JP2000516705A - 分析的測定方法のための固体支持体、その製造方法並びにその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、実質的に不活性の固体支持体材料から構成されており、該支持体材料上で、親水性測定ゾーン（２）が疎水性コーティング（１）により相互分離されており、その際支持体上に１ｃｍ²当たり１０個以上の測定点が施されている、分析測定用の固体支持体（５）に関する。更に、本発明は、該支持体の製造方法、及び該支持体の、診断法、作用物質の探求、組合せ化学、作物保護、毒物学又は環境保護における使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 分析的測定方法のための固体支持体、 その製造方法並びにその使用 本発明は、実質的に不活性の固体支持体材料からなり、該支持体材料上に、表 面ローディング（surface loading）を有していてもよい、親水性測定ゾーンが 少なくとも１つの疎水性コーティングにより相互に分離されており、その際１ｃ ｍ²当たり１０個以上の測定点が施されている分析的測定方法のための固体支持 体に関する。更に、本発明は、前記支持体の製造方法、並びに該支持体の診断、 作用物質探求、組合せ化学（combinatatorial chemistry)、作物保護、毒物学又 は環境保護分野における使用に関する。 作物保護又は医学における作用物質探求の主課題は、新たな先導構造(lead st ructure)の同定及びこれらの構造から惹起される作用物質の開発である。 古典的作用物質探求においては、新規化合物の生物学的効果は、全ての生物、 例えば植物又は微生物におけるランダムスクリーニングで試験された。この目的 のためには、複雑な試験管内及び生体内試験方法が使用され、該試験方法では年 間に数百種の物質を試験することができたに過ぎない。 この場合、生物学的試験が、合成化学に対する制限 要因である。 分子生物学及び細胞生物学において開発された分子試験システムの提供は、該 状況に激烈な変化をもたらした。これらの分子試験システム、例えば受容体結合 アッセイ、酵素アッセイ又は細胞間相互作用アッセイは、一般にマイクロタイタ ープレートで５０〜２５０μｌの反応容量でたやすく実施しかつ容易に自動化す ることができる。これらの試験システムの自動化及び小型化は、高いサンプル処 理量を可能にする。この開発により、多数の異なる化学物質を作用物質の探求に おいて先導構造としての可能な使用のために試験することを可能にする。 現代の自動化された試験システムは、マススクリーニングにおいて１年間当た りに１００，０００種以上の化学物質をそれらの生物学的効果について試験する ことを可能にする。マイクロタイタープレートアッセイは、極めてしばしば使用 される。それというのも、一般に、該アッセイは低コストであり、極めて信頼で きかつ故障し難いからである。 これらの試験システムの有効性を完全に利用し尽くすことができるために、新 規の固相合成が組合せ化学において開発されかつなお開発し続けられている。 組合せ化学は、広範な多様性の異なる化合物、いわゆる物質ライブラリーを作 成することを可能にする。このことは特に、組合せ化学が自動化固相合成を使用 する場合に当てはまる（例えばUebersichtsartikl I．Med．Chem．1994，37，12 33及び1994，37，1385参照）。固相での合成は、大多数の化合物を合成すること ができかつ副生成物及び過剰の反応体を容易に除去することができるので、生成 物の費用のかかる精製が不必要であるという利点を有する。 組合せ化学における多数の合成した化合物により、現代の自動化した試験シス テムの性能を化学物質の多様性の側から完全に利用し尽くすことができる。しか し古典的作用物質合成とは異なり調査すべき化学物質は、組合せ化学を用いた合 成の際には任意の量では入手されないので、試験システムにおける必要な化学物 質量に基づき制限された数の試験システムを試験することができるに過ぎない。 作用物質探求、診断法、環境保護又は作物保護における試験システムの別の欠 点は、多数の試験システムのために必要な試薬、例えば酵素、抗体、受容体、蛍 光色素、放射性もしくはその他の標識したリガンド、サイトカイン、活性化因子 、阻害剤又はその他の試薬は高価かつ製造困難であり及び／又は十分な量では自 動化した試験のために提供されないことにある。 ドイツ国特許出願公開第４４３５７２７号明細書には、試験のために必要な試 薬を減少させるためのアプローチが記載されている。 この方法の欠点は、測定のための支持体をまず費用 をかけて多段階法で製造しなければならないことにある。 もう１つの欠点は、この支持体材料を用いて実施することができる反応は、固 相結合された反応、例えば抗体、抗原、ハプテン又は核酸間の反応体結合に制限 されることにある。溶液内での反応は、この方法では実施することができない。 従って、本発明の課題は、前記欠点を有せずに実施することができる新規の分 析方法を開発しかつ作用物質探求、診断法、環境保護、植物保護、毒物学又は組 合せ化学のために提供することであった。 前記課題は、冒頭に記載した固体支持体を測定法のために使用することにより 解決される。 ところで、極めて小さいマイクロタイタープレートキャビティー内では表面張 力によりマイクロタイタープレートの表面に対する反応液の付着又は毛管力のよ うな力が一層大きな役割を演じ、そうして反応キャビティーへの充填、ひいては 測定を不可能にするが故に、既存のマイクロタータープレート技術を益々小さな 反応キャビティー（＝ウエル）に更に小型化することを妨害している表面張力を 、本発明による支持体のために有利に利用することができることが判明した。 支持体の親水性測定ゾーンとは、反応液、ひいては反応体を塗布した後に測定 が行われる支持体の領域であると理解されるべきである（図１，３及び４におけ る数字２参照）。従って、これらはマイクロタイタープレートのウエルないしは キャビテイーに相当しかつ以下には測定ゾーン又は測定点と称する。 支持体の親水性測定ゾーンは、有利には疎水性ゾーン（図１〜４における数字 １参照）により包囲されている。これらの疎水性ゾーンは、支持体を完全に又は 一部分だけ不連続部をもってカバーする少なくとも１つの疎水性コーティングか ら構成されていてもよい。これらの不連続部（図１〜４における数字５参照）は 、有利には親水性であってよい。 本発明による支持体を実施例により図１〜４を参照して説明する。 測定ゾーン並びに該ゾーンを互いに分離する疎水性ゾーン（図１〜４における 数字１参照）は、例えばマイクロリソグラフィー、ホトエッチング、マイクロプ リント又はマイクロパンチ技術により施すか又はマスク技術を用いて吹き付ける ことができる。プリント配線板の製造技術から、プレート又はロールの表面を意 図的に特定の位置を疎水性にしかつ別の位置を親水性にすることができる光化学 的方法が公知である。この技術を用いれば、例えば簡単にガラス板又は金属板に 、疎水性マージン（図１〜４における数字１参照）により包囲された、数千の規 則的に配置された親水性測定ゾーン（図１〜４における数字２参照）のグリッド を製造することができる。この場合には、まず１つ以 上の疎水性コーティングを支持体に施しかつ引き続き測定ゾーンを所望の位置に 施すか、又は逆にまず親水性測定ゾーン、次いで疎水性ゾーン又は両者を同時に 施すことができる。多重に親水性測定ゾーンを同じ位置に施すこともできる。 図２は、例としてマイクロタイタープレートの大きさの本発明による支持体を 示す。 測定ゾーンは、任意の形を有することができ、円形の測定ゾーンが有利である 。 単数又は複数の疎水性コーティングは、つながって支持体に施されていいても よいが、又は任意の形状の不連続部を有していてもよい。これらはまた測定ゾー ンの周囲の分離したゾーンであってもよく、親水性測定ゾーンを相互に分離する 疎水性のリングが有利である。 単数又は複数の疎水性コーティングは、測定ゾーンが内外に拡がるのを阻止し 、かつそうして個々の反応混合物の正確な測定を可能にすべきである。 原理的には、あらゆる任意の数の測定点を支持体上に施すことが可能であるが 、１ｃｍ²当たり１０個以上の測定点、特に１ｃｍ²当たり１５個以上の測定点、 １ｃｍ²当たり２０個以上の測定点が最も有利である。この場合には、数ｎｌ〜 μｌの容量が施され、有利には５μｌ未満、特に有利には１μｌ以下の容量が施 される。 測定点は、支持体上に任意の所望のグリッドで施すことができ、かつ正方形又 は長方形のグリッドが有利である。 不活性の固体支持体は、小さい凹所（図４参照）を測定ゾーンの位置に有して いもい、同じタイプのブロックの平坦、平面のプレート又は任意の形及び大きさ のシートのからなっていてもよく、この場合平面状支持体（図３参照）が有利で ある。長方形又は正方形の支持体が有利であり、特に有利であるのは、標準マイ クロタイタープレート（１２７.５ｍｍ×８５.５ｍｍ）又はそれも大きいもしく は例えばいわゆるテラサキ・プレート（８１ｍｍ×５６ｍｍ、６０個の測定点） のように小さくてもよいマイクロタイタープレートの整数倍の大きさの長方形の 支持体である。本発明による支持体の有利な大きさは、自動化されたマイクロタ イタープレート技術の全周辺を改造することなく使用することができるという利 点を有する。 支持体は、例えばガラス、セラミック、石英、金属、石、木材、プラスチック 、ゴム、珪素、ゲルマニウム又は磁器のような材料からなっていてもよい。これ らの材料は、純粋な形で、混合物、合金もしくはブレンドとして又は種々の層で 又は例えばプラスチックもしくは塗料を被覆した後に本発明による支持体として 使用することができる。顕微鏡、カメラアシステッド試験及びレーザアシステッ ド試験のようなあらゆる視 覚的試験のために適当である石英、ガラス、プラスチック、ゲルマニウム又は珪 素からなる透明な支持体から製造するのが有利である。 透明なプラスチックとしては、単層又は多層でアクリルニトリル／ブタジエン ／スチレンからなるポリマーと同じ屈折率を有する、又は多層で、例えばポリス チレン及びブタジエンからなるブロックコポリマー（いわゆるポリスチレン／ブ タジエンブレンド）のような、プラスチック成分の領域が、光の波長よりも小さ い帯域を形成する、異なる屈折率を有するあらゆる無定形のプラスチック材料が 適当である。 この関係で挙げることができる特に適当な透明なプラスチックは、ポリスチレ ン、スチレン／アクリルニトリル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＣＶ （＝ポリ塩化ビニル）、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、シリコーン 、ポリエチレン／アクリレート、ポリラクチド又はセルロールアセテート、セル ロースプロピオネート、セルロースブチレート又はそれらの混合物である。検出 又は反応の誘導が近赤外線を介して必要である用途のためには、珪素又はゲルマ ニウム支持体が特に有利である。 本発明による支持体は、アッセイの際にチャージングステーション、インキュ ベーションステーション又は検出ステーションを通過することができるコンベア ベルトの形で構成されていてもよい。 本発明による支持体を製造する方法は、例えばセラミックプレート、石英プレ ート又はガラスプレートから出発する。このために、支持体を有利にはまず清浄 剤、例えばアルコール、アルカリ性クリーナー又は酸性クリーナー、例えばReac alc^(R)（これは、製造元Chemotec GmbHによれば燐酸及び界面活性剤を含有する ）で清浄化する。清浄化を改良するためには、清浄化を有利には超音波浴内で実 施することができる。清浄化後に、支持体を直接又は水及び／又はアルコールも しくはアルコール／水混合物で濯いだ後に乾燥させる。支持体の疎水性コーティ ングは、例えば溶剤、例えばイソプロパノール／Ｈ₂Ｏ（９：１）中の１％のヘ キサデシルトリメトキシシラン溶液でパンチ技術を用いて行う。パンチを、短時 間ガラススライド上に１％のヘキサデシルトリメトキシシラン溶液を塗布するた めにプレスする。引き続き、支持体を乾燥させる。有利には、ガラス支持体を高 めた温度、即ち８０℃以上の温度で乾燥させる。有利には、支持体を乾燥後に再 度過剰の１％のヘキサデシル−トリメトキシ−シランを除去するために、例えば アルコール／水混合物、例えばイソプロパノール／Ｈ₂Ｏ（９：１）で清浄化す る。 場合により、このパンチ技術で親水性測定点の領域内に付加的な表面ローディ ングを施す。この表面ローディングは、例えば蛋白質、酸性もしくは塩基性のポ リマー、例えばポリリシン又は酸性もしくは塩基性分 子の塗布により形成することができる。 サンプル材料及び試薬を施すためには、数ｎｌ〜数μｌの液体量を配量するこ とができるあらゆる方法、例えばインク・ジェト技術が適当である（ドイツ国特 許出願公開第４０２４５４４号明細書参照）又はフロー・サイトメトリー（flow cytometry）、いわゆる細胞選別器（Horan，P.K.，Wheeless，L.L.，Quantitat ive Single Analysis and Sorting，Science 1977，198，149-157）を使用する ことができる。この場合、滴形成は、圧電滴形成（超音波）、圧電滴エジェクシ ョン又は蒸発によるエジェクション（インク・ジェト技術）により行うことがで きる。永久滴形成装置を有するシステム又は要求に応じて滴を発生するシステム を使用することができる。 この技術を用いると、例えば支持体を単数又は複数の並列配置されたノズルの 下を配量された液体のリズムに応じてかつ所定のグリッドに応じて運動させるこ とにより、支持体の多重分析表面に正確に配量しかつ標的に合わせてプレースす ることができる。同様に、例えば少なくとも１つのノズルからなる計量装置を支 持体上を計量された液体のリズムに応じてかつ所定のグリッドに応じて運動させ ることもできる。 これらの技術を用いると、必要であれば、異なる試薬及び／又は個々の細胞を 支持体表面上の所定の位置（測定位置）にプレースしかつ反応させることができ る。本発明による有利な数ナノリットル〜数マイクロリットルの範囲内の少容量 の場合反応体の混合物が極めて急速に侵入し、その結果特別の機械的な混合装置 が不必要であるという利点がある。また、実際の分析を実施するための液体小滴 の添加前に特定のリガンド、例えば蛋白質又は核酸が支持体上に吸着された又は 化学的に結合された形で測定サンプル又は試薬の計量供給前に既に存在すること もできる。 本発明による支持体の別の利点は、例えば試験すべき化学物質、酵素、細胞又 はその他の反応体のような物質、場合により自動化された並列の反応混合物の更 なる増大による時間、反応混合物の更なる少量化によるスペース及びスタッフ需 要の倹約、ひいてはまた最終的にまた費用の倹約にある。 支持体上にプレースされる小滴は、ゲル小滴の形で支持体に形で施し、これを 場合により引き続き固化し、そうして反応液体の蒸発を減少させることもできる 。 反応液体（図３及び４における数字３参照）の蒸発は、疎水性液体のオーバー コーティング（図３及び４における数字４参照）（この場合には単数又は複数の 疎水性コーティングがアンカーのように作用する）によっても減少させることも できる（図３及び４）。オーバーコーテイングのためには、シリコーン油のよう な低粘度の油を使用するのが有利である。 蒸発はまた支持体をほぼ水蒸気飽和雰囲気内でインキュベーションすることに より減少させることもできる。 支持体の冷却により、蒸発を同様に減少させることもできる。 個々の前記の手段又はそれらの混合物を蒸発の減少のために使用することがで きる。 本発明による支持体は、原理的に今日マイクロタイタープレートで実施される あらゆる分析法、例えば比色定量法、蛍光測定法又はデンシトメトリック法のた めに適当である。この場合、ここで可能な測定量の若干のものを挙げれば、光散 乱、混濁、波長依存光吸収、蛍光、発光、ラマン散乱、ＡＴＲ（＝Attenuated T otal Reflection）、放射能、アイソトープ標識、ｐＨ変化又はイオンシフト、 有利には単独に又は組合わせて利用及び測定することができる。 ここでは、本発明による支持体で実施可能な分析方法の例として、抗原に対す る抗体の結合、受容体とリガンドの間の相互作用、酵素による基質分子の特異的 分離、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、凝集試験、又は異なった又は同じ細胞 タイプの間の交互作用、例えば酵素アッセイ、滴定アッセイ、例えばウイルス滴 定アッセイ、赤血球もしくは血小板凝集アッセイ、ラテックスビーズを用いた凝 集アッセイ、ＥＬＩＳＡ（＝Enzyme-linked immunosorbent assay)又はＲＩＡ（ ＝Radioimmunoassey）が挙げられる。 本発明による支持体は、例えば診断、作用物質探求、組合せ化学、植物保護、 毒物学、環境保護において、例えば細胞毒物学的試験において、医学又は生化学 において使用することができる。 本発明による支持体は、特にマススクリーニングのために好適である。 本発明による支持体は、特に現代のイメージ・アクワイヤリング及びイメージ 分析システムのために好適である。 以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、但し以下の実施例は本発明 を限定するものではない。 例１ ガラススライドからなる本発明による支持体の製造 まず、ガラススライドを酸性清浄剤(Reacalc^(R)，Chemotec GmbH提供)の２０ ％の水性溶液で超音波浴内で１０分間清浄化した。引き続き、ガラススライドを 水で、次いで無水のエタノールで清浄化しかつ約２３℃で乾燥させた。 マイクロパンチを用いて、親水性支持体に疎水性コーティングを疎水性リング の形（図１〜４参照）で施した。疎水性層を施すために、イソプロパノール／Ｈ₂ Ｏ（９：１）中の１％のヘキサデシルトリメトキシシラン溶液を使用した。シ ラン溶液中に浸漬したパンチを短時間、約５秒間、支持体にプレスしかつ引き続 き 支持体を１００℃で１５分間乾燥させた。過剰のシラン溶液を、支持体をイソプ ロパノール／Ｈ₂Ｏ（９：１）中に約１分間浸漬することによって支持体から除 去した。２つのタイプのパンチを１ｃｍ²当たり１２及び２５個の測定点を施す ために使用した。 例２ 本発明による支持体を用いたプロテアーゼ阻害剤アッセイ 例１に記載した方法に基づき製造した支持体を用いて、プロテアーゼ阻害剤ア ッセイを実施した。 ９５％以上の相対空気湿度を有する室内で、Microdrop，Norderstedtのマイク ロ計量装置を使用して、前記のようにして製造したスライドにそれぞれ１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８.５)中の蛍光イソシアネート標識したカゼイン（ ２０μｇ／ｍｌ）の溶液１００ｎｌを施した。反応小滴の配置は、パンチにより 施した疎水性ゾーン（＝遮断層）に相応して２×２ｍｍグリッド内に８行及び１ ２列で行った。疎水性リングの幅は、それぞれ０.４ｍｍであった。 引き続き、それぞれ異なったプロテアーゼ阻害剤１ｎｌを１０ｍＭトリス／Ｈ Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８.５）中の１ｍＭ濃度でマイクロドロップ装置を用いて反応 サンプルに添加した。該添加は、正確に予め施した蛍光標識したカゼイン溶液中 で行った。対照としては、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.５）１ナノ リッ トルを使用した。 最後に、プロテアーゼトリプシン１０ｎｌをトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８. ５）中の１０ｍｇ／ｍｌの濃度で反応に添加した。 引き続き、反応滴を蒸発を減少させるために、マイクロドロップ装置で施した 鉱油、シリコーン油又はパラフィン油のいずれかでカバーした。 インキュベーション時間３０分後に、アッセイを測定した。このためにスライ ド下側から逆転蛍光顕微鏡を用いて４５０〜４８５ｎｍの範囲内の線形偏光した 光で蛍光を励起しかつ５１５〜５３０ｎｍの範囲内で検出した。検出のためには 、前方に電動式の回転可能な偏光フィルタを備えたＣＣＤカメラを使用した。 カゼイン分子の偏光の異方性は、以下の方程式により決定した： 上記式中、 Ａ 異方性 Ｐ 偏光 Ｉ平行 励起光の偏光に対して平行な偏光における 蛍光の測定強度 Ｉ垂直 交差した偏光フィルタにおける蛍光の測定 強度 異方性は、分子の旋光拡散定数の尺度でありかつ流体力学的分子寸法の概算の ために使用することができる（G．Weber，Biochemie，Vol．51，1952，145-155 ）。 蛍光イソチオシアネート標識した蛋白質をプロテアーゼによって開裂すると、 ５０〜７５×１０^-3の範囲内の偏光が測定された。プロテアーゼトリプシン阻害 すると、１５０×１０^-3より大きい偏光が測定された。 全部で９６個の反応混合物の並行分析のために、立体拡大器からなる対物レン ズを用いて９６個の測定点を有する全測定ゾーンを同時に検出しかつ画像処理プ ログラムを用いて分析した。 例３ １５３６個の平行測定点でのプロテアーゼ阻害剤アッセイ トリプシン阻害剤アッセイを、例２に記載と同様にしてマイクロタイタープレ ートの大きさの上の１５３６個の平行測定点で（図２参照）で実施した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ， ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に不活性の固体支持体材料から構成されており、該支持体材料上で 、表面ローデイングを有していてもよい親水性測定ゾーンが少なくとも１つの疎 水性コーティングにより相互分離されており、その際支持体上に１ｃｍ²当たり １０個以上の測定点が施されていること特徴とする、分析測定用の固体支持体。 ２．親水性測定ゾーンが互いに少なくとも１つの連続した疎水性コーテイング により分離されている、請求項１記載の固体支持体。 ３．支持体に施された親水性測定ゾーンが互いに不連続的疎水性ゾーンにより 分離されている、請求項１記載の固体支持体。 ４．使用される支持体材料がガラス、セラミック、石英、金属、石、プラスチ ック、ゴム、珪素又は磁器である、請求項１から３までのいずれか１項記載の支 持体。 ５．ガラス、石英、珪素又はプラスチックの群から選択される透明な支持体材 料を使用する、請求項１から４までのいずれか１項記載の支持体。 ６．請求項１から５までのいずれか１項記載の支持体を製造する方法において 、支持体に少なくとも１つの疎水性コーティングを設け、かつ親水性測定ゾーン をマイクロリソグラフィー、ホトエッチング、マイク ロプリント又はマイクロパンチ技術を適用することにより施すことを特徴とする 、分析測定用の固体支持体の製造方法。 ７．請求項１から５までのいずれか１項記載の支持体を製造する方法において 、親水性もしくは親水性化した支持体にマイクロリソグラフィー、ホトエッチン グ、マイクロプリント又はマイクロパンチ技術により、互いに分離された親水性 測定ゾーンが生じるように、少なくとも１つの疎水性コーティングを設けること を特徴とする、分析測定用の固体支持体の製造方法。 ８．支持体の親水性測定ゾーンに付加的に表面ローディング施す、請求項６又 は７記載の方法。 ９．液体分析サンプルを請求項１から５のいずれか１項記載の支持体の親水性 測定ゾーン内に施し、該親水性測定ゾーンは場合により疎水性液体でカバーして もよく、かつ分析を実施すること特徴とする分析的測定方法。 １０．分析的測定を、ほぼ水蒸気飽和雰囲気内で実施する、請求項９記載の方 法。 １１．分析的測定を、支持体を冷却しながら実施する、請求項９又は１０記載 の方法。 １２．請求項１から５のいずれか１項記載の支持体の、診断法、作用物質の探 求、組合せ化学、作物保護、毒物学又は環境保護における使用。