JP2003116385A - 日本脳炎ワクチンをコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物 - Google Patents
日本脳炎ワクチンをコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物Info
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 日本脳炎ワクチンをコードする遺伝子を含む
トランスジェニック植物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記植物によって発現された日本脳
炎ワクチンを提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明は、粘膜免疫運搬体と日本脳炎ウ
イルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉ
ｎ）の融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された
トランスジェニック植物を提供する。特に、前記粘膜免
疫運搬体がコレラトキシンＢ鎖タンパク質（ＣＴＢ）で
あるトランスジェニック植物、および前記植物がタバコ
であるトランスジェニック植物を提供する。
トランスジェニック植物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記植物によって発現された日本脳
炎ワクチンを提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明は、粘膜免疫運搬体と日本脳炎ウ
イルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉ
ｎ）の融合タンパク質をコードする遺伝子が導入された
トランスジェニック植物を提供する。特に、前記粘膜免
疫運搬体がコレラトキシンＢ鎖タンパク質（ＣＴＢ）で
あるトランスジェニック植物、および前記植物がタバコ
であるトランスジェニック植物を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、粘膜免疫運搬体と
日本脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ）の融合タンパク質をコードする遺伝子が導
入されたトランスジェニック植物に関する。
日本脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ）の融合タンパク質をコードする遺伝子が導
入されたトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】発明の背景
日本脳炎ワクチンを含む従来のワクチンは、不活化ワク
チンが主流であり、その接種法に関しては注射器を用い
た接種が最も広く用いられている。現行の日本脳炎ワク
チンは、マウスの脳内にウイルスを接種し、ウイルスが
増殖した頃に脳を取り出してウイルスを分離、精製、不
活化の処理を行う。このようなワクチンは、多くの動物
を犠牲にするという倫理的問題もあるが、コスト的な問
題がさらに深刻である。従来型のワクチンの普及は、先
進諸国においては何ら問題がないが、マラリア、デング
熱、日本脳炎など、多くの感染症の蔓延に悩まされてい
るのは、アジア、アフリカ、中南米諸国の経済途上国が
ほとんどである。
チンが主流であり、その接種法に関しては注射器を用い
た接種が最も広く用いられている。現行の日本脳炎ワク
チンは、マウスの脳内にウイルスを接種し、ウイルスが
増殖した頃に脳を取り出してウイルスを分離、精製、不
活化の処理を行う。このようなワクチンは、多くの動物
を犠牲にするという倫理的問題もあるが、コスト的な問
題がさらに深刻である。従来型のワクチンの普及は、先
進諸国においては何ら問題がないが、マラリア、デング
熱、日本脳炎など、多くの感染症の蔓延に悩まされてい
るのは、アジア、アフリカ、中南米諸国の経済途上国が
ほとんどである。
【０００３】その普及に費用がかかりすぎるという理由
から、経済途上国での集団接種に関して、東南アジアや
アフリカ地域で従来型ワクチンの接種を普及させること
はきわめて困難であり、世界規模での感染症対策が円滑
に行えないというのが現状である。
から、経済途上国での集団接種に関して、東南アジアや
アフリカ地域で従来型ワクチンの接種を普及させること
はきわめて困難であり、世界規模での感染症対策が円滑
に行えないというのが現状である。
【０００４】遺伝子組換え技術によって作り出された組
換えタンパク質ワクチンの経口および経鼻などの経粘膜
免疫法は、注射器を必要としない易接種型ワクチンであ
り、コスト的にも従来型ワクチンより優れている。また
免疫学的にも同等な効果を得ることが可能である。その
中でも特に、組換え植物を使用した「食べるワクチン」
は、経粘膜ワクチンの究極的な接種法であり、コスト面
できわめて優れている。経済的な問題からワクチンの普
及がきわめて困難であるという世界的な状況を考慮する
と、これからのワクチン開発は、食べるワクチンなどの
植物由来組換えワクチンを含む、様々な経粘膜ワクチン
を重点的に行う必要がある。また、先進諸国には新規産
業としても、国際貢献的立場からも魅力ある分野であ
る。
換えタンパク質ワクチンの経口および経鼻などの経粘膜
免疫法は、注射器を必要としない易接種型ワクチンであ
り、コスト的にも従来型ワクチンより優れている。また
免疫学的にも同等な効果を得ることが可能である。その
中でも特に、組換え植物を使用した「食べるワクチン」
は、経粘膜ワクチンの究極的な接種法であり、コスト面
できわめて優れている。経済的な問題からワクチンの普
及がきわめて困難であるという世界的な状況を考慮する
と、これからのワクチン開発は、食べるワクチンなどの
植物由来組換えワクチンを含む、様々な経粘膜ワクチン
を重点的に行う必要がある。また、先進諸国には新規産
業としても、国際貢献的立場からも魅力ある分野であ
る。
【０００５】従来技術
日本脳炎ウイルスワクチンとして機能する物質はタンパ
ク質である。日本脳炎ワクチンは感染マウス脳乳剤から
精製された不活化ワクチンであり、皮下注射によって接
種される。感染経路がポリオやインフルエンザのように
腸管や呼吸器の粘膜ではなく、媒介蚊の吸血によって伝
播する日本脳炎では、ワクチンを粘膜から接種するとい
う発想はなかった。しかし鼻腔等から粘膜免疫が可能で
あれば、注射器が不溶となり接種経費を大幅に下げるこ
とが期待される。そこで、日本脳炎ワクチンを鼻腔粘膜
から接種することが試みられた。その結果、鼻腔内接種
法は、従来の接種法と同様のウイルス感染防御効果を誘
導することが可能であった。粘膜投与による日本脳炎ウ
イルス粒子に対して特異的に抗体を誘導するために、経
粘膜免疫組織に特異的親和性を持つコレラトキシンＢ鎖
（ＣＴＢ）と日本脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇ
ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＪＥ）との融合遺伝子を作
製し、その遺伝子を各生物種（細菌、酵母）に導入する
ことにより、融合タンパク質（ＣＴＢ−ＪＥ Ｅ ｇｌ
ｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）の産生を可能とした。上記日本
脳炎ウイルスワクチンとして利用可能な、ＣＴＢ−ＪＥ
Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎの融合タンパク質は、細
菌や酵母、昆虫細胞、等の各種遺伝子発現系において産
生される。それらの発現系から融合タンパク質を抽出
し、経口、経鼻粘膜から投与することによって全身系の
感染防御的免疫を誘導することが可能であった。
ク質である。日本脳炎ワクチンは感染マウス脳乳剤から
精製された不活化ワクチンであり、皮下注射によって接
種される。感染経路がポリオやインフルエンザのように
腸管や呼吸器の粘膜ではなく、媒介蚊の吸血によって伝
播する日本脳炎では、ワクチンを粘膜から接種するとい
う発想はなかった。しかし鼻腔等から粘膜免疫が可能で
あれば、注射器が不溶となり接種経費を大幅に下げるこ
とが期待される。そこで、日本脳炎ワクチンを鼻腔粘膜
から接種することが試みられた。その結果、鼻腔内接種
法は、従来の接種法と同様のウイルス感染防御効果を誘
導することが可能であった。粘膜投与による日本脳炎ウ
イルス粒子に対して特異的に抗体を誘導するために、経
粘膜免疫組織に特異的親和性を持つコレラトキシンＢ鎖
（ＣＴＢ）と日本脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇ
ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（ＪＥ）との融合遺伝子を作
製し、その遺伝子を各生物種（細菌、酵母）に導入する
ことにより、融合タンパク質（ＣＴＢ−ＪＥ Ｅ ｇｌ
ｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）の産生を可能とした。上記日本
脳炎ウイルスワクチンとして利用可能な、ＣＴＢ−ＪＥ
Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎの融合タンパク質は、細
菌や酵母、昆虫細胞、等の各種遺伝子発現系において産
生される。それらの発現系から融合タンパク質を抽出
し、経口、経鼻粘膜から投与することによって全身系の
感染防御的免疫を誘導することが可能であった。
【０００６】また、従来、皮下注射によって接種される
場合、夾雑物が含まれているとその夾雑物に対する免疫
応答が誘導される可能性があったが、経口投与によって
経粘膜投与される場合、夾雑物による免疫応答は誘導さ
れずに、粘膜を介して吸収結合されるタンパク質のみに
免疫応答が誘導可能であった。
場合、夾雑物が含まれているとその夾雑物に対する免疫
応答が誘導される可能性があったが、経口投与によって
経粘膜投与される場合、夾雑物による免疫応答は誘導さ
れずに、粘膜を介して吸収結合されるタンパク質のみに
免疫応答が誘導可能であった。
【０００７】特に、植物ワクチンの場合、食用の植物に
遺伝子発現させることにより、直接腸管粘膜を介して免
疫することが可能である。上記の構成およびその粘膜免
疫投与法は、ヒト、家畜動物を含む脊椎動物全般に応用
できるものであり、「食べるワクチン」としての利用が
期待されている。そこで、経粘膜日本脳炎ワクチンとし
て、上記遺伝子の導入されたトランスジェニック植物の
作製が望まれていた。
遺伝子発現させることにより、直接腸管粘膜を介して免
疫することが可能である。上記の構成およびその粘膜免
疫投与法は、ヒト、家畜動物を含む脊椎動物全般に応用
できるものであり、「食べるワクチン」としての利用が
期待されている。そこで、経粘膜日本脳炎ワクチンとし
て、上記遺伝子の導入されたトランスジェニック植物の
作製が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】このような問題を解決
するために、本発明は、日本脳炎ワクチン（粘膜免疫運
搬体と日本脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃ
ｏｐｒｏｔｅｉｎ）の融合タンパク質）をコードする遺
伝子が導入されたトランスジェニック植物を提供するこ
とを目的とする。
するために、本発明は、日本脳炎ワクチン（粘膜免疫運
搬体と日本脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃ
ｏｐｒｏｔｅｉｎ）の融合タンパク質）をコードする遺
伝子が導入されたトランスジェニック植物を提供するこ
とを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、粘膜免疫運搬体
（コレラトキシンＢ鎖タンパク質（ＣＴＢ））と日本脳
炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅ
ｉｎ）との融合タンパク質が、日本脳炎ワクチンとして
機能することを見出し、かつ前記タンパク質を発現する
トランスジェニック植物を作製することに成功し、本発
明を完成するに至った。
を解決するため鋭意研究を行った結果、粘膜免疫運搬体
（コレラトキシンＢ鎖タンパク質（ＣＴＢ））と日本脳
炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅ
ｉｎ）との融合タンパク質が、日本脳炎ワクチンとして
機能することを見出し、かつ前記タンパク質を発現する
トランスジェニック植物を作製することに成功し、本発
明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、本発明は、粘膜免疫運搬体と日
本脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ）の融合タンパク質をコードする遺伝子を含むト
ランスジェニック植物を提供する。
本脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ）の融合タンパク質をコードする遺伝子を含むト
ランスジェニック植物を提供する。
【００１１】本発明は、さらに前記粘膜免疫運搬体がコ
レラトキシンＢ鎖タンパク質（ＣＴＢ）である、前記ト
ランスジェニック植物、および前記日本脳炎ウイルス外
郭タンパク質が、Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎである、
請求項１または２に記載のトランスジェニック植物を提
供する。
レラトキシンＢ鎖タンパク質（ＣＴＢ）である、前記ト
ランスジェニック植物、および前記日本脳炎ウイルス外
郭タンパク質が、Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎである、
請求項１または２に記載のトランスジェニック植物を提
供する。
【００１２】より好ましくは、本発明は、ｐＢＩ１２１
−ＣＴＢ−ＪＥが導入されたトランスジェニック植物を
提供する。
−ＣＴＢ−ＪＥが導入されたトランスジェニック植物を
提供する。
【００１３】また、本発明は前記植物がタバコである、
前記トランスジェニック植物を提供する。
前記トランスジェニック植物を提供する。
【００１４】さらに、本発明は、日本脳炎ワクチンとし
て使用するための、前記トランスジェニック植物を提供
する。．以下本発明を詳細に説明する。
て使用するための、前記トランスジェニック植物を提供
する。．以下本発明を詳細に説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明のトランスジェニック植物
には、粘膜免疫運搬体と日本脳炎ウイルス外郭タンパク
質（ＪＥＶ）との融合タンパク質をコードする遺伝子が
導入される。前記融合タンパク質は、粘膜免疫運搬体と
日本脳炎ウイルス外郭タンパク質が、インフレームとな
るように連結されたタンパク質である。
には、粘膜免疫運搬体と日本脳炎ウイルス外郭タンパク
質（ＪＥＶ）との融合タンパク質をコードする遺伝子が
導入される。前記融合タンパク質は、粘膜免疫運搬体と
日本脳炎ウイルス外郭タンパク質が、インフレームとな
るように連結されたタンパク質である。
【００１６】ここで、「粘膜免疫運搬体」とは、粘膜組
織に特異的親和性を有するタンパク質をいう。前記粘膜
免疫運搬体は、たとえばコレラトキシンＢ鎖タンパク
質、毒素原性大腸菌（ＬＴＢ）、サルモネラ菌もしくは
乳酸菌等の細菌、ウイルス、病原体、またはその他に由
来する、粘膜細胞表面に親和性を有するタンパク質を使
用することができる。本発明の一つの態様において、前
記粘膜免疫運搬体は、好ましくはコレラトキシンＢ鎖タ
ンパク質（ＣＴＢ）である。
織に特異的親和性を有するタンパク質をいう。前記粘膜
免疫運搬体は、たとえばコレラトキシンＢ鎖タンパク
質、毒素原性大腸菌（ＬＴＢ）、サルモネラ菌もしくは
乳酸菌等の細菌、ウイルス、病原体、またはその他に由
来する、粘膜細胞表面に親和性を有するタンパク質を使
用することができる。本発明の一つの態様において、前
記粘膜免疫運搬体は、好ましくはコレラトキシンＢ鎖タ
ンパク質（ＣＴＢ）である。
【００１７】本発明の一つの態様において、前記日本脳
炎ウイルス外郭タンパク質は、日本脳炎ウイルスのタン
パク質であって、好ましくは、外郭に含まれるＥｇｌｙ
ｃｏｐｒｏｔｅｉｎである。
炎ウイルス外郭タンパク質は、日本脳炎ウイルスのタン
パク質であって、好ましくは、外郭に含まれるＥｇｌｙ
ｃｏｐｒｏｔｅｉｎである。
【００１８】前記融合タンパク質をコードする遺伝子の
取得方法は特に限定されないが、前記ＤＮＡは、たとえ
ば以下のように作製することができる。
取得方法は特に限定されないが、前記ＤＮＡは、たとえ
ば以下のように作製することができる。
【００１９】ＣＴＢ、および日本脳炎ウイルス外郭タン
パク質ＪＥＶ（Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）をコード
するｃＤＮＡ配列は既知であるので、その配列を基にし
てプライマーを設計し、通常のＰＣＲ法を使用して、又
は化学合成によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮ
Ａ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによ
り、本発明の遺伝子を得ることができる。
パク質ＪＥＶ（Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）をコード
するｃＤＮＡ配列は既知であるので、その配列を基にし
てプライマーを設計し、通常のＰＣＲ法を使用して、又
は化学合成によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮ
Ａ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによ
り、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２０】前記プライマーは、Ｃ’末端側にＥタンパ
ク遺伝子を融合可能な配列を含んでいてもよい。また、
Ｎ’端側には真核生物での発現効率を高めるためのＫｏ
ｚａｃ配列、Ｃ’端側のＢａｍＨＩまたはＳｐｅＩサイ
トにインフレームで外来遺伝子を融合可能にする配列を
含むプライマーを設計してもよい。
ク遺伝子を融合可能な配列を含んでいてもよい。また、
Ｎ’端側には真核生物での発現効率を高めるためのＫｏ
ｚａｃ配列、Ｃ’端側のＢａｍＨＩまたはＳｐｅＩサイ
トにインフレームで外来遺伝子を融合可能にする配列を
含むプライマーを設計してもよい。
【００２１】具体的には、前記融合タンパク質のうち、
コレラトキシンＢ鎖由来タンパク質をコードするＤＮＡ
の取得法としては、たとえば、以下の反応条件、テンプ
レート、およびプライマーを使用してＰＣＲを行うこと
によって増幅できる； テンプレート：プラスミドｐＭ２、 Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴ
ＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号１） Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＧＴＡＧＧＧＧ
ＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＣＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴ
ＡＣＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣ−３’（配列番
号２） ＰＣＲ条件：９４℃において３分の後、９４℃において
４５秒、５５℃において１分、７２℃において１分を３
０サイクル、次に７２℃において１０分。
コレラトキシンＢ鎖由来タンパク質をコードするＤＮＡ
の取得法としては、たとえば、以下の反応条件、テンプ
レート、およびプライマーを使用してＰＣＲを行うこと
によって増幅できる； テンプレート：プラスミドｐＭ２、 Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴ
ＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号１） Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＧＴＡＧＧＧＧ
ＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＣＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴ
ＡＣＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣ−３’（配列番
号２） ＰＣＲ条件：９４℃において３分の後、９４℃において
４５秒、５５℃において１分、７２℃において１分を３
０サイクル、次に７２℃において１０分。
【００２２】また、日本脳炎ウイルスのＲＮＡゲノムを
テンプレートとしたＲＴ−ＰＣＲ法によって、日本脳炎
ウイルス外郭タンパク質（Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉ
ｎ）を増幅すればよい。設計したプライマーは、その塩
基配列に従って化学合成することができる。ＰＣＲは常
法に従って行うことができる。たとえば、以下の反応条
件、テンプレート、およびプライマーを使用してＰＣＲ
を行うことによって増幅できる； Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＴ
ＧＣＡＣＡ−３’（配列番号３） Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： （Ｃ１） ５’−ＧＣＧＡＣＴＡＧＴＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＧＧＴ
ＴＣＣＡＴ−３’（配列番号４） （Ｃ２） ５’−ＧＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＡＡ
ＴＧＧＴＧ−３’（配列番号５） （Ｃ３）５’−ＧＣＧＡＣＴＡＧＴＣＣＣＴＴＧＴＧＴ
ＧＡＴＣＣＡＡＧＡ−３’（配列番号６） ９４℃において３分の後、９４℃において１分、５５℃
において１分、７２℃において１分を３０サイクル、次
に７２℃において１０分。
テンプレートとしたＲＴ−ＰＣＲ法によって、日本脳炎
ウイルス外郭タンパク質（Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉ
ｎ）を増幅すればよい。設計したプライマーは、その塩
基配列に従って化学合成することができる。ＰＣＲは常
法に従って行うことができる。たとえば、以下の反応条
件、テンプレート、およびプライマーを使用してＰＣＲ
を行うことによって増幅できる； Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＴ
ＧＣＡＣＡ−３’（配列番号３） Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： （Ｃ１） ５’−ＧＣＧＡＣＴＡＧＴＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＧＧＴ
ＴＣＣＡＴ−３’（配列番号４） （Ｃ２） ５’−ＧＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＡＡ
ＴＧＧＴＧ−３’（配列番号５） （Ｃ３）５’−ＧＣＧＡＣＴＡＧＴＣＣＣＴＴＧＴＧＴ
ＧＡＴＣＣＡＡＧＡ−３’（配列番号６） ９４℃において３分の後、９４℃において１分、５５℃
において１分、７２℃において１分を３０サイクル、次
に７２℃において１０分。
【００２３】増幅された配列は、たとえば制限酵素で切
断した後に、市販のプラスミドにクローニングすること
ができる。このプラスミドを公知の方法（例えば、Ｊ．
ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．１．２１−１．５２）に従って
単離精製する。そして、サンガー法やマクサム・ギルバ
ート法等の公知の方法、および自動塩基配列決定装置
（ＡＢＩ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３１０）用い
て塩基配列を決定できる。
断した後に、市販のプラスミドにクローニングすること
ができる。このプラスミドを公知の方法（例えば、Ｊ．
ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．１．２１−１．５２）に従って
単離精製する。そして、サンガー法やマクサム・ギルバ
ート法等の公知の方法、および自動塩基配列決定装置
（ＡＢＩ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３１０）用い
て塩基配列を決定できる。
【００２４】前記融合タンパク質は、免疫誘導活性を有
する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個の
アミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
上記のような変異は、例えば、融合タンパク質のアミノ
酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜５０個程度、
さらに好ましくは１〜２０個のアミノ酸が欠失してもよ
く、又は、融合タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも
１個、好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１
〜２０個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、融合
タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましく
は１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜２０個のアミ
ノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。免疫誘導活性を
有している限り、より短い、またはより長いペプチド配
列をコードしてもよい。遺伝子に変異を導入するには、
Ｋｕｎｋｅｌ法や Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公
知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異
的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットなどを用
いて行うことができる。
する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個の
アミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
上記のような変異は、例えば、融合タンパク質のアミノ
酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜５０個程度、
さらに好ましくは１〜２０個のアミノ酸が欠失してもよ
く、又は、融合タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも
１個、好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１
〜２０個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、融合
タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましく
は１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜２０個のアミ
ノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。免疫誘導活性を
有している限り、より短い、またはより長いペプチド配
列をコードしてもよい。遺伝子に変異を導入するには、
Ｋｕｎｋｅｌ法や Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公
知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異
的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットなどを用
いて行うことができる。
【００２５】なお、免疫誘導活性とは、前記融合ンパク
質を投与された動物が、前記融合タンパク質を異物とし
て認識し、前記融合タンパク質に対する抗体を体内に生
産し、かつ該抗体が前記融合タンパク質の活性部分に作
用して日本脳炎ウイルスの活性を阻害する活性である。
質を投与された動物が、前記融合タンパク質を異物とし
て認識し、前記融合タンパク質に対する抗体を体内に生
産し、かつ該抗体が前記融合タンパク質の活性部分に作
用して日本脳炎ウイルスの活性を阻害する活性である。
【００２６】次に、粘膜免疫運搬体と日本脳炎ウイルス
外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）との
融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを作
製する方法について説明する。
外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）との
融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを作
製する方法について説明する。
【００２７】植物導入用組換えベクターの作製及びアグ
ロバクテリウムの形質転換植物導入用組換えベクター
は、上述のように得られたＤＮＡを、そのまま、または
所望により適当な制限酵素で消化し、あるいは、適切な
リンカーを連結して構築することができる。ＤＮＡを挿
入するためのベクターとして、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１
２１、ｐＧＡ４８２等のバイナリーベクターやｐＬＧＶ
２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間ベ
クターが挙げられるが、これらのベクターに限定されな
い。
ロバクテリウムの形質転換植物導入用組換えベクター
は、上述のように得られたＤＮＡを、そのまま、または
所望により適当な制限酵素で消化し、あるいは、適切な
リンカーを連結して構築することができる。ＤＮＡを挿
入するためのベクターとして、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１
２１、ｐＧＡ４８２等のバイナリーベクターやｐＬＧＶ
２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間ベ
クターが挙げられるが、これらのベクターに限定されな
い。
【００２８】前記融合タンパク質をコードする遺伝子
は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組
み込まれることが必要である特に植物体内で、外来遺伝
子などを発現させるためには、構造遺伝子の前後に、そ
れぞれ植物用のプロモーターとターミネーターを配置さ
せる必要がある。本発明で利用可能なプロモーターとし
ては、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ
Ｖ）由来の３５Ｓ転写物［Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， Ｒ．
Ａ． ｅｔ ａｌ．： Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ ６：３
９０１−３９０７（１９８７）］、トウモロコシのユビ
キチン［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ａ．Ｈ． ｅｔ
ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１８：６７
５−６８９（１９９２）］、ノパリン合成酵素（ＮＯ
Ｓ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成酵素遺伝子、イ
ネのアクチン（Ａｃｔ１）遺伝子等のプロモーターが挙
げられ、ターミネーター配列としては、例えばカリフラ
ワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由
来のターミネーター等が挙げられる。但し、植物体内で
機能することが知られているプロモーターやターミネー
ターであれば、これらのものに限定されない。
は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組
み込まれることが必要である特に植物体内で、外来遺伝
子などを発現させるためには、構造遺伝子の前後に、そ
れぞれ植物用のプロモーターとターミネーターを配置さ
せる必要がある。本発明で利用可能なプロモーターとし
ては、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ
Ｖ）由来の３５Ｓ転写物［Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ， Ｒ．
Ａ． ｅｔ ａｌ．： Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ ６：３
９０１−３９０７（１９８７）］、トウモロコシのユビ
キチン［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ａ．Ｈ． ｅｔ
ａｌ．：Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１８：６７
５−６８９（１９９２）］、ノパリン合成酵素（ＮＯ
Ｓ）遺伝子、オクトピン（ＯＣＴ）合成酵素遺伝子、イ
ネのアクチン（Ａｃｔ１）遺伝子等のプロモーターが挙
げられ、ターミネーター配列としては、例えばカリフラ
ワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由
来のターミネーター等が挙げられる。但し、植物体内で
機能することが知られているプロモーターやターミネー
ターであれば、これらのものに限定されない。
【００２９】また、必要に応じてプロモーター配列と前
記ＤＮＡとの間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持
つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデ
ヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）のイントロン［Ｇｅｎｅｓ
＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１：１１８３−１２００
（１９８７）］を導入することができる。さらに、効率
的に目的の形質転換細胞を選択するために、有効な選択
マーカー遺伝子を併用してもよい。その際に使用する選
択マーカーとしては、抗生物質ハイグロマイシンに対す
る抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子、ビアラホス（ｂｉａ
ｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノス
リシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子、
ブラストサイジンＳに対する抵抗性を付与するブラスト
サイジンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）遺伝子などが挙げら
れる。
記ＤＮＡとの間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持
つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデ
ヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）のイントロン［Ｇｅｎｅｓ
＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１：１１８３−１２００
（１９８７）］を導入することができる。さらに、効率
的に目的の形質転換細胞を選択するために、有効な選択
マーカー遺伝子を併用してもよい。その際に使用する選
択マーカーとしては、抗生物質ハイグロマイシンに対す
る抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子、ビアラホス（ｂｉａ
ｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノス
リシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子、
ブラストサイジンＳに対する抵抗性を付与するブラスト
サイジンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）遺伝子などが挙げら
れる。
【００３０】また、ＣＴＢと融合遺伝子の分子間摩擦を
最小限にとどめるため、ＣＴＢと融合遺伝子の間にはヒ
ンジ領域を挿入してもよい。ヒンジ領域は、たとえば、
ＧＰＧＰを１単位としてシングル、ダブル、トリプルと
タンデムに３種構築することができる。その際、ヒンジ
領域のコドンは植物種では比較的使用頻度の低いものを
使用し、タンパク翻訳の際リボゾームが一時停止あるい
は減速するようにすればよい。
最小限にとどめるため、ＣＴＢと融合遺伝子の間にはヒ
ンジ領域を挿入してもよい。ヒンジ領域は、たとえば、
ＧＰＧＰを１単位としてシングル、ダブル、トリプルと
タンデムに３種構築することができる。その際、ヒンジ
領域のコドンは植物種では比較的使用頻度の低いものを
使用し、タンパク翻訳の際リボゾームが一時停止あるい
は減速するようにすればよい。
【００３１】さらに、植物細胞の小胞体内で組換えタン
パク質が効率よく蓄積し、融合タンパク質が５量体を形
成しやすくするために、小胞体残留シグナル（ＳＥＫＤ
ＥＬ）を融合タンパク質のＣ’端側に挿入してもよい。
その際、ＳＥＫＤＥＬはコドン頻度の最も高いものを使
用し、その後ろにストップコドンＴＧＡを挿入すればよ
い。
パク質が効率よく蓄積し、融合タンパク質が５量体を形
成しやすくするために、小胞体残留シグナル（ＳＥＫＤ
ＥＬ）を融合タンパク質のＣ’端側に挿入してもよい。
その際、ＳＥＫＤＥＬはコドン頻度の最も高いものを使
用し、その後ろにストップコドンＴＧＡを挿入すればよ
い。
【００３２】所望により、さらにエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シ
グナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有す
るものを連結することができる。
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シ
グナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有す
るものを連結することができる。
【００３３】融合タンパク質をコードする遺伝子をバイ
ナリーベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮ
Ａを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡ
の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入し
てベクターにライゲーションする方法などが採用され
る。
ナリーベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮ
Ａを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡ
の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入し
てベクターにライゲーションする方法などが採用され
る。
【００３４】前記組換えベクターの例として、たとえ
ば、前記融合タンパク質をコードする遺伝子をｐＢＩ１
２１ベクターに挿入すればよい。
ば、前記融合タンパク質をコードする遺伝子をｐＢＩ１
２１ベクターに挿入すればよい。
【００３５】まず、ｐＢＩ系植物発現ベクターの下流
に、ＣＴＢ領域をコードする遺伝子を含む発現ベクター
を構築する（図３、４）。このようなベクターに、ＪＥ
Ｖ ｃＤＮＡのＥタンパク質領域を挿入し、ＪＥＶ／Ｃ
ＴＢ融合タンパク質を発現可能なベクターを構築する
（図５）。
に、ＣＴＢ領域をコードする遺伝子を含む発現ベクター
を構築する（図３、４）。このようなベクターに、ＪＥ
Ｖ ｃＤＮＡのＥタンパク質領域を挿入し、ＪＥＶ／Ｃ
ＴＢ融合タンパク質を発現可能なベクターを構築する
（図５）。
【００３６】たとえば、前記のように構築されたＣＴＢ
遺伝子を含む融合遺伝子をＣＴＢｈ １−３ＳＥＫＤＥＬ
として、プラスミドベクターｐＩＢＴ２１０．１内のカ
リフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流
に挿入して、ｐＩＢＴ２１０．１−ＣＴＢｈ１−３ＳＥ
ＫＤＥＬを作製する（図３）。
遺伝子を含む融合遺伝子をＣＴＢｈ １−３ＳＥＫＤＥＬ
として、プラスミドベクターｐＩＢＴ２１０．１内のカ
リフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流
に挿入して、ｐＩＢＴ２１０．１−ＣＴＢｈ１−３ＳＥ
ＫＤＥＬを作製する（図３）。
【００３７】次にこのプラスミドベクターからＣＴＢｈ
１−３ＳＥＫＤＥＬ発現カセットを持つＴ−ＤＮＡ領域
全体をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切り出し、植物発
現ベクターｐＢＩ１２１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ
フラグメントと入れ換えてｐＢＩ１２１−ＣＴＢｈ
１−３ＳＥＫＤＥＬを作製する（図４）。この植物発現
ベクターは、ＣＴＢの下流にＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ
サイトを有し、これらの制限酵素サイトに外来遺伝子を
挿入するとＣＴＢとインフレームになり、ＣＴＢ融合タ
ンパク質を産生できる。
１−３ＳＥＫＤＥＬ発現カセットを持つＴ−ＤＮＡ領域
全体をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切り出し、植物発
現ベクターｐＢＩ１２１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ
フラグメントと入れ換えてｐＢＩ１２１−ＣＴＢｈ
１−３ＳＥＫＤＥＬを作製する（図４）。この植物発現
ベクターは、ＣＴＢの下流にＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ
サイトを有し、これらの制限酵素サイトに外来遺伝子を
挿入するとＣＴＢとインフレームになり、ＣＴＢ融合タ
ンパク質を産生できる。
【００３８】上記ｐＢＩ１２１−ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫ
ＤＥＬのＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩサイトにＪＥＶＥｇｌｙ
ｃｏｐｒｏｔｅｉｎの全長を挿入して、ＣＴＢ−ＪＥＶ
Ｅ融合遺伝子を構築する（ｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−Ｊ
Ｅ）（図５）。上記のようにＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒを使用して、融合遺伝子の前塩基配列を確認し、ＣＴ
ＢとＪＥＶＥ遺伝子がインフレームであることを確認す
る。
ＤＥＬのＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩサイトにＪＥＶＥｇｌｙ
ｃｏｐｒｏｔｅｉｎの全長を挿入して、ＣＴＢ−ＪＥＶ
Ｅ融合遺伝子を構築する（ｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−Ｊ
Ｅ）（図５）。上記のようにＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒを使用して、融合遺伝子の前塩基配列を確認し、ＣＴ
ＢとＪＥＶＥ遺伝子がインフレームであることを確認す
る。
【００３９】次に、前記融合タンパク質をコードする遺
伝子を導入したトランスジェニック植物を作製する方法
について説明する。
伝子を導入したトランスジェニック植物を作製する方法
について説明する。
【００４０】本発明において、植物とは、植物培養細
胞、栽培植物の植物体、植物の器官（例えば葉、花弁、
茎、根、根茎、種子等）、または組織（例えば表皮、師
部、柔組織、木部、維管束等）のいずれをも意味するも
のである。ここで使用する植物種としては、特に制限は
ないが、イネ、ムギ、タバコ、トマト、シロイヌナズナ
など様々な植物が挙げられる。好ましくは、トマト、ナ
ス、ピーマン、タバコ等のナス科植物である。さらに好
ましくはタバコがあげられる。
胞、栽培植物の植物体、植物の器官（例えば葉、花弁、
茎、根、根茎、種子等）、または組織（例えば表皮、師
部、柔組織、木部、維管束等）のいずれをも意味するも
のである。ここで使用する植物種としては、特に制限は
ないが、イネ、ムギ、タバコ、トマト、シロイヌナズナ
など様々な植物が挙げられる。好ましくは、トマト、ナ
ス、ピーマン、タバコ等のナス科植物である。さらに好
ましくはタバコがあげられる。
【００４１】本発明において遺伝子が導入される植物の
形態としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態
の植物細胞が含まれる。例えば、培養細胞、プロトプラ
スト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルスが挙げられる
が、これらに制限されない。本発明における植物細胞に
は、植物体中の細胞も含まれる。
形態としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態
の植物細胞が含まれる。例えば、培養細胞、プロトプラ
スト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルスが挙げられる
が、これらに制限されない。本発明における植物細胞に
は、植物体中の細胞も含まれる。
【００４２】前記融合タンパク質をコードする遺伝子に
よる植物の形質転換は、当技術分野における技術者に公
知の種々の方法を用いて導入することが可能である。前
記遺伝子を含むベクターをアグロバクテリウムのバイナ
リーベクター法、パーティクルガン法、またはポリエチ
レングリコール法などで植物宿主に導入することにより
行うことができる。あるいはプロトプラストにエレクト
ロポレーション法で導入して形質転換することもでき
る。
よる植物の形質転換は、当技術分野における技術者に公
知の種々の方法を用いて導入することが可能である。前
記遺伝子を含むベクターをアグロバクテリウムのバイナ
リーベクター法、パーティクルガン法、またはポリエチ
レングリコール法などで植物宿主に導入することにより
行うことができる。あるいはプロトプラストにエレクト
ロポレーション法で導入して形質転換することもでき
る。
【００４３】パーティクルガン法による直接遺伝子導入
は、選択マーカー遺伝子を含むベクターと前記遺伝子を
含むベクターとを混合して、同時に植物の細胞に撃ち込
むコトランスフォーメーション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ）法により行うことができる。形質転換
の結果得られるシュート、毛状根などは、細胞培養、組
織培養または器官培養に用いることが可能であり、また
従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の
植物ホルモンの投与などにより植物体に再生させること
ができる。
は、選択マーカー遺伝子を含むベクターと前記遺伝子を
含むベクターとを混合して、同時に植物の細胞に撃ち込
むコトランスフォーメーション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ）法により行うことができる。形質転換
の結果得られるシュート、毛状根などは、細胞培養、組
織培養または器官培養に用いることが可能であり、また
従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の
植物ホルモンの投与などにより植物体に再生させること
ができる。
【００４４】アグロバクテリウムのバイナリーベクター
法を用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列
（ＬＢ，ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換え
ベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換
えベクターをアグロバクテリウム・チュメファシエンス
ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ等
に導入し、これを植物への形質導入用に用いる。
法を用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列
（ＬＢ，ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換え
ベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換
えベクターをアグロバクテリウム・チュメファシエンス
ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ等
に導入し、これを植物への形質導入用に用いる。
【００４５】たとえば、タバコに導入する場合、以下の
ようにして形質導入を行えばよい。無菌培養した非組換
えたばこ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）の葉を切り出し、１．
５−２ｃｍ四方の大きさに切る。切り取った葉は感染が
起こりやすいように、ナイフで所々に傷を付け、上記の
ように組換えたアグロバクテリウムの培養液（Ｏ．Ｄ
６００＝１×１０）に３分間浸す。その後、葉についた
アグロバクテリウム液をできるだけ取り除きＭＳ寒天培
地の上に必ず裏返して（気孔側を上にして）隙間なく敷
き詰める。
ようにして形質導入を行えばよい。無菌培養した非組換
えたばこ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）の葉を切り出し、１．
５−２ｃｍ四方の大きさに切る。切り取った葉は感染が
起こりやすいように、ナイフで所々に傷を付け、上記の
ように組換えたアグロバクテリウムの培養液（Ｏ．Ｄ
６００＝１×１０）に３分間浸す。その後、葉についた
アグロバクテリウム液をできるだけ取り除きＭＳ寒天培
地の上に必ず裏返して（気孔側を上にして）隙間なく敷
き詰める。
【００４６】シャーレをパラフィルムで閉じて、２カ所
ほど空気孔をあけ、暗室で３日間室温においてインキュ
ベートして感染を促す。
ほど空気孔をあけ、暗室で３日間室温においてインキュ
ベートして感染を促す。
【００４７】３日後、暗室に入れておいた葉を抗生物質
（カナマイシン）（５０μｇ／ｍｌ）と植物ホルモン
（オーキシンおよびサイトキニン）を含むＭＳ ｓｈｏ
ｏｔｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍに移し替え、カルスの
誘導を行う。２〜３週間でカルスから芽が出始めるの
で、出てきた芽をカルスから切り取り抗生物質（カナマ
イシン）（５０μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＳ ｒｏｏｔ
ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ入りのＭａｇｎｅｔａ
Ｂｏｘに移し替え、植物の無菌培養を作製し、組換えタ
バコを得ることができる。
（カナマイシン）（５０μｇ／ｍｌ）と植物ホルモン
（オーキシンおよびサイトキニン）を含むＭＳ ｓｈｏ
ｏｔｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍに移し替え、カルスの
誘導を行う。２〜３週間でカルスから芽が出始めるの
で、出てきた芽をカルスから切り取り抗生物質（カナマ
イシン）（５０μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＳ ｒｏｏｔ
ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ入りのＭａｇｎｅｔａ
Ｂｏｘに移し替え、植物の無菌培養を作製し、組換えタ
バコを得ることができる。
【００４８】本発明の遺伝子が導入された植物は、選択
マーカーによるスクリーニング、または遺伝子もしくは
その発現産物の解析により、遺伝子を保持する形質転換
細胞を選択することが可能である。たとえば、得られた
トランスジェニック植物及びその次世代に目的とする遺
伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞及
び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ
法またはサザンブロット法などを用いて、導入した遺伝
子を検出することにより行うことができる。得られたト
ランスジェニック植物は、土壌またはバーミキュライト
を詰めたポットで栽培し、株分けする。このようにして
得られた遺伝子導入植物も、本発明の範囲に含まれる。
また、本発明の遺伝子の植物組織内での発現部位は、例
えば各組織におけるｍＲＮＡの発現またはタンパク質の
発現を解析することにより確認することができる。具体
的には、本発明トランスジェニック植物による発現の確
認方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法等
が挙げられ、抗体を用いたウエスタン解析法等が挙げら
れるが、これらに限定されない。
マーカーによるスクリーニング、または遺伝子もしくは
その発現産物の解析により、遺伝子を保持する形質転換
細胞を選択することが可能である。たとえば、得られた
トランスジェニック植物及びその次世代に目的とする遺
伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞及
び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ
法またはサザンブロット法などを用いて、導入した遺伝
子を検出することにより行うことができる。得られたト
ランスジェニック植物は、土壌またはバーミキュライト
を詰めたポットで栽培し、株分けする。このようにして
得られた遺伝子導入植物も、本発明の範囲に含まれる。
また、本発明の遺伝子の植物組織内での発現部位は、例
えば各組織におけるｍＲＮＡの発現またはタンパク質の
発現を解析することにより確認することができる。具体
的には、本発明トランスジェニック植物による発現の確
認方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法等
が挙げられ、抗体を用いたウエスタン解析法等が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【００４９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。
【００５０】１．アグロバクテリウムによるＣＴＢ−Ｊ
Ｅの発現。
Ｅの発現。
【００５１】方法
ＣＴＢ−ＪＥＶ Ｅタンパク質融合遺伝子の構築
以下のようにしてコレラトキシンＢ鎖タンパク質と日本
脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅ
ｉｎ）との融合タンパク質を含む発現ベクターを作製し
た（図３）。
脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅ
ｉｎ）との融合タンパク質を含む発現ベクターを作製し
た（図３）。
【００５２】粘膜免疫アジュバントとしてコレラトキシ
ンＢ鎖遺伝子をプラスミドｐＭ２からＰＣＲ増幅し、そ
のＣ’末端側にＥタンパク遺伝子を融合可能なようにし
た。ＣＴＢ遺伝子を増幅する際、Ｎ’端側は、真核生物
での発現効率を高めるためのＫｏｚａｃ配列（ＧＣＣＡ
ＴＧＧ：ＡＴＧは開始コドンである）を導入し、Ｃ’端
側のＢａｍＨＩまたはＳｐｅＩサイトにインフレームで
外来遺伝子を融合できるようにした。ＰＣＲは、以下の
反応条件、テンプレート、およびプライマーを使用して
行った。
ンＢ鎖遺伝子をプラスミドｐＭ２からＰＣＲ増幅し、そ
のＣ’末端側にＥタンパク遺伝子を融合可能なようにし
た。ＣＴＢ遺伝子を増幅する際、Ｎ’端側は、真核生物
での発現効率を高めるためのＫｏｚａｃ配列（ＧＣＣＡ
ＴＧＧ：ＡＴＧは開始コドンである）を導入し、Ｃ’端
側のＢａｍＨＩまたはＳｐｅＩサイトにインフレームで
外来遺伝子を融合できるようにした。ＰＣＲは、以下の
反応条件、テンプレート、およびプライマーを使用して
行った。
【００５３】テンプレート：プラスミドｐＭ２、
Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴ
ＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号７） Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＧＴＡＧＧＧＧ
ＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＣＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴ
ＡＣＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣ−３’（配列番
号８） ＰＣＲ条件：９４℃において３分の後、９４℃において
４５秒、５５℃において１分、７２℃において１分を３
０サイクル、次に７２℃において１０分。
ＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号７） Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｉｍｅｒ： ５’−ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＧＴＡＧＧＧＧ
ＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＣＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴ
ＡＣＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣ−３’（配列番
号８） ＰＣＲ条件：９４℃において３分の後、９４℃において
４５秒、５５℃において１分、７２℃において１分を３
０サイクル、次に７２℃において１０分。
【００５４】ＣＴＢと融合遺伝子の分子間摩擦を最小限
にとどめるため、ＣＴＢと融合遺伝子の間にヒンジ領域
（ＧＰＧＰ）を挿入した。ヒンジ領域は、ＧＰＧＰを１
単位としてシングル、ダブル、トリプルとタンデムに３
種構築した。その際、ヒンジ領域のコドンは植物種では
比較的使用頻度の低いものを使用し、タンパク翻訳の際
リボゾームが一時停止あるいは減速するようにした。ま
た、植物細胞の小胞体内で組換えタンパク質が効率よく
蓄積し、融合タンパク質が５量体を形成しやすくするた
めに、小胞体残留シグナル（ＳＥＫＤＥＬ）を融合タン
パク質のＣ’端側に挿入した。具体的には、ＳＥＫＤＥ
Ｌはコドン頻度の最も高いものを使用し、その後ろにス
トップコドンＴＡＡを挿入した（ＴＣＣ ＧＡＡ ＡＡ
Ｇ ＧＡＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＴＡＡ ：それぞれＳ
Ｅ Ｋ Ｅ Ｄ Ｅ Ｌ ストップコドン、に対応す
る）。
にとどめるため、ＣＴＢと融合遺伝子の間にヒンジ領域
（ＧＰＧＰ）を挿入した。ヒンジ領域は、ＧＰＧＰを１
単位としてシングル、ダブル、トリプルとタンデムに３
種構築した。その際、ヒンジ領域のコドンは植物種では
比較的使用頻度の低いものを使用し、タンパク翻訳の際
リボゾームが一時停止あるいは減速するようにした。ま
た、植物細胞の小胞体内で組換えタンパク質が効率よく
蓄積し、融合タンパク質が５量体を形成しやすくするた
めに、小胞体残留シグナル（ＳＥＫＤＥＬ）を融合タン
パク質のＣ’端側に挿入した。具体的には、ＳＥＫＤＥ
Ｌはコドン頻度の最も高いものを使用し、その後ろにス
トップコドンＴＡＡを挿入した（ＴＣＣ ＧＡＡ ＡＡ
Ｇ ＧＡＴ ＧＡＡ ＣＴＴ ＴＡＡ ：それぞれＳ
Ｅ Ｋ Ｅ Ｄ Ｅ Ｌ ストップコドン、に対応す
る）。
【００５５】このように構築された融合遺伝子をＣＴＢ
ｈ１−３ＳＥＫＤＥＬとして、プラスミドベクターｐＩ
ＢＴ２１０．１内のカリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓプロモーターの下流に挿入して、ｐＩＢＴ２１０．１
−ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬを作製した（図３）。
ｈ１−３ＳＥＫＤＥＬとして、プラスミドベクターｐＩ
ＢＴ２１０．１内のカリフラワーモザイクウイルス３５
Ｓプロモーターの下流に挿入して、ｐＩＢＴ２１０．１
−ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬを作製した（図３）。
【００５６】ｐＩＢＴ２１０．１への挿入は、ＳａｃＩ
で消化した後（前記Ｃ末端プライマーには、ＳａｃＩ認
識部位（ＧＡＧＣＴＣ）を組み込んである）、通常の方
法でライゲーションを行った。
で消化した後（前記Ｃ末端プライマーには、ＳａｃＩ認
識部位（ＧＡＧＣＴＣ）を組み込んである）、通常の方
法でライゲーションを行った。
【００５７】ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬの全長は、自
動塩基配列決定装置（ＡＢＩ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ ３１０）で確認した。次にこのプラスミドベクタ
ーからＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬ発現カセットを持つ
Ｔ−ＤＮＡ領域全体をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切
り出し、植物発現ベクターｐＢＩ１２１のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントと入れ換えてｐＢＩ１２１
−ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬを作製した（図４）。こ
の植物発現ベクターは、ＣＴＢの下流にＢａｍＨＩおよ
びＳｐｅＩサイトを有し、これらの制限酵素サイトに外
来遺伝子を挿入するとＣＴＢとインフレームになり、Ｃ
ＴＢ融合タンパク質を産生できる。
動塩基配列決定装置（ＡＢＩ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ ３１０）で確認した。次にこのプラスミドベクタ
ーからＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬ発現カセットを持つ
Ｔ−ＤＮＡ領域全体をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切
り出し、植物発現ベクターｐＢＩ１２１のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントと入れ換えてｐＢＩ１２１
−ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬを作製した（図４）。こ
の植物発現ベクターは、ＣＴＢの下流にＢａｍＨＩおよ
びＳｐｅＩサイトを有し、これらの制限酵素サイトに外
来遺伝子を挿入するとＣＴＢとインフレームになり、Ｃ
ＴＢ融合タンパク質を産生できる。
【００５８】次に日本脳炎ウイルスＥ ｇｌｙｃｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ遺伝子の全長をウイルスのＲＮＡゲノムから
ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。そのｃＤＮＡを基に
して、遺伝子の３’側の約３０％（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒ
ｏｔｅｉｎのアミノ酸残基３００番から、アミノ酸残基
３７７番まで（Ｃ１）、アミノ酸残基３９９番まで（Ｃ
２）、アミノ酸残基４２６番まで（Ｃ３））をＢａｍＨ
Ｉ−ＳｐｅＩサイトに挿入して、ＣＴＢ−ＪＥＶＥ融合
遺伝子を構築し（ｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−ＪＥ）（図
５）、上記のようにＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用
して、融合遺伝子の前塩基配列を確認し、ＣＴＢとＪＥ
ＶＥ遺伝子がインフレームであることを確認した。
ｏｔｅｉｎ遺伝子の全長をウイルスのＲＮＡゲノムから
ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。そのｃＤＮＡを基に
して、遺伝子の３’側の約３０％（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒ
ｏｔｅｉｎのアミノ酸残基３００番から、アミノ酸残基
３７７番まで（Ｃ１）、アミノ酸残基３９９番まで（Ｃ
２）、アミノ酸残基４２６番まで（Ｃ３））をＢａｍＨ
Ｉ−ＳｐｅＩサイトに挿入して、ＣＴＢ−ＪＥＶＥ融合
遺伝子を構築し（ｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−ＪＥ）（図
５）、上記のようにＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用
して、融合遺伝子の前塩基配列を確認し、ＣＴＢとＪＥ
ＶＥ遺伝子がインフレームであることを確認した。
【００５９】ここで、図３〜５を参照して、作製したｐ
ＢＩ１２１−ＣＴＢ−ＪＥについて説明する。ｐＢＩ１
２１−ＣＴＢ−ＪＥのＴ−ＤＮＡ領域は、ＲＢとＬＢに
挟まれた領域で以下の遺伝子を含む（ＲＢとＬＢは、ア
グロバクテリウムによって認識され、植物核内にＴ−Ｄ
ＮＡのコピーを挿入する際に不可欠な塩基配列領域であ
る）。
ＢＩ１２１−ＣＴＢ−ＪＥについて説明する。ｐＢＩ１
２１−ＣＴＢ−ＪＥのＴ−ＤＮＡ領域は、ＲＢとＬＢに
挟まれた領域で以下の遺伝子を含む（ＲＢとＬＢは、ア
グロバクテリウムによって認識され、植物核内にＴ−Ｄ
ＮＡのコピーを挿入する際に不可欠な塩基配列領域であ
る）。
【００６０】１． トランスジェニック植物に抗生物質
カナマイシン耐性を賦与するフォスフォトランスフェラ
ーゼ遺伝子（ＮＰＴ−ＩＩ）発現カセット（ＮＯＳプロ
モーター及びＮＯＳターミネーター領域を含む）を含
む。これは、組換え体選抜に必要な遺伝子である。
カナマイシン耐性を賦与するフォスフォトランスフェラ
ーゼ遺伝子（ＮＰＴ−ＩＩ）発現カセット（ＮＯＳプロ
モーター及びＮＯＳターミネーター領域を含む）を含
む。これは、組換え体選抜に必要な遺伝子である。
【００６１】２． ＣＴＢ−ＪＥ発現カセット（ｅＣａ
ＭＶ３５Ｓプロモーター＊、ＴＥＶ５’翻訳エンハンサ
ー領域＊＊、及びＶＳＰ３’ターミネーター）を含む。
ヒンジ領域の後方、ＳＥＫＤＥＬ小胞体残留シグナルの
前方に日本脳炎ウイルスＥ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ
をＣＴＢ−ヒンジ領域とｉｎ ｆｒａｍｅになるように
挿入したことにより、ＣＴＢタンパクとＥタンパクはヒ
ンジ部位によって隔たれている。また、植物の小胞体に
組換えタンパクが蓄積されるように、Ｅ−ｇｌｙｃｏｐ
ｒｏｔｅｉｎの直ぐ後方にＳＥＫＤＥＬ小胞体残留シグ
ナルを結合した。ＣＴＢのＮ’末端にあるリーダーペプ
チドは、ＣＴＢ遺伝子本来のものであり、グラム陰性菌
のペリプラズム内へ移行する際に機能するが、植物発現
用の構築物においては、植物細胞内の小胞体に移行する
機能を果たす。
ＭＶ３５Ｓプロモーター＊、ＴＥＶ５’翻訳エンハンサ
ー領域＊＊、及びＶＳＰ３’ターミネーター）を含む。
ヒンジ領域の後方、ＳＥＫＤＥＬ小胞体残留シグナルの
前方に日本脳炎ウイルスＥ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ
をＣＴＢ−ヒンジ領域とｉｎ ｆｒａｍｅになるように
挿入したことにより、ＣＴＢタンパクとＥタンパクはヒ
ンジ部位によって隔たれている。また、植物の小胞体に
組換えタンパクが蓄積されるように、Ｅ−ｇｌｙｃｏｐ
ｒｏｔｅｉｎの直ぐ後方にＳＥＫＤＥＬ小胞体残留シグ
ナルを結合した。ＣＴＢのＮ’末端にあるリーダーペプ
チドは、ＣＴＢ遺伝子本来のものであり、グラム陰性菌
のペリプラズム内へ移行する際に機能するが、植物発現
用の構築物においては、植物細胞内の小胞体に移行する
機能を果たす。
【００６２】＊ｅＣａＭＶ３５Ｓプロモーター：プロモ
ーターの５’側が２重（タンデム）になっており、本来
のＣａＭＶ３５Ｓよりも数倍転写効率が高い。
ーターの５’側が２重（タンデム）になっており、本来
のＣａＭＶ３５Ｓよりも数倍転写効率が高い。
【００６３】＊＊ＴＥＶ５’翻訳エンハンサー：タバコ
に感染するウイルス由来の配列で、翻訳効率を向上させ
る塩基配列である。
に感染するウイルス由来の配列で、翻訳効率を向上させ
る塩基配列である。
【００６４】アグロバクテリウムへのｐＢＩ１２１−Ｃ
ＴＢ−ＪＥ遺伝子の導入 ＣＴＢ−ＪＥＶＥ融合遺伝子を有するバイナリーベクタ
ー（ｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−ＪＥ）をＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４
にエレクトロポレーション法で導入した。遺伝子導入の
際、Ｂｉｏ Ｒａｄのジーンパルサーを使用して、大腸
菌への遺伝子導入と同一のプロトコルで行った。具体的
には、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωにおいて、約３
０ｎｇ／μｌのＤＮＡを１μｌ（約３０ｎｇのＤＮＡ）
を使用して行った。
ＴＢ−ＪＥ遺伝子の導入 ＣＴＢ−ＪＥＶＥ融合遺伝子を有するバイナリーベクタ
ー（ｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−ＪＥ）をＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４
にエレクトロポレーション法で導入した。遺伝子導入の
際、Ｂｉｏ Ｒａｄのジーンパルサーを使用して、大腸
菌への遺伝子導入と同一のプロトコルで行った。具体的
には、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωにおいて、約３
０ｎｇ／μｌのＤＮＡを１μｌ（約３０ｎｇのＤＮＡ）
を使用して行った。
【００６５】遺伝子導入されたアグロバクテリウムをカ
ナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）によって選択し、プラス
ミドミニプレップ法によって導入されたバイナリーベク
ターをアグロバクテリウムから取りだした。挿入前と比
較してそのサイズに変化がないかどうかをいくつかの制
限酵素で切断することによって確認した。
ナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）によって選択し、プラス
ミドミニプレップ法によって導入されたバイナリーベク
ターをアグロバクテリウムから取りだした。挿入前と比
較してそのサイズに変化がないかどうかをいくつかの制
限酵素で切断することによって確認した。
【００６６】形質転換アグロバクテリウムに由来する融
合タンパク質の検出 アグロバクテリウムをＹＥＢ溶液（リファンピシン５０
μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、
カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）で培養し、バクテリアタ
ンパク抽出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して以下のよう
に全水溶性タンパク質を抽出した。
合タンパク質の検出 アグロバクテリウムをＹＥＢ溶液（リファンピシン５０
μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、
カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）で培養し、バクテリアタ
ンパク抽出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して以下のよう
に全水溶性タンパク質を抽出した。
【００６７】１． 形質転換アグロバクテリウム１グラ
ムにつき８μｌのｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏ
ｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）および８０μｌの
ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加して、２０
分間室温でインキュベート。
ムにつき８μｌのｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏ
ｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）および８０μｌの
ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加して、２０
分間室温でインキュベート。
【００６８】２． アグロバクテリウム１グラムにつき
４ｍｇのｄｅｏｘｙｃｈｏｉｃ ａｃｉｄを添加して、
３７℃でインキュベート。
４ｍｇのｄｅｏｘｙｃｈｏｉｃ ａｃｉｄを添加して、
３７℃でインキュベート。
【００６９】３． ライセートがどろどろになったとこ
ろで、アグロバクテリウム１グラムにつきＤＮａｃｅＩ
（１ｍｇ／ｍｌ）を添加して、約３０分間室温でインキ
ュベート。
ろで、アグロバクテリウム１グラムにつきＤＮａｃｅＩ
（１ｍｇ／ｍｌ）を添加して、約３０分間室温でインキ
ュベート。
【００７０】４． 高速（４００００ｇ程度）の遠心
（３０分間遠心）でライセートを沈殿させ、上清を分
離。
（３０分間遠心）でライセートを沈殿させ、上清を分
離。
【００７１】次に形質転換アグロバクテリウム由来のＣ
ＴＢ−ＪＥ融合タンパク質がＣＴＢの受容体であるＧＭ
１ガングリオシドに対する特異的親和性を保っているこ
とを確認するために、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡを以下の要領
で行った。
ＴＢ−ＪＥ融合タンパク質がＣＴＢの受容体であるＧＭ
１ガングリオシドに対する特異的親和性を保っているこ
とを確認するために、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡを以下の要領
で行った。
【００７２】１． マイクロタイタープレートをｍｏｎ
ｏｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＭ１（Ｓｉｇ
ｍａ Ｇ−７６４１）、１００μｌ／ウェル（３．０μ
ｇ／ｍｌ 重炭酸バッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ
３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３）、ＰＨ９．６）により４
℃において一晩コーティング。
ｏｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＭ１（Ｓｉｇ
ｍａ Ｇ−７６４１）、１００μｌ／ウェル（３．０μ
ｇ／ｍｌ 重炭酸バッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ
３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３）、ＰＨ９．６）により４
℃において一晩コーティング。
【００７３】２． プレートをＰＢＳＴ［ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０］で洗浄し、１％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）で３７℃において２時間ブロッ
キングして、再度洗浄。
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０］で洗浄し、１％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）で３７℃において２時間ブロッ
キングして、再度洗浄。
【００７４】３． 形質転換アグロバクテリウム抽出液
を数段階にＰＢＳで希釈し、１００μｌ／ウェルで一晩
４℃においてインキュベート。続いて洗浄。
を数段階にＰＢＳで希釈し、１００μｌ／ウェルで一晩
４℃においてインキュベート。続いて洗浄。
【００７５】４． ＣＴＢまたはＪＥＶのＥタンパク質
を認識する一次抗体（１０００から５０００倍希釈）を
添加して３７℃において２時間インキュベート。続いて
洗浄。
を認識する一次抗体（１０００から５０００倍希釈）を
添加して３７℃において２時間インキュベート。続いて
洗浄。
【００７６】５． アルカリホスファターゼ・コンジュ
ゲートの二次抗体（１００μｌ／ウェル）を添加して、
３７℃において１時間インキュベート。続いて洗浄。
ゲートの二次抗体（１００μｌ／ウェル）を添加して、
３７℃において１時間インキュベート。続いて洗浄。
【００７７】６． アルカリホスファターゼ基質（１０
０μｌ／ウェル）を添加して、室温において２０分間発
色させた後、Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍで測定。
０μｌ／ウェル）を添加して、室温において２０分間発
色させた後、Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍで測定。
【００７８】７． コントロールとしてＣＴＢタンパク
質（Ｓｉｇｍａ）を使用して、植物由来のＣＴＢ融合タ
ンパク質を測定。
質（Ｓｉｇｍａ）を使用して、植物由来のＣＴＢ融合タ
ンパク質を測定。
【００７９】結果
形質転換アグロバクテリウムは、カリフラワーモザイク
ウイルス３５Ｓプロモーターにより、その下流に存在す
るＣＴＢ−ＪＥＶＥ融合タンパク質を産生していること
が確認された。
ウイルス３５Ｓプロモーターにより、その下流に存在す
るＣＴＢ−ＪＥＶＥ融合タンパク質を産生していること
が確認された。
【００８０】２．アグロバクテリウム由来の融合タンパ
ク質を使用したマウス粘膜免疫実験。
ク質を使用したマウス粘膜免疫実験。
【００８１】方法
菌体の粗抽出液を用いてマウスの免疫実験を行った。免
疫ルートとして、経口、経鼻、腹腔の３ルートから行
い、週１回の計４回免疫した。最終免疫から１週間後に
尻尾から採決した血清を用いて抗体価の測定を行った。
中和試験では、日本脳炎ウイルスの北京株を用いて、日
本脳炎ワクチン試験で行われているように、血清希釈度
１０倍以上でプラック数が半減する場合を中和抗体陽性
とした。
疫ルートとして、経口、経鼻、腹腔の３ルートから行
い、週１回の計４回免疫した。最終免疫から１週間後に
尻尾から採決した血清を用いて抗体価の測定を行った。
中和試験では、日本脳炎ウイルスの北京株を用いて、日
本脳炎ワクチン試験で行われているように、血清希釈度
１０倍以上でプラック数が半減する場合を中和抗体陽性
とした。
【００８２】結果
経口および経鼻によるルートのみ菌体成分に対する抗体
が上昇せず、発現タンパク質のみを特異的に認識する抗
体の誘導が確認された。また、経口投与群では５匹中４
匹がウイルス中和抗体を産生していることがわかった。
が上昇せず、発現タンパク質のみを特異的に認識する抗
体の誘導が確認された。また、経口投与群では５匹中４
匹がウイルス中和抗体を産生していることがわかった。
【００８３】融合タンパク質は粘膜投与によって、従来
の日本脳炎ワクチン投与法は、注射接種により抗体誘導
を行うが、同等な効果を得ることができる。すなわち、
コレラトキシンＢ鎖タンパク質との融合タンパク質を作
製することによって、ウイルス外郭タンパク質を効率よ
く腸管粘膜組織に運搬し、全身性の免疫応答を誘導する
ことが可能である（表１）。
の日本脳炎ワクチン投与法は、注射接種により抗体誘導
を行うが、同等な効果を得ることができる。すなわち、
コレラトキシンＢ鎖タンパク質との融合タンパク質を作
製することによって、ウイルス外郭タンパク質を効率よ
く腸管粘膜組織に運搬し、全身性の免疫応答を誘導する
ことが可能である（表１）。
【００８４】
【表１】
３．日本脳炎ワクチンの経鼻接種によるウイルス中和抗
体の誘導実験。
体の誘導実験。
【００８５】方法
現行の日本脳炎ウイルスワクチンの粘膜免疫による抗体
誘導能を調べるため、マウスを使用して経鼻免疫実験を
行った。週一回、計４回接種し、最終免疫から１週間後
に抗体価の測定を行った。中和試験に関しては、上記の
ＣＴＢ−ＪＥ融合タンパク質摂取の場合と同様に行っ
た。
誘導能を調べるため、マウスを使用して経鼻免疫実験を
行った。週一回、計４回接種し、最終免疫から１週間後
に抗体価の測定を行った。中和試験に関しては、上記の
ＣＴＢ−ＪＥ融合タンパク質摂取の場合と同様に行っ
た。
【００８６】粘膜免疫ルートの効率を調べるために、現
行日本脳炎ワクチンを希釈し、経鼻免疫した後、ＥＬＩ
ＳＡによって抗体価と中和抗体価を調べた。
行日本脳炎ワクチンを希釈し、経鼻免疫した後、ＥＬＩ
ＳＡによって抗体価と中和抗体価を調べた。
【００８７】結果
結果は表２の通りである。免疫開始３週間後から抗体価
の上昇が認められた。ワクチン単独でも、アジュバント
との混合でも、抗体価の上昇が認められたが、アジュバ
ントの混合によりＥＬＩＳＡ抗体価と中和抗体価に著し
い上昇が確認された（表２）。
の上昇が認められた。ワクチン単独でも、アジュバント
との混合でも、抗体価の上昇が認められたが、アジュバ
ントの混合によりＥＬＩＳＡ抗体価と中和抗体価に著し
い上昇が確認された（表２）。
【００８８】
【表２】
【００８９】粘膜免疫ルートの効率は、腹腔投与に使わ
れるワクチン量（１３４ｎｇ）と比較すると、混合ワク
チンの場合でも約３倍量のワクチンが必要であることが
明らかとなった。アジュバントを使用しない場合は、そ
の１０倍量を投与しても抗体価の上昇が確認されなかっ
た（表３）。
れるワクチン量（１３４ｎｇ）と比較すると、混合ワク
チンの場合でも約３倍量のワクチンが必要であることが
明らかとなった。アジュバントを使用しない場合は、そ
の１０倍量を投与しても抗体価の上昇が確認されなかっ
た（表３）。
【００９０】
【表３】
４．トランスジェニックタバコによる融合タンパク質の
発現。
発現。
【００９１】方法
アグロバクテリウム感染によるタバコの形質転換
構築したバイナリーベクターｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−Ｊ
Ｅを植物核染色体内に導入する能力を持つ土壌細菌の一
種であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）へ挿入する。ｐＢＩ１
２１−ＣＴＢｈ １−３ＳＥＫＤＥＬを菌体内に持つアグ
ロバクテリウムをリファンピシン（５０ｎｇ／ｍｌ）、
ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシ
ン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＢ培地（１ｌあたり：
Ｂｅｅｆ Ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ、Ｂａｃｔｏ ｙｅａ
ｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １ｇ、Ｓｕｃｒｏｓｅ ５ｇ、
Ｂａｃｔｏ Ａｇｅｒ ９ｇ、ｐＨ７．３）で３日間培
養し、アセトシリンゴン（３７０μＭ）を含む滅菌した
ＭＳＯ培養液（１ｐａｃｋ／ｌ ＭＳ ｓａｌｔｓ、
３．０％ ｓｕｃｒｏｓｅ、１×Ｂ５ ｖｉｔａｍｉｎ
ｓ、ｐＨ５．８）に１０９−１０１０ｂａｃｔｅｒｉａ
／ｍｌ程度になるように懸濁した。滅菌したタバコの趣
旨をＭＳ培地で発芽させ、葉が７−８枚出るくらいまで
培養した後、葉を取り、メスで格子状（２ｃｍ四方くら
い）に切り出した。これら切り取ったリーフディスクは
感染が起こりやすいように、ナイフで所々に傷を付け、
形質転換アグロバクテリウムの懸濁液に１〜２分間浸
し、取りだした後に余分な液体を取り除いて、ＭＳ寒天
培地の上に、必ず裏側が上になるように（気孔側を上に
して）隙間なく敷き詰めた。シャーレをパラフィルムで
閉じて、２カ所ほど空気孔をあけ、暗室で３日間室温に
おいてインキュベートして感染を促した。３日後に、リ
ーフディスクを取りだし、カナマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）、ＮＡＡ（１００μｇ／ｍｌ）、クラフォラン（３
００μｇ／ｍｌ）を含むＭＳ選択培地に移し替えた。か
ら２週間程度でカルス化が進行した後、シュートが形成
され、葉が２〜３枚程度になった時点でカルスから切り
出し、ＭＳ選択培地で個別に培養を続けた。シュートか
ら根が形成されて、植物体が成長し始めた後、土に移植
し、さらに成長させた。
Ｅを植物核染色体内に導入する能力を持つ土壌細菌の一
種であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）へ挿入する。ｐＢＩ１
２１−ＣＴＢｈ １−３ＳＥＫＤＥＬを菌体内に持つアグ
ロバクテリウムをリファンピシン（５０ｎｇ／ｍｌ）、
ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシ
ン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＢ培地（１ｌあたり：
Ｂｅｅｆ Ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ、Ｂａｃｔｏ ｙｅａ
ｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １ｇ、Ｓｕｃｒｏｓｅ ５ｇ、
Ｂａｃｔｏ Ａｇｅｒ ９ｇ、ｐＨ７．３）で３日間培
養し、アセトシリンゴン（３７０μＭ）を含む滅菌した
ＭＳＯ培養液（１ｐａｃｋ／ｌ ＭＳ ｓａｌｔｓ、
３．０％ ｓｕｃｒｏｓｅ、１×Ｂ５ ｖｉｔａｍｉｎ
ｓ、ｐＨ５．８）に１０９−１０１０ｂａｃｔｅｒｉａ
／ｍｌ程度になるように懸濁した。滅菌したタバコの趣
旨をＭＳ培地で発芽させ、葉が７−８枚出るくらいまで
培養した後、葉を取り、メスで格子状（２ｃｍ四方くら
い）に切り出した。これら切り取ったリーフディスクは
感染が起こりやすいように、ナイフで所々に傷を付け、
形質転換アグロバクテリウムの懸濁液に１〜２分間浸
し、取りだした後に余分な液体を取り除いて、ＭＳ寒天
培地の上に、必ず裏側が上になるように（気孔側を上に
して）隙間なく敷き詰めた。シャーレをパラフィルムで
閉じて、２カ所ほど空気孔をあけ、暗室で３日間室温に
おいてインキュベートして感染を促した。３日後に、リ
ーフディスクを取りだし、カナマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）、ＮＡＡ（１００μｇ／ｍｌ）、クラフォラン（３
００μｇ／ｍｌ）を含むＭＳ選択培地に移し替えた。か
ら２週間程度でカルス化が進行した後、シュートが形成
され、葉が２〜３枚程度になった時点でカルスから切り
出し、ＭＳ選択培地で個別に培養を続けた。シュートか
ら根が形成されて、植物体が成長し始めた後、土に移植
し、さらに成長させた。
【００９２】形質転換タバコの解析
カナマイシン耐性を示すタバコからゲノムＤＮＡを抽出
し、ＣＴＢ領域を特異的に増幅するプライマーセット、
配列を使用してＰＣＲ増幅（最初に９４℃で３分、次に
９４℃で４５秒、５５℃で１分、７２℃で１分を３０サ
イクル、最後に７２℃で１０分）を行い、タバコが形質
転換されていることを確認した。形質転換されているタ
バコは、以下の要領で植物タンパク抽出バッファー（２
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、４００ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１４ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏ
ｌ、１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙ
ｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２
０）を用いて、水溶性の全タンパク質を抽出した。
し、ＣＴＢ領域を特異的に増幅するプライマーセット、
配列を使用してＰＣＲ増幅（最初に９４℃で３分、次に
９４℃で４５秒、５５℃で１分、７２℃で１分を３０サ
イクル、最後に７２℃で１０分）を行い、タバコが形質
転換されていることを確認した。形質転換されているタ
バコは、以下の要領で植物タンパク抽出バッファー（２
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、４００ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１４ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏ
ｌ、１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙ
ｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２
０）を用いて、水溶性の全タンパク質を抽出した。
【００９３】１． １ｇの植物組織（タバコのは、ジャ
ガイモの根茎等）につき１ｍｌの抽出バッファーを使用
して氷上のすり鉢でする。
ガイモの根茎等）につき１ｍｌの抽出バッファーを使用
して氷上のすり鉢でする。
【００９４】２． ホモジェネートを１７０００×ｇ、
４℃で１５分間遠心。
４℃で１５分間遠心。
【００９５】３． 上清を回収して、もう一度遠心。
【００９６】４． 上清をタンパク質アッセイに使用す
る。この時タンパク質は１０〜２０μｌにつき約５０〜
１００μｇになる。
る。この時タンパク質は１０〜２０μｌにつき約５０〜
１００μｇになる。
【００９７】タンパク抽出液を使用して、ＣＴＢ−ＪＥ
融合タンパク質がＣＴＢの受容体であるＧＭ１ガングリ
オシドに対する特異的親和性を保っていることを確認す
るために、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡを以下の要領で行った。
融合タンパク質がＣＴＢの受容体であるＧＭ１ガングリ
オシドに対する特異的親和性を保っていることを確認す
るために、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡを以下の要領で行った。
【００９８】１． マイクロタイタープレートをｍｏｎ
ｏｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＭ１（Ｓｉｇ
ｍａ Ｇ−７６４１）、１００μｌ／ウェル（３．０μ
ｇ／ｍｌ 重炭酸バッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ
３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３）、ＰＨ９．６）により、
４℃において一晩コーティング。
ｏｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ−ＧＭ１（Ｓｉｇ
ｍａ Ｇ−７６４１）、１００μｌ／ウェル（３．０μ
ｇ／ｍｌ 重炭酸バッファー（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ
３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３）、ＰＨ９．６）により、
４℃において一晩コーティング。
【００９９】２． プレートをＰＢＳＴ［ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０］で洗浄し、１％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）で３７℃において２時間ブロッ
キングして、再度洗浄。
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０］で洗浄し、１％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）で３７℃において２時間ブロッ
キングして、再度洗浄。
【０１００】３． 形質転換アグロバクテリウム抽出液
を数段階にＰＢＳで希釈し、１００μｌ／ウェルで一晩
４℃においてインキュベート。続いて洗浄。
を数段階にＰＢＳで希釈し、１００μｌ／ウェルで一晩
４℃においてインキュベート。続いて洗浄。
【０１０１】４． ＣＴＢまたはＪＥＶのＥタンパク質
を認識する一次抗体（１０００から５０００倍希釈）を
添加して３７℃において２時間インキュベート。続いて
洗浄。
を認識する一次抗体（１０００から５０００倍希釈）を
添加して３７℃において２時間インキュベート。続いて
洗浄。
【０１０２】５． アルカリホスファターゼ・コンジュ
ゲートの二次抗体（１００μｌ／ウェル）を添加して、
３７℃において１時間インキュベート。続いて洗浄。
ゲートの二次抗体（１００μｌ／ウェル）を添加して、
３７℃において１時間インキュベート。続いて洗浄。
【０１０３】６． アルカリホスファターゼ基質（１０
０μｌ／ウェル）を添加して、室温において２０分間発
色させた後、Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍで測定。
０μｌ／ウェル）を添加して、室温において２０分間発
色させた後、Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍで測定。
【０１０４】７． コントロールとしてＣＴＢタンパク
質（Ｓｉｇｍａ）を使用して、植物由来のＣＴＢ融合タ
ンパク質を測定。
質（Ｓｉｇｍａ）を使用して、植物由来のＣＴＢ融合タ
ンパク質を測定。
【０１０５】結果
トランスジェニックタバコを数固体解析した結果、タバ
コの葉に由来する全水溶性タンパク質１ｇにつき、２〜
１２μｇの組換えＣＴＢ−ＪＥ融合タンパク質が産生さ
れていることが確認された（図６）。
コの葉に由来する全水溶性タンパク質１ｇにつき、２〜
１２μｇの組換えＣＴＢ−ＪＥ融合タンパク質が産生さ
れていることが確認された（図６）。
【０１０６】
【発明の効果】従来の日本脳炎ワクチン投与法は、注射
接種により抗体誘導を行うが、本発明では、融合タンパ
ク質の粘膜投与により、それと同等な効果を得ることが
できる。すなわち、コレラトキシンＢ鎖タンパク質との
融合タンパク質を作製することにより、ウイルス外郭タ
ンパク質を効率よく腸管粘膜組織に運搬し、全身系の免
疫応答を誘導することが可能である。この融合タンパク
質が導入されたトランスジェニック植物の作成が可能で
あるため。食用の植物に遺伝子発現させることにより、
直接腸管粘膜を介して免疫することが可能である。上記
の構成およびその粘膜免疫投与法は、ヒト、家畜動物を
含む脊椎動物全般に応用できるものであり、「食べるワ
クチン」としての利用が期待されている
接種により抗体誘導を行うが、本発明では、融合タンパ
ク質の粘膜投与により、それと同等な効果を得ることが
できる。すなわち、コレラトキシンＢ鎖タンパク質との
融合タンパク質を作製することにより、ウイルス外郭タ
ンパク質を効率よく腸管粘膜組織に運搬し、全身系の免
疫応答を誘導することが可能である。この融合タンパク
質が導入されたトランスジェニック植物の作成が可能で
あるため。食用の植物に遺伝子発現させることにより、
直接腸管粘膜を介して免疫することが可能である。上記
の構成およびその粘膜免疫投与法は、ヒト、家畜動物を
含む脊椎動物全般に応用できるものであり、「食べるワ
クチン」としての利用が期待されている
【０１０７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> The transgenic plant that contain the gene coding a japanese ence
phalitis virus vaccines.
<120> The president of Uneversity of Ryukyu
<130> A0001001463
<160> 8
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Primer
<400> 1
gcgccatggt taaattaaaa tttggtgtt 29
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> Primer
<400> 2
cgcgagctct taaagttcat ccttttcgga tcctggacta gtaggggtac cgggcccggg 60
tccatttgcc atactaattg cggcaatcgc 90
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Primer
<400> 3
gcgggatcca cctatggcat gtgcaca 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Primer
<400> 4
gcgactagtt ccgaaggggg gttccat 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Primer
<400> 5
gcgactagta gctttatgcc aatggtg 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Primer
<400> 6
gcgactagtc ccttgtgtga tccaaga 27
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Primer
<400> 7
gcgccatggt taaattaaaa tttggtgtt 29
<210> 8
<211> 90
<212> DNA
<213> Primer
<400> 8
cgcgagctct taaagttcat ccttttcgga tcctggacta gtaggggtac cgggcccggg 60
tccatttgcc atactaattg cggcaatcgc 90
【図１】ＣＴＢ−ＪＥ融合タンパク質の応用例を示す
図。
図。
【図２】日本脳炎ウイルスＥｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ
の増幅部位を示す模式図。
の増幅部位を示す模式図。
【図３】コレラトキシンＢ鎖タンパク質（ＣＴＢ）との
融合タンパク質を含む発現ベクター、ｐＩＢＴ２１０．
１−ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬを示す模式図。
融合タンパク質を含む発現ベクター、ｐＩＢＴ２１０．
１−ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬを示す模式図。
【図４】コレラトキシンＢ鎖タンパク質（ＣＴＢ）日本
脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ）（ＪＥＶ）との融合タンパク質を含む植物発現
ベクター、ｐＢＩ１２１−ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬ
を示す模式図。
脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ）（ＪＥＶ）との融合タンパク質を含む植物発現
ベクター、ｐＢＩ１２１−ＣＴＢｈ１−３ＳＥＫＤＥＬ
を示す模式図。
【図５】コレラトキシンＢ鎖タンパク質（ＣＴＢ）日本
脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ）（ＪＥＶ）との融合タンパク質を含むバイナリ
ーベクター、ｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−ＪＥを示す模式
図。
脳炎ウイルス外郭タンパク質（Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ）（ＪＥＶ）との融合タンパク質を含むバイナリ
ーベクター、ｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−ＪＥを示す模式
図。
【図６】タバコにおけるＣＴＢ−ＪＥ融合タンパク質の
発現量を示す図。
発現量を示す図。
フロントページの続き
(72)発明者 辻 尚利
茨城県つくば市松代４−415−１
(72)発明者 佐藤 良也
沖縄県北中城村安谷屋693−１
(72)発明者 福永 利彦
沖縄県那覇市首里石嶺町４−58
(72)発明者 佐藤 茂俊
沖縄県中頭郡西原町字千原１番地 琉球大
学農学部内
(72)発明者 長嶺 勝
沖縄県那覇市首里末吉町１−180−９
(72)発明者 倉根 一郎
東京都千代田区一番町17−７−601
Ｆターム(参考） 2B030 CA15 CA17 CA19
4B024 AA01 AA07 BA32 BA38 CA04
CA07 DA01 EA02 EA04 GA11
Claims (6)
- 【請求項１】 粘膜免疫運搬体と日本脳炎ウイルス外郭
タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子が導入
されたトランスジェニック植物。 - 【請求項２】 前記粘膜免疫運搬体がコレラトキシンＢ
鎖タンパク質（ＣＴＢ）である、請求項１に記載のトラ
ンスジェニック植物。 - 【請求項３】 前記日本脳炎ウイルス外郭タンパク質
が、Ｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎである、請求項１また
は２に記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項４】 ｐＢＩ１２１−ＣＴＢ−ＪＥが導入され
たトランスジェニック植物。 - 【請求項５】 前記植物がタバコである、請求項１〜４
の何れか一項に記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項６】 日本脳炎ウイルスワクチンとしての使用
するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトラ
ンスジェニック植物。．
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001316859A JP2003116385A (ja) | 2001-10-15 | 2001-10-15 | 日本脳炎ワクチンをコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001316859A JP2003116385A (ja) | 2001-10-15 | 2001-10-15 | 日本脳炎ワクチンをコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003116385A true JP2003116385A (ja) | 2003-04-22 |
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