JP2003113096A - アルブミン合成促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、脂肪肝・肝線維症・肝硬変・出血性
ショック・外傷性ショック・熱傷・低アルブミン血漿を
伴う成人呼吸促迫症候群（ARDS）・ネフローゼを回復・
改善するのに好適な医薬品または食品を提供することを
課題とする。 【解決手段】ローヤルゼリー中の分子量５７キロダルト
ンの糖タンパク質は、肝細胞刺激因子（Hepatocyte sti
mulating factor, HSF）等の刺激因子の様にアルブミン
合成を促進することにより、脂肪肝・肝線維症・肝硬変
・出血性ショック・外傷性ショック・熱傷・低アルブミ
ン血漿を伴う成人呼吸促迫症候群（ARDS）・ネフローゼ
を回復・改善するので、これを、医薬品及び食品に配合
させることにより優れた医薬品または食品を提供でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、脂肪肝・肝線維症
・肝硬変等の肝疾患や出血性ショック・外傷性ショック
・熱傷・低アルブミン血漿を伴う成人呼吸促迫症候群
（ARDS）・ネフローゼを回復・改善又は予防を行うのに
好適な作用を示すアルブミン合成促進剤またはそれを含
有する医薬品または食品に関する。

【０００２】

【従来の技術】肝臓は、免役グロブリンを除く血漿タン
パク質のほとんど全てを合成分泌している。古くから腺
性器官として位置づけられている肝臓は、膵臓外分泌腺
や唾液腺などに比べて優るとも劣らない活発な分泌タン
パク質合成を行っている。肝臓のこの重要な機能を担っ
ているのが、周知の如く肝細胞である。肝細胞は、外分
泌腺細胞に共通してみられる良く発達した粗面小胞体と
ゴルジ体を有している。肝細胞の合成分泌しているタン
パク質は、多種類に及び、その合成量も変化に富んでい
る。

【０００３】また、肝細胞の血漿タンパク質合成能は、
ホルモンや栄養素などの種々の因子によって調節されて
いる。血漿タンパク質合成の調節作用は、数時間オーダ
ーの長期的作用が主であるため、灌流肝や肝スライス、
分離肝細胞などのin vitro実験系では不十分であり、初
代培養肝細胞が最も適した実験系である。近年、成熟ラ
ット初代培養肝細胞を用いてアルブミン遺伝子発現が厳
格なグルココルチコイド支配を受けているとういう事
や、acute phase protein合成の調節因子として肝細胞
刺激因子（Hepatocyte stimulating factor, HSF）とい
うモノカインが見つけられている。

【０００４】また、アルブミンは、血漿タンパク質の８
％を占める主成分であり、多くの重要な生理機能を担っ
ている。血清アルブミン合成分泌能は、肝実質細胞の示
す重要な肝特異機能の１つである。それゆえ、従来肝由
来の上皮細胞株や肝癌細胞が肝実質細胞由来であるかど
うかを同定する場合に、その発現の安定性と共に定性定
量法が容易なこともあって最もよく利用されたマーカー
である。 さらに、アルブミン製剤が知られており、こ
れは血液製剤のであり、血漿タンパク質を分離精製した
血漿分画製剤の１つである。その適応症として、肝硬変
を初め、出血性ショック、外傷性ショック、熱傷、低ア
ルブミン血漿を伴う成人呼吸促迫症候群（ARDS）、ネフ
ローゼ等の治療に用いられている。

【０００５】一方、成長因子的な作用を示すものが、発
明者らによってローヤルゼリーから単離されており、分
子量５７-ｋＤａの糖蛋白質であることが分かってい
る。その生物活性作用として、肝臓保護作用、血糖値維
持作用、高アンモニア血症抑制作用、抗ストレス作用、
乳酸蓄積抑制作用、有酸素運動促進作用，ＮＫ細胞活性
正常化作用、限界運動量増強作用，疲労回復作用，細胞
増殖促進作用等を発明者らは見いだしている。

【０００６】これまでに、ローヤルゼリーの分子量５７
-ｋＤａの糖蛋白が、アルブミン合成を促進すること
は、確認されていない。更に、グルココルチコイドや肝
細胞刺激因子（Hepatocyte stimulating factor, HSF）
の様にアルブミン遺伝子を発現させ、アルブミン合成を
促進する物質、即ち刺激因子的作用を有する５７-ｋＤ
ａの糖蛋白を含有し、肝臓保護作用を示す医薬品乃至は
食品も知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況をふまえて為されたものであり、肝機能障害等の為
の肝臓保護剤を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題の解決手段】この様な状況に鑑みて、本発明者ら
は鋭意研究努力を重ねた結果、ローヤルゼリー中の分子
量５７キロダルトンの糖タンパク質がアルブミン合成を
促進することにより肝臓保護作用を示し、これを、医薬
品及び食品に配合することにより優れた肝臓保護剤を提
供できることを見い出し、発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、次に示す技術に関するものである。 ＜１＞ ローヤルゼリーからなる、アルブミン合成促進
剤。 ＜２＞ ローヤルゼリーが、下記に示す、タンパク質を
９重量％以上含有するものであることを特徴とする、＜
１＞に記載のアルブミン合成促進剤。 １）ローヤルゼリー中のタンパク質の非変性ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳永動において単一バンドを形成す
る。 ２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンで
ある。 ３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含
む。 ＜３＞ ＜１＞又は＜２＞に記載のアルブミン合成促進
剤を含有することを特徴とする組成物。 ＜４＞ 医薬又は、食品であることを特徴とする、＜３
＞に記載の組成物。 ＜５＞ 脂肪肝・肝線維症・肝硬変・出血性ショック・
外傷性ショック・熱傷・低アルブミン血漿を伴う成人呼
吸促迫症候群（ARDS）・ネフローゼを回復・改善するも
のであることを特徴とする、＜３＞又は＜４＞に記載の
組成物 以下、本発明について、実施の形態を中心に説明を加え
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】（１）電気泳動によるローヤルゼ
リー中の５７キロダルトンのタンパク質の定性方法 本発明のローヤルゼリー中の５７キロダルトンのタンパ
ク質は、電気泳動によりタンパク質の構成を分析し、有
効成分であるタンパク質の分子量を特定することを特徴
とする。電気泳動の方法としては、該有効タンパク質が
特定できれば特段の限定は受けないが、好ましい方法
は、水溶性ローヤルゼリータンパク質（３％ローヤルゼ
リー水溶液（Ｗ／Ｖ））をポリアクリルアミドゲル（１
０％均一）にて、電流２０ｍＡで電気泳動し、クマシー
ブリリアントブルーにより染色して、タンパク質を特定
する方法である。この様な電気泳動に於ける、本発明の
タンパク質の分子量はその精製タンパク質のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、５７キロダルト
ンと決定された。

【００１０】（２）ローヤルゼリー中の５７キロダルト
ンタンパク質の調製方法 凍結乾燥したローヤルゼリーを０．７重量％で１０ｍＭ
のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ＵＦ１０
万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ１００；限外濾過）で６倍濃
縮、７回脱塩を行い、その濾液をさらにＵＦ３万（Ｍｉ
ｎｉｐｌａｔｅ３０；限外濾過）で８倍濃縮、１回脱塩
を行い、分子量１０万〜３万の分画を得た。上記の分子
量１０万〜３万のサンプルは、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画す
ることで、分子量５７キロダルトン蛋白質を分離でき
る。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、通常に
知られている方法に従って行えば良く、例えば東ソー株
式会社製ＤＥＡＥーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍをカラ
ムとして用いて、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を展開液Ａ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０）と１ＭＮａＣｌを展開液Ｂとしてグラジェントによ
り、流速を５ｍｌ／ｍｉｎ、２８０ｎｍの吸光度で検出
し、２．５ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮ
ｏ．１１９〜１２７に分子量５７キロダルトンの蛋白質
画分を検出することができる。さらにこの画分をゲル濾
過クロマトグラフィーにより、これは通常に知られてい
る方法に従って行えば良く、この様な好ましい例として
は、例えば、ファルマシア株式会社製ＨｉＬｏａｄ１６
／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ６００をカラムとして用いて、
０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カリウム
バッファーｐＨ７．０を展開液とし、流速を１．０ｍｌ
／ｍｉｎ、カラム温度を３５℃に設定し、２８０ｎｍの
吸光度で検出し、２．０ｍｌ／チューブで分画したフラ
クションＮｏ．３５〜４３に分子量５７キロダルトンの
蛋白質を検出することが出来る。（電気泳動にて同一蛋
白質を確認）また、既知分子量のゲル濾過分析の結果よ
り、上記蛋白質は、分子量５７キロダルトンモノマー蛋
白質であると確定された。又、この蛋白質は、Ｎ−グル
コシダーゼＦによって消化され、消化後の分子量が４８
キロダルトンになるため糖蛋白質であることを本発明者
は見出している。

【００１１】（３）初代培養肝細胞の培養方法 ウィスター系ラット７週齢（体重：約１５０ｇ）の肝臓
をハンクスバッファーにて灌流後、コラゲナーゼ溶液で
灌流し肝細胞を得た。これをペニシリンとストレプトマ
イシンをそれぞれ１００ｍｇ／ｌ含有し、５％ＦＢＳを
添加したＬ１５培地で２回洗浄し、その後、ペニシリン
とストレプトマイシンをそれぞれ１００ｍｇ／ｍｌ、イ
ンスリン１０―６Ｍ、デキサメタゾン１０―６Ｍ、アプ
ロチニン０．７μｇ／ｍｌ、を含有する５％ＦＢＳ添加
のＬ１５培地にて３７℃、３時間、ＣＯ２インキュベー
ターで培養し、その後、同条件にて、毎日培地交換をし
て５日間培養した。尚、培養初期から最後まで、コント
ロールとして無添加系のものと、５７キロダルトンの糖
蛋白質を０．５ｍｇ／ｍｌ及びローヤルゼリーを１．５
ｍｇ／ｍｌを加え、アルブミン産生に対する影響を見
た。そして、培地中に放出されたアルブミン産生レベル
を経時的に測定した。

【００１２】（４）ＥＬＩＳＡ法によるアルブミンの定
量法 抗体吸着過程として、ＰＢＳで１０００倍希釈された一
次抗体であるＩｇＧ溶液をELISA用９６ウェルに５０μ
ｌずつ載せる、３７℃で２時間処理し（または、低温、
４℃で一晩）、吸着させ、吸引によりウェルからＩｇＧ
溶液を吸い取り、洗浄過程として２００μｌのＴ−ＰＢ
Ｓで２〜３回洗浄し、ペーパータオル上で水気をきる。
ブロッキング過程として、２％スキムミルクーＴ−ＰＢ
Ｓ（０．０１％ＮａＮ３含有）の２００μｌで、３７℃
で２時間処理し（または、低温、４℃で一晩）し、洗浄
過程として２００μｌのＴ−ＰＢＳで３回洗浄し、測定
サンプルである培養濾液をＰＢＳで８０倍に希釈して、
その希釈液５０μｌを加え３７℃で２時間処理し、アル
ブミンを結合させ（スタンダードとして、ラットアルブ
ミン：０〜０．５μｇ／ｍｌで検量線を作る）、２００
μｌのＴ−ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体としてＰＢＳ
で１０００倍希釈したＨＲＰ標識ラビットアルブミンＩ
ｇＧ５０μｌを添加し、３７℃で２時間処理し、２００
μｌのＴ−ＰＢＳで５回洗浄し、７５μｌの基質溶液
（０．１Ｍクエン酸バッファーｐＨ６．０と０．３Ｍリ
ン酸バッファーｐＨ６．０を１：１に調製し、これにｏ
−フェニレンジアミン二塩酸塩４００μｇ／ｍｌ濃度に
なるよう添加し、さらに、H２O２が最終濃度０．０２４
％に調製する）を添加し、発色するまで室温で１０〜１
５分間処理し、１０％Ｈ２ＳＯ４２５μｌ添加して、プ
レートリコーダー（測定波長：４９２ｎｍ）で、アルブ
ミンを定量した。

【００１３】（５）本発明の脂肪肝・肝線維症・肝硬変
・出血性ショック・外傷性ショック・熱傷・低アルブミ
ン血漿を伴う成人呼吸促迫症候群（ARDS）・ネフローゼ
改善治療用の組成物 本発明の脂肪肝・肝線維症・肝硬変・出血性ショック・
外傷性ショック・熱傷・低アルブミン血漿を伴う成人呼
吸促迫症候群（ARDS）・ネフローゼ改善及び治療用の組
成物は、ローヤルゼリーから単離・精製された分子量５
７キロダルトンの糖タンパク質を含有することを特徴と
する。上記分子量５７キロダルトンの糖タンパク質は、
特に、肝疾患の治療に有効であり、これを人に投与する
ことにより、四塩化炭素等による急性肝障害、アルコー
ル摂取による肝障害、ウィルス感染による慢性肝障害等
の肝疾患に対する改善効果が得られる。本発明の肝疾患
治療薬の適応症としては、脂肪肝、肝線維症、急性肝
炎、慢性肝炎、アルコール性肝炎、ウィルス性肝炎、ア
ルコール性脂肪肝、アルコール性肝硬変等が挙げられ
る。本発明の分子量５７キロダルトンの糖タンパク質
は、そのまま、あるいは慣用の製剤担体と共に動物及び
人に投与することが出来る。１日の好ましい有効投与量
は、分子量５７キロダルトンのタンパク質量として、
０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、更に好ましい投
与量は０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。投与形
態としては、特に限定はなく、必要に応じて適宜選択し
て使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤
等の経口剤、注射剤、座剤等の非経口剤が挙げられる。
以上の製剤は、常法によって製造される。通常知られた
任意成分を本発明の分子量５７キロダルトンのタンパク
質の生理活性が損なわれない程度に配合することが出来
る。かかる任意成分として、白糖、乳糖等の賦形剤、デ
ンプン、ゼラチン等の結合剤、カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウ
ム等の崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル等
の界面活性剤、タルク、ロウ類等の滑沢剤、軽質無水ケ
イ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル等の流動促進剤、生
理食塩水、ブドウ糖水溶液等の希釈剤、矯味矯臭剤、着
色剤、殺菌剤、防腐剤、香料等が挙げられる。

【００１４】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明について更に
詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限
定を受けないことは、言うまでもない。

【００１５】＜実施例１＞ アルブミン合成に対する分子量５７キロダルトンタンパ
ク質の影響 （培養方法及び処理方法）ウィスター系ラット７週齢
（体重：約１５０ｇ）の肝臓をハンクスバッファーにて
灌流後、コラゲナーゼ溶液で灌流し肝細胞を得た。これ
をペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ１００ｍ
ｇ／ｌ含有し、５％ＦＢＳを添加したＬ１５培地で２回
洗浄し、その後、ペニシリンとストレプトマイシンをそ
れぞれ１００ｍｇ／ｍｌ、インスリン１０―６Ｍ、デキ
サメタゾン１０―６Ｍ、アプロチニン０．７μｇ／ｍ
ｌ、を含有する５％ＦＢＳ添加のＬ１５培地にて３７
℃、３時間、ＣＯ２インキュベーターで培養し、その
後、同条件にて、毎日培地交換をして５日間培養した。
尚、培養初期から最後まで、コントロールとして無添加
系のものと、５７キロダルトンの糖蛋白質を０．５ｍｇ
／ｍｌ及びローヤルゼリーを１．５ｍｇ／ｍｌを加え、
アルブミン産生に対する影響を見た。そして、培地中に
放出されたアルブミン産生レベルを経時的（培養開始：
１、２，３，４，５日後）に測定した。 表１に示す様
に、本発明のアルブミン合成促進剤である分子量５７キ
ロダルトンのタンパク質及びローヤルゼリーは、コント
ロール群に比べて、アルブミン合成を促進していた。こ
のことは、本発明のアルブミン合成促進剤である分子量
５７キロダルトンのタンパク質は、脂肪肝・肝線維症・
肝硬変・出血性ショック・外傷性ショック・熱傷・低ア
ルブミン血漿を伴う成人呼吸促迫症候群（ARDS）・ネフ
ローゼ改善治療用に優れることを意味する。

【００１６】

【表１】

【００１７】＜実施例２＞肝炎各病型に対応する病態モ
デルとして、四塩化炭素による中毒性肝障害モデルを用
いて肝疾患治療に有効な物質の評価を行った。即ち、予
備飼育後のラットに５０％四塩化炭素／オリーブ油を４
ｍｌ／ｋｇ経口投与し、２０時間絶食させた後、表２に
記載の被検物質を７０ｍｇ／ｋｇ経口投与した。投与の
方法は、被検物質２００ｍｇを、１重量％Ｔｒｉｔｏｎ
−Ｘ１００の生理食塩水１０ｍｌに乳化させ、ゾンデで
投与した。各群のラットは４匹とした。水と餌は四塩化
炭素投与までの間自由に摂取させ、四塩化炭素投与後は
絶食させ、水のみをそのまま与えた。被検物質投与から
２４時間後に採血し、血液は室温下で３０分放置した
後、毎分３０００回転で１０分間遠心分離して血清を得
た。

【００１８】この血清について、全ピルビン（Ｔ−Ｂｉ
ｌ）（Ｊｅｎｄｒａｓｓｉｋｉ法）、全コレステロール
（Ｔ−Ｃｈｏ）（コレステロールオキシダーゼ法）、ト
リグリセリド（ＴＧ）（ＧＰＯ−ｐ−クロロフェノール
法）、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ，ＧＰＴ）（ＰＯＰ
−ＴＯＯＳ法）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｐａｓ
ｅ）（フェニルリン酸基質法）を和光純薬（株）製キッ
トを用いて定量した。

【００１９】各被検物質投与群のＴ−Ｂｉｌ，Ｔ−Ｃｈ
ｏ，ＴＧ，ＧＯＴ，ＧＰＴ及びＡｌｐａｓｅの値に対す
る影響を平均値として表６に示す。尚、表６の標準は四
塩化炭素を投与しない群、コントロールは四塩化炭素を
投与し被検物質を投与しない群を示す。表２の結果から
わかるように、全ピルビン、全コレステロール、トリグ
リセリド、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ，ＧＰＴ）の各
値がコントロールに対して有意に低下し、本発明のアル
ブミン合成促進剤である分子量５７キロダルトンタンパ
ク質を投与することにより効率的に肝機能障害を改善す
る作用が認められた。

【００２０】

【表２】

【００２１】＜実施例３〜５＞表３示す処方に従って、
健康食品を作成した。即ち、処方成分を１０重量部の水
と共に転動相造粒し、打錠して錠剤状の健康食品を得
た。これらのものは何れも優れた疲労回復効果を有して
いた。尚、表中の数値の単位は重量部を表す。

【００２２】

【表３】

【００２３】＜実施例６〜８＞表４に示す処方に従っ
て、健康食品を作成した。即ち、処方成分を撹拌可溶化
しドリンク製剤の健康食品を得た。これらのものは何れ
も優れた疲労回復効果を有していた。尚、表中の数値の
単位は重量部を表す。

【００２４】

【表４】

【００２５】＜実施例９〜１１＞表５の処方に従って、
室温で撹拌溶解することにより注射製剤の医薬品を作成
した。尚、表中の数値の単位は重量部を表す。四塩化炭
素による中毒性肝臓障害モデルに於いてトランスアミナ
ーゼであるＧＯＴ，ＧＰＴに値を下げる効果があった。

【００２６】

【表５】

【００２７】

【発明の効果】本発明によれば、アルブミン合成促進剤
である分子量５７キロダルトンのタンパク質を食品や医
薬に含有させることにより脂肪肝・肝線維症・肝硬変・
出血性ショック・外傷性ショック・熱傷・低アルブミン
血漿を伴う成人呼吸促迫症候群（ARDS）・ネフローゼを
回復・改善するのに好適な薬剤を提供することが出来
る。

【００２８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING ＆＃６０；110＆＃６２； ポーラ化成工業株式会社 ＆＃６０；120＆＃６２； アルブミン合成促進剤 ＆＃６０；130＆＃６２； Ｐ２００１０９９ ＆＃６０；140＆＃６２； ＆＃６０；141＆＃６２；2001-10-04- ＆＃６０；160＆＃６２； 1 ＆＃６０；170＆＃６２；PatentIn Ver.2.0

【００２９】 ＆＃６０；210＆＃６２； 1 ＆＃６０；211＆＃６２； 25 ＆＃６０；212＆＃６２； PRT ＆＃６０；213＆＃６２； Apis mellifera ＆＃６０；220＆＃６２； ＆＃６０；221＆＃６２； UNSURE ＆＃６０；222＆＃６２； (24) ＆＃６０；223＆＃６２； Xaa=unknown ＆＃６０；400＆＃６２； 1 Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Leu Lys Lys Leu Pro Ile Leu His 1 2 10 10 Glu Met Lys Phe Phe Asp Tyr Xaa Asp 20 25

【００３０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/12 Ａ６１Ｐ 13/12 17/02 17/02 // Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｆターム(参考） 4B018 MD77 ME02 ME14 4C087 AA01 AA02 BB22 MA52 MA66 NA14 ZA51 ZA59 ZA75 ZA89 4H045 AA10 AA30 BA10 CA51 EA01 EA20 FA71

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ローヤルゼリーからなる、アルブミン合
   成促進剤。
2. 【請求項２】 ローヤルゼリーが、下記に示す、タンパ
   ク質を９重量％以上含有するものであることを特徴とす
   る、請求項１に記載のアルブミン合成促進剤。 １）ローヤルゼリー中のタンパク質の非変性ポリアクリ
   ルアミドゲル電気泳永動において単一バンドを形成す
   る。 ２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
   気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンで
   ある。 ３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含
   む。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のアルブミン合成
   促進剤を含有することを特徴とする組成物。
4. 【請求項４】 医薬又は、食品であることを特徴とす
   る、請求項３に記載の組成物。
5. 【請求項５】 脂肪肝・肝線維症・肝硬変・出血性ショ
   ック・外傷性ショック・熱傷・低アルブミン血漿を伴う
   成人呼吸促迫症候群（ARDS）・ネフローゼを回復・改善
   するものであることを特徴とする、請求項３又は４に記
   載の組成物