JP2000517187A

JP2000517187A - 繊維芽細胞増殖因子相同因子（ｆｈｆ）及び使用方法

Info

Publication number: JP2000517187A
Application number: JP10511956A
Authority: JP
Inventors: ネーサンズ，ジェレミー; スモールウッド，フィリップ，エム．
Original assignee: ザジョーンズホプキンスユニバーシティースクールオブメディシン
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-27
Publication date: 2000-12-26
Also published as: EP0960117A1; US6020189A; ATE360025T1; WO1998008864A1; EP0960117A4; AU4240697A; EP0960117B1; NZ334259A; ES2281916T3; AU730403B2; US6635744B1; BR9712793A; IL128569A; DE69737633T2; IL128569A0; DE69737633D1; CA2263827A1; US20040102379A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、繊維芽細胞増殖因子相同因子(FHF)ポリペプチド、及びそれらをコードする核酸分子を提供する。FHFポリペプチド及び核酸を使用する診断及び治療方法も本発明に包含される。

Description

【発明の詳細な説明】繊維芽細胞増殖因子相同因子(FHF)及び使用方法発明の背景 1.発明の分野本発明は、一般的にはポリペプチド増殖因子に関するものであり、より特定的には繊維芽細胞増殖因子相同因子(fibroblast growth factor homologous facto r:FHF)及びFHFをコードする核酸に関する。 2.関連技術の説明繊維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリーは、in vivo及びin vitroにおいて広範な増殖促進、生存及び分化活性を有する、構造的に関連したタンパク質の一群を包含する(Baird及びGospodarowicz,N.Y．Acad．Sci.,638:1，1991;Eckenstein，J ．Neurobiology，25:1467，1994;Mason，Cell，78:547，1994に概説されている) 。1996年6月の時点で、このファミリーの9種のメンバーが分子クローニングにより特性決定され、それらの配列が刊行物に発表されている。特性決定されたこのファミリーの最初の2種のメンバーである、酸性FGF(aFGF/FGF-1)及び塩基性FGF( bFGF/FGF-2)は、脳、眼、腎臓、胎盤、副腎組織等を含む多数の組織で見い出されている(Jayeら、Science，233:541，1986;Abrahamら、Science，233:545，198 6)。これらの因子は、繊維芽細砲、内皮細胞、海馬及び大脳皮質ニューロン、アストログリアを含む、中胚葉及び神経外胚葉由来の種々の組織の強力な分裂促進因子及び生存因子であることが判明している(Burgess及びMaciag，Ann．Rev．Bi ochemistry，58:575，1989)。FGFファミリーの別のメンバーとしては、マウス乳癌ウイルスによる活性化の通常のターゲットである遺伝子によりコードされ、従って発癌因子であると推定されるint-2/FGF-3がある(Smithら、EMBO J.,7:1013 ，1988)。FGF-4、FGF-5、及びFGF-6をコードする遺伝子はNIH 3T3細胞に導入された場合、形質転換活性を有し(Delli-Boviら、Cell，50:729，1987;Zhanら、Mo l．Cell．Biol．8:3487，1988;Maricsら、Oncogene，4:335，1989)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)/FGF-7、FGF-8、及びFGF-9はそれぞれケラチノサイト、 O，245:752，1989;Tanakaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:8928，1992;Miya motoら、Mol．Cell．Biol.,13:4251，1993)。最近の実験により、いくつかのFGF が最初にそれらが同定されたときには明らかでなかった生物活性を有していることが示されている。例えば、FGF-2はツメガエル胚において腹側中胚葉を l Cell 51:869-877，1989)、FGF-4はニワトリ体肢芽の増殖及びパターン形成に関与していることが示され(Niswanderら、Nature 371:609-612，1994)、FGF-5はマウスにおいて毛嚢周期を制御していることが示され(Hebert,Cell 78:1017-102 5，1994)、FGF-8は胚ニワトリ中脳の複製を起こすことが示されている(Crossley ら、Nature 380:66-68，1996)。aFGF(FGF-1)及びbFGF(FGF-2)を含むいくつかのF GFは古典的なシグナル配列をもたず、それらの分泌機構は不明である。現在のデータによれば、FGF-1及びFGF-2はER-ゴルジ分泌経路とは異なる経路により細胞から放出されるとされている(Florkiewiczら、J．Cell Physiol．162:388-399， 1995;Jacksonら、J．Biol．Chem．270:33-36，1995)。刊行物に記載されたFGFファミリーの9種のメンバー、FGF1〜9は155〜268アミノ酸長であり、約25%以上のアミノ酸配列同一性を共有し、約140アミノ酸の保存中央領域を有する。この領域は、インターロイキン1-α及び1-βの折り畳まれたコアと構造上ほぼ同一の、三回対称を有するコンパクトなβ-バレルを形成している(Zhuら、Science 251:90-93，1991;Zhangら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88 :3446-3450，1991;Erikssonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3441-3445， 1991;Agoら、J．Biochem．110:360-363，1991)。FGF-1及びFGF-2は古典的シグナル配列を欠くことにおいてもインターロイキン1-βに似ている。 FGFのシグナル伝達は膜貫通チロシンキナーゼ受容体の活性化により起こると一般に考えられている。例えば、FGF-1、FGF-2及びFGF-7/KGFは、そのような受容体に対する高い親和性結合を介してその生物学的活性の一部または全部を発揮することが示されている(例えば、Leeら、Science 245;57，1989参照、Johnson 及びWilliams，Adv．Cancer Res.,60:1，1993に概説されている)。これまで4種のFGF受容体(FGFR)遺伝子が同定されており(Johnsonら、Adv．Cancer Res.,60:1 -41，1993)、マウス及びヒトの両方においてこれらの遺伝子のサブセットについて活性化あるいは不活性化受容体突然変異が報告されている。マウスにおいては、FGFR1またはFGFR2遺伝子の破壊が早期の胎児の死亡に至らせ(Dengら、Genes D ev．8:3045-3057，1994;Yamaguchiら、Genes Dev．8:3032-3044，1994)、FGFR3 の破壊が骨の過成長を起こすことが報告されている(Dengら、Cell 84:911-921， 1996;Colvinら、Nature Genet．12:390-397，1996)。ヒトにおいては、FGFR1、F GFR2及びFGFR3における点突然変異が種々の骨格疾患に見出されている(Muenke及びSchell，Trends Genet．11，308-313，1995により概説されている)。最近の研究から、細胞外リガンド結合ドメイン内の代替的プレｍＲＮＡスプライシングにより受容体の多様性が増加し、この結果、異なるリガンド結合特性を有する多数の受容体イソフォームが同一の遺伝子によってコードされ得るということが示された(Johnson及びWilliams、前出)。組織培養系においては、aFGFまたはbFGFのその細胞表面受容体への結合がホスホリパーゼC-γを活性化し(Burgessら、Mol ．Cell．Biol．10:4770，1990)、このホスホリパーゼC-γは種々の分裂促進シグナルを統合することが知られている経路の成分である。FGFファミリーの多くのメンバーはまた、ヘパリンに強固に結合し、ヘパリン、FGF、及び膜貫通受容体の三元複合体は生物学的に関連するシグナル伝達種である可能性がある。発明の概要本発明は、繊維芽細胞増殖因子相同因子(FHF)ポリペプチド及びそれをコードする核酸を提供する。FHFは、中枢神経系(CNS)の細胞並びに末梢神経組織の細胞の増殖、生存、及び分化の調節に関与する。本発明はまた、FHF遺伝子発現における変化を検出するための方法も提供し、これは神経退行性疾患や新生物形成性疾患の診断に使用することができる。FHF の発現及び／または活性を調節する、神経退行性疾患及び腫瘍性疾患の治療方法も本発明に含まれる。図面の簡単な説明図1は、FHF-1(配列番号1)、FHF-2(配列番号2)、FHF-3(配列番号3)、及びFHF-4 (配列番号4)のアミノ酸配列間のアライメントを示す。FHF1〜4の4種全てにおいて保存されているアミノ酸には陰影を付して四角で囲み、FHF1〜4の一部のみにおいて保存されているアミノ酸には陰影を付した。図2は、FHF-1(配列番号1)、FHF-2(配列番号2)、FHF-3(配列番号3)、FHF-4(配列番号4)、FGF-1(配列番号5)、FGF-2(配列番号6)、及びFGF-9(配列番号7)のアミノ酸配列のアライメントを示す。大きな黒丸はFHF-1〜4の間で同一であるが、9 種のこれまでに特性決定された9種のFGF(FGF-1〜9)においては異なっているアミノ酸を示す。マウスFHF-2のイントロン位置は、整列させた配列の上に矢じりによって示す。FGF-2の結晶構造においてβシート構造を有する12個のセグメントの位置には下線を付した(Ericksonら、Proc．Natl．Acad Sci．USA 88:3441-344 5，1991)。図3は、マウス及びヒトFHFと、これまでに特性決定されたFGFファミリーの9種のメンバー(hFHF-1(配列番号1)、hFHF-2(配列番号2)、hFHF-3(配列番号3)、hFHF -4(配列番号4)、mFHF-1(配列番号8)、mFHF-2(配列番号9)、mFHF-3(配列番号10) 、及びmFHF-4(配列番号11))のそれぞれと、のアミノ酸配列のアライメントを示す。 FGFファミリーのメンバーには、aFGF/FGF-1(配列番号5;Jayeら、前出)、bFGF/ FGF-2(配列番号6;Abrahamら、前出)、int-2/FGF-3(配列番号12;Smithら、前出) 、FGF-4(配列番号13;Delli-Boviら、前出)、FGF-5(配列番号14;Zhanら、前出)、 FGF-6(配列番号15;Maricasら、前出)、ケラチノサイト増殖因子/FGF-7(配列番号 16;Finchら、前出)、FGF-8(配列番号17;Tanakaら、前出)、及びFGF-9(配列番号7 ;Miyamotoら、前出)が含まれる("m"はマウスを表し、"h"はヒトを表す)。図4は、哺乳動物FHF及びFGFファミリーのメンバーの系統樹を示し、FHFまたは FGFファミリーのメンバーの任意の対を結びつける各経路の長さは、その対のアミノ酸配列の分岐度に比例している("m"はマウスを表し、"h"はヒトを表す)。図5は、FHF-1のヌクレオチド配列(配列番号18)及び推定アミノ酸配列(配列番号1)を示す。図6は、FHF-2のヌクレオチド配列(配列番号19)及び推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。図7は、FHF-3のヌクレオチド配列(配列番号20)及び推定アミノ酸配列(配列番号3)を示す。図8は、FHF-4のヌクレオチド配列(配列番号21)及び推定アミノ酸配列(配列番号4)を示す。図9は、マウスのFHF-1、FHF-2、及びFHF-3遺伝子についての部分的な染色体連鎖地図を示す。これらの遺伝子は、種間戻し交配分析によりマップされた。各染色体地図の左側には、組換え体N2動物の数が表示されており、各遺伝子座の対にタイプ分けされたN2動物の総数で除している。センチモルガン(±1標準誤差)の単位での遺伝子距離として表される組換え発生頻度も表示した。遺伝子座間に組換え体が見出されない場合については、組換えの距離の上位95%信頼限界を括弧内に示した。ヒト染色体上の遺伝子座の位置が判明している場合は染色体地図の右側に示した。たいていのヒト遺伝子座の地図上の位置についての参照はGDB(ゲノムデータベース)から得ることができる。このGDBは、The William H．Welch M edical Library of The Johns Hopkins University(Baltimore，Maryland)によりメンテナンスされている、ヒト連鎖情報のコンピュータデータベースである。図10は、成体マウスにおけるFHF転写産物の組織分布を示す。種々のマウスの組織から、10マイクログラムの全ＲＮＡを調製し(Chomczinski及びSacchi，Anal ．Biochem,162:156，1987)、表示したアンチセンスリボプローブ(FHF-1〜4)を使用するRNアーゼプロテクション実験に用いた(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York，New York，1987)。これらのＲＮＡサンプルは、1;脳、2;眼、3;心臓、4;腎臓、5;肝臓、6;肺、7;脾臓、 8;精巣、及び9;酵母ｔＲＮＡである。ＲＮＡポリメラーゼIIプローブを用いた対照反応を図の最下部に示す。図11は、発生中及び成体のマウスから調製された切片におけるFHF転写産物のi n situ位置決定を示す。³³P in situハイブリダイゼーションは赤で示し、黒及び白で示したクレシルバイオレット染色上に重ねて示した。使用したプローブ及びサンプルは、(A)FHF-2，ell、(B)FHF-3，ell、(C，D)FHF-2，e17、(E)FHF-1， P1,眼の高さにおける頭部を通る冠状断面、(F)FHF-2，P1,頭部中央を通る冠状断面、(G)FHF-1,成体、(H，I)FHF-2，成体、(J)FHF-3,成体、(K，L)FHF -4，成体である。図12は、マカクザルCNSの切片におけるFHF-1免疫染色を示す。染色サンプルは、(A)中心前運動皮質、(B)一次体性感覚皮質における領域3b、(C)一次聴覚皮質、(D)上頭頂小葉における領域7b、及び(E)一次視覚皮質である。パネルF〜Hは、 FHF-1に対して免疫反応性を有する皮質性ニューロンの集団が、大形の強免疫反応性細胞(矢印)、小形の弱免疫反応性細胞(矢じり)、及びミクログリアに類似する微小突起を有する小形の弱免疫反応性細胞(二重矢印)を含むことを示す。パルブアルブミン(G)及びFHF-1(H)の同時の免疫染色によって、大形及び小形のニューロンが双方に対して免疫反応性であることが示されている。FHF-1免疫反応性細胞体の不均一な分布は、海馬台複合体(S)、CA野、及び歯状回(DG)を含む海馬体構成体(I)において見られる。背側視床(J)では、FHF-1免疫反応性細胞体が、尾側腹後外側核(VPLc)におけるパッチを占め、外側膝状核(LGN)の巨大細胞及び小細胞層の両層において見られる。内側膝状複合体は、免疫染色された細胞を殆ど含まない。基底終脳(K)では、免疫反応性ニューロンが淡蒼球(Gpe及びGPi)の外部及び内部セグメントの双方に存在する。スケールバーは(A〜E)では500μｍ、(F)では20μｍ、(G，H)では75μｍ、(I〜K)では1mmである。図13は、FHF-1がヒト胎児の腎細胞である293細胞によっては分泌されないことを示す。293細胞には、ヒト成長ホルモン(左の2レーン;hGH)、FHF-1(中央の2レーン)、またはヒト赤錐体視物質(右の2レーン;Red)の発現を指令するプラスミドを一過性にトランスフェクトした。これらの細胞は、無血清培地において³⁵Sメチオニンで6時間標識し、細胞(C)または培地(M)に存在する全タンパク質をSDS-P AGEにより分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。hGHの分泌が観察されたが、FHF-1は観察されなかった。タンパク質標準の移動度は図の左に示し、上から下に向かって分子量は220、97、66、46、30、21.5、及び14.3kDaである。hGH及びFHF-1の移動度は図の右側に示した。図14は、FHF-1核局在化シグナル(NLS)を同定するために使用したFHF-1構築物の概要である。免疫染色によるこれらの構築物の位置決定(構築物1〜4)及びX-ga l染色によるFHF-1-βガラクトシダーゼ融合物の位置決定(構築物5〜12)も示す。各構築物の下部の数字は、その構築物に存在するFHF-1からのアミノ酸を示す(N; 核染色、C;細胞質染色、++;強い染色、+;弱い染色、-;非染色。a:構築物12は、1 5〜20%の細胞において細胞質染色を示し、細胞の80-85%において核局在化を示す )。図15は、図14に示した構築物の二重標識免疫蛍光位置決定を示す。抗体は、(A ，B)0.7μｍで光学的に切片化した、FHF-1(緑)及びBiP(ERマーカー;赤)の二重標識免疫蛍光位置決定、及び(C〜F）FHF-1-βガラクトシダーゼ融合タンパク質の組織化学的位置決定に使用した。全ての実験は一過性にトランスフェクトされた 293細胞において行った。使用した構築物は、(A)完全長FHF-1,構築物1、(B)構築物4、(C)完全長βガラクトシダーゼ、(D)構築物6、(E)構築物11、(F)構築物12である。発明の詳細な説明本発明は、繊維芽細胞増殖因子相同因子(FHF)と指称するポリペプチド増殖因子、及びそれをコードする核酸を提供する。FHF-1〜4と指称される４種のFHFをコードする遺伝子を単離し配列決定した。FHF-1の推定アミノ酸配列はFGF-9の推定アミノ酸配列と27％の同一性を有し、FHF-1〜4のアミノ酸配列は、互いに58〜 70％の同一性を有する。従ってFHFはFGFファミリーの新たな分科を確定する。 FHFは、発生中及び成体の神経系において発現し、従って神経系の発生及び機能の調節において役割を果たしていると考えられている。従って、FHFポリペプチド及びそれをコードする核酸は、神経系に影響を及ぼす症状の治療及び診断方法に使用することができる。前述の症状としては、例えば、卒中、パーキンソン病及びアルツハイマー病のような神経退行性疾患、色素性網膜炎や黄斑変性症のような網膜退行性疾患、小脳退行性疾患、及び癌が挙げられる。FHF関連分子のより具体的な利用は、それらの組織特異性から探り出すことができる。例えば、 FHF-1〜4は全て脳で発現するが、FHF-1〜3は眼において特異的に発現し、FHF-1 及び4は精巣において発現し、FHF-2は心臓で発現する。従って、当分野で周知の標準的な免疫化及びスクリーニング法を用いて、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を製造することができる。これらの抗体は、容易に検出可能に標識することができ、組織学的に用いて所与のFHFを含む組織を同定することができる。FHFはまた、例えば神経細胞や神経組織のような培養細胞または組織を移植の前に維持しておくための方法において使用することもできる。さらに、FHFを用いて、in vitroでニューロンの成長を促進し、例えばそれらによって産生されるインターロイキン2(IL-2)のような増殖因子の産生を促進することができる。F HFポリペプチド及び核酸を使用する方法については以下に詳述する。本発明は実質的に純粋なFHFポリペプチドを提供する。FHFポリペプチドは、例えば、FHF-1〜4のような、少なくとも2種、例えば3または4種のFHFにおいて、保存された少なくとも5つの連続したアミノ酸を含むものとして特性化され得る。この5つの保存アミノ酸の1またはそれ以上(例えば2〜4)は、FHFで保存されていることに加えて、9種のこれまでに特性化されたFGF(FGF-1〜9、上記参照のこと)の何れにおいても保存されていないものとして特性化され得る。本明細書において使用する用語「実質的に純粋な」は、ポリペプチドのような分子(例えばFHFポリペプチド、またはその断片)であって、天然の状態でそれに付随している他のタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、及びその他の生物学的物質を実質的に含んでいないものを表す。例えば実質的に純粋な分子、例えばポリペプチドとは、乾燥重量で少なくとも60％が対象の分子であるものとし得る。当業者であれば標準的なタンパク質精製法を用いてFHFポリペプチドを精製することができ、このポリペプチドの純度は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(例えばSDS-PAGE)、カラムクロマトグラフィー(例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC))、アミノ末端アミノ酸配列分析等の標準的な方法を用いて決定することができる。本発明に包含されるFHFポリペプチドは、FHF-1〜4のアミノ酸配列の1種、例えばFHF-4のアミノ酸配列を有し得る。FHF-1〜4のようなFHFポリペプチドは、脳において発現されること、これまでに知られたシグナル配列を欠いていること、核局在化シグナルまたは核局在化様シグナルを含むこと、及び完全長で約225〜250 個のアミノ酸(FHF-1;244アミノ酸、FHF-2;245アミノ酸、FHF-3;225アミノ酸、FH F-4;247アミノ酸、例えば図1〜3及び図5〜8参照のこと)を含むことにより特徴付けることができる。本発明のFHFポリペプチドは、ヒトまたはマウスのような哺乳動物に由来するものであり得る。同様に本発明に含まれるものとして、FHF-1〜4の1種、例えばFHF-4のようなFH Fポリペプチドの配列と「実質的に同一な」配列を有するポリペプチドが挙げられる。「実質的に同一な」アミノ酸配列とは、保存的アミノ酸置換、例えば1つのアミノ酸による同じクラスの他のアミノ酸の置換(例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような１つの疎水性アミノ酸による別の疎水性アミノ酸の置換、あるいは、例えばアルギニンによるリシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、またはグルタミンによるアスパラギンの置換のような1つの極性アミノ酸による別の極性アミノ酸の置換)によって、あるいは1またはそれ以上の非保存的な置換、欠失、または挿入のみによって基準の配列と異なり、ただしポリペプチドが少なくとも1種のFHF特異的活性またはFHF 特異的エピトープを有しているものである。例えばFHFポリペプチドから1以上のアミノ酸を欠失させて、その生物学的活性に有意な変化を生じさせずにポリペプチドの構造を修飾することができる。例えば、FHFの生物学的活性に不必要なアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸を除去することができる。このような修飾によって、より小さい活性FHFポリペプチドを生成し得る。本発明に包含されるその他のFHFポリペプチドは、FHF-1〜4の何れか、例えばF HF-4のようなFHFポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。アミノ酸配列の相同性を決定する際に比較される長さは、例えば少なくとも15アミノ酸、例えば少なくとも20、25 、または35アミノ酸とし得る。相同性は、標準的な配列解析ソフトウェア(例えばGenetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center ，1710 University Avenue，Madison，WI 53705のSequence Analysis Software Package;Ausubelら、前出も参照のこと)を用いて測定することができる。本発明はまた、少なくとも1種のFHF特異的活性またはエピトープを有する、FH F-1〜4のようなFHFポリペプチドの断片も包含する。例えば、少なくとも8〜10アミノ酸を含むFHFポリペプチド断片を、FHF特異的抗体の産生の際に免疫原として使用することができる。この断片は、例えばFHFにおいて保存されたアミノ酸配列を含み得、このアミノ酸配列は、FHFにおいては保存されているがFGF-1〜9においては保存されていないアミノ酸配列を含み得る。このような断片は、図1〜3 を参照のことしてFHFの配列とFGFの配列とを比較することにより容易に同定することができる。そのペプチド免疫原としての利用に加えて、上記のFHF断片は、例えばELISAのようなイムノアッセイにおいて使用してサンプル中のFHF特異的抗体の存在を検出することができる。本発明のFHFポリペプチドは、いくつかある標準的な方法の任意のものを用いて得ることができる。例えば、FHFポリペプチドは、標準的な組換え発現系(以下参照のこと)において製造するか、あるいは化学的に合成するか(この方法は小さいFHFペプチド断片に限定されることがあり得る)、あるいはそれらが天然に発現している組織から精製することができる(例えば、Ausubelら、前出参照のこと)。本発明はまた、上記のFHFポリペプチド及びその断片をコードする単離された核酸分子も提供する。例えば、FHF-1〜4の何れか、例えばFHF-4をコードする核酸は本発明に含まれる。これらの核酸は、天然のヌクレオチド配列(図1〜3及び図5〜8参照のこと)、あるいは、遺伝暗号の縮重のためにFHF-1〜4をコードする天然の核酸とは異なっているが同じアミノ酸をコードする配列を含み得る。本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド、またはそれらの組合せや修飾物を含み得る。「単離された核酸」は、それが由来する生物の天然のゲノムにおいて存在するときに通常それが直接隣接している5'及び3'フランキング配列と直接隣接していないＤＮＡまたはＲＮＡ分子のような核酸を意昧する。従ってこの用語が表しているのは、例えば、プラスミドベクターやウイルスベクターのようなベクターに組み込まれた核酸、異種細胞のゲノムに(または同種の細胞のゲノムであるが、天然のものとは異なる部位に)組み込まれた核酸、PCR増幅や制限酵素による切断によって製造されたＤＮＡ断片あるいはin vitro転写によって生成されたＲＮＡ分子のような独立した分子として存在する核酸である。またこの用語は、例えば融合タンパク質の製造に使用することができるような追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成する組換え核酸も表す。本発明の核酸分子は、FHF遺伝子産物(例えば、FHF ＲＮＡ及びFHFポリペプチド、以下参照のこと)の製造のための標準的な方法において鋳型として使用することができる。さらに、FHFポリペプチド(及びその断片)をコードする核酸分子及び関連する核酸、例えば(1)FHFポリペプチドまたはその断片(例えば少なくとも12、15、20、または25ヌクレオチドを含む断片)をコードする核酸に対して相補的な、またはハイブリダイズする配列を含む核酸、及び(2)FHFポリペプチドまたはその断片(例えば少なくとも12、15、20、または25ヌクレオチドを含む断片) をコードする核酸に対して相補的な配列とハイブリダイズする配列を含む核酸は、そのハイブリダイゼーション特性に注目した方法において使用することができる。例えば、以下にさらに詳細に説明するように、そのような核酸分子は、FHF核酸を合成するためのPCR法、サンプル中のFHF核酸の存在を検出するための方法、新たなFHFファミリーのメンバーをコードする核酸を同定するためのスクリーニング方法、及び治療方法において使用することができる。本発明はまた、FHF-1〜4に加えて、FHFポリペプチドファミリーのメンバーをコードする核酸分子を同定するための方法も包含する。これらの方法では、サンプル、例えばFHFポリペプチドをコードする核酸を含むｃＤＮＡライブラリーのような核酸ライブラリーを、FHF特異的プローブ、例えばFHF特異的核酸プローブでスクリーニングする。FHF特異的核酸プローブは、FHFポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの相補的配列と特異的にハイブリダイズする核酸分子(例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド、またはそれらの組合せや修飾物を含む分子)である。FHFがFGF(即ちFGFファミリーの最初の９種のメンバー(FGF-1〜9) 、上記参照のこと)と密接に関連していることから、用語「FHF特異的プローブ」は、本発明の方法における意味として、FHFポリペプチドをコードする核酸またはその相補的配列と、FGFをコードする核酸またはその相補的配列と比較して検出可能な程度により高い程度で結合するプローブを意味する。従って、用語「FH F特異的プローブ」は、FHFポリペプチド(またはその相補的配列)をコードする核酸に結合し得るが、FGF(またはその相補的配列)をコードする核酸には測定できる程度には結合し得ないプローブを含む。本発明は、FHF特異的核酸プローブの製造を容易にする。このようなプローブを得るための方法は、図1〜3に示すアミノ酸配列アラインメントに基づいて設計することができる。図1においては、例えば、FHFにおいて保存されたアミノ酸配列(「FHF保存的アミノ酸」)を四角で囲んだ。図2においては、FHFにおいて保存されているがFGF(即ちFGF-1〜9)においては保存されていないアミノ酸(「FHF特異的アミノ酸」)を大きな黒のドットによって示した。少なくとも12、例えば少なくとも15、25、35、50、100、または150のヌクレオチドを含み得るプローブは、いくつかある標準的な方法の何れかを用いて製造することができる(例えば、A usubelら、前出を参照のこと)。例えば、好ましくは、このプローブは以下の実施例1に記載したようなPCR増幅法を用いて生成する。これらの方法においては、 FHF特異的アミノ酸を含み得るFHF保存的配列(図1)に対応するプライマーを設計し、得られるPCR産物をｃＤＮＡライブラリーのような核酸ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用する。FHF-4をコードするヌクレオチド配列は全体として、FHF-1〜3の配列の分析に基づくこのプロセスの後に同定された。当分野において知られるように、PCRプライマーは、通常少なくとも15ヌクレオチド、例えば15〜30ヌクレオチドを含むように設計される。7個のアミノ酸を含むFHFペプチドをコードする21ヌクレオチドを含むFHF特異的プライマーの設計について以下に説明する。好ましくは、このようなプローブ中のヌクレオチドの殆どあるいは全てが、FHF特異的アミノ酸を含むFHF保存的アミノ酸をコードするものとする。例えば、少なくとも40％のFHF保存的アミノ酸を含むペプチドをコードする配列を含むプライマーを使用することができる。21個のヌクレオチドを含むこのようなプライマーは、少なくとも3/7、4/7、5/7、6/7、または7/7のFHF 保存的アミノ酸をコードする配列を含み得る。図1〜3の分析によって決定できるように、7個のアミノ酸をコードする21個のヌクレオチドのプライマーの場合、最大5個のアミノ酸がFHF特異的であり得る。従ってこのプライマーは、少なくとも1個のFHF特異的アミノ酸、例えば最大5個のFHF特異的アミノ酸をコードする配列を含み得る。プライマー配列を設計する鋳型としてFHF特異的アミノ酸配列がひとたび選択されると、例えば標準的な化学的方法を用いてプライマーを合成することができる。上記のように、遺伝暗号の縮重のため、このようなプライマーは適切な縮重配列を含むように設計されるべきであるが、これは当業者が容易に決定することができる(上記及び以下の実施例1参照のこと)。上記の指針に基づいて、FHF特異的プライマーの設計のための鋳型として使用することができるFHF保存的アミノ酸ペプチドの例を以下に示す。別の例は、例えば図1〜3のアラインメントのようなFHFポリペプチドの配列アラインメントの分析により見出すことができる。プライマーは、例えば、必要なプライマーの長さに応じて、これらのペプチドの5〜10アミノ酸の領域に基づいて設計することができる。例えば、プライマーは以下に示すセグメントのいずれかの7個の連続したアミノ酸に対応するように設計することができる。 1．ＡＡＡＩ/ＬＡＳＳ/ＧＳＬＩＲＱＫＲ（配列番号22）（ヒトFHF-1のアミノ酸2〜14に対応する） 2．ＰＱＬＫＧＩＶＴＲ/Ｋ（配列番号23）（ヒトFHF-1のアミノ酸68〜76に対応する） 3．ＴＬ/ＨＦＮＬＩＰＶＧＬＲＶＶ（配列番号24）（ヒトFHF-1のアミノ酸104〜116に対応する） 4．ＡＭＮＧ/Ｓ/ＡＥＧＹ/ＬＬＹ（配列番号25）（ヒトFHF-1のアミノ酸128〜136に対応する） 5．ＫＥＳ/ＣＶＦＥＮＹＹＶ（配列番号26）（ヒトFHF-1のアミノ酸148〜157に対応、この配列の"ＶＦＥＮＹＹＶ"(配列番号27)部分に基づくプライマーの例については以下の実施例1を参照のこと） 6．ＳＧＲＡ/ＧＷＦ/ＹＬＧＬ（配列番号28）（ヒトFHF-1のアミノ酸169〜177に対応する） 7．ＭＫＧＮＲ/ＨＶＫＫＴ/ＮＫ（配列番号29）（ヒトFHF-1のアミノ酸184〜193に対応、この配列の"ＭＫＧＮＨ/ＲＶＫ"(配列番号30)部分に基づくプライマーの例については以下の実施例1を参照のこと） 8．ＶＣ/ＡＭＹＲＩＱ/ＫＥＰＳＬＨ（配列番号31）（ヒトFHF-1のアミノ酸205〜214に対応）上記のように、FHF特異的プライマー、例えば上記のFHF特異的ペプチドまたはその一部分に基づくプライマーは、FHFファミリーのメンバーをコードする核酸を同定するための標準的なスクリーニング方法(例えば、Ausubelら、前出参照のこと)において使用することができる、FHF特異的プローブの生成のためのPCR反応に使用することができる。 FHF特異的核酸プローブに加えて、FHF特異的抗体のようなFHF特異的ポリペプチドプローブを、新規なFHFポリペプチドまたはその一部分をコードする核酸について、例えば発現ライブラリーのようなサンプルをスクリーニングするために使用することができる。例えば、FHF特異的ペプチドに特異的に結合する抗体をこの方法で使用することができる。このようなスクリーニングを行うための方法は当分野で周知である(例えば、Ausubelら、前出参照のこと)。一対の核酸分子(または一本の核酸分子内の二つの領域)の配列が互いに「相補的」とされるのは、その対の一方のメンバーの各ヌクレオチドと、その対の他方のメンバーの各ヌクレオチドとの間で塩基対形成相互作用が生じ得る場合である。一対の核酸分子(または一本の核酸分子内の二つの領域)が、互いに「ハイブリダイズする」とされるのは、それらが両者の間の塩基対形成相互作用によって二重らせんを形成する場合である。当分野で知られるように、核酸対間のハイブリダイゼーションにはハイブリダイズする領域間の完全な相補性は要求されないが、使用されるハイブリダイゼーション条件の下で二重らせんを維持するために十分なレベルの塩基対形成が存在することが必要である。ハイブリダイゼーション反応は、特異的相互作用とある程度の非特異的相互作用が発生し得る、低度から中程度のストリンジェンシー条件下で通常行われる。ハイブリダイゼーションの後、中程度または高度のストリンジェンシー条件下で洗浄を行って非特異的結合を除去することができる。当分野で知られるように、最適な洗浄条件は、実験的に、例えばストリンジェンシーを徐々に高めることによって決定することができる。ストリンジェンシーに影響を及ぼす変更可能な条件パラメータとしては、例えば、温度及び塩濃度がある。一般に、塩濃度が低くなり温度が高くなるほどストリンジェンシーは高くなる。例えば、ハイブリダイゼーション溶液として同一またはより低い塩濃度を含む溶液を用いて、低温(例えば室温)で洗浄を開始することができる。その後の洗浄を、同じ塩溶液を含む、次第に温度を高くした溶液を用いて行うことができる。あるいは、洗浄段階において、塩濃度を低下させて温度を維持するか、塩濃度を低下させるとともに温度を高めることができる。ストリンジェンシーに影響を与える変更可能な別のパラメータとしては、例えば、ホルムアミドのような不安定化剤の利用等が挙げられる。核酸ハイブリダイゼーション反応では、特定のストリンジェンシーのレベルを得るために用いる条件はハイブリダイズさせる核酸の種類により変化する。例えば、核酸のハイブリダイズ領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成 (例えばGC対AT含量)及び核酸の型(例えばＲＮＡまたはＤＮＡ)を、ハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮し得る。別の考慮事項として、核酸の一つが、例えばフィルター上に固定化されているかどうかということが挙げられる。漸進的にストリンジェンシー条件を高める例は、以下のように、室温付近における2×SSC/0.1％ SDS(ハイブリダイゼーション条件)、室温付近における0.2×S SC/0.1％ SDS(低ストリンジェンシー条件)、約42℃における0.2×SSC/0.1％ SDS (中程度のストリンジェンシー条件)、そして約68℃における0.1×SSC(高ストリンジェンシー条件)とするものである。洗浄は、これらの条件の一つのみ、例えば高ストリンジェンシー条件のみを用いて行うか、これらの条件のそれぞれを用いて、例えば上記の順序に従って各条件でそれぞれ10〜15分間、上記した段階の任意のものあるいは全てを反復することによって行うことができる。しかし上記のように、最適な条件は使用する特定のハイブリダイゼーション反応に応じて変化し、実験的に決定することができる。本発明の核酸分子は、いくつかある標準的な方法の任意のものによって得ることができる。例えば、標準的な組換え法、酵素的方法(例えばPCRまたは逆転写(R T)/PCR法)、及び化学的方法(例えばホスホルアミダイトに基づく合成)を用いてこれら分子を生成することができる。さらにこれらの分子は、標準的なハイブリダイゼーション法を用いて核酸ライブラリーや組織サンプルのようなサンプルから単離することができる。例えば上記のように、標準的な方法を用いて、ゲノムまたはcＤＮＡライブラリーをFHF核酸配列に対応する核酸プローブとハイブリダイズさせてライブラリー中の相同なヌクレオチド配列の存在を検出することができる(例えば、Ausubelら、前出参照のこと)。これらの方法は上記により詳細に説明した。また上記のように、FHF特異的エピトープのような少なくとも１つのF HFエピトープを含むポリペプチドをコードする核酸は、FHF特異的抗体をプローブとして用いて、λgt11に含まれるライブラリーのようなｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することもできる。このような抗体はポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体とすることができ、標準的な方法により製造される(例えば、Harlow及びLane，Antibodies:A Laboratory Man ual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbo r，New York，1988参照のこと)。 FHF核酸分子は、プラスミドベクターやウイルスベクターのようなベクターに挿入することができ、これにより(1)挿入された核酸分子の発現、及び／または( 2)挿入断片の増幅が容易になる。当分野で周知のように、このようなベクターは、例えば、細胞内における挿入された核酸の転写を促進するプロモーター配列、複製開始点、それが発現される細胞にG418耐性を与えて形質転換された細胞の表現型選択を可能にする選択マーカーをコードするネオマイシン耐性遺伝子のような遺伝子を含み得る。本発明において使用するのに適したベクターとしては、例えば細菌で使用するためのT7ベース発現ベクター(例えば、Rosenbergら、Gene，56:125，1987参照のこと)、哺乳動物細胞で使用するためのpMSXND発現ベクター(Lee及びNathans，J Biol．Chem.，263:3521，1988)、及び昆虫細胞で使用するためのバキュロウイルス由来ベクターが挙げられる。このようなベクター中の核酸は、例えば発現が求められる細胞の型に基づいて選択されるプロモーターに作動可能に結合される。例えば、T7プロモーターは細菌において使用することができ、ポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において使用することができ、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターは哺乳類細胞において使用することができる。また、より高等な真核生物の場合には、組織特異的プロモーターが利用できる(本発明において使用し得る別の適当なベクター及びプロモーターについては、Ausu belら、前出参照のこと、またPouwelsら、Cloning Vectors:A Laboratory Manua l，1985，Supp.1987も参照のこと)。本発明において使用し得るウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス40(SV40)、及びウシ乳頭腫ウイルスのベクターが挙げられ(例えば、Gluzman編，Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Ha rbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1982参照のこと)、これらについては以下にさらに記載する。例えば上記のベクターを用いてFHFポリペプチドを産生するためにFHF核酸を導入し得る細胞には、原核生物細胞(例えば大腸菌細胞のような細菌細胞)、及び真核生物細胞(例えばSaccharomyces cerevisiae細胞のような酵母細胞、Spod optera frugiperda細胞(例えばSf-9細胞)のような昆虫細胞、及びCHO、Cos-1、N IH-3T3、及びJEG3細胞のような哺乳動物細胞)が含まれる。このような細胞は、当業者に知られる数多くの異なるソース、例えばthe American Type Culture Co llection(ATCC)，Rockville，Marylandから入手可能である(Ausubelら、前出も参照のこと)。本発明の核酸が導入された細胞及びその子孫は、突然変異のために親細胞と同一でないものも含め、本発明に包含される。本発明の核酸(例えば上記のベクター中に挿入された核酸)を、一時的あるいは安定に細胞に導入するための方法は当分野で周知である(例えばAusubelら、前出を参照のこと)。例えば、大腸菌細胞のような原核生物細胞の場合、指数増殖する細菌から標準的なCaCl₂(あるいはMgCl₂やRbCl)法により調製されたコンピテント細胞を標準的な方法で形質転換することができる。細菌細胞の形質転換はプロトブラスト融合法を使用して行うこともできる。真核生物細胞の場合は、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクションやエレクトロボレーション等の慣用の物理的方法を使用してトランスフェクションを行うことができる。また、標準的な方法を使用して核酸(例えばプラスミド中に含まれるもの)をリポソーム内に封入することができる。ウイルスベクターの場合は、当分野で周知の適当な感染法を使用することができる(Ausubelら、前出を参照のこと)。本発明のFHFポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトすることに加えて、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞は、選択可能なマーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子あるいは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子をコードする第二の核酸により同時にトランスフェクトすることもできる。上記したようにそのような選択可能マーカーは形質転換細胞の選択を容易にする。上記系において生成されるポリペプチドの単離及び精製は、特定の系に適当な慣用の方法を使用して行うことができる。例えば分取クロマトグラフィー、モノクローナルまたはポリクローナル抗体等の抗体を使用する免疫学的分離等を使用することができる。 FHFポリペプチド(例えばFHF-1〜4のいずれかあるいは全部)に特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体等の抗体も本発明に包含される。これらの抗体は、標準的な抗体生産方法(Kohlerら、Nature,256:495，1975; Ausbelら、前出、Harlow及びLane、前出参照のこと)において、FHFポリペプチドあるいはFHFエピトープを保持するFHFポリペプチド断片を免疫原として使用することにより製造できる。本明細書で使用する用語「抗体」は、インタクトなイムノグロブリン分子のみならず、FHFポリペプチドのエピトープと結合することができるイムノグロブリン分子の断片、例えばFab、Fab'、(Fab')₂、Fv及びSCA断片等も含む。これらの抗体断片はそれらが誘導された抗体の抗原(例えばFHF抗原)に選択的に結合する能力をいくらか保持しており、当分野で周知の方法を使用して製造でき(Harlow 及びLane、前出参照のこと)、さらに次のように定義される。 (1)Fab断片は抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントからなり、完全な抗体分子を酵素パパインで消化して製造し、無傷の軽鎖と重鎖の一部からなる断片として得られる。 (2)抗体分子のFab'断片は、完全な抗体分子をペプシンで処理した後に還元して得られ、無傷の軽鎖と重鎖の一部からなる分子を生成する。この方法においては処理する抗体1分子につき2個のFab'断片が得られる。 (3)抗体の(Fab')₂断片は、完全な抗体分子を酵素ペプシンで処理し、その後の還元を行わないことにより得られる。(Fab')₂断片は2つのFab'断片が2つのジスルフィド結合により一体に保持された二量体である。 (4)Fv断片は、2本の鎖として発現した軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む遺伝子工学的に製造された断片として定義される。 (5)単鎖抗体(「SCA」)は、適当なフレキシブルポリペプチドリンカーにより結合された軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む、遺伝子工学的に製造された単鎖分子である。本発明で使用する用語「エピトープ」は、抗体、例えばFHF-4特異的抗体のパラトープが結合する抗原、例えばFHFポリペプチド上の抗原決定基を意味する。抗原決定基は通常、アミノ酸や糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピング(grouping)からなり、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有し得る。上記したように、FHF-特異的抗体の製造に使用することができる抗原としてはFHF-1〜4のいずれか等のFHFポリペプチド、あるいはFHFポリペプチド断片が挙げられる。動物を免疫化するのに用いられるポリペプチドまたはペプチドは、標準的な組換え法、化学的合成法、あるいは精製法により得られる。当分野で周知のように、免疫原性を増加させるために、抗原をキャリアタンパク質に結合させることができる。通常使用されるキャリアとしては、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、破傷風毒素等が挙げられる。その後結合したペプチドを用いて動物(例えばマウス、ラット、ウサギ等)を免疫する。そのようなキャリアに加え、周知のアジュバントを抗原とともに投与して強い免疫応答の誘導を促進することができる。 FHF特異的ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、FHFポリペプチド、例えば抗体を生成させたFHFポリペプチド(あるいはその断片)を含むマトリックスに結合させて、そのマトリックスから溶出させることにより精製することができる。抗体精製及び濃縮のその他の方法は当分野で周知であり、本発明のFHF特異的抗体について実施できる(例えばColiganら、Unit 9，Current Protocol in Immu nology，Wiley Interscience，1994を参照のこと)。 FHF特異的抗原に対応する抗イディオタイブ抗体も本発明に包含され、標準的な方法を使用して製造することができる。これらの抗体はFHF特異的抗体に対して製造され、従ってFHF特異的エピトープを模倣するものとなる。分子の対(例えば抗体-抗原対あるいは核酸対)のメンバーは、それらが互いに他の非特異的分子よりも高いアフィニティで結合する場合、「特異的に結合する」という。例えば、抗原に対して生成された抗体であって、その抗原に対して非特異的タンパク質よりも効率的に結合する抗体は前記抗原に特異的に結合するということができる(同様に核酸プローブは、塩基対形成相互作用により核酸ターゲットと特異的二重らせんを形成する場合、前記ターゲットに特異的に結合するということができる(上記参照のこと))。上記したように、これまでに同定されたFGFポリペプチド(すなわちFGF-1〜9) に対するアミノ酸配列相同性並びにその組織局在性により、FHFは神経系の発生と機能の制御に役割を果しているものと考えられる。FHFのレベルの変化、例えばレベルの上昇は、細胞増殖性疾患、例えば神経系の細胞増殖性疾患と関連している可能性がある。本明細書で使用する用語「細胞増殖性疾患」は、悪性及び非悪性の細胞増殖を含む異常に過剰な細胞の増殖を特徴とする症状を示すものである。逆に、不十分な細胞増殖により特徴付けられる症状はFHFの発現の減少を特徴とし得る。従って、患者のサンプル中のFHFのレベルを検出することによりこれらの症状を診断し、モニターすることができる。 FHF特異的抗体及び核酸は、サンプル、例えば生物学的流体(例えば脳脊髄液(C SF)、例えば腰部あるいは脳室CSF)、あるいは組織サンプル(例えばCNS組織、例えば神経組織あるいは眼組織)中のFHFポリペプチド(抗体を使用)または核酸(核酸プローブを使用)の存在を検出する方法におけるプローブとして使用することができる。これらの方法においては、FHF特異的抗体または核酸プローブを、FHF 関連疾患を有することが疑われる患者からのサンプルと接触させ、前記抗体または核酸プローブのサンプルへの特異的結合を検出する。疑われるサンプル中に存在するFHFポリペプチドあるいは核酸のレベルを、対照サンプル、例えば非感染の個体からの同等のサンプルにおけるレベルと比較して、前記患者がFHF関連細胞増殖性疾患を有しているかどうかを判定することができる。FHFポリペプチドあるいはその断片は、例えばサンプル中のFHF特異的抗体の存在を検出するための診断方法におけるプローブとしても使用できる。 FHF特異的核酸プローブは、サンプル中のFHF核酸に対する結合の検出を容易にする化合物により標識することができる。例えば、プローブはビオチン化ヌクレオチドを含むことができ、これに対しては検出可能に標識されたアビジン複合体 (例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ結合アビジン)が結合することができる。放射性標識核酸プローブも使用できる。これらのプローブは、核酸ハイブリダイゼーションアッセイに使用してサンプル中の変化したFHFのレベルを検出することができる。例えば、in situハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼ保護、及びノーザンブロット法を使用することができる。本発明に使用できるその他の標準的な核酸検出方法は当業者に知られている(Ausubelら、前出参照のこと)。さらに、診断分子が核酸である場合は、FHF特異的プローブとの結合の前に増幅することができる。PCRを使用することが好ましいが、他の核酸増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応(LCR)、連結活性化転写(ligated activate d transcription:LAT)及び核酸配列に基づく増幅(NASBA)法を使用してもよい。診断法におけるFHF特異的抗体の使用を以下にさらに記載する。本発明の抗体は、in vitroまたはin vivo免疫診断に使用することができる。前記抗体は、例えば、抗体が液相中にあるか、または固相担体(例えばガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然あるいは修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、あるいはマグネタイト担体等)に結合させるイムノアッセイにおいて使用するのに適している。これらのイムノアッセイで使用される抗体は、当分野で周知のいくつかある標準的方法のいずれかにより検出可能に標識することができる(例えば酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド状金属、化学発光化合物、燐光化合物、生物発光化合物等)。本発明の抗体を利用できるイムノアッセイの例としては、直接または間接フォーマットを使用して行われる競合及び非競合イムノアッセイが挙げられる。そのようなイムノアッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ(RIA)及びサンドイッチアッセイ(例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA))が挙げられる。本発明の抗体を使用した抗原の検出は、生理的サンプルについての免疫組織学的アッセイを含む、フォワード、リバースあるいは同時モードで行われるイムノアッセイを使用して行うことができる。その他のイムノアッセイフォーマットが当分野で周知であり、本発明に使用することができる(例えばColiganら、前出参照のこと)。上記したin vitro法に加えて、FHF特異的モノクローナル抗体は、抗原、例えばFHF抗原(例えばFHF-1〜4のいずれか)のin vivo検出のための方法に使用することができる。これらの方法においては、検出可能に標識された抗体を、当業者により診断に有効な量として決定された投与量で患者に投与する。本明細書において使用する用語「診断に有効な」は、モノクローナル抗体が特異的な抗原を有する部位の検出を可能とするのに十分な量で投与される、検出可能に標識されたモノクローナル抗体の量を示す。当業者には明らかなように、投与される検出可能に標識されたモノクローナル抗体の濃度は、ポリペプチドを含む細胞に対する抗体の結合が、バックグラウンドと比較して検出可能であるのに十分なものでなければならない。さらに、検出可能に標識されたモノクローナル抗体は循環系から速やかに消失し、最適なターゲット対バックグラウンドシグナル比を与えるようにすることが望ましい。 in vivo診断のための検出可能に標識されたモノクローナル抗体の投与量は、個体の年齢及び体重、疾患の程度等の要因により変化する。投与量は、多剤投与が意図されているかどうか、抗原負荷、あるいは当業者に知られるその他の要因によっても変化し得る。初期診断に加え、上記のFHFポリペプチド、核酸、及びFHF特異的抗体はFHF発現に関連する症状の進行をモニターするためのin vitro及びin vivo法に使用することができる。例えば治療の開始後に、FHF関連疾患の緩解過程をモニターする方法に使用することができる。これらの方法においては、患者からのサンプル中のものとして、あるいは上記のin vivo法を用いて、FHF特異的マーカー(例えばFHFポリペプチド、FHF核酸、あるいはFHF特異的抗体)のレベルの変化を検出する。本発明はさらに、FHFポリペプチドの発現の変化に関連する症状、例えば細胞増殖性疾患(例えば中枢あるいは末梢神経系の細胞増殖性疾患、例えば神経組織、精巣、心臓組織、眼細胞等に影響する症状)の治療方法を提供する。FHF関連細胞増殖性疾患の治療は、例えば、細胞中のFHF遺伝子発現あるいはFHF活性を調整することにより行うことができる。用語「調整する」は、例えばFHFが過剰発現している場合はその発現を抑制し、FHFが過少発現している場合はその発現を増加させることを含む。細胞増殖性疾患がFHFの過剰発現に関連している場合は、転写あるいは翻訳レベルでFHF発現を阻害する核酸を使用して該疾患を治療することができる。この方法は、例えば、アンチセンス核酸(すなわち、ターゲット核酸、例えばFHFポリペプチドをコードする核酸に相補的であるかあるいはハイブリダイズすることができる核酸)、リボザイム、あるいはトリプレックス剤を使用する。アンチセンス及びトリプレックス法は核酸をマスキングすることにより機能し、リボザイム法は核酸を切断することにより機能するものである。さらに、FHFポリペプチドに結合する抗体をFHFの活性をブロックする方法に使用することができる。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためにアンチセンス法を使用することは当分野で周知である(例えばMarcus-Sakura，Anal．Biochem.，172:289，1988参照のこと)。アンチセンス核酸は、特定の核酸分子、例えばＲＮＡ分子(例えばｍＲＮＡ分子)の少なくとも一部分に相補的な、あるいはハイブリダイズする核酸分子( 例えばＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、あるいは修飾物(例えば分子の安定性を高める修飾、例えば2'-Ｏ-アルキル(例えばメチル)置換ヌクレオチド )あるいはその組合せ)である(例えばWeintraub，Scientific American，262:40 ，1990参照のこと)。アンチセンス核酸は対応する核酸、例えばｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、細胞は二本鎖ｍＲＮＡを翻訳できないことから、これが前記ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。本発明に使用されるアンチセンス核酸は、典型的には少なくとも10〜12ヌクレオチドの長さであり、例えば少なくとも15、20、25、50、75、あるいは100ヌクレオチドの長さである。アンチセンス核酸は、それと阻害的二重らせんを形成することが意図されるターゲット核酸と同等な長さを有していてもよい。以下にさらに記載するように、アンチセンス核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドとして細胞中に導入してもよく、あるいは例えば遺伝子治療法を使用してアンチセンス核酸をコードする核酸を導入した細胞中で製造してもよい。遺伝子治療を目的とするFHFアンチセンス核酸の増殖性疾患に罹患した細胞への導入は、組換え発現ベクター、例えばキメラウイルスあるいはコロイド状分散系、例えば標的指向リポソームを使用して行うことができる。当業者であれば、多大な実験を行うことなくセンス及びアンチセンスFHF核酸の導入のための適当な経路及び手段を知っており、容易に確認することができるであろう。遺伝子治療法は、FHFポリペプチド(例えばFHF-1〜4のいずれか)をコードする遺伝子を細胞に運ぶためにも使用することができる。これらの方法は不十分なFH F発現に関連する症状を治療するために行うことができる。すなわちこれらの方法は、例えば、卒中、神経退行性疾患、例えばパーキンソン病及びアルツハイマー病、網膜退行性疾患、例えば色素性網膜炎及び黄斑変性症、及び末梢神経障害等の症状における組織修復あるいは置換を促進するのに使用できる。精巣におけるFHF-4の高い発現レベルのため、この組織の疾患の治療に関連してFHF-4特異的ポリペプチド、核酸及び抗体の種々の用途がある。そのような用途としては、精巣におけるFHF-4発現に関連する細胞増殖性疾患の治療が挙げられる。また、種々の精巣の発生の間のあるいは後天的な疾患をFHF-4関連分子を使用することによって治療することができる。そのような症状としては、例えば、ウイルス感染(例えばウイルス性精巣炎)、自己免疫症、精子製造あるいは機能不全、外傷、精巣癌等が挙げられる。精巣におけるFHF-4の高いレベルの存在は、FHF-4あるいはFHF-4類似体を男性不妊症を治療するのに使用することができることを示唆している。ｍＲＮＡ翻訳をブロックすることに加えて、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを、転写を停止させる方法、例えばトリプレックス法に使用することができる。この方法においては、オリゴヌクレオチドが二重らせんＤＮＡの周囲に配列特異的な形態で巻きついて三本鎖らせんを形成し、ターゲット遺伝子からの転写がブロックされる。このようなトリプレックス化合物は、選択された遺伝子のユニークな部位を認識するように設計することができる(M aherら、Antisense Res．and Dev.，1(3):227，1991;Helene，Anticancer Drug Design，6(6):569,1991)。特異的に標的指向化されたリボザイムを、FHF発現を減少させることを目的とした治療法に使用することもできる。以下の実施例は例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。実施例中に記載した手順は本発明の特定の形態を実施するのに使用できるものの典型的なものであり、当業者に知られたその他の手順も使用できる。以下の材料及び方法を実施例に記載した実験を行うのに使用した。材料および方法ランダムｃＤＮＡ配列決定。網膜ｃＤＮＡライブラリーの構築、テンプレートの調製、および配列決定の詳細はWangら、J．Biol．Chem.271，4468-4476，1996 によって記述されている。縮重ＰＣＲ。隣接するEcoRI制限部位を有する完全に縮重したセンス鎖プライマーをアミノ酸配列VFENYYV（配列番号27）に対応するように合成し、かつ隣接するBamHI部位を有する、3種類の部分的に縮重したアンチセンスプライマーをアミノ酸配列MKGN（Ｈ／Ｒ）VK（配列番号30）の全ての可能なコドンを含むように合成した。これらのプライマーを、以下の条件：1×（94℃、7分）、35×（45℃ 、2分；72℃、0．5分；94℃、0．5分；95℃、0．25分）の下でT.アクアチクス（ T.aquaticus）ポリメラーゼを用いるヒト、マウス、およびウシゲノムＤＮＡテンプレートの増幅に用いた。ＰＣＲ産物をEcoRIおよびBamHIで切断し、分取用アガロースゲル電気泳動で分画し、pBluescriptにサブクローン化して、個別に配列決定した。ｃＤＮＡおよびゲノムクローン。成人網膜（Nathansら，Science 232，193-20 2，1986）およびP0−P7マウスの眼に由来する、オリゴ−dTでプライムしたｃＤＮＡライブラリーをＤＮＡハイブリダイゼーションにより標準条件（例えば、Sa mbrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Ha rbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989を参照）の下でスクリーニングした。ヒトＦＨＦ−１、ＦＨＦ−２、およびＦＨＦ−３、並びにマウスＦＨＦ−１、ＦＨＦ−３、およびＦＨＦ−４の完全なコーディング領域配列を2つの独立したｃＤＮＡクローンから得た。ヒトＦＨＦ−４については、最初の72コドンは1つのクローンから配列決定し、残りのコーディング領域は2つの独立したクローンから配列決定した。マウスＦＨＦ−２については、クローン化ゲノムＤＮＡおよびP0−P7マウス眼ｃＤＮＡライブラリーに由来する完全長コーディング領域の増幅により得られたＰＣＲ産物からコーディング配列を決定した。バクテリオファージラムダ中のマウスゲノムＤＮＡライブラリーの部分的MboI 消化物をスクリーニングして、マウスＦＨＦ−２ゲノムクローンを得た。染色体位置決定。ヒト染色体マッピングを、各々異なるヒト染色体を担持する 24のヒト−マウスまたはヒト−ハムスターハイブリッド細胞系（Oncor、Gaither sburg、MD）のパネルから得られるＤＮＡをサザンブロット分析することによって行った。文献に記載されている通りに（CopelandおよびJenkins，Trends Gene t．7，113-118，1991）、（C57BL／6JｘM．spretus）F1メスとC57BL／6Jオスとを交配させることにより、種間戻し交配子孫を誕生させた。合計で205匹のN2マウスをＦＨＦ遺伝子座のマッピングに用いた。ＤＮＡ単離、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、サザンブロットトランスファー、およびハイブリダイゼーションは、本質的に文献に記載されている通りに（Jenkinsら，J．Virol．43，2 6-36，1982）、ゼータバインド（Zetabind）ナイロンメンブラン（AMF-Cuno）を用いて行った。洗浄を行い、最終的なストリンジェンシーを0．8−1．0×SSCP、 0．1％SDS、65℃とした。ＦＨＦ−１プローブ、マウスゲノムＤＮＡの1キロ塩基断片では、BamHIでの消化の後、C57BL／6J（Ｂ）ＤＮＡ中に2．1キロ塩基の断片が、およびM．spretus（Ｓ）ＤＮＡ中に10．0キロ塩基の断片が検出された。ＦＨＦ−２プローブ、マウスｃＤＮＡの0．75キロ塩基断片では、19．0、11．5、8 ．2、および2．2キロ塩基（Ｂ）並びに13．5、8．2、および2．2キロ塩基（Ｓ）のBglI断片が検出された。ＦＨＦ−４プローブ、マウスｃＤＮＡの0．3キロ塩基断片では、約24．0キロ塩基（Ｂ）および7．7キロ塩基（Ｓ）のEcoRV断片が検出された。大部分のプローブおよび種間戻し交配においてＦＨＦ遺伝子に連結する遺伝子座のＲＦＬＰは以前に報告されている。これらには、第14染色体上のIrg1および Rap2a（Leeら，Immunogenet.41，263-270，1995）；第16染色体上のSmst（Sirac usaら，Genetics 127，169-179，1991）；並びにＸ染色体上のHprt、Cd401、およびAr（Allenら，Science 259，990-993；Fletcherら，Genomics 24，127-132 ，1994）が含まれる。アポリポタンパク質Ｄ（Apod）用のプローブ、Alan Peter sonによって提供されたラットｃＤＮＡの290塩基対HindIII／BamHI断片では、3 ．1および2．8キロ塩基（Ｂ）並びに3．1および2．6キロ塩基（Ｓ）のXbaI断片が検出された。2．6キロ塩基のM．spretus特異的XbaI ＲＦＬＰの遺伝を続けた。組換え距離を、文献に記載されているように（Green，in Genet ics and Probability in Animal Breeding Experiments(Oxford Press，New Yor k)，pp.77-113，1981）、コンピュータプログラムSPRETUS MADNESSを用いて算出した。対立遺伝子分布パターンの説明に必要な組換えの数を最小にすることにより遺伝子の順序を決定した。ＲＮアーゼプロテクション。グアニジニウムチオシアネート中でホモジネートし、フェノールで抽出した後、5．7Ｍ塩化セシウムを用いて遠心することにより、成体マウスの脳、眼、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、および精巣から全ＲＮＡを調製した（Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2ndEd.，C old Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989）。各組織からの10マイクログラムの全ＲＮＡ、または10マイクログラムの酵母ｔＲＮＡをＲＮアーゼプロテクションアッセイに用いた。pBluescriptにクローン化した直線化テンプレートに対してＴ７またはＴ３ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いて、リボプローブを合成した。アンチセンス鎖に由来する150−250ヌクレオチドを含むマウスＦＨＦプローブの各々を25−50ヌクレオチドのベクター配列に連結した。試薬はアンビオン（Ambion）（オースティン、テキサス州）から入手し、用いたハイブリダイゼーションおよび消化条件はアンビオンが推奨する通りとした。 In Situハイブリダイゼーション。新たに解剖した成体マウスの脳、全胚、または頭部をドライアイス／エタノールスラリー上に配置されたプラスチック型において急速に凍結し、文献に記載されている通りに切片化処理した（Coleら，J ．Neurochem．55，1920-1927，1990）。³³Ｐ標識アンチセンスリボプローブを、直線化pBluescriptプラスミドサブクローンから、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いて調製した。in situハイブリダイゼーションを、50％ホルムアミド、0．3ＭＮａＣｌ中56℃で、文献に記載されている通りに行った（Saffen，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，7795-7799，1988）。ＲＮアーゼ処理に続いて、それらのスライドを0．1×ＳＳＣ中、55℃で1時間洗浄した。ハイブリダイズした切片をＸ線フィルムに露出した後、該スライドをクレシルバイオレットで染色した。染色したスライドのデジタル化画像および対応するオートラジオグラムをアドビ・フォトショップ（Adobe Photoshop）ソフトウェアを用いて重ね合わせた。用いたプローブは：ＦＨＦ−１、完全なコーティング領域を含む0．75キロ塩基；ＦＨＦ−２、0．3キロ塩基のイントロン4および0．2キロ塩基のエクソン5を含む0．5キロ塩基；ＦＨＦ−３、コーディング領域の5’または3’側半分を含む2つの0．4キロ塩基セグメント；およびＦＨＦ−４、コーディング領域の3’側2／3を含む0．5キロ塩基であった。異なるマウスＦＨＦのコーディング領域は63％〜71％のヌクレオチド配列の同一性を共有し、これは、用いた条件下では交差ハイブリダイゼーションがほとんど、もしくは全く存在しないはずであることを示唆する。免疫組織化学。ウサギポリクローナル抗ＦＨＦ−１抗体を、Ｔ７遺伝子10タンパク質に融合したＦＨＦ−１のカルボキシル末端190アミノ酸からなる細菌性融合タンパク質に対して生じさせた（Studierら，Meth．Enzymol．185，60-89，19 80）。抗ＦＨＦ−１抗体を、アフィニティマトリックスとしてのニトロセルロース上に固定化されたこの融合タンパク質を用いてアフィニティ精製し、この融合パートナーに対する抗体を固定化Ｔ７遺伝子10タンパク質に吸収させることにより除去した。霊長類の脳のサンプルを免疫染色するため、3頭のサル（アカゲザル(Macaca mulatta)）をケタミン（35ｍｇ／kg、i．ｍ．）で麻酔し、致死量のペントバルビタールナトリウム(100ｍｇ／kg、i．v．)を注射して、0．1Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7．4）中4％のパラホルムアルデヒドを心臓を通して灌流させた。脳を取り出し、20％ショ糖中4℃で凍結保護し、凍結して、10または20μｍの厚さで切断した。切片を、過酸化水素の存在下において、アフィニティ精製ウサギ抗ＦＨＦ−１抗体、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Vector）、ペルオキシダーゼ結合アビジン（エクストラビジン（Extravidin）、Sigma Chemical Co.）、および3，3’−ジアミノベンジジン二塩酸塩（Aldrich）と共に順にインキュベートした。次に、大部分の切片をゼラチン被覆スライドに乗せ、脱水し、清浄化して、カバーグラスで覆った。組織化学的反応に続いて、幾つかの10μｍ厚切片を洗浄し、マウス抗パルブアルブミン（Sigma）、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Vector）、およびテキサスレッド（Texas Red）（Chemicon）に結合させたストレプトアビジン中で順にインキュベートした。これらの切片を清浄なスライドに乗せ、部分的に乾燥させ、グリセロール／リン酸緩衝液媒体中で覆った。隣接する切片をシトクロムオキシダーゼについて組織化学的に処理し、またはニッスル物質について染色し、皮質下核または皮質領域および層の境界を決定した。トランスフェクトした細胞におけるＦＨＦ−１の生産および局在化。ＦＨＦ− １の翻訳の効率を高めるため、完全なＦＨＦ−１読取り枠（オープンリーディングフレーム）を真核生物の発現ベクターpCIS（Gormanら，DNA Protein Eng．Tec h．2，3-10，1990）に挿入する前に、開始メチオニンのコーディング配列のすぐ 5’側の領域をＰＣＲ増幅により最適リボソーム結合部位（CCACCATGG）に変換した。このpCISベクターはβ−ガラクトシダーゼ構築物にも用いた。ヒト胚性腎臓細胞（293細胞）に、この発現構築物およびシミアンウイルス40（ＳＶ40）大Ｔ抗原を発現するプラスミド（pRSV−TAg）をリン酸カルシウム法（Gormanら、前出）を用いて一時的にトランスフェクトした。³⁵Ｓ−メチオニン標識化については、トランスフェクションの24時間後に細胞を無血清培地に移し、6時間標識化した。免疫染色については、トランスフェクトした細胞をゼラチン被覆カバーグラス上で増殖させた。トランスフェクションの1日後、これらの細胞をＰＢＳ中の2％ホルムアミド中、室温で30分間固定し、冷メタノールを用いて−20℃で10 分間透過処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の3％ＢＳＡ中で15分間プレインキュベートし、ＰＢＳ中の3％ＢＳＡ中の希釈率1：1000のアフィニティ精製抗ＦＨＦ−１抗体および希釈率1：400のマウスモノクローナル抗ＢｉＰと共に室温で1時間インキュベートし、ＰＢＳ中の0．1％TWEEN−20^TMを用いて室温で3 ×15分洗浄し、次いでＰＢＳ中の3％ＢＳＡ中のフルオレセイン結合ロバ抗ウサギＩｇＧおよびローダミン結合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に30−60分間インキュベートした。次に、カバーグラスをＰＢＳ中の0．1％TWEEN-20^TMで洗浄し、0．1％ 1，4−ジアゾビシクロ−［2，2，2］−オクタン（ＤＡＢＣＯ）、75％グリセロール、10ｍＭトリス、ｐＨ8．0中でマウントした。Ｘ−gal染色については、トランスフェクトした細胞を0．5％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中、室温で10分間固定し、2ｍＭＭｇＣｌ₂を含むＰＢＳで2回洗浄し、ＰＢＳ中1ｍｇ／mlの5ｍＭＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆、5ｍＭＫ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆、2ｍＭＭｇＣｌ₂中、37℃で1−2 時間インキュベートして、ＰＢＳ中の0．5％グルタルアルデヒド中、室温で10分間、後固定した。実施例1 繊維芽細胞増殖因子相同因子（ＦＨＦ）の同定ヒト網膜で発現する遺伝子産物を同定するため、ヒト網膜ｃＤＮＡクローンの無作為のセグメントを部分的に配列決定し、得られた部分的な配列を公的に利用可能なデータベースの配列と比較した。詳細には、ラムダgt10中に構築した成人網膜ｃＤＮＡライブラリー（Nathansら，Science，232:193，1986）を増幅し、E coRIで切断することによりｃＤＮＡインサートを大量に切り出し、アガロースゲル電気泳動によりベクターから精製した。精製したｃＤＮＡインサートを熱変性した後、5’末端にEcoRI部位を有し、かつ3’末端に6つの無作為のヌクレオチドを有する合成オリゴヌクレオチド（5’−GACGAGATATTAGAATTCTACTCGNNNNNN-3’ ；（配列番号32））をプライマーとして用いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片の存在下で連続して二回ＤＮＡ合成を行った。得られた二重鎖ＤＮＡ分子を、独自5’隣接配列に対応するプライマー（5’−CCCCCCCCCGACGAGATATTAGAA TTCTACTCG−3’；（配列番号33））を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。元のｃＤＮＡインサートの無作為のサンプル採取に相当するこれらのＰＣＲ産物をEcoRIで切断し、長さが約500塩基対のセグメントのみを含むように分取用アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画して、ラムダgt10中にクローン化した。このライブラリーに由来する3000個の単一プラークを96ウェルのトレーに並べ、これらのクローンに由来するインサートをＰＣＲによって増幅した後、ジデオキシ法および自動化蛍光検出（Applied Biosystems）を用いて配列決定した。各インサートの一端から一回配列決定したものを3つの読取り枠（オープンリーディングフレーム）の全てにおいて両鎖に対して概念的に翻訳し、得られた6つのアミノ酸配列を、BLASTX検索アルゴリズムを用いるGenBank非重複タンパク質データベースでの相同性の検索に用いた。すでに文献に記載されているＦＧＦファミリーのメンバーに対して統計的に有意の相同性を示す部分ｃＤＮＡが1つ同定された。この部分ｃＤＮＡをプローブとして用いて、読取り枠（オープンリーディングフレーム）全体を包含する2つのクローンを含めて多数の独立したｃＤＮＡクローンをヒト網膜ｃＤＮＡライブラリーから単離し、そこから完全なヌクレオチド配列を決定した。この完全なヌクレオチド配列はＦＧＦスーパーファミリーの新規かつ高度に分岐したメンバーをコードし、繊維芽細胞増殖因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）と命名された。ＦＨＦ−１の推定アミノ酸配列は224個のアミノ酸を有し、ＦＨＦ−１と最も高い相同性を共有するＦＧＦファミリーのメンバーであるＦＧＦ−９と27％同一である。ＦＨＦ−１のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図5に示す。このＦＨＦ−１の配列を用いて、国立バイオテクノロジー情報センター（Nati onal Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）の発現した配列タグ（ＥＳＴ）および配列タグ付け部位（ＳＴＳ）のデータベースを検索した。ヒト小児脳ｃＤＮＡライブラリー（Adamsら，Nature Genet．4，373-380，1993）から誘導されたＥＳＴエントリーの1つ（ＤＢＥＳＴ ID 06895）はＦＨＦ−１のカルボキシル末端に対して有意の相同性を有する77アミノ酸のセグメントをコードしたが、ＦＧＦファミリーの他のメンバーに対する有意の相同性はなかった。このアミノ酸セグメントを含むポリペプチドをＦＨＦ−２と命名した。ヒトゲノムＤＮＡから誘導されたＳＴＳエントリーの1つ（ＤＢＥＳＴ ID 76387；Brody ら，Genomics 25，238-247，1995)が、ＦＨＦ−１に対する相同性の程度が高く、かつ他のＦＧＦファミリーのメンバーに対する相同性の程度が低いタンパク質セグメントをコードする推定エクソンを含んでいた。このアミノ酸セグメントを含むポリペプチドをＦＨＦ−3と命名した。全長ＦＨＦ−２およびＦＨＦ−３ｃＤＮＡクローンを成人網膜ｃＤＮＡライブラリーから単離し、これらがそれぞれ 245個および225個のアミノ酸を含むタンパク質をコードし、その各々がＦＨＦ− １に対して、および互いに、58％を上回るアミノ酸同一性を有することが見出された。ＦＨＦ−２およびＦＨＦ−３のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列をそれぞれ図6および図7に示す。ＦＨＦ−１、ＦＨＦ−２、およびＦＨＦ−３の配列を比較することでアミノ酸配列が高度に保存された幾つかの領域が明らかとなり、これらの領域のうちの２つを用いてＰＣＲで使用する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらのプライマーは、得られるＰＣＲ産物のクローン化を容易にするため、それらの3’末端の保存されたアミノ酸（ＦＨＦ−１配列（配列番号１）の残基151− 157および184−190；図5および下記を参照）、並びにそれらの5’末端の制限酵素切断部位に対するコドンに相当する配列を有する。隣接するEcoRI制限部位を有する完全縮重センス鎖プライマーをアミノ酸配列VFENYYV（配列番号２７；アミノ酸151−157）に対して合成した（5’−CCGATCGAATTCGTNTT（T／C）GA（A／G ）AA（T／C）TA（T／C）TA（T／C）GT−3’；配列番号34）。隣接するBamHI部位を有する３つの部分縮重アンチセンスプライマーを、アミノ酸配列MKGN（Ｈ／Ｒ）VK（配列番号30；アミノ酸184−190）に対する可能なコドンすべてを含むように合成した（5’−GCGATCGGATCCTTNAC（A／G）TG（A／G）TTNCC（T／C）TTCAT− 3’（配列番号35）；5’−GCGATCGGATCCTTNAC（T／C）CT（A／G）TTNCC（T／C） TTCAT−3’（配列番号36）；および5’−GCGATCGGATCCTTNACNCG（A／G）TTNCC（ T／C）TTCAT-3’（配列番号37））。３対のセンスおよびアンチセンスプライマーを、ヒト、マウス、およびウシゲノムＤＮＡテンプレート並びにサームス・アクアチクス（Thermus aquatics）ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応に用い、以下の条件の下で反応を行った：1×（94℃、7分）、35×（45℃、2分；72℃、0 ．5分；94℃、0．5分；95℃、0．25分）。ＰＣＲ産物をEcoRIおよびBamHIで切断し、分取用アガロースゲル電気泳動で分画し、pBluescriptにサブクローン化して、個別に配列決定した。マウス、ヒト、およびウシゲノムＤＮＡテンプレートを用いて得られた増幅産物を分析することにより、これらの種の各々において、ＦＨＦ−１、ＦＨＦ−２、およびＦＨＦ−３のこの領域が単一のエクソン内でコードされることが明らかになった。また、これらの種のすべてに存在し、かつＦＨＦ様タンパク質をコードすることが見出された第4のクラスのＦＨＦ様ＰＣＲ産物の存在もこの分析で明らかとなり、該タンパク質をＦＨＦ−４と命名した。ＦＨＦ−４に対応するＰＣＲ産物をプローブとして用い、ヒト網膜ｃＤＮＡライブラリーおよび発生中のマウスの眼のｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡクローンを単離した。ＦＨＦ−１、ＦＨＦ−２、およびＦＨＦ−３に対して60％を上回るアミノ酸同一性を有する247アミノ酸のタンパク質がこれらのクローンによってコードされるものと予想される。ＦＨＦ−４のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図8に示す。図3は同定されたＦＨＦおよびすでに特徴付けられて公開されているＦＧＦ（1 −9）のアミノ酸配列のアラインメントを示し、図4は同定されたＦＨＦおよびすべての公開されたＦＧＦの配列の樹状図である。ＦＨＦの各々と9つのＦＧＦファミリーメンバーとを対比することでは30％未満のアミノ酸配列同一性しか示されないが、4つのＦＨＦの間で対比することではすべて58％〜71％のアミノ酸配列同一性が示される。マウスおよびヒトオルトログ（orthologue）の間では、97 ％を上回るアミノ酸同一性が存在する。マウスのＦＨＦは以下に記載するアミノ酸置換によってそれらのヒトオルトログと相違する。最初と最後の文字はそれぞれヒトとマウスの配列におけるアミノ酸を示し、数字はそのポリペプチド鎖に沿った位置を示す：ＦＨＦ−１：Ｑ86Ｅ；ＦＨＦ−２：Ａ２Ｔ、Ｌ136Ｈ；ＦＨＦ −３：Ａ58Ｔ、Ｐ60Ｑ、Ｑ180Ｒ，Ｌ197Ｖ、Ｑ207Ｒ、Ａ217Ｔ、Ｐ225Ｈ；およびＦＨＦ−４：Ｃ40Ｆ、Ａ181Ｖ、Ｐ221Ａ、Ｓ244Ｃ。したがって、これらの4つのＦＨＦはＦＧＦファミリーの異なる高度に保存された分岐を規定する。ＦＨＦ１−４は各々認識可能なアミノ末端シグナル配列を欠いている。すでに特徴付けられているＦＧＦファミリーのメンバーのうち、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ− ２、およびＦＧＦ−９も認識可能なアミノ末端シグナル配列を欠いていることにより区別される（Abrahamら，Science 233，545-548，1986；Jayeら，Science23 3 ，541-545，1986；Miyamotoら，Mol．Cell Biol．13，4251-4259，1993）。現在の証拠は、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２が細胞質ゾルで合成され、ＥＲ−ゴルジ分泌経路から独立した機構によって放出されることを示している（Florkiewic zら，J．Cell Physiol．162，388-399，1995；Jacksonら，J．Biol．Chem．270 ，33-36，1995）。ＦＧＦ−９は切断可能なアミノ末端シグナル配列を欠いているが、これはグリコシル化されており、培養神経膠腫、チャイニーズハムスター卵巣、およびCOS細胞から、おそらくはＥＲ−ゴルジ経路を介して効率的に分泌される（Miyamotoら，Mol．Cell Biol．13，4251-4259，1993）。実施例2 ＦＨＦ−４の推定アミノ酸配列図8は、上述のヒト網膜ｃＤＮＡクローンから誘導されたヒトＦＨＦ−４のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。上述のように、ヒトＦＨＦ−４遺伝子の一次翻訳産物は長さが247アミノ酸であるものと予想される。図8のヌクレオチド位置78−80に示されるヒトＦＨＦ−４開始メチオニンコドンは枠内の最初のＡＴＧである：この位置に良好なコンセンサスリボソーム結合部位（CCACCA TG G；Kozak，Nucleic Acids Res.，15:8125，1987）が見られる。このＡＴＧの選択は、図1のアラインメントにおいて示されるように、ＦＨＦ−１、ＦＨＦ− ２、およびＦＨＦ−３における翻訳開始部位に従う。ＦＨＦ−４の読取り枠内の次のメチオニンコドンは推定開始メチオニンコドンの85コドン3’側に位置する。ＦＨＦ１−３に加えてＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２と同様に、ＦＨＦ−４は識別可能なアミノ末端シグナル配列を欠く。ヒトＦＨＦ−４はアミノ酸242−244に単一のAsn−Lys−Serモチーフを有しており、これはアスパラギン結合グリコシル化のためのコンセンサス配列と一致するが、この部位は高度に相同のマウスＦＨＦ−４配列（図３を参照）では保存されず、それがグリコシル化に用いられない可能性があることが示唆される。実施例3 ＦＨＦ遺伝子の染色体位置決定ヒトにおいては、ＦＨＦ−１、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３、およびＦＨＦ−４はそれぞれ第3、Ｘ、第17、および第13染色体上に位置する。ＦＨＦ−１、ＦＨＦ −２、およびＦＨＦ−４の染色体位置は、個別のヒト染色体を担持する齧歯類− ヒトハイブリッド細胞系に由来するゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより決定した。例えば、ヒトＦＨＦ−４の場合、各々が異なるヒト染色体（Oncor、Gaithersburg、メリーランド州）を含む24のヒト−マウスおよびヒト−ハムスター細胞系のパネルに由来する制限酵素消化ＤＮＡを含むサザンブロットを行った。ヒトＦＨＦ−４プローブをヒト、マウス、およびハムスターのゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせると、ハイブリダイズする断片のサイズは異なっていた。ハイブリッドパネルのうち、ヒト特異的ハイブリダイゼーションパターンはヒト第1および第13染色体を担持するハイブリッド細胞系に相当するレーンに見られ、これらの細胞系のうちの1つが他の細胞系に存在する染色体に由来するさらなるゲノム配列を有することが示唆される。これらの2つのヒト染色体のうちのどちらがＦＨＦ−４遺伝子を含んでいたのかを決定するため、マウス遺伝子の位置を種間戻し交配マッピングにより決定した。以下でさらに論じられるように、この分析は、ＦＨＦ−４遺伝子をマウス第14染色体のRap2a遺伝子から1cM未満で、ヒト染色体13q34とシンテニーである領域内に位置付けた。まとめると、これらのデータは、ヒトにおいては、ＦＨＦ−４が第13染色体に位置付けられることを示す。ＦＨＦ−３遺伝子座は、ＦＨＦ−３のエクソンの1つを含む上記ＳＴＳがヒト第17染色体から誘導され、かつBRCA−1遺伝子の近くに位置付けられた（Brodyら，Genomics 25，238-247，1995）ことから、ヒト第17染色体上にある。マウスにおけるＦＨＦ−１、ＦＨＦ−２、およびＦＨＦ−４の染色体位置を、（C57BL／6J×Mus spretus）、F1×C57BL／6Jの交雑種からの種間戻し交配マッピングパネルを用いて決定した。このマッピングパネルは、19のマウス常染色体のすべておよびX染色体全体に十分に分布している2100を超える遺伝子座（Copel andおよびJenkins，Trends Genet．7，113-118，1991）について型が調べられている。C57BL／6JおよびM．spretusのＤＮＡを幾つかの制限酵素で消化し、有益なＲＦＬＰについてサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。各々の遺伝子座の染色体位置を、戻し交配マウスにおけるその系統間分布をその戻し交配においてすでにマッピングされている他のすべての遺伝子座の系統間分布パターンと比較することにより決定した（図９）。ＦＨＦ−１はマウス第16染色体の近位領域、Smstに対して1．6cM遠位、およびApodに対して5.1cM近位に位置付けられた。ＦＨＦ−２はX染色体に位置付けられ、かつ共通に型が調べられた1 68匹のマウスにおいてCd401との組換えを生じることがなく、これらの2つの遺伝子座が互いの1．8cM以内にあることが示唆される（95％を上回る信頼区間）。上述のように、ＦＨＦ−４は第14染色体の遠位領域に位置付けられ、かつ共通に型が調べられた142匹のマウスにおいてRap2aと組換えを生じることがなく、これらの2つの遺伝子座が互いの2．1cＭ以内にあることが示唆される。ＦＨＦ−３遺伝子は、14の制限酵素で試験したときに有益なＲＦＬＰが明らかにならなかったため、この戻し交配パネルでは位置付けられなかった。ヒトＦＨＦ−３遺伝子がＢＲＣＡ−１と近接していることから、マウスＦＨＦ− ３遺伝子がヒト第17染色体のＢＲＣＡ−１とシンテニーである第11染色体上の領域に存在することが示唆される。これらのＦＨＦ遺伝子は、複合マウス結合地図（マウスゲノムデータベース、Jackson Laboratory、Bar Harbor、メイン州）の、ＦＨＦ対立遺伝子候補であり得る多数の突然変異を有する領域に位置する。実施例4 ＦＨＦＲＮＡの組織および細胞下分布マウスにおけるＦＨＦの発現パターン。4つの同定されたＦＨＦ遺伝子の各々から誘導される転写物の組織分布をＲＮアーゼプロテクション実験において決定した。脳、眼、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、および精巣から調製したＲＮＡの分析から、各々のＦＨＦが脳において発現し、ＦＨＦ−１、ＦＨＦ−２、およびＦＨＦ−３が眼において発現し、ＦＨＦ−１およびＦＨＦ−４が精巣において発現し、そしてＦＨＦ−２が心臓において発現することが明らかとなった（図10）。脳においては、ＦＨＦ−２転写物は他のＦＨＦのいずれに由来する転写物よりも少なくとも5倍豊富である。発生の過程でのＦＨＦ遺伝子の発現パターンを、妊娠第11日（ｅ11）、妊娠第 17日（ｅ17）、出生後第1日（Ｐ1）、および成体から得た切片を用いるin situ ハイブリダイゼーション実験により研究した。ＦＨＦ−２転写物は検査した時点の各々で豊富であり、腸神経系などの中枢および末梢神経系のすべての区画に存在する（図11A、11C、11Dおよび11F）。このＲＮアーゼプロテクション実験と一致して、ＦＨＦ−２転写物はｅ17の発生中の心臓で観察された（図11D）。ＦＨＦ−１、ＦＨＦ−３、およびＦＨＦ−４転写物も発生中の神経系全体にわたって広範に分布することが観察された（図11Bおよび11E）。例えば、Ｐ1では、ＦＨＦ−１は網膜、嗅上皮、および嗅球において高度に発現することが見出された（図11E）。ｅ11では、ＦＨＦ−１およびＦＨＦ−３は体壁の体節パターンにも見出された（図11B）。成体の脳においては、各々のＦＨＦは異なる発現パターンを示した。ＦＨＦ−１転写物は嗅球に高濃度で存在し、かつ小脳、深部小脳核、皮質全体、および複合中脳構造に低濃度で存在し（図11G）；ＦＨＦ−２転写物は海馬で最も多量であり、かつ複合脳領域に低濃度で存在し（図11Hおよび1 1I）；ＦＨＦ−３転写物は嗅球、海馬、および小脳に存在していて、プルキンエ細胞層に最も集中し（図11J）；およびＦＨＦ−４転写物は小脳の顆粒層全体にわたって高濃度で存在し、かつ海馬および嗅球に低濃度で存在していた（図11K および11L）。サルの脳におけるＦＨＦ−１免疫反応性の分布。成体アカゲザルの脳におけるＦＨＦ−１免疫反応性の分布をアフィニティ精製ポリクローナル抗ＦＨＦ−１抗体を用いて検査した。これらの抗体は、トランスフエクトした293細胞の免疫染色およびウエスタンブロッティングにより決定されたとき、組換えＦＨＦ−１には結合するが、組換えＦＨＦ−２には結合しない。これらの抗体との免疫反応性は「ＦＨＦ−１免疫反応性」と呼ばれるが、ＦＨＦファミリーの他のメンバーが観察される免疫染色の原因の一部である可能性が存在する。ＦＨＦ−１免疫反応性細胞体はアカゲザルの大脳皮質全体にわたって存在するが、いかなる一領域においても層を横切る分布は不均一であり、機能野を横切る密度および分布に顕著な変動を示す（図12A−12E）。図12の低倍率顕微鏡写真は、一次視覚野、体性感覚野、および聴覚野に免疫染色された細胞が比較的高密度に存在し、これらの細胞が中層を優勢に占めることを示す。対照的に、中心前運動野および上頭頂小葉の連合皮質には免疫染色されたニューロンがより少なく、かつより広範に散在する。これらの皮質野の各々に共通のものは幾つかのＦＨＦ−１免疫反応性集団の存在であり、その最も顕著なものは比較的大きく（12−14μｍ径）、免疫反応性が強力な細胞体を有する。より小さく（8−10μｍ径）、より軽度に免疫染色された細胞体を有する他のニューロンもすべての野に存在する（図12F）。同時位置決定実験では、大脳皮質内のＦＨＦ−１免疫反応性ニューロンが、カルシウム結合タンパク質、パルブアルブミンに対して免疫反応性であるニューロンのサブ集団を形成することが示され（図12Gおよび12H）、このパルブアルブミンはサルの大脳皮質においてＧＡＢＡ作動性（gabanergic）介在ニューロンのサブセットを形成することが示されている（Hendryら，Exp．Brain Res．76，467-472，198 9）。海馬の形成においては免疫染色した細胞の密度の変動も見られ、鉤状回複合体では免疫反応性が強い細胞体が比較的一般的であるが、ＣＡ野、歯状門（de ntate hilus）、および歯状回では広範囲に散在する（図12I）。ＦＨＦ−１免疫染色の異なるパターンが視床背側核に見られた（図12J）。この領域の多くの核のうちのほんの僅かのみが免疫反応性ニューロンを有し、それらの中で最も優勢のものは主体性感覚リレー核（尾側腹側後側外側核、ＶＰＬ）および視覚リレー核（外側膝状体核、ＬＧＮ）である。ＬＧＮにおいては、大細胞および小細胞層の両者が等しく免疫染色される。図12Jは、誕生以来閉鎖により失われた眼と同側のＬＧＮにおいて、正常な眼によって神経支配される層よリも失われた眼によって神経支配される層で免疫染色が顕著に少ないことを示す。視床背側核の核における比較的大きなサイズのＦＨＦ−１免疫染色された細胞体は、それらがそれらの軸策を大脳皮質に送るニューロンの細胞体であることを示唆する。パルブアルブミンに対して軽度に免疫反応性であるＶＰＬおよびＬＧＮのニューロンにおけるＦＨＦ−１免疫反応性の局在がこの結論を支持する。なぜならば、視床背側核におけるこれらのパルブアルブミン免疫染色されたニューロンが視床皮質系ニューロンであることが示されているためである（JonesおよびHendry，Eur．J．Neurosci．1，222-246，1989）。視床背側核の外側では、ＦＨＦ−１免疫反応性ニューロンは、淡蒼球および被殻、赤核、黒質、並びに第三神経複合体を含む皮質下核の多様なコレクション内に存在していた（図12K）。加えて、深部小脳核におけるニューロンと同様に、上丘および下丘の両者の深層における大細胞が免疫染色された。結論として、ＦＨＦ−１免疫反応性は脳脊髄軸を横切って広範に分布するが、ニューロンのサブセットにおいては各々のレベルで存在していた。トランスフェクト細胞におけるＦＨＦ−１の細胞下位置決定。上述のように、この報告以前に文献に記載されている9つのＦＧＦのうち、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２はアミノ末端シグナル配列の欠如並びにＥＲおよびゴルジ装置とは独立の経路を介する分泌により区別される（Florkiewiczら，J．Cell Physiol．162 ，388-399，1995；Jacksonら，J．Biol．Chem．270，33-36,1995）。さらに、ＦＧＦ−１および代わりの翻訳開始によって生成されるＦＧＦ−２アイソフォームのサブセットは、標的細胞の核内の他に、それらが合成された細胞の核内に蓄積することが示されている（Imamauraら，Science 249，1567-1570，1990；Imamau raら，J．Biol．Chem．267，5676-5679；Buglerら，Molec．Cell．Biol．11，57 3-577，1991；Zhanら，Biochem．Biophys．Res．Comm．188，982-991，1992；Ca oら，J．Cell Science 104,77-87，1993；Wiedlochaら，Cell 76，1039-1051，1 994）。これらのタンパク質は、コンセンサスＮＬＳと厳密に一致する核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の核への蓄積は、これらのタンパク質が、細胞表面受容体に結合し、かつそれを活性化することにより媒介されるものに加えて作用モードを有する可能性を生じている。ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２と同様に、同定された4つのＦＨＦの各々は古典的なシグナル配列を欠き、ＮＬＳとして機能し得る塩基性残基のクラスターをそのアミノ末端近くに有する。これらの観察は、ＦＨＦがそれらの分泌機構およびそれらの細胞下局在化においてＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２に類似する可能性があることを示唆する。この可能性を試験するため、一時的にトランスフェクトした、ヒト胚性腎細胞である293細胞において合成されたＦＨＦ−１の命運を決定した。一組の実験においては、生合成により標識されたＦＨＦ−１が細胞内には高レベルで蓄積するが、培地中に検出可能な程度には分泌されないことが見出された（図13）。対照的に、平行トランスフェクションにより産生されたヒト成長ホルモンは効率的に分泌された（図13）。293細胞は様々な成長ホルモンをＥＲ −ゴルジ経路を介して分泌することができるため、この実験はＦＨＦがこの経路を介しては分泌されないとする提案と一致する。第2の組の実験においては、トランスフェクトした293細胞の免疫染色によリその核内でのＦＨＦ−１の蓄積が明らかとなり、これは塩基性残基のクラスターがＮＬＳとして機能し得ることを示唆する。類似の結果がＦＨＦ−２で得られた。ＮＬＳモチーフの2つの主要クラス、古典的および二連モチーフが記載されている（Boulikas，Crit．Rev．Eukaryotic Gene Expression 3，193-227,1993）。古典的ＮＬＳは6個のリジンまたはアルギニンアミノ酸を含み、二連ＮＬＳはアミノ酸10個のスペーサーで分離されている3もしくは4個の塩基性アミノ酸の2つのクラスターを含む。ＦＨＦ−１においては、塩基性アミノ酸のクラスターは二連ＮＬＳコンセンサスにより近似する。推定ＦＨＦ−１ＮＬＳを同定して特徴付けるため、ＦＨＦ−１の欠失変異体の細胞下局在化を抗ＦＨＦ−１抗体を用いる免疫染色により決定し、そしてＦＨＦ−１とβ−ガラクトシダーゼとの融合の細胞下局在化をＸ−gal染色により決定した。これらの実験は、ＦＨＦ−１のアミノ酸11−18および28−38のアルギニンおよびリジンの2つのクラスターが二連ＮＬＳの2つの塩基性領域を形成することを示す。ＦＨＦ−１タンパク質の側では、いずれかのクラスターを除去することでは細胞質ＦＨＦ−１の穏やかな増加が生じるものの相当量の核内蓄積が残ったままであった（構築物2および3；図14 ）が、両方の領域を除去することでは核内蓄積が消失した（構築物4；図14および15）。移入に必要とされる最小領域をさらに特徴付けるため、ＦＨＦ−１の最初の56個または最初の69個の残基をβ−ガラクトシダーゼに融合させたところ、これらが機能性ＮＬＳを含むことが示された（構築物5および6；図14および15）。ＦＨＦ−１のアミノ酸1−22または23−55を個別にβ−ガラクトシダーゼに融合させることでは直接核内に局在化させることができず、これは二連ＮＬＳの両方のパーツの必要性または最初の55残基に対して遠位の配列の必要性を示す。ＦＨＦ−１の最初の69個のアミノ酸に融合したβ−ガラクトシダーゼでは、欠失分析の結果は無傷のＦＨＦ−１で見られるものに類似していた（構築物5、9、10、および11；図14および15）。最後に、アミノ酸10個のスペーサーで分離された塩基性アミノ酸の2つのクラスターのみを含むＦＨＦ−１アミノ酸11−38の融合体は、この領域を含むより大きいセグメントよりも効率では劣るものの核内局在化をもたらし、これは二連ＮＬＳコンセンサスの外側のアミノ酸1−10または56−6 8が核内局在化において補助的な役割を果たすことを示す。本発明を上に詳述される説明に関して記載したが、前述の記載が本発明の範囲を説明することを目的とするものであって、それを限定しようとするものではないことは理解されるであろう。本発明の他の側面、利点、および変形は以下の請求項の範囲の内にある。ここで言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は参照することによりそれらの全体が組み込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 15/08 Ａ６１Ｐ 15/08 25/02 25/02 25/16 25/16 25/28 25/28 27/02 27/02 31/12 31/12 35/00 35/00 37/00 37/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 16/24 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/02 Ａ６１Ｋ 37/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｑ 1/68 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者スモールウッド，フィリップ，エム. アメリカ合衆国 21797―9621 メリーランド州，ウッドバイン，ウッドバインロード 5022

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋な繊維芽細胞増殖因子相同因子(FHF)ポリペプチド。２．前記ポリペプチドが、 a.約225〜250アミノ酸の長さであり、 b.アミノ末端のシグナル配列をもたず、 c.核局在化シグナルを含む、請求項１に記載のポリペプチド。３．前記ポリペプチドが、FHF-1(配列番号1)、FHF-2(配列番号2)、FHF-3(配列番号3)、及びFHF-4(配列番号4)のアミノ酸配列中に保存された少なくとも５個の連続アミノ酸のセグメントを含む、請求項１に記載のポリペプチド。４．前記セグメントが配列番号22の配列の少なくとも５アミノ酸を含む、請求項３に記載のポリペプチド。５．前記セグメントが配列番号24の配列の少なくとも５アミノ酸を含む、請求項３に記載のポリペプチド。６．前記ポリペプチドがFHF-4である、請求項１に記載のポリペプチド。７．前記ポリペプチドが図８のアミノ酸配列(配列番号4)を含む、請求項１に記載のポリペプチド。８．請求項１に記載のFHFポリペプチドをコードする、単離された核酸。９．前記核酸の配列が図８のヌクレオチド配列(配列番号21)を含む、請求項８に記載の核酸。 10．前記核酸の配列が、 a.図８のヌクレオチド配列(配列番号21)(ここでTはUでもよい)、 b.図８のヌクレオチド配列(配列番号21)の相補物にハイブリダイズする核酸配列、及び c.少なくとも15ヌクレオチドを含み、図８のヌクレオチド配列(配列番号21)の相補物にハイブリダイズするａまたはｂの断片、からなる群から選択される、請求項８に記載の核酸。 11．請求項８に記載の核酸にハイブリダイズする核酸。 12．請求項10に記載の核酸にハイブリダイズする核酸。 13．前記核酸が哺乳動物のものである、請求項８に記載の核酸。 14．前記核酸がヒトのものである、請求項13に記載の核酸。 15．請求項８に記載の核酸を含む発現ベクター。 16．前記ベクターがプラスミドである、請求項15に記載のベクター。 17．前記ベクターがウイルスである、請求項15に記載のベクター。 18．請求項15に記載のベクターで安定に形質転換された細胞。 19．請求項１に記載のFHFポリペプチドと結合する抗体。 20．前記抗体がモノクローナルである、請求項19に記載の抗体。 21．請求項１に記載のFHFポリペプチドの発現に関連する細胞増殖性疾患を検出する方法であって、 a.該疾患を有するかまたは該疾患を有することが疑われる被験者からの検体を、FHFポリペプチドの発現を検出する試薬と接触させ、 b.前記試薬の検体への結合を検出する、ことを含む前記方法。 22．前記細胞が脳細胞である、請求項21に記載の方法。 23．前記試薬が抗体である、請求項21に記載の方法。 24．前記試薬が核酸である、請求項21に記載の方法。 25．前記核酸が請求項８に記載の核酸にハイブリダイズする、請求項24に記載の方法。 26．前記核酸が請求項８に記載の核酸の相補物にハイブリダイズする、請求項24 に記載の方法。 27．検出をin vivoで行う、請求項21に記載の方法。 28．検出をin vitroで行う、請求項21に記載の方法。 29．前記試薬が検出可能な標識を含む、請求項21に記載の方法。 30．請求項１に記載のFHFポリペプチドの発現と関連する細胞増殖性疾患の治療方法であって、該疾患を有するかまたは該疾患を有することが疑われる被験者にFHFポリペプチドの活性を抑制する薬剤を投与することを含む前記方法。 31．前記薬剤が抗FHF抗体である、請求項30に記載の方法。 32．前記薬剤が請求項８に記載の核酸にハイブリダイズする核酸である、請求項 30に記載の方法。 33．前記細胞が脳細胞である、請求項30に記載の方法。 34．前記薬剤がキャリアを使用して細胞に導入される、請求項30に記載の方法。 35．前記キャリアがベクターである、請求項34に記載の方法。 36．FHF特異的核酸プローブによりFHFポリペプチドをコードする核酸を含むサンプルをつり上げることを含む、FHFポリペプチドをコードする核酸の同定方法。 37．FHF特異的核酸プローブが、 a.少なくとも7個の連続アミノ酸をコードし、そのうち少なくとも4個がFHF-1(配列番号1)、FHF-2(配列番号2)、FHF-3(配列番号3)、及び FHF-4(配列番号4)のアミノ酸配列中に保存されたものである核酸、または b.その相補的配列、にハイブリダイズする、請求項36に記載の方法。