JP2000517175A - ヒトｄｂｉ／ａｃｂｐ様タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト・ジアゼパム結合インヒビター／アシルＣｏＡ結合タンパク質（ＤＢＩ／ＡＣＢＰ）様タンパク質（ＤＢＩＨ）を同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ＤＢＩＨをコードする核酸配列を含む遺伝子組換え発現ベクター及び宿主細胞を提供する。本発明はまた、薬剤デリバリー用、及びＤＢＩＨの発現が関係する疾病の治療のための組換え体タンパク質の産生のための実質的に精製されたＤＢＩＨの利用を提供する。更に、本発明は、ＤＢＩＨの発現が関係する疾病の治療における、ＤＢＩＨに対するアンチセンス分子の利用を提供する。本発明はまた、ＤＢＩＨをコードする自然発生の配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチド及びこのタンパク質と特異的に結合する抗体を含む診断用組成物を利用する診断検査法についても記述している。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＤＢＩ／ＡＣＢＰ様タンパク質技術分野 本発明は、新規なヒトＤＢＩ／ＡＣＢＰ様タンパク質の核酸及びアミノ酸配列 、及び疾病の診断、研究、予防、及び治療におけるこれらの配列の利用に関する ものである。背景技術 ジアゼパム結合インヒビター／アシルＣｏＡ結合タンパク質（ＤＢＩ／ＡＣＢ Ｐ）様タンパク質は、酵母菌から哺乳類までの様々な種において見出される１０ ｋｄａｌのタンパク質である。このタンパク質は、種々の器官及び組織において 発現される。元々ＤＢＩは、そのＡ型γアミノ酪酸（GABA_A）レセプターからジ アゼパムを置換する能力に基づいて、ラットの脳から精製された（Guidotti et al(1983)Proc Nat Acad Sci USA 80:3531-3535）。続けて肝臓から精製されたア シル−コエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）結合タンパク質（ＡＣＢＰ）は、ＤＢＩ と同一のものであることが分かった（Mikkelsen J et al(1987)Biochem J 245:8 57-861）。このタンパク質はエンドゼピン、ＤＢＩ、又はＡＣＢＰとして知られ ているが、現在では通常ＤＢＩ／ＡＣＢＰと呼ばれる。ＤＢＩ／ＡＣＢＰ、及び それに由来するポリペプチドは、例えば（１）GABA_A／ベンゾジアゼパムレセプ ター修飾、（２）アシルＣｏＡ代謝、（３）ステロイド産生、及び（４）インス リン分泌(Knudsen J et al(1993)Mol Cell Biochem 123:129-138に記載されてい る)のような種々の生物学的プロセスに関与する。 アシルＣｏＡリガンドが結合している、及び結合していないウシのＤＢＩ／Ａ ＣＢＰの三次元溶体構造は、ＮＭＲによって解析された（Andersen KV and Poul sen FM(1992)J Mol Biol 226:1131-41; Kragelund et al(1993)J Mol Biol 230:1260-1277）。ＤＢＩ／ＡＣＢＰは左向 き逆平行束をなす４つのαヘリックス（Ａ１乃至Ａ４）からなり、平行なヘリッ クスであるＡ１及びＡ４が、ヘリックスＡ２及びＡ３と逆平行に構成されている 。ヘリックスＡ２は、鉢状の構造的記憧において他の３つのヘリックスのそれぞ れと相互作用する。その鉢状構造の内側表面は、ヘリックスＡ２とＡ３との間の 境界面において、非極性及び非荷電残基の部分を有する。鉢状構造の縁部は主と して極性及び荷電基を有するが、これらは両親媒性ヘリックスの親媒性残基によ るものである。リガンド結合部位は鉢状構造の内側表面上にあり、このタンパク 質により一部形成され、かつパンテテイン及びＣｏＡのアデノシン３'リン酸に よって一部形成された非極性の構造において、脂肪酸アシルＣｏＡリガンドの脂 肪酸アシル鎖に結合する。パンテテイン及びＣｏＡ部分も同様に極性が高く荷電 した表面を形成し、これによってその表面が鉢状のタンパク質の特性及び荷電し た縁部と共に、複合体全体の可溶性を確保している（Kragelund et al(1993)J M ol Biol 230:1260-1277）。 アシルＣｏＡエステルに対するウシのＤＢＩ／ＡＣＢＰの結合親和性は、アシ ル鎖の長さによって決まる。ここで親和性が最大になるのは、長鎖（Ｃ１４〜Ｃ ２２）アシルＣｏＡエステルに対してである。このタンパク質は、アシルＣｏＡ エステルの結合において非常に高い特異性を有し、遊離ＣｏＡや遊離脂肪酸には 結合しない（Rosendal J et al(1993)Biochem J 290:321-326）。ＤＢＩ／ＡＣ ＢＰは、結合した長鎖脂肪アシルＣｏＡを分離し、加水分解からアシルＣｏＡを 保護して、ホスファチジルコリン膜からアシルＣｏＡを抽出し、且つ膜間アシル ＣｏＡ輸送を媒介する（Rasmussen et al(1994)Biochem J 299:165-170）。例え ば星細胞腫、グリア芽細胞腫、髄芽腫のような急速に増殖する脳腫瘍においてＤ ＢＩ／ＡＣＢＰが過剰発現することは、それが急速に増殖する 神経細胞における高エネルギーアシルＣｏＡ代謝の調節に関与し得ることを示唆 している（Alhi He ta l(1995)Cell Growth D1ffer 6:309-314）。 ＤＢＩ／ＡＣＢＰはまた、ベンゾジアゼピンのGABA_Aレセプターへの結合を阻 害する。このGABA_Aレセプターは、シナプス後Ｃｌ-チャネルである。抑制性神経 伝達物質GABAにより誘発されたＣｌ-イオンチャネル開口バーストは、ベンゾジ アゼピンにより持続する。これによりベンゾジアゼピンは、GABA媒介シナプス抑 制性反応を促進して病理学的不安を低減する。ＤＢＩ／ＡＣＢＰ又はそのタンパ ク分解性断片、特にオクタデカン神経ペプチド（ＯＤＮ、ＤＢＩ／ＡＣＢＰアミ ノ酸３２〜５０）は、ベンゾジアゼピンの不安低減効果を抑制する。肝性脳症、 鬱病、及び不安症のような神経性疾患と診断された患者の脳及び脳脊髄液におい てＤＢＩ／ＡＣＢＰの発現は増加する（Costa E and Guidotti Ａ(1991)Life Sc iences 49:325-344）。 ＤＢＩ／ＡＣＢＰはまた、ミトコンドリアにおけるステロイド生合成の調節に も関与する(Garnier et al(1993)Endocrinology 132:444-458)。またＤＢＩ／Ａ ＣＢＰは、ミトコンドリアの内膜へのコレステロール供給を促進することにより 、副腎におけるミトコンドリアのステロイド産生を刺激する（Yanagibashi K(19 88)Endocrinology 123:2075-2082）。Knudsen et al（1993,supra）は、ＤＢＩ ／ＡＣＢＰが、コレステロールからステロイドへの変換において放出された脂肪 酸から産生された脂肪アシルＣｏＡエステルの清掃も行い得る。ＤＢＩ／ＡＣＢ Ｐに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ラットの精巣のライジッヒ細胞 におけるホルモン刺激によるステロイド産生を抑制する（Boujrad N et al(1993 )Proc Nat Acad Sci USA 90:5728-5731）。 ＤＢＩ／ＡＣＢＰは試験された全ての組織において見い出されたが、最も多量 に見い出されたのは、肝臓、腎臓、脳、副腎、腸管、及び唾液 腺においてであった（Knudsen J et al(1993)Mol Cell Biochem 123:129-138） 。免疫組織化学的局所化により、ＤＢＩ／ＡＣＢＰが所与の器官内における限定 された細胞において選択的に発現されることが分かった。高濃度のＤＢＩ／ＡＣ ＢＰは、ステロイドを産生する精巣及び副腎皮質の細胞において、及びステロイ ド及び脂肪代謝に関与する肝実質細胞において見出された。高濃度のＤＢＩ／Ａ ＣＢＰはまた、尿細管、上側腸管、及び大きい細気管支の上皮細胞や、水及び電 解質吸収及び分泌のために専門化された細胞においても見出された。脳において は、脈絡叢、及び脳室周囲器官において高濃度のＤＢＩ／ＡＣＢＰが見られたが 、これらの器官は、分泌の制御は脳脊髄液の重量浸透圧濃度の調節に専門化され ている（Bovolin et al(1990)Reg Pept1des 29:267-281）。 新規な組織特異的ＤＢＩ／ＡＣＢＰ様タンパク質の発現又は活性の選択的調節 により、それが発現される組織に関係する生化学的異常や疾病の管理をうまく行 うことが可能になり得る。更に、この小形タンパク質の結合特性を、そのままで は不溶性の治療用分子の可溶性担体に利用して薬物デリバリーの用途に用いるこ とができる。発明の開示 本発明は、ヒトＤＢＩ／ＡＣＢＰ及びウシのＤＢＩ／ＡＣＢＰのアイソフォー ムに対して化学的及び構造的相同性を有する、新規な組織特異的ＤＢＩ／ＡＣＢ Ｐ様タンパク質（以下ＤＢＩＨと称する）を開示する。従って、本発明は、ヒト 及びウシに由来するものを含むＤＢＩ／ＡＣＢＰのファミリーの構造的特徴を有 する、配列番号：１のアミノ酸配列によりコードされる、実質的に精製されたＤ ＢＩ／ＡＣＢＰ様タンパク質を提供する。 本発明のある実施例は、ＤＢＩＨをコードする単離され、実質的に精製された ポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例では、このポリヌ クレオチドは配列番号：２のヌクレオチド配列である。更に、本発明は、厳密な 条件の下で、配列番号：２の配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を提 供する。 本発明は更に、ＤＢＩＨをコードする核酸配列、オリゴヌクレオチド、ペプチ ド核酸（ＰＮＡ）、その断片、部分、又はアンチセンス分子にも関連する。本発 明はまた、ＤＢＩＨをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び宿 主細胞や生物体の形質転換のための、その利用にも関連する。本発明はまた、配 列番号：１のＤＢＩに特異的に結合する抗体、及び実質的に精製された配列番号 ：１のＤＢＩを含む医薬品組成物にも関連する。図面の簡単な説明 第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図は、MacDNAsisソフトウエア（Hitachi Sof tware Engineering Co Ltd,San Bruno CA）を用いて作製された、ヒトＤＢＩ／ ＡＣＢＰ様タンパク質ＤＢＩＨのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（ 配列番号：２）を示す図である。 第２Ａ図及び第２Ｂ図は、DNAStarソフトウエア（DNAStar Inc,Madison WI） のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作製された、ＤＢＩＨ（配 列番号：１）、１０４個のアミノ酸からなるヒトＤＢＩ／ＡＣＢＰアイソフォー ム（GI 181478；配列番号：３）、８４個のアミノ酸からなるヒトＤＢＩ／ＡＣ ＢＰアイソフォーム（GI 118276；配列番号：４）、及び８６個のアミノ酸から なるウシのＤＢＩ／ＡＣＢＰ（GI 118275；配列番号：５）の間のアミノ酸配列 アライメントを示す図である。 第３図は、（MacDNAsisソフトウエアを用いて作製された）ＤＢＩＨ（配列番 号：１）に対する疎水性プロットのグラフであり、Ｘ軸はアミノ酸の位置を表し 、Ｙ軸は負の方向に疎水性のレベルを表す。 第４図は、（MacDNAsisソフトウエアを用いて作製された）ＤＢＩＨ（配列番 号：１）の推定二次構造を示す図である。発明の実施の形態 定義 本明細書において、「核酸配列」とは、一本鎖か二本鎖の、センス鎖、又はア ンチセンス鎖であるゲノムの若しくは合成起源のＤＮＡ、ＲＮＡや、オリゴヌク レオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は一部分を意 味する。同様に、本明細書において「アミノ酸配列」とは、ペプチド若しくはタ ンパク質配列を意味する。 本明細書において「ペプチド核酸」とは、リジンのようなアミノ酸残基及びア ミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これらの小分子は、抗遺 伝子剤とも称され、核酸のこれらの相補的な（鋳型の）鎖に結合することにより 転写物の伸張を停止させる（Nielsen PE等(1993)Anticancer Drug Des 8:53-63 ）。 ＤＢＩＨの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸の「置換」により異な るものとなったアミノ酸配列を有し得るものである。この変異体は「保存的」変 化を含むものであり得、この保存的変化においては例えばロイシンをイソロイシ ンで置き換える場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性 を有する。稀に、変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変 化では例えばグリシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、ア ミノ酸の欠失、挿入、若しくはその両方も含まれ得る。例えばDNAStarソフトウ エアのような従来より周知のコンピュータプログラムを用いて、生物学的或いは 免疫学的活性を損なわずに、置換、挿入、又は除去できるアミノ酸及びそのアミ ノ酸の数を決定することができる。 本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若し くはアミノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化 として定義される。 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生のＤＢＩＨと比較し て、結果的に１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残基の加わるような ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。 本明細書において「置換」とは、１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ 酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化を指 す。 用語「生物学的に活性」とは、自然発生のＤＢＩＨの構造的機能、調節機能、 又は生化学的機能を有するＤＢＩＨを意味する。同様に「免疫学的活性」とは、 天然の、組換えの、又は合成のＤＢＩＨ、若しくはその任意のオリゴペプチドが 適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する能力 として定義される。 本明細書において、「誘導体」なる用語は、化学的に修飾されたＤＢＩＨをコ ードする核酸、又はコードされたＤＢＩＨを意味する。このような修飾の例には 、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。核酸誘導体は 、天然ＤＢＩＨの必須の生物学的特性を保持しているポリペプチドをコードする 。 本明細書において、「実質的に精製」なる用語は、この天然の環境から取り除 かれ、天然にはそれが結合して存在する少なくとも１つの他の成分から単離又は 分離されて、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは 少なくとも９０％遊離した核酸配列又はアミノ酸配列を有する分子を意味する。 「厳密性」とは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）か らＴｍの約２０〜２５℃下の範囲で発生する。当業者には理解できるように、厳 密性のあるハイブリダイゼーションでは、同一のポリヌ クレオチド配列を同定、つまり検出したり、或いは類似の、すなわち近縁なポリ ヌクレオチド配列を同定、つまり検出するために用いることができる。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション(ハイブリッド形成)」は「核 酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」(Coombs J(1994)Dictionary o f Biotechnology ,Stockton Press社,New York)を含む概念である。増幅とは、核 酸配列の複製を作り出すこととして定義され、通常周知のポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）法により実行される（Dieffenbach CW and GSDveksler(1995),PCR Pr imer,aLaboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press社,New york）。 説明 本発明は、ヒト傍神経節ライブラリー（PGANNOT01）からの部分的ｃＤＮＡの 中から初めに同定された、ＤＢＩＨと表記される、新規なヒトＤＢＩ／ＡＣＢＰ 様タンパク質と、疾病の研究、診断、予防、及び治療におけるここに開示する核 酸及びアミノ酸配列の利用とに関するものである。LIFESEQ^TMデータベース（Inc yte Pharmaceuticals,Palo AltoCA）を用いたノーザン解析によって、ＤＢＩＨ をコードするｍＲＮＡが傍神経節においてのみ存在することが分かる。これは、 ＤＢＩ／ＡＣＢＰが、幅広い組織に分布しているのと対照的である。傍神経節の 細胞は、副腎髄質のクロム親和性細胞のものと類似の交換節前神経支配を受ける 。傍神経節はよく血管新生化されており、分泌細胞は通常毛細血管に隣接した位 置にある。ホルモンの通過をほとんど妨げないため、傍神経節細胞は遠隔性と局 所性双方の内分泌効果を有する。 本発明はＤＢＩＨ変異体もその範囲に含む。好適なＤＢＩＨ変異体はＤＢＩＨ アミノ酸配列（配列番号：１）と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有す るものであり、より好適なＤＢＩＨ変異体は配列番 号：１の配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列類似性を有するものであり、最 も好適なＤＢＩＨ変異体は配列番号：１の配列と少なくとも９５％のアミノ酸配 列類似性を有するものである。 ＤＢＩＨの一部分をコードする核酸配列は、初めに、アミノ酸配列アライメン トのコンピュータ検索によりｃＤＮＡインサイト社クローンＮｏ．６２０９８４ において同定された。ここに開示する配列番号：２の核酸配列（第１Ａ図、第１ Ｂ図、及び第１Ｃ図）は、ＤＢＩＨと表記される配列番号:１のアミノ酸配列を コードする。本発明は、ＤＢＩＨと、２つのヒトのアイソフォーム（GI 181478; Gray PW et al(1986)Proc Nat Acad Sci USA 83:7547-7551及びGI 118276;Marqu ardt H et al(1986)J Biol Chem 261:9727-9731）、及び１つのウシのアイソフ ォーム（GI 118275,Marquardt H et al,supra）を含む他のＤＢＩ／ＡＣＢＰの 間の、第２Ａ図及び第２Ｂ図に示すような構造的相同性に部分的に基づいている 。GI 181478、GI 118276、及びGI 118275は、それぞれＤＢＩＨと３９％、４２ ％、及び４０％の配列同一性を有している。 ＤＢＩＨは１４５個のアミノ酸からなり、ヒドロパシープロット（第３図）及 び二次構造推定（第４図）に基づき、少なくとも４つのヘリックスセグメントか らなる可溶性のタンパク質である。ヒト及びウシのＤＢＩ／ＡＣＢＰの中央部分 に対するその相同性から、ＤＢＩＨの４つのαヘリックスは４５〜５６番目、６ １〜７７番目、９２〜１０３番目、及び１０６〜１２１番目の位置、又はその近 傍に残基を有すると推定される。ヒト及びウシのＤＢＩ／ＡＣＢＰの８６残基( それぞれGI 118276及びGI 118275）を比較すると、ＤＢＩＨはＮ末端に追加の４ ０アミノ酸、Ｃ末端の近傍に追加の１４アミノ酸を有する（第２Ａ図及び第２Ｂ 図参照）１０４個のアミノ酸からなるヒトＤＢＩ／ＡＣＢＰアイソフォーム(GI 181478)も同様に、８６残基の形態と比較すると、Ｎ末端近 傍に追加の２３個のアミノ酸を含んでいる。ＤＢＩＨのＮ末端及びＣ末端におけ る追加の残基は、任意のαヘリックス細胞を有しておらず（第４図）、親水性荷 電残基の比率が高く、このことはこの追加の残基が膜貫通、もしくはシグナル配 列ではないことを表している。しかし、ＤＢＩＨのＮ末端又はＣ末端における追 加の残基は、タンパク分解性の処理をうけて、in vivoでより小さいＤＢＩＨの 形態にされ得る。 ＤＢＩＨコーディング配列 ＤＢＩＨの核酸及びアミノ酸配列は、第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示 されている。本発明によれば、ＤＢＩＨのアミノ酸配列をコードする任意の核酸 配列を用いて、ＤＢＩＨを発現する組換え体分子を作り出すことができる。ここ に説明する特定の実施例では、ＤＢＩＨの部分的配列は、初めに、ヒト傍神経節 組織ライブラリー（PGANNOT01)からインサイト社クローンＮｏ．６２０９８４と して単離された。 遺伝暗号の縮重の結果、既知の又は自然発生の遺伝子のヌクレオチド配列に対 して最小限の相同性しか有していないものも含まれる多数のＤＢＩＨコード化ヌ クレオチド配列が作り出され得る、ということは当業者には明らかであろう。本 発明は、特に、可能なコドン選択に基づく組み合わせの選択によりなされ得る全 ての可能な核酸配列の変化をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは、自 然発生のＤＢＩＨのヌクレオチド配列に当てはまる標準的なトリプレット遺伝暗 号に基づいて作り出されるものであり、このような全ての変異は、ここに具体的 に示されたものと考えられたい。 ＤＢＩＨ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は適切に選択された厳 密性の条件の下で、自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な ものであるのが好ましいが、概ね異なるコドン使用を有するＤＢＩＨ又はその変 異体をコードするヌクレオチド配列を作り出 すことは有益であり得る。コドン選択は、特定のコドンが宿主によって使用され る頻度に従って、特定の原核細胞の、或いは真核細胞の発現宿主においてペプチ ドが発現する速度を高めるように選択され得る。ＤＢＩＨ及びその誘導体をコー ドするヌクレオチド配列を、コードされるアミノ酸配列を変更することなく実質 的に変更する理由は、例えば天然配列から作り出される転写物よりより長い半減 期のようなより望ましい特性を有するＲＮＡ転写物の産生のためである。 現在では、ＤＢＩＨ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列、若しくはその一 部分を、完全に合成ケミストリにより作製して、その後、その合成遺伝子を任意 の入手可能なＤＮＡベクター及び細胞系に、この出願時点において周知の試薬を 用いて挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＤＢＩＨをコード する配列又はその任意の部分に突然変異を誘発させることができる。 また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性の条件の下で、第１Ａ 図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なポリ ヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件は、Berger及びKimmel(1 987,Guide to Molecular Cloning Technioues ．Methods in Enzymology,Vol 152 ,Academic Press,San Diego CA)に記載されているように、核酸結合複合体また はプローブの融点（Ｔｍ）に基づいており、定義された「厳密性」で用いられる 基準を与える。上記文献は本明細書と一体に引用されたものである。 本発明において用いられ得るＤＢＩＨをコードする変異核酸配列は、異なるヌ クレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的 に等価のＤＢＩＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである 。そのタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに 置換を含み、結果的に機能的に等価 なＤＢＩＨとなる。慎重なアミノ酸置換は、ＤＢＩＨの生物学的活性が保持され る限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒 性についての類似性に基づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸にはア スパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及び アルギニンが含まれ、同じ親水値を持つ荷電していない極性頭基を有するアミノ 酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン 、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンが含まれ る。 本発明の範囲に含まれるものとして、ＤＢＩＨのアレルがある。ここで用いる 「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＤＢＩＨの別形態である。アレルは変異 、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変化したｍＲＮＡ或いはポリペ プチドを生成するが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は変更 される場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、アレル形態が存 在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。アレルを生 じる変異は一般に、アミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に起因する。このタ イプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の遺伝子の組み合わせて、与えられた配 列内の１又は２以上の位置で生じ得る。 ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ，Se quenase（商標）のクラノウフラグメント（US Biochemical社,Cleveland OH）、 Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社,Norwalk CT）、熱安定性Ｔ７ポリメラー ゼ（Amersham社,Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersburg MD）Methods社 から市販されているELONGASE増幅システムのような組換えポリメラーゼとプルー フリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。好 ましくは、この処理は、Hamilton Micro Lab2200(Hamilton社,Reno NV)、Peltier Thermal Cycler（PTC200；MJReserch社,Watertown MA)並びにABI3 77DNAシーケンサ（Perkin Elmer社）のような装置を用いて自動化される。 ポリヌクレオチド配列の延長 ＤＢＩＨをコードするポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列と 、プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には 周知の様々な方法とを用いて延長することができる。Gobinda等（1993;PCR Meth ods Applic 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するために汎 用プライマーを用いる直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）法を開示している。ここでは、まずゲノムＤＮＡが、既知の領域に対し て特異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅され る。増幅された配列は、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内 部に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣ Ｒの各回の生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素 を用いて配列決定される。 逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増 幅、または延長を行うことができる(Triglia等(1988)Nucleic Acids Res 16:818 6)。プライマーは、OLIGO（登録商標）4.06(National Biosciences社,Plymouth MN)或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２０〜３０ヌクレオ チドで、５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列 にアニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域 の適当なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分子内ライゲーシ ョンにより環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型として使用される。 キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom M等（1991）PCR Methods Applic 1:111-19）は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣 接するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行うための方法である。またキャプチ ャＰＣＲでは、多重制限酵素消化及びライゲーションによってＰＣＲ前にＤＮＡ 分子の未知の部分に、組換え二本鎖配列を配置する必要がある。 未知の配列を検索するために用いることができる別の方法は、Parker JD等の 方法である（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60）。更に、ＰＣＲ、ネスト化 プライマー並びにPromoterFinderのライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内を歩 行させることができる（PromoterFinder（登録商標）、Clontech社（Palo Alto CA））。このプロセスは、ライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イン トロン／エクソン接合部を探し出すのに有用である。 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適なライブラリーは、サイズ選 択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムプライ ミングした（rondom primed）ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流領域を含 むより多くの配列を含むという点で好適である。ランダムプライミングしたライ ブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生成しない場合、 特に有用である。またゲノムライブラリーは、プロモータ結合領域の５’まで延 長するために有用である。 サイズを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌクレオチド配列を 確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。迅速な配列決定の ためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社（Fullerton CA） 並びに他の企業から入手できる。キャピラリー電気泳動法では、電気泳動分離の ための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる蛍光色素（各ヌクレ オチドに対して１つ） を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波長の検出を行う。出力／光強度は適切 なソフトウエア（例えばPerkin elmer社製のGenotyper（登録商標）及びSequenc e Navigator（登録商標））を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷から コンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。 キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定された量の中に存在するＤＮＡ の小片の配列決定に特に適している。この方法により３０分間でＭ１３ファージ ＤＮＡの３５０ｂｐを再現可能な形で配列決定できたことが報告されている（Ru iz-Martinez MC等（1993）Anal Chem 65:2851-8）。 ヌクレオチド配列の発現 本発明により、ＤＢＩＨ、そのポリペプチドの断片、融合タンパク質或いはそ の機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのＤ ＢＩＨの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成するために用いることができる 。遺伝暗号固有の縮重のために、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ酸配列 をコードする他のＤＮＡ配列も、ＤＢＩＨのクローニングや発現のために用いる ことができる。当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＤＢＩ Ｈコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であり得る。特定の原核細胞 或いは真核細胞の宿主において好適なコドン(Murray E等(1989);Nucleic AcidsR es 17:477-508)を選択して、例えば、ＤＢＩＨ発現率を増大させたり、或いは自 然発生配列から生成された転写産物より長い半減期のような望ましい特性を有す る組換えＲＮＡ転写産物を生成することができる。 本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＤＢＩＨコード配列を変更するた めに組換えられ得るが、このような変更には、限定はしないが遺伝子生成物のク ローニング、プロセシング並びにまた発現を修飾するための変更が含まれる。例 えば、特定部位突然変異誘発のような当業者 には周知の技術を用いて突然変異を誘発させることによって、新しい制限部位の 挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変化等をもたらすことができ る。 本発明の別の実施例では、天然ＤＢＩＨコーディング配列、修飾ＤＢＩＨコー ディング配列或いは組換えＤＢＩＨコーディング配列を異種の配列に結合して、 融合タンパク質をコードする配列にする。例えば、ＤＢＩＨ活性のインヒビター を選別すべくペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体に より認識される異種のペプチドを発現するキメラＤＢＩＨタンパク質をコード化 することが役立ち得る。融合タンパク質はＤＢＩＨ配列と異種のタンパク質配列 との間の位置に切断部位を包含するように設計することもでき、これによってＤ ＢＩＨを切断して、異種の部分から分けて実質的に精製することが可能となる。 本発明の別の実施例では、ＤＢＩＨコーディング配列は、当業者によく知られ た化学的方法（Caruthers等（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、Crea, Horn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci,Caruthers（1980）Tetrahedron Lett 21:719、Chow,Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照）を用いて 、全体的に、或いは部分的に合成することができる。別法では、ＤＢＩＨアミノ 酸配列を、全体的に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体 を生成することができる。例えば、種々の固相技術(Roberge JY等(1995)Science 269:202-204)でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI43 1Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を製造者の指示に従って用いることに より達成することができる。 この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより精 製することができる（例えばCreighton（1983）Proteins Structure And Molecu lar Principles ,WH Freeman and Co,New York 参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いは配列決定処理により 確認することができる（例えばthe Edman degradation procedure;Creighton， 上述）。さらにＤＢＩＨのアミノ酸配列、或いはその任意の部分を、その直接の 合成の際に改変したり、また他の細胞内メディエータ或いはその任意の部分に由 来する配列と化学的方法を用いて結合して、変異体ポリペプチドを生成すること ができる。 発現系 生物学的に活性のＤＢＩＨを発現するために、ＤＢＩＨコーディングヌクレオ チド配列或いは機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコー ド化配列の転写及び翻訳に必要不可欠な要素を含むベクターに挿入される。 ＤＢＩＨコーディング配列及び適切な転写や翻訳の制御エレメントを含む発現 ベクターを構成するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には 、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え、即ち遺伝子組 換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook等（1989）Molecular Clonin g,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel FM 等CnrrentProtocol in Molecular Biology,John Wilky&Sons,New Yorkに記載さ れている。 種々の発現ベクター／宿主系を、ＤＢＩＨコード化配列を保持し、かつ発現す るために利用することができる。このようなものには、限定はされないが、組換 えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転 換した細菌、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌、ウイルス発現ベクター （例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（ 例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）をト ランスフェク トした、或いはバクテリア発現ベクター（例えばTi、或いはpBR322プラスミド） で形質転換した植物細胞系、或いは動物細胞系が含まれる。 これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び特異性は 様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサー、プロモータ及び３’非翻訳領域 であり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作 用する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを 含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが用いられ得る。例えば、バクテ リア系においてクローニングする際には、Bluescript（登録商標）ファージミド （Stratagene社，LaJolla CA）のハイブリッドlacZプロモータ及びptrp-lacハイ ブリッド並びに同様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイルスポリヘ ドリンプロモータは昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム（例えば熱 ショック，RUBISCO及びストレージタンパク質遺伝子）に由来する、或いは植物 ウイルス（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダー配列）に由来するプロモ ータ或いはエンハンサはベクターにクローン化され得る。哺乳動物細胞では、哺 乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモータが最適である。ＤＢＩＨ の多数の複製を含む株細胞を生成する必要がある場合には、SV40或いはEBVに基 づくベクターを、適切な選択マーカーと共に用いる。 細菌系では、ＤＢＩＨの発現の用途に応じて多数の発現ベクターが選択され得 る。例えば抗体を誘発するために大量のＤＢＩＨが必要とされる場合は、容易に 精製される融合タンパク質を高濃度で発現できるベクターが望まれる。そのよう なベクターには、限定はしないが、大腸菌クローニングベクター及び発現ベクタ ーBluescript（Stratagene社）（このベクターでは、ＤＢＩＨコード化配列が、 アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を備え たフレーム内にお いてベクターに結合されてハイブリッドタンパク質が生成される）や、pINベク ター（Van Heeke&Schuster（1989）J Biol Chem 264:5503-5509）等が含まれる 。またpGEXベクター(Promage社、Madison WI)も、グルタチオンＳ−トランスフ ァーゼ（GST）を有する融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するため 用いられる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン アガロースビーズへの吸着に続き、遊離グルタチオンの存在下における溶出によ り溶解した細胞から容易に精製できる。その系において生成されたタンパク質は ヘパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計さ れ、対象となるクローン化ポリペプチドは随意にGST部分から放出され得る。 酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因 子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導性プロモータを 含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等（前出）及 びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。 植物発現ベクターを用いる場合には、ＤＢＩＨをコードする配列の発現は、多 数の任意のプロモータにより促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモータ（ Brisson等（1984）Nature 310:511-514）のようなウイルス性プロモータは、単 独で、或いはTMV(Takamatsu等(1987)EMBO J 6:307-311)からのオメガ−リーダー 配列と共に用いられる。別法では、RUBISCO（Coruzzi等（1984）EMBO J 3:1671- 1680）、Broglie等（1984）Science 224:838-843）の小サブユニット、或いは熱 ショックプロモータ(Winter J及びSinibaldi RM(1991)Results Probl Cell Diff er 17:85-105)のような植物プロモータが用いられる。これらの構成は直接ＤＮ Ａ形質転換或いは病原体媒介トランスフェクションに より植物細胞内に導入される。そのような技術を再検討する場合には、Hobbs S 及びMurry LE、McGraw Hill Yearbook of Science and TechnologY（1992）McGr aw Hill NY,pp191-196及びWeissbach and Weissbach（1988）Methods for Plant Molecular Biology ,Academic Press NY,pp421-463を参照されたい。 ＤＢＩＨを発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。そ のような系の一つでは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV） がベクターとして用いられ、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの 幼虫において外来遺伝子を発現する。ＤＢＩＨコード化配列は、ポリヘドリン遺 伝子のような、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモ ータの制御下に置かれる。ＤＢＩＨの挿入が成功した場合には、ポリヘドリン遺 伝子が不活性にされ、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスが生成され る。次いで、この変異体ウイルスは、S.frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼 虫への感染させるために用いられ、その中でＤＢＩＨが発現される（Smith等（1 983）J Virol 46:584、Engelhard EK等（1994）Proc Nat Acad Sci 91:3224-7） 。 哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現 ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＤＢＩＨのコード化配列 は、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳物 複合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須領域への挿入により、感染し た宿主細胞でＤＢＩＨを発現することができる生存可能なウイルスになる（Loga n及びShenk（1984）Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659）。さらにラウス肉腫ウイ ルス（RSV）エンハンサのような転写エンハンサを哺乳類宿主細胞内の発現を増 加させるために用いることができる。 また、ＤＢＩＨ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要で ある。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接の配列が含まれる。ＤＢ ＩＨ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合 には、追加の翻訳制御シグナルは不要である。しかしながらコード化配列、或い はその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シ グナルが与えられなければならない。さらに、開始コドンは正しい読み枠内にあ る必要があり、全インサートの転写を確実に行わなければならない。外来転写エ レメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであ り得る。発現の効果は、その細胞系に適切なエンハンサを含めることにより強化 される（Scharf等（1994）Results Probl Cell Differ 20:125-62、Bitter等（1 987）Methods Enzymol 153:516-544）。 さらに宿主細胞株は、挿入された配列を望ましい形に改変したり、発現したタ ンパク質のプロセシングを行う能力で選択される。このようなポリペプチドの修 飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化 、脂質化（lipidation）並びにアシル化を含む。またタンパク質の「プレプロ」 形態を切り離す、翻訳後プロセシングは、正しい挿入、折り畳み、並びにまた機 能の発揮のために重要である。CHO,HeLa,MDCK,293,WI38等のような異なる宿主細 胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機構を有して おり、導入される外来タンパク質の修飾やプロセシングを確実に実行するべく選 択される。 長期間にわたって高収率の変異体タンパク質の生産を確保するためには、安定 した発現が望ましい。例えばＤＢＩＨを安定的に発現する株細胞は、ウイルス由 来の複製物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベ クターを用いて形質転換される。ベクターの 導入に続いて、細胞は、選択培地に切り替えられる前に、濃縮培地内で１〜２日 間成長させられる。選択マーカーは選択物への耐性を与え、導入された配列をＤ ＮＡ内に安定的に結合する細胞を同定できるようにする。安定的に形質転換され た細胞の耐性凝集塊はその細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖することが できる。 形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ る。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler 等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ （Lowy等（1980）Cell 22:817-23）遺伝子を含み、それぞれtk-及びaprt-細胞に おいて用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の 基礎として用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を 与え（Wigler等(1980)Natl Acad Sci77:3567）、nptはアミノグリコシッド剤、 ネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（Colberre-Garapin等（1981）J Mol Biol 150:1）、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsulfuron)、フォスフィ ノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricinacetyltransferase） に対する耐性を与える（上記Murry）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば 細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、細胞 がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにするhisD が記載されている（Hartman及びMulligan（1988）Proc Nalt Acad Sci 85:8047 ）。最近になって、形質転換体を同定するためばかりではなく、特定ベクター系 による一過性の或いは安定なタンパク質発現の量を定量するために広く用いられ るβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及びルシフェリンのような標識による 可視標識が非常によく用いられるようになった（Rhodes CA等（1995）Methods M ol Biol 55:121-131）。 本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定 マーカー遺伝子発現の存在／不存在は、対象の遺伝子も存在することを示唆す るが、その存在及び発現は確認されるべきである。例えばＤＢＩＨがマーカー遺 伝子配列内に挿入されるなら、ＤＢＩＨを含む組換え細胞がマーカー遺伝子の機 能の存在により同定できる。別法ではマーカー遺伝子は、単一プロモータの制御 下でＤＢＩＨ配列と直列に配置することができる。誘導または選択に応じてのマ ーカー伝子の発現は、通常さらにＤＢＩＨの発現をも示す。 この他、ＤＢＩＨのコーディング配列を含み、さらにＤＢＩＨを発現する宿主 細胞が、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、限定 はしないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び 、核酸及びタンパク質の検出並びにまた定量するための膜、溶液或いは破片ベー スの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。 ＤＢＩＨポリヌクレオチド配列の存在は、ＤＢＩＨのプローブ、一部、或いは フラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーシ ョン或いは、増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは 、ＤＢＩＨ配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用し、ＤＢＩ ＨのＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出する。本明細書において「オリ ゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いは、ＰＣＲで増幅さ れるセグメントであるアンプリマーとして用いることができる、少なくとも１０ ヌクレオチド、多い場合には６０ヌクレオチド、好適には１５〜３０ヌクレオチ ド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。 このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいず れかを用いてＤＢＩＨポリペプチドの発現を検出し、測定する ための種々のプロトコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例と しては、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ） 及び蛍光表示式細胞分取器法（ＦＡＣＳ）を含む。ＤＢＩＨポリペプチド上で２ つの非干渉なエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位 モノクローナルベースイムノアッセイ（two-site,monoclonal-based immunoassa y）は好適ではあるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並 びに他のアッセイは、Hampton R等(1990,Serologivcal Methods,a Laboratory M anual,APS Press,St Paul MN)及びMaddox DE等（1983,I Exp Med 158:1211）等 に記載されている。 さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ ノ酸検査法において用いることができる。ＤＢＩＨに関連する配列を検出するた めの標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための 手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、末端標識化或いは標識 化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法では、ＤＢＩＨ配列、或い はその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクターにクローニング される。そのようなベクターは当分野では周知であり、市販されており、Ｔ７， Ｔ３或いはＳＰ６並びに標識されたヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリメラ ーゼの付加により、in vitroでのＲＮＡプローブ合成のために用いることができ る。 Pharmacia Biotech社(Piscataway NJ)、Promega社(Madison WI)並びにUS Bioc hemical社（Cleveland OH）のようないくつかの企業がこれらの手順に対する商 用のキット及びプロトコルを提供している。適切なリポーター分子、すなわち標 識には、放射性核種、酵素、蛍光性剤、化学ルミネセンス剤或いは色素生成剤や 、基質、補助因子、インヒビタ ー、磁気粒子或いはそれに類似のものが含まれる。そのような標識の使用につい て記載している特許には、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,35 0号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号並びに第4,336,241号があ る。また、組換え免疫グロブリンの製造については米国特許第4,816,567号に記 載の方法を用いることができ、本明細書とともに参照されたい。 ＤＢＩＨの精製 ＤＢＩＨをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培 地からコード化タンパク質を発現及び回収するために適切な条件下で培養される 。組換え細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベクタ ーに応じて、細胞内に分泌、つまり含有されるようにすることができる。当業者 には理解されるように、ＤＢＩＨをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベク ターは、原核細胞か、真核細胞の細胞膜を通してのＤＢＩＨの分泌を誘導するシ グナル配列を含むように設計される。他の組換え体作製物では、ＤＢＩＨを、可 溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオ チド配列に結合することができる（Kroll DJ等（1993）DNA Cell Biol 12:441-5 3、融合タンパク質を含むベクターに関する上記論議も参照されたい）。 またＤＢＩＨは、タンパク質精製を容易にするために加えられた１または２以 上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質として発現される 。そのような精製を容易にするドメインには、限定はしないが、固定化金属上で の精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレート ペプチド（Porath J（1992）Protain Expr Purif 3:263-281）、固定化免疫グロ ブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにＦＬＡＧＳ延長／ アフィニティ精製シ ステムにおいて用いられるドメイン（Immunex社、Seattle WA）が含まれる。精 製ドメイン及びＤＢＩＨ間に第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen,S an Diego CA）のような切断可能なリンカー配列を含めるのは精製を促進するの に役立つ。このような発現ベクターの１つは、ＤＢＩＨを含む融合タンパク質の 発現を提供し、かつ６個のヒシチジン残基、それに続くチオレドキシン及びエン テロキナーゼ切断部位をコードする核酸を含む。ヒシチジン残基によりＩＭＩＡ Ｃ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、Porathら(1992)Prot ein Expression and Purification 3:263-281に記載）上での精製を促進すると 共にエンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からの目的タンパク質の精製 のための手段となる。 組換え体の産生に加えて、ＤＢＩＨのフラグメントは、固層技術を用いた直接 のペプチド合成で形成することもできる。（Stewartら（1969）Solid-Phase Pet ide Synthesis,WH Freeman Co,San Francisco;Merrifield J(1963)J Am Chem So c 85:2149-2154を参照されたい）。in vitroタンパク質合成は手作業で行えるが 、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431A ペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer,Foster City CA）を製造者の指示に従っ て用いて行うことができる。ＤＢＩＨの種々のフラグメントを個別に化学的に合 成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出すことができる。 ＤＢＩＨの使用 ここに開示するポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の使用の原理は、新規 なＤＢＩＨ及びヒト及びウシのＤＢＩ／ＡＣＢＰのアイソフォームの間の化学的 及び構造的相同性に部分的に基づいている。ＤＢＩＨは、傍神経節腫を含む傍神 経節の機能の異常が関係する病気、疾患、又は疾病の診断及び治療に用いること ができる。 傍神経節腫の臨床的特徴及び病的状態を引き起こす主な原因は、カテコールア ミンの異常放出である。最も一般的な症状は高血圧である。傍神経節腫は、高血 圧の原因であり治療可能である。実際、適切に診断及び治療がなされるならば、 死に至る場合はほとんどない。 ＤＢＩＨは、傍神経節におけるカテコールアミンのような生物学的分子の生合 成や代謝の調節に役立ち得る。傍神経節の機能に関係する分子、又はその前駆物 質、又は代謝産物は、脂肪性アシルＣｏＡがＤＢＩ／ＡＣＢＰに結合するのと類 似の方式で、ＤＢＩＨに結合し得る。ＤＢＩＨは、加水分解や酸化のような望ま しくない副反応から結合したリガンドを捕捉し保護したり、レセプターにリガン ドが結合した分子を提示し得る。この他、ＤＢＩＨ又はその断片は、傍神経種に おけるカテコールアミン誘導性応答の神経調節物質としても作用し得る。 ＤＢＩＨ又はその断片を、それが捕捉する、又はそれが相互作用する特定の分 子を同定するために用いることができる。この点に関して、ＤＢＩＨは、複合体 が水溶性となって治療用のデリバリーに適切なものとなるように薬剤に特異的に 結合させて治療薬を分離するためにも用いることができる。 傍神経節関連疾患が関係するＤＢＩＨの過剰発現では、ＤＢＩＨを抑制するこ とが有益であり得る。ＤＢＩＨは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与によ って抑制することが可能である。別法では、ＤＢＩＨのアクティブ部位を特異的 に認識する抗体が、異常ＤＢＩＨ活性が関係する疾病や病気の治療のために導入 され得る。 ＤＢＩＨの構造により、他の治療的分子の送達におけるその利用も可能となる 。ＤＢＩＨは、通常水に不溶性であるか、又は僅かしか溶けない治療用薬剤又は 薬物に結合し得る。ＤＢＩＨ分子の高い電荷密度のために、タンパク質−リガン ド複合体が水性環境で可溶性になる。治療用 リガンドに対するＤＢＩＨの特異性及び結合親和性は、当業者には周知のタンパ ク質工学技術により操作することができる。 ＤＢＩＨの抗体 ＤＢＩＨ特異的抗体は、ＤＢＩＨの発現が関係する病気や疾病の診断のために 役立つ。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクロ ーナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ライブ ラリにより生成されるフラグメントが含まれる。中和抗体、すなわちＤＢＩＨポ リペプチドの生物活性を抑制する抗体は、特に診断及び治療に好適である。 抗体誘発のためのＤＢＩＨは生物学的活性を有している必要はないが、そのタ ンパク質断片、つまりオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特異的抗体 を誘発するために用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましく は少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。これらの配列は 、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一のものであり、小さい自然発生の 分子の全アミノ酸配列を含み得る。ＤＢＩＨアミノ酸の短いストレッチを、キー ホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のような 他のタンパク質の配列に融合することができる。ＤＢＩＨに対する抗体の生成の ために、当分野においてよく知られる手順が用いられる。 抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は 、免疫学的特性を保持するＤＢＩＨ或いはその任意の部分、フラグメント或いは オリゴペプチドを注入することにより免疫することができる。宿主の種に応じて 、種々のアジュバントが免疫学的反応を促進するために用いられる。そのような アジュバントには、限定はしないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミ ニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような表面活性物質ア ジュバント、プルロ ニックポリオルアジュバント、ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバン ト、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットヘモシニアンアジュバント並 びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ＢＣＧ（カルメット-ゲラン 杆菌）及びコリネバクテリウムパルヴム（Corynebacterium parvum）は有用なヒ トアジュバントである。 ＤＢＩＨに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞によって抗体分 子の産生を行うための任意の技術を用いて調製される。これらは、限定はしない が、Koehler及びMilstein(1975,Nature256:495-497)に当初掲載されたハイブリ ドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor等（1983）Immunol Today 4 :72、Cote等（1983）Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）及びＥＢＶ−ハイブリ ドーマ技術（Cote等（1985）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss Inc,pp77-96）を含む。 さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ 抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのた めに開発された技術が用いられる（Morrison等（1984）Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855）、Neuberger等（1984）Nature 312:604-608、Takeda等（1985）Natu re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のための周知技術（米国特許第 4,946,778号）を、ＤＢＩＨ特異的一本鎖抗体を生成するために適用する。 また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導することにより、或い はOrlandi等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter G及びMil stein C（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような組換え免疫グロブ リンライブラリー、または高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングす ることによっても生成することができる。 ＤＢＩＨに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができ る。例えばこのようなフラグメントには、限定はしないが、抗体分子のペプシン 消化により生成することができるＦ（ａｂ’）₂フラグメント及びＦ（ａｂ’）₂ フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるＦａ ｂフラグメントが含まれる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルＦ ａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブ ラリーを構築する（Huse WD等（1989）Science 256:1275-1281）。 確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のい ずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定量測定法のための種々のプ ロトコルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセイでは、一般 に、ＤＢＩＨとその特異的抗体（或いは類似のＤＢＩＨ結合分子）との間の複合 体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特異的ＤＢＩＨタンパク質上の ２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部 位モノクローナル用イムノアッセイが好適ではあるが、競合結合アッセイも用い られる。これらの検査法はMaddox DE等（1983,J Exp Med 158:1211）に記載され ている。 ＤＢＩＨ特異的抗体を用いる診断検査法 特定のＤＢＩＨ抗体は、ＤＢＩＨの発現の誘発によって特性化される病気或い は疾病の診断や、ＤＢＩＨで治療されている患者のモニタリングのためのアッセ イにおいて役立つ。ＤＢＩＨについての診断アッセイは、ヒトの体液、細胞或い は組織の抽出物において、ＤＢＩＨを検出するための抗体或いは標識を利用する 方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾の有無に拘わらず用いるこ とができる。多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或いは非共有結 合かのいずれかで それらをリポーター分子と結合することにより標識される。種々のリポーター分 子が周知となっており、その幾つかについては上記した。 それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクロー ナル抗体を用いて、ＤＢＩＨポリペプチドを測定するための種々のプロトコルが 当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法（ELISA）、ラジオ イムノアッセイ（RIA）並びに蛍光表示式細胞分取器法（FACS）がある。ＤＢＩ Ｈポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル 抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイは好適ではあるが、競合 的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイは、他にもあるが、Maddox DE 等（1983,I Exp Med 158:1211）に記載されている。 疾病の診断の基礎を提供するために、ＤＢＩＨ発現についての通常の値、すな わち標準値が確立されなければならない。これは複合体形成のために適切な条件 下で、ヒト或いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られる体液或いは 細胞抽出物と、ＤＢＩＨに対する抗体とを結合することにより得ることができる が、これは当分野ではよく知られた技術である。標準的な複合体形成量は、一連 のポジティブコントロールの希釈系とそれを比較することにより定量され、抗体 の既知の量が既知の濃度の精製ＤＢＩＨと結合される。その後正常サンプルから 得られた標準値を、ＤＢＩＨが関係する疾患を潜在的に患う被験者からのサンプ ルから得られた値と比較する。標準値と対象値との偏差によって疾病の存在を確 認できる。 薬物スクリーニング ＤＢＩＨ、その触媒作用性または免疫原性フラグメント或いはオリゴペプチド は、種々の任意の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニン グのために用いることができる。そのような試験にお いて用いられるフラグメントは、溶液、固体支持体への付着、細胞表面への付着 、或いは細胞内への定着において制限はない。ＤＢＩＨと試験される薬剤との間 の触媒活性、すなわち結合複合体形成の低下が測定される。 薬物スクリーニングのための別の方法は、ＤＢＩＨポリペプチドへの安定的な 結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを可能にするもので あり、１９８４年９月１３日公告の欧州特許出願第84/03564号（Guysen）に詳細 に記載されている。この文献を本明細書に一体に参照されたい。概要としては、 多数の別々の小ペプチド試験用化合物をプラスチックピン或いはいくつかの他の 表面のような、固体基質上で合成する。ポリペプチド試験化合物をＤＢＩＨフラ グメントと反応させ、洗浄する。次いで結合ＤＢＩＨを当分野で周知の方法によ り検出する。また精製ＤＢＩＨを前述の薬物スクリーニング技術において使用す るために、プレート上に直接コーティングすることもできる。別法では、ペプチ ドを捕捉し、固形支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いる。 また本発明は、ＤＢＩＨに結合し得る中和抗体特性が、ＤＢＩＨとの結合につ いて特に試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図 している。このようにして、抗体を用いて１または２以上の抗原性決定基をＤＢ ＩＨと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。 ＤＢＩＨコーディングポリヌクレオチドの使用 ＤＢＩＨポリヌクレオチド、或いはその一部が診断並びにまた治療目的で用い られる。診断目的の場合、本発明のＤＢＩＨは、ＤＢＩＨの発現が関与する生検 組織における遺伝子発現を検出し、かつ定量するために用いられる。診断試験は 、ＤＢＩＨが存在、不存在、及び過剰発現の 何れの状態にあるかを区別したり、治療的介入の際にＤＢＩＨ濃度の調節をモニ タリングするのに役立つ。本発明の範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチ センスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。 本発明の別の側面は、ＤＢＩＨまたは近縁な分子をコードするゲノム配列を含 むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いはＰ ＣＲプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわち 非常に高度な保存領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオチ ド）か、低度に保存的な領域（例えば特に３’領域におけるシステイン残基の間 の領域）の何れに由来するのかということや、ハイブリダイゼーション或いは増 幅の（高度の、中程度の或いは低度の）厳密性によって、そのプローブが自然発 生ＤＢＩＨのみを同定するものであるか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定 するものであるかが決まってくる。 プローブは近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いるこ とができ、好ましくは、これらのＤＢＩＨの任意のものをコードする配列から得 られるヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイブリダイ ゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列か、プロモータ、エン ハンサエレメント及び自然発生ＤＢＩＨのイントロンを含むゲノムの配列に由来 するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータ分子に より標識することができ、この標識には、³²Ｐや³⁵Ｓのような放射性核種、アビ ジン／ビオチン結合系によりプローブに結合するアルカリホスファターゼのよう な酵素標識等が含まれる。 ＤＢＩＨのＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブの生成のた めの他の手段は、ｍＲＮＡプローブ産生用のベクターにＤＢＩＨやＤＢＩＨ誘導 体をコードする核酸配列をクローン化することである。 このようなベクターは周知であって市販されており、Ｔ７やＳＰ６ ＲＮＡポリ メラーゼのような適切なＲＮＡポリメラーゼや適切な放射性標識ヌクレオチドを 付加することにより、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いることが できる。 診断 ＤＢＩＨをコードするポリヌクレオチド配列を、ＤＢＩＨの発現が関与する病 気や疾病の診断のために用いることができる。例えば、ＤＢＩＨをコードするポ リヌクレオチド配列を、ＤＢＩＨ発現を検出するための生検組織や体液の、ハイ ブリダイゼーションアッセイ或いはＰＣＲアッセイにおいて用いることができる 。そのような定性的及び定量的方法の形態には、サザンブロット法或いはノーザ ンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜用技術、ＰＣＲ技術、ディップス ティック試験法（試験紙法）、ピン或いはチップ技術及びELISA技術が含まれる 。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており、実際に市販されている多 くの診断キットの基礎となっている。 ここに開示したＤＢＩＨヌクレオチド配列は、炎症や疾病に関係する活性化や 誘導を検出するアッセイのための基礎を提供する。ＤＢＩＨヌクレオチド配列は 、既知の方法により標識され得、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した 条件の下で、患者の体液や組織のサンプルに加えられる。インキュベーション時 間の経過後、このサンプルを、ヌクレオチドが酵素で標識されている場合には所 望に応じて色素（または他の展開剤を要する標識）を含む適合性の液体で洗浄す る。この適合性の液体をリンスした後、色素を定量して標準値と比較する。生検 サンプルや抽出サンプルにおける色素の量が、比較用対照サンプルの色素量を著 しく上回っている場合には、このヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配 列とハイブリッド形成しており、サンプル内に著しく高い濃度 のＤＢＩＨヌクレオチド配列が存在していることは、関連する炎症及び／または 疾患が存在していることを示している。 このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するため、動物実験、 臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタリングする際に用いることができる 。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＤＢＩＨ発現に対する正常な或い は標準的なプロフィールが確立されなければならない。この標準プロフィールは 、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出物を 、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、ＤＢＩＨ或いはその一 部と結合することにより確立される。標準的なハイブリッド形成は、正常被験者 に対して得られる値と、既知の実質的に精製されたＤＢＩＨの量が用いられる同 一の実験におけるポジティブコントロール希釈系列で得られる値とを比較するこ とにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、ＤＢＩ Ｈ発現に関連する障害或いは疾患を潜在的に患っている被験者からのサンプルか ら得られる値と比較される。標準値と被験者値との偏差から疾病の存在が確認さ れる。 ひとたび疾患が確認されると、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファ イルが作成される。このようなアッセイは、その数値が正常すなわち標準パター ンに向かって回復しているか否かを評価するために規則的に繰り返される。継続 的な治療プロファイルを用いて数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を示 すことができる。 米国特許第4,683,195号、第4,800,195号並びに第4,965,188号に記載のような ＰＣＲ法により、ＤＢＩＨ配列に基づくオリゴヌクレオチドの追加の使用法が提 供される。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成されるが、酵素を用い て発生させたり、或いは組換え体を起源として生成することもできる。一般にオ リゴマーは、通常特定の遺伝子或 いは状態を同定するために最適な条件下で用いられる２つのヌクレオチド配列、 即ちセンス方向（５’→３’）のヌクレオチド及びアンチセンス方向（３’←５ ’）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴマー、入れ子オリゴマーの組 、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出 や定量のためのより低い厳密性の条件下であっても用いることができる。 さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識(radiolabeli ng)（Melby PC等1993 J Immunol Methods 159:235-44）或いはビオチン標識（Du plaa C等1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチドの利用、制御核酸の同時増幅 （coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して書かれた標準的なグラ フ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、ＥＬＩＳＡ形式のアッセイ を実行することにより迅速に行うことができ、対象のオリゴマーが様々な希釈溶 液中に現れ、分光光度分析或いは比色分析反応により迅速に定量することができ る。このタイプの確定診断により、健康の専門家が患者の積極的治療を開始した り、病状の悪化を防ぐことが可能となる。同様に、当業者に周知のアッセイを用 いて、患者の治療の際に、その病状の進行をモニタリングすることができる。ま た、まだ開発されていない分子生物学的技術でも、その新技術が既知のヌクレオ チド配列の性質、例えばトリプレット遺伝暗号、特異的塩基対形成等に基づくも のであれば、ここに開示したヌクレオチド配列をそれに利用することができる。 治療的利用 ＤＢＩ／ＡＣＢＰをコードする遺伝子に対するその相同性及びその発現プロフ ァイルに基づき、ここに開示するＤＢＩＨポリヌクレオチドは、傍神経節におけ る異常な機能が関係する病気の治療のための分子のデザインの基礎を提供し得る 。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来 する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の 器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当 業者によく知られた方法は、アンチＤＢＩＨを発現する組換えベクターを構築す るために用いることができる。例えばManiatis等（上記）及びAusubel等（上記 ）に記載された技術を参照されたい。 完全長ｃＤＮＡ配列、並びにまたその調節エレメントを含むポリヌクレオチド により、研究者は遺伝子機能のセンス調節（Youssoufian H及びHF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13:98-104）、或いはアンチセンス調節（Eguchi等（1991）Annu Rev Biochem 60:631-652）の調査用のツールとしてＤＢＩＨを用いることができ る。このような技術は、現在当分野ではよく知られており、センス或いはアンチ センスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラグメントを、コーディング領 域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計することができる。 所望のＤＢＩＨコーディング断片を高度に発現する発現ベクターを細胞または 組織にトランスフェクトすることにより、ＤＢＩＨをコードする遺伝子の機能を 停止させることができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアン チセンス配列とともに細胞から溢れ出し得る。ＤＮＡへの組み込みがない場合で すら、このようなベクターは、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解さ れるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような一過性の発現は、非複製ベク ター（Mettler I,personal communication）でも１ヶ月以上、適当な複製エレメ ントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。 上述のように、ＤＢＩＨの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ或いはイ ントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰ ＮＡを設計することにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、 例えばリーダー配列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが 好適である。またアンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを 防止することにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、抑 制は、「三重らせん」塩基対合法を用いて達成することができる。三重らせん対 合は、二重らせんが、ポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するべく 十分に開かないようにする。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は、Gee JE ら(Huber BE and BI Carr(1994)Molecular and Immunologic Approaches，Futur a Publishing Co,Mt Kisco NY)により記載されている。 リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で ある。リボザイムの作用の仕組みでは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の 配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる 切断（endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、ＤＢＩＨの エンドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に触媒し得る、人工合成 のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、 配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣが後続するリボザイム切断部位に対する標的分 子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝 子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、 そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価される 。また候補の標的の適切性の評価は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相 補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性を試験すること により行われる。 本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための 当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホス ホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のような化学合成オリゴヌクレオチ ドの技術が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＤＢＩＨをコードするＤＮＡ配 列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなＤＮＡ 配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有す る多種のベクターに組み込まれる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセ ンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成物が、株細胞、細胞或いは組織 内に導入される。 ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが できる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’並びにまた３’ 末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステ ラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２’Ｏ−メ チルを使用することを含む。このコンセプトは、ＰＮＡの産生において固有のも のであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グア ニン、シチジン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び 類似の修飾形態とともに、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブト シン（Wybutosine）のような従来あまり用いられなかった塩基を含めることによ って、これら全ての分子に拡張することができる。 細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方 法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo治療法に対して も適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞に ベクターを導入し、自家移植のためにクローンとして増殖して同じ患者に戻す方 法が、ここで引用されている米国特許第 5,399,493号及び第5,437,994号に記載されている。トランスフェクションによる 送達、リポソームによる送達は、当分野でよく知られているものである。 更に、ここに開示するＤＢＩＨのヌクレオチド配列は、新技術、即ち、限定は しないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特 性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する技術であれば、まだ開 発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。 近縁なポリヌクレオチド配列の検出及びマッピング ＤＢＩＨの核酸配列は、自然発生のゲノム配列のマッピングのためのハイブリ ダイゼーションプローブを生成するために用いることができる。この配列は、よ く知られた技術を用いて、特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対してマ ッピングすることができる。このような技術には、染色体を展着物（chromosoma l spreads）についてのin situハイブリダイゼーション（Verma等（1988）Human Chromosomes:A Manual of Basic Technique,Pergamon Press，New York）、フ ローソーティング（flow-sorted）染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体（Ｙ ＡＣｓ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１構造体或いはPrice CM（ 1993;Blood Rev 7:127-34）及びTrask BJ（1991;Trends Ganet7:149-54）に概要 が示されている単染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造が含まれる 。 染色体展着物についての蛍光in situハイブリダイゼーションの技術は、“Ver ma等（1988）Human Chromosomes:A Manual of BasicTechnioue,Pergamon Press ，New York”に記載されている。染色体調製物の蛍光in situハイブリダイゼー ション及び他の染色体マッピング技術は、追加の遺伝子地図データと関係を有す る。遺伝子地図データ の例は、1994 Genome Issue of Science(265:1981f)に見ることができる。物理 的染色体地図上でのＤＢＩＨの位置と、特定の失敗（または特定の疾病の素因） との相関関係を助けとして、ある遺伝病が関係するＤＮＡの領域を限界決定する ことができる。本発明のヌクレオチド配列を、健常者と、キャリアまたは患者と の遺伝子配列の違いを検出するために用いることができる。 染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する際に 大変重要である。ヒトゲノムのＳＴＳに基づく地図の最近の例は、Whitehead-MI T Center for genomic Reserch（Hudson TJら(1995)Science 270:1945-1954）か ら最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いはアームが未知 であっても、マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置から、関 連する標識を明らかにすることができる。新しい配列は、染色体の腕、或いはそ の一部への物理的マッピングにより割当てることができる。これは位置クローニ ング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情 報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患或いは症 候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴ〜11q22-23（Gatti等（1988）Nature 33 6:577-580）への遺伝子連鎖により粗く局所化されれば、その領域にマッピング される任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子 を表すことができる。本発明のヌクレオチド配列は、正常者とキャリアまたは患 者との間の、転座、逆位等による染色体位置の違いを検出するために用いること もできる。 医薬品組成物 本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、また はインヒビターを、単独で、或いは安定化化合物のような少なくとも１つの他の 薬剤とともに含んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は 、任意の無菌の生体適合性製薬用担体に含めて投与されるが、このような担体に は、限定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。 これらの分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して 、賦形剤或いは製薬学的に許容される担体と混合される他の薬品組成物に入れて 投与され得る。本発明の一実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学 的に不活性なものである。医薬品組成物の投与 医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、 局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与 、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与が含 まれる。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合 物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的 に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Reming ton's Pharmaceutical Sciences”（Mack Publishing Co,Easton PA）の最新版 において見出すことができる。 経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担 体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治 療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液 体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の剤形として処方さ れる。 経口投与するための医薬品調製物は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合する ことによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適 切な補助剤を添加した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、 錠剤或いは糖衣剤核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、サクロ ース、マンニトール或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク 質充填剤、とうもろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセル ロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロ ースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのような ゴム、並びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば 、架橋結合したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなア ルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可 溶化剤が加えられる。 糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混 合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量 を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムの ような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る 。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪 油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或 いは懸濁される。 非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、 本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理 緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。 水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール 或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性 成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒 或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド 或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応 じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるように なる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。 局所的投与または経鼻投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透 剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、一般的に周知である。製造と保管 本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化 処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍 結乾燥処理により製造される。 この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸 、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに 形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製 剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、使用前に緩衝 剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５．５にある２％〜７％のマンニトールにおけ る凍結乾燥粉末である。 製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調 製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のため にラベル付けされる。ＤＢＩＨの投与のため、このようなラベルには、投与の量 、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的 を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業 者の能力の範囲内で行うことができる。 任意の化合物について、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、或い は通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のア ッセイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効果的 な投与量や投与経路を決定することができる。 治療的に有効な投与量とは、疾病状態を寛解するタンパク質、その抗体、アン タゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療 有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個体 群の５０％において治療的に有効な投与量、５０％有効量）を決定するための、 細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的手順により決定することがで きる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５ ０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい 。これらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒ トへの使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような 化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃 度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並 びに投与経路に応じてこの範囲内で変化する。 正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択 される。投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果 を維持するために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、 または患者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤 、反応感受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物 は３〜４日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度 に応じて２週間に１度投与してもよい。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大 約１ｇであり、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは供給の方法に関 するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特許第4,657,760号 、第5,206,344号或いは第5,225,212号を参照されたい。当業者は、ヌクレオチド に対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異なる剤形を採用するであ ろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状 態、位置等によって決まってくる。 以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本 発明をこの実施例に限定しようとするものではない。 産業上の応用 １ ｃＤＮＡライブラリーの構築 傍神経節ｃＤＮＡライブラリーの作製のために用いられる通常の組織は、４６ 歳の成人男性から得られた（Lot＃0084;Mayo Clinic,Rochester MN）。冷凍組織 を、Brinkmann Homogenizer Polytron PT-3000（Brinkmann Instruments,Westbu ry NJ）を用いてホモジナイズし、グアニジウムイソチオシアネート溶液に溶解 した。このライセートを、Beckman L8-70M Ultracentrifuge（Beckman Instrume nts）でBeckman SW28ロータを用いて、５．７Ｍの塩化セシウムクッションを 通して、周囲温度で１８時間２５，０００ｒｐｍで遠心分離処理した。Stratage ne社のＲＮＡ単離プロトコルに従って、ｐＨ４．０の酸性フェノールで２回抽出 し、０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノールを用いて沈殿させ、 ＤＥＰＣ処理した水に再懸濁し、３７℃で１５分間ＤＮアーゼ処理した。等量の 酸性フェノールで反応を停止させ、Qiagen Oligotex kit（QIAGEN Inc,Chatswor th CA）を用いてＲＮＡを単離し、これをｃＤＮＡライブラリーの作製に用いた 。 このＲＮＡはSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（catalog＃18248-013;Gibcol/BRL）の推奨プロトコルに従って取り扱い 、ｃＤＮＡをpSport Iにリゲートした。続けてプラスミドpSport IをDH5a^TMコン ピテント細胞（Cat.＃18258-012,Gibco/BRL）に入れて形質転換させた。 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、ミニプレップキット（Catalogue＃774 68:Advanced Genetic Technologies Corporation,Gaithersburg MD）を用いて精 製した。このキットは９６０回の精製のための試薬を備えた、９６穴ブロックか らなるキットである。以下の変更点を除いてキットの推奨プロトコルを採用した 。（１）９６個のウエルのそれぞれを、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシン及び０．４ ％のグリセロールを含む滅菌Terrific Broth（Catalogue＃22711,LIFE TECHNOLO GIES^TM,Gaithersburg MD）を１ｍｌだけ充填した。（２）細菌をウェルへ負荷し た後２４時間培養して６０μｌの溶解バッファに溶解した。（３）Beckman GS-6 Rを用いて、２９００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行った後に、内容物をブロ ックし、一次濾板に添加した。（４）TRISバッファにイソプロパノールを添加す るオプションの行程は、定例的には行わなかった。プロトコルの最終ステップの 後、保管の ためBeckman９６穴ブロックにサンプルを移送した。 プラスミドＤＮＡの精製のための別の方法では、MAGIC MINIPREPS^TMDNA精製シ ステム（Catalogue♯A7100,Promega,Madison WI）又はQIAwell^TM-8プラスミド、 QIAwell PLUSDNA、及びQIAwell ULTRADNA精製システム（QIAGEN Chatsworth CA ）を用いる。 ｃＤＮＡの配列決定は、Hamilton Micro Lab2200（Hamilton,Reno NV）を、４ 基のPeltier Thernal Cyclers(PTC200 MJ Research,Watertown MA）及びApplied Biosystems 377又は373DNA Sequencing Systems（Perkin Elmer）と組み合わせ て用いて、SangerＦ及びAR Coulson（1975;Ｊ Mol Biol 94:441f）の方法で行い 、読み枠を決定した。 ３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの推定タンパク質の相同性検索 Applied Biosystems社で開発された検索アルゴリズムを、INHERIT（商標）670 Sequence Analysis Systemに組み込んで用いて、各ｃＤＮＡの配列をGenBankの 配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language（TR W社、LosAngeles CA）を用いて相同な領域を決定した。配列の比較をどのように 行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセッ ト、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組を用いて、対象の配 列に対して相同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適切な配列 には、初期値とともにスコアが付けられた。これによって、これらの相同な領域 をドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、相同な領域と偶然の 一致とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Watermanアライメントを用いて 表示した。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT（商標）670配列 解析システムをＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pa ttern Specification Language及びパラメータウィンドウを用いて、タンパク質 データベースから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともに スコアを付けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、 有意な相同性を有する領域と偶然の一致とを区別した。 BLASTは、Basic Local Alignment Search Tool(Altschul SF(1993)JMol Evol3 6:290-300;Altschul,SF等(1990)J Mol Biol215:403-10)の略称であり、これを用 いて局部的な配列アライメントを検索した。BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸 配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求める。そのアライメントの 局所性のために、BLASTは厳密な一致、すなわちホモログを求める際に特に有効 である。BLASTは間隙を含まない一致を求めるのに役立つ。BLASTアルゴリズム出 力の基本的な単位は、High-scoring Segment Pair（HSP）である。 HSPは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが、 そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのアラ イメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満足 、即ち、カットオフスコアを超えている。BLASTアプローチは問い合わせ配列と データベース配列との間のHSPを見つけ出すものであり、見出された任意の一致 の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足する一致の みを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列一致を知らせるため の統計的に有意な閾値を確定するパラメータである。Ｅは全データベース検索の 情況においてHSP（或いはHSPの組）の発生の機会の期待される頻度の上側の境界 として解釈される。その一致がＥを満足する任意のデータベース配列がプログラ ム出力において報告される。 ４ ノーザン法による解析 ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由 来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写 物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrookら、上述）。 類似のコンピュータ技術で、BLAST（Altschul SF 1993 and 1990,上述）を用 いてGenBankまたはLIFESEQ（商標）データベース（Incyte,Palo Alto CA）のよ うなデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多 数の膜式ハイブリダイゼーションより非常に短時間で行うことができる。更に、 コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるか の分類を決定することができる。 検索の基準値は、プロダクトスコアであり、これは以下の式で定義されるもの である。 （配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ このプロダクトスコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致 の双方を考慮している。例えば、プロダクトスコアが４０の場合は、一致は誤差 が１〜２％の範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相 同な分子は、通常プロダクトスコアとして１５〜４０を示すものを選択すること により同定されるが、スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される 。 ５ 完全長まで、又は調節エレメントを回復するまでのＤＢＩＨの延長 完全長ＤＢＩＨの核酸配列（配列番号：２）は、部分的ヌクレオチド配列を完 全長まで延長するため、或いはゲノムライブラリから５’配列を得るためのオリ ゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いることができる。一方のプライ マーはアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を 開始するために合成され、他方のプライマーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延 長するために合成される。これらのプライマーにより、周知のＤＢＩＨ配列を「 外側に」延長し、対象の制御領域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプ リコンを生成できるようになった（１９９５年６月７日出願の米国特許出願第08 /487,112号を本明細書と一体に参照されたい）。初期プライマーは、Oligo（登 録商標）4.06（National Biosciences社、Plymouth MN）、或いは他の適切なプ ログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで５０％以上のＧＣ含有率を 有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計すること ができる。結果的にヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生じる 任意のヌクレオチドのストレッチの延長はが回避される。 元の選択されたｃＤＮＡライブラリーか、ヒトゲノムライブラリーを用いて、 配列を延長する。後者のライブラリーは、５’上流配列を得るために最も役立つ 。必要なら、既知領域をさらに延長するために追加のプライマーの組が設計され る。 XL-PCRキット（Perkin Elmer社）のための指示に従って、酵素と反応混合物と を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０pmolの各プラ イマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合 、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（PTC200;MJ Reserch社、Watertown MA）を 用いて、以下のパラメータで実行される。 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア ガロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに 成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルか ら切り出した。さらなる精製には、QIAQuick（登録商標）（QIAGEN社）のような 市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌク レオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容易にする平滑末端 を作った。 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、 １μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチド キナーゼを加えて、その混合物を、室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜イ ンキュベートする。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な溶媒内にある ）を、３μｌのリゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地 （Sembrook J等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュベーションの後 、全ての形質転換混合物を、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani（ＬＢ）寒天上 にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、適切な 市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に入れられた１ ５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後日、 ５μｌの各オーバーナイト培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：１ ０に希釈した後、各５μｌのサンプルをＰＣＲアレイ内に移す。 ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４単位を含む１８μｌの濃 縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以 下の条件に従って行う。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動 させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロ ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。 ６ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、 ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０の 塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃＤＮＡ フラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、５０ｐ ｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ-³²Ｐ]アデノシン三リン酸（Amers ham社,Chicago IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN（商標）、 Boston MA）とを組み合わせて用いて標識する。標識されたオリゴヌクレオチド を、 SephadexG-25超精細樹脂カラム（Pharmacia社）を用いて精製する。それぞれ毎 分１０⁷カウントを含む各部分を、以下のエンドヌクレアーゼ（Asel,BglII,EcoR I,PstI,XbaI或いはPvuII；DuPont NEN（商標））の１つを用いて消化されるヒト ゲノムＤＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼーション解析において用いる。 切断した各ＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン膜（ Nytran Plus,Schleicher＆Schuell,Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーショ ンは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、ブロッ トは、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウム まで段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。XOMATAR（登録 商標）フィルム（Kodak,Rochester NY）を、数時間かけてPhosphoimager casset te（Molecular Dynamics,Sunnyvale CA）においてブロットに露光された後、ハ イブリダイゼーションパターンが視覚的に比較される。 ７ アンチセンス分子 ＤＢＩＨ配列或いはその任意の一部は、天然ＤＢＩＨのin vivoまたはin vitr o発現を抑制するために用られ得るアンチ七ンス分子の設計のための基礎となる 。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴマーの使用について特に記すが、大 きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いることができる。第１ Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示すようなＤＢＩＨのコード化配列に基づく相 補的なオリゴヌクレオチド用いて、自然発生ＤＢＩＨの発現を抑制することがで きる。この相補的なオリゴヌクレオチドを第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に 示す最も一義的な５’配列から設計し、これを用いてプロモーターが結合するの を阻害することにより転写を抑制したり、リボソームが転写物に結合するのを阻 害することによりＤＢＩＨ転写物の翻訳を抑制することができ る。配列番号：２のリーダー配列及び５’配列の適切な部分を用いることにより 、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１ Ｃ図に示すヌクレオチドのなかの、ポリペプチドのシグナル配列または初めの方 のコーディング配列に翻訳される領域全体にわたる１５〜２０個のヌクレオチド を含むようになる。 ８ ＤＢＩＨの発現 ＤＢＩＨの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、その ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニン グ用のpBluescriptベクターを、大腸菌株であるXLI-BlueMRF（商標）（Stratage ne）においてＤＢＩＨを発現するのに用いる。クロ−ニング部位の上流には、β −ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはアミノ基末端メ チオニン及びβ−ガラクトシダーゼの７残基が存在する。直後に続くこれら８つ の残基は、転写に役立つバクテリオファージプロモーターであり、多くの一義的 な切断部位を含むリンカーである。 単離されたＩＰＴＧトランスフェクト菌株を標準的な方法を用いて誘導するこ とにより、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及 び完全長ＤＢＩＨからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は、後 の行う活性のアッセイにおいて直接用いることができる菌培地へのＤＢＩＨの分 泌を誘導する。 ９ ＤＢＩＨの活性 リガンドのＤＢＩＨへの結合は、等温滴定マイクロカロリメーター（Micro-Ca lInc,Northampton MA）で、生じたエンタルピー（熱発生又は熱吸収）の変化を モニタリングすることによりアッセイする。滴定熱測定には、リガンド又は受容 体分子の標識は不要で、検出は単に、結合時のエンタルピーの熱の内因性の変化 に基づく。既知の量のリガンド 溶液を、コンピュータ制御式で、ＤＢＩＨを含む熱的に制御されたチャンバ内に 複数回注入する。各注入後のエンタルピーの変化を、注入の回数に対してプロッ トし、結合等温線を作る。ＤＢＩＨ溶液及び注入されたリガンドの量や濃度を、 結合等温線と共に用いて、候補のリガンドとＤＢＩＨの会合度、数及び親和性に ついての数値を計算する。 １０ ＤＢＩＨ特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電 気泳動法（Sambrook前出）を用いて精製されたＤＢＩＨを用いる。ＤＢＩＨから 翻訳されたアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社）を用いて解析して 免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者には周知の手 段により合成して、当業者に周知の方法で抗体をを産生するために用いる。Ｃ末 端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピトー プを選択するための解析法は、Ausubel FM等（上記）の論文に記載されており、 第４図及び第５図に示されている。 通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ プチドシンセサイザーModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法ケミストリにより合成し、 Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ： Ausubel FM等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（ ＫＬＨ、Sigma）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおけるオリゴペ プチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド 活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％BSAを用い てブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識され たヤギ抗ウサギＩｇＧに反応させる。 １１ 特異的抗体を用いる自然発生ＤＢＩＨの精製 自然発生ＤＢＩＨ或いは組換えＤＢＩＨは、ＤＢＩＨに対する特異的な抗体を用 いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イム ノアフィニティーカラムは、CnBr活性化Sepharose（Pharmacia Biotech社）のよ うな活性化クロマトグラフレジンとＤＢＩＨ抗体とを共有結合させることにより 構成される。結合後、そのレジンを製造者の指示に従って、ブロックし洗浄する 。 ＤＢＩＨを発現する細胞からの細胞分画を、全細胞の可溶化及び分画遠沈によ る小細胞分画の単離、界面活性剤の添加、若しくは周知の他の方法で調製する。 別法では、適当なシグナル配列を含む組換え体ＨＩＴＰ断片を、トランスフェク ト細胞が増殖可能な培地に有用な量だけ分泌させる。 ＤＢＩＨを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＤＢ ＩＨを優先的に吸収できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高イオ ン強度緩衝剤で）洗浄する。このカラムを、抗体／ＤＢＩＨ結合を切るような条 件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イ オンのようなカオトロピックイオン）で溶離させ、ＤＢＩＨを回収する。 １２ ＤＢＩＨと相互作用する分子の同定 ＤＢＩＨは、それが相互作用する分子の同定、特性化、及び精製のための研究 用ツールとして役立つ。アフィニティー精製の一実施例では、ＤＢＩＨをクロマ トグラフィーラムと共有結合で結合させる。細胞及び細胞膜を抽出し、内生のＤ ＢＩＨは除去され、種々のＤＢＩＨを含まない小成分がカラムを通過する。ＤＢ ＩＨが結合した分子は、その生物学的親和性によってカラムに結合する。ＤＢＩ Ｈ複合体をカラムから回収して解離させ、回収された分子に対してＮ末端タンパ ク質シークエンシングか、高速液体クロマトグラフィー／質量分析（ＨＰＬＣ／ ＭＳ） の何れかを行う。次に、このアミノ酸配列か質量分析結果を用いて、捕捉された 分子の同定したり、タンパク質リガンドの場合には適切なｃＤＮＡライブラリー からの該遺伝子のクローニングのための縮重オリゴヌクレオチドプローブをデザ インする。 別の方法では、ＤＢＩＨに対するモノクローナル抗体を産生させて、その抗体 のＤＢＩＨへの結合を阻害する化合物を同定する。次にこれらのモノクローナル 抗体をアフィニティー精製か関連分子の発現クローニングにおいて用いる。 他の可溶性結合分子は同様な方法で同定される。¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬 （Bolton,AE and Hunter,WM(1973)Biochem J 133:529）であらかじめ標識したＤ ＢＩＨを、例えば傍神経節、リウマチ様滑膜、又は小脳のような組織又は細胞に 由来する抽出物又は生検材料と共にインキュベートする。インキュベーションの 後、（精製されたＤＢＩＨ分子のサイズよりも大きい）ＤＢＩＨ複合体を、サイ ズ排除クロマトグラフィーや密度勾配遠心分離法のようなサイジング技術によっ て同定し、周知の方法で精製する。この可溶性結合タンパク質に対してＮ末端シ ークエンシング又は質量分析を行い、可溶性タンパク質又は分子が既知である場 合にはデータベースを用いた同定を行うための、この可溶性タンパク質が未知で ある場合にはクローン化するための十分な情報を得る。 上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本 発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及 び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実 施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実 施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を 実施するために記載された方法 の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明らかなように 、以下の請求項の範囲内に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＵＳ (72)発明者 ゴリ、スリヤ・ケイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94086・ サニーベイル・＃338・アイリスアベニュ ー 620

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：１のアミノ酸配列、又はその断片を含む実質的に精製されたポリ ペプチド。 ２．請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチド 配列。 ３．配列番号：２の配列又はその変異体からなることを特徴とする請求項３に記 載の単離され精製されたポリヌクレオチド配列。 ４．配列番号：２の配列に相補的な配列又はその変異体を含むポリヌクレオチド 配列。 ５．厳密な条件の下で、配列番号：２の配列とハイブリッド形成する単離された ポリヌクレオチド配列。 ６．請求項３のポリヌクレオチド配列を含む組み換え体発現ベクター。 ７．請求項３のポリヌクレオチド配列を含む組換え体宿主細胞。 ８．配列番号：１の配列又はその断片からなるポリペプチドの生成方法であって 、 （ａ）該ポリペプチドの発現に適した条件の下で請求項７の宿主細胞を培養す る過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から該ポリペプチドを回収する過程とを有すること を特徴とする配列番号：１の配列又はその断片からなるポリペプチドの生成方法 。 ９．請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。 １０．配列番号：１のポリペプチドを適切な製薬用担体と共に含む医薬品組成物 。 １１．配列番号：１の配列と治療用薬剤とからなる薬物デリバリー用ポリペプチ ド。