JP2000516963A

JP2000516963A - 酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法

Info

Publication number: JP2000516963A
Application number: JP10549662A
Authority: JP
Inventors: マーク・ダブリュー・バイテンスキー; 達郎吉田
Original assignee: University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California
Priority date: 1997-05-15
Filing date: 1998-05-14
Publication date: 2000-12-19
Also published as: US5789151A; AU7495698A; EP0981272A4; WO1998051147A1; EP0981272A1

Abstract

(57)【要約】酸素除去と添加剤使用による赤血球細胞の長期冷却保存法。赤血球品質を維持し、輸血後の体内生存率を延長するコスト有効性の高い、４℃保存工程を記載する。インビボ生存率の向上、および、アデノシン三燐酸濃度の維持は、４℃で冷蔵した赤血球細胞における溶血および膜小胞生産の低下をも含めて、保存開始時に赤血球中の酸素濃度を減少させることによって、特に、同赤血球細胞を不活性ガスによって噴射し、かつ、それらの細胞をアデニン、デキストロース、マニトール、クエン酸イオン、および、二水素燐酸を含むが、塩化ナトリウムは含まない水溶液において、酸素貧食性物質を含む無酸素環境に置かれる酸素透過性容器中に保存することによって、実現される。

Description

【発明の詳細な説明】酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法技術分野本発明は一般に血液の液性保存法に関わる。さらに特定的には添加剤存在下、および、無酸素下における赤血球の冷蔵保存法に関わる。本発明は、契約番号W- 7405-ENG-36の下に米国エネルギー省によってカリフォルニア大学理事会に付与された政府援助によってなされた。本発明においては合衆国政府もある種の権利を有する。背景技術現在の血液供給は、それにたいする需要よりも相当に少ない。保存血液は、保存中に着実に変性するものであるから、約６週間後では使用に耐えないとされている。このことは、そのような血球は輸血後循環系の中で生存することができないことから判断される。生存不能の理由の一部は、ヘモグロビンの酸化と変性、および、アデノシン三燐酸(ATP)の枯渇にある。さらに、非自己的ドナーからの血液を受容することに伴う危険性は、依然として重大である。現代の需要に対応するためには、血液保存法は単純で、安価で、長期的なものでなければならない。赤血球(RBC)は、体内の渦流条件下では蛋白合成なしに約４ヶ月生存する。ヘモグロビン(Hb)がmet-Hbに変換するためには酸素(O₂)が必須であるが、met-Hbが分解するとヘミクローム、ヘミン、および、遊離Fe³⁺のような有害産物が生成される。これらの産物は、O₂と共に、ヒドロキシル遊離基(OH-)の形成を触媒するが、OH-およびmet-Hb分解産物のいずれも赤血球の脂質膜、膜骨格、および、細胞内含有物を損傷する。下記に論ずるように、現在の赤血球保存法は、ヘモグロビン分解損傷経路に対処していない。冷蔵は、生体内におけるmet-Hbの還元に必須な酵素を可逆的に不能にし、赤血球環境において損傷的に作用するO₂の溶解度を増し(ほぼ２倍)、かつ、ブドウ糖分解速度を減少させることによって(4℃における同速度は、３７℃の場合の約１％である)ATP濃度を低下させる。赤血球ATP濃度の減少は、有棘赤血球(赤血球の非安定形)形成、膜小胞化速度の上昇、赤血球表面積の減少、および、脾臓マクロファージによる選択的排除の加速を招く。小胞化は、冷却保存期間全体を通じて持続するが、これは有棘赤血球形成によりさらに悪化し、赤血球表面積を減少させることによって赤血球生存率を低下させる。血液保存状況下においてATP濃度を上昇・維持することの効果については従来から研究されている。例えば、グリーンウォルト(Greenwalt)等、Vox Sang 65， 87-94(1993)による「燐酸化アンモニウム添加溶液修飾液による、生体内・試験管内赤血球保存に関する研究」において、同著者等は、mMで、20NH4Cl，30Na2HP O4,２アデニン、110デキストロース、55マニトール、pH7.15を含む実験的添加溶液(EAS-2)が、ヒトRBCの保存有効期限を、現在標準の６週間から、８−９週の改善的標準へ延長するのに効果的であることを確定した。１回の洗浄工程後に上清を除去した沈層RBCが輸血には適当である。グリーンウォルト（Greenwalt）等はさらにATP濃度以外の要因が、保存が５０日を越えると、RBCの生存率を決めるに当ってその重要度を次第に増すようだとしている。彼等は、エル・ウッド（L．W ood）とイー・ビュートラー（E．Beutler）の、「燐酸アデニンン培養液で保存したヒト血液の生存率」Transfusion7，401-408(1967)の結果を引用し、自身の実験においても、約８週の保存期間を過ぎるとATP濃度とRBCの２４時間生存測定結果との間の関係がより明瞭でなくなってくることを見ている。イー・ビュートラー（E．Beutler）とシー・ウェスト（C．West）は、「CPD-A2中に４２日間および４９日間置いた赤血球濃縮体の保存」J．Lab．Clin．Med．102，53-62(1983)においても、赤血球ATP濃度と生存率の関係は、長期の保存期間の後では弱くなると再言している。１９８６年４月２９日にハロルド・ティ・メリーマン（Harold T．Meryman）等に付与された米国特許４，５８５，７３５号において、低張懸濁液と、約４℃ における赤血球長期保存法とが開示されている。好ましい低張懸濁液は、１１０ｍＭブドウ糖、５５ｍＭマニトール、７．９ｍＭクエン酸カリウム、２５．８ｍＭ燐酸カリウム、１４．７ｍＭ燐酸二水素カリウム、２ｍＭアデニン、および、５０ｍＭNH4Clを含む。これは、最大１２５日の各種期間二種類の溶液中に保存した赤血球の、生体内２４時間生存証明実験に用いられた、１１０ｍＭブドウ糖、５５ｍＭマニトール、５８．６ｍＭクエン酸カリウム、２５．８ｍＭ燐酸カリウム、１４．７ｍＭ燐酸二水素カリウム、および、２ｍＭアデニンにほぼ等しい。この−７３５特許の第２図から、この低張液が、赤血球にたいして有意に高い保護を与えることが観察される。輸血前に細胞は遠心により沈殿させ、輸血用液に再懸濁する。ホウグマン（Hoegman）等Vox Sang 61，27-34(1986)による「＋４℃の液性保存時における酸素の赤血球にたいする作用」において、著者等は、赤血球のATP 含有量は、標準法で調製した血液バッグを無酸素雰囲気で保存した場合、２−３週後ではやや良好な状態に維持されることを明らかにした。静脈血を冷蔵し、さらに、中等度の酸素透過度を持つ保存バッグ(標準的ポリ塩化ビニール(PVC)製バッグを用い、最近市販の透過度の高いバッグは使用しなかった)を、窒素環境下に置き、それによって酸素飽和度のレベルを徐々に下げることによって保存中に酸素を除去した。酸素濃度の低下は、４℃保存時にはゆっくりと起こるので、開始時〜６０％ヘモグロビン飽和度であったものが、５週時に〜３０％ヘモグロビン飽和度に達するという風で完全からは程遠いものであった。この工程が、保存細胞の全体的性質にたいしてどのような作用を持つかについては結論が得られなかった。この著者等は、酸素依存性のヘモグロビン損傷や、ヘモグロビン分解産物による酸素介在性損傷を対象にしたわけではなく、また、それらの損傷を有意に低下させることもできなかった。１９９７年８月２９日マーク・ダブリュ・ビフィンスキー（Mark W．Bifensky ）等に付与された、「冷蔵赤血球有効期限延長のための酸素除去使用法」にたいする米国特許５，６２４，７９４号において、保存時の酸素除去を用いて、４℃ に長期保存した赤血球について、アデノシン三燐酸濃度を維持し、かつ、溶血や赤血球の膜小胞生成を低下させる方法が開示されている。低酸素濃度を実現するために、赤血球を不活性ガスで噴射し、酸素吸収性環境下に保存する。以上から、本発明の目的は、ヘモグロビン変性、赤血球破壊(溶血)、および、 ATP枯渇の諸問題に対処するために、酸素除去の積極的効果と添加液の使用を、自己輸血および、強化的他者輸血法の実施と合致するやり方で、最大限に利用し、さらに、その期間赤血球を冷蔵保存してもその後の血球使用に悪影響を及ぼすことがない、赤血球保存期間を有意に延長する、血液保存法を提供することである。本発明のもう一つの目的は、輸血可能なサンプルを調製するのに必要な工程の複雑さを極小に抑えながら実行可能な血液保存延長法を提供することである。本発明のさらにもう一つの目的は、添加液の使用が、嫌気性保存と協働的である血液保存延長法を提供することである。本発明の上記以外の目的、効果、および、新規の構成は、一部は下記の説明の中に述べられようし、また一部は、当業者ならば、下記を精査することによって明らかにされようし、または、本発明を実行することによって習得されるであろう。本発明の目的ならびに効果は、付属の請求項に特に指摘される装置利用法や併用法を用いることによって理解・実現されよう。発明の開示前記の、ならびに、その他の目的を実現するために、また、本明細書において実施態様に示され、広範に説明される本発明の意図に対応して、本発明の赤血球保存法は、下記の工程を含む。すなわち、保存すべき赤血球を含む全血標本を、抗凝固液と混合し、それによって赤血球の第１の懸濁液を形成する工程、第１の懸濁液の液性成分(血漿)から赤血球を濃縮し、それによって沈層赤血球塊を形成する工程、得られた沈層赤血球を、塩化ナトリウムを含まず、アデニン、デキストロース、マニトール、クエン酸イオン、および、二水素燐酸イオンを含む水溶液から成る添加液と混合し、それによって第２の赤血球懸濁液を形成する工程、この赤血球に不活性ガスを噴射することによって、第２赤血球懸濁液中の赤血球の酸素濃度を、入手時の酸素濃度の１０％未満に減少させる工程、および、第２赤血球懸濁液中の赤血球を４℃で保存する工程、の諸工程である。できれば、この冷却赤血球をそれ以上酸素に暴露させないことが好ましい。さらにできれば、この保存赤血球の酸素濃度は保存中に減少させることが好ましい。添加液の量は、最終ヘマトクリット値が３０％と４０％の間となるのに十分なものであることが好ましい。さらに、添加液のｐＨは、約７．１に調整されていることが好ましい。本発明のもう一つの局面であり、その目的と意図に合致する、その赤血球保存法は下記の工程を含む。すなわち、沈層赤血球塊を形成する工程、この沈層赤血球を、塩化ナトリウムを含まず、アデニン、デキストロース、マニトール、クエン酸イオン、および、二水素燐酸イオンを含む水溶液から成る添加液と混合し、それによって赤血球懸濁液を形成する工程、この赤血球懸濁液中の赤血球の酸素濃度を、入手時の赤血球酸素濃度の１０％未満に減少させる工程、および、この赤血球懸濁液中の赤血球を４℃で保存する工程、の諸工程である。できれば、この冷蔵赤血球をそれ以上酸素に暴露させないことが好ましい。さらにできれば、この保存赤血球の酸素濃度は保存中に減少させることが好ましい。添加液の量は、最終ヘマトクリット値が３０％と６０％の間となるのに十分なものであることが好ましい。さらに、添加液のｐＨは、約７．１に調整されていることが好ましい。本発明の利点と効果は、ヘモグロビン変性を防止する環境(O₂除去)を創成した結果、冷蔵赤血球におけるATP濃度の維持、溶血および膜小胞蓄積の減少を生じ、その結果、有効冷蔵保存期間が延長されることを含む。図面の簡単な説明本明細書に含まれ、同明細書の一部を形成する付属の図面は、本発明の実施態様を示すものであり、本記載と相俟って、本発明の原理を説明するのに役立つ。この図面において、第１、２図は、OFAS1(約２ｍＭのアデニン、約１１０ｍＭのデキストロース、約６５ｍＭのマニトール、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および、約２０ｍＭの燐酸二水素ナトリウム水溶液）中に８および９週好気的(右下がり斜線)、および、嫌気的(左下がり斜線)に保存した赤血球のインビボ(生体内)回収率を示す。第１図は、二重標識法による結果を比較したものであり、第２図は、単一標識法による結果を比較したものである。第３、４および、５図は、赤血球におけるアデノシン三燐酸(ATP)濃度のインビボ回収率測定を行い、その値を時間の関数で示したものである。第３図は、OF AS1における嫌気性保存(黒丸)と好気性保存(白丸)を比較したものであり、第４図は、通常の保存用培養液における好気性保存(Ｘ印)と、OFAS1における嫌気性保存(黒丸)を比較したものであり、第５図は、通常の保存培養液における好気性保存(Ｘ印)と、OFAS1における好気性保存(白丸)を比較したものである。第５図は、酸素除去しない場合においても、OFAS1を使用した方が、通常の保存液にまさる好結果をもたらすが、ただしその効果は第３図に示す酸素除去とOFAS1との併用効果よりはるかに小さい、ことを示す。第６図は、インビボ測定で得た赤血球の小胞生産を時間の関数として示す。ただしここに、細胞は、OFAS1において好気的に(白丸)、また、嫌気的に(黒丸)保存したものである。第７図は、インビボ測定で得た赤血球の溶血を時間の関数として示す。ただしここに、細胞は、OFAS1において好気的に(白丸)、また、嫌気的に(黒丸)保存したものである。さらにまた、通常の保存培養液に好気的に保存した細胞から得たデータ(Ｘ印)も示す。第８図は、通常の保存液に好気的に保存した赤血球(小円)、通常の保存液に嫌気的に保存した細胞(ダイヤ)、OFAS1に好気的に保存した細胞 (プラス印)、および、OFAS1に嫌気的に保存した細胞(倒立三角)におけるATP濃度を時間の関数として比較し、かつ、OFAS1における嫌気性保存の協働作用を示す。第８図に使用した赤血球のいずれもインビボ測定には用いていない。発明を実施するための最良の形態簡単に言うと、本発明は、輸血用赤血球(RBC)の生体内生存特性の向上であって、保存時に同赤血球から酸素を除去し、通常の保存液の代わりに、アデニン、デキストリン、マニトール、クエン酸イオン、および、二水素燐酸イオンの水溶液から事実上成る保存液OFAS1を加え、かつ、保存RBCの酸素にたいするそれ以上の暴露を防止することによって、４℃で長期間保存される輸血用赤血球細胞(RBC )の生体内生存特性を向上することを含む。溶血、小胞生産、および、ATP濃度のインビトロ(試験管内)検査は、総合的に判断するならば、生体内生存率について有効な指標を与える。さらに、嫌気性保存と、OFAS1使用の協働作用を示す証拠が、これらインビトロ検査測定値から得られた。OFAS1添加液に投入した赤血球の冷蔵保存時に、酸素除去のもたらす効果について、さらにヒトでインビボ回収率測定を行って調べた。これらの測定結果は、インビトロ試験の結論を完全に裏付けるものであった。OFAS1添加液は、FDA承認溶液AS-1(現在の処方では２ｍＭのアデニン、１２２ｍＭのデキストロース、４２ｍＭのマニトール、および、１５４ｍＭの塩化ナトリウム)、および、AS-3(現在の処方では２．２ｍＭのアデニン、６１ｍＭのデキストロース、７０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２ｍＭのクエン酸、および、２０ｍＭの燐酸水素ナトリウム)に見られる組成を含むが、新規の組成を全く含まない。しかしながら、OFAS1溶液は塩化ナトリウムを含まない。OFAS1液のｐＨは、水酸化ナトリウムの添加により約７．１に調整される。もちろん、この目的を達するのに他の塩基を使用してもよい。次に、この溶液を、０．２μｍポアのフィルターによる濾過によって滅菌する。この理由は、この添加液を、一般に使用されるオートクレーブ法によって滅菌すると変性が生じると考えられているからである。酸素除去、および、OFAS1添加液の作用は、ジ-(2-エチルヘキシル)フタレート (DEHP)可塑剤を含む標準ポリ塩化ビニール(PVC)製血液バッグに保存した赤血球について調べた。この血液バッグをアルゴンにより８回から１０回噴射し、温暖赤血球から酸素を除去した。これにより、この赤血球の酸素濃度は、入手時の酸素濃度の１０％未満に減少した(赤血球を含む各輸送バッグについては、同ガスを噴出する前に、純粋アルゴンで満たし、約１０分間静かに振とうした)。インビトロ検査用に調製した赤血球については、通常、血液バンクから入手後、１単位の血液を、標準保存バッグにおいてAS-1/AS-3添加液中に２から５日間保存した。次に、各単位の血液を、約１２０ｍＬの分液に分割し、１５０ｍＬ容量のDE HP可塑化PVC輸送用バッグ内に納め、光遮蔽血液バンク冷蔵庫中で４℃で保存した。光遮蔽していない赤血球については測定を行わなかった。しかしながら、本発明者等は、蛍光は、赤血球にたいして有意な変性作用をもたらすことはないと考える。サンプルは、滅菌隔壁付属標本抽出ポートから必要に応じて抽出した。赤血球内における乳酸蓄積を防止するには、急速な酸素追放後に急速な冷却を実行することが必須である。さらに、酸素は、赤血球冷却後においても除去可能であることを付け加えておかなければならない。しかしながら、赤血球は、一旦冷却されると酸化作用から保護されないままであり、かつ、酸素除去は、４℃と比べると３７℃または２１℃ではより急速に行われるものであるから、酸素除去後に赤血球を冷却するのが好ましい工程である。ホウグマン(Hoegman)等(上述)の報告によれば、通常のPVC血液保存バッグは、O₂にたいして透過性を持つという。１単位の沈層赤血球が完全に酸素添加されるには通常保存で約４週間かかる。保存ガスを置換することによって生ずる長期の影響を評価するために、輸送バッグを、アルゴンのような不活性ガスで満たした嫌気性チェンバーに保存した。嫌気性チェンバーを、部分真空に暴露し、次に選択した不活性ガスを満たすという工程を２−３サイクル繰り返して、血液バッグのガス置換をさらに促進した。さらに、約１０％(v/v)の水素ガスをパラジウム触媒と共に、保存血液を収容する嫌気性チェンバーのアルゴン保存用ガスに加え、その血液バッグから出現する微量のO₂を連続的に除去した。「コントロール」標本については、細胞を、それ以上処置することなく１５０ ml輸送パックに保存した。OFAS1における好気性、嫌気性いずれの保存についても、細胞を、輸送パックに入れた状態で２，０００xgで遠心し、上清を除去し、適当量の添加液で置換し、最終ヘマトクリット(Hct)が約４０になるようにした。膜小胞の生産は、分離した小胞分画についてその蛋白含量を測定して定量した。ATP濃度は、市販の検査キットを用いて測定した。データはすべて４−６単位の血液から得た平均値で示す。インビボ試験は、１集団１０人の被験者を２群に分けて行った。先ず、１単位の血液をCP2D抗凝固液に採取した。次いで、血小板と血漿を除去し、OFAS1を加えた。次に、酸素を前述したやり方で除去した。全血単位を、嫌気的条件下においも、好気的条件下においても、OFAS1添加液に入れ、８および９週間静かに放置保存した。２４時間輸血後回収率を、公知のTc-99m/Cr-51二重標識プロトコールを用いて求めた。２４時間インビボ回収率実験の成績を表に示す。ここに本発明の好ましい実施態様について詳細に参照するつもりであるが、その実施例は、付属の図面に示される。ここで図面を参照すると、第１図は、Cr-5 1とTc-99による二重標識法で得られた結果を示し、第２図は、Cr-51のデータのみから得られた結果を示す。赤血球は、約４０％のHct(ヘマトクリット遠心を用いて得た値）を持つようにOFAS1を添加して、酸素除去下(左下がり斜線)、および、酸素非除去下(右下がり斜線)にて保存した。血液保存業界における現在の慣行は、約６０％のヘマトクリットを持つ赤血球を保存することである(４０容量％保存液プラス６０容量％の沈層赤血球)。本発明においては、３０％と６０％の間のヘマトクリットが、受容可能な保存特性を与えると予想されるが、４０％未満のヘマトクリットでは、保存バッグ容量の大きさが目立つようになる。数字ｎは、平均される被験者の数を示す。８週好気性標本の場合、一人の被験者において、Tc-99m標識が得られなかった。従って、この被験者については、単一標識データしか得られなかった。数名の脱落者がいたために、示した結果の中には、５名よりも少ない数の被験者の平均が示されている。この表、および、図１と２からは下記の結論が得られると思われる。 1. 酸素除去は、９週間の保存後、２４時間回収率を１６％高める。 2. 予想通り、単一標識の回収率は、すべてのケースにおいて二重標識法の場合の回収率を相当に（７−９％）上回る。 3. 嫌気性保存の場合、８週と９週の間に２４時間回収率においてほとんど差が認められなかったが、それと対照的に、酸素存在下に保存した標本においては最大１０％の低下が認められた。 4. 嫌気性治験において集団の規模が小さくなっても(５名にたいして４名の被験者)、８週、および、９週のいずれの保存においても被験者間変動の増加は見られなかった。上記の２４時間インビボ回収実験実行後に、赤血球標本を、輸血日付を越えてさらに４−８週間保存した。これらの標本についていくつかのインビトロ診断テスト(ATP濃度、小胞生産、および、溶血の程度)を実行した。その結果を第３−７図に示す。インビトロ試験のみに使用した血液と異なり、標本は、元の保存バッグから毎週採取し、ATP濃度は、保存８ないし９週から測定開始した。インビトロ実験用に調製した血液から入手したデータはすべて平均し、かつ、その標準偏差も図に示した。第３図は、OFAS1において好気的に保存した細胞(白丸)と、嫌気的に保存した細胞(黒丸)について、細胞ATP濃度の時間的変化を比較したものであり、第４図は、OFAS1において嫌気的に保存した赤血球(黒丸)と、 AS1/AS3において好気的に保存した「コントロール」赤血球(Ｘ印)の間でATP濃度を比較したものであり、第５図は、OFAS1において好気的に保存した細胞(白丸) と、AS1/AS2において好気的に保存した細胞(Ｘ印)の間でATPの時間的変化を比較したものである。点線は、通例に従って保存した赤血球細胞の６週保存点とその時のATP濃度とを示す。OFASI1において嫌気的に保存した赤血球細胞では、同様のATP濃度に、保存１３週後に達する。後述するように、インビトロ・コントロール実験においては、各データ点は、AS-1およびAS-2中で好気的に保存した４− ７個の赤血球標本の平均を示す。これらのデータは、２年に渡って、保存血液の１２０を越える単位から集めたものである。第５図は、通常の(「コントロール」)好気性保存(Ｘ印)とOFAS1中における好気性保存(白丸)の間でATP濃度を比較したものである。OFAS1において好気的に保存した赤血球の方が、AS-1/AS-3中に好気的に保存した細胞に比べて、７週時において、有意に高いATP濃度を示すのが分かる。しかしながら、ATPの時間的低下は、OFAS1に保存した標本の方がより急峻で、１０週を越えると通常の添加液の濃度に近づく。第６図は、インビボ測定を時間的に行った赤血球における小胞生産を示す。細胞懸濁液から分離された小胞の量は、標準蛋白定量法を用いて定量した。第６図において、データはすべて平均値であり、また、標準偏差も示す。OFAS1における嫌気性保存を黒丸で表し、OFAS1における好気性保存を白丸で表わす。第７図は、インビボ測定を時間的に行った赤血球の溶血を示す。溶血の程度は、標準法によって定量した。インビボ実験用に調製した血液から得たデータは全て平均し、かつ、標準偏差も図示した。AS-1/AS-3における好気的保存(「コントロール」)の場合の溶血コントロール・データも比較のために示した。好気的AS1 /AS3コントロール(Ｘ印)における溶血の程度は、OFAS1において好気的に保存したインビボ標本(白丸)や、OFAS1において嫌気的に保存したインビボ標本(黒丸)の場合よりも有意に高いことが判明した。現在では、本発明者等は、コントロール標本における、この観察された溶血速度の増加は、毎週の標本採取時に受ける、より頻繁な、徹底的な攪拌に由来すると考えている。これと対照的に、インビボ標本の方は、輸血の日付まで、週に１度静かに反転されるだけである。このインビトロ成績から、下記のように結論してよいと思われる。すなわち、１．ATP濃度は、OFAS1における嫌気的保存の方が、OFAS1における好気的保存よりも、有意に高い(第３図)。２．好気性コントロール(６週時における好気的インビトロ・データ)で見られたATPの減少濃度にたいし、無酸素の場合、９０日間の保存期間後にやっとほぼ等しくなった(第４図)。３．高濃度のATPは、AS-1やAS-3コントロールに比べると、OFAS1に保存した好気性標本の方に観察された。これらのデータは、好気的に保存した場合においても、OFAS1は、僅かではあるが、ATP濃度を高める効果を持つことを示す。しかしながら、ATP高濃度は、直接には、８週間保存以後の２４時間回収率の増進をもたらさなかった(第５図)。４．小胞生産速度は、８週と９週時では、二種の保存形態間で近似していた。しかしながら、小胞生産は、好気性標本においては、１０週を越えると加速する (第６図)。また、５．溶血率は、冷蔵保存１１週までは、好気性および嫌気性標本において近似していた(第７図)。コントロールのインビトロ測定値は、好気的保存標本においてかなり高い溶血率を示す。前述したように、この理由の一部は、毎週採取するごとにバッグを徹底的に混合するのに必要とされる手技に由来するものと思われる(即ち、インビボ標本と比べると、０から９週の間で標本採取に関してこの余分な手技が加わる)。このような手技は、嫌気的に保存した血液にたいしては有害な影響を及ぼさないようであった（未発表データ）。OFAS1は、溶血率の減少にも貢献するようであるが、現在のところこの点に関してデータはまだ得られていない。第８図は、ATP濃度の時間変化を、通常の保存培養液に好気的に保存した赤血球(小円)、通常の保存培養液に嫌気的に保存した細胞(ダイヤ)、OFAS1に好気的に保存した細胞(プラス)、および、OFAS1に嫌気的に保存した細胞(倒立白抜き三角)の間で比較したもの、および、OFAS1における嫌気的保存の協働作用を示す。第８図で用いた赤血球のいずれもインビボ測定には使用しなかった。今、「協働作用」を、OFAS1中に嫌気的に保存した赤血球におけるヘモグロビン１グラム当りのATP(μｍｏl)を、AS-1中に好気的に保存した赤血球におけるヘモグロビン１グラム当りのATP(μｍｏｌ)(コントロール)、プラス、同コントロールにおけるヘモグロビン１グラム当りのATP(μｍｏｌ)と、OFAS1中に好気的に保存した赤血球におけるヘモグロビン１グラム当りのATP(μｍｏｌ)との差、プラス、同コントロールにおけるヘモグロビン１グラム当りのATP(μｍｏｌ)と、AS1中に嫌気的に保存した赤血球におけるヘモグロビン１グラム当りのATP(μｍｏｌ)との差、の合計(この合計を、正立白抜き三角でプロットした)で割ったものに等しいとすると、OFAS1中に嫌気的に保存した細胞における協働作用は、第８図の倒立黒三角のプロットとして観察される。本発明の前記の記載は、例示と説明のために提示されたものであって、詳細な全体像を与えることを意図したものでもなければ、本発明を、ここに開示された形態に厳密に制限するためのものでもない。また、前記の教示に基づいて思考するならば、多くの修正、変法が可能であることは言うまでもない。これらの実施態様は、本発明の原理をもっとも良く説明できるように、また、その実地の応用が、他の当業者において、本発明を、各種実施態様において、また、当面する特定の目的に合致するように各種の修正を施して、最善の利用が可能となるように、選ばれ、記載されたものである。本発明の範囲は、付属の請求項によって定義されることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者吉田達郎アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02165 ニュートン，コモンウェルスアヴェニュー 1736

Claims

【特許請求の範囲】１．赤血球保存法であって、ａ．保存すべき赤血球を含む全血標本を抗凝固液と混合し、それによって第１の赤血球懸濁液を形成する工程、ｂ．第１懸濁液の液性成分から赤血球を分離濃縮し、それによって沈層赤血球塊を形成する工程、ｃ．得られた沈層赤血球を、アデニン、デキストロース、マニトール、クエン酸イオン、および、二水素燐酸イオンを含む水溶液から事実上成る添加液と混合し、それによって第２の赤血球懸濁液を形成する工程、ｄ．第２の赤血球懸濁液における赤血球の酸素濃度を、同赤血球を不活性ガスによって噴射することによって、全血の酸素濃度の約１０％以下に減少させる工程、および、ｅ．第２の赤血球懸濁液中の赤血球を４℃で保存する工程、の諸工程を含むことを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。２．請求の範囲第１項に記載の赤血球保存法であって、さらに第２赤血球懸濁液を、無酸素環境に置かれた酸素透過性容器に保存する工程を含むことを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。３．請求の範囲第１項に記載の赤血球保存法であって、さらに第２赤血球懸濁液を酸素貧食性物質を含む無酸素環境に置かれた酸素透過性容器に保存する工程を含むことを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。４．請求の範囲第１項に記載の赤血球保存法であって、第２懸濁液中の赤血球の酸素濃度を減少させる前記工程が、第２懸濁液を４℃に冷却する前記工程の前に来ることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。５．請求の範囲第１項に記載の赤血球保存法であって、添加液が、約２ｍＭのアデニン、約１１０ｍＭのデキストロース、約６５ｍＭのマニトール、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および、約２０ｍＭの燐酸二水素ナトリウムの水溶液から事実上成ることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。６．請求の範囲第１項に記載の赤血球保存法であって、添加液の量が、３０％から６０％の最終ヘマトクリットを実現するのに十分なように選ばれることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。７．請求の範囲第１項に記載の赤血球保存法であって、添加液のｐＨが約７．１に調整されていることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。８．赤血球保存法であって、ａ．沈層赤血球塊を形成する工程、ｂ．この沈層赤血球を、アデニン、デキストロース、マニトール、クエン酸イオン、および、二水素燐酸イオンを含む水溶液から事実上成る添加液と混合し、それによって赤血球懸濁液を形成する工程、ｃ．この赤血球懸濁液における赤血球の酸素濃度を、同赤血球を不活性ガスによって噴射することによって、沈層赤血球塊の酸素濃度の約１０％以下に減少させる工程、および、ｄ．同赤血球懸濁液中の赤血球を４℃で保存する工程、の諸工程を含むことを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。９．請求の範囲第８項に記載の赤血球保存法であって、さらに前記赤血球懸濁液を、無酸素環境に置かれた酸素透過性容器に保存する工程を含むことを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１０．請求の範囲第８項に記載の赤血球保存法であって、さらに前記赤血球懸濁液を酸素貧食性物質を含む無酸素環境に置かれた酸素透過性容器に保存する工程を含むことを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１１．請求の範囲第８項に記載の赤血球保存法であって、懸濁液中の赤血球の酸素濃度を減少させる前記工程が、懸濁液を４℃に冷却する前記工程の前に来ることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１２．請求の範囲第８項に記載の赤血球保存法であって、添加液が、約２ｍＭのアデニン、約１１０ｍＭのデキストロース、約６５ｍＭのマニトール、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および、約２０ｍＭの燐酸二水素ナトリウムの水溶液から事実上成ることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１３.請求の範囲第８項に記載の赤血球保存法であって、添加液の量が、３０％から６０％の最終ヘマトクリットを実現するのに十分なように選ばれることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１４．請求の範囲第８項に記載の赤血球保存法であって、添加液のｐＨが約７．１に調整されていることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１５．赤血球保存法であって、ａ．沈層赤血球塊を形成する工程、ｂ．この沈層赤血球を、アデニン、デキストロース、マニトール、クエン酸イオン、および、二水素燐酸イオンを含むが、塩化ナトリウムを含まない水溶液から成る添加液と混合し、それによって赤血球懸濁液を形成する工程、ｃ．この赤血球懸濁液における酸素濃度を、同赤血球を不活性ガスによって噴射することによって、沈層赤血球塊の酸素濃度の約１０％以下に減少させる工程、および、ｄ．同赤血球懸濁液中の赤血球を４℃で保存する工程、の諸工程を含むことを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１６．請求の範囲第１５項に記載の赤血球保存法であって、さらに前記赤血球懸濁液を、無酸素環境に置かれた酸素透過性容器に保存する工程を含むことを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１７．請求の範囲第１５項に記載の赤血球保存法であって、さらに前記赤血球懸濁液を酸素貧食性物質を含む無酸素環境に置かれた酸素透過性容器に保存する工程を含むことを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１８．請求の範囲第１５項に記載の赤血球保存法であって、懸濁液中の赤血球の酸素濃度を減少させる前記工程が、懸濁液を４℃に冷却する前記工程の前に来ることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。１９．請求の範囲第１５項に記載の赤血球保存法であって、添加液が、約２ｍＭのアデニン、約１１０ｍＭのデキストロース、約６５ｍＭのマニトール、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および、約２０ｍＭの燐酸二水素ナトリウムを含むが、塩化ナトリウムは含まない水溶液から成ることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。２０．請求の範囲第１５項に記載の赤血球保存法であって、添加液の量が、３０％から６０％の最終へマトクリットを実現するのに十分なように選ばれることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。２１．請求の範囲第１５項に記載の赤血球保存法であって、添加液のｐＨが約７．１に調整されていることを特徴とする酸素除去・添加剤使用による赤血球長期保存法。