JP2000516579A - 腸栄養性ｇｌｐ―２ペプチドのアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グルカゴン様ペプチド２のアンタゴニストを同定した。胃腸組織の増殖に対するその効果を記載する。医薬としてのその製剤、および胴疾患の治療におけるその治療用途および関連用途を記載する。また、グルカゴン様ペプチド２のアンタゴニストの同定方法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 腸栄養性GLP-2ペプチドのアンタゴニストＩ．発明の分野 本発明は、グルカゴン様ペプチド-2の機能的アンタゴニストであるグルカゴン 関連ペプチド、および特に腸組織における過形成の阻止または低形成の誘導のた めのそれらの治療的用途に関する。II ．発明の背景 グルカゴン遺伝子の発現は、160残基のプログルカゴン産物からプロセシング され組織によって決定される種々のペプチド産物を与える。プログルカゴン前駆 体内でのこれらのペプチドの編成は、アンコウ、ラット、ハムスターおよびウシ の膵臓からのプレプログルカゴンcDNAの分子クローニングにより明らかにされた 。これらの分析は、プレプログルカゴンが、グルカゴンおよびグリセンチンの配 列だけでなく、２つの追加的なグルカゴン様ペプチド（GLP-1およびGLP-2）も含 有し、これらが、グルカゴンおよびお互いから、２つのスペーサーまたは介在ペ プチド（IP-1およびIP-II）により分離されていることを明らかにした。これら のペプチドは、古典的なプロホルモン切断部位に特徴的な塩基性アミノ酸対に隣 接し、このことは、それらが、プログルカゴンの翻訳後プロセシング後に遊離さ れうることを示唆している(Drucker,Pancreas,1990,5(4):484)。膵ランゲルハン ス島中のプログルカゴンから遊離されたペプチドの分析は、例えば、遊離される 一次膵ペプチドが29-merグルカゴンであり、一方、グリセンチン、オキシントモ ジュリン、IP-IIおよびグルカゴン様ペプチドは小腸および大腸内に、より優勢 であると示唆している。これらのグルカゴン様ペプチドが腸内に存在することが このように証明されたことは、これらの新たに見出された腸ペプチドの厳密な構 造および推定機能に関する研究を促すこととなった。いくつかの証拠が、GLP-1 が重要な新規調節ペプチドかもしれないことを示唆しているため、ほとんどの研 究はGLP-1に集中している。実際のところ、GLP-1が、膵β細胞上の受容体との相 互作用を介してグルコース依存的に媒介される作用であるインスリン 遊離のための公知の最も強力なペプチド作動性刺激物質であることが確認されて いる。GLP-1およびその誘導体は、糖尿病の治療用に開発中である。 GLP-2の生物学的役割に関して、同時係属米国特許出願第08/422,540号（PCT公 開第ＷＯ96/32414号）（その全体を参考として本明細書に組入れることとする） は、啼乳動物GLP-2が栄養因子として作用して、腸組織の増殖を促進すると開示 している。GLP-2の効果は、特に、小腸の成長の増強により特徴づけられる。さ らに、同時係属米国特許出願第08/631,273号およびPCT出願第PCT/CA97/00252号 （それらを共にその全体を参考として本明細書に組入れることとする）は、脊椎 動物GLP-2の類似体が、増強された腸栄養活性を有し得ると開示している。III ．発明の概要 GLP-2の腸栄養活性を抑制しうるペプチドがGLP-2ペプチドの構造の改変により 得られることを、本発明で見出した。より詳しくは、本発明の１つの態様におい て、最初の４個のＮ末端残基の任意の1〜4個が欠失するように突然変異している 第１参照哺乳動物GLP-2のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含んでなるこ とを特徴とするアンタゴニストを提供する。本発明のもう１つの態様において、 該アンタゴニストは、ヒトGLP-2のAsp¹⁵、Phe²²、Thr²⁹、Thr³²およびAsp³³のア ミノ酸位置に対応するアミノ酸位置から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が、 参照哺乳動物GLP-2のその位置に天然には存在しないアミノ酸で置換されるよう に突然変異した参照哺乳動物GLP-2に対応する。本発明のもう１つの態様におい ては、Ala²位が、Leu、Cys、Glu、Arg、TrpおよびPO₃-Tyr²よリなる群から選ば れるアミノ酸で置換されている。本発明のさらにもう１つの態様においては、該 アンタゴニストは、参照哺乳動物GLP-2から突然変異して前記の置換および欠失 の任意の組合せを有するポリペプチドに対応する。 また、本発明の１つの態様として、GLP-2アンタゴニストの製造法および同定 方法を提供する。 さらに、本発明は、医学的または獣医学的治療における用途として、GLP-2活 性をin vivoで拮抗するのに有効な量のGLP-2アンタゴニストと医薬上または獣医 学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物または獣医学組成物を提供する。 本発明のGLP-2アンタゴニストのGLP-2アンタゴニスト活性は、小腸組織の質量 の減少として、あるいはGLP-2またはその腸栄養性類似体の腸栄養活性を抑制す る能力として、in vivoで明らかである。したがって、本発明のもう１つの態様 において、動物またはヒトを含む被検体において小腸組織の質量を減少させるか 又は小腸組織の増殖を抑制する方法であって、小腸組織の質量の減少を引き起こ すのに有効な量の本発明のGLP-2アンタゴニストをその被検体に運搬する工程を 含んでなる方法を提供する。 そのような治療が有用と考えられる被検体には、例えば、GLP-2の過剰投与に よる又はGLP-2を過剰産生する腫瘍による小腸の過形成状態に罹患した被検体、 および、例えば、臨床的肥満の治療において小腸の切除に代わる非外科的手段と しての小腸の低形成の予防的誘導が有用と考えられる状態に罹患した被検体が含 まれる。IV ．発明の詳細な説明 本発明は、新規クラスのGLP-2アンタゴニストの治療用途および関連用途、特 に、胃腸組織（特に小腸）の増殖速度を減少させるための用途に関する。本発明 のGLP-2アンタゴニストの生物学的効果は、模擬治療対照に対する小腸の重量の 減少として、あるいはGLP-2またはGLP-2の腸栄養性類似体の腸栄養活性を、GLP- 2またはGLP-2の腸栄養性類似体のいずれかを単独で与えた対照動物に対して抑制 する能力として現れる。 本発明のGLP-2アンタゴニストは、腸栄養性GLP-2ペプチドの構造類似体である 。GLP-2ペプチドは、GLP-2の種々の脊椎動物形態、および腸栄養活性を依然とし て保有するGLP-2類似体の修飾形態(保護基を有するアミノ酸残基の少なくとも１ つの付加、欠失、置換および／または取込みにより特徴づけられるもの)の総称 である。しかしながら、本明細書に記載するように、これらの腸栄養性GLP-2ペ プチドの或る部位特異的改変が、その部位特異的に改変された類似体にアンタゴ ニスト活性を付与することがある。 以下の説明に限定されるものではないが、アンタゴニスト活性を付与する部位 特異的改変は、GLP-2ホルモンペプチドの機能的活性の１つ（すべての機能的活 性という訳ではない）を阻害すると考えられる。例えば、GLP-2類似体にアンタ ゴニスト活性を付与する改変は、その類似受容体に対するホルモン結合は阻害し ないが該結合受容体を介する後続のシグナル伝達を妨げるものであってもよい。 例えば、該ホルモンの部位特異的改変は、細胞の内部にシグナルを伝達するのに 必要なホルモン受容体の二量化を妨げるものであってもよい。アンタゴニスト活 性のそのような作用は、例えばヒト成長ホルモンなどの他のホルモンで認められ ている(Fuhら,Science，1992,256:1677-1680を参照されたい)。 一般には、哺乳動物GLP-2間で高度に保存されている部位が、アンタゴニスト を得るための修飾の候補となる。哺乳動物間では、少なくとも残基1〜5、7、15 および22、29および32〜33が高度に保存されている。したがって、これらの部位 の残基の欠失または置換により、GLP-2アンタゴニストが得られる可能性がある 。さらに、これらの保存部位の近くの部位の或る修飾が、局所的三次アミノ酸構 造または隣接保存残基の配置を損なうことにより、アンタゴニスト活性を与える こともある。 本発明のGLP-2アンタゴニストには、ヒトGLP-2の配列と比べて最初の４個のＮ 末端アミノ酸の任意の１以上が欠失している、脊椎動物GLP-2由来の配列を有す るペプチド誘導体が含まれる。本発明では、これらの類似体を、GLP-2アンタゴ ニストの欠失クラスと称することにする。GLP-2拮抗作用は最初の４個のアミノ 酸内のGLP-2のＮ末端構造の破壊から生じうることが、GLP-2アンタゴニストの欠 失クラスから理解されるであろう。したがって、GLP-2アンタゴニストの欠失ク ラスには、GLP-2(2-33)、GLP-2(3-33)、GLP-2(4-33)およびGLP-2(5-33)、[デスA la²]GLP-2、[デスAsp³]GLP-2および[デスGly⁴]GLP-2が含まれる。 また、本発明のGLP-2アンタゴニストには、脊椎動物GLP-2の置換誘導体が含ま れる。GLP-2アンタゴニストの置換クラスには、以下の位置（ヒトGLP-2の配列に 基づく）の以下のアミノ酸の１つが別のアミノ酸で置換されたアンタゴニストが 含まれる：残基15、22、29、32および33。また、該置換クラスには、あるAla²置 換を含むものが含まれる。 本発明の実施態様において、GLP-2アンタゴニストは、欠失および置換の任意 の組合せを含むことが可能であり、また、記載されている部位における２以上の 置換を含むことが可能であると理解されるべきである。 Ａ．GLP-2アンタゴニスト したがって、GLP-2アンタゴニストは、配列： を有するヒトGLP-2の類似体であってもよい。特に示さない限り、「GLP-2」なる 語は、ヒトGLP-2の配列を意昧する。 本発明のアンタゴニストは、第１参照哺乳動物GLP-2のアミノ酸配列に対応す るアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、該ポリペプチドが突然変異 していることにより、 （i）最初の４個のＮ末端残基の任意の1〜4個が欠失している、または （ii）ヒトGLP-2のAsp¹⁵、Phe²²、Thr²⁹、Thr³²およびAsp³³のアミノ酸位置に対 応するアミノ酸位置から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が、該参照GLP-2の その位置に天然には存在しないアミノ酸で置換されている、または （iii）Ala²位が、Leu、Cys、Glu、Arg、TrpおよびPO₃-Tyr²よりなる群から選ば れるアミノ酸で置換されている、または （iv）(i)および(ii)、または（ii）および（iii）の組合せが突然変異している ことを特徴とするポリペプチドである。 本発明の特定の実施態様では、例えば、1、2、3、4、22、29、32および／また は33位の残基で改変している本発明のGLP-2アンタゴニストは、ヒトGLP-2のAla^{1 5} 変異体であるラットGLP-2；デグー(degu)GLP-2、ウシGLP-2、ブタGLP-2、モル モットGLP-2およびハムスターGLP-2（それらの配列は、Buhlら（J.Biol.Chem.， 1988,263(18):8621）を含む多数の著者により報告されている）の誘導体であっ てもよい。 ある特定の位置に存在するGLP-2残基は、種々の脊椎動物種から単離されたGLP -2の配列を整列し、該配列を、前記のヒト配列と比較することにより決定す る。 さらに、1、2、3、4、22、29、32および／または33位の残基で改変している本 発明のGLP-2アンタゴニストは、例えば同時係属来国特許出願第08/632,533号お よび08/631,273号ならびにPCT公開第WO 96/32414号およびPCT出願第PCT/CA 97/0 0252号に記載のGLP-2アゴニストの誘導体であってもよい。 アンタゴニストを与えるこれらの部位における適当なアミノ酸置換は、本明細 書に記載のGLP-2拮抗作用のマウスモデルを用いて容易に決定することができる 。すなわち、構造的改変を含むGLP-2化合物を得、ついで本明細書中に例示する マウスモデルにおいてGLP-2拮抗作用に関してスクリーニングする。腸の成長の 減少を惹起し、および／または、GLP-2またはGLP-2アゴニストの腸栄養活性を抑 制するGLP-2化合物は、このスクリーニングにおいてGLP-2アンタゴニストと同定 される。 本発明のGLP-2アンタゴニストが、本明細書中に例示するマウスモデルでの評 価において、（1）ビヒクルのみを与えた対照動物に対する小腸重量の測定可能 な減少を一貫してもたらす、および／または、（2）前記マウスモデルにおいてG LP-2またはGLP-2アゴニスト（好ましくは、アゴニストに対して10:1、より好ま しくは4:1のモル過剰比）との共投与により評価した場合、GLP-2またはGLP-2ア ゴニストの腸栄養効果の測定可能な抑制（これは、GLP-2の単独投与により誘導 される小腸重量の増加の減少により示される）を一貫して招くならば、該アンタ ゴニストはGLP-2の機能的アンタゴニストと考えられる。 治療的用途に特に適しているのは、ビヒクルのみを与えた対照動物に対して少 なくとも約10％の腸重量の減少をもたらすGLP-2の機能的アンタゴニストである 。治療的用途に好ましいのは、少なくとも15％以上の小腸重量の減少をもたらす ものである。 本発明のGLP-2アンタゴニストの、小腸の質量を減少させる活性は、空腸、特 に近位空腸に関して最も顕著に認められ、遠位回腸でも認められる。さらに、GL P-2アンタゴニストの活性は、小腸の陰窩／絨毛の高さの減少として認められる こともある。 あるいは、GLP-2アンタゴニストは、前記で詳しく説明した共投与モデルを用 いて評価することができる。この場合、アンタゴニストをGLP-2または腸栄養性 類似体と約10:1のモル比、より好ましくは約4:1のモル比で共投与した場合に、 それらが、GLP-2またはその腸栄養性類似体の活性を少なくとも10％減少させる ならば（これは、ＧＬＰ−２またはGLP-2アゴニストのみで処理した対照動物に 対する、小腸の重量の増加の減少により示される）、該アンタゴニストはGLP-2 の有用なアンタゴニストであると考えられる。 本発明のもう１つの態様においては、GLP-2のアンタゴニスト（例えば前記の もの）を同定するのに有用な方法であって、 1）該ペプチド配列内に改変を含むGLP-2類似体を得、 2）腸の質量の測定可能な減少を惹起しうる治療方式を用いて該類似体で哺乳動 物を処理し、 3）小腸の重量に対する及び／又は小腸の陰窩細胞の陰窩／絨毛の高さに対する 該類似体の効果を、模擬処理した対照動物との比較により判定し、それにより、 機能的GLP-2アンタゴニストを、前記重量および／または前記高さの減少を惹起 するGLP-2類似体と同定する工程を含んでなる方法を提供する。 本発明の関連態様においては、機能的GLP-2アンタゴニストを同定するのに有 用なもう１つの方法であって、 1）該ペプチド配列内に改変を含むGLP-2類似体を得、 2)GLP-2またはGLP-2アゴニストの腸栄養活性を抑制しうる治療方式を用いて該類 似体で哺乳動物を処理し、 3）小腸の重量に対する及び／又は小腸の陰窩細胞の陰窩／絨毛の高さに対する 該類似体の効果を、GLP-2またはGLP-2アゴニストを与えた対照動物との比較によ り判定し、それにより、機能的GLP-2アンタゴニストを、GLP-2の腸栄養活性およ び／またはGLP-2アゴニストの腸栄養活性を抑制するGLP-2類似体と同定する工程 を含んでなる方法を提供する。 機能的GLP-2アンタゴニストを同定するのに有用な前記方法の好ましい変法に おいては、該GLP-2類似体を、本明細書に記載のGLP-2アンタゴニストから選択す る。 Ｂ．置換アミノ酸の選択 置換アミノ酸は、ペプチド化学者に利用可能な多種多様なアミノ酸から選択す ることができ、D-アミノ酸およびL-アミノ酸ならびにそれらの多数の誘導体を含 む。最も実用的には、選択したアミノ酸は、固相または液相合成により、あるい は組換えDNA製造手段により容易に取込ませることができるであろう。 第１スクリーニングにおいて、アンタゴニスト活性に関する候補類似体を、ア ラニンスキャニング（alanine scanning）突然変異誘発または他の体系的な突然 変異誘発方法により同定する。本明細書で詳しく説明する方法を用いて、これら のアラニン置換をアンタゴニスト活性に関して試験する。 本発明のもう１つの態様においては、GLP-2ホルモンとその標的分子（例えば 、受容体）との構造的相互作用（水素結合、塩橋、疎水性相互作用、残基の配置 ）を引き起こすのに重要な天然に存在するアミノ酸残基を劇的に変化させること により、より有効なGLP-2アンタゴニストを製造することが可能である。これを 意図する場合には、通常、残りの天然に存在する全18個の残基による置換で各部 位をスクリーニングする必要はない。実際には、残基群の代表的なメンバーを選 択する。一般には、これらの群は、 ａ．正に荷電した残基:His、ArgおよびLys ｂ．負に荷電した残基:AspおよびGlu ｃ．アミド:AsnおよびGln ｄ．芳香族残基:Phe、Tyr、Trp ｅ．疎水性残基:Ala、Pro、Gly、Val、Leu、IleおよびMet ｆ．非荷電親水性残基:SerおよびThr である。これらのアンタゴニスト候補を調製する場合には、その位置に天然に存 在する残基型以外の群から残基を選択することになろう。極端な置換は、逆の特 性の組合せの群から残基を選択することにより得られる。例えば、負に荷電した 残基を、正に荷電した残基で置換することができる。 Ala²置換の場合には、GLP-2活性のアンタゴニストが得られるように該置換ア ミノ酸を注意深く選択する。２位での置換が、GLP-2の腸栄養活性を増強する効 果を与えうることに注意すべきである。例えば、Ala²をGlyで置換すると、劇的 に増強された腸栄養活性と、DPP-IV酵素によるGLP-2ペプチドの消化に対する 抵抗性とが得られる。驚くべきことに、本発明のGLP-2アンタゴニストは、Ala² を置換することによっても得ることができる。本発明の実施態様においては、GL P-2アンタゴニストを得るのに有用な、２位の置換アミノ酸は、Leu、Cys、Glu、 Arg、TrpおよびPO₃-Tyrから選択する。これらの置換を含むGLP-2アンタゴニスト は、DPP-IV酵素による消化に対して該ペプチドを抵抗性にするという追加的な利 点を有する。好ましくは、Ala²置換アミノ酸は、Cys、Glu、LeuおよびArgから選 択する。 Asp²⁴、Phe²²、Thr²⁹、Thr³²およびAsp³³と置換するアミノ酸は、望ましくは 、小さな疎水性側鎖を含むアミノ酸（例えば、Ala、GlyおよびVal）から選択す る。 本発明の実施態様においては、GLP-2アンタゴニストの置換クラスには、[Gly² ,Ala¹⁵]GLP-2、[Ala²²]GLP-2、[Ala¹⁵]GLP-2(2-33)、[Ala¹⁵]GLP-2(3-33)、[Ala³³ ]GLP-2(4-33)、[Ala¹⁵]GLP-2(5-33)、[Gly²,Ala²²]GLP-2、[Gly⁷,Ala²⁷]GLP-2 、[Gly²,Ala³²]GLP-2、[Gly²,Ala³³]GLP-2、[Leu²]GLP-2、[Glu²]GLP-2、[Arg²] GLP-2、[Trp²]GLP-2、[PO₃-Tyr²]GLP-2、[Cys²]GLP-2、[Ala¹⁵]GLP-2、[Ala²⁹]G LP-2、[Ala³²]GLP-2および[Ala³³]GLP-2が含まれる。 Ｃ．本発明の類似体の特性を改善するための追加的な修飾 本発明のGLP-2アンタゴニストは、記載されているタイプの構造的改変を含む 一方で、GLP-2自体またはGLP-2アゴニストの配列と一致した種々のアミノ酸配列 を有することが可能である。また、GLP-2アンタゴニストは、脊椎動物GLP-2アゴ ニストの類似体であって、該ペプチドの他の生化学的、生物学的または生理的特 性を向上させるために付随的な修飾が施されているものであってもよい。そのよ うな修飾には、例えば(２位以外の位置での置換により拮抗作用が付与されるペ プチドにおいて)、酵素DPP-IVによる消化に対してGLP-2アンタゴニストを抵抗性 にするアミノ酸による天然のAla²の置換が含まれる。この目的に適したアミノ酸 には、特に、Glyが含まれる。また、Met¹⁰残基を、より酸化的に安定なアミノ酸 （例えば、Leu、Nle、IleまたはAla）で置換することができる。したがって、Me t¹⁰が置換されたそのような類似体は、合成、後処理および保存中に、より安定 である。これに関連したもう１つの修飾は、Arg以外のアミノ酸による20位アミ ノ酸の置換である。ある適用（特に、医薬上または獣医学上許容 されるペプチドの合成的製造）においては、TFAなどの溶媒からの対イオンがArg 残基により保持されるのを避けるために、この修飾が望ましい。 また、望ましくない生化学的攻撃およびin vivoでの破壊からペプチド末端を 保護するためにペプチド化学の分野において通常使用する型の保護基を含むよう にＮ末端またはＣ末端が修飾された分子も、本発明の範囲内に含まれる。 適当なＮ末端保護基には、例えば、アセチルなどのC_1-5アルカノイル基が含ま れる。また、アミノ機能を欠くアミノ酸類似体も、Ｎ末端保護基として適してい る。適当なＣ末端保護基には、Ｃ末端カルボキシルの炭素原子においてケトンま たはアミドを形成する基、または該カルボキシルの酸素原子においてエステルを 形成する基が含まれる。ケトンおよびエステルを形成する基には、アルキル基、 特に、分枝状または非分枝状のC_1-5アルキル基、例えばメチル、エチルおよびプ ロピル基が含まれ、アミド形成基には、アミノ官能基、例えば第一級アミン、ま たはアルキルアミノ官能基、例えばモノ-C_1-5アルキルアミノおよびジ-C_1-5アル キルアミノ基、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチル アミノ、メチルエチルアミノなどが含まれる。また、例えば脱カルボキシル化ア ミノ酸類似体（例えば、アグマチン）などのアミノ酸類似体も、この化合物のＣ 末端を保護するのに適している。 本発明の実施態様は、特に、Ｎ末端保護基がアセチルであるそのような類似体 、およびＣ末端保護基がアミン（例えば、-NH₂-）である類似体を含む。 Ｄ．GLP-2アンタゴニストの合成 本発明のGLP-2アンタゴニストは、ペプチド化学の標準的な技術を用いて合成 することができ、すべて本明細書に記載の教示に従いGLP-2アンタゴニスト活性 に関して評価することができる。L-アミノ酸のみを含むGLP-2アンタゴニストは 、組換えDNA技術を適用することにより商業的な量で製造することができる。こ の目的には、所望のGLP-2アンタゴニストをコードするDNAを、発現ベクター中に 導入し、微生物、例えば酵母または他の細胞性宿主中に形質転換し、ついで、そ れを、GLP-2アンタゴニストの発現に適した条件下で培養する。種々の遺伝子発 現系が、この目的に応用されており、典型的には、選択した宿主が天然で用いる 発現調節要素から所望の遺伝子の発現を駆動する。GLP-2は、その活性に翻訳 後グリコシル化を必ずしも必要としないため、その産生は、大腸菌（E．coli） などの細菌宿主内で簡便に行なうことができる。そのような産生のためには、選 択されたGLP-2アンタゴニストをコードするDNAを、大腸菌（E．coli）のlac、tr pまたはPL遺伝子の発現制御下に配置するのが有効である。GLP-2アンタゴニスト 自体をコードするDNAの発現に代わる手段として、該発現産物の単離および安定 性を改善する担体タンパク質にGLP-2アンタゴニストが遊離可能に結合した融合 タンパク質としてGLP-2アンタゴニストが発現されるように、該宿主を改変する ことができる。 選択されたGLP-2アンタゴニストの製造に普遍的に適用可能なアプローチにお いて、また、非遺伝的にコードされるアミノ酸を含むGLP-2アンタゴニスト形態 ならびにＮ末端およびＣ末端が誘導体化された形態を製造するために必然的に用 いるアプローチにおいては、自動ペプチド合成の十分に確立された技術を用いる 。その一般的な説明は、例えば、J.M.StewartおよびJ.D.Young,Solid Phase Pep tide Synthesis ，第２版,1984,Pierce Chemical Company,Rockford,Illinoisお よびM.BodanszkyおよびA.Bodanszky,The Practice of Peptide Synthesis,1984 ，Springer-Verlag，New York;Applied Biosystems 430A Users Manual,1987,AB I Inc.，Foster City，Californiaに記載されている。これらの技術においては 、例えばOrskovら，1989，前掲に記載のとおり、FmocまたはtBocプロトコールを 用いて適当に保護されたアミノ酸の逐次的な付加により、GLP-2アンタゴニスト をそのＣ末端の樹脂結合残基から成長させる。 また、Ｎおよび／またはＣ保護基の導入には、固相ペプチド合成法に一般的な プロトコールを適用することができる。Ｃ末端保護基の導入には、典型的には例 えば、支持樹脂（これは、該樹脂からの切断により、所望のＣ末端保護基を有す るペプチドが得られるように化学的に修飾されている）を固相として用いて、所 望のペプチドの合成を行なう。Ｃ末端に第一級アミノ保護基を有するペプチドを 得るためには、例えば、p-メチルベンズヒドリルアミン（MBHA）樹脂を用いて合 成を行ない、ペプチド合成の完了時に、フッ化水素酸での処理により、Ｃ末端が アミノ化された所望のペプチドを遊離させる。同様に、Ｃ末端のN-メチルアミン 保護基の導入は、N-メチルアミノエチルで誘導体化されたDVB樹脂を用いて 行ない、それをHFで処理して、N-メチルアミド化Ｃ末端を有するペプチドを遊離 させる。また、エステル化によるＣ末端の保護を、常法により行なうことができ る。この場合、引き続いてエステル官能基を形成するための所望のアルコールと の反応が可能となるように、側鎖が保護されたペプチドが樹脂から遊離されうる 樹脂／保護基の組合せを用いる。メトキシアルコキシベンジルアルコールまたは 同等のリンカーで誘導体化されたDVB樹脂とFMOC保護基との組合せを、この目的 に用いることができ、この場合、該支持体からの切断は、ジクロロメタン中TFA により行なう。ついで、所望のアルコールを加えることにより、適当に活性化（ 例えば、DCCによるもの）されたカルボキシル官能基のエステル化を進行させ、 ついで該エステル化ペプチド産物の脱保護および単離を行なうことができる。 Ｎ末端保護基の導入は、合成されたペプチドが樹脂にまだ結合している間に、 例えば、適当な無水物およびニトリルでの処理により行なうことができる。Ｎ末 端にアセチル保護基を導入するためには、例えば、樹脂に結合したペプチドを、 アセトニトリル中20％無水酢酸で処理することができる。ついで該Ｎ保護ペプチ ド産物を樹脂から切断し、脱保護し、ついで単離する。 所望のペプチド配列を合成し、樹脂から切断し、完全に脱保護したら、ついで 選択したアミノ酸配列を有する単一のオリゴペプチドの回収が保証されるように 該ペプチドを精製する。アルキル化シリカカラム（例えば、C₄-、C₆-またはC₁₆- シリカ）上の逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）などの標準的な任意 のアプローチを用いて、精製を行なうことができる。そのようなカラム分画は、 一般には、通常は少量（例えば、0.1％）の対形成剤（pairing agent、例えば、 TFAまたはTEA）を含有する水性緩衝液中の有機溶媒（例えば、アセトニトリル） の割合（％）を次第に増加させてゆく直線勾配（例えば、10〜90％）を用いて行 なう。あるいは、ペプチド種の荷電特性に基づいてペプチド種を分離するために 、イオン交換HPLCを使用することができる。カラム画分を集め、所望の／必要な 純度のペプチドを含有する画分を所望によりプールする。本発明の１つの実施態 様においては、ついで、切断用の酸（例えば、TFA）を医薬上または獣医学上許 容される酸（例えば、酢酸、塩酸、リン酸、マレイン酸、酒石酸、コハク 酸など）と交換すための確立された方法で該ペプチドを処理して、該ペプチドの 水溶性塩を得る。 Ｅ．本発明のGLP-2アンタゴニストの用途 本発明では、胃腸組織増殖速度の減少から利益を受けると考えられる患者（動 物およびヒトを含む）を治療するために、GLP-2アンタゴニストを投与する。１ つの態様では、候補となる患者は、小腸組織の質量の減少から利益を受けると考 えられる患者である。本明細書に例示する結果により示されるとおり、この組織 に対するGLP-2アンタゴニストの効果は劇的であり、小腸管粘膜における過形成 により特徴づけられる疾患または状態（GLP-2を産生する腫瘍を含む）に罹患し た患者にとって有益であることは明らかである。GLP-2アンタゴニストの効果か ら利益を受けることが明らかと考えられるもう１つの患者群は、小腸組織の低形 成を誘導するのが有用と考えられる患者、例えば、例えば、近い将来、放射線療 法または化学療法を受ける予定の患者、あるいは放射線療法または化学療法を受 けている患者である。小腸上皮細胞は、迅速な細胞分裂により特徴づけられ、し たがって、放射線療法または化学療法による損傷を特に受けやすい。実際のとこ ろ、小腸上皮細胞に対する細胞損傷は、治療を受けている癌患者における有意な 死亡原因および罹患原因となる。したがって、これらの療法の開始直前および治 療の経過中に、これらの細胞の増殖速度を減少させるのが望ましいであろう。こ れらの患者における小腸細胞の増殖速度を減少させて、化学療法または放射線療 法での治療前に腸休止を達成することができれば、より高用量の放射線療法剤お よび化学療法剤の投与を可能にするという追加的な利点が得られるであろう。 GLP-2の機能的アンタゴニストが臨床的に有用であると考えられるもう１つの 臨床場面は、慢性的または急性的にGLP-2またはGLP-2アゴニストを過剰投与され ている患者（動物またはヒトを含む）の治療である。GLP-2の機能的アゴニスト の更にもう１つの可能な用途は、毒素または他の薬物が粘膜層を越えて輸送され るのを阻止することである。いくつかの疾患における病理的効果は、腸上皮を介 した毒素または薬物の吸収の結果として生じる。腸上皮を減少させることにより 小腸の吸収能を取り除くことが有益かもしれない。例えば、コレラなどのいくつ かの疾患は、コレラ毒素が腸上皮自体における受容体に結合し、脱水および 死を招くことにより、致命的となる。GLP-2アンタゴニストは腸の休止を引き起 こし、毒素の標的組織（腸上皮）を除去し、それにより、コレラに対する病理的 応答を排除する。 小腸の質量の減少から利益を受ける考えられる更にもう１つの患者群は、肥満 に罹患した患者であり、この場合、小腸の切除などの外科的介入に代わる手段と して有用である。 したがって、１つの態様において、本発明は、小腸組織の増殖の減少をそれを 要する患者において引き起こすための方法であって、GLP-2を拮抗するのに有効 な量の本発明のGLP-2アンタゴニストを該患者に運搬する工程を含んでなる方法 を提供する。GLP-2アンタゴニストでの治療の治療効力は、絨毛形態を調べるた めの腸生検により、あるいは栄養吸収の生化学的評価によりモニターすることが できる。また、治療した個々の状態に関する臨床的エンドポイント（例えば、体 重減少）を用いて、有効性を評価することができる。関連態様においては、本発 明は、胃腸疾患の病理的症状を軽減するために、治療的に有効な量の本発明の機 能的アンタゴニストを医薬上または獣医学上許容される担体と共に投与すること により、胃腸疾患に罹患した患者を治療する方法を提供する。例えば、腫瘍サイ ズを減少させるために、小腸癌の患者にGLP-2アンタゴニストを投与することが できる。あるいは、腸運動障害、過敏性腸および慢性下痢の患者は、運動性を増 強し及び／又は下痢を軽減するGLP-2アンタゴニストから利益を受けるかもしれ ない。 その態様のもう１つの点において、本発明は、放射線療法または化学療法を含 む治療方式の一部として胃腸組織の質量を減少させるための患者の治療方法であ って、小腸の質量を減少させる量のGLP-2アンタゴニストを患者に投与すること を特徴とする方法を提供する。本発明は、GLP-2アンタゴニストと放射線療法剤 または化学療法剤との共投与、あるいは放射線療法または化学療法の開始前に小 腸組織の増殖を減少させるためのGLP-2アンタゴニストの投与の両方を含む。 GLP-2アンタゴニストの適当な投与方式は、腸損傷が後に軽減することおよび／ または放射線療法または化学療法後の回復時間をモニターすることにより決定す ることができる。 さらに別の態様においては、本発明は、GLP-2の効果に拮抗する能力（これは 、管理された食事摂取条件下での体重減少により示される）を有するGLP-2アン タゴニストの有効量を肥満患者に投与することを含んでなる、肥満の治療方法を 提供する。 もう１つの態様においては、本発明は、GLP-2を産生する腫瘍に罹患した患者 の治療方法であって、GLP-2の効果に拮抗する能力（治療期間にわたる腸上皮の サイズおよび小腸の質量の減少により示される）を有するGLP-2アンタゴニスト の有効量を該治療を要する患者に投与することを含んでなる方法を提供する。 GLP-2のアンタゴニストのもう１つの用途は、小腸の吸収不全の問題による流 体不均衡を矯正するための療法としての用途である。GLP-2アンタゴニストでの 治療の有効性は、糞便の容量、ICFおよびECF容量、尿容量および重量モル浸透圧 濃度、血圧、および血漿電解質を評価することによりモニターする。 本発明で用いる「患者」なる語は、ヒトまたは他の哺乳動物（家畜およびペッ トを含む）を含む。 Ｆ．GLP-2アンタゴニストの製剤 ヒトおよび動物を含む患者に対する投与のために、本発明の１つの態様におい て、発熱物質を実質的に含まない医薬上または獣医学上許容される形態で（例え ば、0.22μのフィルターで滅菌濾過した製剤として）GLP-2アンタゴニストを提 供する。望ましくは、製剤化するGLP-2アンタゴニストは、HPLC上の単一の又は 個別化されたピークとして移動し、その分析に際して均一かつ真正なアミノ酸組 成および配列を示し、また、医薬または獣医学製品の品質を規制する種々の国家 団体により制定された基準を満足する。 治療に使用する場合には、選択したGLP-2アンタゴニストを、選択した投与経 路により該ペプチドを運搬するのに適した医薬上または獣医学上許容される担体 と共に製剤化する。適当な医薬上または獣医学上許容される担体としては、ペプ チドに基づく薬物と共に通常用いる担体（例えば、希釈剤、賦形剤など）が挙げ られる。一般的な薬物の製剤化に関する手引書として、Remington's Pharmaceut ical Sciences”、第17版,Mack Publishing Company,Easton,Penn.,1985を参照 することができる。本発明の１つの実施態様においては、該化合物 を、皮下または静脈内への注入または注射による投与用に製剤化して、発熱物質 を含まない無菌形態の水溶液として用い、所望により、弱酸性または生理的pHに 緩衝化する。したがって、該化合物は、蒸留水、より望ましくは食塩水、緩衝化 食塩水または５％ブドウ糖溶液中で投与することができる。必要に応じて、溶解 増強剤（例えば、酢酸）を加えることにより、水溶性を増加させることができる 。 注射剤として使用するためには、注射部位またはその付近にGLP-2アンタゴニ ストを貯留するように働くゼラチンで水性担体またはビヒクルを補足して、それ が所望の作用部位へ徐々に放出されるようにする。貯留効果を得るのに有効なゼ ラチンの濃度は、10〜20％の範囲内にあると考えられる。また、ヒアルロン酸な どの代替的なゲル化剤も貯留剤として有用かもしれない。 また、本発明のGLP-2アンタゴニストは、GLP-2アンタゴニストの長期徐放投与 のための徐放性埋め込み装置として製剤化することができる。そのような徐放製 剤には、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ乳酸ポリグリコール酸共重合体、メチルセ ルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの生体適合性重合体の複合材が含まれ る。薬物運搬ビヒクル中の分解性重合体の構造、選択および用途は、Dombら，Po lymers for Advenced Technologies 3:279-292(1992)などのいくつかの刊行物に おいて検討されている。医薬製剤または獣医学製剤中の重合体の選択および使用 に関する追加的な教示は、Ｍ．ChasinおよびＲ．Langer(編),“Biodegradable P olymers as Drug Delivery Systems”,Vol.45,“Drugs and the Pharmacetical Sciences”,M.Dekker,New York,1990に記載されている。また、GLP-2アンタゴニ ストの徐放性を得るためにリポソームを使用することができる。関心のある薬物 のリポソーム製剤の使用方法および製造法に関する詳細は、とりわけ、米国特許 第4,944,948号、米国特許第5,008,050号、米国特許第4,921,706号、米国特許第4 ,927,637号、米国特許第4,452,747号、米国特許第4,016,100号、米国特許第4,31 1,712号、米国特許第4,370,349号、米国特許第4,372,949号、米国特許第4,529,5 61号、米国特許第5,009,956号、米国特許第4,725,442号、米国特許第4,737,323 号、米国特許第4,920,016号に記載されている。GLP-2アンタゴニストの局所的高 濃度または持続性循環レベルを得るのが望ましい場合には、 徐放製剤に特に関心が持たれる。 GLP-2アンタゴニストは、内因性GLP-2活性に拮抗するのに有効な量の該ペプチ ドを単位量または複数投与量で含有する無菌充填バイアルまたはアンプルの形態 で用いることができる。該バイアルまたはアンプルは、そのまま投与できる製剤 として、GLP-2アンタゴニストおよび所望の担体を含有することが可能である。 あるいは、該バイアルまたはアンプルは、適当な担体（例えば、リン酸緩衝食塩 水）中での再構成に適した形態（例えば、凍結乾燥形態）中にGLP-2ペプチドを 含有することが可能である。 注射剤の代わりに、他の投与経路用にGLP-2アンタゴニストを製剤化すること ができる。錠剤、カプセル剤などの経口投与形態は、標準的な医薬的または獣医 学的慣例に従い製剤化することができる。 最後に、体重の減少または他の治療適応症のためのGLP-2アンタゴニストの長 期的運搬は、遺伝子治療技術により行なうことができる。例えば、高レベルのGL P-2アンタゴニストを発現するようにex vivoで細胞を操作し、ついで、治療効果 を得るためにそのような細胞を対象動物またはヒトに移植することができる。 Ｇ．本発明のGLP-2アンタゴニストの投与 治療に最も適した治療的投与および方式は、勿論、治療する疾患または状態、 患者の体重および他のパラメーターによって異なる。本明細書において以下に記 載する結果は、約1mg/kg〜100μｇ/kg（またはそれ未満）と同等のGLP-2アンタ ゴニストの用量を１日２回、10日間にわたり投与すると、小腸の質量の非常に有 意な減少が得られることを示している。それよりはるかに少ない用量（例えば、 μg/kgの範囲）およびより短いか又はより長い持続期間あるいは治療頻度であっ ても、治療的に有用な結果（すなわち、特に小腸の質量の統計的に有意な減少） が得られると考えられる。ヒトでの使用に最も適した用量の大きさおよび投与方 式は、本明細書に記載の結果から導かれ、適切に計画された臨床試験で確認する ことができる。 有効量および治療プロトコールは、通常の手段で決定することができる。すな わち、実験動物において低用量で開始し、ついで効果をモニターしながら投与量 を増加させる。また、投与方式も体系的に変化させることができる。所定の患者 に対する最適投与量の決定の際には、臨床家が多数の要因を考慮することができ る。これらのうち最も重要なのは、血漿中を通常循環しているGLP-2の量であり 、これは、健康な成人では、安静状態においては151pmol/mlのオーダーであり、 栄養摂取後には225pmol/mlまで上昇する(Orskov,C.およびHolst,J.J.，1987,Sca nd.J.Clin.Lav.Invest.47:165)。追加的な要因には、患者の大きさ、患者の年齢 、患者の全身状態、治療する個々の疾患、疾患の重症度、患者中の他の薬物の存 在、GLP-2アンタゴニストのin vivo活性などが含まれる。動物研究の結果および 臨床文献を考慮した後、試験投与量を選択することとなる。in vitro結合競合ア ッセイから導かれる結合定数およびKiなどの情報を、in vivoでのGLP-2アンタゴ ニストの算出半減期と同様に、投与量の計算において使用することができると、 当業者に理解されるであろう。 ヒトにおける典型的なGLP-2アンタゴニストの用量は、約10μｇ/kg体重/日〜 約10mg/kg/日、好ましくは、約50μg/kg/日〜約5mg/kg/日、最も好ましくは、約 100μｇ/kg/日〜1mg/kg/日であろう。本発明のGLP-2アンタゴニストはGLP-2より 10〜100倍も強力であると考えられるため、そのようなGLP-2アンタゴニストの典 型的な用量は、より少なくてもよく、例えば、約100ng/kg体重/日〜1mg/kg/日、 好ましくは、1μｇ/kg/日〜500μｇ/kg/日、より好ましくは、1μｇ/kg/日〜100 μｇ/kg/日とすることができる。実施例１：GLP-2アンタゴニストの合成 以下のGLP-2アンタゴニストペプチドを合成した： [Gly²,Ala¹⁹]GLP-2、[Gly²,Ala²²]GLP-2、[Gly²,Ala²⁹]GLP-2、[Gly²,Ala³²]GLP -2、[Gly²，Ala³³]GLP-2、ラットGLP-2(2-33)、ラットGLP-2(3-33)、ラットGLP- 2(4-33)、ラットGLP-2(5-33)、[Leu²]GLP-2、[Glu²]GLP-2、[Arg²]GLP-2、[Trp² ]GLP-2、[Cys²]GLP-2、[PO₃-Tyr²]GLP-2および[Phg²]GLP-2。 １グラム当たり0.5ミリ当量（meq）の置換を有する６グラム（g）のクロロメ チル（Merrifield）樹脂（C末端が遊離した酸ペプチドの場合）を使用して、３ ミリモル（mmol）のスケールで、300ミリリットル（ml）容器中、手動で固相ペ プチド合成（SPPS）を行なった。アミノ酸を、アミノ末端においてt-ブチルオキ シカルボニル（tBoc）基で保護した。三官能性アミノ酸の側鎖を、ベンジル （Bz、セリンおよびトレオニンの場合）、ベンジルオキシメチル（BOM、ヒスチ ジンの場合）、2-ブロモベンジルオキシカルボニル(2-BrZ、チロシンの場合）、 2-クロロベンジルオキシカルボニル(2-CIZ、リジンの場合）、シクロヘキシル（ cHex、アスパラギン酸およびグルタミン酸の場合）およびトシル（Tos、アルギ ニンの場合）基で保護した。第１アミノ酸を、保護された該アミノ酸のエステル 化により、フッ化カリウム（KF）の存在下、クロロメチル樹脂に結合させた。0. 5meq/gの置換を有する6gの樹脂を使用して、4-メチルベンズヒドリルアミン（MB HA）樹脂上、3mmolのスケールでＣ末端アミドペプチドを合成した。文献記載の ペプチド伸長法に従い、第１アミノ酸をMBHA樹脂に結合させた。 ジクロロメタン（CH₂Cl₂）中の50％トリフルオロ酢酸（TFA）を使用してアミ ノ基の脱保護を行ない、ついでCH₂Cl₂中の10％トリエチルアミン（Et₃N）での２ 回の洗浄により中和した。CH₂Cl₂／ジメチルホルムアミド（DMF）中、N,N-ジシ クロヘキシルカルボジイミド／1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（DCCIHOBt）で 活性化することにより、ペプチドの伸長を行なった。各伸長工程の後、成長中の ペプチド鎖をCH₂Cl₂中の20％Ac₂Oでキャッピングした。それぞれの伸長、キャッ ピングおよび脱保護工程の後、該ペプチド−樹脂をイソプロパノール（iPrOH） およびメタノール（MeOH）で洗浄した。それらの洗浄を１回繰返した。記載され ているとおりの脱保護および中和の後、CH₂Cl₂中の20％Ac₂Oでの末端アミノ基の アセチル化により、Ｎ末端アセチルペプチドを調製した。ジメチルスルフィド（ DMS）とスカベンジャーとしてのp-クレーゾールとを含有するフッ化水素（HF） を使用する低−高（low-high）法により、樹脂結合産物を常套的に切断した。 アセトニトリルで修飾される水中の0.1％TFAでの勾配溶出を用いるVydac C18 、15〜20μｍ幅の孔、２インチ×12インチの逆相シリカカラムを使用する分取高 速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、粗製ペプチドを精製した。溶出を22 0ナノメートル（nm）でモニターした。アセトニトリルで修飾される水中の0.1％ TFAを用いる勾配溶出によるVydac C18、5μｍ、4.6×254ミリメートル（mm）の 逆相シリカカラムを使用する分析HPLCにより、集めた各画分を純度に関して分析 し、215nmでモニターした。95％を超える純度を示す画分を合わ せ、凍結乾燥した。凍結乾燥粉末の水中溶解により（溶解を助けるために必要に 応じてアセトニトリルを加える）、該ペプチドの酢酸塩をTFA塩から調製した。 該溶液を、プロトン化したBio-Rex-70陽イオン交換樹脂に通した。ベッド容量の ５倍量の水で該樹脂を洗浄し、樹脂に結合したペプチドを水中の50％酢酸で溶出 した。該溶出物を水で希釈し、凍結乾燥した。 Vydac C18、5μｍ、4.6×254mmの逆相シリカカラムを使用する２つの分析用逆 相HPLC方法により、最終的な凍結乾燥粉末を純度に関して分析した。２つの溶媒 系（アセトニトリルで修飾した、トリエチルアミンホスファートでpH2.25に調整 した水の勾配；およびアセトニトリルで修飾される水中の0.1％TFAの勾配）を使 用した。該カラム溶出物を215nmでモニターした。各産物が何であるかは、アミ ノ酸分析および電子分光（electrocopy）−質量分析により確認した。 つぎにGLP-2アンタゴニストを、以下の実施例２に記載のとおりに製剤化した 。特に示さない限り、GLP-2アンタゴニストのそれぞれは、室温で完全に水溶性 であった。実施例２：GLP-2アンタゴニストの製剤化 GLP-2アンタゴニストを、リン酸緩衝生理食塩水中またはゼラチン含有デポー 製剤として注射用に製剤化した。PBSで製剤化するGLP-2アンタゴニスト製剤の場 合には、まず、8OgのNaCl(BDH ACS 783)、2gのKCl(BDH ACS 645)、11.5gのNa₂HP O₄（Anachemia AC-8460）および2gのKH₂PO₄（Malinckrodt AR7100）を使用して1 0×ストックPBS溶液を調製し、これを無菌蒸留水で１リットルの合計容量にした 。該ストック溶液を無菌蒸留水で10：１希釈することにより最終的なワーキング 溶液を得、必要に応じて、十分な容量の10N NaOHを使用してこれをpH7.3〜7.4に 調整した。ついで該ワーキング溶液を30分間、高圧滅菌した。最終的なワーキン グPBS溶液において、濃度は、137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na₂HPO₄・7H₂Oおよ び1.4mM KH₂PO₄であった。 所望のペプチド濃度を有する製剤を得るのに要求されるとおりに、粉末化ペプ チドとしてのGLP-2アンタゴニストを該ワーキングPBS溶液に加えた。例えば、13 0mg/lのGLP-2アンタゴニストのPBS溶液を得るために、5.2mgのGLP-2アンタゴニ ストを40mlのPBSに溶解して130μｇ/mlの濃度のGLP-2アンタゴ ニストを得、濾過滅菌した。0.5mlのGLP-2アンタゴニスト溶液を毎日２回注射し た。 ゼラチンをベースとしたGLP-2アンタゴニスト製剤を得るためには、まず、12 グラムのゼラチン(Sigma，ブタの皮膚からのG-8150 Lot#54HO7241 Type A[9000- 70-8]〜300ブルーム(Bloom))を100mlの蒸留水に溶解することにより、ゼラチン 溶液を調製した。ついで該ゼラチン溶液を高圧滅菌し、37℃で加温し、前記のと おりにリン酸緩衝生理食塩水に予め溶解したGLP-2アンタゴニストを加えて、特 定の所望のペプチド濃度を得た。例えば、130mg/lの濃度のGLP-2アンタゴニスト の、ゼラチンをベースとしたPBS溶液を得るためには、5.2mgのGLP-2アンタゴニ ストで調製した10mlのPBS溶液を、前記で最初に説明した30mlの20％ワーキング ゼラチン溶液で希釈した。穏やかにピペッティングすることにより該溶液を混合 して、PBS/15％ゼラチン中の130mg/l GLP-2アンタゴニストの最終溶液を得た。実施例３：ジペプチジルペプチダーゼIVに対する抵抗性に関するアッセイ ジペプチジルペプチダーゼIV（DPP-IV）に対する抵抗性に関して、以下のペプ チドを試験した：対照ペプチドであるラットGLP-2、[D-Ala²]ラットGLP-2アゴニ スト、および[Gly²]ラットGLP-2アゴニスト。また、DPP-IV抵抗性に関して、以 下のペプチドも試験した:[Gly²,Ala¹⁵]GLP-2、[Gly²,Ala²²]GLP-2、[Gly³,Ala²⁹ ]GLP-2、[Gly²,Ala³²]GLP-2、[Gly²,Ala³³]GLP-2、[Leu²]GLP-2、[Glu²]GLP-2、 [Arg²]GLP-2、[Trp²]GLP-2、[PO₃-Tyr²]GLP-2および[Cys²]GLP-2。該アッセイを 行なうために、50％グリセロール、10mM Tris(pH7.8)、EDTAおよび0.02％NaN₃中 に0.125ミリ単位(mU)の酵素を含有するヒト胎盤DPP-IV(Calbiochem，La Jolla， CA，cat．#317624)の溶液2.5マイクロリットル（μｌ）を、pH7.4のPBS中0.2mg/ mlの濃度で調製した試験ペプチドの溶液50μｌに加えた。該混合物を循環水浴中 37℃で24時間インキュベートした。PBS中4mg/mlの濃度で調製したジプロチンＡ の溶液50μｌを加えることにより、該インキュベーションをクエンチした。各ペ プチドは、二連で試験した。 逆相（RP）HPLCにより各サンプルを以下のとおりに分析した。クエンチしたイ ンキュベーション混合物90μｌをRainin Dynamax 300Å、C18、５ミクロン、 4.6×250ミリメートルのカラム上に注入した。直線勾配および1ml/分の流速によ り、0.1％アセトニトリルで修飾される水中の0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）で 該サンプルを溶出した。サンプル成分を214ナノメートル（nm）で検出した。切 断産物に対応するピークの相対積分により(残りの未消化親ペプチドのものと比 較した)、切断の度合を測定した。対照ペプチドであるラットGLP-2(1-33)の切断 産物（これは、ラットGLP-2(3-33)であるはずである）が残基Ala²とAsp³との間 の切断から生じたことが、この成分の保持時間を合成ペプチド標準（ラットGLP- 2(3-33)）の保持時間と比較し、HPLCから該産物を集め、質量分析により分析す ることにより確認した。 24時間のインキュベーション後、対照ペプチドであるラットGLP-2の22％をDPP -IVにより切断した。ペプチド[D-Ala²]ラットGLP-2、[Gly²]ラットGLP-2、[Gly² ,Ala¹⁵]GLP-2、[Gly²,Ala²²]GLP-2、[Gly²,Ala²⁹]GLP-2、[Gly²,Ala³²]GLP-2、[ Gly²,Ala³³]GLP-2、[Leu⁷]GLP-2、[Glu²]GLP-2、[Arg²]GLP-2、[Trp²]GLP-2、[P O₃-Tyr²]GLP-2および[Cys²]GLP-2に関しては、24時間後、切断産物は検出されな かった。実施例４：マウスへの投与によるGLP-2アンタゴニストの評価 投与対象は、Charles River Laboratory(Ontario,Canada)から入手したCD1マ ウスであった。特に示さない限り、これらのCD1マウスは、注射時の齢を６週齢 に一致させた雌であった(１群当たりn=3〜4)。各実験の開始前に該動物を、最低 24時間、実験施設に順応させた。動物を耳パンチにより標識した。実験中、該マ ウスには餌や行動に制限を課さなかった。明期／暗期の周期は、午後６から午前 ６時までの12時間であった。対照は齢および性別を一致させた動物であった(n=3 〜4)。PBSの合計容量0.5cc中のペプチド2.5μｇを、マウスに１日２回（b.i.d） 皮下注射し、該マウスを実験施設内で毎日モニターした。動物を、注射の10日ま たは14日後に屠殺した。屠殺する前に少なくとも20時間、絶食させた。 該マウスをCO₂で麻酔し、心臓穿刺により採血した。血液を75μｌのTED（Tras ysol;EDTA(5000KIU/ml:1.2mg/ml;ジプロチン-A)）中に集め、該血液を14k×gで ５分間遠心分離し、分析前に血漿を−70℃で保存した。腹膜腔から小 腸（幽門から盲腸まで）を摘出し、洗浄し、秤量し、測定した。比較のために、 各動物からの切片を、同じ解剖学的位置から得た。近位空腸、遠位空腸および遠 位回腸を表す組織形態計測のために幽門から8±2cm、18±2cm、32±2cmの位置か ら、それぞれ1.5〜2.0cmの長さの断片を得た。各小腸断片を、組織ブロック中、 その腸間膜対側縁上で縦方向に開き、ついで10％ホルマリン（vol./vol.）上に 一晩配置し、ついで70％ETOHに移した。 ビヒクルのみで処理したマウスに対する、アンタゴニストで処理したマウスの 腸重量の平均変化を、ビヒクルのみで処理したマウスの平均腸重量で割り、この 数字に100を掛けることにより、小腸の重量の変化率（％）を計算した。 これらの結果は、アラニン残基による15、29、32または33位の保存残基の置換 を含有するヒトGLP-2のアンタゴニストをマウスに注射すると、実際に、小腸の 重量が減少することを証明している。これに対して、これらの位置に野生型残基 を含有する（しかし、Gly²置換を含有している）ヒトGLP-2の類似体を同じ実験 プロトコールでマウスに注射すると、小腸の重量は増加するであろう（データは 示していない）。したがって、本発明者らは、15、29、32または33位の残 基の置換が、GLP-2の機能的活性を部分的に損ない、GLP-2アンタゴニストを与え ると結論する。 さらに、このデータはまた、Gly以外のアミノ酸残基（特に、Leu、Glu、Arg、 Trp、Cys、PO₃-TyrおよびPhg）によるAla²位の置換がアンタゴニスト活性を与え るという非常に驚くべき結果を示している。実施例５：GLP-2とのマウスへの共投与によるGLP-2アンタゴニストの評価 候補ペプチドアンタゴニストおよびラットGLP-2を、示されているとおりにア ンタゴニスト25μｇ／GLP-22.5μｇ(リン酸緩衝生理食塩水0.5ml当たり)（10：1 の比の場合）またはアンタゴニスト12.5μｇ／GLP-22.5μｇ（リン酸緩衝生理食 塩水0.5ml当たり）(4：1の比の場合)の最終比率が得られるようにPBSに溶解した 。該アンタゴニスト／GLP-2混合物を6〜8週齢のCD1雌マウスに皮下投与した。こ の場合、注射したペプチドの量は、アンタゴニスト25μｇ／GLP-22.5μｇ（0.5m l中、１日２回）またはアンタゴニスト12.5μｇ／GLP-22.5μｇ(0.5ml中、１日 ２回)であった。10〜14日後、ペプチドを注射したマウスおよび対照マウス（生 理食塩水を注射したマウス）を屠殺し、小腸の重量を測定した。 これらの結果は、GLP-2の最初の1〜4個の残基の欠失が、実験マウスへの同時 注射の際にラットGLP-2の腸栄養活性に拮抗するアンタゴニストを与えることを 示している。これらの結果は、少なくとも２つの理由で有意義なものである。ま ず第１に、このデータは、GLP-2ペプチドの最も遠方の（extreme）アミノ末 端が、GLP-2の腸栄養効果に関与していることを示している。したがって、欠失 の代わりに、この末端を破壊する他の改変、例えば、逆の特性を有するアミノ酸 での置換もまた、得られる類似体にアンタゴニスト活性を伝える可能性があるで あろう。第２に、アンタゴニストおよびGLP-2の共投与は、GLP-2の腸栄養効果を 減少させ、または更には除去するように作用するであろう。したがって、GLP-2 の過剰の産生が生じた状態にある患者、例えば、GLP-2を分泌する及び／又はGLP -2ペプチドに栄養的に応答する腫瘍を有する患者に、GLP-2のアンタゴニストを 投与することができる。 文献の援用 引用したすべての特許、特許出願および刊行物を、参考として本明細書に組入 れることとする。 均等物 以上の明細書の記載は、当業者が本発明を実施するのに十分なものである。実 際には、分子生物学、タンパク質化学、医学の分野または関連分野の当業者に明 らかな、本発明の実施のための前記手段の種々の改変が、以下の請求の範囲の範 囲内に含まれると意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ドラッカー，ダニエル，ジェイ. カナダ国 エム６ビー ３ジー３ オンタ リオ州，トロント，ファーンウッド ロー ド 19 (72)発明者 クリビシ，アンナ，イー. カナダ国 エム６エイチ ３ビー５ オン タリオ州，トロント，ヘイブロック スト リート 64 (72)発明者 サムナー―スミス，マーティン カナダ国 エル７イー ３ブイ４ オンタ リオ州，ボルトン，キングスビュウ ドラ イブ 110

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第１参照哺乳動物GLP-2のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含んで なるポリペプチドであって、該ポリペプチドが突然変異していることにより、（ i）最初の４個のＮ末端残基の任意の1〜4個が欠失している、または（ii）ヒトG LP-2のAsp¹⁵、Phe²²、Thr²⁹、Thr³²およびAsp³³のアミノ酸位置に対応するアミ ノ酸位置から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が、該参照GLP-2のその位置に 天然には存在しないアミノ酸で置換されている、または（iii）Ala²位が、Leu、 Cys、Glu、Arg、TrpおよびPO₃-Tyr²よりなる群から選ばれるアミノ酸で置換され ている、または(iv)(i)、(ii)および／または（iii）の組合せが突然変異してお り、該ポリペプチドがGLP-2アンタゴニスト活性を示すことを特徴とするポリペ プチド。 ２．前記参照哺乳動物GLP-2が、ヒトGLP-2、デグーGLP-2、ウシGLP-2、ブタGL P-2、モルモットGLP-2およびハムスターGLP-2よりなる群から選ばれる、請求項 １に記載のペプチド。 ３．前記参照哺乳動物GLP-2がヒトGLP-2である、請求項１または２に記載のペ プチド。 ４．Asp¹⁵、Phe²²、Thr²⁹、Thr³²およびAsp³³よりなる群から選ばれる位置に 置換を有する、請求項１、２または３のいずれか１項に記載のペプチド。 ５．[Leu²]GLP-2、[Glu²]GLP-2、Arg²]GLP-2、[Trp²]GLP-2、[PO₃-Tyr²]GLP-2 および[Cys²]GLP-2よりなる群から選ばれる、請求項１、２または３のいずれか １項に記載のペプチド。 ６．GLP-2(2-33)である、請求項１、２または３のいずれか１項に記載のペプ チド。 ７．GLP-2(3-33)である、請求項１、２または３のいずれか１項に記載のペプ チド。 ８．GLP-2(4-33)である、請求項１、２または３のいずれか１項に記載のペプ チド。 ９．GLP-2(5-33)である、請求項１、２または３のいずれか１項に記載のペプ チド。 10．ペプチドが、（i）Val、GlyまたはD-AlaによるAla²の置換、（ii）Leu、I le、NleまたはAlaによるMet¹⁰の置換、（iii）アミノ末端保護基、および（iv） カルボキシ末端保護基よりなる群から選ばれる１以上の置換をさらに含む、請求 項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。 11．[Gly²，Ala¹⁵]GLP-2、[Gly²，Ala²²]GLP-2、[Gly²，Ala²⁹]GLP-2、[Gly², Ala³²]GLP-2および[Gly²,Ala³³]GLP-2よりなる群から選ばれる、請求項10に記載 のペプチド。 12.請求項1〜11のいずれか１項に記載の治療的に有効な量のペプチド及び医薬 上許容される担体を含んでなる医薬組成物。 13．GLP-2の機能的アンタゴニストの有効量を患者に投与する工程を含んでな る、患者の小腸組織の増殖を抑制する方法。 14．小腸組織の過形成の減少または低形成の誘導を引き起こす請求項１〜11の いずれか１項に記載の治療的に有効な量のペプチドを患者に運搬する工程を含ん でなる、患者の小腸組織の過形成を減少させるか又は低形成を誘導する方法。 15．該患者が肥満に罹患しているか、または該患者が化学療法または放射線療 法での治療前に腸の休止を要する、請求項14に記載の方法。 16．胃腸疾患の病理的効果または症状を改善する請求項１〜11のいずれか１項 に記載の治療的に有効な量のペプチドを胃腸疾患を有する患者に投与することを 含んでなる、胃腸疾患の治療方法。 17．該胃腸疾患が、小腸癌、コレラ、過敏性腸、腸運動障害および慢性下痢よ りなる群から選ばれる、請求項16に記載の方法。 18．（1）(i)少なくとも１つのアミノ酸の欠失、および（ii）少なくとも１つ のアミノ酸位置の、その位置に天然には存在しないアミノ酸による置換、および （iii）(i)および（ii）の組合せから選ばれる構造的改変を有するGLP-2類似体 を得る工程、 （2）小腸の重量の減少を惹起しうる治療方式を用いて該類似体で哺乳動物を処 理する工程、 （3）小腸の重量に対する該類似体の効果を、ビヒクルのみを与えた対照哺乳動 物との比較により判定し、それにより、GLP-2の機能的アンタゴニストを、該小 腸の重量の減少を惹起する類似体と同定する工程を含んでなる、GLP-2アンタゴ ニストの同定方法。 19．（1）(i)少なくとも１つのアミノ酸の欠失、および（ii）少なくとも１つ のアミノ酸位置の、その位置に天然には存在しないアミノ酸による置換、および （iii）(i)および（ii）の組合せから選ばれる構造的改変を有するGLP-2類似体 を得る工程、 （2）GLP-2のみを投与した場合に認められる小腸の重量の増加の減少を惹起しう る治療方式を用いて、GLP-2またはGLP-2の腸栄養性類似体と共投与する前記類似 体で哺乳動物を処理する工程、 （3）小腸の重量に対する該類似体の効果を、GLP-2のみ又はGLP-2の腸栄養性類 似体のみを与えた対照動物との比較により判定し、それにより、機能的アンタゴ ニストを、小腸の重量の増加の減少を惹起する類似体と同定する工程を含んでな る、GLP-2アンタゴニストの同定方法。 20．前記GLP-2類似体の構造的改変が、最初の４個のＮ末端残基の任意の１〜4 個の欠失である、請求項18または19に記載の方法。 21．前記GLP-2類似体の構造的改変が、Asp¹⁵、Phe²²、Thr²⁹、Thr³²およびAsp³³ から選ばれる位置の置換である、請求項18または19に記載の方法。 22．請求項18または19に記載の方法により同定されたGLP-2アンタゴニスト。