JP2002155103A

JP2002155103A - エンドトキシンフリーのβ１，３−グルカン及びその製造法並びに医療用ゲル素材

Info

Publication number: JP2002155103A
Application number: JP2001311970A
Authority: JP
Inventors: Katsunori Yoshida; 克典吉田; Toshio Hariki; 利男梁木; Michihiro Yamaguchi; 道広山口
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2001-10-09
Publication date: 2002-05-28

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、エンドトキシンフリーのβ−１，
３グルカン及びβ−１，３グルカン中のエンドトキシン
を分解不活化する方法を提供することを目的とする。【構成】本発明のエンドトキシンフリーのβ１，３グ
ルカンは、エンドトキシンの含有量が０．１ＥＵ／ｇ以
下であることを特徴とする。また、本発明の製造法は、
β１，３グルカンに酸もしくは塩基を含む有機溶媒を加
え、処理温度が室温であることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エンドトキシンフリー
（エンドトキシンを不活性化）のβ−１，３グルカン及
びその製造法並びに医療用ゲル素材に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、バイオテクノロジーの進歩によ
り、微生物やヒト、動物または植物組織などの細胞を培
養して、細胞内外の有用物質を効率的かつ大量に得る技
術が実用化されつつある。これら技術のうち特定の微生
物を用いた微生物培養法はすでに、多くの分野で工業的
に利用されている。β−１，３グルカンは微生物等が産
生するグルコースの重合体であり、このうち直鎖状のも
のはカードランとして知られている。カードランは水不
溶性であるが、その分散液を加熱することによりゲルを
調製することができる。カードランゲルはオートクレー
ブによる１２１℃の加熱滅菌に耐えるため、滅菌の必要
な医療用ゲルに好適である。我々はすでに、カードラン
ゲルを用いた超音波診断機プローブ用スタンドオフ材の
発明に成功している。

【０００３】しかしながら、上記のような細胞・微生物
培養では菌体や培地に由来する不純物を完全に取り除く
には、非常に煩雑な操作を伴い、物質によっては実質的
に困難なものもある。不純物のうちでも、特にエンドト
キシンは近年、その毒性が問題となっている。エンドト
キシンは菌体内毒素とも呼ばれ、グラム陰性菌によって
普遍的に産成され得ることが知られている。エンドトキ
シンは強力な発熱性物質であり、注射などによりヒト体
内に運び込まれると悪寒や発熱を惹起する。また、血管
拡張、下痢及び類似症及び極端な場合には致命的ショッ
クの徴候を伴う原繊維反応を生ずることが知られてい
る。そのほか、エンドトキシンは白血球増多症、炭水化
物及び蛋白質代謝における有害な変化及び繊維素形成に
よる広くひろがった脈管内閉塞を起こすことも知られて
いる。従って、エンドトキシンの効率の良い除去法・不
活化法が切望されている。従来、エンドトキシンを除去
する方法として特定の吸着剤に接触させての吸着除去す
る方法（特公昭５２−１０２４１４号公報、特開昭６０
−１５０８８７号公報、特公平１−１６３８９号公報、
特開平３−１０９３９７号公報、特公平６−４１４７９
号公報、特公平６−２２６２３号公報）が、もっとも一
般的に知られている。そのほか、逆浸透膜による除去法
（特開昭５３−６４９４８号公報）、加熱による不活化
法（特開平２−１４１６６６号公報）、綿繊維を酸もし
くはアルカリ性の有機溶媒存在下で加熱し不活化する方
法（米国特許第４８３２７５１号）等も開示されてい
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
エンドトキシン吸着除去法ではいずれも、対象物質を水
溶液とする必要があり、水溶性のβ−１，３グルカンは
非常に高粘度となるため、効率が著しく悪い。また、カ
ードランは水に不溶なため、実質的に上記方法は利用で
きない。また、蒸留法、逆浸透膜法では、上記理由のほ
か、エネルギーコストや設備費、操作性等の点で十分に
満足できない。一方、加熱によるエンドトキシンの不活
化法では、６０℃以上で少なくとも６０分加熱するよう
に開示されているが、本条件ではカードランは流動性の
ないゲルを形成するため、その後の操作に図ることが出
来ない。酸もしくはアルカリ性の有機溶媒下で加熱し不
活化する方法では、６０℃から８０℃の加熱を行うが、
加熱操作を経ることにより、β−１，３グルカンは褐変
を起こすのみならず、ゲル化能の低下が認められる。

【０００５】本発明は上記従来の問題点を解決し、β−
１，３グルカン中のエンドトキシンを分解不活化する方
法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らはβ−１，３
グルカン中のエンドトキシンを分解不活化する方法につ
いて鋭意探求を行ったところ、β−１，３グルカンに酸
もしくは塩基を含む有機溶媒を加え、室温で処理するこ
とにより、効率よくエンドトキシンが不活化されること
を見い出し本発明を完成した。

【０００７】即ち、本発明のエンドトキシンフリーのβ
１，３−グルカンは、エンドトキシンの含有量が０．１
ＥＵ／ｇ以下であることを特徴とする。また、本発明の
エンドトキシンフリーのβ１，３−グルカン製造法は、
β１，３−グルカンに酸もしくは塩基を含む有機溶媒を
加え、処理温度が室温であることを特徴とする。本発明
の医療用ゲル素材は、エンドトキシンの含有量が０．１
ＥＵ／ｇ以下のβ１，３−グルカンを主成分とすること
を特徴とする。

【０００８】以下に、本発明を詳細に説明する。

【０００９】

【作用】本発明の対象物質となるβ−１，３グルカン
は、Ｄ−グルコース残基が、β１→３結合で連なったグ
ルカンのことであり、自然界には、酵母・カビの細胞壁
の骨格構造物として、また多くの担子菌子実体の主要な
多糖成分として存在している。酵母グルカンには水、ア
ルカリに不溶性であるが、わずかのβ１→６結合の枝分
かれがあるといわれている。担子菌の子実体、或いは細
胞外に生成されるβ−１，３グルカンは水溶性で、多く
の場合主鎖を構成するβ１→３結合のグルコース残基３
個のうち１個に１個のグルコース残基がβ１→６結合で
ついている（スクレログルカン）。最近の研究でβ−
１，３グルカンの示す抗腫瘍効果が注目されているが、
これはマクロファージの活性化によるものと推定されて
いる。細菌の中にも細胞外にβ−１，３グルカン（カー
ドラン）をつくるものが見いだされている。

【００１０】カードランは直鎖状のβ−１，３グルカン
であり、その水分散液は加熱により低濃度でも、強固な
ゲルを形成することから、高含水率水性ゲルの調製に有
利である。その他のβ−１，３グルカンでは、側鎖が多
いほど水溶性が高いが、マイルドスミス分解等の方法に
より側鎖を間引くことにより水不溶性となり、加熱によ
りゲルを形成する性質を持ち始める（ＰｏｌｙＪ．
１３（１２）１１３５−１１４３（１９８１））。加熱
調製したゲルは、１２１℃のオートクレーブ滅菌にも耐
え、無菌化も比較的容易であるとともに、仮に体内に留
置された場合でも長時間かけて生体内で徐々に分解され
る性質を有する（薬学雑誌１１０（１０）８６９
−８７５，１９９０）。これらのことより、β−１，３
グルカンゲルは、医療用ゲル素材として優れた性質を有
すると考えられる。これら性質を生かし、本発明者らは
すでに、β−１，３グルカンゲルを用いた超音波診断機
プローブ用スタンドオフ材の開発に成功している。すな
わち、超音波診断を行う場合、体表面もしくは臓器表面
に直接超音波診断装置のプローブを当てて内部の状態を
観察しようとした際に超音波診断装置の特性上、表面下
数ｃｍ以内の領域での鮮明な画像を得ることは非常に困
難である。また、実際の体・臓器表面は平らな状態では
なく、各々に特徴的な湾曲・凹凸を持つことになるた
め、ある一定の形態を保った不可変なプローブでは目的
の部位に密着させることは不可能である。生体とプロー
ブの間に空気が介在すると超音波伝播率の著しい低下が
起こり、診断機上に正確な画像を結ばなくなる。そこ
で、プローブと生体との間に適当なスペーサー（スタン
ドオフ材）を介在せしめることが有効であり、β−１，
３グルカンゲルを用いたスタンドオフ材は、超音波特
性、安全性の点から非常に好適である。スタンドオフ材
の利用は、体表面からの診断のみならず、穿刺・術中へ
の応用が期待されている。このような場合には、術中の
事故によりゲルが体内に留置されたり、また、積極的に
体内にスタンドオフ材を留置し術後の経過観察に利用さ
れたりする。また、近年、蓄膿症の術後では一時的な整
形基材として、美容形成等の分野では合成高分子に変わ
る安全な天然のゲル素材が求められており、このような
利用用途にも同ゲルは期待されている。しかしながら、
β−１，３グルカンは微生物培養等によって調製される
ため、エンドトキシンの混入が避けられない。微量に混
在するエンドトキシンが発熱等人体に好ましくない影響
を与える可能性があり、エンドトキシンフリーの基材が
望まれていた。

【００１１】本発明のエンドトキシン不活化法は、酸も
しくは塩基を含む水溶性の有機溶媒をβ−１，３グルカ
ンに加え、６０℃以下で攪拌することを特徴とする。す
なわち、通常の工業レベルで使用されるアルコール等の
溶媒が使用でき、これらは含水物であってもなんら処理
に問題はない。また、酸もしくは塩基も特殊な試薬を必
要とせず、代表例として塩酸や水酸化ナトリウムが挙げ
られる。処理温度としては、これまで加熱によりエンド
トキシンの分解を促進する方法がとられてきたが、本発
明によれば、驚くべきことに加熱することなく、充分に
目的の達せられることが明らかとなった。すなわち、特
開平２−１４１６６６号公報で開示された方法では６０
℃以上、好ましくは１００℃で６０分間もの処理が必要
であり、米国特許第４８３２７５１号明細書に開示され
ているコットン中のエンドトキシン不活化法でも６０か
ら８０℃の加熱を要する。コットンはセルロースからな
り、その基本構造は、Ｄ−グルコースがβ１→４結合で
連なったものである。セルロース分子は結晶化度が非常
に高く、処理液が分子内部まで到達し、内部のエンドト
キシンを不活化するのに加熱のエネルギーを要するもの
と考えられる。一方、β−１，３グルカンは類似の基本
構造を示すが、セルロースよりも結晶化度が低いため、
室温でも十分に処理が可能であると考えられる。多糖類
は酸もしくは塩基の存在下で加熱することにより、容易
に加水分解し主鎖の切断が起こる。主鎖の切断は低分子
化を招き、本来の高分子に由来する性質の減弱を引き起
こす。すなわち、β−１，３グルカンの場合には、ゲル
化能の低下が認められ、調製されるゲルは硬く脆いもの
となってしまうばかりか、極端な場合には全くゲル化能
を失う。また、低分子化に伴う反応として褐変・着色も
認められる。

【００１２】本発明により処理されたβ−１，３グルカ
ン中のエンドトキシン量は、ＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ
ＡｍｅｂｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅ）を用いたエンドト
キシン検出法で定量が可能である。例えば、和光純薬製
ＬＡＬＳ試薬（ＬｉｍｕｌｕｓＥＳーＪＴｅｓｔ
ＷＡＫＯ）では、凝固因子となりうるβ−１，３グルカ
ンの影響を排除して定量が可能である。すなわち、β−
１，３グルカンを注射用水に溶解または分散し、溶解し
ないものは遠心分離等の操作により除去する。試験溶液
に、一定量のＬＡＬ試薬を添加し、トキシノメーター
（ＴＯＸＩＮＯＭＥＴＥＲＥＴ−２０１，ＷＡＫ
Ｏ）により、ゲル化に要する時間からエンドトキシン量
を定量する。

【００１３】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらによりなんら限定されるもの
ではない。（実施例１）カードラン粉末（武田薬品工業製）５重量
部に、１００重量部の９５％エタノールと０．４重量部
の水酸化ナトリウムを加え、マグネチックスターラーで
室温にて１時間攪拌した。その後、中和等量となる塩酸
を加え、続けて１０分間攪拌し完全に中和した。デカン
テーションにより上澄みを捨て、更に１００重量部の９
５％エタノールを加えて処理粉末の洗浄を行った。放置
後、デカンテーションにより上澄みを捨て乾燥し、エン
ドトキシンフリーのカードランを得た。上記、エンドト
キシンフリーのカードラン１重量部をとり、２０重量部
の注射用水（大塚製薬製）を加え、クリーンベンチ内で
３０分間攪拌した。ＬＡＬ法により上澄み中のエンドト
キシンを定量したところ、検出限界の０．０２ＥＵ／ｍ
ｌ（ＥｎｄｏｔｏｘｉｎＵｎｉｔ）以下であった。

【００１４】上記エンドトキシンフリーのカードラン
を、５重量部とり９５重量部の生理食塩水（光製薬製）
加えホモジナイザー（日本精機製；パワーホモジナイザ
ーＰＭ１）で１０分間攪拌した。上記カードラン分散液
を真空下で充分に脱気後、型に注入し１００℃、１０分
間の加熱によりゲル化を行った。冷却し型から取り出し
た後、高圧加熱滅菌器で１２１℃、２０分間の加熱を行
った。レオメーター（不動工業（株）製；ＮＲＭ−２０
１０Ｊ−ＣＷ）で物性を測定したところ、破断強度
３．５ｘ１０³ｇ・ｆ／ｃｍ²、ヤング率６．５ｘ１０⁶
ｄｙｎ／ｃｍ²を示した。

【００１５】（実施例２）レンチナン粉末（味の素製）
３重量部に１００重量部の９０％アセトンと０．１重量
部の酢酸を加え、超音波洗浄機（東京超音波機器製；Ｕ
Ｃ−０５１５）で室温にて３０分間処理を行った。その
後、中和等量となる水酸化カリウムを加え、更に１０分
間の超音波洗浄を行った。デカンテーションにより上澄
みを捨て、更に１００重量部の９０％アセトンを加えて
処理粉末の洗浄を行った。放置後、デカンテーションに
より上澄みを捨て乾燥し、エンドトキシンフリーのレン
チナンを得た。実施例１と同様にしてエンドトキシンを
定量したところ、検出限界以下であった。（実施例３）スクレログルカン（三栄源エフエフアイ
製）１０ｇをを０．０３ＭＮａＩＯ４，１０リットル
に溶解し、５℃で５日間放置した。次に、エチレングリ
コール５００ｍｌを加え攪拌後、５℃で２日間透析し
た。透析内液にアンモニア水を加え弱アルカリ性とした
後に、５ｇのＮａＢＨ₄を加え放置した。次に、１Ｎ酢
酸で中和後、５℃で再び流水透析し、エバポレーターで
濃縮乾固した。こうして調製した粉末をβ−１，３グル
カナーゼで分解し、その分解液をＮｏ．５０のロ紙（東
洋ロ紙）上にスポットし、ｎ−ブタノール／ｉｓｏ−プ
ロパノール／水＝３：１２：４で展開したところ、本品
はスクレログルカンのβ−１，６結合した側鎖が、全体
の約９５％間引かれたカードラン様のβ−１，３グルカ
ンであることが明かとなった。上記処理済みスクレログ
ルカン７重量部に１００重量部のアセトニトリルと０．
０５重量部の硫酸を加え、マグネチックスターラーで室
温にて２時間攪拌した。その後、中和等量となる水酸化
ナトリウムを加え、続けて１０分間攪拌し完全に中和し
た。デカンテーションにより上澄みを捨て、更に１００
重量部の９５％エタノールを加えて処理粉末の洗浄を行
った。放置後、デカンテーションにより上澄みを捨て乾
燥し、エンドトキシンフリーの側鎖の間引かれたスクレ
ログルカンを得た。実施例１と同様にしてエンドトキシ
ンを定量したところ、検出限界以下であった。

【００１６】（比較例１）カードラン粉末（武田薬品工
業製）５重量部に、１００重量部の注射用水を加え、マ
グネチックスターラーで室温にて１時間攪拌した。放置
後、上澄みをとり、実施例１と同様にしてエンドトキシ
ンを定量したところ、１２６．７ＥＵ／ｍｌであった。

【００１７】（比較例２）１０重量部のカードランに５
００ｍｌの９５％エタノールと１．０ｇの水酸化ナトリ
ウムを加え、８０℃で１時間放置した。放置後、溶媒を
吸引ろ過により除去し、粉末を５００ｍｌの９５％エタ
ノールで洗浄した後、乾燥した。調製された粉末は、褐
色を帯びたものとなった。実施例１と同様にして、ゲル
を調製し物性を測定したところ、破断強度１．１ｘ１０
²ｇ・ｆ／ｃｍ²、ヤング率４．９ｘ１０⁷ｄｙｎ／ｃ
ｍ²を示し、実施例１のカードランゲルに比較し、硬く
脆いゲルとなっていることが分かった。

【００１８】（比較例３）カードラン粉末（武田薬品工
業製）５重量部に、１００重量部の９５％エタノールを
加え、マグネチックスターラーで室温にて１時間攪拌し
た。デカンテーションにより上澄みを捨て、更に１００
重量部の９５％エタノールを加えて処理粉末の洗浄を行
った。放置後、デカンテーションにより上澄みを捨て乾
燥し、カードラン粉末を得た。上記のカードランについ
て、実施例１と同様にエンドトキシンを定量したとこ
ろ、８８．４ＥＵ／ｍｌであった。

【００１９】（実施例４）実施例１で調製したエンドト
キシンフリーのカードラン３重量部に生理食塩水９７重
量部を加え、ホモジナイザーで１０分間攪拌した。上記
カードラン分散液を真空下で充分に脱気後、型に注入し
１００℃、１０分間の加熱によりゲル化を行った。冷却
し型から取り出した後、高圧加熱滅菌器で１２１℃、２
０分間の加熱を行った。レオメーター（不動工業（株）
製；ＮＲＭ−２０１０Ｊ−ＣＷ）で物性を測定したとこ
ろ、破断強度１．８ｘ１０³ｇ・ｆ／ｃｍ²、ヤング率
３．８ｘ１０⁶ｄｙｎ／ｃｍ²を示した。上記のように調
製したゲルについて音響特性を測定した結果、音速１４
９９ｍ／ｓ、減衰０．１２ｄＢ／ＭＨｚ・ｃｍとの値を
得た。次に、上記接触媒体を超音波診断装置のプローブ
と皮膚の間に置き画像診断を行ったところ、ゲルを介在
せしめない場合に比較し明かに鮮明な画像が得られた。

【００２０】（実施例５）整形手術用シリコーンゴムに
替わる水性ゲルの調製のため、実施例１で調製したエン
ドトキシンフリーのカードランによりゲルを調製した。
エンドトキシンフリーのカードラン４重量部に生理食塩
水９６重量部を加え、ホモジナイザーで１０分間攪拌し
た。上記カードラン分散液を真空下で充分に脱気後、型
に注入し１００℃、１０分間の加熱によりゲル化を行っ
た。冷却し型から取り出した後、高圧加熱滅菌器で１２
１℃、２０分間の加熱を行った。上記ゲルの安全性を確
認するため、ウサギを用いた埋植毒性試験に供した。す
なわち、ゲルを１ｘ１ｘ１０ｍｍに切断し、ウサギ背部
に注射針を用いて同ゲルを埋植し７２時間後に組織を切
り出し、肉眼、病理組織学的観察結果を得た。対照とし
ては、未処理のカードラン原末を用いて同様にゲルを調
製し使用した。エンドトキシンフリーのカードランゲル
では、埋植部位にほとんど変化が認められないのに比較
して、カードラン原末ゲルでは肉眼で被包形成、出血が
認められ、病理組織学的観察では、好中球の浸潤が認め
られた。

【００２１】

【発明の効果】本発明により、従来の方法では困難であ
ったβ−１，３グルカンのエンドトキシン不活化処理が
可能となった。しかも、従来の方法に比較しはるかに簡
便、低コストであり、スケールアップも容易であること
から、実際の工業的レベルでのエンドトキシンフリーβ
−１，３グルカン製造に利用できる。

【００２２】また、本発明のエンドトキシンフリーβ−
１，３グルカンは、高い安全性が確保され、医療用材料
として利用できる

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山口道広神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地株式会社資生堂第一リサーチセンター内Ｆターム(参考） 4C076 AA09 EE30 FF70 GG43 4C090 AA01 AA07 BA23 BB12 BB33 BB35 BB52 BC15 BD42 CA33 CA41 DA22

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エンドトキシンの含有量が０．１ＥＵ／
ｇ以下であることを特徴とするエンドトキシンフリーの
β１，３−グルカン。
【請求項２】酸もしくは塩基を含む有機溶媒で室温で
処理されたことを特徴とする請求項１に記載のエンドト
キシンフリーのβ１，３−グルカン。
【請求項３】前記酸もしくは塩基が各々ＨＣｌ、Ｈ₂
ＳＯ₄、ＨＮＯ₃、ＨＣｌＯ₄、ＣＨ₃ＣＯＯＨ、ＣＣｌ₃
ＣＯＯＨ、ＣＦ₃ＣＯＯＨ、Ｈ₃ＰＯ₄もしくはＮａＯ
Ｈ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）₂、ＮＨ₃である請求項１また
は２に記載のエンドトキシンフリーのβ１，３−グルカ
ン。
【請求項４】前記有機溶媒がメタノール、エタノー
ル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノ
ール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ペ
ンタノール、アセトン、ジオキサン、アセトニトリル等
の水溶性の有機溶媒のうち１種もしくは２種以上の組み
合わせから選択されることを特徴とする請求項２乃至３
のいずれか１項に記載のエンドトキシンフリーのβ１，
３−グルカン。
【請求項５】 β１，３−グルカンに酸もしくは塩基を
含む有機溶媒を加え、処理温度が室温であることを特徴
とするエンドトキシンフリーのβ１，３−グルカン製造
法。
【請求項６】前記酸もしくは塩基が各々ＨＣｌ、Ｈ₂
ＳＯ₄、ＨＮＯ₃、ＨＣｌＯ₄、ＣＨ₃ＣＯＯＨ、ＣＣｌ₃
ＣＯＯＨ、ＣＦ₃ＣＯＯＨ、Ｈ₃ＰＯ₄もしくはＮａＯ
Ｈ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）₂、ＮＨ₃である請求項５に記
載のエンドトキシンフリーのβ１，３−グルカン製造
法。
【請求項７】前記有機溶媒がメタノール、エタノー
ル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノ
ール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ペ
ンタノール、アセトン、ジオキサン、アセトニトリル等
の水溶性の有機溶媒のうち１種もしくは２種以上の組み
合わせから選択されることを特徴とする請求項５または
６に記載のエンドトキシンフリーのβ１，３−グルカン
製造法。
【請求項８】エンドトキシンの含有量が０．１ＥＵ／
ｇ以下のβ１，３−グルカンを主成分とすることを特徴
とする医療用ゲル素材。