍｇのエチニルエステラジオール、０．０５ｍｇ のレボノルゲストレルおよび０．７５ｍｇのメチルテストステロンを含む６つの 錠剤；月経周期の１４−１８日に連続して摂取される、約０．０７５ｍｇのレボ ノルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む５つ の錠剤；月経周期の１９−２８日に連続して摂取される、約０．１２５ｍｇのレ ボノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む１ ０の錠剤；および、月経周期の１−７日に摂取される経口避妊薬ホルモンを含ま ない７つのプラシーボ錠剤。 実施例８ 以下のような、２８の錠剤を含む経口避妊薬調合物：月経周期の８−１３日に 連続して摂取される、０．０３ｍｇのエチニルエステラジオール、０．０５ｍｇ のレボノルゲストレルおよび１．０ｍｇのメチルテストステロンを含む６つの錠 剤；月経周期の１４−１８日に連続して摂取される、約０．０７５ｍｇのレボノ ルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む５つの 錠剤；月経周期の１９−２８日に連続して摂取される、約０．１２５ｍｇのレボ ノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニノレエステラジオールを含む１ ０の錠剤；および、月経周期の１−７日に摂取される経口避妊薬ホルモンを含ま ない７つのプラシーボ錠剤。 実施例９ 以下のような、２８の錠剤を含む経口避妊薬調合物：月経周期の８−１３日に 連続して摂取される、０．０３ｍｇのエチニルエステラジオール、０．０５ｍｇ のレボノルゲストレルおよび１．５ｍｇのメチルテストステロンを含む６つの錠 剤；月経周期の１４−１８日に連続して摂取される、約０．０７５ｍｇのレボノ ルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む５つの 錠剤；月経周期の１９−２８日に連続して摂取される、約０．１２５ｍｇのレボ ノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む１０ の錠剤；および、月経周期の１−７日に摂取される経口避妊薬ホルモンを含まな い７つのプラシーボ錠剤。 実施例１０ 以下のような、２８の錠剤を含む経口避妊薬調合物：月経周期の８−１３日に 連続して摂取される、０．０３ｍｇのエチニルエステラジオール、０．０５ｍｇ のレボノルゲストレルおよび１．５ｍｇのメチルテストステロンを含む６つの錠 剤；月経周期の１４−１８日に連続して摂取される、約０．０７５ｍｇのレボノ ルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む５つの 錠剤；月経周期の１９−２８日に連続して摂取される、約０．１２５ｍｇのレボ ノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む１０ の錠剤；および、月経周期の１−７日に摂取される経口避妊薬ホルモンを含まな い７つのプラシーボ錠剤。 実施例１１ 以下のような、２８の錠剤を含む経口避妊薬調合物：月経周期の８−１３日に 連続して摂取される、０．０３ｍｇのエチニルエステラジオール、０．０５ｍｇ のレボノルゲストレルおよび０．２５ｍｇのメチルテストステロンを含む６つの 錠剤；月経周期の１４−１８日に連続して摂取される、約０．０７５ｍｇのレボ ノルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオール、および約 ０．２５ｍｇのメチルテストステロンを含む５つの錠剤；月経周期の１９−２８ 日に連続して摂取される、約０．１２５ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０． ０３０ｍｇのエチニルエステラジオール、０．２５ｍｇのメチルテストステロン を含む１０の錠剤；および、月経周期の１−７日に摂取される経口避妊薬ホルモ ンを含まない７つのプラシーボ錠剤。実施例１２ 以下のような、２８の錠削を含む経口避妊薬調合物：月経周期の８−１３日に 連続して摂取される、０．０３ｍｇのエチニルエステラジオール、０．０５ｍｇ のレボノルゲストレルおよび０．５ｍｇのメチルテストステロンを含む６つの錠 剤；月経周期の１４−１８日に連続して摂取される、約０．０７５ｍｇのレボノ ルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオール、および約０ ．５ｍｇのメチルテストステロンを含む５つの錠剤；月経周期の１９−２８日に 連続して摂取される、約０．１２５ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３ ０ｍｇのエチニルエステラジオール、０．５ｍｇのメチルテストステロンを含む １０の錠剤；および、月経周期の１−７日に摂取される経口避妊薬ホルモンを含 まない７つのプラシーボ錠剤。 本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様について記載しているが、本 発明の概念、精神および範囲から離れることなく、本発明に記載された組成物、 方法および段階または方法の段階の順序を変化させることができることが、当業 者らには明らかであろう。さらに具体的には、化学的および物理的の両方で関連 するある薬剤を本明細書に記載した薬剤と置換することができ、同一または類似 の結果が得られることが、明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の 置換および修飾はすべて、添付クレイムに定義されたように、本発明の精神、範 囲および概念内にあると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 19/10 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 避妊薬使用者の骨蓄積の増強に有効な量のエストロゲン、プロゲスチ ンおよびアンドロゲンを含む、避妊薬製剤 ２． 前記アンドロゲンがメチルテストステロンである、請求項１記載の製 剤。 ３． さらに、一日の投与量当たり、約０．２ｍｇから約１．５ｍｇまでの メチルテストステロンを含むと定義される、請求項２記載の製剤。 ４． 前記の製剤が月経周期の約８−１３日の間投与される、請求項１記載 の製剤。 ５． 前記プロゲスチンが約０．０５０ｍｇのレボノルゲストレルであり、 前記エストロゲンが約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールである、請求 項１記載の製剤。 ６． （ａ） 月経周期の８日から約１３日まで毎日投与される、メチルテ ストステロン、レボノルゲストレルおよびエチニルエステラジオールを含む、製 剤： （ｂ） 月経周期の１３日に続いて毎日投与されるレボノルゲストレ ルおよびエチニルエステラジオールを含む製剤： を含む、経口避妊薬製剤。 ７， さらに、月経周期の１−７日の間毎日摂取されるプレシーボ組成物を 含む、請求項６記載の製剤。 ８． 組成物（ａ）が、さらに毎日の投与量当たり約０．２ｍｇから約１． ５ｍｇのメチルテストステロンを含むと定義される、請求項６記載の製剤。 ９． 製剤（ａ）が、さらに約０．０５０ｍｇのレボノルゲストレルおよび 約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含むと定義される、請求項８記 載の製剤。 １０． 組成物（ｂ）が、さらに； 月経周期の１４−１８日に摂取される約０．０７５ｍｇのレボノルゲストレルお よび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む、第一の組成物：およ び、 月経周期の１９−２８日に摂取される約０．１２５ｍｇのレボノルゲストレルお よび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む、第二の製剤： であると定義される、請求項６記載の製剤。 １１． 第一の製剤、第二の製剤、またはその両方が、さらに、毎日の投与量 当たり約０．２５ｍｇから約０．５ｍｇのメチルテストステロンを含むと定義さ れる、請求項１０記載の製剤。 １２． 毎日の投与量当たり、約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテスト ステロン、約０．０５０ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇの工 チニルエステラジオールを含む、経口避妊薬組成物。 １３． 以下の(ａ)〜(ｄ)のように、２８の錠剤として調合される経口避妊薬 組成物： （ａ） 約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチルテストステロン、約 ０．０５０ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステ ラジオールを含む、６つの錠剤； （ｂ） 約０．０７５ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０４０ ｍｇのエチニルエステラジオールを含む、５つの錠剤； （ｃ） 約０．１２５ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３０ ｍｇのエチニルエステラジオールを含む１０の錠剤；および、 （ｄ） ７つのプラシーボ錠剤。 １４． 組成物（ｂ）、組成物（ｃ）またはその両方が、さらに、錠剤当たり ０．２０ｍｇから０．５０ｍｇのメチルテストステロンを含む、請求項１３記載 の経口避妊薬組成物。 １５． 前記の錠剤が、それぞれ一錠ずつ保たれるように設計された２８の区 画を含むディスペンサー内に含まれる、前記ディスペンサーが決められた順序で 前記錠剤を区画化する手段を提供する、請求項１３記載の経口避妊薬組成物。 １６． 経口避妊薬と共に患者にアンドロゲンを投与することを含む、経口避 妊薬に含まれるエストロゲンを摂取した、骨質量ピークに達していない患者の骨 の蓄積を強化する方法。 １７． アントロゲンが、月経周期の８−１３日に一日当たり約０．２ｍｇか ら約１．５ｍｇのメチルテストステロンとして投与される、請求項１６記載の方 法。 １８． アンドロゲンが、月経周期の８−２８日に、一日当たり約０．２ｍｇ から約１．５ｍｇのメチルテストステロンとして投与される、請求項１６記載の 方法。 １９． 患者の妊娠を予防する方法であって： 月経周期８−１３日に、毎日、約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメチ ルテストステロン、約０．５０ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３０ｍ ｇのエチニルエステラジオール； 月経周期の１４−１８日に、毎日、約０．０７５ｍｇのレボノルゲス トレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオール；および、 月経周期の１９−２８日に、毎日、約０．１２５ｍｇのレボノルゲス トレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオール： を含む、調合物を患者に投与することを含む、前記の妊娠予防法。 ２０． 患者の妊娠を予防する方法であって： 月経周期の８−１３日に、毎日、約０．２ｍｇから約１．５ｍｇのメ チルテストステロン、約０．５０ｍｇのレボノルゲストレルおよび約０．０３０ ｍｇのエチニルエステラジオール； 月経周期の１４−１８日に、毎日、約０．０７５ｍｇのレボノルゲス トレル、約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールおよび約０．２ｍｇから 約０．５ｍｇのメチルテストステロン；および。 月経周期の１９−２８日に、毎日、約０．１２５ｍｇのレボノルゲス トレル、約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールおよび約０．２ｍｇから 約０．５ｍｇのメチルテストステロン： を含む、調合物を患者に投与することを含む、前記の妊娠予防法。 ２１． 月経周期の１−７日に毎日摂取される、プラシーボ組成物を含む７つ の錠剤； 月経周期の８−１３日に毎日摂取される、約０．２ｍｇから約１．５ ｍｇのメチルテストステロン、約０．０５０ｍｇのレボノルゲストレルおよび約 ０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む６つの錠剤； 月経周期の１４−１８日に毎日摂取される、約０．０７５ｍｇのレボ ノルゲストレルおよび約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む、５ つの錠剤； 月経周期の１９−２８に毎日摂取される、約０．１２５ｍｇのレボノ ルゲストレルおよび約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む、１０ の錠剤；および それぞれの区画が経口避妊薬組成物を含む、２８の区画を含むディス ペンサー： を含む、一ヶ月の経口避妊薬のパック。 ２２． 月経周期の１−７日に毎日摂取される、プラシーボ組成物を含む７つ の錠剤； 月経周期の８−１３日に毎日摂取される、約０．２ｍｇから約１．５ ｍｇのメチルテストステロン、約０．０５０ｍｇのレボノルゲストレルおよび約 ０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールを含む６つの錠剤； 月経周期の１４−１８日に毎日摂取される、約０．０７５ｍｇのレボ ノルゲストレル、約０．０４０ｍｇのエチニルエステラジオールおよび約０．２ ｍｇから約０．５ｍｇのメチルテストステロンを含む、５つの錠剤； 月経周期の１９−２８に毎日摂取される、約０．１２５ｍｇのレボノ ルゲストレル、約０．０３０ｍｇのエチニルエステラジオールおよび約０．２ｍ ｇから約０．５ｍｇのメチルテストステロンを含む、１０の錠剤；および それぞれの区画が経口避妊薬組成物を含む、２８の区画を含むディス ペンサー： を含む、一ヶ月の経口避妊薬のパック。