JP2003174886A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ストレプトコッカス ディスガラクティアエ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉ
ａｅ）由来の、スーパー抗原性を有する新規タンパク
質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、および該タンパ
ク質の精製法の提供。 【解決手段】Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ由来の特定
のアミノ酸配列と同じ、または実質的に同一のアミノ酸
配列を含むことを特徴とするタンパク質および該タンパ
ク質をコードすることを特徴とするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ストレプトコッカ
ス ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactia
e)由来のスーパー抗原性を有する新規タンパク質に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】一般抗原は、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇ
ｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ；以下，ＡＰＣ
と呼ぶ）内でプロセッシングを受けペプチド断片に分解
された後、主要組織適合抗原複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉ
ｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ
ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略す）クラスII分子と
複合体を形成して細胞表面に提示される。このときＴ細
胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｅｒ；以下、ＴＣ
Ｒと略す）は超可変部の相補性決定領域を用いてＭＨＣ
クラスII分子−ペプチド複合体を認識するため、活性化
されるＴ細胞は限定される。一方、スーパー抗原はＡＰ
Ｃによるプロセッシングを受けずにＭＨＣクラスII分子
とＴＣＲのβ鎖可変領域部分（以下、Ｖβと呼ぶ）の外
側に結合する。すなわちスーパー抗原はＶβの中でも多
様性に乏しい部分を認識するため、特定のＶβを持つＴ
細胞をその特異性に関係なく大量に活性化させる。Ｔ細
胞の過剰な活性化に伴い、単球、マクロファージの活性
化、サイトカインの大量放出が起こり、血圧低下、発熱
などの症状が引き起こされると考えられている。

【０００３】スーパー抗原は細菌性、ウイルス性、植物
性の３系統に分類できるが、中でも細菌性スーパー抗原
はヒトの感染症と深く関連している。細菌性スーパー抗
原として、黄色ブドウ球菌が産生する腸管毒素Ａ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｅ（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ；以下順に、ＳＥＡ、ＳＥ
Ｂ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、ＳＥＥと呼ぶ）や、トキシックシ
ョックシンドロームトキシン−１（ｔｏｘｉｃ ｓｈｏ
ｃｋ ｓｙｎｄｒｏｍ ｔｏｘｉｎ−１；以下、ＴＳＳ
Ｔ−１と略す）、Ａ群溶血性連鎖球菌が産生する外毒素
Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐ
ｙｒｏｇｅｎｉｃ ｅｘｏｔｏｘｉｎ Ａ、Ｃ、Ｆ、
Ｇ、Ｈ；以下順に、ＳＰＥＡ、ＳＰＥＣ、ＳＰＥＦ、Ｓ
ＰＥＧ、ＳＰＥＨと呼ぶ）、エルシニア菌が産生する外
毒素（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ；以下、
ＹＰＭと略す）が同定されている。

【０００４】スーパー抗原が関与している疾患として
は、ＴＳＳＴ−１に起因する毒素性ショック症候群（ｔ
ｏｘｉｃ ｓｈｏｃｋ ｓｙｎｄｒｏｍ；以下，ＴＳＳ
と略す）や新生児ＴＳＳ様発疹症（Ｎｅｏｎａｔａｌ
ＴＳＳ−ｌｉｋｅ ｅｘａｎｔｈｅｍａｔｏｕｓ ｄｉ
ｓｅａｓｅ；以下、ＮＴＥＤと略す）、ＹＰＭが原因の
全身エルシニア菌感染症などがある。さらに、猩紅熱や
劇症型Ａ群連鎖球菌感染症、急性全身性血管炎である川
崎病にも、スーパー抗原の関与が示唆されているが、原
因毒素は未だ明確になっていない。また、劇症型Ａ群連
鎖球菌感染症と類似の症例においてＣ群連鎖球菌である
ストレプトコッカス ディスガラクティアエ(Streptoco
ccus dysgalactiae)が検出されたという報告もあるが、
ストレプトコッカス ディスガラクティアエ(Streptoco
ccus dysgalactiae)はウシの乳房炎の原因菌としてしば
しば検出されるもののヒトからの採取例が少ないため、
これまで臨床的にあまり着目されていなかった。よっ
て、ストレプトコッカス ディスガラクティアエ(Strep
tococcus dysgalactiae)が産生する新たなスーパー抗原
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉ
ａｅ ｍｉｔｏｇｅｎ；以下、ＳＤＭと略す）の同定
は、未知のスーパー抗原が関与している可能性がある疾
患の発症機序を解明し、予防、あるいは治療法を確立す
るために必要であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なスー
パー抗原を提供することを目的としている。より詳細に
は、ストレプトコッカス ディスガラクティアエ(Strep
tococcus dysgalactiae)由来の、スーパー抗原性を有す
る新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、
および該タンパク質の精製法の提供を目的としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するために下記の構成を有する。 （１）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列と同
じ、もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むことを
特徴とするタンパク質またはその塩。 （２）配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列と同
じ、もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むことを
特徴とするシグナルペプチド質またはその塩。 （３）（１）記載のタンパク質Ｎ末端に、（２）記載の
シグナルペプチドが結合していることを特徴とするタン
パク質またはその塩。

【０００７】（４）（１）もしくは（３）記載のタンパ
ク質または（２）記載のシグナルペプチドをコードする
ことを特徴とするＤＮＡを含有するＤＮＡ。

【０００８】（５）形質転換した微生物を培養すること
により生成し、これを採取することを特徴とする（１）
もしくは（３）記載のタンパク質もしくははその塩また
は（２）記載のシグナルペプチドもしくはその塩の製造
法。 （６）ストレプトコッカス ディスガラクティアエ(Str
eptococcus dysgalactiae)を培養し、培養培地から
（１）もしくは（３）記載のタンパク質もしくはその塩
または（２）記載のシグナルペプチドもしくはその塩を
採取することを特徴とする該タンパク質もしくはその塩
または該シグナルペプチドもしくはその塩の製造法

【０００９】

【発明実施の形態】本発明の配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列は、同定されたＳＤＭのものである。本発明の
配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質は、スト
レプトコッカス ディスガラクティアエ(Streptococcus
dysgalactiae)に由来するタンパク質であってもよく、
組み換えタンパク質であってもよく、合成タンパク質で
あってもよい。

【００１０】本発明による新規タンパク質には、配列表
の配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一の
アミノ酸配列を含むタンパク質またはその塩も含まれ
る。配列番号２と実質的に同一のアミノ酸配列として
は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と約８０％以
上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５
％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられ
る。本発明の配列番号２と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質またはその塩としては、例えば、
配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のア
ミノ酸配列を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列
を有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタン
パク質またはその塩などが好ましい（以下、配列番号２
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するタンパク質を、本発明によるタ
ンパク質または本発明による新規タンパク質あるいは新
規タンパク質と称することがある）。実質的に同質の性
質としては、例えばヒト末梢血リンパ球に対するマイト
ジェン活性やＶβの選択性などが挙げられる。実質的に
同質とは、それらの性質が定性的に同質であることを示
す。従って、ヒト末梢血リンパ球に対するマイトジェン
活性やＶβの選択性が同等であることが好ましいが、こ
れらの性質の程度、タンパク質の分子量などの量的要素
は異なっていてもよい。

【００１１】本発明によるシグナルペプチドには、配列
表の配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むペプチ
ド、およびその塩が含まれ、配列番号４で表されるアミ
ノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さ
らに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸
配列などが挙げられる。より具体的には、配列番号４で
表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
有し、シグナルペプチドとしての機能を発揮できるペプ
チドであれば特に限定されず、分子量などの量的要素は
異なっていてもよい。

【００１２】また、本発明のタンパク質としては、例え
ば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するタン
パク質のＮ末端に、配列番号４で表されるアミノ酸配列
を含有するシグナルペプチドが結合したタンパク質など
も挙げられる。例えば、配列番号４で表されるシグナル
ペプチドを有するタンパク質は、本発明のタンパク質を
製造するための中間体として有用である。

【００１３】本発明のタンパク質、本発明のシグナルペ
プチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に本発明の
シグナルペプチドが結合したタンパク質は、ペプチド表
記の慣例にしたがって左端がアミノ末端（以下、Ｎ末端
と呼ぶ）、右端がカルボキシル末端（以下、Ｃ末端と呼
ぶ）である。本発明のタンパク質、本発明のシグナルペ
プチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に本発明の
シグナルペプチドが結合したタンパクのＣ末端は通常、
カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート
（−ＣＯＯ−）であるが、アミド（−ＣＯＮＨ２）また
はエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエス
テル基のＲとして、例えばＣ¹〜⁶アルキル基を用いるこ
とができ、アルキル基としては例えば、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどが挙
げられる。またエステル基のＲとしては、例えばＣ³〜⁸
シクロアルキル基を用いることができ、シクロアルキル
基としては例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルな
どが挙げられる。さらにエステル基のＲとしては例えば
フェニル、α−ナフチルなどのＣ⁶〜¹²アリール基、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ¹〜²アルキル
基、もしくはα−ナフチルメチルなどのαナフチル−Ｃ
¹〜²アルキル基、ビバロイルオキシメチルなどが用いら
れる。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル
基あるいはカルボキシレートを有している場合、カルボ
キシル基あるいはカルボキシレートがアミド化またはエ
ステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれ
る。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末
端のエステルなどを用いることができる。さらに、本発
明のタンパク質としては、アミノ酸残基Ｎ末端のアミノ
基が保護基で保護されているもの、生体内で切断されて
生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化
したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例え
ば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、イン
ドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基で保護さ
れているものが含まれる。ここで置換基の保護基として
は例えば、ホルミル基、アセチル基、Ｃ¹〜⁶アシル基な
どが挙げられる。また、本発明のタンパク質、本発明の
シグナルペプチド、または本発明のタンパク質のＮ末端
に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質とし
ては、糖鎖が結合した複合タンパク質なども含まれる。

【００１４】本発明のタンパク質、本発明のシグナルペ
プチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に本発明の
シグナルペプチドが結合したタンパク質の塩としては、
生理学的に許容される酸（例えば、無機酸、有機酸）や
塩基（例えば、アルカリ金属塩）などとの塩が用いら
れ、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩が用いら
れる。このような塩としては、例えば、無機酸との塩、
あるいは有機酸との塩などが用いられる。無機酸として
は例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などを用い
ることができ、また有機酸としては例えば、酢酸、蟻
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、しゅう酸、安息香酸、メ
タンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを用いること
ができる。

【００１５】本発明のタンパク質、本発明のシグナルペ
プチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシ
グナルペプチドが結合したタンパク質は、ストレプトコ
ッカス ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgala
ctiae)から製造することもできるし、本発明のタンパク
質、本発明のシグナルペプチドまたは本発明のタンパク
質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタン
パク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養
することによっても製造することができる。

【００１６】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、例えば配列番号１で表される塩基配列を含有す
るＤＮＡ、または配列番号１で表されるＤＮＡと厳しい
条件下でハイブリッドを形成する塩基配列を有し、本発
明のタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク
質をコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。
厳しい条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４
０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭであり 、温度が
約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃である条件
を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約
６５℃の場合がさらに好ましい。配列番号１で表される
塩基配列を有するＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッド
を形成できるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表
される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以
上さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基
配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。

【００１７】本発明のシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、例えば配列番号３で表される塩基配列を
含有するＤＮＡ、または配列番号３で表されるＤＮＡと
厳しい条件下でハイブリッドを形成する塩基配列を有
し、本発明のシグナルペプチドと実質的に同質の性質を
有するシグナルペプチドをコードするＤＮＡであればい
ずれのものでもよい。配列番号３で表される塩基配列を
有するＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッドを形成でき
るＤＮＡとしては、例えば、配列番号３で表される塩基
配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上さらに好
ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有
するＤＮＡなどが用いられる。

【００１８】本発明のタンパク質、本発明のシグナルペ
プチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシ
グナルペプチドが結合したタンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、前述した本発明のタンパク質、本発明のシ
グナルペプチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に
本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質をコー
ドし、スーパー抗原性を有するものであればいかなるも
のであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
ライブラリー、前記した細菌由来のｃＤＮＡ、前記した
細菌由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれ
でもよい。また、５’末端側の翻訳終止コドンの塩基と
しては、ＴＡＡ、ＴＧＡ、ＴＡＧのいずれでもよい。

【００１９】本発明は、前記タンパク質、前記シグナル
ペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明の
シグナルペプチドが結合したタンパク質をコードするＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを有し当該タンパク質を発現しうるプラ
スミドおよびこのプラスミドを有する宿主細胞を提供す
る。宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、肺炎双
球菌、連鎖球菌などの原核細胞宿主、酵母、ＣＯＳ細
胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、３Ｔ３細胞、３Ｔ６細
胞、Ｌｔｋ−細胞などの真核細胞宿主など、遺伝子組換
え技術分野において通常用いられるすべての宿主細胞を
用いることができる。本発明のプラスミドとしては、用
いる宿主に対応して適切なプラスミドであればいかなる
ものでもよい。プラスミドとしては、例えば、通常の発
現用プラスミド／ウイルスベクターを用いればよく、原
核細胞宿主を用いる場合には、例えば、ＥＴ−３ａ−
ｄ、ｐＥＴ−５ａ−ｃ、ｐＥＴ−９ａ−ｄ、ｐＥＴ−１
１ａ−ｄ、ｐＥＴ−１２ａ−ｃなどのベクターを用いる
ことができる。本発明は、ストレプトコッカス ディス
ガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)または上
記宿主細胞を培養することを特徴とする前記タンパク
質、前記シグナルペプチドもしくは本発明のタンパク質
のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパ
ク質またはそれらの塩の製造法を提供する。本発明のタ
ンパク質またはシグナルペプチドまたは本発明のタンパ
ク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタ
ンパク質を発現しうるストレプトコッカス ディスガラ
クティアエ(Streptococcus dysgalactiae)または宿主細
胞は、細胞の性質に応じて通常の方法で培養することが
できる。培養培地はストレプトコッカス ディスガラク
ティアエ(Streptococcus dysgalactiae)または宿主細胞
の培養に適した培地であれば限定されない。培養培地か
ら該タンパク質を得るためには、イオン交換クロマトグ
ラフィーと硫安分画を必要回繰り返し、必要に応じてヒ
ドロキシアパタイトカラム、ゲル濾過などを行うことに
より単離精製することができる。

【００２０】本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細
胞から抽出するにためには、培養後、公知の方法で菌体
または細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチーム、凍結融解などによって菌体あるいは細
胞を破壊した後、遠心分離や濾過によりタンパク質の粗
抽出液を得る方法などを用いることができる。培養液中
にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知
の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を得
る。上記の方法で得られた培養上清、あるいは抽出液中
に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を
適切に組み合わせて行うことができる。分離、精製法と
しては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度を利用する方
法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、およびＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を
利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷
電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、
等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など
が用いられる。タンパク質が遊離体で得られた場合に
は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に
変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公
知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体また
は他の塩に変換することができる。なお、組み替え体が
産生するタンパク質を精製前または精製後に適当なタン
パク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加
えたり、ペプチドを部分的に除去することもできる。タ
ンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモト
リプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテイン
キナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。

【００２１】本発明のタンパク質は、公知の合成法に従
っても製造することができる。タンパク質の合成法とし
ては、例えば、固相合成法、液相合成法を用いることが
でき、本発明のタンパク質を構成しうる部分ペプチドも
しくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護
基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペ
プチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護
基の脱離としては、例えば、以下の１〜５に記載された
方法が挙げられる。 １．Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ およびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅ
ｔｔｉ、ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ（１９６６年） ２．ＳｃｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９６５年） ３．泉屋信夫他，ペプチド合成の基礎と実験 丸善
（株） （１９７５年） ４．矢島冶明および榊原俊平、生化学実験講座１、タン
パク質の化学IV、２０５、（１９７７年） ５．矢島冶明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチ
ド合成、広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて、本発明のタンパク質、本
発明のシグナルペプチドもしくは本発明のタンパク質の
Ｎ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク
質またはそれらの塩を精製単離することができる。上記
方法で得られるペプチドもしくはタンパク質が遊離体で
ある場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によ
って適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得ら
れた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によ
って遊離体または他の塩に変換することができる。

【００２２】本発明に係るタンパク質、本発明に係るシ
グナルペプチドもしくは本発明のタンパク質のＮ末端に
本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質、また
はそれらをコードするＤＮＡは、該タンパク質もしくは
該シグナルペプチドが関与している疾患の診断に用いる
ことができる。その診断方法としては例えば酵素免疫測
定法があり、該タンパク質もしくは該シグナルペプチド
を用いて該タンパク質もしくは該ペプチドに対する抗体
価を測定することができるし、該タンパク質もしくは該
シグナルペプチドを動物に免疫して得られた抗体を用い
て、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドの濃度を
測定することもできる。さらに、該タンパク質もしくは
該シグナルペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡ
は、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドが関与し
ている疾患の治療や治療法の開発に用いることができ
る。治療としては例えば、該タンパク質を失活させたり
該タンパク質による免疫系の活性化を抑制するための医
薬品や、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドを吸
着除去できるカラム、または該タンパク質に対する抗体
を用いて、該タンパク質が関与している疾患に対する治
療を行うことができるし、感染症患者において分離され
た感染菌のＤＮＡを解析することでも該タンパク質を産
生する菌を判別することができるため、感染症疾患の治
療につなげることもできる。

【００２３】

【実施例】実施例１：新規タンパク質の精製 透析により高分子成分を除去したＤｉｆｃｏ社製Ｂｒａ
ｉｎ−Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ液体培地でストレ
プトコッカス ディスガラクティアエ(Streptococcus d
ysgalactiae)を３７℃、５％二酸化炭素インキュベータ
ー中で終夜静置培養した。遠心分離およびフィルターろ
過により菌体を除去した培養液を水で５倍に希釈後、リ
ン酸添加によりｐＨ４．５に調製した。この培養上清に
あらかじめクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平
衡化したアマシャムファルマシア社製ＳＰ−Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ２５を添加することにより培養上清中から活
性タンパク質をゲルに吸着させた。このＳＰ−Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ２５をカラムに充填しクエン酸−リン酸緩
衝液で洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出させ
た。得られた溶出液に７５％飽和硫酸アンモニウム溶液
を添加して沈殿させた後蒸留水に溶解し、２５ｍＭ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．３）に対して透析を行った。これ
をあらかじめ２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で
平衡化したＴｏｓｏｈ製ＳＰ−５ＰＷ陽イオン交換カラ
ムに添加し、０．４Ｍまでの塩化ナトリウムの直線的濃
度勾配により溶出した。溶出液の各分画の活性は、ヒト
末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣと呼ぶ）に対するマイト
ジェン活性により測定した。すなわち、常法によりＰＢ
ＭＣを調整しこれに各分画液を希釈して添加後、実施例
２に記載の方法でマイトジェン活性の測定を行った。活
性分画を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）で平
衡化したヒドロキシアパタイトカラムにかけ、０．２Ｍ
までのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の直線的勾配に
より溶出した。得られた活性分画をアマシャムファルマ
シア社製Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｇ７５ゲル濾過カラムに
より展開した。得られた活性タンパク質はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上で３３ｋＤａの分子量であった（図１）。本法に
より１０Ｌの培養から５０μｇ程度の新規タンパク質が
精製できた。

【００２４】実施例２：新規タンパク質の活性およびそ
の作用機序 （１）Ｔ細胞活性化能 ヒツジ赤血球とのロゼット形成法によってヒト末梢血リ
ンパ球をＴ細胞分画と非Ｔ細胞分画に分け、（ａ）Ｔ細
胞分画単独、（ｂ）非Ｔ細胞分画単独、（ｃ）Ｔ細胞分
画と非Ｔ細胞分画を１対１の割合で混合したもの、の３
種類の細胞懸濁液を用意した。各細胞懸濁液を細胞数が
１×１０５／ｗｅｌｌとなるよう９６穴のマイクロプレ
ートに添加し、これにＳＤＭを１ｐｇ／ｍｌから１０ｎ
ｇ／ｍｌの各濃度で添加して、３７℃、５％ＣＯ２イン
キュベーター中で２日間培養した。

【００２５】この培養上清を希釈し、上清中に含まれる
インターロイキン２（以下、ＩＬ−２と略す）の量を、
ＩＬ−２に依存して増殖するＣＴＬＬ−２細胞を用いた
バイオアッセイにより測定した。（ｃ）のサンプルでＩ
Ｌ−２の産生が認められた（表１）ことから、ＳＤＭに
はマイトジェン活性があることが示された。さらに、Ｔ
細胞単独（（ｂ）のサンプル）ではＩＬ−２が産生され
ず、Ｔ細胞と非Ｔ細胞が共存している場合にのみ、ＩＬ
−２の産生が起こった。ＳＤＭによるＴ細胞活性化には
Ｔ細胞以外の細胞も必要であることが示された。

【００２６】

【表１】

【００２７】（表１）Ｔ細胞／非Ｔ細胞分画混合懸濁液
へのＳＤＭ刺激によるＩＬ−２産生性（Ｕ／ｍｌ） （２）Ｔ細胞活性化能のＭＨＣクラスII依存性 マウス繊維芽細胞であるＬ細胞にＭＨＣクラスIIの亜型
であるヒト白血球抗原−ＤＲ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏ
ｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ＤＲ；以下、ヒトＨＬＡ−
ＤＲと呼ぶ）を形質転換した細胞（以下、８１２４細胞
と呼ぶ）に対し、マイトマイシンＣ処理およびＸ線照射
を行い、増殖能を失わせた。この細胞と実施例２（１）
の方法で分画したＴ細胞をそれぞれ１×１０５／ｗｅｌ
ｌ、５×１０５／ｗｅｌｌになるよう４８穴のマイクロ
プレートに混合して播種した。これに１０ｎｇ／ｍｌの
ＳＤＭを添加し、２日間培養した後、上清を採取してＩ
Ｌ−２濃度を測定した。この実験を、ＨＬＡ−ＤＲで形
質転換していないＬ細胞についても行った。８１２４細
胞とＴ細胞が共存する場合にのみＩＬ−２産生が認めら
れたことから、ＳＤＭはＭＨＣクラスII依存性にＴ細胞
を活性化することが示された。

【００２８】（３）Ｔ細胞活性化におけるプロセッシン
グ依存性 ８１２４細胞を１％パラホルムアルデヒドで３７℃、５
分間の処理を行うことで固定化し、細胞の抗原プロセッ
シング能を失わせた。この細胞および実施例２（１）の
方法で分画したＴ細胞をそれぞれ１×１０５／ｗｅｌ
ｌ、５×１０５／ｗｅｌｌになるよう４８穴のマイクロ
プレートに混合して播種した。１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＭ
を添加し、２日間培養した後、上清を採取してＩＬ−２
濃度を測定した。この実験を、パラホルムアルデヒド処
理をしていない８１２４細胞についても行った。

【００２９】プロセッシング能のない細胞でもＩＬ−２
産生が認められたことから、ＳＤＭによるＴ細胞活性化
にはプロセッシング過程は不必要であることが確認でき
た。

【００３０】（４）Ｔ細胞抗原レセプターＶβ鎖可変領
域を持ったＴ細胞の選択的活性化 実施例２（２）の方法に従い、８１２４細胞およびＴ細
胞を混合、播種し、これに１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＭまた
は１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体を添加して２日間培養し
た。培養後Ｔ細胞を回収し、ｃＤＮＡを調製した。得ら
れたｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により２２種類のヒ
トＶβ領域に対応したプライマーを用いてそれぞれの領
域を増幅した。ｃＤＮＡの調整およびＰＣＲは、常法に
従って行った。それぞれのＶβ領域の増幅度をＳＤＭ刺
激の場合と抗ＣＤ３抗体刺激の場合で比較したところ、
ＳＤＭで刺激した細胞についてのみＶβ１およびＶβ８
領域を持ったＴ細胞が選択的に増幅された（図３）。

【００３１】以上、実施例２（１）〜（４）で述べたよ
うに、ＳＤＭはＴ細胞の活性化能を有すること、またそ
の活性化能は、ＭＨＣクラスII依存性であり、プロセッ
シング非依存性であり、ＴＣＲのＶβ１、またはＶβ８
に特異的であることが確認できた。これらのことより、
ＳＤＭはスーパー抗原であることが明らかとなった。

【００３２】実施例３：新規タンパク質のアミノ酸配列
および新規タンパク質をコードするＤＮＡ配列の解析 図２は本発明の新規タンパク質のアミノ酸配列とそれを
コードするＤＮＡの塩基配列とを対応させたものであ
る。図２においてアミノ酸配列については１〜２６がシ
グナルペプチドであり、塩基配列については１〜３が開
始コドン、７１５〜７１７が終止コドンである。

【００３３】（１）新規タンパク質のアミノ酸配列解析 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦにブロッティングし目的
タンパク質のみのバンドとしたサンプルについて、ヒュ
ーレットパッカー社製Ｇ１００５Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｑｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて末端から３
６アミノ酸残基分のアミノ酸配列を同定した。

【００３４】（２）新規タンパク質をコードするＤＮＡ
配列の解析 以下のＰＣＲではＳｉｇｍａ社製ＡｃｃＴａｑ ＬＡを
用いた。得られたアミノ酸配列の内部に２カ所のプライ
マーを設定し、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を得、これをク
ローニングして両プライマー間の内部の塩基配列情報を
得た。さらにこの塩基配列部分に相当するセンス側（以
下、ｐｒｉｍｅｒ１と称す）、アンチセンス側（以下、
ｐｒｉｍｅｒ２と称す）のプライマーを設計した。

【００３５】また、ストレプトコッカス ディスガラク
ティアエ(Streptococcus dysgalactiae)のゲノムＤＮＡ
をＳａｕ３ＡＩで部分消化し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ
サイトへｌｉｇａｔｉｏｎした。これをテンプレート
し、ｐｒｉｍｅｒ１、ｐｒｉｍｅｒ２とｐＵＣ１８上の
マルチクローニングサイトの両外側に設定されたプライ
マー（以下それぞれ，ｐｒｉｍｅｒ３、ｐｒｉｍｅｒ４
と称す）を使ってｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ３、ｐ
ｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ４、ｐｒｉｍｅｒ２とｐｒ
ｉｍｅｒ３、ｐｒｉｍｅｒ２とｐｒｉｍｅｒ４の４通り
の組み合わせでＰＣＲを行った。得られた断片につい
て、一部はクローニング後、残りの部分はｐｒｉｍｅｒ
１とｐｒｉｍｅｒ２を用いた直接シーケンシングによっ
て塩基配列情報を得た。

【００３６】最終的な配列を確認するために、得られた
塩基配列情報を元にして配列の両末端部分に近い部位に
プライマーを設定し、それらを用いてＰＣＲで増幅し
た。得られた断片について、シーケンス用試薬としてＡ
ＢＩのＢｉｇＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、解析シス
テムとしてＡＢＩの３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌ
ｙｚｅｒを使用し、直接シーケンシングによって配列を
同定した。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、Ｃ群溶血性連鎖球菌であ
るストレプトコッカス ディスガラクティアエ(Strepto
coccus dysgalactiae)由来のスーパー抗原性を有する新
規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、ある
いは該タンパク質の精製法を提供することができる。製
造された新規タンパク質は、該タンパク質のかかわる疾
病のメカニズム研究、該タンパク質を用いる疾病の診断
および診断キット、該タンパク質のかかわる疾病の治
療、治療法の開発ならびに治療薬の開発に役立てること
ができる。

【００３８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. <120> Novel protein and its DNA <130> 36C01700-A <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 639 <212> DNA <213> Streptococcus dysgalactiae <400> 1 gatgctgtgt tggttaatag cgaattaaaa aatatctata tgaaagatgt aattaataaa 60 accaatatga agataacaaa gaaaattggc acccagctaa tatttaatac gaatgaaaaa 120 actagagtct gggatgatga taattataat aaagttatat ctagcaatgt ttctccagcg 180 caagaaagac gttttaagga agaagaagaa gttgatattt atgctctaat aaaatcctac 240 agtgtgatat gtaaggaaca atataattat gttgatggag gtttgataaa aacaagtgac 300 agagaaaaac ttgattcaac aatatatatg aatatttttg gggaacagat accgctaaaa 360 gagcaatcaa aatataaaat cacatttcag aataagtttg taacttttca agaaattgat 420 gttagactta ggaaaagttt gatgagcgat aatagaataa agttatatga acataactca 480 atttgtaaaa aagggtattg gggaattcat tacaaagata atacaacaaa gtttaccgat 540 ttattcaccc atcctaacta tacagataac gaaacaattg atatgagtaa agttagtcac 600 tttgatgttt acttaaacga agaattttct aaaaattaa 639 <210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Streptococcus dysgalactiae <400> 2 Asp Ala Val Leu Val Asn Ser Glu Leu Lys Asn Ile Tyr Met Lys Asp 1 5 10 15 Val Ile Asn Lys Thr Asn Met Lys Ile Thr Lys Lys Ile Gly Thr Gln 20 25 30 Leu Ile Phe Asn Thr Asn Glu Lys Thr Arg Val Trp Asp Asp Asp Asn 35 40 45 Tyr Asn Lys Val Ile Ser Ser Asn Val Ser Pro Ala Gln Glu Arg Arg 50 55 60 Phe Lys Glu Glu Glu Glu Val Asp Ile Tyr Ala Leu Ile Lys Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Val Ile Cys Lys Glu Gln Tyr Asn Tyr Val Asp Gly Gly Leu Ile 85 90 95 Lys Thr Ser Asp Arg Glu Lys Leu Asp Ser Thr Ile Tyr Met Asn Ile 100 105 110 Phe Gly Glu Gln Ile Pro Leu Lys Glu Gln Ser Lys Tyr Lys Ile Thr 115 120 125 Phe Gln Asn Lys Phe Val Thr Phe Gln Glu Ile Asp Val Arg Leu Arg 130 135 140 Lys Ser Leu Met Ser Asp Asn Arg Ile Lys Leu Tyr Glu His Asn Ser 145 150 155 160 Ile Cys Lys Lys Gly Tyr Trp Gly Ile His Tyr Lys Asp Asn Thr Thr 165 170 175 Lys Phe Thr Asp Leu Phe Thr His Pro Asn Tyr Thr Asp Asn Glu Thr 180 185 190 Ile Asp Met Ser Lys Val Ser His Phe Asp Val Tyr Leu Asn Glu Glu 195 200 205 Phe Ser Lys Asn 210 <210> 3 <211> 78 <212> DNA <213> Streptococcus dysgalactiae <400> 3 atgaaaaaaa ataccttggc tttgctattc cttgtgtgtg tatcgcttac cctatgcact 60 actgagagtg tcttttca 78 <210> 4 <211> 26 <212> PRT <213> Streptococcus dysgalactiae <400> 4 Met Lys Lys Asn Thr Leu Ala Leu Leu Phe Leu Val Cys Val Ser Leu 1 5 10 15 Thr Leu Cys Thr Thr Glu Ser Val Phe Ser 20 25

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示
す。

【図２】本発明の新規タンパク質の塩基配列およびアミ
ノ酸配列を示す。

【図３】ＳＤＭ刺激に対する各Ｖβ領域の増幅度を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 柴山 尚子 滋賀県大津市園山１丁目１番１号 東レ株 式会社滋賀事業場内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 CA03 CA07 CA20 DA05 FA18 GA11 4B064 AG01 CA02 CA19 CC01 CC24 CE04 CE06 CE07 CE09 CE10 CE11 DA01 DA15 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA11 DA86 EA20 EA52 FA74 GA22 GA23 GA24

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配
   列と同じ、または実質的に同一のアミノ酸配列を含むこ
   とを特徴とするタンパク質。
2. 【請求項２】配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配
   列と同じ、または実質的に同一のアミノ酸配列を含むこ
   とを特徴とするタンパク質の塩。
3. 【請求項３】形質転換した微生物またはストレプトコッ
   カス ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalact
   iae)を培養することにより請求項１記載のタンパク質を
   生成し、これを採取することを特徴とする新規タンパク
   質の製造法。
4. 【請求項４】形質転換した微生物またはストレプトコッ
   カス ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalact
   iae)を培養することにより請求項２記載のタンパク質の
   塩を生成し、これを採取することを特徴とする新規タン
   パク質の塩の製造法。
5. 【請求項５】請求項１に記載のタンパク質をコードする
   ことを特徴とするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
6. 【請求項６】配列表の配列番号１で表される塩基配列か
   らなることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配
   列と同じ、もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む
   ことを特徴とするシグナルペプチド。
8. 【請求項８】配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配
   列と同じ、もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む
   ことを特徴とするシグナルペプチドの塩。
9. 【請求項９】形質転換した微生物あるいはストレプトコ
   ッカス ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgala
   ctiae)を培養することにより請求項７に記載のシグナル
   ペプチドを生成し、これを採取することを特徴とする新
   規シグナルペプチドの製造法。
10. 【請求項１０】形質転換した微生物あるいはストレプト
    コッカス ディスガラクティアエ(Strepotcoccus dysga
    lactiae)を培養することにより請求項８に記載のシグナ
    ルペプチドの塩を生成し、これを採取することを特徴と
    する新規なシグナルペプチドの塩の製造法。
11. 【請求項１１】請求項７に記載シグナルのペプチドをコ
    ードすることを特徴とするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
12. 【請求項１２】配列表の配列番号３で表される塩基配列
    からなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
13. 【請求項１３】配列表の配列番号２で表されるアミノ酸
    配列と同じ、または実質的に同一のアミノ酸配列を含む
    ことを特徴とするタンパク質のＮ末端に、請求項７に記
    載のシグナルペプチドが結合していることを特徴とする
    タンパク質。
14. 【請求項１４】配列表の配列番号２で表されるアミノ酸
    配列と同じ、または実質的に同一のアミノ酸配列を含む
    ことを特徴とするタンパク質のＮ末端に、請求項７に記
    載のシグナルペプチドが結合していることを特徴とする
    タンパク質の塩。
15. 【請求項１５】形質転換した微生物あるいはストレプト
    コッカス ディスガラクティアエ(Streptococcus dysga
    lactiae)を培養することにより請求項１３に記載のタン
    パク質を生成し、これを採取することを特徴とする新規
    なタンパク質の製造法。
16. 【請求項１６】形質転換した微生物あるいはストレプト
    コッカス ディスガラクティアエ(Streptococcus dysga
    lactiae)を培養することにより請求項１４に記載のタン
    パク質の塩を生成し、これを採取することを特徴とする
    新規なタンパク質の塩の製造法。
17. 【請求項１７】請求項１３に記載のタンパク質をコード
    することを特徴とするＤＮＡを含有するＤＮＡ。