JP2003180367A - 高等植物における伸展活性化カルシウム透過チャンネルのＡｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子および当該遺伝子を用いたトランスジェニック植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高等植物において重力屈性に関連する遺伝子
および当該遺伝子を用いたトランスジェニック植物を提
供する。 【解決手段】 酵母のｍｉｄ１変異株の致死性を機能的
に相補しうる遺伝子として、高等植物のシロイヌナズナ
から伸展活性化カルシウム透過チャンネルをコードする
遺伝子を同定した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高等植物における
重力屈性に関連する遺伝子および当該遺伝子を用いたト
ランスジェニック植物に関する。詳細には、高等植物の
伸展活性化カルシウム透過チャンネルをコードするＡｔ
ＭＩＤ１Ｂ遺伝子、前記遺伝子によりコードされ、且つ
伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネルの機能を有するタンパ
ク質に関する。本発明はまた、前記遺伝子の発現が変更
されたトランスジェニック植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物の根は重力の方向に伸長し、茎は重
力に逆らって成長するが、この当たり前の生命現象は植
物の重力屈性として知られ、まず最初に植物が重力を感
知するということから開始されると考えられている。植
物の重力屈性は長く研究の対象となっており、また、宇
宙ステーションが現実のものとなった今日その研究はあ
らためて注目を集めている。しかし、植物が如何にして
重力を感知するか、その植物における重力センサーおよ
び重力屈性の分子レベルの機構は生化学的、分子生物学
的には全く知られていない。

【０００３】植物のみならず全ての細胞において、重力
センサーは重力という機械的刺激を受容し、そのシグナ
ルを細胞内に伝達しうる機械受容チャンネル分子、例え
ば伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネル等であろうと予測さ
れていたが、細菌などの原核生物ではいくつかの分子が
同定されているものの、真核生物では配列相同性のある
分子は全く知られていなかった。近年、酵母の突然変異
株を用いた分子生物学的・電気生理学的解析により真核
生物として初めて機械受容チャンネル遺伝子ＭＩＤ１が
同定され、この遺伝子が伸展活性化カルシウム透過チャ
ンネルであることが報告された（Iida H., et al., Mo
l. Cell. Biol. 14 (1994), pp.8259-8271; Kanzaki M.
et al., Science 285 (1999), pp. 882-886）。しか
し、この分子はそれ自体が直接重力を関知するわけでは
なく、重力等の機械的刺激により生じる細胞や組織の荷
重が細胞に対して作用し、この伸展活性化Ｃａ²⁺透過チ
ャンネルが活性化されると予測されており、生体に対す
る重力作用の多くはこのような形で細胞に作用すると考
えられた。その意味で機械受容チャンネルは、実質的に
細胞の重力センサーの有力な候補である。

【０００４】一方、種々の動物や植物において、その全
ゲノム構造を解析するゲノムプロジェクトが進行し、高
等植物においては、単子葉類では例えばイネなど、そし
て双子葉類では例えばシロイヌナズナについてゲノムの
解析が急速に進行している。特にシロイヌナズナではゲ
ノム構造の解析は既に完了しているが、これらの遺伝子
データバンクをサーチしても、酵母にて見出されたＭＩ
Ｄ１と配列相同性がある遺伝子は、シロイヌナズナのゲ
ノムを含む高等植物からは見出されなかった。

【０００５】しかしながら、高等植物における重力屈性
の機構を解明することは、風雨などに対して耐性を有
し、また倒れたとしても立て直すことが可能な農作物、
特に穀物を作製しうるために、基礎科学の分野のみなら
ず、農業においても非常に重要である。このため、高等
植物において重力センサーに関連する、伸展活性化Ｃａ
²⁺透過チャンネルなどの機械受容チャンネルの遺伝子の
取得が求められている。

【０００６】

【本発明が解決すべき課題】従って、本発明の課題は、
高等植物において重力屈性に関連する遺伝子および当該
遺伝子を用いたトランスジェニック植物を提供すること
である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究した結果、酵母のｍｉｄ１変異株
の致死性を機能的に相補しうる遺伝子として、高等植物
のシロイヌナズナから、伸展活性化カルシウム透過チャ
ンネルをコードする遺伝子（ＡｔＭＩＤ１Ａ）を同定し
た。次いで、ＡｔＭＩＤ１Ａ遺伝子とアミノ酸配列上７
３％同一（８３％類似）の遺伝子としてＡｔＭＩＤ１Ｂ
を同定した。

【０００８】従って、本発明は、高等植物における伸展
活性化カルシウム透過チャンネルの遺伝子および当該遺
伝子を用いたトランスジェニック植物に関する。詳細に
は、シロイヌナズナ由来のＡｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子および
当該遺伝子によりコードされる伸展活性化カルシウム透
過チャンネルの機能を有するタンパク質に関する。

【０００９】本発明の遺伝子ＡｔＭＩＤ１Ｂは、高等植
物のシロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーから酵母ｍ
ｉｄ１変異株の致死性を機能的に相補しうるＡｔＭＩＤ
１Ａの相同遺伝子として特定された、４１６アミノ酸を
コードする全長１,２５１bpからなる新規遺伝子であ
る。本発明のＡｔＭＩＤ１Ｂは、酵母ＭＩＤ１変異株の
致死性を機能的に相補しうること、さらに実際に酵母に
おいて発現させた結果から、酵母の伸展活性化カルシウ
ム透過チャンネルをコードする遺伝子ＭＩＤ１と同じ機
能を有する、即ちシロイヌナズナ由来の伸展活性化カル
シウム透過チャンネルをコードする遺伝子であることが
示されているＡｔＭＩＤ１Ａと機能的に同一と考えられ
る。

【００１０】本発明の遺伝子ＡｔＭＩＤ１Ｂのクローニ
ングについて、酵母で同定された伸展活性化カルシウム
透過チャンネルをコードする遺伝子ＭＩＤ１と配列相同
性を有する遺伝子は遺伝子データベース上では見出され
なかったため、先ず、高等植物のｃＤＮＡから伸展活性
化カルシウム透過チャンネルをコードする遺伝子を直接
クローニングし、得られた遺伝子の相同遺伝子として本
発明の遺伝子ＡｔＭＩＤ１Ｂを取得した。なお、材料の
高等植物としては、栽培が容易で世代交代も早く、且つ
ゲノム構造の解析が進行しているシロイヌナズナを用い
た。

【００１１】本発明の遺伝子ＡＴＭＩＤ１Ｂのクローニ
ングには、理化学研究所筑波研究所植物分子生物学教室
にて作製されたシロイヌナズナ改変ラムダｇｔ１１ｃＤ
ＮＡライブラリーを用いた。本発明の遺伝子は、前記ラ
イブラリーをスクリーニングして、ＡｔＭＩＤ１Ａ遺伝
子と塩基配列上相同性のあるｃＤＮＡとして単離し、そ
の塩基配列およびコードされるアミノ酸配列を決定し
た。

【００１２】従って、１つの態様において本発明は、伸
展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネルの機能を有し、且つ下記
のアミノ酸配列： （ａ）SEQ ID NO: 2 に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）(ａ)に示されるアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子に関す
る。

【００１３】本発明の別の態様において、本発明の伸展
活性化カルシウム透過チャンネルをコードする遺伝子
は、次の塩基配列： （ａ）SEQ ID NO: 1 に示される塩基配列、（ｂ）(ａ)
に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズする塩基配列、または（ｃ）上記(ａ)もしく
は(ｂ)の塩基配列と相補的な塩基配列からなる。

【００１４】本発明はまた、センスまたはアンチセンス
の向きにて作動的なプロモーター配列に連結された本発
明の遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクタ
ーに関する。本発明の遺伝子の高レベル発現および／ま
たは部位もしくは時期特異的な発現を所望する場合に
は、当該ＤＮＡをセンスの向きにてプロモーターに連結
する。一方、伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネルの発現を
阻害（例えば部位または時期特異的な阻害）を所望する
場合には、アンチセンスの向きにてプロモーターに連結
する。

【００１５】また、本発明の遺伝子の発現を阻害するた
めに、ＲＮＡｉ（RNA interference）を利用することが
できる。この方法では、標的ＲＮＡ（本発明においては
ＡｔＭＩＤ１ＡのｍＲＮＡ）のセンスおよびアンチセン
スＲＮＡを、連結した１つの分子として植物細胞内で発
現させる。発現したそのＲＮＡ分子は分子内水素結合に
より二本鎖ＲＮＡ分子を形成するが、本来のｍＲＮＡと
も二本鎖ＲＮＡを形成する。このような二本鎖ＲＮＡ分
子は細胞内ＲＮＡ分解機構により分解されるため、結果
的に標的ＲＮＡが分解される（Chuang C. F. and Meyer
owitz E. M., Proc. Natl Acad. Sci USA 97: pp. 4985
-4990, 2000）。

【００１６】本発明の遺伝子の発現を阻害するために、
リボザイムもまた用いることができる。所望の標的ＲＮ
Ａを特異的に切断し、標的ＲＮＡを機能的に不活性化す
るリボザイムを設計することが可能である。また、アン
チセンスＲＮＡ中にリボザイム配列を包含させることも
効果的であり、そのような標的ＲＮＡ特異的リボザイム
の設計と使用は、例えばHaseloff et al., Nature 334,
pp.585-591 (1988)に記載されている。また、本発明の
遺伝子の発現を阻害するために、Ｔ−ＤＮＡ挿入法（Fe
ldmann, K. A. Plant J. 1: pp.71-82, 1991）および
エチルメタンスルホン酸などによる突然変異誘発法を用
いることができる。

【００１７】本発明の遺伝子をコードするＤＮＡを発現
させるためのプロモーター／エンハンサー配列は、植物
細胞において本発明の遺伝子を発現しうる任意のもの、
例えばアグロバクテリウムまたはリゾビウムのような植
物細胞内で発現する遺伝子を含む、植物、植物ウイル
ス、細菌由来のプロモーターを用いることができる。そ
のようなプロモーターの例には、Agrobacterium tumefa
ciensのＴ−ＤＮＡ由来のプロモーター、Ｓｍａｓプロ
モーター、桂皮アルコールデヒドロゲナーゼプロモー
タ、Ｎｏｓプロモーター、リブロース二リン酸カルボキ
シラーゼオキシゲナーゼ（Rubisco）プロモーター、Ｇ
ＲＰ１−８プロモーター、カリフラワー・モザイク・ウ
イルス（CaMV）からの３５Ｓプロモーター、植物由来の
アクチンやヒストン等のプロモーター／エンハンサーお
よび公知である種々の植物遺伝子からのその他の転写開
始領域が包含される。また、ＡｔＭＩＤ１Ａ遺伝子のプ
ロモーター配列も用いることができる。

【００１８】また、本発明の遺伝子を効率よく発現させ
るために、遺伝子のコード領域のポリヌクレオチドコー
ディング領域の３′末端にポリ(Ａ)⁺配列を包含させる
のが好ましい。ポリ(Ａ)⁺配列は、種々の植物遺伝子ま
たはＴ−ＤＮＡ由来のものを用いることができるが、こ
れらに限定されるものではない。また、所望の遺伝子を
高レベルにて発現させるのに有用な他の配列、例えば特
定の遺伝子のイントロン配列、５′不翻訳領域の配列な
どを本願発明の組換え発現ベクターに包含させることが
できる。

【００１９】本発明の組換え発現ベクターは、選択マー
カー遺伝子として種々の抗生物質耐性遺伝子や他のマー
カー遺伝子をコードする配列を包含させるのが好まし
い。マーカー遺伝子の例には、抗スペクチノマイシン遺
伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ストレプトマイ
シンホスホトランスフェラーゼ（SPT）遺伝子）、カナ
マイシンまたはジェネティシン耐性のネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼ（NPTII）遺伝子、ハイグロマイ
シン耐性のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ
（HPT）遺伝子、アセト乳酸合成酵素（ALS）を阻害する
除草剤に対する耐性遺伝子、グルタミン合成酵素を阻害
する除草剤に対する耐性遺伝子（例えばbar 遺伝子）、
β−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等
が包含される。

【００２０】また、高等植物の遺伝子発現に有用な代表
的なベクターは当該技術分野においてよく知られてお
り、 Rogers et al., Methods Enzymol., 153, pp.253-
277 (1987)に記載されるAgrobacterium tumefaciensの
Ｔｉプラスミド由来のベクターなどのベクターＤＮＡの
一部を植物細胞に導入した際に宿主植物のゲノムに組込
みうるベクター、例えばＴｉプラスミド由来のｐＫＹＬ
Ｘ６、ｐＫＹＬＸ７、ｐＢＩ１０１、ｐＢＨ２１１３、
ｐＢＩ１２１（Clontech Laboratories, Inc., Palo Al
to, CA）およびこれらから誘導し得る組換えプラスミド
が含まれる。

【００２１】本発明の組換え発現ベクターは、外来性遺
伝子を植物細胞に導入するための公知の方法、例えばパ
ーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）法、リン酸カルシウム法、
ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、
リポフェクション法およびアグロバクテリウム法などの
微生物媒介トランスフェクション法を用いて所望の植物
細胞に導入することができる。植物細胞においては、パ
ーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）法およびアグロバクテリウ
ム法が好ましく、アグロバクテリウム法が特に好ましい
（Bechtold N. & Pelletier G., Methods Mol. Biol. 8
2, pp.259-266, 1998）。

【００２２】故に、本発明は、前記遺伝子または組換え
発現ベクターを用いて作成され、且つその発現が変更さ
れたトランスジェニック植物に関する。本発明によれ
ば、例えば重力に影響を受けないまたは風雨等に対して
耐性を有するトランスジェニック植物が提供される。伸
展活性化カルシウム透過チャンネルは重力、接触、浸透
圧、風圧などを感知するセンサーとしての役割を果たし
ており、その機能は植物の生長に大きく影響する。この
ため、本発明は前記遺伝子を植物体全体、または局所的
および／または時期特異的に発現させることからなる、
トランスジェニック植物における重力屈性を制御する方
法。別の態様において、本発明は、前述の伸展活性化カ
ルシウム透過チャンネルの遺伝子に対するアンチセンス
ＲＮＡ、ＲＮＡｉおよび／またはリボザイムを植物体全
体または局所的に発現させること、並びにＴ−ＤＮＡの
挿入または突然変異誘発剤を使用することにより、内在
性の当該遺伝子の発現を阻害することからなる、トラン
スジェニック植物における重力屈性を制御する方法に関
する。植物体全体、または局所的および／または時期特
異的な発現は、その発現に用いるプロモーター・エンハ
ンサーを適宜選択することにより達成することができ
る。

【００２３】また、本発明のこの態様において、植物に
導入された伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネルをコードす
る遺伝子は宿主の植物細胞のゲノムに組み込まれ、後の
世代まで安定的に保持される。故に、本発明は、上記ト
ランスジェニック植物細胞から再生される植物体、その
部分並びにその繁殖体（例えば種子や無性生殖体）およ
び子孫を包含する。

【００２４】なお、本明細書にて使用する用語「植物」
は、植物全体、植物器官（例えば葉、幹、根など）、種
子および植物細胞およびその子孫を包含する。また、
「植物細胞」は種子懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カ
ルス組織、葉および根由来の細胞、並びに配偶体（胚、
花粉）およびその前駆体細胞が包含される。本発明の方
法で使用され得る植物は、一般に形質転換技術に従う高
度な植物と同じように広く、単子葉および双子葉植物の
両方を含む。

【００２５】本発明はまた、本発明の遺伝子によりコー
ドされ、伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネルの機能を有す
るタンパク質に関する。当該タンパク質、その断片また
はアミノ酸配列の情報から得られるペプチドを抗原とし
て用いて、伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネルを特異的に
認識しうる抗体の作製に用いることができる。故に、あ
る態様において、本発明は伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャン
ネルを特異的に認識しうる抗体、例えばポリクローナル
抗体またはモノクローナル抗体に関する。前記抗原とし
て、抽出した天然のタンパク質、組換えタンパク質、こ
れらのタンパク質の部分的分解物、または本発明のタン
パク質のアミノ酸配列に基づく合成ペプチドを用いるこ
とができる。合成ペプチドは、例えばSEQ ID NO: 2に示
されるアミノ酸配列から選択される少なくとも５個の連
続したアミノ酸配列、好ましくは１０〜１５アミノ酸残
基からなるポリペプチドである。本発明の抗体は、常法
（例えば、Harlow, E. & Lane,D, in Antibodies-Labor
atory Manual Cold SpringHarbor Laboratory Press.,
pp53-138 (1988年)）に従って作製することができる。

【００２６】本発明にかかる抗体は、ＡｔＭＩＤ１Ｂ遺
伝子によりコードされる伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネ
ルのタンパク質の検出に用いることができるが、これら
と配列相同性がある他の伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネ
ルの検出および検索にも使用することができる。従っ
て、本発明はまた、前記抗体を用いる伸展活性化Ｃａ²⁺
透過チャンネルの検出および／または検索方法に関し、
前記方法によって同定される新規な伸展活性化Ｃａ²⁺透
過チャンネルもまた本発明に包含される。本発明の検出
および／または検索法によれば、他の高等植物における
伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネルを容易に同定すること
が可能である。

【００２７】本発明はまた、SEQ ID NO: 1に示される塩
基配列およびその相補的配列において、少なくとも１０
個の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに関
する。オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくはアミノ
酸５個の長さに対応する１４個であるのが好ましく、ア
ミノ酸７個に対応する２０個以上であるのがさらに好ま
しい。そのようなプライマーにはその５′末端に適する
制限酵素部位を包含させることができる。オリゴヌクレ
オチドプライマーは、本発明の伸展活性化Ｃａ ²⁺透過チ
ャンネルをコードするＤＮＡおよびＲＮＡの検出に用い
るとができ、その手法としては公知の遺伝子検出法を用
いることができるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
法が特に好ましい。

【００２８】また、これらのプライマーを用いて、他の
高等植物由来のＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ）から、新規な伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネル
をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。
その手段としては、公知の適する方法を用いることがで
きるが、ＰＣＲ法が好ましい。

【００２９】伸展活性化カルシウム透過チャンネルは高
等植物においてその生育に必須であるため、これをコー
ドする遺伝子は全ての高等植物（即ち、単子葉類、双子
葉類）に存在し、その塩基配列や当該遺伝子によりコー
ドされるアミノ酸配列は全体的にまたは部分的に保存さ
れていると考えられる。このため、本発明の遺伝子およ
び／またはその配列情報に基づいて、他の植物から伸展
活性化カルシウム透過チャンネルおよび／またはこれを
コードする遺伝子は、例えば上述の方法を用いて容易に
取得することができる。

【００３０】

【実施例】［実施例１］ ＡｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子のスク
リーニング ＡｔＭＩＤ１Ａ遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして用い
て、シロイヌナズナ由来のｃＤＮＡライブラリー（シロ
イヌナズナ改変ラムダｇｔ１１ライブラリー）をコロニ
ーハイブリダイゼーション法によりスクリーニングを行
った。ポジティブのファージクローンからファージＤＮ
Ａを精製し、制限酵素（Ｂａｍ ＨＩ）でｃＤＮＡ部分
を切り出し、pBluescript II SK(-)のＢａｍ ＨＩ部位
に挿入した。ｃＤＮＡを含むプラスミドを配列決定に供
した。

【００３１】［実施例２］ 配列決定およびそのデータ
ベース解析 挿入物の塩基配列をチェインターミネーション法（Shim
adzu DSQ-2000）を用いて決定し、そしてｃＤＮＡにコ
ードされるアミノ酸配列を決定した。その結果、４１６
アミノ酸をコードする全長１,２５１bpからなる新規遺
伝子であることが示された。得られた遺伝子をＡｔＭＩ
Ｄ１Ｂと命名した。ＡｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子の塩基配列を
SEQ ID NO: 1に、この遺伝子がコードするアミノ酸配列
をSEQ IDNO: 2に示す。また、ＡｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子産
物と酵母のＭｉｄ１遺伝子産物についてに疎水性プロッ
トおよび配列相同性について解析したところ、両者の疎
水性プロットのパターンは似ている（図１を参照）が、
アミノ酸配列の比較では、同一のアミノ酸：１０.５
％、類似のアミノ酸２２.０％：総計３２.５％と有意な
相同性は検出されなかった。

【００３２】次いで、ＡｔＭＩＤ１Ｂの塩基配列および
コードされるアミノ酸を相同性等について、遺伝子デー
タベース（National Center for Biotechnology Inform
ationに登録されている全てのデーターベース）を用い
て検索した。解析ソフトはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等を
用いた。SEQ ID NO: 1の塩基配列については、すべての
エントリー遺伝子に対して、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配
列については、エントリーアミノ酸配列およびエントリ
ー遺伝子より翻訳されるアミノ酸配列に対して行った。
特に、シロイヌナズナの全ゲノム構造が既に解析されて
おり、何れの遺伝子に相当するかを検索した。その結
果、SEQ ID NO: 1の塩基配列については、タンパク質を
コードしていると推測されているが機能が全く不明であ
る、シロイヌナズナの第２染色体上の遺伝子Ａｔ２ｇ１
７７８０（GB: ABB80785）であることが示され、同じ染
色体上に相同性のある遺伝子“Ｔ１９Ｋ４.５０（Acces
sionNo. AL022373）”（ＡｔＭＩＤ１Ａ）が見出された
が、それ以外に相同性の高い遺伝子は検出されなかっ
た。SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列についても、前記Ａｔ
２ｇ１７７８０のコード領域のアミノ酸配列（SEQ ID N
O: 4）、Ｔ１９Ｋ４.５０のコード領域を除いて、顕著
な相同性を有する配列は検出されなかった。

【００３３】［実施例２］ トランスジェニック植物 （１）トランスジェニック植物の作製 ｐＦＬ６１−ＡｔＭＩＤ１Ｂプラスミドを制限酵素Ｘｂ
ａＩとＳｍａＩで消化して得られたｃＤＮＡ断片をセン
スの向きで、ＣａＭＶ ３５ＳプロモーターおよびＴｉ
プラスミドのノパリン合成酵素遺伝子のポリアデニル化
シグナルを包含するプラスミドｐＢＨ２１１３（農業生
物資源研究所）のＸｂａＩ／ＳｍａＩ部位に挿入し、Ａ
ｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子高発現用の組換えプラスミドをｐＢ
Ｈ２１１３ＮＢを作製した（図４）。また、ＡｔＭＩＤ
１Ｂ遺伝子のプロモーター領域（転写開始点の上流１.
５kbpの領域）の下流にβ−グルクロニダーゼ遺伝子
（ＧＵＳ）を連結して組換えプラスミドｐＢＩ１０１−
ＡｔＭＩＤ１Ｂｐを作製した（図５）。次いで、Bechto
ld とPelletierの方法（Bechtold N. & Pelletier G.,M
ethods Mol. Biol. 82, pp.259-266, 1998）の方法に従
って、各組換えプラスミドでアグロバクテリウム（Agro
bacterium tumefaciens）を形質転換し、ハイグロマイ
シン耐性により目的のＤＮＡを含む形質転換体を選択し
た。得られた形質転換体をＬＢ培地中にて好気性条件下
にて２８℃で増殖させ、トランスジェニック植物の作製
に供した。

【００３４】シロイヌナズナの種子を５％次亜塩素酸ナ
トリウムで消毒後、Ｇｍ培地＋１０μg／mlハイグロマ
イシン、Ｇｍ培地＋３０μg／mlカナマイシンに播種し
た。播種後、植物を低温処理（４℃、４〜６日）し、グ
ロースチャンバー内（２２℃、明期１６時間−暗期８時
間、相対湿度６０％）に移して６〜７週間生育させた。
その後、シロイヌナズナの株を根ごと取り出した。Bech
told とPelletierの方法に従って、シロイヌナズナ株
を、減圧下（０.１気圧）で２０分間、アグロバクテリ
ウム形質転換体の懸濁液に浸して形質転換を実施し、ハ
イグロマイシン耐性により形質転換体を選別した。次い
で形質転換体を２２℃、明期２４時間、相対湿度６０％
の条件下で生育させて種子を採取した。得られた種子を
播種、生育させてその種子することを繰り返し、トラン
スジェニック植物の第２世代（Ｔ₂植物）および第３世
代（Ｔ₃植物）を取得し、これらを導入遺伝子の発現お
よび表現型の解析に用いた。

【００３５】（２）トランスジェニック遺伝子の発現 ｐＢＩ１０１−ＡｔＭＩＤ１Ｂｐを包含するＴ₂および
Ｔ₃植物から種々の組織（根、茎、葉）を採取し、これ
らをＸ−グルクロニダーゼ緩衝液（２mg／mlＸ−ｇｌｕ
ｃ、０.５mMフェロシアン化カリウム、０.５mMＥＤＴ
Ａ、２０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、５０mMリン酸緩衝液［p
Ｈ７.０］、２％ＤＭＳＯ）中にて３７℃、１２時間Ｇ
ＵＳ反応を行った。各組織ををＦＡＡ固定溶液（１.６m
Mホルムアルデヒド、８.３mM酢酸、３０％エタノール）
で固定し、次いでエタノール中に移してそのまま室温で
一晩おいて植物の脱色させた。その後、透明化液（８０
％抱水クロラール、１０％グリセロ―ル）にて１２時間
透明化処理して、得られた植物組織からプレパラートを
作製した。これらを微分干渉顕微鏡（カールツァイス株
式会社、東京）で観察した。その結果、ＡｔＭＩＤ１Ｂ
遺伝子は、発芽後１週間目で重力を感知すると考えられ
ている子葉および胚軸多く発現し、また発現レベルは低
いものの根において発現することが示された。また、Ａ
ｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子は気孔を構成する孔辺細胞において
発現することが明らかとなった。これらの結果を下記の
表１に示す。

【００３６】

【表１】

【００３７】

【発明の効果】本発明によれば、高等植物の伸展活性化
Ｃａ²⁺透過チャンネルをコードする遺伝子が提供され
る。そのような遺伝子は、シロイヌナズナの全ゲノム構
造の解析が完了しているにもかかわらず、現在まで全く
知られていなかった。また、ゲノム解析の情報では、こ
れまで公知の遺伝子と機能的なホモロジーが何ら見出さ
れない、機能が全く不明な遺伝子としてその配列のみが
登録されていた。本発明の高等植物の伸展活性化Ｃａ²⁺
透過チャンネルをコードする遺伝子は、植物における重
力センサーとして機能していると考えられ、当該遺伝子
を用いれば風雨などに対して耐性を有し、また倒れたと
しても立て直すことが可能な農作物、特に穀物または花
などの観賞用植物を作製しうるために、基礎科学の分野
のみならず、農業においても非常に重要である。さら
に、当該遺伝子は植物の光合成能と密接に関連する気孔
において選択的に発現しているため、光合成能が改善さ
れたトランスジェニック植物を作製することができる。

【００３８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <110> Institute of Physical and Chemical Research <120> AtMID1B gene relating to gravitropism of the plant and a transgenic plant <130> NP-1092 <141> <160> 3 <210> 1 <211> 1251 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)(1251) <400> 1 atggctaatt catgggatca gttaggagaa attgcgtcag tggctcagct tacaggcata 60 gacgctctga aactgattgg aatgatagta aacgctgcga atacagctcg aatgcacaag 120 aagaattgtc gtcaattcgc tcaccatctt aagctcatcc gtaatttgct agagcagatt 180 aaaaactctg agatgaatca acgttcagag attcttgagc cgcttcaagg acttgatgat 240 gctcttagaa gatcttacat tttagtcaaa agttgtcaag aaaaaagtta tctttacttg 300 ttggctatgg gctggaacat tgttaaccag tttgaaaaag ctcagaatga gattgatctg 360 tttctcaaga tcgttccact aataaatatg gcggataatg ctcggattcg ggagaggcta 420 gaagctattg aacgtgatca gcgtgagtat actcttgatg aagaggatag aaaggtgcaa 480 gatgttattt tgaaacaaga atctactaga gaagctgcta catcggtttt aaagaagacg 540 ctctctcgtt catacccgaa catggggttc tgcgaagcgc ttaaaaccga ggaggagaaa 600 ctgcaacttg agttgcaacg ttcgcgggcg cggtatgatg ctgatcaatg tgaagttata 660 caacgtttga ttgatgttac acaaactgct gctactgttg aacctaatct tgaaaaggtg 720 ttgactaaga aagaagagct tacctctagc aagaagagag atgatttgta tgacacggat 780 agtagtagta ttcgagcaga ttcaagatca acgtcttatg tttcatccgg acatgaacta 840 ctttcgggaa gatcattgca acaccgtgga aattggcacg ccgacttgct ggattgttgt 900 tcagaacctt gtctttgctt gaagacactc tttttcccct gtggtacatt ggcaaagatt 960 tccactgtgg caactagtag gcaaatctct tcaactgaag tgtgtaagaa cctaatcgtg 1020 tattctttga tactctcatg ctgttgctat acttgctgca taaggaagaa gcttcgaaag 1080 acactgaaca taacgggagg gtgcattgac gactttttgt cacatctaat gtgttgttgt 1140 tgtgcccttg tccaagaact gagagaagtc gagattcatc gagcttctta cggtacagag 1200 aagagtaata aggaaatgag tccaccaaca cctcagttta tggaagaatg a 1251 <210> 2 <211> 416 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> Met Ala Asn Ser Trp Asp Gln Leu Gly Glu Ile Ala Ser Val Ala Gln 1 5 10 15 Leu Thr Gly Ile Asp Ala Leu Lys Leu Ile Gly Met Ile Val Asn Ala 20 25 30 Ala Asn Thr Ala Arg Met His Lys Lys Asn Cys Arg Gln Phe Ala His 35 40 45 His Leu Lys Leu Ile Arg Asn Leu Leu Glu Gln Ile Lys Asn Ser Glu 50 55 60 Met Asn Gln Arg Ser Glu Ile Leu Glu Pro Leu Gln Gly Leu Asp Asp 65 70 75 80 Ala Leu Arg Arg Ser Tyr Ile Leu Val Lys Ser Cys Gln Glu Lys Ser 85 90 95 Tyr Leu Tyr Leu Leu Ala Met Gly Trp Asn Ile Val Asn Gln Phe Glu 100 105 110 Lys Ala Gln Asn Glu Ile Asp Leu Phe Leu Lys Ile Val Pro Leu Ile 115 120 125 Asn Met Ala Asp Asn Ala Arg Ile Arg Glu Arg Leu Glu Ala Ile Glu 130 135 140 Arg Asp Gln Arg Glu Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Asp Arg Lys Val Gln 145 150 155 160 Asp Val Ile Leu Lys Gln Glu Ser Thr Arg Glu Ala Ala Thr Ser Val 165 170 175 Leu Lys Lys Thr Leu Ser Arg Ser Tyr Pro Asn Met Gly Phe Cys Glu 180 185 190 Ala Leu Lys Thr Glu Glu Glu Lys Leu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Ser 195 200 205 Arg Ala Arg Tyr Asp Ala Asp Gln Cys Glu Val Ile Gln Arg Leu Ile 210 215 220 Asp Val Thr Gln Thr Ala Ala Thr Val Glu Pro Asn Leu Glu Lys Val 225 230 235 240 Leu Thr Lys Lys Glu Glu Leu Thr Ser Ser Lys Lys Arg Asp Asp Leu 245 250 255 Tyr Asp Thr Asp Ser Ser Ser Ile Arg Ala Asp Ser Arg Ser Thr Ser 260 265 270 Tyr Val Ser Ser Gly His Glu Leu Leu Ser Gly Arg Ser Leu Gln His 275 280 285 Arg Gly Asn Trp His Ala Asp Leu Leu Asp Cys Cys Ser Glu Pro Cys 290 295 300 Leu Cys Leu Lys Thr Leu Phe Phe Pro Cys Gly Thr Leu Ala Lys Ile 305 310 315 320 Ser Thr Val Ala Thr Ser Arg Gln Ile Ser Ser Thr Glu Val Cys Lys 325 330 335 Asn Leu Ile Val Tyr Ser Leu Ile Leu Ser Cys Cys Cys Tyr Thr Cys 340 345 350 Cys Ile Arg Lys Lys Leu Arg Lys Thr Leu Asn Ile Thr Gly Gly Cys 355 360 365 Ile Asp Asp Phe Leu Ser His Leu Met Cys Cys Cys Cys Ala Leu Val 370 375 380 Gln Glu Leu Arg Glu Val Glu Ile His Arg Ala Ser Tyr Gly Thr Glu 385 390 395 400 Lys Ser Asn Lys Glu Met Ser Pro Pro Thr Pro Gln Phe Met Glu Glu 405 410 415 <210> 3 <211> 1795 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> genome <222> gene=At2g17780/57041...58838 <308> Accession No. AF024504 (GB:AAB80785) <309> 2000-04-05 <400> 3 atggctaatt catgggatca gttaggagaa attgcgtcag tggctcagct tacaggcata 60 gacgctctga aactgattgg aatgatagta aacgctgcga atacagctcg aatgcacaag 120 aagaattgtc gtcaattcgc tcaccatctt aagctcatcc gtaatttgct agagcagatt 180 aaaaactctg agatgaatca acgttcagag attcttgagc cgcttcaagg acttgatgat 240 gctcttagaa gatcttacat tttagtcaaa agttgtcaag aaaaaagtta tctttacttg 300 ttggctatgg gctggaacat tgttaaccag tttgaaaaag ctcagaatga gattgatctg 360 tttctcaaga tcgttccact aataaatatg gcggataatg ctcggattcg ggtaaattcg 420 cttgcattgt ttactggttt cttgttcttt ttgttgttgc catagttata atgatttgtt 480 atgcaggaga ggctagaagc tattgaacgt gatcagcgtg agtatactct tgatgaagag 540 gatagaaagg tgcaagatgt tattttgaaa caagaatcta ctagagaagc tgctacatcg 600 gttttaaaga agacgctctc tcgttcatac ccgaacatgg ggttctgcga agcgcttaaa 660 accgaggagg agaaactgca acttgagttg caacgttcgc gggcgcggta tgatgctgat 720 caatgtgaag ttatacaacg tttgattgat gttacacaaa ctgctgctac tgttgaacct 780 aatcttgaaa aggtgttgac taagaaagaa gagcttacct ctagcaagaa gagagatgat 840 ttgtatgaca cggatagtag tagtattcga gcagattcaa ggttaatccc atttactccg 900 atatagatga aaatattcat atacttaatg tgttctcaca aaacgtgttg ttcacgtttg 960 atcattgaag gctaatgttt gattggtgtc taatggttga atgtagatca acgtcttatg 1020 tttcatccgg acatgaacta ctttcgggaa gatcattgca acaccgtgga aattggcacg 1080 ccgacttgct ggattgttgt tcagaacctt gtctttgtaa gccctctcat tctgttttta 1140 tctaaccaaa caatgttcca cgctttcttt tctcgttaag attgacgagt gacacttcaa 1200 gattcatact tatctacttt tgaatttgta aaataaggct tgaagacact ctttttcccc 1260 tgtggtacat tggcaaagat ttccactgtg gcaactagta ggcaaatctg taagaaatct 1320 tatatgaatg cagactagtt ttttttccat gtatgagcta tcaagaattt gatacaaaat 1380 tttgatttta tggttttaca gcttcaactg aagtgtgtaa gaacctaatc gtgtattctt 1440 tgatactctc atgctgttgc tatacttgct gcataaggaa gaagcttcga aagacactga 1500 acataacggt acatcaatta aacctctact ttcttaaggt cgtgatgcta aggtttttac 1560 ggatgtcttg aatttgcagg gagggtgcat tgacgacttt ttgtcacatc taatgtgttg 1620 ttgttgtgcc cttgtccaag aactgagaga agtcgagatt catcgagctt cttacggtaa 1680 aatatataca tttacagata tattaacata cttctgaatc taattagtat ttaaaggtac 1740 agagaagagt aataaggaaa tgagtccacc aacacctcag tttatggaag aatga 1795

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子産物と酵母のＭＩＤ１遺
伝子産物の疎水性プロットの比較を示している。

【図２】ＡｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子の高発現用の組換えプラ
スミドｐＢＨ２１１３ＮＢの模式図である。

【図３】ＡｔＭＩＤ１Ｂ遺伝子のプロモーター領域の下
流にβ−グルクロニダーゼ遺伝子を連結した組換えプラ
スミドｐＢＩ１０１−ＡｔＭＩＤ１Ｂｐの模式図であ
る。

フロントページの続き (72)発明者 中川 祐子 東京都小金井市貫井北町４−１−１ 東京 学芸大学教育学部内 (72)発明者 篠崎 一雄 茨城県つくば市高野台３−１−１ 理化学 研究所内 (72)発明者 片桐 健 茨城県つくば市高野台３−１−１ 理化学 研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA80 CA01 DA01 EA01 EA04 FA02 GA11 4B065 AA88X AA88Y AB01 BA01 CA53 4H045 AA10 AA30 BA10 CA30 DA00 EA05 FA72 FA74

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 高等植物の伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャン
   ネルをコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャンネルの機能
   を有し、且つ下記のアミノ酸配列： （ａ）SEQ ID NO: 2 に示されるアミノ酸配列、または
   （ｂ）(ａ)に示されるアミノ酸配列において１もしくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１に記
   載の遺伝子。
3. 【請求項３】 下記の塩基配列： （ａ）SEQ ID NO: 1 に示される塩基配列、（ｂ）(ａ)
   に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイ
   ブリダイズする塩基配列、または（ｃ）上記(ａ)もしく
   は(ｂ)の塩基配列と相補的な塩基配列からなることを特
   徴とする請求項１または２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺
   伝子によりコードされ、且つ伸展活性化Ｃａ²⁺透過チャ
   ンネルの機能を有するタンパク質。
5. 【請求項５】 センスまたはアンチセンスの向きでプロ
   モーターに連結された請求項１〜３のいずれか１項に記
   載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の組換え発現ベクターで
   形質転換した宿主細胞。
7. 【請求項７】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺
   伝子または請求項５に記載の組換えベクターを含むトラ
   ンスジェニック植物細胞。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のトランスジェニック植
   物細胞から得られる植物体、その部分並びにその繁殖体
   および子孫。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の植物において、請求項
   １〜３のいずれか１項に記載の遺伝子を植物体全体また
   は局所的に過剰に発現させることからなる、植物におけ
   る重力屈性を制御する方法。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載の植物において、請求
    項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子を植物体全体ま
    たは局所的にアンチセンスＲＮＡを発現させることによ
    り内在性の当該遺伝子の発現を阻害することからなる、
    植物における重力屈性を制御する方法。