JP2003144144A - 菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法 - Google Patents
菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 加熱殺菌処理に供する微生物菌体または菌体
処理物を含有する液体の保存方法、特に加熱殺菌後の酵
素活性を保持しうる低コストの保存方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、加熱殺菌処理に供する微生物
の菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法であ
って、液体のｐＨを６〜８に調整しながら通気および攪
拌することを特徴とする菌体または菌体処理物を含有す
る液体の保存方法である。
処理物を含有する液体の保存方法、特に加熱殺菌後の酵
素活性を保持しうる低コストの保存方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、加熱殺菌処理に供する微生物
の菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法であ
って、液体のｐＨを６〜８に調整しながら通気および攪
拌することを特徴とする菌体または菌体処理物を含有す
る液体の保存方法である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は加熱殺菌処理に供す
る微生物菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方
法に関する。
る微生物菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え微生物の作り出す酵素は、
各種の化学反応にあわせて最適化され、多くの場合天然
微生物の作り出す酵素よりも活性が高く、産業上有用な
ものが多い。遺伝子組換え微生物は環境・人体の保護等
の観点から各種ガイドラインによりその取り扱いが定め
られている。遺伝子組換え微生物の組換えレベルによっ
ては、生きた遺伝子組換え微生物の外部環境への漏洩及
び人体への直接の接触を防止するために、当該微生物は
閉鎖設備内で取り扱う必要があるとされている。通常、
組換え微生物は、加熱処理により殺菌され、酵素のみが
利用される。このとき加熱処理する菌体液もしくは菌体
処理物を含有する液体を加熱処理終了まで安定に保存し
ておく必要がある。すなわち、酵素活性が失われたり、
腐敗、溶菌を起こすことを防がねばならない。そこで一
般的には、冷蔵や凍結などで保存されているが、低温に
菌体もしくは菌体処理物を保つための冷却コストが大き
い。
各種の化学反応にあわせて最適化され、多くの場合天然
微生物の作り出す酵素よりも活性が高く、産業上有用な
ものが多い。遺伝子組換え微生物は環境・人体の保護等
の観点から各種ガイドラインによりその取り扱いが定め
られている。遺伝子組換え微生物の組換えレベルによっ
ては、生きた遺伝子組換え微生物の外部環境への漏洩及
び人体への直接の接触を防止するために、当該微生物は
閉鎖設備内で取り扱う必要があるとされている。通常、
組換え微生物は、加熱処理により殺菌され、酵素のみが
利用される。このとき加熱処理する菌体液もしくは菌体
処理物を含有する液体を加熱処理終了まで安定に保存し
ておく必要がある。すなわち、酵素活性が失われたり、
腐敗、溶菌を起こすことを防がねばならない。そこで一
般的には、冷蔵や凍結などで保存されているが、低温に
菌体もしくは菌体処理物を保つための冷却コストが大き
い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、加熱
殺菌処理に供する微生物菌体または菌体処理物を含有す
る液体の保存方法、特に加熱殺菌後の酵素活性を保持し
うる低コストの保存方法を提供することにある。
殺菌処理に供する微生物菌体または菌体処理物を含有す
る液体の保存方法、特に加熱殺菌後の酵素活性を保持し
うる低コストの保存方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の加
熱殺菌処理に供する微生物菌体もしくは菌体処理物含有
液の保存方法に関して鋭意検討を行ってきたところ、そ
の保存を攪拌および通気を実施しながらｐHを制御する
ことにより行なうと、極めて効率的に活性の保持をなし
うるものであることを見出した。すなわち本発明は、下
記の保存方法である。 （１）加熱殺菌処理に供する微生物の菌体または菌体処
理物を含有する液体の保存方法であって、液体のｐＨを
６〜８に調整しながら通気および攪拌することを特徴と
する菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法。 （２）通気量が、菌体液または菌体処理物を含有する液
体の体積１に対して0.05以上、1.0以下（単位vvm）であ
ることを特徴とする前記（１）に記載の保存方法。 （３）攪拌所要動力数が、0.5W/m3から1800W/m3である
前記（１）〜（２）のいずれかに記載の保存方法。 （４）無機酸を用いてＰＨを調整することを特徴とする
前記（１）〜（３）のいずれかに記載の保存方法。 （５）無機酸が、硫酸、硝酸、塩酸から選ばれる少なく
とも１つであることを特徴とする前記（４）に記載の保
存方法。 （６）微生物がニトリルヒドラターゼを含有する微生物
であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか
１項に記載の保存方法。
熱殺菌処理に供する微生物菌体もしくは菌体処理物含有
液の保存方法に関して鋭意検討を行ってきたところ、そ
の保存を攪拌および通気を実施しながらｐHを制御する
ことにより行なうと、極めて効率的に活性の保持をなし
うるものであることを見出した。すなわち本発明は、下
記の保存方法である。 （１）加熱殺菌処理に供する微生物の菌体または菌体処
理物を含有する液体の保存方法であって、液体のｐＨを
６〜８に調整しながら通気および攪拌することを特徴と
する菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法。 （２）通気量が、菌体液または菌体処理物を含有する液
体の体積１に対して0.05以上、1.0以下（単位vvm）であ
ることを特徴とする前記（１）に記載の保存方法。 （３）攪拌所要動力数が、0.5W/m3から1800W/m3である
前記（１）〜（２）のいずれかに記載の保存方法。 （４）無機酸を用いてＰＨを調整することを特徴とする
前記（１）〜（３）のいずれかに記載の保存方法。 （５）無機酸が、硫酸、硝酸、塩酸から選ばれる少なく
とも１つであることを特徴とする前記（４）に記載の保
存方法。 （６）微生物がニトリルヒドラターゼを含有する微生物
であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか
１項に記載の保存方法。
【０００５】本発明の微生物は、目的とする酵素を含有
するものであれば特に制限されないが、ニトリルヒドラ
ターゼを含有する微生物が好適である。また、上記にお
けるニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水
分解して対応するアミド化合物を生成する能力をもつ酵
素をいうものである。ここで、ニトリルヒドラターゼを
含有する微生物としては、ニトリルヒドラターゼを産生
し、かつ５０重量％のアクリルアミド水溶液中でニトリ
ルヒドラターゼの活性を保持している微生物が好まし
い。
するものであれば特に制限されないが、ニトリルヒドラ
ターゼを含有する微生物が好適である。また、上記にお
けるニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水
分解して対応するアミド化合物を生成する能力をもつ酵
素をいうものである。ここで、ニトリルヒドラターゼを
含有する微生物としては、ニトリルヒドラターゼを産生
し、かつ５０重量％のアクリルアミド水溶液中でニトリ
ルヒドラターゼの活性を保持している微生物が好まし
い。
【０００６】具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、
コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Ba
cillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseu
domonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドク
ロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッッカス(Rh
odococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、
キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセ
ス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレ
ブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobac
ter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aero
monas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモ
バクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム( Agr
obacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代
表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属
する微生物を好適な例として挙げることができる。
コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Ba
cillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseu
domonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドク
ロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッッカス(Rh
odococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、
キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセ
ス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレ
ブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobac
ter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aero
monas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモ
バクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム( Agr
obacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代
表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属
する微生物を好適な例として挙げることができる。
【０００７】また、該微生物よりクローニングしたニト
リルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質
転換体も本発明でいう微生物に含まれる。なお、ここで
いう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Esc
herichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大
腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subt
ilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物
菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０
８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば
市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５とし
て、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げら
れる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成ア
ミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠
失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐
性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変
異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体
も、本発明でいう微生物に含まれる。
リルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質
転換体も本発明でいう微生物に含まれる。なお、ここで
いう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Esc
herichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大
腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subt
ilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物
菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０
８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば
市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５とし
て、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げら
れる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成ア
ミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠
失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐
性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変
異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体
も、本発明でいう微生物に含まれる。
【０００８】また、本発明における微生物の菌体処理物
は、微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物の
酵素活性画分を分離精製して得られる後分離物、該微生
物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・後分離物を適当な担
体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニト
リルヒドラターゼ等、所望の酵素の活性を有している限
りは本発明の菌体処理物に相当するものである。
は、微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物の
酵素活性画分を分離精製して得られる後分離物、該微生
物菌体や該菌体の抽出物・磨砕物・後分離物を適当な担
体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニト
リルヒドラターゼ等、所望の酵素の活性を有している限
りは本発明の菌体処理物に相当するものである。
【０００９】菌体または菌体処理物を含有する液体とし
ては、微生物の培養液の他、菌体または菌体処理物を各
種バッファー、生理食塩水、水などに溶解ないし懸濁さ
せたものがあげられる。菌体または菌体処理物の濃度は
任意であるが、2〜30wt% の範囲が好ましい。菌体また
は菌体処理物を含有する液体中に通気するガスとして
は、空気を用いるのが好ましい。 通気量は、菌体また
は菌体処理物を含有する液体の体積１に対して0.05以
上、1.0以下（単位vvm、1分間に液体１Lに気体１Lを流
した量が１vvm（volum/volum・分）となる）が好ましい
が、空気の分散や発泡を考えると、0.2〜0.6であること
がより望ましい。本発明の攪拌所要動力数は、0.5W/m3
から1800W/m3が好ましいが、菌体の沈降や発泡を考える
と、100W/m3から800W/m3がより望ましい。液体のｐHは
通常６〜８、望ましくは７〜7.5に調整する。ＰＨの調
整は、無機酸、有機酸などを使用できる。無機酸として
は、硫酸、硝酸、塩酸などを挙げることができる。有機
酸としては、アクリル酸、酢酸、メタクリル酸などを挙
げることができる。なかでも無機酸を使用するのが好ま
しい。保存温度は短期間保存の場合は室温でもよいが、
低温、例えば０℃〜２０℃で保存するのが好ましい。保
存期間も任意であるが、３日以内の範囲が好ましい。
ては、微生物の培養液の他、菌体または菌体処理物を各
種バッファー、生理食塩水、水などに溶解ないし懸濁さ
せたものがあげられる。菌体または菌体処理物の濃度は
任意であるが、2〜30wt% の範囲が好ましい。菌体また
は菌体処理物を含有する液体中に通気するガスとして
は、空気を用いるのが好ましい。 通気量は、菌体また
は菌体処理物を含有する液体の体積１に対して0.05以
上、1.0以下（単位vvm、1分間に液体１Lに気体１Lを流
した量が１vvm（volum/volum・分）となる）が好ましい
が、空気の分散や発泡を考えると、0.2〜0.6であること
がより望ましい。本発明の攪拌所要動力数は、0.5W/m3
から1800W/m3が好ましいが、菌体の沈降や発泡を考える
と、100W/m3から800W/m3がより望ましい。液体のｐHは
通常６〜８、望ましくは７〜7.5に調整する。ＰＨの調
整は、無機酸、有機酸などを使用できる。無機酸として
は、硫酸、硝酸、塩酸などを挙げることができる。有機
酸としては、アクリル酸、酢酸、メタクリル酸などを挙
げることができる。なかでも無機酸を使用するのが好ま
しい。保存温度は短期間保存の場合は室温でもよいが、
低温、例えば０℃〜２０℃で保存するのが好ましい。保
存期間も任意であるが、３日以内の範囲が好ましい。
【００１０】本発明の方法により所定の期間保存された
菌体または菌体処理物含有液は、加熱殺菌処理が施され
る。加熱殺菌温度、時間などは任意に設定することがで
きるが、例えば50〜121℃、3〜20分で行なうことができ
る。また、熱殺菌装置も特に限定されるものではない
が、プレートヒータ式熱交換器、２重管式熱交換器など
の間接加熱手段の熱交換器を挙げることができる。
菌体または菌体処理物含有液は、加熱殺菌処理が施され
る。加熱殺菌温度、時間などは任意に設定することがで
きるが、例えば50〜121℃、3〜20分で行なうことができ
る。また、熱殺菌装置も特に限定されるものではない
が、プレートヒータ式熱交換器、２重管式熱交換器など
の間接加熱手段の熱交換器を挙げることができる。
【００１１】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定され
るものではない。 実施例１ （培養）５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の
組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間の
オートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５
０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、
ＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）を一
白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養
した。 培地組成 酵母エキストラクト ５．０ｇ／Ｌ ポリペプトン １０．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ ５．０ｇ／Ｌ 塩化コバルト・六水和物 １０．０ｍｇ／Ｌ 硫酸第二鉄・七水和物 ４０．０ｍｇ／Ｌ ｐＨ７．５ 上記で得られた培養液を通気・攪拌・ｐHを変えながら
保存し、１日ごとに液の一部をとりだして殺菌処理（60
℃加熱、ホールド3分）後、活性測定をおこなった。な
お、ｐＨの調整には硫酸を使用した。
明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定され
るものではない。 実施例１ （培養）５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の
組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間の
オートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５
０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、
ＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）を一
白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養
した。 培地組成 酵母エキストラクト ５．０ｇ／Ｌ ポリペプトン １０．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ ５．０ｇ／Ｌ 塩化コバルト・六水和物 １０．０ｍｇ／Ｌ 硫酸第二鉄・七水和物 ４０．０ｍｇ／Ｌ ｐＨ７．５ 上記で得られた培養液を通気・攪拌・ｐHを変えながら
保存し、１日ごとに液の一部をとりだして殺菌処理（60
℃加熱、ホールド3分）後、活性測定をおこなった。な
お、ｐＨの調整には硫酸を使用した。
【００１２】（活性測定）培養液を少量とり、遠心分離
（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液よ
り分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再
懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。ニ
トリルヒドラターゼ活性の測定は、基質のアクリロニト
リルの菌体懸濁液への添加にて開始し、２０℃、１５分
の攪拌ののち、燐酸液を加えて反応を停止し、稀釈後、
高速液体クロマトク゛ラフィーで分析した。以下、すべてのデータ
で０日の活性を１とする。
（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液よ
り分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再
懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。ニ
トリルヒドラターゼ活性の測定は、基質のアクリロニト
リルの菌体懸濁液への添加にて開始し、２０℃、１５分
の攪拌ののち、燐酸液を加えて反応を停止し、稀釈後、
高速液体クロマトク゛ラフィーで分析した。以下、すべてのデータ
で０日の活性を１とする。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】
【表３】
【００１６】実施例２
（ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体
の取得）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＭｅｔに置
換するために、特開平９−２７５９７８で得られたｐＰ
Ｔ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、宝酒造社製
の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｉｓ Ｋｉｔ」を用いた部位特異的な変異導入を行っ
た。以後、「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を単にキットと呼ぶ。以下の実
施例では、基本的にキットの原理および操作方法を踏襲
した。３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調
製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌
した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるよう
にアンピシリンを添加した後、実施例１と同様にＭＴ−
１０８２２株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍ
にて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心
チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×
５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ
抽出法により該菌体よりｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤ
ＮＡを調製した。
の取得）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＭｅｔに置
換するために、特開平９−２７５９７８で得られたｐＰ
Ｔ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、宝酒造社製
の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｉｓ Ｋｉｔ」を用いた部位特異的な変異導入を行っ
た。以後、「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を単にキットと呼ぶ。以下の実
施例では、基本的にキットの原理および操作方法を踏襲
した。３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調
製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌
した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるよう
にアンピシリンを添加した後、実施例１と同様にＭＴ−
１０８２２株を一白菌耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍ
にて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心
チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×
５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ
抽出法により該菌体よりｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤ
ＮＡを調製した。
【００１７】ｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１μｇ
を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応
Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１記載のプライマー及び
Ｍ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記
載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成は
キットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５
秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２
℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー
（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライ
マーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５
０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載
の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作に
より行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応
終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロー
ス濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行
ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応
Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１記載のプライマー及び
Ｍ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記
載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成は
キットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５
秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２
℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー
（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライ
マーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５
０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載
の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作に
より行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応
終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロー
ス濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行
ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
【００１８】Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を
用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマ
ーおよびｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０
μｌの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μｌずつ
含む全量４７．５μｌのアニーリング溶液（組成はキッ
トに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８
℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一
定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持す
ることによってアニーリング処理を行った。アニーリン
グ処理液にＴＡＫＡＲＡＬＡ Ｔａｑを０．５μｌ加え
て７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成
させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番
号２に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表
の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて
全量を５０μｌとした後、熱変性（９８℃）１５秒、ア
ニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２
０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反
応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液
５μｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプ
ＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８質
量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約
２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマ
ーおよびｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０
μｌの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μｌずつ
含む全量４７．５μｌのアニーリング溶液（組成はキッ
トに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８
℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一
定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持す
ることによってアニーリング処理を行った。アニーリン
グ処理液にＴＡＫＡＲＡＬＡ Ｔａｑを０．５μｌ加え
て７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成
させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番
号２に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表
の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて
全量を５０μｌとした後、熱変性（９８℃）１５秒、ア
ニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２
０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反
応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液
５μｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプ
ＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８質
量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約
２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
【００１９】続いて、アガロースゲルから約２．０Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約
０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、
５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させ
た。この融解液に対して常法に従ってフェノール／クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を
精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。精製した
約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI
及びＨｉｎｄIIIにより切断した後、この制限酵素処理
液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール
沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌ
のＴＥに溶解した。
ｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約
０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、
５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させ
た。この融解液に対して常法に従ってフェノール／クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を
精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。精製した
約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI
及びＨｉｎｄIIIにより切断した後、この制限酵素処理
液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール
沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌ
のＴＥに溶解した。
【００２０】同様に、ｐＰＴ−ＤＢ１上の唯一の制限酵
素サイトであるＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIIIによりｐＰ
Ｔ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ
社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃
度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロー
ス片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に
懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融
解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホル
ム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製
し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
素サイトであるＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIIIによりｐＰ
Ｔ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ
社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃
度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロー
ス片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に
懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融
解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホル
ム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製
し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【００２１】この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物とｐ
ＰＴ−ＤＢ１断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコ
ンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、大腸菌
バンクを調製した。
ＰＴ−ＤＢ１断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコ
ンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、大腸菌
バンクを調製した。
【００２２】３０ｍｌの試験管に４０μｇ／ｍｌの硫酸
第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コバルト・
二水和物を含む１０ｍｌのＬＢ液体培地（以後、活性発
現培地と呼ぶ）を調製し、１２１℃・２０分間のオート
クレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μ
ｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、該大
腸菌バンクより任意に選別した５クローンを各一白菌耳
ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養
した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チュー
ブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）
により菌体を分離した。
第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コバルト・
二水和物を含む１０ｍｌのＬＢ液体培地（以後、活性発
現培地と呼ぶ）を調製し、１２１℃・２０分間のオート
クレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μ
ｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、該大
腸菌バンクより任意に選別した５クローンを各一白菌耳
ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養
した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チュー
ブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）
により菌体を分離した。
【００２３】該菌体を２００μｌのリン酸カリウムバッ
ファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、これに１質量％のアク
リロニトリルを添加して１０℃で２分間反応させた。反
応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を
停止させ、生成したアクリルアミド濃度を実施例２と同
様のＨＰＬＣ分析により測定した。その結果、５クロー
ン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニ
トリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認され
た。
ファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、これに１質量％のアク
リロニトリルを添加して１０℃で２分間反応させた。反
応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を
停止させ、生成したアクリルアミド濃度を実施例２と同
様のＨＰＬＣ分析により測定した。その結果、５クロー
ン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニ
トリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認され
た。
【００２４】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシ
ークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａ
を用いたプライマーエクステンション法により各クロー
ンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定
した。その結果、（表４）に示したクローンＮｏ．１に
おいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目
のＬｅｕがＭｅｔに置換されていた。
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシ
ークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａ
を用いたプライマーエクステンション法により各クロー
ンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定
した。その結果、（表４）に示したクローンＮｏ．１に
おいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目
のＬｅｕがＭｅｔに置換されていた。
【００２５】
【表４】
【００２６】続いて、 αサブユニットの１２６番目の
ＰｈｅをＴｙｒに置換するために、クローンＮｏ．１の
プラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作によ
り部位特異的な変異導入を行った。すなわち、３０ｍｌ
の試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃
・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地
に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリン
を添加した後、得られたクローンＮｏ．１株を一白菌耳
植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した
後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を
分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よ
りクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡを調製した。
ＰｈｅをＴｙｒに置換するために、クローンＮｏ．１の
プラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作によ
り部位特異的な変異導入を行った。すなわち、３０ｍｌ
の試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃
・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地
に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリン
を添加した後、得られたクローンＮｏ．１株を一白菌耳
植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した
後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を
分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よ
りクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００２７】このクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮ
Ａ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。Ｐ
ＣＲ反応Ｎｏ．４は、配列表の配列番号５記載のプライ
マー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に
配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系
（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８
℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応
（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこと
により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．５は、ＭＵＴ４プライ
マー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プ
ライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各
々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに
記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．４と同様の操
作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．４およびＮｏ．５の
反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガ
ロース濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析
を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大
腸菌バンクを調製した。
Ａ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。Ｐ
ＣＲ反応Ｎｏ．４は、配列表の配列番号５記載のプライ
マー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に
配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系
（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８
℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応
（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこと
により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．５は、ＭＵＴ４プライ
マー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プ
ライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各
々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに
記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．４と同様の操
作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．４およびＮｏ．５の
反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガ
ロース濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析
を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大
腸菌バンクを調製した。
【００２８】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０
ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍに
て約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ
適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラター
ゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローン
でアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラタ
ーゼ活性を保持していることが確認された。ニトリルヒ
ドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌ
より該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳ
ＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製
した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作に
より各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩
基配列を決定した。その結果、（表５）に示したクロー
ンＮｏ．２においてニトリルヒドラターゼのαサブユニ
ットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに、αサブユニットの１
２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
ーンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０
ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍに
て約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ
適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラター
ゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローン
でアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラタ
ーゼ活性を保持していることが確認された。ニトリルヒ
ドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌ
より該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳ
ＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製
した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作に
より各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩
基配列を決定した。その結果、（表５）に示したクロー
ンＮｏ．２においてニトリルヒドラターゼのαサブユニ
ットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに、αサブユニットの１
２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【００２９】
【表５】
【００３０】続いて、βサブユニットの２１２番目のＳ
ｅｒをＴｙｒに置換するために、クローンＮｏ．２のプ
ラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作により
部位特異的な変異導入を行った。すなわち、３０ｍｌの
試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・
２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に
終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを
添加した後、得られたクローンＮｏ．２株を一白菌耳植
菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。
該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠
心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離し
た。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクロ
ーンＮｏ．２株のプラスミドＤＮＡを調製した。
ｅｒをＴｙｒに置換するために、クローンＮｏ．２のプ
ラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作により
部位特異的な変異導入を行った。すなわち、３０ｍｌの
試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・
２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に
終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを
添加した後、得られたクローンＮｏ．２株を一白菌耳植
菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。
該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠
心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離し
た。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクロ
ーンＮｏ．２株のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００３１】このクローンＮｏ．２のプラスミドＤＮＡ
１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣ
Ｒ反応Ｎｏ．６は、配列表の配列番号６記載のプライマ
ー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配
列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系
（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８
℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応
（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこと
により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．７は、ＭＵＴ４プライ
マー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プ
ライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各
々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに
記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．６と同様の操
作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．６およびＮｏ．７の
反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガ
ロース濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析
を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大
腸菌バンクを調製した。
１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣ
Ｒ反応Ｎｏ．６は、配列表の配列番号６記載のプライマ
ー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配
列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系
（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８
℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応
（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこと
により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．７は、ＭＵＴ４プライ
マー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プ
ライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各
々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに
記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．６と同様の操
作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．６およびＮｏ．７の
反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガ
ロース濃度１．０質量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析
を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大
腸菌バンクを調製した。
【００３２】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０
ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍに
て約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ
適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラター
ゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローン
でアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラタ
ーゼ活性を保持していることが確認された。ニトリルヒ
ドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌ
より該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳ
ＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製
した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作に
より各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩
基配列を決定した。その結果、（表６）に示したクロー
ンＮｏ．３においてニトリルヒドラターゼのβサブユニ
ットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒに置換されていた。
ーンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０
ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍに
て約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ
適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラター
ゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローン
でアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラタ
ーゼ活性を保持していることが確認された。ニトリルヒ
ドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌ
より該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳ
ＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製
した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作に
より各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩
基配列を決定した。その結果、（表６）に示したクロー
ンＮｏ．３においてニトリルヒドラターゼのβサブユニ
ットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒに置換されていた。
【００３３】
【表６】
【００３４】このクローンＮＯ．３の菌体を実施例１と
同様に培養し、反応に必要な菌体を得た。上記で得られ
た培養液を通気・攪拌・ｐHを変えながら保存し、１日
ごとに液の一部をとりだして殺菌処理（60℃加熱、ホー
ルド3分）後、活性測定をおこなったが、結果は実施例
１と同じであった。
同様に培養し、反応に必要な菌体を得た。上記で得られ
た培養液を通気・攪拌・ｐHを変えながら保存し、１日
ごとに液の一部をとりだして殺菌処理（60℃加熱、ホー
ルド3分）後、活性測定をおこなったが、結果は実施例
１と同じであった。
【００３５】
【発明の効果】微生物菌体または菌体処理物を含有する
液を本発明の方法により保存した場合、保存後に菌体ま
たは菌体処理物を含有する液体を加熱殺菌した後でも酵
素活性の経時的な低下を抑制することができる。
液を本発明の方法により保存した場合、保存後に菌体ま
たは菌体処理物を含有する液体を加熱殺菌した後でも酵
素活性の経時的な低下を抑制することができる。
【配列表】
＜１１０＞Ｍｉｔｓｕｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．
＜１２０＞Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｕｎｇｕｓ ｂｏｄｙ ｏｒ
ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｆｕｎｇｕｓ ｂｏｄｙ
＜１３０＞Ｐ００００２９５
＜１６０＞６
＜２１０＞１
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２０＞
＜２２３＞Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌａｅｏｔｉｄｅ
ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞１
aacatcatgc gcaagtcg 18
＜２１０＞２
＜２１１＞１７
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２０＞
＜２２３＞Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌａｅｏｔｉｄｅ
ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞２
caggaaacag ctatgac 17
＜２１０＞３
＜２１１＞２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２０＞
＜２２３＞Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌａｅｏｔｉｄｅ
ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞３
ggccagtgcc tagcttacat 20
＜２１０＞４
＜２１１＞１７
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２０＞
＜２２３＞Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌａｅｏｔｉｄｅ
ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞４
gttttcccag tcacgac 17
＜２１０＞５
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２０＞
＜２２３＞Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌａｅｏｔｉｄｅ
ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞５
aactggtaca aggagccg 18
＜２１０＞６
＜２１１＞１８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２０＞
＜２２３＞Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌａｅｏｔｉｄｅ
ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ
＜４００＞６
ccgaactaca gcgtctac 18
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 有井 輝夫
千葉県茂原市東郷1900 三井化学株式会社
内
Ｆターム(参考） 4B050 CC03 CC07 DD02 LL05
Claims (6)
- 【請求項１】 加熱殺菌処理に供する微生物の菌体また
は菌体処理物を含有する液体の保存方法であって、液体
のｐＨを６〜８に調整しながら通気および攪拌すること
を特徴とする菌体または菌体処理物を含有する液体の保
存方法。 - 【請求項２】 通気量が、菌体または菌体処理物を含有
する液体の体積１に対して0.05vvm以上、1.0vvm以下
（単位 vvm）であることを特徴とする請求項１に記載の
保存方法。 - 【請求項３】流体あたりの攪拌所要動力数が、0.5W/m3
から1800W/m3である請求項１〜２のいずれか１項に記載
の保存方法。 - 【請求項４】 無機酸を用いてＰＨを調整することを特
徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存方
法。 - 【請求項５】無機酸が、硫酸、硝酸、塩酸から選ばれる
少なくとも１つであることを特徴とする請求項４に記載
の保存方法。 - 【請求項６】 微生物がニトリルヒドラターゼを含有す
る微生物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれ
か１項に記載の保存方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001344526A JP4205332B2 (ja) | 2001-11-09 | 2001-11-09 | 菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001344526A JP4205332B2 (ja) | 2001-11-09 | 2001-11-09 | 菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008059270A Division JP4652426B2 (ja) | 2008-03-10 | 2008-03-10 | ニトリルヒドラターゼを含有する菌体溶液熱処理物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003144144A true JP2003144144A (ja) | 2003-05-20 |
| JP4205332B2 JP4205332B2 (ja) | 2009-01-07 |
Family
ID=19158039
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001344526A Expired - Lifetime JP4205332B2 (ja) | 2001-11-09 | 2001-11-09 | 菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4205332B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1689875A1 (en) | 2003-12-02 | 2006-08-16 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Manufacture of amides |
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| WO2012161108A1 (ja) * | 2011-05-20 | 2012-11-29 | 株式会社ヤクルト本社 | 微生物の死菌化方法 |
| WO2013129179A1 (ja) | 2012-02-28 | 2013-09-06 | 三菱レイヨン株式会社 | 酵素の保存方法 |
-
2001
- 2001-11-09 JP JP2001344526A patent/JP4205332B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1689875A1 (en) | 2003-12-02 | 2006-08-16 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Manufacture of amides |
| JP2007512821A (ja) * | 2003-12-02 | 2007-05-24 | チバ スペシャルティ ケミカルズ ウォーター トリートメント リミテッド | アミドの製造 |
| EP1689875B1 (en) * | 2003-12-02 | 2009-11-25 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Manufacture of amides |
| US7816106B2 (en) | 2003-12-02 | 2010-10-19 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd. | Manufacture of amides |
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| US9434969B2 (en) | 2003-12-02 | 2016-09-06 | Basf Se | Manufacture of amides |
| JP2011041563A (ja) * | 2009-07-24 | 2011-03-03 | Daiyanitorikkusu Kk | 微生物菌体の保存方法及び微生物菌体の懸濁液 |
| US20140113350A1 (en) * | 2011-05-20 | 2014-04-24 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Method for killing microorganism |
| WO2012161108A1 (ja) * | 2011-05-20 | 2012-11-29 | 株式会社ヤクルト本社 | 微生物の死菌化方法 |
| CN103562374A (zh) * | 2011-05-20 | 2014-02-05 | 株式会社益力多本社 | 微生物的灭菌化方法 |
| US10760066B2 (en) | 2011-05-20 | 2020-09-01 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Method for killing microorganism |
| JP2015192683A (ja) * | 2011-05-20 | 2015-11-05 | 株式会社ヤクルト本社 | 微生物の死菌化方法 |
| JP5901625B2 (ja) * | 2011-05-20 | 2016-04-13 | 株式会社ヤクルト本社 | 微生物の死菌化方法 |
| KR102014732B1 (ko) * | 2011-05-20 | 2019-08-27 | 가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤 | 미생물의 사균화 방법 |
| KR20140010392A (ko) * | 2011-05-20 | 2014-01-24 | 가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤 | 미생물의 사균화 방법 |
| US20180362948A1 (en) * | 2011-05-20 | 2018-12-20 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Method for killing microorganism |
| CN103562374B (zh) * | 2011-05-20 | 2016-10-12 | 株式会社益力多本社 | 微生物的灭菌化方法 |
| AU2012260004B2 (en) * | 2011-05-20 | 2016-11-10 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Method for killing microorganism |
| KR20160112010A (ko) | 2012-02-28 | 2016-09-27 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 효소의 보존 방법 |
| US9353348B2 (en) | 2012-02-28 | 2016-05-31 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Method for preserving enzyme |
| WO2013129179A1 (ja) | 2012-02-28 | 2013-09-06 | 三菱レイヨン株式会社 | 酵素の保存方法 |
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