JP2002253263A - タンパク質の生産方法 - Google Patents

タンパク質の生産方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子組換え技術により所望のタンパク質を
生産する方法であって、生産された所望のタンパク質を
容易にかつ変性させることなく回収することができる、
遺伝子組換え技術による所望タンパク質の生産方法を提
供すること。 【解決手段】 ウイルス粒子を構成するタンパク質をコ
ードする遺伝子と、所望遺伝子とを含む融合遺伝子が組
み込まれたベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞内で
前記融合遺伝子を発現させ、所望のタンパク質をウイル
ス粒子に融合された形で生産し、所望のタンパク質が融
合された該ウイルス粒子を回収する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組換え技術
による所望のタンパク質の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ゲノム解析が進み、ほぼヒトゲノム配列
は一次的なレベルでの配列解析が終了しようとしている
が、各遺伝子の機能解析は程遠いものと言わざるを得な
い。即ち期待したほどの遺伝子数がない可能性が議論さ
れ始めている通り、機能を議論するには単に遺伝子配列
情報だけでは何も議論できない状況が明確になってきて
いる。クローン化された遺伝子の機能は組換えタンパク
質を用い、その機能解析を行わなくてはならないが、通
常大腸菌での発現系では得られるタンパク質が不溶性で
ある為に、その可溶化条件で、構造の変化が伴って来る
事は周知の事実である。これまでは分泌型発現系を用い
たり、リフォールディングステップを利用する事で何と
か辻褄を合わせようとしてきたというのが実態である。
如何に本来の天然型構造に戻す条件を見出すかを研究し
てきたという事が現実である。本来動物細胞を用いると
天然型構造は得られると期待されているが、得られる発
現量が少なかったり、組換え体の選択に時間がかかりす
ぎるとの問題点、すなわち抗生物質等による細胞毒性か
らの回避による選択などでは、この選択条件等が煩雑で
時間ばかりかかり、競争が激しい世の中では受け得いれ
がたいものである。
【０００３】動物細胞由来の糖鎖構造とは異なり、バキ
ュロウイルス発現系が単純ではあるが糖鎖構造を有する
点と種々技術改良がなされた為に（Bac-To-Bac（登録商
標）バキュロウイルス発現システム、GibcoBRl社製、U.
P. patent 5,674,908/4,981,797）、組換え技術が簡単
に行える事から、非常に注目を浴びている。これまでに
分泌型タンパク質発現系への工夫（Protein Expr. Puri
f., 14, 8 12 (1998).）或いは、ウイルス本来のタン
パク質をコードする遺伝子（特に表面膜タンパク質をコ
ードする）の前に挿入する遺伝子を融合させる（J. Imm
unol. Methods,234 123 - 135 (2000), J. Cell Biol.,
143, 1155 1166 (1998)., & Biotechnology, 13, 107
9 1084 (1995).）等種々の工夫がなされてきた。しか
し、分泌型タンパク質等は希望する状態で得られると予
想されるが、膜タンパク質になるとその精製課程でどう
しても可溶化条件処理で、タンパク質の変性が起こる。
或いはflagと称して、精製ステップ用にタグを付与して
それを目安に簡便な精製ステップを提供する方法論も提
供されているが、ステップが多くなるのみでコストがか
かる。そこでは本来のタンパク質以外のタグがどの程度
天然型構造を維持できているかは不明のままで取り扱っ
ている状況にはかわりはない。
【０００４】さらに、遺伝子組換え技術により生産され
るタンパク質を、細胞培養上清や細胞破砕物から精製す
る操作は、硫安沈殿、塩析、種々のクロマトグラフィ
ー、電気泳動等のそれら自体は常法である種々の精製ス
テップを組み合わせて行われるが、これらの精製方法は
操作が煩雑で収率が低く、さらに上述の通り、精製過程
でタンパク質が変性する恐れもある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、遺伝子組換え技術により所望のタンパク質を生産す
る方法であって、生産された所望のタンパク質を容易に
かつ変性させることなく回収することができる、遺伝子
組換え技術による所望タンパク質の生産方法を提供する
ことである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、所望のタンパク質をコードする遺伝子と、ウ
イルス粒子を構成するタンパク質をコードする遺伝子と
の融合遺伝子を宿主細胞中で発現させることにより、所
望のタンパク質をウイルス粒子に結合された形態で生産
させ、該ウイルス粒子を回収し、必要に応じて、回収さ
れたウイルス粒子から所望のタンパク質を回収すること
により所望のタンパク質を容易に、かつ、変性させるこ
となく精製することを見出し本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、ウイルス粒子を構成
するタンパク質をコードする遺伝子と、所望遺伝子とを
含む融合遺伝子をベクターに組み込み、該ベクターを宿
主細胞に導入して宿主細胞内で前記融合遺伝子を発現さ
せ、所望のタンパク質をウイルス粒子に融合された形で
生産し、所望のタンパク質が融合された該ウイルス粒子
を回収することを含む、遺伝子組換え技術によるタンパ
ク質の生産方法を提供する。また、本発明は、複数回膜
貫通型のタンパク質をコードする遺伝子と、所望遺伝子
とを含む融合遺伝子が組み込まれたベクターを、ウイル
ス粒子を産生する宿主細胞に導入して宿主細胞内で前記
融合遺伝子を発現させ、所望のタンパク質を前記ウイル
ス粒子及び前記複数回膜貫通型のタンパク質と融合され
た形で生産し、所望のタンパク質が融合された該ウイル
ス粒子を回収することを含む、遺伝子組換え技術による
タンパク質の生産方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の第１の方法では、ウイル
ス粒子を構成するタンパク質をコードする遺伝子と、所
望遺伝子とを含む融合遺伝子をベクターに組み込み、該
ベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞内で前記融合遺
伝子を発現させ、所望のタンパク質をウイルス粒子に融
合された形で生産し、所望のタンパク質が融合された該
ウイルス粒子を回収する。
【０００９】ここで、ウイルス粒子を構成するタンパク
質としては、例えば、ウイルスのエンベロープを構成す
るコートタンパク質等を挙げることができる。具体的に
は、バキュロウイルスのコートタンパク質でgp64を挙げ
ることができるが、これに限定されるものではなく、宿
主細胞中で形成されるウイルス粒子にその構成要素とし
て組み込まれるタンパク質であればいずれのタンパク質
であってもよい。
【００１０】これらのうち、特にバキュロウイルスのウ
イルス粒子を構成するタンパク質が好ましく、とりわ
け、バキュロウイルスのコートタンパク質であるgp64が
特に好ましい。gp64自体は周知のタンパク質であり、そ
のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列も公知
であり、例えばGenBank Accession No. L22858に記載さ
れている。バキュロウイルスは、昆虫細胞中で強力に発
現するプロモーターを有し、このプロモーターを利用し
たバキュロウイルスベクター及びその宿主であるカイコ
等の昆虫細胞は市販されて広く用いられており、宿主−
ベクター系が確立されている。バキュロウイルスベクタ
ーに所望のタンパク質をコードする遺伝子を組み込み、
昆虫宿主細胞中で発現させる場合、通常、先ず、バクミ
ド(bacmid)ＤＮＡとヘルパープラスミドＤＮＡとを含む
大腸菌細胞に、所望のタンパク質をコードする遺伝子を
含むプラスミドを導入し、大腸菌細胞中での相同組換え
により所望のタンパク質をコードする遺伝子をバクミド
中に組み込み、該バクミドを増殖させた後、宿主昆虫細
胞に感染させる。そうすると、宿主細胞中で、バキュロ
ウイルスと共に所望のタンパク質が生産される。この方
法に用いられる、バクミド、ヘルパープラスミド、及び
これらを含む大腸菌細胞も市販されており、上記の方法
はこれらの市販品を用いて容易に行うことができる。従
って、この常法に基づき、バキュロウイルスベクターに
gp64遺伝子と所望のタンパク質をコードする遺伝子を組
み込み、宿主昆虫細胞中で発現させることにより、所望
のタンパク質が融合したgp64を含むバキュロウイルス粒
子が生産される。また、この場合、昆虫細胞は真核細胞
であるので、原核微生物細胞を宿主とした場合とは異な
り、生産される所望のタンパク質には糖鎖が結合され、
より天然の状態に近づくという利点ももたらされる。
【００１１】所望のタンパク質は、何ら限定されるもの
ではなく、いずれのタンパク質であってもよい。好まし
い例として、フコシルトランスフェラーゼ１〜９、N-ア
セチルグルコサミニルトランスフェラーゼI〜VI、シア
ル酸転移酵素群、ガラクトシル転移酵素等の糖転移酵
素、更には糖鎖構造に硫酸基を付与する糖脂質硫酸転移
酵素群（例えば、ヘパラン硫酸N-硫酸転移酵素やガラク
トシルセラミド硫酸を合成するセレブロシド硫酸転移酵
素）、酸化LDLスカベンジャー受容体、MACRO（Macropha
ge Receptor with Collagenous Structure）等を含むス
カベンジャー受容体ファミリーを含むII型膜タンパク質
類全般も挙げることができるが、これらに限定されるも
のではない。また、ウイルス粒子を構成するタンパク質
をコードする遺伝子と、所望遺伝子とを含む融合遺伝子
は、これらの２つの遺伝子を直接連結したものであって
もよいし、これらの間に介在配列が存在していてもよい
（ただし、この場合には下流側の遺伝子のリーディング
フレームが上流側の遺伝子のリーディングフレームと合
っている必要がある）。また、これらの２つの遺伝子を
含む融合遺伝子を予め形成し、これをベクターに組み込
んでも良いし、先にいずれか一方の遺伝子をベクターに
組み込み、次いで、他の遺伝子をベクターに組み込んで
ベクター内で融合遺伝子を形成してもよい。なお、後述
のように、２つの遺伝子の間に、トロンビンの認識配列
Leu-Val-Gly-Arg-Pro-Serや、Factor Xaの認識配列Ile-
Glu-Gly-Argをコードする配列を介在させておくと、後
の精製工程で、これらのタンパク質分解酵素を作用させ
て所望のタンパク質をウイルス粒子から容易に切り離す
ことができる。
【００１２】所望のタンパク質の少なくとも活性領域
が、ウイルス粒子の外側に露出する形でウイルス粒子に
融合されることが好ましい。このようにすることによ
り、ウイルス粒子から該タンパク質を切り離すことなく
免疫分析又は該タンパク質の活性を指標として所望のタ
ンパク質の存在を確認することができ、また、所望のタ
ンパク質の活性を利用できればよい場合等では、所望の
タンパク質をウイルス粒子から切り離すことなくウイル
ス粒子と融合された形態で用いることも可能である。ウ
イルス粒子の構造がわかっている場合には、これは容易
に行うことができる。すなわち、例えば、バキュロウイ
ルスのgp64では、Ｎ末端が粒子の外側に露出し、Ｃ末端
が粒子の内側に露出することがわかっているので、所望
のタンパク質は、gp64のＮ末端側に融合させればウイル
ス粒子の外側にその全体が露出することになる。一方、
所望のタンパク質が、例えばヒト糖転移酵素のように、
膜貫通領域を有する場合には、膜貫通領域は疎水性が高
いので、ウイルス粒子の膜（殻）に該膜貫通領域を固定
させ、所望のタンパク質がウイルス粒子の膜に埋め込ま
れた形態にあるものを生産することも可能である。所望
のタンパク質の全体がウイルス粒子の外側に完全に露出
している場合には、遠心処理等の間に該タンパク質がウ
イルスから離脱してしまう可能性があるので、所望のタ
ンパク質が膜貫通領域を有する場合には、このようにウ
イルス粒子の膜に埋め込まれた形で該タンパク質を生産
することが好ましい。この場合には、ウイルス粒子の外
側に該タンパク質の活性領域が露出することが好まし
い。これもウイルス粒子の構造と所望のタンパク質の構
造がわかっている場合には容易に行うことができる。例
えば、上記の通り、バキュロウイルスのgp64は、Ｎ末端
が粒子の外側に露出し、Ｃ末端が粒子の内側に露出する
ことがわかっている。一方、ヒト糖転移酵素は、膜貫通
領域よりもＣ末端側に活性領域が存在するII型膜タンパ
ク質ファミリーであることがわかっている。従って、gp
64のＣ末端側に糖転移酵素のＮ末端側が結合するよう
に、gp64遺伝子の3'側下流に糖転移酵素の5'側を連結す
ることにより、糖転移酵素は、そのＮ末端がウイルス粒
子内でgp64のＣ末端に結合し、その膜貫通領域がウイル
ス粒子の膜に固定され、その活性領域がウイルス粒子の
外側に露出した形態で生産される。従って、所望のタン
パク質が膜貫通領域を有する場合には、その全遺伝子を
そのまま発現させればよく、膜貫通領域を除去する等の
操作は不要である。むしろ、所望のタンパク質が遠心分
離操作等の際にウイルス粒子から離脱しないように、ウ
イルス粒子に所望のタンパク質を比較的堅固に固定する
ことが好ましいので、所望のタンパク質は、少なくとも
１個の膜貫通領域を有することが好ましい。gp64はウイ
ルス粒子の膜を貫通する形でウイルス粒子に保持される
ので、所望のタンパク質が１個の膜貫通領域を有する場
合、ウイルス粒子タンパク質と所望のタンパク質の融合
タンパク質は、合計２個の膜貫通領域でウイルス粒子に
固定されることになる。このように、ウイルス粒子タン
パク質と所望のタンパク質の融合タンパク質が合計２個
以上の膜貫通領域を有することが好ましい。
【００１３】本願発明の第２の方法では、融合遺伝子
は、複数回膜貫通型のタンパク質をコードする遺伝子が
融合された形式をとる。これにより、所望のタンパク質
は、複数回膜貫通型のタンパク質に融合された形態で得
られる。上記の通り、膜貫通型のタンパク質の膜貫通領
域は、疎水性が高いので、ウイルス粒子においてもウイ
ルス粒子の膜を貫通する。従って、複数回膜貫通型のタ
ンパク質を、ウイルス粒子を産生する宿主細胞中で発現
させると、ウイルス粒子の膜を複数回貫通する形で該複
数回膜貫通型のタンパク質が生産される。所望のタンパ
ク質は、ウイルス粒子の膜を複数回貫通するこの複数回
膜貫通型タンパク質と融合した形態で得られる。複数回
膜貫通タンパク質は、ウイルス粒子の膜を複数回貫通し
ているので、精製工程においてウイルス粒子から離脱し
にくく、ひいては所望のタンパク質もウイルス粒子から
離脱しにくくなる。
【００１４】本願発明の第２の方法においても、融合さ
れる２種類の遺伝子は、直接連結してもよいし、各遺伝
子の間に介在配列が存在してもよい（ただし、この場合
には下流側の遺伝子のリーディングフレームが上流側の
遺伝子のリーディングフレームと合っている必要があ
る）。また、２種類の遺伝子を連結して融合遺伝子を形
成した後に該融合遺伝子をベクターに組み込んでもよい
し、ベクターに各遺伝子を順次組み込んでベクター内で
融合遺伝子を形成してもよい。なお、複数回膜貫通型タ
ンパク質がウイルス粒子の膜を複数回貫通しやすくする
ために、融合遺伝子は、上流側から複数回膜貫通型タン
パク質をコードする遺伝子、及び所望のタンパク質をコ
ードする遺伝子を含むことが好ましい。なお、２つの遺
伝子の間に、トロンビンの認識配列Leu-Val-Gly-Arg-Pr
o-Serや、Factor Xaの認識配列Ile-Glu-Gly-Argをコー
ドする配列を介在させておくと、後の精製工程で、これ
らのタンパク質分解酵素を作用させて所望のタンパク質
を複数回膜貫通タンパク質から容易に切り離すことがで
きる。
【００１５】複数回膜貫通型タンパク質としては、公知
の種々の複数回膜貫通型タンパク質のいずれであっても
よく、例えば、ヒトケモカイン受容体（CCR3, CCR4,
CCR5など、７回貫通型）、リゾリン脂質受容体としての
Edgファミリー（７回貫通型）、生体内アミン（ノルア
ドレナリン、ドパミン、セロトニン、ヒスタミン）の受
容体（７回貫通型）、プロスタグランジン類の受容体
（７回貫通型）、多くのペプチドホルモンの受容体（７
回貫通型）、ムスカリン受容体（７回貫通型）、グルタ
ミン酸受容体（７回貫通型）、コラーゲン受容体CD３６
（２回貫通型）、スカベンジャー受容体クラスB（SR-
B）（２回貫通型）、ホスファチジン酸ホスファターゼ
（６回貫通型）等を挙げることができるがこれらに限定
されるものではない。
【００１６】なお、第２の方法において、宿主細胞はウ
イルス粒子を産生するものである必要がある。これは、
上記融合遺伝子を、上記したバキュロウイルスベクター
に組み込み、昆虫細胞中で発現させ、それによって、前
記融合遺伝子の発現と同時に、昆虫細胞内でウイルス粒
子を生産させることによって容易に達成することができ
る。あるいは、宿主細胞に別途ウイルス自体を感染させ
たり、又はウイルス粒子を産生するベクターを感染させ
たりして宿主細胞がウイルス粒子を生産するようにして
もよい。
【００１７】本願発明の第２の方法においても、所望の
タンパク質の少なくとも活性領域が、ウイルス粒子の外
側に露出する形で複数回膜タンパク質に融合されること
が好ましい。これもウイルス粒子の構造、複数回膜タン
パク質の構造及び所望のタンパク質の構造がわかってい
れば容易に達成することができる。例えば、複数回膜貫
通型タンパク質として７回膜貫通型のヒトケモカイン受
容体タンパク質CCR3を用い、所望のタンパク質としてヒ
ト糖転移酵素を用いる場合、CCR3は、そのＣ末端側をウ
イルス粒子の内側に露出する形でウイルス粒子の膜を貫
通するので、その下流にヒト糖転移酵素遺伝子を連結す
ることにより、ヒト糖転移酵素の膜貫通領域が８回目の
貫通領域となるように、CCR3とヒト糖転移酵素の融合タ
ンパク質がウイルス粒子の膜に埋め込まれ、ヒト糖転移
酵素の活性領域がウイルス粒子の外側に露出したものが
得られる。
【００１８】なお、複数回膜貫通型タンパク質の膜貫通
回数が偶数の場合には、所望のタンパク質はヒト糖転移
酵素のようなII型膜貫通タンパク質１回膜貫通型が好ま
しく、逆に本来末側が細胞質内に存在する奇数回の膜貫
通型タンパク質の場合には、所望のタンパク質として、
膜貫通ドメイン構造を有しないタンパク質を融合させる
事が好ましい。
【００１９】本願発明の第１及び第２の方法において、
宿主細胞に融合タンパク質を生産させる段階までは、バ
キュロウイルスベクター、宿主昆虫細胞及び大腸菌細胞
を含む、市販のキット等を用いて常法に基づき容易に行
うことができる。
【００２０】宿主細胞内でウイルス粒子が所望のタンパ
ク質、又は複数回膜貫通型タンパク質と所望のタンパク
質との融合した形態で生産された後、該ウイルス粒子を
分離する。一般に、ウイルスは、細胞培養上清中に出て
くるので、細胞培養上清を遠心分離することにより容易
にウイルス粒子を分離することができる。この場合、遠
心分離は、9,000〜100,000g程度の加速度で30〜120分間
程度行うことにより、培養上清中の他の各種成分から容
易に分離することができる。ウイルス粒子は、培養上清
中に含まれる他の種々のタンパク質等に比べるとはるか
に大きいので、遠心分離のみによって容易に分離するこ
とができる。従って、従来法のように種々の煩雑な操作
を経る必要がなく、また、タンパク質が変性する恐れも
ない。ウイルスが培養上清中にあまり出てこない場合に
は、細胞を破砕し、破砕物からウイルス粒子を回収する
が、これも加速度の異なる遠心分離を２〜３回組み合わ
せることにより容易に行うことができる。また、所望の
タンパク質がウイルス表面に露出しているので、回収し
たウイルスを抗原としてマウス等に免疫する事により、
所望のタンパク質に対する抗体を作製することができ
る。
【００２１】所望のタンパク質の少なくとも活性領域が
ウイルス粒子の外側に露出している場合には、回収され
たウイルス粒子自体が所望のタンパク質の活性を有して
いるので、所望のタンパク質の活性を利用できればよい
場合等では、所望のタンパク質をウイルス粒子から切り
離すことなく回収されたウイルス粒子をそのまま所望の
目的に用いることができる。
【００２２】また、他の細胞内で発現タンパク質を得る
方法では、細胞中のタンパク質と発現タンパク質との分
離は容易ではない。発現タンパク質を分泌させ培養液中
に放出させても培養液中のタンパク質との分離が必要で
ある。本発明の方法は、ウイルス粒子を回収するため細
胞中や培養液中のタンパク質との分離が容易である。す
なわち、ウイルスを得ることにより一般的な発現システ
ムに比べて純度の高い発現タンパク質を得ることができ
る。さらに、所望のタンパク質が膜貫通型のタンパク質
の場合には、ウイルスエンベロープ膜に固定された状態
が、天然に取り得る膜貫通時の立体構造を維持している
可能性もある。
【００２３】さらに、ウイルス粒子より、所望のタンパ
ク質を純化するためには、バキュロウイルスのエンベロ
ープを弱い界面活性剤で溶解してヌクレオカプシド（バ
キュロウイルスの核部分）と分離する事ができる。
【００２４】例えば、界面活性剤（トライトンX-100,
Tween類、ノニデッド、デオキシコール酸、コール酸、
リゾPCなど、最終濃度0.05〜1.0％程度）を含む緩衝液
をバキュロウイルス粒子に添加して攪拌するか、または
ソニケーションすることにより、エンベロープを溶解す
る。その後、この溶液を9,000〜100,000g程度の加速度
で30〜120分間程度遠心分離する。ヌクレオカプシドは
沈殿分画に存在し、エンベロープ上に結合していた所望
のタンパク質は、遠心後の上清に存在する。
【００２５】この段階で、主に所望のタンパク質とエン
ベロープ中に存在するエンベロープタンパク質(gp64)に
純化することができる。さらに精製を必要とする場合、
各種カラム（ゲルろ過カラム、イオン交換カラム、レク
チンカラム、抗体カラムなど）を用いて精製する事がで
きる。
【００２６】加えて、ウイルス粒子から所望の必要のタ
ンパク質を切り出す場合、ウイルス表面より、露出され
ている部分にプロテアーゼ認識配列をつけることによ
り、切り出す事ができる。例えば、使用するプロテアー
ゼとしてトロンビンを用いる場合、認識アミノ酸配列は
「Leu-Val-Gly-Arg-Pro-Ser」、プロテアーゼとしてFac
tor Xaの場合、認識アミノ酸配列は「Ile-Glu-Gly-Ar
g」を挿入することができるが、使用できるプロテアー
ゼおよび挿入できる認識アミノ酸配列はこれに限定する
ものではない。具体的な処理方法は、ウイルス粒子をプ
ロテアーゼで処理し、その後、この溶液を9,000〜100,0
00g程度の加速度で30〜120分間程度遠心分離するする。
沈殿か分画にはウイルス粒子が存在し、上清分画に切り
出された所望のタンパク質が存在する。
【００２７】これらの操作は、従来の不溶性タンパク質
の精製操作等と比較するとはるかに単純でしかも緩和な
条件であり、タンパク質の変性の恐れはほとんどない。
【００２８】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２９】参考例１ フコース転移酵素の一つであ
るFUT3遺伝子を直接発現させた場合 α (1,3/1,4)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子(GenBa
nk Accsession No. X53578、以下FUT3と記載する)をバ
キュロイウルスに導入して、FUT3のタンパク質を得るよ
うに設計した。FUT3遺伝子は、常法に従いヒト遺伝子よ
りクローニングした。PCR反応による増幅に用いたプラ
イマーは、制限酵素NdeIサイトを付加したFUT3F１：tcg
cat atg gat ccc ctg ggt gca gcc aagおよび制限酵素
XhoIサイトを付加したFUT3R3：atg ctcgag tca ggt gaa
cca agc cgc tatを用いて行った。このFUT3遺伝子のPC
R増幅産物および構築したpFB6A/CCR3プラスミド（下記
(2)参照）は、制限酵素NdeIおよびXhoIにて処理した。
これらを常法に従い結合して大腸菌(DH5αコンピテント
細胞)に導入し、アンピシリン含有LB寒天プレートに播
種して37℃で約16時間培養した。このプレートより、単
一の大腸菌のコロニーを選択し、この大腸菌をアンピシ
リン含有LB培養液にて約16時間振盪培養した。増殖した
大腸菌より、プラスミドを抽出し、挿入したFUT3遺伝子
の配列を確認した所、すでに報告されているFUT3遺伝子
の配列（GenBank Accession No. X53578）と一致して
いた。このFUT3遺伝子が導入されたプラスミドをpFB6A/
FUT3とした。
【００３０】常法に従い、このFUT3遺伝子を組み込んだ
ドナープラスミド(pFB6A/FUT3)をバクミドDNAとヘルパ
ーDNAを既に導入している大腸菌DH10Bac細胞（GibcoBRl
社製）に導入し、FUT3をバクミドDNAに相同組換えによ
り組み込んだ。これは次のように行った。pFB6A/FUT3を
コンピテント状態の大腸菌DH10Bac細胞に導入し、カナ
マイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、IPTGお
よびBluo-galを含むLB寒天培地に播種し、37℃で約16時
間培養した。相同組換えを起こした大腸菌は、白いコロ
ニーとして確認できるので、白いコロニーを選択してカ
ナマイシン、テトラサイクリンおよびゲンタマイシンを
含むLB培溶液にて37℃で約16時間培養した。この大腸菌
溶液1.5mlより、常法に従ってバクミドDNAを精製して40
μlのTEに溶解した。
【００３１】このバクミドDNA溶液5μlを100μlのSf-90
0II培養液（GibcoBRl社製）に添加しものと、別にCellF
ECTIN試薬（GibcoBRl社製）6μlと100μlのSf-900II培
養液を混合したものとを混ぜ合わせ、45分間室温で静置
した。このバクミドDNA/CellFECTIN混合液にさらに800
μlのSf900II培養液を加え、これを昆虫細胞Sf21細胞Gi
bcoBRl社製、9x105個の細胞を結合した6穴プレート)に
添加し、5時間、27℃で培養した。5時間後にこのバクミ
ドDNA/CellFECTIN混合液を取り除き、抗生物質の入った
Sf-900II培養液で72時間、27℃で培養した。
【００３２】この培養終了後に、培養液を回収した。こ
の培養液には、FUT3を産生する組換えバキュロウイルス
が含まれる。回収した培養液800μlを、別途培養してい
たSf21細胞(T75フラスコ、サブコンフルエントの状態の
もの、抗生物質入りのSf-900II培養液20ml含有)に添加
して72時間、27℃で培養した。72時間培養後、細胞をフ
ラスコより剥して培養液と同時に回収した。回収した細
胞懸濁液を3000rpm、10分間遠心し、上清と沈殿に分離
した。沈殿を細胞分画とし、上清をバキュロウイルス分
画とした。
【００３３】常法に従い、FUT3モノクローナル抗体（特
開平8-119999）を用いてウェスタンブロッティングにて
確認した。その結果、FUT3タンパク質は、Sf21細胞内で
発現が認めれ、分子量の異なった3種類が確認できた。
しかしながら、バキュロウイルス分画には認められなか
った。
【００３４】参考例２ pFB6A/CCR3の構築 常法によりヒト白血球より、ｍRNAを抽出し、ｃDNAを作
製し、ケモカイン受容体CCR3をクローニングした。この
際、停止コドンを除いた部分をPCR反応にて増幅し、用
いたプライマーは、クローニングするために制限酵素認
識配列を付加した。使用したプライマーは、CCR3F：tcg
catatgacaacctcactagatacagtt、CCR3R：tgcgaattcaaaca
caatagagagttccggctctgであった。CCR3遺伝子のPCR増幅
産物は、制限酵素NdeIおよびEcoRIにて処理した。クロ
ーニングに用いたプラスミドは、市販のバキュロウイル
スベクターであるpFastBac donor plasmid(GibcoBRL社
製)のマルチクローニングサイトをNdeIおよびEcoRIでク
ローニング出来るように改良したものである（以下pFB6
Aと記載する）。このpFB6AもNdeIおよびEcoRIにて処理
し、このプラスミドに制限酵素処理したCCR3遺伝子のPC
R増幅産物を結合させた。
【００３５】このCCR3遺伝子のPCR増幅産物を組み込ん
だプラスミドを常法に従い、大腸菌(DH5αコンピテント
細胞)に導入し、アンピシリン含有LB寒天プレートに播
種して37℃で約16時間培養した。このプレートより、単
一の大腸菌のコロニーを選択し、この大腸菌をアンピシ
リン含有LB培養液にて約16時間振盪培養した。増殖した
大腸菌より、プラスミドを抽出して挿入したCCR3遺伝子
の配列を確認した所、すでに報告されているCCR３遺伝
子の配列（GenBank Accession No. AF026535）と一致
していた。そこで、このCCR3遺伝子が導入されたプラス
ミドをpFB6A/CCR3とした。
【００３６】実施例１ フコース転移酵素の一つであ
るFUT3遺伝子をCCR3遺伝子の後ろに融合させて発現させ
た場合 構築したプラスミドpFB6A/CCR3のCCR3遺伝子に糖転移酵
素の一つであるα (1,3/1,4)フコシルトランスフェラー
ゼ遺伝子を結合し、CCR3-FUT3結合タンパクを得るよう
に設計した。FUT3遺伝子は、参考例１でクローニングし
たものを使用した。PCR反応による増幅に用いたプライ
マーは、制限酵素EcoRIサイトを付加したFUT3F：tgcgaa
ttcatggatcccctgggtgcagccおよび制限酵素XhoIサイトを
付加したFUT3R：tgtctcgagtcaggtgaaccaagccgctatを用
いて行った。このFUT3遺伝子のPCR増幅産物および構築
したpFB6A/CCR3プラスミドは、制限酵素EcoRIおよびXho
Iにて処理した。これらを常法に従い結合して大腸菌(DH
5αコンピテント細胞)に導入し、アンピシリン含有LB寒
天プレートに播種して37℃で約16時間培養した。このプ
レートより、単一の大腸菌のコロニーを選択し、この大
腸菌をアンピシリン含有LB培養液にて約16時間振盪培養
した。増殖した大腸菌より、プラスミドを抽出し、挿入
したFUT3遺伝子の配列を確認した所、すでに報告されて
いるFUT3遺伝子の配列（GenBank Accession No. X5357
8）と一致していた。このFUT3遺伝子が導入されたプラ
スミドをpFB6A/CCR3-FUT3とした。
【００３７】常法に従い、このCCR3遺伝子とFUT3遺伝子
を結合したドナープラスミド(pFB6A/CCR3-FUT3)をバク
ミドDNAとヘルパーDNAを既に導入している大腸菌DH10Ba
c細胞に導入し、CCR3-FUT3をバクミドDNAに相同組換え
により組み込んだ。これは次のように行った。pFB6A/CC
R3-FUT3をコンピテント状態の大腸菌DH10Bac細胞に導入
し、カナマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシ
ン、IPTGおよびBluo-galを含むLB寒天培地に播種し、37
℃で約16時間培養した。相同組換えを起こした大腸菌
は、白いコロニーとして確認できるので、白いコロニー
を選択してカナマイシン、テトラサイクリンおよびゲン
タマイシンを含むLB培溶液にて37℃で約16時間培養し
た。この大腸菌溶液1.5mlより、常法に従ってバクミドD
NAを精製して40μlのTEに溶解した。
【００３８】このバクミドDNA溶液5μlを100μlのSf-90
0II培養液に添加しものと、別にCellFECTIN試薬6μlと1
00μlのSf-900II培養液を混合したものとを混ぜ合わ
せ、45分間室温で静置した。このバクミドDNA/CellFECT
IN混合液にさらに800μlのSf900II培養液を加え、これ
を昆虫細胞Sf21細胞(9x105個の細胞を結合した6穴プレ
ート)に添加し、5時間、27℃で培養した。5時間後にこ
のバクミドDNA/CellFECTIN混合液を取り除き、抗生物質
の入ったSf-900II培養液で72時間、27℃で培養した。
【００３９】この培養終了後に、培養液を回収した。こ
の培養液には、CCR3-FUT3を産生する組換えバキュロウ
イルスが含まれる。回収した培養液800μlを、別途培養
していたSf21細胞(T75フラスコ、サブコンフルエントの
状態のもの、抗生物質入りのSf-900II培養液20ml含有)
に添加して72時間、27℃で培養した。72時間培養後、細
胞をフラスコより剥して培養液と同時に回収した。回収
した細胞懸濁液を3000rpm、10分間遠心し、上清と沈殿
に分離した。沈殿を細胞分画とし、上清をバキュロウイ
ルス分画とした。
【００４０】実施例２ pFB6A/gp64の構築 常法に従い、バキュロウイルスよりゲノムDNAを抽出
し、エンベロープ糖タンパク質であるgp64遺伝子をクロ
ーニングした。この際、停止コドンを除いた部分をPCR
反応にて増幅し、用いたプライマーは、クローニングす
るために制限酵素認識配列を付加した。使用したプライ
マーは、制限酵素NdeIサイトを付加したgp64F：tcgcata
tggtaagcgctattgttttatat、制限酵素EcoRIサイトを付加
したgp64R：tgcgaattcatattgtctattacggtttctであっ
た。gp64遺伝子のPCR増幅産物は、制限酵素NdeIおよびE
coRIにて処理した。クローニングに用いたプラスミド
は、pFB6Aを用いた。このpFB6AもNdeIおよびEcoRIにて
処理し、このプラスミドに制限酵素処理したgp64遺伝子
のPCR増幅産物を結合させた。
【００４１】これを常法に従い、gp64遺伝子のPCR増幅
産物を組み込んだプラスミドを大腸菌(DH5αコンピテン
ト細胞)に導入し、アンピシリン含有LB寒天プレートに
播種して37℃で約16時間培養した。このプレートより、
単一の大腸菌のコロニーを選択し、この大腸菌をアンピ
シリン含有LB培養液にて約16時間振盪培養した。増殖し
た大腸菌より、プラスミドを抽出し、挿入したgp64遺伝
子の配列を確認した所、すでに報告されているバキュロ
ウイルスのゲノム配列中gp64遺伝子の配列（GenBank Ac
cession No. L22858）と一致していた。このgp64遺伝
子が導入されたプラスミドをpFB6A/gp64とした。
【００４２】実施例３ フコース転移酵素の一つであ
るFUT3遺伝子をgp64遺伝子の後ろに融合させて発現させ
た場合 gp64遺伝子と糖転移酵素の一つであるα (1,3/1,4)フコ
シルトランスフェラーゼ遺伝子を結合し、gp64-FUT3結
合タンパクを得るためにFUT3遺伝子のクローニングを行
った。FUT3遺伝子の増幅は、実施例3に示した。このFUT
3遺伝子のPCR増幅産物およびプラスミドpFB6Aを制限酵
素EcoRIおよびXhoIにて処理し、常法により結合させ
た。このFUT3遺伝子を組み込んだプラスミドを大腸菌(D
H5αコンピテント細胞)に導入し、アンピシリン含有LB
寒天プレートに播種して37℃で約16時間培養した。この
プレートより、単一の大腸菌のコロニーを選択し、この
大腸菌をアンピシリン含有LB培養液にて約16時間振盪培
養した。増殖した大腸菌より、プラスミドを抽出し、挿
入したFUT3遺伝子の配列を確認した所、すでに報告され
ているFUT3遺伝子の配列（GenBank Accession No. X535
78）と一致していた。このFUT3遺伝子が導入されたプラ
スミドをpFB6A/FUT3とした。
【００４３】そこで、構築したプラスミドpFB6A/gp64を
制限酵素NdeIおよびEcoRIにて処理し、この反応液を低
融点アガロースゲルで分離してgp64遺伝子を得た。さら
に、pFB6A/FUT3プラスミドにgp64を組み込むために、制
限酵素NdeIおよびEcoRIにて処理した。このプラスミド
と精製したgp64遺伝子を常法に従い結合した。このgp64
を組み込んだプラスミド大腸菌(DH5αコンピテント細
胞)に導入しアンピシリン含有LB寒天プレートに播種し
て37℃で約16時間培養した。このプレートより、単一の
大腸菌のコロニーを選択し、この大腸菌をアンピシリン
含有LB培養液にて約16時間振盪培養した。増殖した大腸
菌より、プラスミドを抽出し、挿入したgp64遺伝子の配
列を確認し、挿入が正しく行われている事を確認した。
このgp64遺伝子が導入されたプラスミドをpFB6A/gp64-F
UT3とした。
【００４４】常法に従い、このgp64遺伝子とFUT3遺伝子
を結合したドナープラスミド(pFB6A/ gp64-FUT3)をバク
ミドDNAとヘルパーDNAを既に導入している大腸菌DH10Ba
c細胞に導入し、gp64-FUT3をバクミドDNAに相同組換え
により組み込んだ。これは次のように行った。pFB6A/ g
p64-FUT3をコンピテント状態の大腸菌DH10Bac細胞に導
入し、カナマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシ
ン、IPTGおよびBluo-galを含むLB寒天培地に播種し、37
℃で約16時間培養した。相同組換えを起こした大腸菌
は、白いコロニーとして確認できるので、白いコロニー
を選択してカナマイシン、テトラサイクリンおよびゲン
タマイシンを含むLB培溶液にて37℃で約16時間培養し
た。この大腸菌溶液1.5mlより、常法に従ってバクミドD
NAを精製して40μlのTEに溶解した。
【００４５】このバクミドDNA溶液5μlを100μlのSf-90
0II培養液に添加しものと、別にCellFECTIN試薬6μlと1
00μlのSf-900II培養液を混合したものとを混ぜ合わ
せ、45分間室温で静置した。このバクミドDNA/CellFECT
IN混合液にさらに800μlのSf900II培養液を加え、これ
を昆虫細胞Sf21細胞(9x105個の細胞を結合した6穴プレ
ート)に添加し、5時間、27℃で培養した。5時間後にこ
のバクミドDNA/CellFECTIN混合液を取り除き、抗生物質
の入ったSf-900II培養液で72時間、27℃で培養した。
【００４６】この培養終了後に、培養液を回収した。こ
の培養液には、gp64-FUT3を産生する組換えバキュロウ
イルスが含まれる。回収した培養液800μlを、別途培養
していたSf21細胞(T75フラスコ、サブコンフルエントの
状態のもの、抗生物質入りのSf-900II培養液20ml含有)
に添加して72時間、27℃で培養した。72時間培養後、細
胞をフラスコより剥して培養液と同時に回収した。回収
した細胞懸濁液を3000rpm、10分間遠心し、上清と沈殿
に分離した。沈殿を細胞分画とし、上清をバキュロウイ
ルス分画とした。
【００４７】常法に従い、FUT3モノクローナル抗体を用
いてウェスタンブロッティングにて確認した。その結
果、gp64-FUT3を産生する組換えバキュロウイルス感染S
f21細胞では、陽性バンドが検出されたが、非感染Sf21
細胞では陽性バンドが観察されなかった。
【００４８】参考例３ ｐFB1/CCR3の構築 CCR3との結合タンパク質を作るために、マルチクローニ
ングサイトの配列（制限酵素認識配列）が異なってプラ
スミドを構築するために、pFastBac donor plasmid１(G
ibcoBRL社製、以下pFB1と記載する)にCCR3遺伝子をクロ
ーニングした。この際、停止コドンを除いた部分をPCR
反応にて増幅し、用いたプライマーは、クローニングす
るために制限酵素認識配列を付加した。使用したプライ
マーは、制限酵素EcoRIサイトを付加したCCR3FE：tcgga
attcatgacaacctcactagataca、制限酵素SalIサイトを付
加したCCR3RS：tgcgtcgaccaaacacaatagagagttccであっ
た。CCR3遺伝子のPCR増幅産物およびpFB1プラスミド
は、制限酵素EcoRIおよびSalIにて処理し、常法により
結合させた。
【００４９】このCCR3遺伝子のPCR増幅産物を組み込ん
だプラスミドを常法に従い、大腸菌(DH5αコンピテント
細胞)に導入し、アンピシリン含有LB寒天プレートに播
種して37℃で約16時間培養した。このプレートより、単
一の大腸菌のコロニーを選択し、この大腸菌をアンピシ
リン含有LB培養液にて約16時間振盪培養した。増殖した
大腸菌より、プラスミドを抽出して挿入したCCR3遺伝子
の配列を確認した所、すでに報告されているCCR３遺伝
子の配列（GenBank Accession No.AF026535）と一致し
ていた。そこで、このCCR3遺伝子が導入されたプラスミ
ドをpFB1/CCR3とした。
【００５０】実施例３ ガラクトサミン転移酵素の一
つであるGnTV遺伝子をCCR3遺伝子の後ろに融合させて発
現させた場合 構築したプラスミドpFB1/CCR3のCCR3遺伝子に糖転移酵
素の一つであるN-アセチルグルコサミニルトランスフェ
ラーゼ V遺伝子 (GenBank Accsession No. NM002410、
以下GnTVと記載する)を結合し、gp64-GnTV結合タンパク
を得るためにGnTV遺伝子のクローニングを行った。GnTV
遺伝子は、常法に従いヒト遺伝子よりクローニングし
た。PCR反応による増幅に用いたプライマーは、PCR反応
による増幅に用いたプライマーは、制限酵素SalIサイト
を付加したGnTVF： agagtcgacatggctctcttcactccgtggお
よび制限酵素XhoIサイトを付加したGnTVRXho：tgactcga
gctataggcagtctttgcを用いて行った。このGnTV遺伝子の
PCR増幅産物およびプラスミドpFB1/CCR3は、制限酵素Sa
lIおよびXhoIにて処理した。これらを常法に従い結合し
て大腸菌(DH5αコンピテント細胞)に導入し、アンピシ
リン含有LB寒天プレートに播種して37℃で約16時間培養
した。このプレートより、単一の大腸菌のコロニーを選
択し、この大腸菌をアンピシリン含有LB培養液にて約16
時間振盪培養した。増殖した大腸菌より、プラスミドを
抽出し、挿入したGnTV遺伝子の配列を確認した所、すで
に報告されているGnTV遺伝子の配列（GenBank Accessio
n No.NM002410）と一致した。このGnTV遺伝子が導入さ
れたプラスミドをpFB1/CCR3-GnTVとした。
【００５１】常法に従い、このCCR3遺伝子とGnTV遺伝子
を結合したドナープラスミド(pFB1/CCR3-GnTV)をバクミ
ドDNAとヘルパーDNAを既に導入している大腸菌DH10Bac
細胞に導入し、CCR3- GnTVをバクミドDNAに相同組換え
により組み込んだ。これは具体的に次のように行った。
PFB1/ CCR3- GnTVをコンピテント状態の大腸菌DH10Bac
細胞に導入し、カナマイシン、テトラサイクリン、ゲン
タマイシン、IPTGおよびBluo-galを含むLB寒天培地に播
種し、37℃で約16時間培養した。相同組換えを起こした
大腸菌は、白いコロニーとして確認できるので、白いコ
ロニーを選択してカナマイシン、テトラサイクリンおよ
びゲンタマイシンを含むLB培溶液にて37℃で約16時間培
養した。この大腸菌溶液1.5mlより、常法に従ってバク
ミドDNAを精製して40μlのTEに溶解した。
【００５２】このバクミドDNA溶液5μlを100μlのSf-90
0II培養液に添加しものと、別にCellFECTIN試薬6μlと1
00μlのSf-900II培養液を混合したものとを混ぜ合わ
せ、45分間室温で静置した。このバクミドDNA/CellFECT
IN混合液にさらに800μlのSf900II培養液を加え、これ
を昆虫細胞Sf21細胞(9x105個の細胞を結合した6穴プレ
ート)に添加し、5時間、27℃で培養した。5時間後にこ
のバクミドDNA/CellFECTIN混合液を取り除き、抗生物質
の入ったSf-900II培養液で72時間、27℃で培養した。
【００５３】この培養終了後に、培養液を回収した。こ
の培養液には、CCR3- GnTVを産生する組換えバキュロウ
イルスが含まれる。回収した培養液800μlを、別途培養
していたSf21細胞(T75フラスコ、サブコンフルエントの
状態のもの、抗生物質入りのSf-900II培養液20ml含有)
に添加して72時間、27℃で培養した。72時間培養後、細
胞をフラスコより剥して培養液と同時に回収した。回収
した細胞懸濁液を3000rpm、10分間遠心し、上清と沈殿
に分離した。沈殿を細胞分画とし、上清をバキュロウイ
ルス分画とした。
【００５４】実施例４ ガラクトサミン転移酵素の一
つであるGnTV遺伝子をgp64遺伝子の後ろに融合させて発
現させた場合 gp64遺伝子と糖転移酵素の一つであるN-アセチルグルコ
サミニルトランスフェラーゼ V遺伝子を結合し、gp64-G
nTV結合タンパクを得るためにGnTV遺伝子のクローニン
グを行った。GnTV遺伝子は、常法に従いヒト遺伝子より
クローニングした。PCR反応による増幅に用いたプライ
マーは、制限酵素SalIサイトを付加したGnTVF： agagtc
gacatggctctcttcactccgtggおよび制限酵素KpnIサイトを
付加したGnTVR17：tgaggtaccctataggcagtctttgcを用い
て行った。
【００５５】このGnTV遺伝子のPCR増幅産物およびプラ
スミドpFB6A/gp64を、制限酵素SalIおよびKpnIにて処理
した。これらを常法に従い結合して大腸菌(DH5αコンピ
テント細胞)に導入し、アンピシリン含有LB寒天プレー
トに播種して37℃で約16時間培養した。このプレートよ
り、単一の大腸菌のコロニーを選択し、この大腸菌をア
ンピシリン含有LB培養液にて約16時間振盪培養した。増
殖した大腸菌より、プラスミドを抽出し、挿入したGnTV
遺伝子の配列を確認した所、すでに報告されているGnTV
遺伝子の配列（GenBank Accession No. NM002410）と
一致した。このGnTV遺伝子が導入されたプラスミドをpF
B6A/gp64-GnTVとした。
【００５６】常法に従い、このgp64遺伝子とGnTV遺伝子
を結合したドナープラスミド(pFB6A/ gp64- GnTV)をバ
クミドDNAとヘルパーDNAを既に導入している大腸菌DH10
Bac細胞に導入し、gp64- GnTVをバクミドDNAに相同組換
えにより組み込んだ。これは具体的に次のように行っ
た。pFB6A/ gp64- GnTVをコンピテント状態の大腸菌DH1
0Bac細胞に導入し、カナマイシン、テトラサイクリン、
ゲンタマイシン、IPTGおよびBluo-galを含むLB寒天培地
に播種し、37℃で約16時間培養した。相同組換えを起こ
した大腸菌は、白いコロニーとして確認できるので、白
いコロニーを選択してカナマイシン、テトラサイクリン
およびゲンタマイシンを含むLB培溶液にて37℃で約16時
間培養した。この大腸菌溶液1.5mlより、常法に従って
バクミドDNAを精製して40μlのTEに溶解した。
【００５７】このバクミドDNA溶液5μlを100μlのSf-90
0II培養液に添加しものと、別にCellFECTIN試薬6μlと1
00μlのSf-900II培養液を混合したものとを混ぜ合わ
せ、45分間室温で静置した。このバクミドDNA/CellFECT
IN混合液にさらに800μlのSf900II培養液を加え、これ
を昆虫細胞Sf21細胞(9x105個の細胞を結合した6穴プレ
ート)に添加し、5時間、27℃で培養した。5時間後にこ
のバクミドDNA/CellFECTIN混合液を取り除き、抗生物質
の入ったSf-900II培養液で72時間、27℃で培養した。
【００５８】この培養終了後に、培養液を回収した。こ
の培養液には、gp64- GnTVを産生する組換えバキュロウ
イルスが含まれる。回収した培養液800μlを、別途培養
していたSf21細胞(T75フラスコ、サブコンフルエントの
状態のもの、抗生物質入りのSf-900II培養液20ml含有)
に添加して72時間、27℃で培養した。72時間培養後、細
胞をフラスコより剥して培養液と同時に回収した。回収
した細胞懸濁液を3000rpm、10分間遠心し、上清と沈殿
に分離した。沈殿を細胞分画とし、上清をバキュロウイ
ルス分画とした。
【００５９】常法に従い、抗GnTVモノクローナル抗体
（特開平11-240900）を用いてウェスタンブロッティン
グにて確認した。gp64-GnTVを産生する組換えバキュロ
ウイルス感染Sf21細胞では、約150kdの陽性バンドが検
出されたが、非感染Sf21細胞では陽性バンドが観察され
なかった。
【００６０】
【発明の効果】本発明により、生産された所望のタンパ
ク質を容易にかつ変性させることなく回収することがで
きる、遺伝子組換え技術による所望タンパク質の新規な
生産方法が提供された。本発明の方法によれば、所望の
タンパク質がサイズの大きなウイルス粒子との融合タン
パク質として生産されるので、遠心分離等により極めて
容易に精製することができる。
【００６１】
【配列表】 <110> FUJIREBIO INC. <120> Process for producing proteins <130> 01693 <160>
【００６２】 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for cloning human CCR3 gene <400> 1 tcgcatatga caacctcact agatacagtt 30
【００６３】 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for cloning human CCR3 gene <400> 2 tgcgaattca aacacaatag agagttccgg ctctg 35
【００６４】 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for cloning human fuco syl transferase gene <400> 3 tgcgaattca tggatcccct gggtgcagcc 30
【００６５】 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for cloning human fuco syl transferase gene <400> 4 tgtctcgagt caggtgaacc aagccgctat 30
【００６６】 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for cloning baculoviru s gp64 gene <400> 5 tcgcatatgg taagcgctat tgttttatat 30
【００６７】 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for cloning baculoviru s gp64 gene <400> 6 tgcgaattca tattgtctat tacggtttct 30
【００６８】 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for cloning human CCR3 gene <400> 7 tcggaattca tgacaacctc actagataca 30
【００６９】 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for cloning human CCR3 gene <400> 8 tgcgtcgacc aaacacaata gagagttcc 30
【００７０】 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for cloning human GnTV gene <400> 9 agagtcgaca tggctctctt cactccgtgg 30
【００７１】 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for cloning human GnTV gene <400> 10 tgactcgagc tataggcagt ctttgc 26
【００７２】 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for cloning human GnTV gene <400> 11 tgaggtaccc tataggcagt ctttgc 26
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 哲 東京都中央区日本橋浜町２丁目62番５号 富士レビオ株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 BA32 CA04 DA02 EA02 HA03 HA06 4B050 CC03 DD07 EE10 LL05 4B064 AG01 AG32 CA10 CA19 CC24 DA16

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ウイルス粒子を構成するタンパク質をコ
    ードする遺伝子と、所望遺伝子とを含む融合遺伝子が組
    み込まれたベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞内で
    前記融合遺伝子を発現させ、所望のタンパク質をウイル
    ス粒子に融合された形で生産し、所望のタンパク質が融
    合された該ウイルス粒子を回収することを含む、遺伝子
    組換え技術によるタンパク質の生産方法。
  2. 【請求項２】 前記ウイルス粒子を構成するタンパク質
    が、ウイルスのコートタンパク質である請求項１記載の
    方法。
  3. 【請求項３】 前記ウイルスがバキュロウイルスであ
    り、前記宿主細胞が昆虫細胞である請求項１記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 ウイルス粒子を構成するタンパク質が、
    バキュロウイルスのコートタンパク質gp64である請求項
    ３記載の方法。
  5. 【請求項５】 所望のタンパク質の少なくとも活性領域
    が、ウイルス粒子の外側に露出する形でウイルス粒子に
    融合される請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 前記融合遺伝子は、gp64遺伝子の下流に
    所望のタンパク質をコードする遺伝子が結合されてなる
    請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記所望のタンパク質が糖転移酵素であ
    る請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 回収されたウイルス粒子から所望のタン
    パク質を切断して回収する工程をさらに含む請求項１な
    いし７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 複数回膜貫通型のタンパク質をコードす
    る遺伝子と、所望遺伝子とを含む融合遺伝子が組み込ま
    れたベクターを、ウイルス粒子を産生する宿主細胞に導
    入して宿主細胞内で前記融合遺伝子を発現させ、所望の
    タンパク質を前記ウイルス粒子及び前記複数回膜貫通型
    のタンパク質と融合された形で生産し、所望のタンパク
    質が融合された該ウイルス粒子を回収することを含む、
    遺伝子組換え技術によるタンパク質の生産方法。
  10. 【請求項１０】 前記融合遺伝子は、上流側から複数回
    膜貫通型タンパク質をコードする遺伝子、及び所望のタ
    ンパク質をコードする遺伝子を含む請求項９記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 前記ウイルスがバキュロウイルスであ
    り、前記宿主細胞が昆虫細胞である請求項１０記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 所望のタンパク質の少なくとも活性領
    域が、ウイルス粒子の外側に露出する形でウイルス粒子
    に融合される請求項９ないし１１のいずれか１項に記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】 前記複数回膜貫通型のタンパク質が奇
    数回膜貫通型タンパク質であり、前記所望のタンパク質
    が膜貫通領域を有さない請求項９ないし１２のいずれか
    １項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記複数回膜貫通型のタンパク質がケ
    モカイン受容体CCR3をコードする遺伝子である請求項１
    ３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 回収されたウイルス粒子から所望のタ
    ンパク質を切断して回収する工程をさらに含む請求項９
    ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010273676A (ja) * 2009-04-28 2010-12-09 Univ Of Tokyo 転移基で修飾された基質の製造方法
WO2011099541A1 (ja) 2010-02-12 2011-08-18 大塚製薬株式会社 組換えウイルスの製造方法
US9023365B2 (en) 2006-02-09 2015-05-05 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
JP2015520615A (ja) * 2012-05-23 2015-07-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 治療薬の選択方法
JP2016502570A (ja) * 2012-10-23 2016-01-28 エコール スペリュール デ フィジーク エ シミ アンドゥストリエル デ ラ ヴィル デ パリ 複数回逐次的に形成し、切断することができる可逆的共有結合を含む粒子
US9327018B2 (en) 2006-02-09 2016-05-03 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8697394B2 (en) 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
EP2322644A1 (en) 2000-06-28 2011-05-18 GlycoFi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US7598055B2 (en) 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
US20100086992A1 (en) * 2006-12-22 2010-04-08 Fujirebio Inc. Biosensor, biosensor chip and method for producing the biosensor chip for sensing a target molecule
KR20100063002A (ko) * 2007-07-12 2010-06-10 유니버시티 오브 메디신 앤드 덴티스트리 오브 뉴 저지 항독소 탈안정화 기술
CN111808884A (zh) * 2020-07-23 2020-10-23 云舟生物科技（广州）有限公司 杆状病毒表达系统及其构建方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2761994B1 (fr) * 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6010037198, Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．, 1997, ｖｏｌ．２３８， ｎｏ．３, ｐ．７１７−７２２ *
JPN6010037199, Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．, 2000, ｖｏｌ．２７５， ｎｏ．１, ｐ．８４−９０ *
JPN6010037200, Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．, 200102, ｖｏｌ．２８， ｎｏ．２−３, ｐ．１５５−１６０ *
JPN6010037201, ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ, 1997, ｖｏｌ．２２， ｎｏ．４, ｐ．７３０−７３５ *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9023365B2 (en) 2006-02-09 2015-05-05 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
US9327018B2 (en) 2006-02-09 2016-05-03 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
US9333249B2 (en) 2006-02-09 2016-05-10 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
JP2010273676A (ja) * 2009-04-28 2010-12-09 Univ Of Tokyo 転移基で修飾された基質の製造方法
WO2011099541A1 (ja) 2010-02-12 2011-08-18 大塚製薬株式会社 組換えウイルスの製造方法
JP2015520615A (ja) * 2012-05-23 2015-07-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 治療薬の選択方法
JP2016502570A (ja) * 2012-10-23 2016-01-28 エコール スペリュール デ フィジーク エ シミ アンドゥストリエル デ ラ ヴィル デ パリ 複数回逐次的に形成し、切断することができる可逆的共有結合を含む粒子

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