JP2002065249A

JP2002065249A - 抗酸菌選択分離用培地

Info

Publication number: JP2002065249A
Application number: JP2000255231A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Enari; 博江成; Yutaka Okazawa; 豊岡沢; Kiyonari Yamashita; 研也山下; Kaori Matsumoto; 香里松本
Original assignee: Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd
Current assignee: Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2002-03-05
Anticipated expiration: 2020-08-25
Also published as: JP4668395B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、液体培地において抗酸菌を培養する
際に問題となるコンタミネーションを効果的に防止し、
かつ抗酸菌を従来の検出効率と同等またはそれ以上の効
率を維持しつつ検査期間を短縮することができる、抗酸
菌培養用液体培地を提供することを課題とする。本発明
はさらに、CPCを主成分として含む抗酸菌培養用サンプ
ル前処理剤に適合するための固型培地と液体培地の組合
せからなる抗酸菌培養用固型−液体二相培地を提供する
ことを課題とする。【解決手段】本発明は、M7H9-B培地からなる基本培地
に、ヘミン、L-アスパラギン水和物、カゼインペプト
ン、酵母エキス、オレイン酸を含むことを特徴とする、
改変M7H9-B培地を提供する。本発明はまた、CPCを含む
サンプル前処理剤に適合するための固型ビット培地と液
体改変M7H9-B培地の組合せからなる二相培地を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗酸菌を対象とす
る選択分離培養に関する。より具体的には、抗酸菌培養
用液体培地である改変M7H9-B培地、当該改変M7H9-B培地
を用いた液体−固型二相培地、およびそれらを使用する
抗酸菌培養方法に関する。本発明はさらに、抗酸菌培養
用のサンプル前処理剤および改変M7H9-B培地を含む、抗
酸菌培養キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】結核菌の検査においては、分離培養法が
しばしば用いられる。分離培養法は、サンプルからの抗
酸菌の検出感度が高く、また分離した菌を用いて菌種の
鑑別・同定や、薬剤耐性試験を行うことができるという
特徴を有している。一般的には、分離培養法は、サンプ
ルの前処理、処理サンプルの培地への接種、および成績
判定の3つの工程から構成される。

【０００３】近年の技術の進歩および検査業務の増加に
伴って改訂された新結核菌検査指針2000（2000年4月）
においては、従来の結核菌検査指針と比較して、検査期
間の短縮および検査の精度の向上が要求されている。こ
の新結核菌検査指針2000においては、従来からの直接塗
抹法や小川法に代えて、サンプルの前処理にN-アセチル
-L-システイン・NaOH（NALC-NaOH）を用いる方法により
検査を行うこと、および検出感度の向上に加え迅速性を
重視して、処理サンプル中からの初代分離に液体培地を
使用することが推奨されている。

【０００４】喀痰などのサンプルを用いる場合、抗酸菌
以外の他の一般細菌がサンプル中に混入することは避け
られない。サンプル中に抗酸菌以外の一般細菌が残存し
たまま、これらの前処理したサンプルを液体培地中で培
養した場合には、混入した一般細菌も液体培地中で増殖
するため、培地中で増殖した細菌群の中から、抗酸菌の
みを区別することができないという、いわゆるコンタミ
ネーションの問題が生じていた。また、そのようなコン
タミネーションの有無を確認するため、かかる液体培地
中における抗酸菌以外の一般細菌の有無を確認すること
を目的として、種々の染色法あるいは血液寒天培地など
の使用による検出を行うこととすれば、かえって手間と
コストがかかってしまうなどの不利益を生じることにな
る。従って、このサンプル中に含まれる他の一般細菌
は、分離培養を行う前に、前処理をして予め死滅させて
おくことが望まれている。

【０００５】このようなサンプルの前処理方法として、
NaOH法、NALC-NaOH法、セチルピリジニウムクロライド
（CPC）法などが知られている。NaOH法は、抗酸菌が、
他の一般細菌と比較してNaOHに対する抵抗性が強いとい
う特徴を有していることに基づいて行われる前処理であ
る。しかし、NaOHの濃度が高く、作用温度が高く、ある
いは作用時間が長ければ、抗酸菌もNaOHにより死滅して
しまう。このうち作用濃度および作用時間は、サンプル
の粘性に依存して変化させることが一般的である。その
ため、新結核菌検査指針2000においては、喀痰の場合に
は、粘液溶解剤であるNALCを加えて喀痰の消化を促進
し、NaOHの抗酸菌に対する障害作用の軽減を図るNALC-N
aOH法を推奨している。しかし、NALC-NaOH法でも、後述
するCPC法と比較して、サンプル中の他の一般細菌の混
入、いわゆるコンタミネーションの防止が完全ではない
という欠点が存在していた。

【０００６】これに対して、CPC法は、CPCが細菌に対す
る静菌効果を有していることを利用する方法であり、抗
酸菌が、他の一般細菌と比較して、CPCに対する抵抗性
が比較的強いという特徴に基づいて行われる前処理方法
である。このサンプルの前処理のためのCPC法は、前述
したように、NaOH法もしくはNALC-NaOH法による前処理
と比較して、他の一般細菌の混入をより完全に防止する
ことができるという利点を有している。従って、分離培
養法についての前処理としては、CPC法による前処理が
望まれる。

【０００７】検出感度の向上および迅速性の観点から、
新結核菌検査指針2000において使用することが推奨され
ている液体培地としては、ソートン培地（Sauton's med
ium）、デュボス培地（Dubos medium）、ミドルブルッ
ク7H9ブロス（Middlebrook 7H9 Broth：以下、M7H9-Bと
いう。）といった培地が知られている。これらの液体培
地においては、これまで利用されてきた小川培地などの
固型培地と比較して、培養日数の短縮という目的を達成
することが可能である。

【０００８】これらから総合すると、抗酸菌の分離培養
法において最も望ましい態様は、CPC法により前処理し
たサンプルを、上述したような液体培地中で増殖させる
方法である。

【０００９】抗酸菌は、CPCに対して他の一般細菌と比
較して抵抗性があるとはいうものの、NaOHの場合と同様
に、CPCに対して長時間曝露されることにより、他の一
般細菌と同様に死滅することが知られている。従って、
CPCにより前処理したサンプルを液体培地を使用して培
養する場合には、CPCによる静菌効果を中和することが
できる培地を使用することが必要である。しかし、これ
までに知られている液体培地の中には、CPCによる静菌
効果を中和することができるものは知られていなかっ
た。そのため、従来は、CPCにより前処理されたサンプ
ルについては、CPCの静菌効果を中和することができる
卵培地、例えば小川培地などの固型培地に接種しなけれ
ばならないという欠点を有していた。

【００１０】また、新結核菌検査指針2000の中では、M7
H9-Bを用いた変法として、MGIT（Mycobacteria Growth
Indicator Tube）法も推奨されている。この方法もま
た、検査期間の短縮には非常に効果を発揮し、非放射性
で、特殊な機器を必要とせず、かつ判定も容易であるな
ど利点が多い。しかし、当該液体培地中ではCPCの静菌
効果を中和することができないため、基本的にはサンプ
ルの前処理方法としてCPC法以外の方法を使用すること
しかできず、また試薬としてのコストが高いという問題
点が存在している。

【００１１】このような現状の下、現在の当該技術分野
においては、サンプル中に存在する結核菌以外の一般細
菌によるコンタミネーションをできるだけ効率よく防止
し、従来の固型培地を用いた結核菌の分離・培養方法よ
りも結核菌の検出をより確実かつ短期間に行うため、前
処理としてCPCを利用することができ、コストを抑えた
液体培地を開発することが求められている。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、液体培地に
おいて抗酸菌を培養する際に問題となるコンタミネーシ
ョンを効果的に防止し、かつ抗酸菌を従来の検出効率と
同等またはそれ以上の効率を維持しつつ検査期間を短縮
することができる、抗酸菌培養用液体培地を提供するこ
とを目的とする。本発明はさらに、CPCを主成分として
含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤に適合するための固
型培地と液体培地の組合せからなる抗酸菌培養用固型−
液体二相培地を提供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、M7H9-B培地か
らなる基本培地に、ヘミン、L-アスパラギン水和物、カ
ゼインペプトン、酵母エキス、オレイン酸を含むことを
特徴とする、改変M7H9-B培地を提供する。本発明の改変
M7H9-B培地は、さらに抗菌剤を添加して使用してもよ
い。本発明の改変M7H9-B培地は、従来のM7H9-B基本培地
と比較して、大幅な抗酸菌検出能向上という従来にない
効果を奏することができる。

【００１４】ここで、改変M7H9-B培地中に含まれるヘミ
ンは、イソニアジド（INH）耐性結核菌の分離向上のた
めに培地中に添加する。また、改変M7H9-B培地中に含ま
れるL-アスパラギン水和物、カゼインペプトン、酵母エ
キス、オレイン酸は、抗酸菌発育支持能向上のために培
地中に添加する。

【００１５】前述したように、抗酸菌自体もCPCに長時
間曝されることにより、死滅することが知られているた
め、長期間にわたる培養時においては、CPCによる静菌
効果を中和することが必要となる。しかし、液体培地で
あるM7H9-B基本培地には、このようなCPCによる静菌効
果を中和する作用が存在しない。一方、前述した全卵を
基礎とした培地は、CPCによる静菌効果を中和する効果
を有するが、液体培地のような効率的な抗酸菌の増殖を
期待することができない。

【００１６】そこで、本発明はまた、ビット培地上に、
前述した改変M7H9-B培地を重層させた、抗酸菌培養用固
型−液体二相培地（以下、単に二相培地という。）を提
供する。本発明で使用するビット培地は、全卵を基礎と
する固型培地である。本発明の前述した二相培地は、コ
ハク酸およびCPCを含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤
により処理されたサンプルに対して使用することができ
ることを特徴とする。M7H9-B培地に基づく改変M7H9-B培
地を、全卵を基礎とするビット培地上に重層することに
より、当該改変M7H9-B培地がビット培地と接触するた
め、改変M7H9-B培地中に含まれるサンプル前処理剤由来
のCPCがビット培地の作用により中和され、かつ、改変M
7H9-B培地中に抗酸菌を接種することができるので、当
該改変M7H9-B培地中で効率のよい抗酸菌の培養を実現す
ることができる。

【００１７】本発明は、上記の二相培地を用いた抗酸菌
の培養方法もまた提供する。この抗酸菌の培養方法で
は、上述したようなコハク酸およびCPCにより前処理さ
れたサンプルを培養することができる。本発明の培養方
法では、コハク酸およびCPCの処理を行う前に、サンプ
ルの粘性を低下させる処理を行ってもよい。本発明にお
いては、コハク酸およびCPCによる処理の後に遠心分離
を行って、目的とする抗酸菌を沈殿・濃縮した後に培養
することもできる。

【００１８】本発明においては、さらに改変M7H9-B培地
およびビット培地を含む抗酸菌培養キットを提供する。
この抗酸菌培養キットは、さらに抗菌剤を含んでいても
よい。もしくは、本発明においては、コハク酸およびCP
Cを含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤をさらに含む抗
酸菌前処理−培養キットもまた提供する。この抗酸菌前
処理−培養キットもまた、そのキット中にさらに抗菌剤
を含んでいてもよい。

【００１９】

【発明の実施の形態】抗酸菌培養用サンプル前処理剤お
よびそれを利用したサンプル前処理方法本発明では、まず、サンプル中に存在する抗酸菌以外の
一般細菌によるコンタミネーションを効果的に防止する
ため、抗酸菌培養用サンプル前処理剤（以下、単にサン
プル前処理剤という。）による処理を行う。このサンプ
ル前処理剤は、コハク酸および界面活性剤であるCPCを
含むことを特徴とする。このサンプル前処理剤は、抗酸
菌が、他の一般細菌と比較して、コハク酸およびCPCに
対して抵抗性であるという特徴を利用して、他の一般細
菌を死滅させることを目的としたものである。これによ
り、サンプル中の抗酸菌のみを選択的に回収することが
できる。このようなコハク酸およびCPCを使用するサン
プルの前処理方法を、本明細書の以下において「コハク
酸−CPC法」という。

【００２０】しかし、前述したように、抗酸菌自体もCP
Cに長時間曝されることにより、死滅することから、CPC
を用いてサンプルの前処理を行う場合には、他の一般細
菌に対する静菌効果を発揮でき、かつ抗酸菌に対する静
菌効果を発揮しないような条件下、例えばCPC濃度およ
びサンプル前処理剤反応時間などの条件下、において行
うことが必要である。抗酸菌を死滅させることはない
が、他の一般細菌は死滅させることができる程度のCPC
の濃度は、0.01〜1.0％、より好ましくは0.01〜0.2％、
最も好ましくは0.0375％である。また、サンプル中のコ
ハク酸濃度は、5％であることが好ましい。例えば、コ
ハク酸およびCPCを含むサンプル前処理剤は、以下の組
成：

【００２１】

【表１】

【００２２】を有することができる。そして、当該サン
プル前処理剤による処理時間は、好ましくは5〜60分
間、より好ましくは15〜30分間、最も好ましくは20分間
である。本発明の分離培養方法では、上述したコハク酸
−CPC法による処理を行う前に、サンプルの粘性を低下
させることを目的とする処理を行ってもよい。サンプル
の粘性を低下させることにより、サンプル中に混入する
抗酸菌以外の一般細菌に対するサンプル前処理剤の静菌
効果をより効率よく発揮することができる。サンプルの
粘性を低下させる処理としては、セミアルカリプロテア
ーゼによる処理があげられるがこれには限定されない。
サンプル前処理においてセミアルカリプロテアーゼを使
用した場合、そのサンプル溶液中のセミアルカリプロテ
アーゼ濃度および処理時間は、サンプルの粘性に応じて
当業者が適宜決定することができるが、通常、0.125〜
1.0％、より好ましくは0.125〜0.5％、最も好ましくは
0.25％の濃度、および1〜10分間、より好ましくは5〜10
分間、最も好ましくは10分間である。

【００２３】サンプル前処理剤による処理を行う前に、
セミアルカリプロテアーゼ処理に加えて、NALC-NaOH処
理を行ってもよい。このNALC-NaOH処理の手順は、新結
核菌検査指針2000に記載されるNALC-NaOH法の手順に準
じて行うことができる。このNALC-NaOH処理では、NALC
の作用によりサンプルの粘性を低下させる効果を得られ
る他、NaOHの作用により一般細菌に対する静菌効果を得
ることもできる。NALC-NaOHのサンプル溶液中濃度およ
び処理時間は、サンプルの粘性、検体量に応じて当業者
が適宜決定することができるが、通常、1〜5％、より好
ましくは1〜3％、最も好ましくは1％の濃度で、そして1
0〜30分間、より好ましくは15〜20分間、最も好ましく
は15分間である。

【００２４】セミアルカリプロテアーゼ処理したサンプ
ル、もしくはセミアルカリプロテアーゼ処理およびNALC
-NaOH処理したサンプルは、遠心分離して目的とする抗
酸菌を沈殿・濃縮した後にサンプル前処理剤による処理
に供してもよい。遠心分離の条件は、抗酸菌が沈殿し、
かつ抗酸菌を破壊しない程度の条件を当業者が適宜選択
することができ、好ましくは、2000〜3000×gで10〜30
分間、より好ましくは2000〜3000×gで15〜20分間、最
も好ましくは3000×gで20分間である。サンプルの遠心
分離を行う前に、リン酸緩衝液などの緩衝液を添加して
もよい。

【００２５】本発明の分離培養方法において処理するサ
ンプルは、粘性が高く、抗酸菌以外の一般細菌が混入し
ているサンプル、例えば、喀痰、気管支ファイバー下擦
過サンプル、気管支肺胞、胃内容物などが該当するが、
これらに限定されない。

【００２６】抗酸菌選択分離培地およびそれを利用した
抗酸菌培養方法サンプル前処理剤で処理したサンプルは、その後、通常
の固型培地である2％小川培地、または後述する本発明
の二相培地のいずれにも接種することができる。ここで
2％小川培地とは、以下の組成：

【００２７】

【表２】

【００２８】を有する培地を、90℃で1時間かけて凝固
滅菌し、固型化したものをいう。また、ビット培地と
は、上記組成を有する2％小川培地に対して、さらにSTC
を150 mg添加し、90℃で1時間かけて凝固滅菌し、固型
化したものである。ここでSTCとは、2,3ジフェニル-5-
チエニル-（2）-テトラゾリウムクロリドをいう。

【００２９】本発明において使用するM7H9-B基本培地
は、蒸留水1 Lあたり以下の組成を有する。

【００３０】

【表３】

【００３１】本発明は、上記M7H9-B培地を改良して大幅
に抗酸菌検出能を向上した改変M7H9-B培地を提供する。
本発明の改変M7H9-B培地は、上記M7H9-B培地に対して、
さらに以下の組成：

【００３２】

【表４】

【００３３】を含むことを特徴とする。ここで、ヘミン
は、イソニアジド（INH）耐性結核菌の分離向上のため
にM7H9-B培地中に添加する。また、L-アスパラギン水和
物、カゼインペプトン、酵母エキス、オレイン酸は、抗
酸菌発育支持能向上のためにM7H9-B培地中に添加する。

【００３４】本発明の改変M7H9-B培地には、さらに抗菌
剤を添加して使用してもよい。本発明の改変M7H9-B培地
に添加して使用することができる抗菌剤は、アンホテリ
シンB、シクロヘキシミド、ポリミキシンB、ナリジキシ
ン酸、トリメトプリム、アズロシリンなどから選択する
ことができる。より好ましくはアンホテリシンBおよび
シクロヘキシミドを使用する。改変M7H9-B培地中に使用
する抗菌剤の濃度は、当業者が適宜決定することができ
るが、本発明の場合、例えば、以下の組成：

【００３５】

【表５】

【００３６】の抗菌剤を使用する。本発明の二相培地
は、斜面状に固型化したビット培地上に、上述した改変
M7H9-B培地または抗菌剤を含む改変M7H9-B培地を重層す
ることにより作成する。ビット培地の培地量と改変M7H9
-B培地の培地量は、後に添加するサンプル中のCPC量に
応じて、当業者が適宜決定することができる。好ましい
態様としては、例えば、試験管内で固型化された7 mlの
ビット培地に対して、3 mlの改変M7H9-B培地を重層し、
そして、この二相培地に抗酸菌のサンプルを0.1 ml添加
することができる。以下において、この方法を「二相培
地法」と呼ぶ。

【００３７】サンプルを接種した改変M7H9-B培地または
二相培地は、キャップを閉めた状態で37℃にて培養す
る。培養日数は、接種後8週間を目安とする。臨床検査
の現場においては、当該改変M7H9-B培地もしくは二相培
地におけるサンプルの培養と平行して、従来の固型培地
による抗酸菌の培養を行ってもよい。

【００３８】抗酸菌培養キットおよび抗酸菌前処理−培
養キット本発明においては、改変M7H9-B培地およびビット培地を
組み合わせて、抗酸菌培養キットを提供することができ
る。この抗酸菌培養キットには、さらに抗菌剤を含んで
もよい。改変M7H9-B培地は、例えば表３に記載した組成
を有するM7H9-B基礎培地に表４に記載した成分をさらに
加えた組成を有することができる。また抗菌剤は、当業
者が適宜決定することができるが、例えば表５に記載の
組成を有することができる。

【００３９】本発明においては、また、コハク酸および
CPCを含むサンプル前処理剤、改変M7H9-B培地およびビ
ット培地を含む、抗酸菌前処理−培養キットを提供す
る。サンプル前処理剤に含まれるコハク酸およびCPCの
濃度は、当業者が適宜決定することができるが、例えば
5％コハク酸および0.0375％CPCを含むサンプル前処理剤
を使用することができる。

【００４０】

【実施例】以下に、本発明のコハク酸−CPC法−二相培
地法の効果を、従来から存在する他の方法と比較して説
明する。これらの実施例は本発明を具体的に説明するた
めだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意
図しているものではない。

【００４１】実施例１：サンプル前処理方法の検討実施例１では、コハク酸−CPC法により前処理した場合
の抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数、および一般細菌
汚染率について、他法との比較を行った。

【００４２】本発明で使用するサンプル前処理法である
コハク酸−CPC法は、以下の手順に従って行われる。ま
ず、喀痰サンプル（1 ml）に3倍量の0.25％セミアルカ
リプロテアーゼを添加し、十分に攪拌した後、室温（20
〜25℃）において10分間反応させる。次いで、喀痰サン
プルの2倍量のNALC-NaOHを添加し、十分に攪拌した後、
室温（20〜25℃）において15分間反応させる。これに滅
菌リン酸緩衝液（pH 6.8）を全量で50 mlとなるように
添加してNaOHを中和した後、3000×gで20分間遠心分離
し、抗酸菌を沈渣として回収する。この沈渣に5％のコ
ハク酸と0.0375％のCPCとを含む0.5 mlのサンプル前処
理剤を添加し、20分間反応させる。この前処理をしたサ
ンプルを二相培地に接種し、抗酸菌検出率、抗酸菌平均
検出日数および一般細菌汚染率を得た。

【００４３】本実施例においては、二種類の比較対照を
設定した。1つ目の比較対照として、前述の前処理と同
様にコハク酸−CPC法により前処理したサンプルを、固
型培地であるビット培地上に塗抹し、抗酸菌検出率、抗
酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率を得た。

【００４４】また、2つ目の比較対照としては、新結核
菌検査指針2000に基づき、NALC-NaOH法により前処理し
た喀痰を用いて、MGIT法により分離培養し、抗酸菌検出
率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率を得た。
NALC-NaOH法は、具体的には、以下の手順に従って行わ
れる。まず、喀痰サンプル（1 ml）に2倍量のNALC-NaOH
を添加し、十分に攪拌した後、室温（20〜25℃）におい
て15分間反応させる。これにリン酸緩衝液（pH 6.8）を
全量で50 mlとなるように添加してNaOHを中和した後、3
000×gで20分間遠心分離し、抗酸菌を沈渣として回収す
る。この沈渣を0.5 mlの滅菌リン酸緩衝液で再懸濁し、
MGIT培地に0.5 mlを接種する。

【００４５】MGIT法は、M7H9-B液体培地を含むMGIT試験
管底部に設置されたシリコン中に、培地中の溶存酸素に
対して感受性の蛍光化合物が包埋されており、液体培地
中で抗酸菌の増殖に伴い活発な酸素消費が行われると、
紫外線を照射した際に上記蛍光化合物が蛍光を発すると
いう原理に基づく方法である。

【００４６】塗抹陽性喀痰20サンプルを用いた抗酸菌検
出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率の結果
を以下の表に示す。

【００４７】

【表６】

【００４８】抗酸菌検出率（％）は、本発明の二相培地
で培養した場合、他の対照方法により培養した場合と同
様に、抗酸菌を検出することができることがわかった。
抗酸菌平均検出日数（日）は、抗酸菌の菌種によっても
若干異なるが、コハク酸−CPC法により前処理したサン
プルでは、NALC-NaOH法により前処理したサンプルと比
較して、平均検出日数が長くなっていた。これは、コハ
ク酸−CPC法におけるコハク酸およびCPCによる、抗酸菌
の増殖抑制作用に基づいていると考えられる。

【００４９】一般細菌汚染率については、NALC-NaOH法
により前処理した場合には10％の汚染率であったが、コ
ハク酸−CPC法によれば、汚染率は0％であった。これら
の結果から、本発明においては、サンプルに混入した一
般細菌を死滅させるため、コハク酸およびCPCを包含す
るサンプル前処理剤を使用することとした。しかし、こ
のコハク酸−CPC法および二相培地による本発明の培養
方法によれば、抗酸菌平均検出日数が、NALC-NaOH法に
よる前処理の後MGIT法により培養する従来から使用され
る培養方法よりも長くかかることから、サンプル前処理
剤の構成成分のうち、抗酸菌の増殖に特に影響を与える
と考えられるCPCの濃度を減少させるべく、以下に検討
を加えた。

【００５０】実施例２：サンプル前処理剤の改良サンプル前処理剤は、コハク酸とCPCとを構成成分とし
て含む。このうち、コハク酸については濃度を5％に設
定し、種々の菌種に対する増殖抑制効果を検討した。CP
Cについては、特に抗酸菌の増殖に強い影響を与えるこ
とが考えられるため、種々の菌種毎に、10⁷ CFU/mlの各
細菌の増殖を抑制することができる最小CPC濃度を検討
した。

【００５１】本実施例でCPCおよびコハク酸による前処
理の対象としたのは、喀痰中に存在する一般細菌のう
ち、以下のもの：E. faecalis（ATCC19433、ATCC51299、ATCC29212）S. aureus（ATCC29213）S. pyogenes（ATCC19615）E. coli（ATCC25922）B. subtilis（ATCC6633）P. aeruginosa（ATCC27853）の8種類である。これらのそれぞれの細菌について、10⁷
CFU/mlの細菌の増殖を抑制することができる最小CPC濃
度および5％コハク酸による静菌効果を検討した。

【００５２】コハク酸−CPC法の手順は、添加するサン
プル前処理剤のうちCPCの濃度を除き、実施例１におい
て記載した方法と同一の方法により行った。

【００５３】

【表７】

【００５４】P. aeruginosa（ATCC27853）以外の細菌
は、0.002〜0.006％と非常に低いCPC濃度で増殖を抑制
することができることが確認された。また、P. aerugin
osa（ATCC27853）は、0.013％と他の菌種と比較して、
増殖抑制のために高い濃度のCPCが必要とされるが、5％
コハク酸の作用により増殖抑制をすることができること
が明らかになった。

【００５５】この結果、サンプル前処理剤による抗酸菌
増殖抑制効果を低減するため、コハク酸と組み合わせる
ことにより、サンプル前処理剤中のCPC濃度を下げるこ
とが可能であることがわかった。

【００５６】実施例３：臨床材料からの抗酸菌の検出本実施例においては、実際に臨床材料として集められた
喀痰サンプルについて、本発明のコハク酸−CPC法によ
り前処理した場合の抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日
数、および一般細菌汚染率について、他法との比較を行
った。

【００５７】サンプルの前処理は、添加するサンプル前
処理剤のうちCPCの濃度を除き、実施例１において記載
した方法と同一の方法により行った。この前処理をした
サンプルを本発明の二相培地に接種し、それぞれのサン
プルについて、抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数およ
び一般細菌汚染率を得た。

【００５８】本実施例においては、三種類の比較対照を
設定した。1つ目の比較対照として、コハク酸−CPC法に
より前処理したサンプルを、固型培地であるビット培地
上に塗抹し、抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および
一般細菌汚染率を得た。

【００５９】また、2つ目の比較対照としては、実施例
１に記載した方法と同一の方法により、NALC-NaOH法−M
GIT法により抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および
一般細菌汚染率を得た。

【００６０】さらに、3つ目の比較対照として、NALC-Na
OH法により前処理したサンプルを、固型培地であるビッ
ト培地上に塗抹し、抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数
および一般細菌汚染率を得た。

【００６１】喀痰100サンプルを用いた抗酸菌検出率、
抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率の結果を以下
の表に示す。

【００６２】

【表８】

【００６３】表８は、抗酸菌検出率について4種類の前
処理方法−培養方法を対比した結果を示している。この
結果、本発明の方法であるコハク酸−CPC法−二相培地
法による培養が最も高い検出能を示すことが明らかにな
った。すなわち、塗抹の結果、陽性と判定された全ての
サンプルについて、コハク酸−CPC法−二相培地法の培
養方法で検出することができた。また、塗抹の結果、陰
性と判定されたサンプル中からも、5サンプルの全てに
ついて陽性の判定が得られた。

【００６４】

【表９】

【００６５】表９は、抗酸菌平均検出日数について4種
類の前処理方法−培養方法を対比した結果を示してい
る。この結果から、実施例１に記載したようにコハク酸
−CPC法において使用するCPC濃度を検討した結果、本発
明の方法であるコハク酸−CPC法−二相培地法による培
養がMGIT法と同等の日数で抗酸菌を検出することができ
ることが示された。

【００６６】

【表１０】

【００６７】表１０は、一般細菌汚染率について4種類
の前処理方法−培養方法を対比した結果を示している。
この結果から、コハク酸−CPC法で前処理することによ
り、NALC-NaOH法で前処理した場合と比較して、有意に
一般細菌汚染率を低下させることができることが示され
た。

【００６８】上記の抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数
および一般細菌汚染率の結果から、抗酸菌を検出するた
めの対比した他法および従来からの塗抹により抗酸菌を
検出する方法と比較した場合、本発明のコハク酸−CPC
法−二相培地法による検出方法が優れていることが示さ
れた。

【００６９】実施例４：分離された抗酸菌の同定本実施例では、本発明のコハク酸−CPC法−二相培地法
で培養されたサンプル中の抗酸菌について、培養後に菌
種の同定に移行することが可能かどうかについて検討し
た。

【００７０】本実施例においては、NALC-NaOH法−MGIT
法により培養した抗酸菌を対照として使用した。培養さ
れた抗酸菌の同定は、DNAプローブテストにより行っ
た。DNAプローブテストは、抗酸菌中に存在するリボソ
ームRNA（rRNA）を、このrRNAの配列に相補的な配列を
有する標識DNAプローブを用いて検出する方法である。
具体的なDNAプローブテストの手順は、新結核菌検査指
針2000に記載された手順に従った。

【００７１】DNAプローブテストの原理は次の通りであ
る。抗酸菌が有するrRNAの遺伝子配列のうち、抗酸菌の
それぞれの菌種に特異的な配列部分が知られている。こ
のような特異的な配列部分に対して相補的な配列を有す
るDNAプローブをアクリジニウムエステル（AE）で標識
し、被検サンプルから抽出したrRNAとDNAプローブとの
間でハイブリダイゼーションを行う。次いで、テトラホ
ウ酸ナトリウムで加水分解することにより、未反応のDN
AプローブのAE部分のみを特異的に分解・失活させる。
その結果、AE部分はハイブリッド内部に取り込まれたも
ののみとなるため、AE部分からの化学発光を検出するこ
とにより抗酸菌由来のrRNAが存在していることを示すこ
とができる。

【００７２】コハク酸−CPC法−二相培地法により分離
された抗酸菌株およびNALC-NaOH法−MGIT法により分離
された抗酸菌株について、DNAプローブテストを行った
結果を以下の表に示した。第1回のDNAプローブテストで
同定できなかった株については、第2回目のDNAプローブ
テストを行い、同定を行った。

【００７３】

【表１１】

【００７４】この結果、第1回目のDNAプローブテスト
で、ほぼ全てのコハク酸−CPC法−二相培地法により分
離された株の同定が可能であることがわかった。これは
対照として使用したNALC-NaOH法-MGIT法により分離され
た株を同様にDNAプローブテストにより同定した場合
と、同等またはそれ以上の効率であった。

【００７５】

【発明の効果】本発明により、液体培地において抗酸菌
を培養する際に問題となるコンタミネーションを効果的
に防止し、かつ抗酸菌を従来の検出効率と同等またはそ
れ以上の効率を維持しつつ検査期間を短縮することがで
きる、抗酸菌培養用液体培地を提供することができた。
本発明により、さらに、CPCを主成分として含む抗酸菌
培養用サンプル前処理剤に適合するための固型培地と液
体培地の組合せからなる抗酸菌培養用固型−液体二相培
地を提供することができた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B065 AA36X AC05 BB04 BB08 BB10 BB12 BB19 BB29 BB37 BD13 BD22 BD25 BD29

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ミドルブルック7H9ブロス（M7H9-B培
地）からなる基本培地に、L-アスパラギン水和物、カゼ
インペプトン、酵母エキス、オレイン酸、ヘミンを含む
ことを特徴とする、抗酸菌培養用液体培地である改変M7
H9-B培地。
【請求項２】さらに抗菌剤を添加することを特徴とす
る、請求項１に記載の改変M7H9-B培地。
【請求項３】抗菌剤がアンホテリシンBおよびシクロ
ヘキシミドである、請求項２に記載の改変M7H9-B培地。
【請求項４】ビット培地上に、請求項１〜３のいずれ
か１項に記載の抗酸菌培養用液体培地を重層させた、抗
酸菌培養用の二相培地。
【請求項５】コハク酸およびセチルピリジニウムクロ
ライドを含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤により処理
されたサンプルに対して使用することができることを特
徴とする、請求項４に記載の二相培地。
【請求項６】サンプルを請求項４または５に記載の二
相培地上で培養する、抗酸菌培養方法。
【請求項７】コハク酸およびセチルピリジニウムクロ
ライドを含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤により処理
されたサンプルに対して使用することができることを特
徴とする、請求項６に記載の抗酸菌培養方法。
【請求項８】請求項１〜３のいずれか１項に記載の改
変M7H9-B培地、およびビット培地を含む、抗酸菌培養キ
ット。
【請求項９】さらに抗菌剤を含む、請求項８に記載の
抗酸菌培養キット。
【請求項１０】コハク酸およびセチルピリジニウムク
ロライドを含む抗酸菌培養用のサンプル前処理剤、およ
び請求項８または９に記載の抗酸菌培養キットからな
る、抗酸菌前処理−培養キット。