JP2002500162A - ビトロネクチン受容体アンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ビトロネクチン受容体アンタゴニストであり、骨粗鬆症の治療に有用な式（Ｉ）： 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ビトロネクチン受容体を阻害し、炎症、癌および心血管障害、例え
ば、アテローム性動脈硬化症および再狭窄、ならびに骨吸収が要因となる疾患、
例えば、骨粗鬆症の治療に有用な医薬上活性な化合物に関する。

【０００２】 （発明の背景） インテグリンは、種々の細胞上に発現される膜貫通糖タンパク質である細胞接
着受容体のスーパーファミリーである。これらの細胞表面接着受容体は、ｇｐＩ
Ｉｂ／ＩＩＩａ（フィブリノーゲン受容体）およびα_Vβ₃（ビトロネクチン受容
体）を包含する。フィブリノーゲン受容体ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａは、血小板表面
に発現し、出血している創傷部位での血小板凝集および止血クロットの形成を媒
介する。Philipsら, Blood., 1988, 71, 831。ビトロネクチン受容体α_Vβ₃は、
内皮、平滑筋、破骨細胞および腫瘍細胞を包含する多くの細胞上に発現し、よっ
て、種々の機能を有する。破骨細胞の膜上に発現したα_Vβ₃受容体は、骨吸収過
程の鍵となる工程である破骨細胞の骨マトリックスへの接着を媒介する。Rossら
, J. Biol. Chem., 1987, 262, 7703。過剰の骨吸収によって特徴付けられる疾 患は、骨粗鬆症である。ヒト大動脈平滑筋細胞上に発現したα_Vβ₃受容体は、経
皮的な冠状血管形成術後に再狭窄を引き起こす可能性のある工程である新生脈管
内膜へのそれらの移動を媒介する。Brownら, Cardiovascular Res., 1994, 28,
1815。さらに、Brooksらは、Cell, 1994, 79, 1157において、α_Vβ₃アンタゴニ
ストが脈管形成血管のアポトーシスを引き起こすことによって腫瘍退縮を促進で
きることを明らかにした。よって、ビトロネクチン受容体を遮断する薬剤は、骨
粗鬆症、再狭窄および癌のような疾患の治療において有用であろう。

【０００３】 ビトロネクチン受容体は、現在、α_Vβ₁、α_Vβ₃およびα_Vβ₅と称する３種類
のインテグリンを指すことが知られている。Hortonら, Int. J. Exp. Pathol.,
1990, 71, 741。α_Vβ₁は、フィブロネクチンおよびビトロネクチンと結合する 。α_Vβ₃は、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、トロンボスポンジン、
ビトロネクチン、フォン・ヴィルブランド因子、オステオポンチンおよび骨シア
ロタンパク質Ｉを包含する多種のリガンドと結合する。α_Vβ₅は、ビトロネクチ
ンと結合する。ビトロネクチン受容体α_Vβ₅は、微小血管内皮細胞を包含する種
々の細胞型の細胞接着に関与することが明らかになり（Davisら, J. Cell. Biol
., 1993, 51, 206）、血管形成におけるその役割が確認された。Brooksら, Scie
nce, 1994, 264, 569。このインテグリンは、正常な皮膚においてではなく、ヒ トの創傷肉芽組織における血管上に発現する。

【０００４】 ビトロネクチン受容体は、トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（またはＲＧ
Ｄ）モチーフを含有する骨マトリックスタンパク質に結合することが知られてい
る。よって、Hortonら, Exp. Cell Res. 1991, 195, 368には、ＲＧＤ含有ペプ チドおよび抗ビトロネクチン受容体抗体（２３Ｃ６）が破骨細胞による象牙質吸
収および細胞伸展を阻害することが開示されている。さらに、Satoら, J. Cell
Biol. 1990, 111, 1713には、ＲＧＤ配列を含有するヘビ毒ペプチドであるエキ スタチンが組織培養において骨吸収の強力な阻害剤であること、および破骨細胞
の骨への付着を阻害することが開示されている。

【０００５】 この度、ある特定の化合物がα_Vβ₃およびα_Vβ₅受容体の強力な阻害剤である
ことを見出した。特に、かかる化合物がフィブリノーゲン受容体よりもビトロネ
クチン受容体の強力な阻害剤であることを見出した。

【０００６】 （発明の概要） 本発明は、ビトロネクチン受容体阻害の薬理活性を有しており、炎症、癌およ
び心血管障害、例えば、アテローム性動脈硬化症および再狭窄、ならびに骨吸収
が要因である疾患、例えば、骨粗鬆症の治療に有用である下記式（Ｉ）で示され
る化合物を含む。

【０００７】 本発明は、また、式（Ｉ）で示される化合物および医薬担体を含んでなる医薬
組成物である。 本発明は、また、ビトロネクチン受容体によって媒介される疾患の治療方法で
ある。特定の態様において、本発明の化合物は、アテローム性動脈硬化症、再狭
窄、炎症、癌および骨吸収が要因である疾患、例えば、骨粗鬆症の治療に有用で
ある。

【０００８】 （詳細な記載） 本発明は、フィブリノーゲン受容体よりもビトロネクチン受容体の強力な阻害
剤である新規化合物を含む。新規化合物は、含窒素置換基がベンゾアゼピンの芳
香族６員環に存在し、酸性基を含有する脂肪族置換基がベンゾアゼピンの７員環
に存在するベンゾアゼピン核を含む。当該ベンゾアゼピン環系は、ビトロネクチ
ン受容体と好都合に相互作用し、６および７員環上の置換基側鎖もまた該受容体
と好都合に相互作用するように該置換基側鎖を配向させると考えられる。最も短
い分子内経路を経る約１２〜１４個の介在共有結合が、ベンゾアゼピンの７員環
の脂肪族置換基上の酸性基とベンゾアゼピンの芳香族６員環上にある含窒素置換
基の窒素との間に存在することが好ましい。

【０００９】 本発明は、式（Ｉ）：

【化４】 で示される化合物またはその医薬上許容される塩を含む。この化合物は、(Ｓ)−
８−[３−(４−ピリジン−２−イルアミノ)−１−プロピルオキシ]−３−オキソ
−２−(２,３,４−トリフルオロベンジル)−２,3,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−
２−ベンゾアゼピン−４−酢酸である。

【００１０】 式（Ｉ）で示される化合物は、ビトロネクチンおよび他のＲＧＤ含有ペプチド
のビトロネクチン受容体への結合を阻害する。破骨細胞上のビトロネクチン受容
体の阻害は、破骨細胞の骨吸収を阻害し、骨吸収が病状と関連する疾患、例えば
、骨粗鬆症および変形性関節症の治療に有用である。

【００１１】 別の態様において、本発明は、オステオカルシン放出の増加を引き起こす式（
Ｉ）で示される化合物を投与することからなる骨形成を刺激する方法である。骨
生産の増加は、石灰化骨量の欠乏があるかまたは骨のリモデリングが望まれる病
態、例えば、骨折治癒および骨折の予防において明らかな利益がある。骨構造の
喪失を引き起こす疾患および代謝障害は、また、かかる治療により利益を得るで
あろう。例えば、上皮小体亢進症、ページェット病、悪性疾患の高カルシウム血
症、骨転移により生じる骨溶解性病変、固定化または性ホルモン欠乏に起因する
骨喪失、ベーチェット病、骨軟化症、骨化過剰症および大理石骨病は、本発明の
化合物の投与により利益を得ることができる。

【００１２】 さらに、本発明の化合物は、多くの異なる型の細胞上のビトロネクチン受容体
を阻害するので、該化合物は、炎症性障害、例えば、慢性関節リウマチおよび乾
癬、ならびに心血管疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症および再狭窄の治療
に有用であろう。本発明の式（Ｉ）で示される化合物は、限定するものではない
が、血栓塞栓症、喘息、アレルギー、成人呼吸窮迫症候群、対宿主移植片病、臓
器移植拒絶、敗血症性ショック、湿疹、接触皮膚炎、炎症性腸疾患および他の自
己免疫疾患を包含する他の疾患の治療または予防に有用である。本発明の化合物
は、また、創傷治癒にも有用である。

【００１３】 本発明の化合物は、また、血管形成障害の予防を包含する治療に有用である。
本明細書で使用される「血管形成障害」なる語は、異常な新血管新生を伴う症状
を包含する。新しい血管の成長が疾患と関連した病状の原因となるかまたは該病
状に関与する場合、血管形成の阻害は、疾患の有害な影響を減少させるであろう
。かかる疾患標的の一例が糖尿病性網膜症である。新しい血管の成長が有害な組
織の成長を維持するのに要求される場合、血管形成の阻害は、該組織への血液供
給を減少させ、それにより、血液供給要求に基づいた組織量の減少に寄与するで
あろう。例えば、腫瘍増殖および充実性腫瘍転移の確立のために新血管新生が継
続的に必要である腫瘍の増殖が挙げられる。よって、本発明の化合物は、腫瘍組
織血管形成を阻害し、それにより、腫瘍転移および腫瘍増殖を予防する。

【００１４】 よって、本発明の方法によると、本発明の化合物を用いる血管形成の阻害は、
疾患の症状を改善でき、ある場合には、疾患を治療できる。

【００１５】 本発明の化合物に関する別の治療標的は、新血管新生によって特徴付けられる
眼病である。かかる眼病は、角膜新血管障害、例えば、角膜移植、ヘルペス性角
膜炎、梅毒性角膜炎、翼状片およびコンタクトレンズ使用に関連した新血管パン
ヌスを包含する。付加的な眼病は、また、年齢に関連した黄斑変性、推定眼ヒス
トプラスマ症、未熟児網膜症および新血管緑内障を包含する。

【００１６】 本発明は、さらに、式（Ｉ）で示される化合物および抗腫瘍剤、例えば、トポ
テカン（topotecan）およびシスプラチンを段階的にまたは物理的に配合して投 与することからなる腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。

【００１７】 本発明は、また、本発明の化合物のプロドラッグを包含する。プロドラッグは
、式（Ｉ）で示される活性な親薬物をイン・ビボで放出する共有結合した担体で
あると考えられる。よって、本発明の別の態様において、式（Ｉ）で示される化
合物の調製における中間体でもある、式（ＩＩ）：

【化５】 で示される新規プロドラッグまたはその医薬上許容される塩を提供する。

【００１８】 本発明の別の態様において、式（ＩＩＩ）：

【化６】 で示される新規中間体またはその医薬上許容される塩を提供する。

【００１９】 本明細書ではペプチドおよび化学技術分野で一般に用いられる略号および記号
を用いて本発明の化合物を記載する。一般に、アミノ酸略号は、Eur. J. Bioche
m., 158, 9 (1984)に記載されている生化学命名法についてのＩＵＰＡＣ−ＩＵ Ｂ共同委員会（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature）に
従う。

【００２０】 本明細書で使用される場合、Ｃ_1-6アルキルは、炭素原子１〜６個の置換され ていてもよいアルキル基を意味し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピ
ル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオ
ペンチルおよびヘキシルならびにその単純脂肪族異性体を包含する。

【００２１】 ある特定の試薬を本明細書中では略書きする。ＤＣＣは、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドを示し、ＤＭＡＰは、ジメチルアミノピリジンを示し、ＤＩＥＡは
、ジイソプロピルエチルアミンを示し、ＥＤＣは、１−(３−ジメチルアミノプ ロピル)−３−エチルカルボジイミド・塩酸塩を示す。ＨＯＢｔは、１−ヒドロ キシベンゾトリアゾールを示し、ＴＨＦは、テトラヒドロフランを示し、ＤＩＥ
Ａは、ジイソプロピルエチルアミンを示し、ＤＥＡＤはジエチルアゾジカルボキ
シレートを示し、ＰＰｈ₃は、トリフェニルホスフィンを示し、ＤＩＡＤは、ジ イソプロピルアゾジカルボキシレートを示し、ＤＭＥは、ジメトキシエタンを示
し、ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドを示し、ＮＢＳは、Ｎ−ブロモスクシンイ
ミドを示し、Ｐｄ／Ｃは、パラジウム−炭素触媒を示し、ＰＰＡは、ポリリン酸
を示し、ＤＰＰＡは、ジフェニルホスホリルアジドを示し、ＢＯＰは、ベンゾト
リアゾール−１−イルオキシ−トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフル
オロホスフェートを示し、ＨＦは、フッ化水素酸を示し、ＴＥＡは、トリエチル
アミンを示し、ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸を示し、ＰＣＣは、クロロクロム酸
ピリジニウムを示す。

【００２２】 式（Ｉ）で示される化合物は、その全内容が出典明示により本明細書の一部と
される１９９３年１月７日に公開されたBondinellらのＰＣＴ出願公開WO 93/000
95およびBondinellらのＰＣＴ出願公開WO 94/14776に記載の方法によって調製さ
れる。

【００２３】 さらに、式（Ｉ）で示される化合物は、下記スキームに詳細に記載される方法
によって調製される。

【００２４】

【化７】

【００２５】 １９９３年１月７日に公開されたBondinellらのＰＣＴ出願公開WO 93/00095お
よびBondinellらのＰＣＴ出願公開WO 94/14776に記載された一般的な方法により
調製された化合物Ｉ−１をミツノブ型カップリング反応（Organic Reactions 19
92, 42, 335-656; Synthesis 1981, 1-28）で２−[Ｎ−(３−ヒドロキシ−１− プロピル)−Ｎ−(tert−ブトキシカルボニル)アミノ]ピリジン−Ｎ−オキシドと
反応させてＩ−２を得る。該反応は、ジエチルアゾジカルボキシレートとトリフ
ェニルホスフィンとの間で形成された複合体により媒介され、非プロトン性溶媒
、例えば、ＴＨＦ、ＣＨ₂Ｃl₂またはＤＭＦ中で行われる。得られた生成物Ｉ− ２を、当業者によく知られている標準アルキル化条件下、２位（ベンゾアゼピン
・ナンバリング）でアルキル化することができる。例えば、Ｉ−２を、適当な溶
媒、通常、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＥまたはその混合物中、水素化ナトリウム、Ｌ
ＤＡまたはリチウムヘキサメチルジシラジドなどの塩基で処理してアミドＮ−Ｈ
の脱プロトン化を行うことができる。得られた陰イオン種を適当な求電子物質、
例えば、２,３,４−トリフルオロベンジルブロミドで処理してＮ−アルキル化を
引き起こし、生成物Ｉ−３を得る。標準的な酸性条件下、Ｉ−３からtert−ブト
キシカルバメート（Ｂｏｃ）基を除去してＩ−４を得ることができる。かかる条
件は、当業者によく知られており、適当な参考書物、例えば、Greene,“Protect
ive Groups in Organic Synthesis”(Wiley-Interscience発行) に記載されてい
る。不活性溶媒、例えば、メタノール、エタノール、または２−プロパノール中
、パラジウム触媒、好ましくは、活性炭上のパラジウム金属を用いる移動水素化
条件下、Ｉ−４のピリジン−Ｎ−オキシド部分を対応するピリジンＩ−５に還元
する。シクロヘキサン、１,４−シクロヘキサジエン、ギ酸、およびギ酸の塩、 例えば、ギ酸カリウムまたはギ酸アンモニウムが、この反応タイプにおける水素
移動試薬として一般に用いられる。Ｉ−５のメチルエステルを、水性塩基、例え
ば、水性ＴＨＦ中のＬiＯＨまたは水性メタノールもしくはエタノール中のＮaＯ
Ｈを用いて加水分解し、中間カルボン酸塩を適当な酸、例えば、ＴＦＡまたはＨ
Ｃlで酸性化してカルボン酸Ｉ−６を得る。別法としては、所望により、中間体 カルボン酸塩を単離することができるか、または、遊離カルボン酸のカルボン酸
塩を当業者によく知られている方法により調製することができる。

【００２６】 化合物の酸付加塩を標準的な方法において、適当な溶媒中、親化合物および過
剰の酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリ
フルオロ酢酸、マレイン酸、コハク酸またはメタンスルホン酸から調製する。親
化合物を適当なカチオンを含有する過剰のアルカリ試薬、例えば、水酸化物、炭
酸塩またはアルコキシドで；または適当な有機アミンで処理することによってカ
チオン塩を調製する。Ｌi⁺、Ｎa⁺、Ｋ⁺、Ｃa⁺⁺、Ｍg⁺⁺およびＮＨ₄ ⁺のようなカ チオンは、医薬上許容される塩に存在するカチオンの特別な例である。

【００２７】 本発明は、また、式（Ｉ）で示される化合物および医薬上許容される担体を含
有する医薬組成物を提供する。したがって、式（Ｉ）で示される化合物は、薬剤
の製造において使用してもよい。上記のように調製された式（Ｉ）で示される化
合物の医薬組成物は、非経口投与用の溶液剤または凍結乾燥粉末剤として処方し
てもよい。粉末剤は、適当な希釈剤または他の医薬上許容される担体の添加によ
って使用前に復元してもよい。液体製剤は、緩衝等張水溶液であってもよい。適
当な希釈剤の例は、通常等張生理食塩溶液、標準水中５％デキストロースまたは
緩衝酢酸ナトリウムもしくはアンモニウム溶液である。かかる製剤は、特に、非
経口投与に適するが、経口投与に使用してもよく、または吸入用の計量器付き吸
入器もしくは噴霧器中に含まれてもよい。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒ
ドロキシセルロース、アラビアガム、ポリエチレングリコール、マンニトール、
塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムなどの賦形剤を加えることが望ましい
。

【００２８】 別法として、これらの化合物は、経口投与用に、カプセルに入れたり、錠剤に
したり、または乳剤もしくはシロップ剤に調製してもよい。組成物の増量もしく
は安定化のために、または組成物の調製を容易にするために、医薬上許容される
固形または液状担体を加えてもよい。固形担体は、デンプン、ラクトース、硫酸
カルシウム・二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸
、タルク、ペクチン、アラビアガム、寒天またはゼラチンを包含する。液状担体
は、シロップ、落花生油、オリーブ油、生理食塩水および水を包含する。担体は
、また、単独またはワックスと一緒のモノステアリン酸グリセリンまたはジステ
アリン酸グリセリンのような徐放性物質を包含し得る。固形担体の量は、変化す
るが、好ましくは、投与単位あたり約２０ｍｇ〜約１ｇであろう。医薬調製物は
、錠剤の場合、粉砕、混合、顆粒化、および、必要ならば、圧縮；またはハード
ゼラチンカプセルの場合、粉砕、混合、および充填を含む製薬の慣用技術によっ
て調製される。液状担体を使用する場合、調製物は、シロップ剤、エリキシル剤
、乳剤または水性もしくは非水性懸濁剤の形態であろう。かかる液体製剤は、直
接、経口で投与してもよく、またはソフトゼラチンカプセル中に充填してもよい
。

【００２９】 直腸投与の場合、本発明の化合物は、また、カカオ脂、グリセリン、ゼラチン
またはポリエチレングリコールなどの賦形剤と組み合わせ、坐剤に成形してもよ
い。

【００３０】 本明細書に記載される化合物は、ビトロネクチン受容体のアンタゴニストであ
り、根元的な病状がビトロネクチン受容体と相互作用するリガンドまたは細胞に
起因する疾患の治療に有用である。例えば、これらの化合物は、骨マトリックス
の喪失が病状を生み出す疾患の治療に有用である。よって、本発明の化合物は、
骨粗鬆症、上皮小体亢進症、ページェット病、悪性疾患の高カルシウム血症、骨
転移により生じる骨溶解性病変、固定化または性ホルモン欠乏に起因する骨喪失
の治療に有用である。本発明の化合物は、また、抗腫瘍剤、抗血管形成剤、抗炎
症剤および抗転移剤として有用性を有し、アテローム性動脈硬化症および再狭窄
の治療に有用であると考えられる。

【００３１】 当該化合物は、薬物の濃度が骨吸収または他のかかる徴候を阻害するのに十分
であるような方法において経口または非経口のいずれかで患者に投与される。当
該化合物を含有する医薬組成物は、患者の症状に合った方法において約０.１〜 約５０ｍｇ／ｋｇの経口投与量で投与される。好ましくは、経口投与量は、約０
.５〜約２０ｍｇ／ｋｇであろう。急性疾患治療の場合、非経口投与が好ましい 。水または通常生理食塩水中５％デキストロース中におけるペプチド、または適
当な賦形剤を含む同様の製剤の静脈内輸液が最も効果的であるが、筋肉内ボーラ
ス注射もまた有用である。典型的には、非経口投与量は、約０.０１〜約１００ ｍｇ／ｋｇ；好ましくは、０.１〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。当該化合物は、１ 日の全投与量が約０.４〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日に達するようなレベルで１日 １〜４回投与される。当該化合物の正確な投与量および投与方法は、薬剤の血中
レベルを治療効果を得るのに必要な濃度と比較することにより当業者によって容
易に決定される。

【００３２】 本発明は、さらに、骨粗鬆症を治療するか、または骨喪失を阻害する方法であ
って、式（Ｉ）で示される化合物および他の骨吸収阻害剤、例えば、ビスホスホ
ネート（すなわち、アレンドロネート）、ホルモン置換療法、抗エストロゲンま
たはカルシトニンを段階的にまたは物理的に配合して投与することからなる方法
を提供する。さらに、本発明は、本発明の化合物および同化剤、例えば、骨喪失
の予防および／または骨量の増加に有用な骨形態発生タンパク質、イプロフラボ
ンを用いる治療方法を提供する。

【００３３】 さらに、本発明は、腫瘍増殖を阻害する方法であって、式（Ｉ）で示される化
合物および抗腫瘍剤を段階的にまたは物理的に配合して投与することからなる方
法を提供する。カンプトテシンアナログクラスの化合物、例えば、トポテカン、
イリノテカン（irinotecan）および９−アミノカンプトテシン、ならびに白金配
位錯体、例えば、シスプラチン、オルマプラチン（ormaplatin）およびテトラプ
ラチン（tetraplatin）は、抗腫瘍剤のよく知られた群である。カンプトテシン アナログクラスの化合物は、その全開示が出典明示により本明細書の一部とされ
る米国特許第5,004,758号、第4,604,463号、第4,473,692号、第4,545,880号、第
4,342,776号、第4,513,138号、第4,399,276号、欧州特許出願公開第0 418 099号
および第0 088 642号、Waniら, J. Med. Chem. 1986, 29, 2358、Waniら, J. Me
d. Chem. 1980, 23, 554、Waniら, J. Med. Chem. 1987, 30, 1774、およびNitt
aら, Proc. 14th International Congr. Chemotherapy, 1985, Anticancer Sect
ion 1, 28に記載されている。白金配位錯体であるシスプラチンは、プラチノー ル（Platinol（登録商標））の名称でブリストル・マイヤーズ−スクイブ・コー
ポレイション（Bristol Myers-Squibb Corporation）から入手できる。シスプラ
チンに関する有用な処方は、各々の全開示が出典明示により本明細書の一部とさ
れる米国特許第5,562,925号および第4,310,515号に記載されている。

【００３４】 式（Ｉ）で示される化合物および抗腫瘍剤を段階的にまたは物理的に配合して
投与することからなる腫瘍増殖を阻害する方法において、白金配位化合物、例え
ば、シスプラチンは、ゆっくりとした静脈内輸液を用いて投与することができる
。好ましい担体は、マンニトールを含有するデキストロース／生理食塩溶液であ
る。白金配位化合物の投与計画は、治療単位あたり体表面積１平方メートルあた
り約１〜約５００ｍｇ（ｍｇ／ｍ²)を基礎とする。白金配位化合物の輸液は、１
週に１〜２回行われ、この週単位の治療を数回繰り返してもよい。カンプトテシ
ンアナログクラスの化合物を非経口投与に用いる場合、一般に使用される治療単
位は、約５日間連続で１日あたり約０.１ｍｇ〜約３００.０ｍｇ／体表面積ｍ² である。最も好ましくは、トポテカンのために使用される治療単位は、約５日間
連続で１日あたり約１.０〜約２.０ｍｇ／体表面積ｍ²である。好ましくは、治 療単位は、約７日〜約２８日の間隔で少なくとも１回繰り返される。

【００３５】 医薬組成物は、式（Ｉ）で示される化合物および抗腫瘍剤の両方を用いて同じ
容器内に処方してもよいが、別々の容器における処方が好ましい。両方の薬剤が
溶液形態で提供される場合、それらは、同時に投与するための輸液／注射系また
はタンデム装置に含ませることができる。

【００３６】 式（Ｉ）で示される化合物および抗腫瘍剤を同時または別々に都合よく投与す
るために、単一の容器、例えば、箱、カートンまたは他の容器内に、各々が上記
のような非経口投与のための有効量の式（Ｉ）で示される化合物および上記のよ
うな非経口投与のための有効量の抗腫瘍剤を含んでいる個々の瓶、袋、バイアル
または他の容器を含むキットが調製される。かかるキットは、例えば、別々の容
器または同じ容器中の凍結乾燥したプラグ（plug）としてでもよい両方の薬剤、
および復元用溶液の容器を含むことができる。これの変形物は、使用前に混合す
ることができる単一容器の２つのチャンバーにおいて復元用溶液および凍結乾燥
プラグを含むものである。かかる装置を用いて抗腫瘍剤および本発明の化合物を
２つの容器中に別々にパッケージしてもよく、または、粉末として一緒に凍結乾
燥させて単一容器内に提供してもよい。

【００３７】 両方の薬剤が溶液形態で提供される場合、それらを同時に投与するための輸液
／注射系またはタンデム装置に含ませることができる。例えば、式（Ｉ）で示さ
れる化合物は、静脈注射可能な形態、または管系を介して第２の輸液袋中の抗腫
瘍剤に直列に連結した輸液袋中にあってもよい。かかる系を用いて、患者は、最
初に式（Ｉ）で示される化合物のボーラス型注射または輸液、次いで、抗腫瘍剤
の輸液を受けることができる。

【００３８】 いくつかの生物学的アッセイの１つにおいて化合物を試験して所定の薬理効果
を有するのに要求される化合物の濃度を決定してもよい。

【００３９】 ビトロネクチン結合の阻害 α_vβ₃と結合する固相[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０： バッファーＴ（２ ｍＭ ＣaＣl₂および１％オクチルグルコシドを含有する）中のヒト胎盤またはヒ
ト血小板α_vβ₃（０.１−０.３ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＭ ＣaＣl₂、１ｍＭ ＭnＣl₂ 、１ｍＭ ＭgＣl₂（バッファーＡ）および０.０５％ＮaＮ₃を含有するバッファ ーＴで希釈し、次いで、直ちに９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ニューヨーク州
ニューヨークのコーニング（Corning））に１ウェルあたり０.１ｍＬで加えた。
１ウェルあたりα_vβ₃ ０.１−０.２μｇを加えた。プレートを４℃で一夜イン キュベートした。実験時に、ウェルをバッファーＡで１回洗浄し、同じバッファ
ー中３.５％ウシ血清アルブミン０.１ｍＬと共に室温で１時間インキュベートし
た。インキュベーション後、ウェルを完全に吸引し、バッファーＡ ０.２ｍＬで
２回洗浄した。

【００４０】 化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解して２ｍＭ貯蔵溶液を得、これを最終化合物
濃度１００μＭまで結合バッファー（１５ｍＭ トリス−ＨＣl（ｐＨ７.４）、 １００ｍＭ ＮaＣl、１ｍＭ ＣaＣl₂、１ｍＭ ＭnＣl₂、１ｍＭ ＭgＣl₂）で希 釈した。次いで、該溶液を所望の最終化合物濃度まで希釈した。種々の濃度の非
標識アンタゴニスト（０.００１−１００μＭ）を３重試験でウェルに加え、次 いで、５.０ｎＭの[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０（６５−８６Ｃｉ／ミリモル
）を添加した。

【００４１】 プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェル
を完全に吸引し、氷冷したバッファーＡ ０.２ｍＬを用いてウェルからウェルへ
移す方式（well-to-well fashion）で１回洗浄した。受容体を１％ＳＤＳ ０.１
ｍＬで可溶化し、ベックマン（Beckman）ＬＳ液体シンチレーション・カウンタ ー中、レディ・セーフ（Ready Safe）３ｍＬを添加して液体シンチレーションカ
ウンティングによって効率４０％で、結合した[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０ を測定した。[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の非特異的結合を２μＭ ＳＫ＆Ｆ
−１０７２６０の存在下で測定し、一貫して全放射リガンド投入量の１％未満で
あった。ＩＣ₅₀（[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の結合を５０％阻害するため のアンタゴニストの濃度）をＬＵＮＤＯＮ−２プログラムを変更した非線形最小
二乗曲線−適合法によって決定した。Ｋ_i（アンタゴニストの解離定数）を方程 式：Ｋ_i＝ＩＣ₅₀／(１＋Ｌ／Ｋ_d)（ここに、ＬおよびＫ_dは、各々、[³Ｈ］−Ｓ Ｋ＆Ｆ−１０７２６０の濃度および解離定数である）によって算出した。 本発明の化合物は、約０.００３マイクロモルの濃度でＳＫ＆Ｆ １０７２６０
へのビトロネクチン結合を阻害する。

【００４２】 また、本発明の化合物を骨形成の阻害の評価に関して当該分野で標準的なアッ
セイ、例えば、欧州特許出願公開EP 528 587に開示された骨吸収窩（pit）形成 アッセイにおいてイン・ビトロおよびイン・ビボでの骨吸収について試験し、ま
た、それは、Wronskiら, Cells and Materials 1991, Sup. 1, 69-74に記載され
た、ラット破骨細胞の代わりにヒト破骨細胞、および卵巣切除ラットモデルを用
いて行ってもよい。

【００４３】 血管平滑筋細胞移動アッセイ ラットまたはヒト大動脈平滑筋細胞を用いた。８ｕｍの孔を有するポリカーボ
ネート膜（コスター（Costar））を用いることによって細胞移動をトランスウェ
ル（Transwell）細胞培養チャンバー中でモニターした。フィルターの下部表面 をビトロネクチンで被覆した。細胞を、０.２％ウシ血清アルブミンを補足した ＤＭＥＭ中に細胞２.５−５.０×１０⁶個／ｍＬの濃度で懸濁し、種々の濃度で 試験化合物を用いて２０℃で２０分間前処理した。溶媒単独を対照として用いた
。細胞懸濁液０.２ｍＬをチャンバーの上部コンパートメントに入れた。下部コ ンパートメントは、０.２％ウシ血清アルブミンを補足したＤＭＥＭ ０.６ｍＬ を含んだ。インキュベーションを９５％空気／５％ＣＯ₂の雰囲気中３７℃で２ ４時間行った。インキュベーション後、フィルターの上部表面上の非移動細胞を
穏やかに削り落とすことによって除去した。次いで、フィルターをメタノール中
に固定し、１０％ギームザ染色液で染色した。ａ）フィルターの下部表面へ移動
した細胞数をカウントすること、またはｂ）染色した細胞を１０％酢酸で抽出し
、次いで、６００ｎｍでの吸光度を測定することのいずれかによって移動を測定
した。

【００４４】 甲状腺上皮小体切除ラットモデル 各実験群は、成体雄性Sprague-Dawleyラット（体重２５０−４００ｇ）５−６
匹よりなる。ラットは、使用７日前に（販売元、タコニック・ファームズ（Taco
nic Farms）により）甲状腺上皮小体切除される。全てのラットに、３日毎に置 換用量のチロキシンを投与する。ラットへの投与後、ヘパリンを添加した試験管
に尾の静脈穿刺によって全血採取した直後に全血中の循環イオン化カルシウムレ
ベルを測定する。イオン化Ｃaレベル（チバ−コーニング（Ciba-Corning）モデ ル６３４カルシウムｐＨ分析器で測定した）が＜１.２ｍＭ／Ｌである場合、ラ ットを試験群に入れる。各ラットに留置静脈および動脈カテーテルを、各々、試
験物質のデリバリーおよび血液採取のために装着する。次いで、ラットにカルシ
ウム不含食餌および脱イオン水を与える。基準Ｃaレベルを測定し、各ラットに 対照ビヒクルまたはヒト上皮小体ホルモン１−３４ペプチド（ｈＰＴＨ１−３４
、生理食塩水／０.１％ウシ血清アルブミン中１.２５μｇ／ｋｇ／時間の投与量
、Bachem, Ca）またはｈＰＴＨ１−３４および試験物質の混合物のいずれかを、
外部のシリンジポンプを用いる静脈カテーテルを介する連続静脈内輸液により投
与する。各ラットのカルシウム血症応答を６−８時間の輸液期間の間、２時間の
間隔で測定する。

【００４５】 ヒト破骨細胞吸収および接着アッセイ 骨吸収窩吸収および接着アッセイが開発され、破骨細胞腫組織由来の正常なヒ
ト破骨細胞を用いて標準化された。アッセイ１は、レーザー共焦顕微鏡により破
骨細胞骨吸収窩容積を測定するために開発された。アッセイ２は、コラーゲンフ
ラグメント（吸収の間に放出される）を競合ＥＬＩＳＡによって測定する高処理
量スクリーンとして開発された。

【００４６】 アッセイ１（レーザー共焦顕微鏡を使用する） ・ ヒト破骨細胞腫由来の細胞懸濁液のアリコートを液体窒素貯蔵から取り出し
、迅速に３７℃に加温し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃で５分）によりＲＰ
ＭＩ−１６４０培地で１回洗浄する。 ・ 培地を吸引し、ネズミ抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体で置換し、次いで、ＲＰＭＩ−
１６４０培地で１：３に希釈する。懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、
頻繁に混合する。 ・ 細胞を冷ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、次いで、遠心分離（１０００ｒ
ｐｍ、４℃で５分）し、次いで、細胞を１５ｍｌの無菌遠心管に移す。単核細胞
の数を改良したノイバウアー（Neubauer）・カウンティング・チャンバー中で数
える。

【００４７】 ・ ヤギ抗−マウスＩgＧで被覆した十分な磁性ビーズ（単核細胞あたり５個） （ニューヨーク州グレート・ネックのダイナル（Dynal））をそれらの貯蔵瓶か ら取り出し、新鮮な培地５ｍｌに入れる（これは、毒性のアジ化物保存剤を洗い
去る）。ビーズを磁石上に固定することによって培地を除去し、新鮮な培地に取
り替える。 ・ ビーズを細胞と混合し、懸濁液を氷上で３０分間インキュベートする。該懸
濁液を頻繁に混合する。 ・ ビーズ被覆細胞を磁石上に固定し、残りの細胞（破骨細胞が豊富なフラクシ
ョン）を５０ｍｌの無菌遠心管にデカントする。 ・ 新鮮な培地をビーズ被覆細胞に加えていずれもの捕捉した破骨細胞を移動さ
せる。この洗浄過程を１０回繰り返す。ビーズ被覆細胞を捨てる。

【００４８】 ・ 二酢酸フルオレセインを用いて生存細胞を標識して生存能力のある破骨細胞
をカウンティング・チャンバー中で数える。大内径使い捨てプラスチックパスツ
ールピペットを用いてチャンバーに試料を加える。 ・ 破骨細胞を遠心分離によりペレット化し、密度を１０％ウシ胎児血清および
１.７ｇ／リットルの重炭酸ナトリウムを補足したＥＭＥＭ培地中の適当な数に 調整する（破骨細胞数は腫瘍によって異なる）。 ・ 細胞懸濁液の３ｍｌアリコート（化合物処理物あたり）を１５ｍｌの遠心管
へデカントする。細胞を遠心分離によりペレット化する。

【００４９】 ・ 各遠心管に、適当な化合物処理物３ｍｌを加える（ＥＭＥＭ培地中５０μＭ
に希釈した）。また、適当なビヒクル対照、陽性対照（１００μｇ／ｍｌに希釈
した抗−ビトロネクチン受容体ネズミモノクローナル抗体［８７ＭＥＭ１］）お
よびアイソタイプ対照（１００μｇ／ｍｌに希釈したＩgＧ_2a）も包含される。 試料を３７℃で３０分間インキュベートする。 ・ 細胞の０.５ｍｌアリコートを４８ウェルプレート中の無菌象牙質薄片上に 播種し、３７℃で２時間インキュベートする。各処理物を４重試験でスクリーン
する。 ・ 薄片を温かいＰＢＳ（６ウェルプレートにおいて１０ｍｌ／ウェル）を６回
交換して洗浄し、次いで、化合物処理物または対照試料を含有する新鮮な培地中
に入れる。試料を３７℃で４８時間インキュベートする。

【００５０】 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）法（破骨細胞系統の細胞のため
の選択染色） ・ 接着した破骨細胞を含有する骨薄片をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、２％
グルタルアルデヒド（０.２Ｍカコジル酸ナトリウム中）中に５分間固定する。 ・ 次いで、それらを水で洗浄し、ＴＲＡＰバッファー（Ｎ,Ｎ−ジメチルホル ムアミドに溶解し、１０ｍＭ酒石酸ナトリウムを含有する０.２５Ｍクエン酸バ ッファー（ｐＨ４.５）と混合した０.５ｍｇ／ｍｌナフトールＡＳ−ＢＩリン酸
塩）中３７℃で４分間インキュベートする。 ・ 冷水で洗浄後、薄片を１ｍｇ／ｍｌファースト・レッド・ガーネットを含有
する冷酢酸バッファー（０.１Ｍ、ｐＨ６.２）中に浸漬し、４℃で４分間インキ
ュベートする。 ・ 過剰のバッファーを吸引し、薄片を水で洗浄後、風乾する。 ・ ＴＲＡＰ陽性破骨細胞（赤煉瓦色／紫沈殿物）を明視野顕微鏡によって数え
、次いで、超音波処理により象牙質の表面から除去する。 ・ ニコン／レーザーテク（Nikon／Lasertec）ＩＬＭ２１Ｗ共焦顕微鏡を用い て骨吸収窩容積を測定する。

【００５１】 アッセイ２（ＥＬＩＳＡ読出し装置を使用する） アッセイ１の最初の９工程に記載のように、ヒト破骨細胞を増殖させ、化合物
スクリーニングのために調製する。明らかにするために、これらの工程を以下に
繰り返す。 ・ ヒト破骨細胞腫由来の細胞懸濁液のアリコートを液体窒素貯蔵から取り出し
、３７℃に迅速に加温し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃で５分）によりＲＰ
ＭＩ−１６４０培地で１回洗浄する。 ・ 培地を吸引し、ネズミ抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体で置換し、次いで、ＲＰＭＩ−
１６４０培地で１：３に希釈する。懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、
頻繁に混合する。 ・ 細胞を冷ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、次いで、遠心分離（１０００ｒ
ｐｍ、４℃で５分）し、次いで、細胞を１５ｍｌの無菌遠心管に移す。単核細胞
の数を改良したノイバウアー・カウンティング・チャンバー中で数える。

【００５２】 ・ ヤギ抗−マウスＩgＧで被覆した十分な磁性ビーズ（単核細胞あたり５個） （ニューヨーク州グレート・ネックのダイナル）をそれらの貯蔵瓶から取り出し
、新鮮な培地５ｍｌに入れる（これは、毒性のアジ化物保存剤を洗い去る）。ビ
ーズを磁石上に固定することによって培地を除去し、新鮮な培地に取り替える。
・ ビーズを細胞と混合し、懸濁液を氷上で３０分間インキュベートする。懸濁
液を頻繁に混合する。 ・ ビーズ被覆細胞を磁石上に固定し、残りの細胞（破骨細胞が豊富なフラクシ
ョン）を５０ｍｌの無菌遠心管にデカントする。 ・ 新鮮な培地をビーズ被覆細胞に加えていずれもの捕捉した破骨細胞を移動さ
せる。この洗浄過程を１０回繰り返す。ビーズ被覆細胞を捨てる。

【００５３】 ・ 二酢酸フルオレセインを用いて生存細胞を標識して生存能力のある破骨細胞
をカウンティング・チャンバー中で数える。大内径使い捨てプラスチックパスツ
ールピペットを用いて試料をチャンバーに加える。 ・ 破骨細胞を遠心分離によりペレット化し、密度を１０％ウシ胎児血清および
１.７ｇ／リットルの重炭酸ナトリウムを補足したＥＭＥＭ培地中の適当な数に 調整する（破骨細胞数は腫瘍によって異なる）。

【００５４】 アッセイ１に上記した方法とは対照的に、化合物を４種類の投与量でスクリー
ンして下記に概説するようにＩＣ₅₀を求める。 ・ 破骨細胞調製物を試験化合物（４種類の投与量）または対照と共に３７℃で
３０分間プレインキュベートする。 ・ 次いで、それらを４８ウェル組織培養プレートのウェル中のウシ皮質骨薄片
上に播種し、３７℃でさらに２時間インキュベートする。 ・ 骨薄片を温かいリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を６回交換して洗浄して非
接着細胞を除去し、次いで、新鮮な化合物または対照を含有する４８ウェルプレ
ートのウェルへ戻す。 ・ 次いで、組織培養プレートを３７℃で４８時間インキュベートする。 ・ 各ウェルからの上清を別々の試験管に吸引し、吸収過程の間に放出されるＩ
型コラーゲンのｃ−テロペプチドを検出する競合ＥＬＩＳＡにおいてスクリーン
する。これは、Ｉ型コラーゲンのａ１−鎖のカルボキシ末端テロペプチドに存在
する８アミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ）と特異的に反応するウサギ抗体を含有する市販のＥＬＩＳＡ（デン
マークのオステオメター（Osteometer））である。結果は、ビヒクル対照と比較
した吸収の％阻害で表す。

【００５５】 ヒト破骨細胞接着アッセイ アッセイ１の最初の９工程に上記したように、ヒト破骨細胞を増殖させ、化合
物スクリーニングのために調製する。明らかにするために、これらの工程を以下
に繰り返す。 ・ ヒト破骨細胞腫由来の細胞懸濁液のアリコートを液体窒素貯蔵から取り出し
、迅速に３７℃に加温し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分、４℃）によりＲＰ
ＭＩ−１６４０培地で１回洗浄する。 ・ 培地を吸引し、ネズミ抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体で置換し、次いで、ＲＰＭＩ−
１６４０培地で１：３に希釈する。懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、
頻繁に混合する。 ・ 細胞を冷ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、次いで、遠心分離（１０００ｒ
ｐｍ、４℃で５分）し、次いで、細胞を１５ｍｌの無菌遠心管に移す。単核細胞
の数を改良したノイバウアー・カウンティング・チャンバー中で数える。

【００５６】 ・ ヤギ抗−マウスＩgＧで被覆した十分な磁性ビーズ（単核細胞あたり５個） （ニューヨーク州グレート・ネックのダイナル）をそれらの貯蔵瓶から取り出し
、新鮮な培地５ｍｌに入れる（これは、毒性のアジ化物保存剤を洗い去る）。ビ
ーズを磁石上に固定することによって培地を除去し、新鮮な培地に取り替える。 ・ ビーズを細胞と混合し、懸濁液を氷上で３０分間インキュベートする。該懸
濁液を頻繁に混合する。 ・ ビーズ被覆細胞を磁石上に固定し、残りの細胞（破骨細胞が豊富なフラクシ
ョン）を５０ｍｌの無菌遠心管にデカントする。 ・ 新鮮な培地をビーズ被覆細胞に加えていずれもの捕捉した破骨細胞を移動さ
せる。この洗浄過程を１０回繰り返す。ビーズ被覆細胞を捨てる。

【００５７】 ・ 二酢酸フルオレセインを用いて生存細胞を標識して生存能力のある破骨細胞
をカウンティング・チャンバー中で数える。大内径使い捨てプラスチックパスツ
ールピペットを用いてチャンバーに試料を加える。 ・ 破骨細胞を遠心分離によりペレット化し、密度を１０％ウシ胎児血清および
１.７ｇ／リットルの重炭酸ナトリウムを補足したＥＭＥＭ培地中の適当な数に 調整する（破骨細胞数は腫瘍によって異なる）。

【００５８】 ・ 破骨細胞腫由来の破骨細胞を化合物（４種類の投与量）または対照とともに
３７℃で３０分間プレインキュベートする。 ・ 次いで、細胞をオステオポンチン被覆スライド（ヒトまたはラットオステオ
ポンチン２.５μｇ／ｍｌ）上に播種し、３７℃で２時間インキュベートする。 ・ リン酸緩衝生理食塩水でスライドを激しく洗浄することによって非接着細胞
を除去し、スライド上に残っている細胞をアセトン中に固定する。 ・ 破骨細胞を該表現型の細胞の選択マーカーである酒石酸抵抗性酸性ホスファ
ターゼ（ＴＲＡＰ）に対して染色し（工程１５−１７を参照のこと）、光学顕微
鏡によって数える。結果をビヒクル対照と比較した接着の％阻害で表す。

【００５９】 細胞接着アッセイ 細胞および細胞培養 ヒト胎芽腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）をＡＴＣＣから入手した（カタログ番号
ＣＲＬ１５７３）。アールの塩、１０％ウシ胎児血清、１％グルタミンおよび１
％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するイーグルの最少必須培地（ＥＭＥ
Ｍ）中で細胞を増殖させた。

【００６０】 構築およびトランスフェクション α_vサブユニットの３.２ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントおよびβ₃サ
ブユニットの２.４ｋｂ ＸｂａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、平滑末端ライゲー
ションにより、ＣＭＶプロモーターおよびＧ４１８選択マーカーを含有するｐＣ
ＤＮベクター（Aiyarら, 1994）のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶクローニング部位に 挿入した。安定な発現のために、ジーン・パルサー（Gene Pulser）（Hensleyら
, 1994）を用いてＨＥＫ２９３細胞８０×１０⁶個をα_v＋β₃構築物（各サブユ ニットのＤＮＡ ２０μｇ）で電気形質転換し、１００ｍｍプレート中に播いた （細胞５×１０⁵個／プレート）。４８時間後、増殖培地に４５０μｇ／ｍＬジ ェネティシン（Geneticin、Ｇ４１８硫酸塩、メリーランド州ベセスダのギブコ −ビーアールエル（GIBCO-BRL））を追加した。コロニーがアッセイするのに十 分な程に大きくなるまで、細胞を選択培地中で維持した。

【００６１】 トランスフェクト細胞の免疫細胞化学的分析 ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞がビトロネクチン受容体を発現するかどう
かを決定するために、遠心分離により細胞を顕微鏡スライドガラス上に固定し、
室温で２分間アセトン中に固定し、風乾させた。標準的な間接免疫蛍光法を用い
てα_vβ₃複合体に対して特異的なモノクローナル抗体である２３Ｃ６に対する特
異的な反応性を証明した。

【００６２】 細胞接着研究 コーニング（Corning）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをヒトビトロネクチン （ＲＰＭＩ培地中０.２μｇ／ｍＬ）０.１ｍＬで４℃で一夜、予め被覆した。実
験時に、このプレートをＲＰＭＩ培地で１回洗浄し、ＲＰＭＩ培地中３.５％Ｂ ＳＡで室温で１時間ブロックした。トランスフェクトされた２９３細胞を、２０
ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.４および０.１％ＢＳＡを補足したＲＰＭＩ培地に細 胞０.５×１０⁶個／ｍＬの密度で再懸濁した。細胞懸濁液０.１ｍＬを各ウェル に加え、種々のα_vβ₃アンタゴニストの存在または不在下で、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。インキュベーション後、１０％ホルムアルデヒド溶液（ｐＨ
７.４）０.０２５ｍＬを加え、細胞を室温で１０分間固定した。プレートをＲＰ
ＭＩ培地０.２ｍＬで３回洗浄し、接着細胞を０.５％トルイジン・ブルー０.１ ｍＬで室温で２０分間染色した。脱イオン水で大量に洗浄することにより過剰な
染料を除去した。５０ｍＭ ＨＣlを含有する５０％エタノール０.１ｍＬの添加 により、細胞中に取り込まれたトルイジン・ブルーを溶出させた。細胞接着を６
００ｎｍの光学濃度にてマイクロタイタープレート・リーダー（ヴァージニア州
スターリングのタイターテク・マルチスキャン・エムシー（Titertek Multiskan MC））上で定量した。

【００６３】 固相α_vβ₅結合アッセイ： ビトロネクチン受容体α_vβ₅をヒト胎盤から精製した。受容体調製物を５０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣl、ｐＨ７.５、１００ｍＭ ＮaＣl、１ｍＭ ＣaＣl₂、１ｍＭ ＭnＣl₂、１ｍＭ ＭgＣl₂（バッファーＡ）で希釈し、直ちに、１ウェルあたり ０.１ｍｌで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えた。α_vβ₃ ０.１−０.２μｇ
を１ウェルごとに加えた。プレートを４℃で一夜インキュベートした。実験時に
、ウェルをバッファーＡで１回洗浄し、同じバッファー中３.５％ウシ血清アル ブミン０.１ｍｌと共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーション 後、ウェルを完全に吸引し、バッファーＡ ０.２ｍｌで２回洗浄した。

【００６４】 [³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０競合アッセイにおいて、種々の濃度の非標識 アンタゴニスト（０.００１−１００μＭ）をウェルに加え、次いで、５.０ｎＭ
の[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を添加した。プレートを室温で１時間インキ ュベートした。インキュベーション後、ウェルを完全に吸引し、氷冷バッファー
Ａ ０.２ｍｌを用いてウェルからウェルへ移す方式で１回洗浄した。受容体を１
％ＳＤＳ ０.１ｍｌで可溶化し、結合した[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を、 ベックマンＬＳ６８００液体シンチレーション・カウンターにおいてレディ・セ
ーフ（Ready Safe）３ｍｌを添加して液体シンチレーション・カウンティングに
より効率４０％で測定した。[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の非特異的結合を ２μＭ ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の存在下で測定し、一貫して全放射リガンド投 入量の１％未満であった。ＩＣ₅₀（[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の結合を５ ０％阻害するアンタゴニストの濃度）をＬＵＮＤＯＮ−２プログラムを変更した
非線形最小二乗曲線−適合法によって決定した。Ｋ_i（アンタゴニストの解離定 数）をチェンおよびプルソフ（Cheng and Prusoff）の方程式：Ｋ_i＝ＩＣ₅₀／( １＋Ｌ／Ｋ_d)（ここに、ＬおよびＫ_dは、各々、[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０
の濃度および解離定数である）によって算出した。

【００６５】 ＲＧＤに媒介されるＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ結合の阻害 ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの精製 古い洗浄したヒト血小板（赤十字社から入手した）１０単位を３％オクチルグ
ルコシド、２０ｍＭトリス−ＨＣl、ｐＨ７.４、１４０ｍＭ ＮaＣl、２ｍＭ Ｃ
aＣl₂中、４℃で２時間穏やかに攪拌することによって溶解した。溶解物を１０ ０,０００ｇで１時間遠心分離した。得られた上清を２０ｍＭトリス−ＨＣl、ｐ
Ｈ７.４、１００ｍＭ ＮaＣl、２ｍＭ ＣaＣl₂、１％オクチルグルコシド（バッ
ファーＡ）で予め平衡化した５ｍＬのレンチル・レクチン・セファロース４Ｂカ
ラム（E. Y. Labs）に加えた。２時間インキュベーション後、カラムを冷バッフ
ァーＡ ５０ｍＬで洗浄した。レクチンに保持されたＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａを、 １０％デキストロースを含有するバッファーＡで溶出させた。全ての手順を４℃
で行った。得られたＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって示されるように純度＞９５％であった。

【００６６】 リポソームにおけるＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの取り込み ホスファチジルセリン（７０％）およびホスファチジルコリン（３０％）の混
合物（アバンチ・ポーラー・リピッズ（Avanti Polar Lipids））を窒素気流下 でガラス試験管の壁に乾燥させた。精製したＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａを最終濃度０
.５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、タンパク質：リン脂質比１：３（ｗ：ｗ）でリン脂 質と混合した。混合物を再懸濁し、超音波処理浴中で５分間超音波処理した。次
いで、１２,０００−１４,０００分子量分離透析チューブを用いて混合物を５０
ｍＭトリス−ＨＣl、ｐＨ７.４、１００ｍＭ ＮaＣl、２ｍＭ ＣaＣl₂の１００ ０倍過剰液（２回交換して）に対して一夜透析した。ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ含有
リポソームを１２,０００ｇで１５分間遠心分離し、約１ｍｇ／ｍＬの最終タン パク質濃度で透析バッファー中に再懸濁した。リポソームを必要時まで−７０℃
で貯蔵した。

【００６７】 ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａへの競合結合 [³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０をＲＧＤ型リガンドとして用いる間接的な競 合結合法によってフィブリノーゲン受容体（ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ）への結合を
アッセイした。９６ウェル濾過プレートアセンブリー（マサチューセッツ州ベッ
ドフォードのミリポア・コーポレイション（Millipore Corporation））におい て０.２２μｍ親水性デュラポア（durapore）膜を用いて結合アッセイを行った 。ウェルを１０μｇ／ｍＬポリリジン（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミ
カル・カンパニー（Sigma Chemical Co.））０.２ｍＬで室温で１時間予め被覆 して非特異的結合をブロックした。種々の濃度の非標識ベンゾアゼピンを４重試
験でウェルに加えた。[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を各ウェルに最終濃度４.
５ｎＭで加え、次いで、精製した血小板ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ含有リポソーム１
μｇを添加した。混合物を室温で１時間インキュベートした。ＧＰＩＩｂ−ＩＩ
Ｉａ−結合[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０をミリポア（Millipore）濾過マニホ
ールドを用いる濾過により未結合のものから分離し、次いで、氷冷バッファーで
洗浄した（２回、各０.２ｍＬ）。濾過器に残存している結合した放射能をベッ クマン液体シンチレーション・カウンター（Model LS6800）におけるレディ・ソ
ルブ（Ready Solve）（カリフォルニア州フラートンのベックマン・インストゥ ルメンツ（Beckman Instruments））１.５ｍＬ中において効率４０％でカウント
した。２μＭ非標識ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の存在下で非特異的結合を測定し、
一貫して試料に加えた全放射能の０.１４％未満であった。全データポイントは 、４回の測定の平均である。

【００６８】 競合的結合データを非線形最小二乗曲線適合法によって分析した。該方法は、
アンタゴニストのＩＣ₅₀（[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の特異的結合を平衡 で５０％阻害するアンタゴニストの濃度）を提供する。ＩＣ₅₀は、チェンおよび
プルソフ方程式：Ｋ_i＝ＩＣ₅₀／（１＋Ｌ／Ｋ_d）（ここに、Ｌは、競合結合アッ
セイに使用される[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の濃度（４.５ｎＭ）であって
、Ｋ_dは[³Ｈ]−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の解離定数であり、それは、スキャッチ
ャード（Scatchard）分析によって決定されたように４.５ｎＭである）に基づく
アンタゴニストの平衡解離定数（Ｋ_i）と関係がある。

【００６９】 本発明の化合物は、１０：１より大きな、フィブリノーゲン受容体に相対的な
ビトロネクチン受容体に対するアフィニティーを有する。この化合物は、１００
：１よりも大きな活性比を有する。

【００７０】 単独または抗腫瘍剤と組み合わせた式（Ｉ）で示される化合物の効力は、いく
つかの移植可能なマウス腫瘍モデルを用いて決定してもよい。これらのモデルの
詳細は、米国特許第5,004,758号および第5,633,016号を参照のこと。

【００７１】 以下の実施例は、如何なる場合も本発明の範囲を限定しようとするものではな
く、本発明の化合物を製造および使用する方法を説明するために提供されるもの
である。多くの他の実施態様が当業者にとって容易に明らかとなるであろう。

【００７２】 実施例 一般的記載 ¹Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、２５０または４００ＭＨｚのいずれ かで記録した。化学シフトは、内部標準テトラメチルシラン（ＴＭＳ）より百万
分のいくつ（ｐｐｍ）低磁場か（δ）で示す。ＮＭＲデータの略号は次のとおり
である：ｓ＝１重線、ｄ＝２重線、ｔ＝３重線、ｑ＝４重線、ｍ＝多重線、ｄｄ
＝２重線が２重、ｄｔ＝３重線が２重、ａｐｐ＝見かけ、ｂｒ＝幅広い。Ｊは、
ヘルツで測定したＮＭＲ結合定数を示す。ＣＤＣl₃は、ジュウテリオクロロホル
ムであり、ＤＭＳＯ−ｄ₆は、ヘキサジュウテリオジメチルスルホキシドであり 、ＣＤ₃ＯＤは、テトラジュウテリオメタノールである。赤外（ＩＲ）スペクト ルは、透過方式で記録し、バンド位置を波長の逆数（ｃｍ^-1）で示す。マススペ
クトルは、電子スプレー（ＥＳ）イオン化技術を用いて得た。元素分析は、ニュ
ージャージー州ホワイトハウスのクォンティテイティブ・テクノロジズ・インコ
ーポレイテッド（Quantitative Technologies Inc.）により行った。融点は、ト
ーマス−フーバー（Thomas-Hoover）融点装置で得、修正しない。全ての温度を 摂氏で示す。アナルテク・シリカ・ゲル（Analtech Silica gel）ＧＦおよびイ ー・メルク・シリカ・ゲル（E. Merck Silica Gel）６０ Ｆ−２５４薄層プレー
トを薄層クロマトグラフィーに用いた。フラッシュおよび重力クロマトグラフィ
ーは、共に、イー・メルク・キーゼルゲル（E. Merck Kieselgel）６０（２３０
−４００メッシュ）シリカゲル上で行った。分析および分取ＨＰＬＣは、レイニ
ン（Rainin）またはベックマン・クロマトグラフで行った。ＯＤＳは、オクタデ
シルシリル誘導体化シリカゲルクロマトグラフィー支持体を示す。５μＡｐｅｘ
−ＯＤＳは、コロラド州リトルトンのジョーンズ・クロマトグラフィー（Jones
Chromatography）によって製造された５μの名目上の粒度を有するオクタデシル
シリル誘導体化シリカゲルクロマトグラフィー支持体を示す。ＹＭＣ ＯＤＳ− ＡＱ（登録商標）は、ＯＤＳクロマトグラフィー支持体であって、日本、京都の
ＹＭＣリミテッド・カンパニー（YMC Co. Ltd.）の登録商標である。ＰＲＰ−１
（登録商標）は、ポリマー（スチレン−ジビニルベンゼン）クロマトグラフィー
支持体であって、ネバダ州リーノーのハミルトン・カンパニー（Hamilton Co.）
の登録商標である。セライト（Celite（登録商標））は、酸洗浄珪藻土シリカで
構成される濾過助剤であって、コロラド州デンバーのマンヴィル・コーポレイシ
ョン（Manville Corp.）の登録商標である。

【００７３】 実施例１ (Ｓ)−３−オキソ−８−[３−(ピリジン−２−イルアミノ)−１−プロピルオ キシ]−２−[２,３,４−(トリフルオロベンジル)−２,３,４,５−テトラヒドロ −１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸の調製

【００７４】 調製例１ (±)−８−ヒドロキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２ −ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルの調製 ａ） ４−ブロモ−３−ブロモメチルアニソール ２−ブロモ−５−メトキシトルエン（２０ｇ、０.１０モル）、Ｎ−ブロモス クシンイミド（１９.６ｇ、０.１１モル）、ベンゾイルペルオキシド（１ｇ、４
ミリモル）、および塩化メチレン（２００ｍＬ）の混合物にフラッドランプを１
８時間照射して穏やかに還流させた。次いで、混合物を−１０℃に数時間冷却し
、溶液をデカントして沈殿したスクシンイミドを除去した。該溶液を濃縮し、残
留物をクロロホルム／ヘキサンから結晶化して標記化合物を薄黄色角柱体として
得た（１９.７ｇ、７０％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl₃）δ ７.４５(ｄ，Ｊ＝８. ９Ｈz，１Ｈ)、６.９９(ｄ，Ｊ＝３Ｈz，１Ｈ)、６.７４(ｄｄ，Ｊ＝８.９，３ Ｈz，１Ｈ)、４.５５(ｓ，２Ｈ)、３.８０(ｓ，３Ｈ)。

【００７５】 ｂ） ３−ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノメチル−４−ブロモアニソ
ール ４−ブロモ−３−ブロモメチルアニソール（２４ｇ、８６ミリモル）およびカ
リウムジ−tert−ブチルイミノジカルボキシレート（２４ｇ、９４ミリモル）の
ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）中混合物を、アルゴン下、室温で１８時間
攪拌した。次いで、反応を真空濃縮し、残留物を酢酸エチルと水との間で分配し
た。有機相を水および食塩水で洗浄し、乾燥させ（ＭgＳＯ₄）、濃縮した。残留
物をヘキサンから再結晶して標記化合物を白色固体として得た（１５ｇ、４２％
）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl₃）δ ７.４０(ｄ，Ｊ＝８.６Ｈz，１Ｈ)、６.６８(ｍ
，２Ｈ)、４.８１(ｓ，２Ｈ)、３.７４(ｓ，３Ｈ)、１.４４(ｓ，１８Ｈ)。

【００７６】 ｃ） (±)−３−カルボメトキシ−４−[２−ビス(tert−ブトキシカルボニル
)アミノメチル−４−メトキシフェニル]−３−ブテン酸メチル ５００ｍＬのフラスコに３−ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノメチル−
４−ブロモアニソール（１５ｇ、３６ミリモル）、イタコン酸ジメチル（７.５ ｇ、４７ミリモル）、トリ−ｏ−トリルホスフィン（１ｇ、３モル）、酢酸パラ
ジウム（０.４ｇ、２ミリモル）、ジイソプロピルエチルアミン（１２.８ｍＬ、
７２ミリモル）、およびプロピオニトリル（１５０ｍＬ）を入れた。混合物をア
ルゴンでパージし（排気／アルゴンフラッシュのサイクルを数回）、次いで、ア
ルゴン下、１時間加熱還流した。反応を室温に冷却し、次いで、氷冷エチルエー
テル（５００ｍＬ）中に注いだ。得られた沈殿物を濾去し、濾液を濃縮した。残
留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中１０％−２０％酢酸エチル）
に付すことにより精製して標記化合物を薄黄色油状物として得た（１１.８ｇ、 ６６％）：¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣl₃）δ ７.９４(ｓ，１Ｈ)、７.１５(ｄ，Ｊ＝８
.１Ｈz，１Ｈ)、６.７７(ｄ，Ｊ＝８.１Ｈz，１Ｈ)、６.７６(ｓ，１Ｈ)、４.７
３(ｓ，２Ｈ)、３.８１(ｓ，３Ｈ)、３.７９(ｓ，３Ｈ)、３.７１(ｓ，３Ｈ)、 ３.３８(ｓ，２Ｈ)、１.４５(ｓ，１８Ｈ)。

【００７７】 ｄ） (±)−３−カルボメトキシ−４−[２−ビス(tert−ブトキシカルボニル
)アミノメチル−４−メトキシフェニル]ブタン酸メチル (±)−３−カルボメトキシ−４−[２−ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミ ノメチル−４−メトキシフェニル]−３−ブテン酸メチル（１１.８ｇ）、酢酸エ
チル（１２０ｍＬ）、および１０％パラジウム−炭（１ｇ）を入れた圧力容器を
４５ｐｓｉの水素下で１８時間振盪した。次いで、混合物を濾過し、濾液を濃縮
して標記化合物を無色油状物として得た（１２ｇ、１００％）：¹Ｈ ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣl₃）δ ７.００(ｄ，Ｊ＝８.２Ｈz，１Ｈ)、６.７１(ｍ，２Ｈ)、４.８１( ｓ，２Ｈ)、３.７５(ｓ，３Ｈ)、３.６６(ｓ，３Ｈ)、３.６３(ｓ，３Ｈ)、３. ０５(ｍ，２Ｈ)、２.７３(ｍ，２Ｈ)、２.４２(ｄｄ，Ｊ＝１６.０，４.８Ｈz，
１Ｈ)、１.４４(ｓ，１８Ｈ)。

【００７８】 ｅ） (±)−３−カルボメトキシ−４−[２−(アミノメチル)−４−メトキシ フェニル]ブタン酸メチル (±)−３−カルボメトキシ−４−[２−ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミ ノメチル−４−メトキシフェニル]ブタン酸メチル（１２ｇ）のクロロホルム（ １００ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（５０ｍＬ）中溶液を、アルゴン下、室温
で４時間攪拌した。次いで、溶液を真空濃縮して標記化合物を粘性油状物として
得た（１０ｇ、１００％）：ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ ２９６.２(Ｍ＋Ｈ)⁺。

【００７９】 ｆ） (±)−８−メトキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ −２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル (±)−３−カルボメトキシ−４−[２−(アミノメチル)−４−メトキシフェニ ル]ブタン酸メチル（１０ｇ、２４ミリモル）およびトリエチルアミン（１７ｍ Ｌ、１２０ミリモル）のトルエン（１００ｍＬ）中溶液を１８時間加熱還流した
。次いで、反応を濃縮し、残留物を酢酸エチルと水との間で分配した。水性層を
酢酸エチルで２回抽出し、合わせた有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥させ（Ｍ
gＳＯ₄）、濃縮して標記化合物を黄褐色固体として得た（４.８ｇ、７６％）： ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ ２６４.２(Ｍ＋Ｈ)⁺。

【００８０】 ｇ） (±)−８−ヒドロキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１ Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル アルゴン下、０℃の(±)−８−メトキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラ ヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル（３.０ｇ、１１ミリモル ）およびエタンチオール（４.２ｍＬ、５７ミリモル）の塩化メチレン（１００ ｍＬ）中攪拌溶液に無水塩化アルミニウム（７.６ｇ、５７ミリモル）を滴下し た。得られた混合物を室温に加温し、一夜攪拌し、次いで、濃縮した。残留物を
氷−水でトリチュレートし、得られた固体を濾過により回収し、乾燥させて標記
化合物をオフホワイト色の固体として得た（２.６４ｇ、９１％）：ＭＳ(ＥＳ) ｍ／ｅ ２５０.２(Ｍ＋Ｈ)⁺。

【００８１】 調製例２ (±)−８−ヒドロキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２ −ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルのエナンチオマーのＨＰＬＣ分離 ａ） (Ｒ)−(＋)−８−ヒドロキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒド ロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルおよび(Ｓ)−(−)−８−ヒドロ
キシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン− ４−酢酸メチル (±)−８−ヒドロキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２ −ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルを、以下の条件を用いるキラルＨＰＬＣによ
りそのエナンチオマーに分割した：ダイアセル・キラルパックＡＳ（Diacel Chi
ralpak AS（登録商標））カラム（２１.２×２５０ｍｍ）、ＥtＯＨ移動相、流 速７ｍＬ／分、２５４ｎｍでｕｖ検出、注入７０ｍｇ；(Ｒ)−(＋)−８−ヒドロ
キシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン− ４−酢酸メチルのｔ_R＝２１.５分；(Ｓ)−(−)−８−ヒドロキシ−３−オキソ−
２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルのｔ_R ＝３９.１分。

【００８２】 調製例３ (±)−８−メトキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２− ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルのエナンチオマーのＨＰＬＣ分離 ａ） (Ｒ)−(+)−８−メトキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−
１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルおよび(Ｓ)−(−)−８−メトキシ−
３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢 酸メチル (±)−８−メトキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２− ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルを、以下の条件を用いるキラルＨＰＬＣにより
そのエナンチオマーに分割した：ダイアセル・キラルパックＡＳ（登録商標）カ
ラム（２１.２×２５０ｍｍ）、ＣＨ₃ＣＮ移動相、流速１５ｍＬ／分、２５４ｎ
ｍでｕｖ検出、注入５００ｍｇ；(Ｒ)−(＋)−８−メトキシ−３−オキソ−２, ３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルのｔ_R＝ １０.２分；(Ｓ)−(−)−８−メトキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒド
ロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルのｔ_R＝１９.０分。

【００８３】 調製例４ (Ｓ)−８−メトキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２− ベンゾアゼピン−４−酢酸メチルの脱メチル化 ａ） (Ｓ)−８−ヒドロキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１ Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル アルゴン下、−８℃の三臭化ホウ素（２０.５３ｍＬ、０.２１７モル）のＣＨ
Ｃl₃（１６０ｍＬ）中溶液に(Ｓ)−８−メトキシ−３−オキソ−２,３,４,５− テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル（１５.０ｇ、０.０
５７モル）のＣＨＣl₃（１６０ｍＬ）中溶液を、温度を−５℃〜０℃に維持しつ
つ、３０分にわたって滴下した。反応混合物を約−８℃で３０分間攪拌し、次い
で、ＭeＯＨ（２００ｍＬ）を、温度を約０℃に維持しつつ、最初に滴下して添 加した。反応混合物を濃縮して粘性油状物を得、これをＭeＯＨ（１００ｍＬ） から再濃縮した。該油状物をＨ₂Ｏ／ＭeＯＨに溶解し、少量の黒ずんだ固体を濾
去した。濾液を５０％水酸化ナトリウムで（ｐＨ７に）中和し、その間に白色固
体が沈殿した。懸濁液のｐＨを少量の酢酸の添加により４.５に調整し、固体を 回収し、真空乾燥させて標記化合物を得た（９.７ｇ、６８％）。生成物を、Ｈ ＰＬＣによりキラル純度についてアッセイした：キラルパックＡＳ（登録商標）
カラム（４.６×５０ｍｍ）、１００％ＥtＯＨ移動相、流速０.５ｍＬ／分、２ １５ｎｍでのｕｖ検出；ｔ_R＝７.５分（Ｓ−エナンチオマー、９９％）；ｔ_R＝ ４.４分（Ｒ−エナンチオマー、１％）。

【００８４】 調製例５ ２−[Ｎ−(３−ヒドロキシ−１−プロピル)−Ｎ−(tert−ブトキシカルボニル
)アミノ]ピリジン−Ｎ−オキシドの調製

【００８５】 ａ） ２−[(３−ヒドロキシ−１−プロピル)アミノ]ピリジン−Ｎ−オキシド ２−クロロピリジン−Ｎ−オキシド（１６.６ｇ、０.１モル）、３−アミノ−
１−プロパノール（１５.３ｍＬ、０.２モル）、ＮaＨＣＯ₃（４２ｇ、０.５モ ル）、tert−アミルアルコール（１００ｍＬ）の混合物を加熱還流した。２１時
間後、反応を冷却し、ＣＨ₂Ｃl₂（３００ｍＬ）で希釈し、吸引濾過して不溶性 物質を除去した。濾液を濃縮し、トルエンから再濃縮して黄色油状物を得た。シ
リカゲルクロマトグラフィー（２０％ＭeＯＨ／ＣＨＣl₃）に付して標記化合物 を黄色固体として得た（１５.６２ｇ、９３％）；ＴＬＣ（２０％ＭeＯＨ／ＣＨ
Ｃl₃）Ｒ_f０.４８；¹Ｈ ＮＭＲ（２５０、ＣＤＣl₃）δ ８.０７(ｄｄ，Ｊ＝６.
６，１.２Ｈz，１Ｈ)、７.３４(ｂｒ ｔ，１Ｈ)、７.１０−７.３０(ｍ，１Ｈ) 、６.６４(ｄｄ，Ｊ＝８.５，１.４Ｈz，１Ｈ)、６.４０−６.６０(ｍ，１Ｈ)、
４.４９(ｂｒ ｓ，１Ｈ)、３.６５−３.９０(ｍ，２Ｈ)、３.３５−３.６０(ｍ ，２Ｈ)、１.７５−２.００(ｍ，２Ｈ)；ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ １６９(Ｍ＋Ｈ)⁺。

【００８６】 ｂ） ２−[Ｎ−(３−ヒドロキシ−１−プロピル)−Ｎ−(tert−ブトキシカル
ボニル)アミノ]ピリジン−Ｎ−オキシド ２−[(３−ヒドロキシ−１−プロピル)アミノ]ピリジン−Ｎ−オキシド（８. ０ｇ、４７.６ミリモル）のtert−ＢuＯＨ（８０ｍＬ）中溶液をジ−tert−ブチ
ルジカーボネート（１１.４ｇ、５５.３ミリモル）で処理した。１８時間後、溶
液を濃縮し、残留物をヘキサンでトリチュレートした。得られた固体を真空乾燥
させて標記化合物をオフホワイト色の固体として得た（１２.５ｇ、９８％）； ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ ２６９.３(Ｍ＋Ｈ)⁺。

【００８７】 調製例６ (Ｓ)−３−オキソ−８−[３−(ピリジン−２−イルアミノ)−１−プロピルオ キシ]−２−(２,３,４−トリフルオロベンジル)−２,３,４,５−テトラヒドロ−
１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸の調製

【００８８】 ａ） (Ｓ)−８−[３−[Ｎ−(１−オキソピリジン−２−イル)−Ｎ−(tert− ブトキシカルボニル)アミノ]−１−プロピルオキシ]−３−オキソ−２,３,４,５
−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル 室温で、(Ｓ)−８−ヒドロキシ−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ− １Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル（０.６５ｇ、２.７５ミリモル）お
よびトリフェニルホスフィン（１.９４ｇ、７.４ミリモル）の無水ＤＭＦ（１３
.５ｍＬ）中溶液に２−[Ｎ−(３−ヒドロキシ−１−プロピル)−Ｎ−tert−ブト
キシカルボニル)アミノ]ピリジン−Ｎ−オキシド（１.８ｇ、６.８４ミリモル）
およびジエチルアゾジカルボキシレート（１.１９ｇ、６.８４ミリモル）の無水
ＤＭＦ（２２.５ｍＬ）中溶液を１０分間にわたって滴下した。１６時間後、溶 液を茶色の油状物に蒸発させ、これを酢酸エチル（５００ｍＬ）と水（１００ｍ
Ｌ）との間で分配させた。有機層を水（２×１００ｍＬ）および食塩水（１００
ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎa₂ＳＯ₄）、濃縮して薄茶色の油状物を得た。シ リカゲルクロマトグラフィー（５％ＭeＯＨ／ＣＨ₂Ｃl₂）に付すことにより精製
して標記化合物を得た（０.８５ｇ、６０％）。ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ ５００.３(Ｍ
＋Ｈ)⁺。

【００８９】 ｂ） (Ｓ)−８−[３−[Ｎ−(１−オキソピリジン−２−イル)−Ｎ−(tert− ブトキシカルボニル)アミノ]−１−プロピルオキシ]−２−(２,３,４−トリフル
オロベンジル)−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾア
ゼピン−４−酢酸メチル アルゴン下、−１５℃で、(Ｓ)−８−[３−[Ｎ−(１−オキソピリジン−２− イル)−Ｎ−(tert−ブトキシカルボニル)アミノ]−１−プロピルオキシ]−３− オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メ チル（０.４７０ｇ、０.９４ミリモル）の無水ＤＭＦ（１０.０ｍＬ）中溶液に リチウムビス(トリメチルシリル)アミド（１.０ｍＬ、１.０ミリモル）の１.０ Ｍ溶液を滴下した。１０分後、２,３,４−トリフルオロベンジルブロミド（０. ２２ｇ、０.９６ミリモル）の無水ＴＨＦ（５.０ｍＬ）中溶液を滴下した。溶液
を２時間にわたって室温に加温した。１８時間後、溶液を蒸発させ、残留物を酢
酸エチル（２００ｍＬ）と水（３０ｍＬ）との間で分配させた。有機層を水（２
×２５ｍＬ）および食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎa₂ＳＯ₄）、濃 縮して薄黄色の固体を得た。シリカゲルクロマトグラフィー（５％ＭeＯＨ／Ｃ Ｈ₂Ｃl₂）に付すことにより精製して標記化合物を得た（０.４５ｇ、７５％）。
ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ ６４４.１(Ｍ＋Ｈ)⁺。

【００９０】 ｃ） (Ｓ)−８−[３−[Ｎ−(１−オキソピリジン−２−イル)アミノ]−１− プロピルオキシ]−２−(２,３,４−トリフルオロベンジル)−３−オキソ−２,３
,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル (Ｓ)−８−[３−[Ｎ−(１−オキソピリジン−２−イル)−Ｎ−(tert−ブトキ シカルボニル)アミノ]−１−プロピルオキシ]−２−(２,３,４−トリフルオロベ
ンジル)−３−オキソ−２,３,４,５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン
−４−酢酸メチル（０.３９、０.６１ミリモル）を１,４−ジオキサン中４.０Ｍ
塩化水素の溶液（２０ｍＬ）に溶解し、反応を室温で１６時間保持した。溶媒を
除去して油状物を得、これをエーテルでトリチュレートして固化した。この物質
を塩化メチレン（８０ｍＬ）に溶解し、飽和ＮaＨＣＯ₃（１０ｍＬ）で洗浄した
。有機層を乾燥させ（Ｎa₂ＳＯ₄）、濃縮して標記化合物を得た（０.３３ｇ、９
８％）。ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ ５４４.１(Ｍ＋Ｈ)⁺。

【００９１】 ｄ） (Ｓ)−３−オキソ−８−[３−(ピリジン−２−イルアミノ)−１−プロ ピルオキシ]−２−(２,３,４−トリフルオロベンジル)−２,３,４,５−テトラヒ
ドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル (Ｓ)−８−[３−[Ｎ−(１−オキソピリジン−２−イル)アミノ]−１−プロピ ルオキシ]−２−(２,３,４−トリフルオロベンジル)−３−オキソ−２,３,４,５
−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル（０.２８ｇ、０.
５２ミリモル）およびシクロヘキセン（０.２８ｇ、３.３５ミリモル）の、１０
％Ｐd／Ｃ（０.２７０ｇ）を含有するメタノール（１５ｍＬ）中溶液を１６時間
加熱還流し、冷却し、セライト（celite（登録商標））を介して濾過した。濾液
を濃縮して標記化合物を得た（０.２７ｇ、９９％）。ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ ５２８
.１(Ｍ＋Ｈ)⁺。

【００９２】 ｅ） (Ｓ)−３−オキソ−８−[３−(ピリジン−２−イルアミノ)−１−プロ ピルオキシ]−２−(２,３,４−トリフルオロベンジル)−２,３,４,５−テトラヒ
ドロ−１Ｈ−２−ベンゾアゼピン−４−酢酸 (Ｓ)−３−オキソ−８−[３−(ピリジン−２−イルアミノ)−１−プロピルオ キシ]−２−(２,３,４−トリフルオロベンジル)−２,３,４,５−テトラヒドロ−
１Ｈ−ベンゾアゼピン−４−酢酸メチル（０.２７ｇ、０.５２ミリモル）の、メ
タノール（１５ｍＬ）および０.５Ｎ ＮaＯＨ（３.０ｍＬ）の混合物中溶液を５
０℃で加熱した。２時間後、反応を室温に冷却し、ＴＦＡ（０.５０ｍＬ）で処 理し、濃縮して薄黄色の固体を得た。半分取ＨＰＬＣ（ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ、 １０μｍ、１２０Ａ、５０ｍｍ×２５０ｍｍ、０.１％ＴＦＡを含有する４０％ ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏ）に付すことにより精製して標記化合物を得た（０.２１０ｇ 、６７％）。ＭＳ(ＥＳ)ｍ／ｅ ５１４.４(Ｍ＋Ｈ)⁺。元素分析（Ｃ₂₇Ｈ₂₆Ｆ₃Ｎ ₃ Ｏ₄・１.３ＣＦ₃ＣＯ₂Ｈ：Ｃ, ５３.７３；Ｈ, ４.１６；Ｎ, ６.３５。測定値
：Ｃ, ５３.６４；Ｈ, ４.１１；Ｎ, ６.１４。

【００９３】 実施例２ 非経口投与単位組成物 実施例１の化合物２０ｍｇを無菌乾燥粉末として含有する調製物を以下のとお
り調製する：当該化合物２０ｍｇを蒸留水１５ｍＬに溶解する。溶液を無菌条件
下で２５ｍＬの多投与アンプル中に濾過し、凍結乾燥する。粉末を静脈注射また
は筋肉注射用の水中５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）２０ｍＬの添加により復元す
る。投与量は、注射容量により決定される。次いで、計量した容量のこの投与単
位を別の容量の注射用Ｄ５Ｗに添加することにより希釈してもよいか、また、計
量した投与量を、ＩＶ点滴用瓶もしくは袋または他の注射−輸液系のような薬物
を投薬するための別の装置に添加してもよい。

【００９４】 実施例３ 経口投与単位組成物 実施例１の化合物５０ｍｇをラクトース７５ｍｇおよびステアリン酸マグネシ
ウム５ｍｇと混合し、粉砕することにより経口投与用カプセルを調製する。得ら
れた粉末をスクリーンし、ハードゼラチンカプセルに充填する。

【００９５】 実施例４ 経口投与単位組成物 シュークロース２０ｍｇ、硫酸カルシウム・二水和物１５０ｍｇおよび実施例
１の化合物５０ｍｇを１０％ゼラチン溶液と混合し、顆粒化することにより経口
投与用錠剤を調製する。湿顆粒をスクリーンし、乾燥させ、デンプン１０ｍｇ、
タルク５ｍｇおよびステアリン酸３ｍｇと混合し；錠剤に圧縮する。

【００９６】 上記の記載は、本発明の製法および使用法を完全に開示するものである。しか
しながら、本発明は、本明細書の上記に記載の特定の具体例に限定するものでは
ないが、以下の請求の範囲の範囲内でのその全ての修飾を包含するものである。
本明細書に引用した定期刊行物、特許および他の出版物に関する種々の言及は、
当該分野の現状を構成するものであり、出典明示により完全に示されるかのごと
く本明細書の一部とされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 19/10 29/00 29/00 35/00 35/00 35/04 35/04 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ Ｆターム(参考） 4C086 BC32 GA07 GA08 MA03 MA05 NA14 ZA45 ZA97 ZB11 ZB21 ZB26 ZC42

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
2. 【請求項２】 請求項１記載の化合物および医薬上許容される担体を含有し
   てなる医薬組成物。
3. 【請求項３】 請求項１記載の化合物、抗腫瘍剤および医薬上許容される担
   体を含有してなる医薬組成物。
4. 【請求項４】 抗腫瘍剤がトポテカンである請求項３記載の医薬組成物。
5. 【請求項５】 抗腫瘍剤がシスプラチンである請求項３記載の医薬組成物。
6. 【請求項６】 α_vβ₃受容体の拮抗が必要とされる病態の治療方法であって
   、かかる治療を必要とする対象に請求項１記載の化合物を投与することからなる
   方法。
7. 【請求項７】 α_vβ₅受容体の拮抗が必要とされる病態の治療方法であって
   、かかる治療を必要とする対象に請求項１記載の化合物を投与することからなる
   方法。
8. 【請求項８】 骨粗鬆症の治療方法であって、かかる治療を必要とする対象
   に請求項１記載の化合物を投与することからなる方法。
9. 【請求項９】 脈管形成の阻害方法であって、かかる阻害を必要とする対象
   に請求項１記載の化合物を投与することからなる方法。
10. 【請求項１０】 腫瘍増殖または腫瘍転移の阻害方法であって、かかる阻害
    を必要とする対象に請求項１記載の化合物を投与することからなる方法。
11. 【請求項１１】 アテローム性動脈硬化症または再狭窄の治療方法であって
    、かかる治療を必要とする対象に請求項１記載の化合物を投与することからなる
    方法。
12. 【請求項１２】 炎症の治療方法であって、かかる治療を必要とする対象に
    請求項１記載の化合物を投与することからなる方法。
13. 【請求項１３】 腫瘍増殖の阻害方法であって、かかる阻害を必要とする対
    象に請求項１記載の化合物および抗腫瘍剤を段階的にまたは物理的に配合して投
    与することからなる方法。
14. 【請求項１４】 抗腫瘍剤がトポテカンである請求項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 抗腫瘍剤がシスプラチンである請求項１３記載の方法。
16. 【請求項１６】 式（ＩＩ）： 【化２】 で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
17. 【請求項１７】 式（ＩＩＩ）： 【化３】 で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
18. 【請求項１８】 薬剤として用いるための請求項１記載の化合物。
19. 【請求項１９】 α_vβ₃受容体の拮抗が必要とされる疾患の治療用薬剤の製
    造における請求項１記載の化合物の使用。
20. 【請求項２０】 α_vβ₅受容体の拮抗が必要とされる疾患の治療用薬剤の製
    造における請求項１記載の化合物の使用。
21. 【請求項２１】 骨粗鬆症の治療用薬剤の製造における請求項１記載の化合
    物の使用。
22. 【請求項２２】 脈管形成の阻害用薬剤の製造における請求項１記載の化合
    物の使用。
23. 【請求項２３】 腫瘍増殖または腫瘍転移の阻害用薬剤の製造における請求
    項１記載の化合物の使用。
24. 【請求項２４】 アテローム性動脈硬化症または再狭窄の治療用薬剤の製造
    における請求項１記載の化合物の使用。
25. 【請求項２５】 炎症の治療用薬剤の製造における請求項１記載の化合物の
    使用。
26. 【請求項２６】 物理的に配合したかまたは段階的投与のための、腫瘍増殖
    の阻害用薬剤の製造における請求項１記載の化合物および抗腫瘍剤の使用。
27. 【請求項２７】 抗腫瘍剤がトポテカンである請求項２６記載の使用。
28. 【請求項２８】 抗腫瘍剤がシスプラチンである請求項２６記載の使用。
29. 【請求項２９】 物理的に配合したかまたは段階的投与のための、骨粗鬆症
    の治療用薬剤の製造における請求項１記載の化合物および骨吸収の阻害剤の使用
    。