JP2003180376A - 新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ

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JP2003180376A
JP2003180376A JP2002185208A JP2002185208A JP2003180376A JP 2003180376 A JP2003180376 A JP 2003180376A JP 2002185208 A JP2002185208 A JP 2002185208A JP 2002185208 A JP2002185208 A JP 2002185208A JP 2003180376 A JP2003180376 A JP 2003180376A
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Masataka Miwa
真敬 三輪
Takashi Ito
隆司 伊藤
Yasushi Shintani
靖 新谷
Nobuyuki Miyajima
伸行 宮嶋
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Takeda Chemical Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニン
グ等に有用な新規タンパク質の提供。 【解決手段】 ヒト由来のタンパク質またはその塩、該
タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質に対する
リガンドの決定方法、リガンドと該タンパク質との結合
性を変化させる化合物のスクリーニング方法／スクリー
ニング用キット、該スクリーニングで得られる化合物ま
たはその塩など。 【効果】 本発明のヒト由来のタンパク質またはそれを
コードするＤＮＡは、（１）本発明のタンパク質に対す
るリガンドの決定、（２）本発明のタンパク質の機能不
全に関連する疾患の予防および／または治療剤、（３）
本発明のタンパク質とリガンドとの結合性を変化させる
化合物等のスクリーニングなどに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト心臓由来の新
規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその
塩およびそれをコードするポリヌクレオチド等に関す
る。さらには、本発明の新規Ｇタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩を用いたスクリーニング方
法、スクリーニング用キット、該スクリーニング方法ま
たはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物お
よびその塩等に関する。
【０００２】
【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質などの生
理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプタータ
ンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらの
レセプタータンパク質のうち多くは共役しているguanin
e nucleotide-binding protein（以下、Ｇタンパク質と
略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナ
ル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通
した構造をもっていることから、Ｇタンパク質共役型レ
セプタータンパク質あるいは７回膜貫通型レセプタータ
ンパク質（７ＴＭＲ）と総称される。Ｇタンパク質共役
型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細
胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分
子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物
質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レ
セプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細
胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制と
いった種々の反応が惹起される。各種生体の細胞や臓器
の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプ
タータンパク質、特にはＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質との関係を明らかにすることは、各種生体の
細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連し
た医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとな
る。
【０００３】例えば、生体の種々の器官では、多くのホ
ルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活
性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわ
れている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に
存在し、それぞれに対応するレセプタータンパク質を通
してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知
のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多
く、それらのレセプタータンパク質の構造に関しても、
これまで報告されていないものが多い。さらに、既知の
レセプタータンパク質においてもサブタイプが存在する
かどうかについても分かっていないものが多い。生体に
おける複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプ
タータンパク質との関係を明らかにすることは、医薬品
開発に非常に重要な手段である。また、レセプタータン
パク質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よく
スクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内
で発現しているレセプタータンパク質の遺伝子の機能を
解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要
であった。近年、生体内で発現している遺伝子を解析す
る手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研
究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃ
ＤＮＡの断片配列がExpressed Sequence Tag（ＥＳＴ）
としてデータベースに登録され、公開されている。しか
し、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推
定することは困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来、Ｇタンパク質共
役型レセプターと生理活性物質（すなわち、リガンド）
との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（す
なわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす
物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストま
たはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品とし
て活用されてきた。従って、このように生体内での生理
発現において重要であるばかりでなく、医薬品開発の標
的ともなりうるＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質を新規に見出し、その遺伝子（例えばｃＤＮＡ）をク
ローニングすることは、新規Ｇタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の特異的リガンドや、アゴニスト、アン
タゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。し
かし、Ｇタンパク質共役型レセプターはその全てが見出
されているわけではなく、現時点でもなお、未知のＧタ
ンパク質共役型レセプター、また対応するリガンドが同
定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数
存在しており、新たなＧタンパク質共役型レセプターの
探索および機能解明が切望されている。Ｇタンパク質共
役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を指標とす
る、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探
索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアン
タゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガン
ドが見出されなくても、該レセプターの不活化実験（ノ
ックアウト動物）から該レセプターの生理作用を解析す
ることにより、該レセプターに対するアゴニストまたは
アンタゴニストを作製することも可能である。これら該
レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストなどは、Ｇタンパク質共役型レセプターの機能
不全に関連する疾患の予防／治療薬や診断薬として活用
することが期待できる。さらにまた、Ｇタンパク質共役
型レセプターの遺伝子変異に基づく、生体での該レセプ
ターの機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因と
なっている場合も多い。この場合には、該レセプターに
対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、
該レセプター遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）
への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス
核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもでき
る。この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の
欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であ
り、該レセプターの遺伝子は、該レセプターの機能不全
に関与する疾患の予防／治療薬や診断薬に応用すること
もできる。本発明は、上記のように有用な新規Ｇタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質を提供するものであ
る。すなわち、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータン
パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、該Ｇタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ
およびそれらの誘導体）を含有するポリヌクレオチド
（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体）、該ポリヌク
レオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクター
を保持する形質転換体、該Ｇタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質またはその塩の製造法、該Ｇタンパク質共
役型レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドま
たはその塩に対する抗体、該Ｇタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の発現量を変化させる化合物、該Ｇタン
パク質共役型レセプターに対するリガンドの決定方法、
リガンドと該Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質
との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴ
ニスト）またはその塩のスクリーニング方法、該スクリ
ーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスク
リーニングキットを用いて得られうるリガンドと該Ｇタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質との結合性を変化
させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはそ
の塩、およびリガンドと該Ｇタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質との結合性を変化させる化合物（アンタゴ
ニスト、アゴニスト）もしくは該Ｇタンパク質共役型レ
セプタータンパク質の発現量を変化させる化合物または
その塩を含有してなる医薬などを提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ヒト脂肪細胞由来の新規なＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡを単
離し、その全塩基配列を解析することに成功した。そし
て、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、第
１〜第７膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、こ
れらのｃＤＮＡにコードされるタンパク質が７回膜貫通
型のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質であるこ
とを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づい
て、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至っ
た。
【０００６】すなわち、本発明は、（１） 配列番号：
５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質またはその塩、（２）
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有する上記
（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
またはその塩、（３） 配列番号：１で表されるアミノ
酸配列を含有する上記（１）記載のＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質またはその塩、（４） 上記
（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
の部分ペプチドまたはその塩、（５） 上記（１）記載
のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードす
るポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（６）ＤＮＡである上記（５）記載のポリヌクレオチ
ド、（７） 配列番号：２または配列番号：６で表され
る塩基配列を含有する上記（６）記載のポリヌクレオチ
ド、（８） 上記（５）記載のポリヌクレオチドを含有
する組換えベクター、（９） 上記（８）記載の組換え
ベクターで形質転換させた形質転換体、（１０）上記
（９）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質を生成せしめる
ことを特徴とする上記（１）記載のＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質またはその塩の製造法、（１１）
上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその
塩に対する抗体、（１２）上記（１）記載のＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質のシグナル伝達を不活性
化する中和抗体である上記（１１）記載の抗体、（１
３）上記（１１）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１４）上記（１１）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１５）上記（１１）記載のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチド
またはその塩を用いることにより得られうる上記（１）
記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または
それらの塩に対するリガンド、（１６）上記（１５）記
載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のリガン
ドを含有してなる医薬、（１７）上記（１）記載のＧタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記
（４）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを
特徴とする上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質それらの塩に対するリガンドの決定方
法、（１８） 上記（１）記載のＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプ
チドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと
上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質またはその塩との結合性を変化させる化合物または
その塩のスクリーニング方法、（１９）上記（１）記載
のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上
記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有するこ
とを特徴とするリガンドと上記（１）記載のＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性
を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キ
ット、（２０）上記（１８）記載のスクリーニング方法
または上記（１９）記載のスクリーニング用キットを用
いて得られうるリガンドと上記（１）記載のＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性
を変化させる化合物またはその塩、（２１） 上記（２
０）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２２）上記（５）記載のポリヌクレオチドとハイスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレ
オチド、（２３） 上記（５）記載のポリヌクレオチド
と相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌク
レオチド、（２４） 上記（５）記載のポリヌクレオチ
ドまたはその一部を用いることを特徴とする上記（１）
記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のｍＲ
ＮＡの定量方法、（２５） 上記（１１）記載の抗体を
用いることを特徴とする上記（１）記載のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質の定量方法、（２６） 上
記（２４）または上記（２５）記載の定量方法を用いる
ことを特徴とする上記（１）記載のＧタンパク質共役型
レセプターの機能が関連する疾患の診断方法、（２７）
上記（２４）記載の定量方法を用いることを特徴とす
る上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスク
リーニング方法、（２８）上記（２５）記載の定量方法
を用いることを特徴とする細胞膜における上記（１）記
載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２
９）上記（２７）記載のスクリーニング方法を用いて得
られうる上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質の発現量を変化させる化合物またはその
塩、（３０） 上記（２８）記載のスクリーニング方法
を用いて得られうる細胞膜における上記（１）記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる
化合物またはその塩、（３１） 上記（２９）記載の化
合物またはその塩を含有してなる医薬、（３２） 上記
（３０）記載の化合物またはその塩を含有してなる医
薬、（３３） 中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、
癌、代謝性疾患、免疫系疾患または消化器系疾患の予防
・治療剤である上記（２１）２１、３１または３２記載
の医薬、（３４） 哺乳動物に対して、上記（１８）記
載のスクリーニング方法または上記（１９）記載のスク
リーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記
（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその
塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、炎症
性疾患、循環器疾患、癌、代謝性疾患、免疫系疾患また
は消化器系疾患の予防・治療方法、（３５） 哺乳動物
に対して、上記（２７）記載のスクリーニング方法を用
いて得られうる上記（１）記載のＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質の発現量を変化させる化合物または
その塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、
炎症性疾患、循環器疾患、癌、代謝性疾患、免疫系疾患
または消化器系疾患の予防・治療方法、（３６） 哺乳
動物に対して、上記（２８）記載のスクリーニング方法
を用いて得られうる細胞膜における上記（１）記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる
化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とす
る中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、代謝性疾
患、免疫系疾患または消化器系疾患の予防・治療方法、
（３７） 中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾、癌、代謝
性疾患、免疫系疾患または消化器系疾患の予防・治療剤
を製造するための上記（１８）記載のスクリーニング方
法または上記（１９）記載のスクリーニング用キットを
用いて得られうるリガンドと上記（１）記載のＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合
性を変化させる化合物またはその塩の使用、（３８）
中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、代謝性疾患、
免疫系疾患または消化器系疾患の予防・治療剤を製造す
るための上記（２７）記載のスクリーニング方法を用い
て得られうる上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質の発現量を変化させる化合物またはそ
の塩の使用、（３９） 中枢疾患、炎症性疾患、循環器
疾患、癌、代謝性疾患、免疫系疾患または消化器系疾患
の予防・治療剤を製造するための上記（２８）記載のス
クリーニング方法を用いて得られうる細胞膜における上
記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質量を変化させる化合物またはその塩の使用、
【０００７】さらには、（４０）タンパク質が、配列
番号：５で表されるアミノ酸配列、配列番号：１で表さ
れるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、
１〜３０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらに
好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したア
ミノ酸配列、配列番号：５で表されるアミノ酸配列に
１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より
好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１
〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列
番号：５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上
（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１
０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミ
ノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または
それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質である上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩、（４１）上記（１）記載
のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはそ
の塩または上記（４）記載の部分ペプチドもしくはその
塩と、試験化合物とを接触させることを特徴とする上記
（１８）記載のリガンドの決定方法、（４２）リガンド
が、例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノ
イド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メ
ラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、
バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡ
ＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴ
ン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチ
ン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、Ｖ
ＩＰ（バソアクティブ インテスティナル ポリペプチ
ド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリ
ン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレ
ーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアス
タチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノ
シン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー
（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡ
Ｐ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１
０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカ
インサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−
２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮ
ＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，Ｍ
ＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３
０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔ
ａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬ
ＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏ
ｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒ
ａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファ
ミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒス
タミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティッ
クポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸
（ＬＰＡ）またはスフィンゴシン１−リン酸である上記
（４０）記載のリガンドの決定方法、
【０００８】（４３）（i）上記（１）記載のＧタンパ
ク質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩または
上記（４）記載の部分ペプチドもしくはその塩と、リガ
ンドとを接触させた場合と、（ii）上記（１）記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩
または上記（４）記載の部分ペプチドもしくはその塩
と、リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との
比較を行うことを特徴とする上記（１８）記載のスクリ
ーニング方法、（４４）（i）標識したリガンドを上記
（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
もしくはその塩または上記（４）記載の部分ペプチドも
しくはその塩に接触させた場合と、（ii）標識したリガ
ンドおよび試験化合物を上記（１）記載のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質もしくはその塩または上記
（４）記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた
場合における、標識したリガンドの上記（１）記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその塩
または上記（４）記載の部分ペプチドもしくはその塩に
対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガ
ンドと上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング方法、（４５）（i）標
識したリガンドを上記（１）記載のＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた場合
と、（ii）標識したリガンドおよび試験化合物を上記
（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
を含有する細胞に接触させた場合における、標識したリ
ガンドの該細胞に対する結合量を測定し、比較すること
を特徴とするリガンドと上記（１）記載のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を
変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（４６）（i）標識したリガンドを上記（１）記載のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質を含有する細胞
の膜画分に接触させた場合と、（ii）標識したリガンド
および試験化合物を上記（１）記載のＧタンパク質共役
型レセプタータンパク質を含有する細胞の膜画分に接触
させた場合における、標識したリガンドの該細胞の膜画
分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする
リガンドと上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化
合物またはその塩のスクリーニング方法、
【０００９】（４７）（i）標識したリガンドを上記
（９）記載の形質転換体を培養することによって該形質
転換体の細胞膜に発現したＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質に接触させた場合と、（ii）標識したリガ
ンドおよび試験化合物を上記（９）記載の形質転換体を
培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質に接触させた
場合における、標識したリガンドの該Ｇタンパク質共役
型レセプタータンパク質に対する結合量を測定し、比較
することを特徴とするリガンドと上記（１）記載のＧタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との
結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニン
グ方法、（４８）（i）上記（１）記載のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質またはその塩を活性化する
化合物を上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、（i
i）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質またはその塩を活性化する化合物および試験化
合物を上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質を含有する細胞に接触させた場合における、
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を介した細胞
刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンド
と上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（４９）上記（１）記
載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
の塩を活性化する化合物を上記（９）記載の形質転換体
を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現し
たＧタンパク質共役型レセプタータンパク質に接触させ
た場合と、上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩を活性化する化合物および
試験化合物を上記（９）記載の形質転換体を培養するこ
とによって該形質転換体の細胞膜に発現したＧタンパク
質共役型レセプタータンパク質に接触させた場合におけ
る、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を介する
細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガ
ンドと上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物
またはその塩のスクリーニング方法、
【００１０】（５０）上記（１）記載のＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質を活性化する化合物が、アン
ギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシスト
キニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニュー
ロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、
オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡ
ＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニ
ン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、
ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアク
ティブ インテスティナル ポリペプチド）、ソマトス
タチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニ
ン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプ
チド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロス
タグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナ
リン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，
ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−
７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢ
ＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリ
ー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，
ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−
１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡ
ＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，
ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，Ｍ
ＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモ
カインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなど
のＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎ
ｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エン
ドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロ
テンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイ
ド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）または
スフィンゴシン１−リン酸である上記（４７）または
（４８）記載のスクリーニング方法、（５１）上記（４
３）〜（５０）記載のスクリーニング方法で得られうる
リガンドと上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化
合物またはその塩、（５２）上記（４３）〜上記（５
０）記載のスクリーニング方法で得られうるリガンドと
上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質またはその塩との結合性を変化させる化合物または
その塩を含有することを特徴とする医薬、
【００１１】（５３）上記（１）記載のＧタンパク質共
役型レセプタータンパク質を含有する細胞を含有するこ
とを特徴とする上記（１９）記載のスクリーニング用キ
ット、（５４）上記（１）記載のＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質を含有する細胞の膜画分を含有する
ことを特徴とする上記（１９）記載のスクリーニング用
キット、（５５）上記（９）記載の形質転換体を培養す
ることによって該形質転換体の細胞膜に発現したＧタン
パク質共役型レセプタータンパク質を含有することを特
徴とする上記（１９）記載のスクリーニング用キット、
（５６）上記（５３）〜（５５）記載のスクリーニング
用キットを用いて得られうる、リガンドと上記（１）記
載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、（５
７）上記（５３）〜（５５）記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られうる、リガンドと上記（１）記載の
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩
との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有する
ことを特徴とする医薬、（５８）上記（１１）記載の抗
体と、上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまた
はその塩とを接触させることを特徴とする上記（１）の
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記
（４）記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、（５
９）上記（１１）記載の抗体と、被検液および標識化さ
れた上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたは
その塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化
された上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまた
はその塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の
上記（１）記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその
塩の定量法、および（６０）被検液と担体上に不溶化し
た上記（１１）記載の抗体および標識化された上記（１
１）記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴
とする被検液中の上記（１）記載のＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペ
プチドまたはその塩の定量法等を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質（以下、レセプタータンパク質と略記
する場合がある）は、配列番号：５で表されるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
するレセプタータンパク質である。本発明のレセプター
タンパク質は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、モル
モット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経
細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウ
ム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内
皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免
疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュ
ラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸
球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨
芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細
胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン
細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在
するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅
球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床
下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭
葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、
膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血
管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前
立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格
筋などに由来するタンパク質であってもよく、また合成
タンパク質であってもよい。
【００１３】配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番
号：５で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好まし
くは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、特
に好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０
％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する
アミノ酸配列などが挙げられる。本発明の配列番号：５
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：５
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有し、配列番号：５で表されるアミノ酸配列と実質
的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。実
質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活
性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に
同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示
す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達
作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好
ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜
２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や
タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ
い。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活
性の測定は、公知の方法に準じて行うことができるが、
例えば、後に記載するリガンドの決定方法やスクリーニ
ング方法に従って測定することができる。配列番号：５
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質として、具体的には、配列番号：
１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが
挙げられる。
【００１４】また、本発明のレセプタータンパク質とし
ては、配列番号：５で表されるアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ま
しくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５
個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：５で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好
ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個
程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸
が付加したアミノ酸配列、配列番号：５で表されるア
ミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３
０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ま
しくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせ
たアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられ
る。
【００１５】本明細書におけるレセプタータンパク質
は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミ
ノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するレセプ
タータンパク質をはじめとする、本発明のレセプタータ
ンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、
カルボキシレート(−ＣＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮ
Ｈ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであっても
よい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ
−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペン
チル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、
例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール
基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ
1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−
ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基
のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオ
キシメチル基などが用いられる。本発明のレセプタータ
ンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボ
キシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミ
ド化またはエステル化されているものも本発明のレセプ
タータンパク質に含まれる。この場合のエステルとして
は、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられ
る。さらに、本発明のレセプタータンパク質には、上記
したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のア
ミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどの
Ｃ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護
されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグ
ルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のア
ミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、ア
ミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基
など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル
などのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、例え
ば、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するレ
セプタータンパク質、配列番号：１で表されるアミノ酸
配列を含有するレセプタータンパク質などが用いられ
る。
【００１６】本発明のレセプタータンパク質の部分ペプ
チド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）とし
ては、上記した本発明のレセプタータンパク質の部分ペ
プチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、
本発明のレセプタータンパク質分子のうち、細胞膜の外
に露出している部位であって、レセプター結合活性を有
するものなどが用いられる。具体的には、配列番号：５
で表されるアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク
質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析におい
て細胞外領域（親水性部位）であると分析された部分を
含むペプチドである。また、疎水性部位を一部に含むペ
プチドも同様に用いることができる。個々のドメインを
個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同
時に含む部分のペプチドでも良い。本発明の部分ペプチ
ドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプタータン
パク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以
上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以
上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。実
質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と
約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましく
は約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なか
でも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％
以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。ここで、
「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。
「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行うこと
ができる。
【００１７】また、本発明の部分ペプチドは、上記アミ
ノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０
個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ
酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個
以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１
〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））の
アミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１ま
たは２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ま
しくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ
酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発
明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯ
Ｈ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-）、アミド（−Ｃ
ＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであっ
てもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、上記し
た本発明のレセプタータンパク質と同様に、Ｎ末端のメ
チオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているも
の、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログ
ルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置
換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖
鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドな
ども含まれる。本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学
的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容
される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例え
ば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫
酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プ
ロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石
酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられ
る。
【００１８】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩は、上記した哺乳動物の細胞または組織から公知のレ
セプタータンパク質の精製方法によって製造することも
できるし、後に記載する本発明のレセプタータンパク質
をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養するこ
とによっても製造することができる。また、後に記載す
るタンパク質合成法またはこれに準じて製造することも
できる。哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、
哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸な
どで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラ
フィーを組み合わせることにより精製単離することがで
きる。
【００１９】本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成
には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることが
できる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチ
ル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン
樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジル
アルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニル
アセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４
−（２'，４'−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチ
ル）フェノキシ樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェ
ニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙
げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ
基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とす
るタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従
い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパ
ク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高
希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施
し、目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合
成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる
が、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類
としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジ
イミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロ
リル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる
活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢt、Ｈ
ＯＯＢt）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加する
か、または、対称酸無水物またはＨＯＢtエステルある
いはＨＯＯＢtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸
の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００２０】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十
分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分
な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチル
イミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化する
ことができる。
【００２１】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニ
ル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられ
る。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化
（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシ
ャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの
直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、ア
ラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−
ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステ
ル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエス
テル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカル
ボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニル
ヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護
することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステ
ル化またはエーテル化によって保護することができる。
このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル
基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロ
イル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボ
ニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。
また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジ
ル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などであ
る。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、
例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジ
ル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Ｔｏｓ、４-メトキシ-２，３，６−トリメチルベンゼン
スルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、
Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２２】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニ
トロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロ
フェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕
などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたもの
としては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられ
る。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ
−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸
処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温
度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタン
ジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカ
チオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンの
イミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロ
フェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリ
プトファンのインドール保護基として用いられるホルミ
ル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタ
ンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外
に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによる
アルカリ処理によっても除去される。
【００２３】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。
【００２４】本発明のタンパク質の部分ペプチドまたは
その塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは
本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断するこ
とによって製造することができる。ペプチドの合成法と
しては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによ
っても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得
る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ
せ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ
とにより目的のペプチドを製造することができる。公知
の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の
〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋
白質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な
塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合
は、公知の方法によって遊離体に変換することができ
る。
【００２５】本発明のレセプタータンパク質をコードす
るポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のレセプ
タータンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいか
なるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとして
は、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮ
Ａ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一
本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、
二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでも
よい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード
鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード
鎖）であってもよい。本発明のレセプタータンパク質を
コードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の
実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９
９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明
のレセプタータンパク質のｍＲＮＡを定量することがで
きる。本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織
よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したも
のを用いて直接Reverse TranscriptasePolymerase Chai
n Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によっ
て増幅することもできる。具体的には、本発明のレセプ
タータンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、ま
たは配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ
とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ＤＮＡを有し、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を
含有するレセプタータンパク質と実質的に同質の活性
（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）
を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡであ
れば何れのものでもよい。配列番号：６で表される塩基
配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番
号：６で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは
約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ま
しくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有す
るＤＮＡなどが用いられ、具体例としては、配列番号：
２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが挙げられ
る。
【００２６】ハイブリダイゼーションは、公知の方法あ
るいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et
al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の
方法などに従って行うことができる。また、市販のライ
ブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方
法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイス
トリンジェントな条件に従って行うことができる。該ハ
イストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃
度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭ
で、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃
の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温
度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的には、
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するレセプ
タータンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番
号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配
列番号：１表されるアミノ酸配列を含有するレセプター
タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２
で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ
る。本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ
の塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列
の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本
発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけ
ではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。本発
明に従えば、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質
遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチ
センス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化し
た、あるいは決定されたＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき
設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核
酸）は、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝
子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡ
の合成または機能を阻害することができるか、あるいは
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡと
の相互作用を介してＧタンパク質共役型レセプタータン
パク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。Ｇ
タンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡの選
択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＧタ
ンパク質共役型レセプタータンパク質関連ＲＮＡと特異
的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド
は、生体内および生体外でＧタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用で
あり、また病気などの治療または診断に有用である。用
語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩
基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるい
は相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配
列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応
する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相
補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）
のアミノ酸を通常指している。Ｇタンパク質共役型レセ
プタータンパク質遺伝子の５'端ヘアピンループ、５'端
６−ベースペア・リピート、５'端非翻訳領域、ポリペ
プチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ
翻訳終止コドン、３'端非翻訳領域、３'端パリンドロー
ム領域、および３'端ヘアピンループは好ましい対象領
域として選択しうるが、Ｇタンパク質共役型レセプター
タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択し
うる。
【００２７】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に
相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブ
リダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係
は、「アンチセンス」であるということができる。アン
チセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リ
ボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボース
を含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミ
ジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリ
ヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するそ
の他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および
合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含
有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡや
ＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の
付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）な
どが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮ
Ａ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮ
Ａハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌ
クレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さら
には公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知
られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル
化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物
で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたも
の、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、
ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメー
トなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有
結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエ
ートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアー
ゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シ
グナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例え
ば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有している
もの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、
ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、
金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属な
ど）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修
飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸
など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌ
クレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミ
ジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複
素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうし
た修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、
アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその
他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレ
オチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修
飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲ
ンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエ
ーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２８】本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド
（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸
（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例と
しては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そ
してポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミ
ドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定さ
れるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のよ
うな方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内で
のアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセ
ンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス
鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし
毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなも
のにする。こうして修飾は当該分野で数多く知られてお
り、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vo
l. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Cr
ooke et al. ed., Antisense Research and Applicatio
ns, CRC Press, 1993 などに開示がある。本発明のアン
チセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、
塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロス
フェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療
により適用されたり、付加された形態で与えられること
ができうる。こうして付加形態で用いられるものとして
は、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ
ンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高め
たり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例え
ば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水
性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質として
は、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリ
ルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こ
うしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させる
ことができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介し
て付着させることができうる。その他の基としては、核
酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ
用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌク
レアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられ
る。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレング
リコール、テトラエチレングリコールなどのグリコール
をはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙
げられるが、それに限定されるものではない。アンチセ
ンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の
生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質の生体内や生体外の翻訳系
を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方
法で細胞に適用できる。
【００２９】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織
よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse
TranscriptasePolymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ
−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもでき
る。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：６で表される
塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮ
Ａ、または（２）配列番号：６で表される塩基配列を含
有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするＤＮＡを有し、配列番号：５で表されるア
ミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質と実質的に
同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達
作用など）を有するレセプタータンパク質をコードする
ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられ
る。配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ
とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６で表される塩基
配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好
ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の
相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いら
れ、具体例としては、配列番号：２で表される塩基配列
を含有するＤＮＡなどが挙げられる。
【００３０】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチド（以下、本発明のレセプタータンパク質と
略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクロ
ーニングの手段としては、本発明のレセプタータンパク
質をコードするＤＮＡの塩基配列の部分塩基配列を有す
る合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅
するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本
発明のレセプタータンパク質の一部あるいは全領域をコ
ードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識し
たものとのハイブリダイゼーションによって選別するこ
とができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例え
ば、モレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor La
b. Press, 1989）に記載の方法などに従って行うことが
できる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添
付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができ
る。
【００３１】ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知
のキット、例えば、MutanTM-superExpress Km（宝酒
造）、MutanTM-K（宝酒造）等を用いて、ODA-LA PCR法
やGapped duplex法やKunkel法等の公知の方法あるいは
それらに準じる方法に従って行うことができる。クロー
ン化されたレセプタータンパク質をコードするＤＮＡは
目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化
したり、リンカーを付加したりして使用することができ
る。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンとして
のＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コドンと
してのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよ
い。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当
な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。本発明のレセプタータンパク質の発現ベクターは、
例えば、（イ）本発明のレセプタータンパク質をコード
するＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、
（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモー
ターの下流に連結することにより製造することができ
る。
【００３２】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢ
Ｒ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプ
ラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９
４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１
５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウ
イルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの
動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲ
ｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏな
どが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとし
ては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ
モーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物
細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、
ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプ
ロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられ
る。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、
ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である
場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモータ
ー、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３３】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞
を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する
場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても
選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、本発明のレセプタータンパク質のＮ端末側に
付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｐｈ
ｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、
宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シ
グナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主
が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２
・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、
インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・
シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ
利用できる。このようにして構築された本発明のレセプ
タータンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクター
を用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３４】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ
１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１
９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リ
サーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９
(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１
巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス
（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕，ＤＨ５α
〔Inoue,H.,Nojima,H.and Okayama,H.,Gene,96,23-28(1
990)〕，ＤＨ１０Ｂ〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８
７巻，４６４５−４６４９(１９９０)〕などが用いられ
る。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチ
ルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４
巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・
オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistr
y），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。酵
母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２
Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１
２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomy
ces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピ
キア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられ
る。
【００３５】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spod
optera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia n
iの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来の
High FiveTM 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞また
はEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイ
ルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx m
ori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞と
しては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２
１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Viv
o）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫とし
ては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Vero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、
ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズ
ハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細
胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウ
スミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが
用いられる。
【００３６】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０
(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８
２)などに記載の方法に従って行うことができる。バチ
ルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆
General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)な
どに記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質
転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−
１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７
５巻，１９２９(１９７８))などに記載の方法に従って
行うことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換する
には、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technolog
y）,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行うこと
ができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞
工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６
７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virolo
gy），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って
行うことができる。このようにして、Ｇタンパク質共役
型レセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有する
発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、ア
ンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、
ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽
出液などの無機または有機物質、無機物としては、例え
ば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マ
グネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタ
ミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐ
Ｈは約５〜８が望ましい。
【００３７】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５
(１９８０)」や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地
〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），
８１巻，５３３０（１９８４）が挙げられる。培地のｐ
Ｈは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２
０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて
通気や撹拌を加える。
【００３８】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９
５、７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清
等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地の
ｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養
は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通
気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を
培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎
児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），
１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロ
ロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰ
ＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカ
ン・メディカル・アソシエーション（The Journal of t
he American Medical Association）１９９巻，５１９
(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ
・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディ
スン（Proceeding ofthe Society for the Biological
Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられ
る。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約
３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体
の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のＧタンパク質
共役型レセプタータンパク質を生成せしめることができ
る。
【００３９】上記培養物から本発明のレセプタータンパ
ク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行
うことができる。本発明のレセプタータンパク質を培養
菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公
知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝
液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融
解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心
分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を得
る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸
グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１
００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液
中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、培養
終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離
し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、
あるいは抽出液中に含まれるレセプタータンパク質の精
製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うこ
とができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩
析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、
限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電
点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用
いられる。
【００４０】かくして得られるレセプタータンパク質が
遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で
得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法
により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するレセプタータンパク質を、精
製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させるこ
とにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分
的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例
えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンド
ペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼな
どが用いられる。かくして生成する本発明のレセプター
タンパク質またはその塩の活性は、標識したリガンドと
の結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノア
ッセイなどにより測定することができる。
【００４１】本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明の
レセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたは
その塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩（以下、本発明のレセプタータンパク質等と略
記する場合がある）に対する抗体は、本発明のレセプタ
ータンパク質等を抗原として用い、公知の抗体または抗
血清の製造法に従って製造することができる。
【００４２】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製 本発明のレセプタータンパク質等は、哺乳動物に対して
投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。
用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、
イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙
げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられ
る。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗
原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の
認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓ま
たはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞
を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血
清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタ
ータンパク質等と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行うことがで
きる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミル
スタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ））〕〕、
２５６巻、４９５頁（１９７５年）」」に従い実施する
ことができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙
げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細
胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０
などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。
用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数
との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥ
Ｇ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が
１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、
好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベ
ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４３】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の方法が使用できるが、例え
ば、レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体
とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハ
イブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素
などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用い
られる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗
体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロ
ブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイ
ブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで
標識したレセプタータンパク質等を加え、固相に結合し
たモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられ
る。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに
準じる方法に従って行うことができるが、通常はＨＡＴ
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加
した動物細胞用培地などで行うことができる。選別およ
び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるも
のならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜
２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含む
ＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドー
マ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。
ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の
抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４４】（ｂ）モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナ
ル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法
〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気
泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着
法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテ
インＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗
体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精
製法〕に従って行うことができる。
【００４５】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
したがって製造することができる。例えば、免疫抗原
（本発明のレセプタータンパク質等の抗原）とキャリア
ータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナ
ル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免
疫動物から本発明のレセプタータンパク質等に対する抗
体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより
製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫
抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリ
アータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの
混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに
対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様
な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブ
ミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット
・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.
１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方
法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリ
ングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グル
タルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エス
テル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エ
ステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に
対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通
常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行うこ
とができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫
された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から
採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体
価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして
測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記の
モノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリン
の分離精製法に従って行うことができる。
【００４６】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩、その部分ペプチドまたはその塩、および該レセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａは、（１）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質に対するリガンド（アゴニスト）の決定、
（２）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療
剤、（３）遺伝子診断剤、（４）本発明のレセプタータ
ンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる
化合物のスクリーニング方法、（５）本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化さ
せる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治
療剤、（６）本発明のＧタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質に対するリガンドの定量法、（７）本発明のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの
結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニス
トなど）のスクリーニング方法、（８）本発明のＧタン
パク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの結合
性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）
を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、
（９）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分
ペプチドまたはその塩の定量、（１０）細胞膜における
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、（１
１）細胞膜における本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する
各種疾病の予防および／または治療剤、（１２）本発明
のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまた
はその塩に対する抗体による中和、（１３）本発明のＧ
タンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするＤ
ＮＡを有する非ヒト動物の作製などに用いることができ
る。特に、本発明の組換え型Ｇタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の発現系を用いたレセプター結合アッセ
イ系を用いることによって、哺乳動物に特異的なＧタン
パク質共役型レセプターに対するリガンドの結合性を変
化させる化合物（例、アゴニスト、アンタゴニストな
ど）をスクリーニングすることができ、該アゴニストま
たはアンタゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとし
て使用することができる。本発明のレセプタータンパク
質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明の
レセプタータンパク質等と略記する場合がある）、本発
明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコ
ードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合
がある）および本発明のレセプタータンパク質等に対す
る抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）の
用途について、以下に具体的に説明する。
【００４７】（１）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質に対するリガンド（アゴニスト）の決定 本発明のレセプタータンパク質もしくはその塩または本
発明の部分ペプチドもしくはその塩は、本発明のレセプ
タータンパク質またはその塩に対するリガンド（アゴニ
スト）を探索し、または決定するための試薬として有用
である。すなわち、本発明は、本発明のレセプタータン
パク質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもし
くはその塩と、試験化合物とを接触させることを特徴と
する本発明のレセプタータンパク質に対するリガンドの
決定方法を提供する。試験化合物としては、公知のリガ
ンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビ
ノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、
メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリ
ン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、
ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グル
カゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトス
タチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴ
Ｈ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アン
ドリレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ド
ーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲ
Ｐ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロ
イコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモ
カインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，
ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣ
Ｐ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤ
Ｆ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡ
Ｆ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−
４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、Ｍ
ＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、Ｍ
ＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ
−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，Ｄ
Ｃ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサ
ブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモ
カインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどの
ＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリ
ン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシ
ン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラ
ニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシ
ン１−リン酸など）の他に、例えば、哺乳動物（例え
ば、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル
など）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などを本発明のレ
セプタータンパク質に添加し、細胞刺激活性などを測定
しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることが
できる。
【００４８】具体的には、本発明のリガンド決定方法
は、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペ
プチドもしくはその塩を用いるか、または組換え型レセ
プタータンパク質の発現系を構築し、該発現系を用いた
レセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発
明のレセプタータンパク質に結合して細胞刺激活性（例
えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内
Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生
抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、
細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓ活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制
する活性）を有する化合物（例えば、ペプチド、タンパ
ク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物な
ど）またはその塩を決定する方法である。本発明のリガ
ンド決定方法においては、本発明のレセプタータンパク
質またはその部分ペプチドと試験化合物とを接触させた
場合の、例えば、該レセプタータンパク質または該部分
ペプチドに対する試験化合物の結合量や、細胞刺激活性
などを測定することを特徴とする。
【００４９】より具体的には、本発明は、 標識した試験化合物を、本発明のレセプタータンパク
質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもしくは
その塩に接触させた場合における、標識した試験化合物
の該タンパク質もしくはその塩、または該部分ペプチド
もしくはその塩に対する結合量を測定することを特徴と
する本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対す
るリガンドの決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のレセプタータンパク
質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場
合における、標識した試験化合物の該細胞または該膜画
分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明の
レセプタータンパク質またはその塩に対するリガンドの
決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のレセプタータンパク
質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養する
ことによって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質
に接触させた場合における、標識した試験化合物の該レ
セプタータンパク質またはその塩に対する結合量を測定
しすることを特徴とする本発明のレセプタータンパク質
に対するリガンドの決定方法、
【００５０】試験化合物を、本発明のレセプタータン
パク質を含有する細胞に接触させた場合における、レセ
プタータンパク質を介した細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細
胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活
性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活
性など）を測定することを特徴とする本発明のレセプタ
ータンパク質またはその塩に対するリガンドの決定方
法、および 試験化合物を、本発明のレセプタータンパク質をコー
ドするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによ
って細胞膜上に発現したレセプタータンパク質に接触さ
せた場合における、レセプタータンパク質を介する細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトール
リン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン
酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する
活性または抑制する活性など）を測定することを特徴と
する本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対す
るリガンドの決定方法を提供する。 特に、上記〜の試験を行ない、試験化合物が本発明
のレセプタータンパク質に結合することを確認した後
に、上記〜の試験を行うことが好ましい。
【００５１】まず、リガンド決定方法に用いるレセプタ
ータンパク質としては、上記した本発明のレセプタータ
ンパク質または本発明の部分ペプチドを含有するもので
あれば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて
大量発現させたレセプタータンパク質が適している。本
発明のレセプタータンパク質を製造するには、上記の発
現方法が用いられるが、該レセプタータンパク質をコー
ドするＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現すること
により行うことが好ましい。目的とするタンパク質部分
をコードするＤＮＡ断片には、通常、相補ＤＮＡが用い
られるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例
えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。本発明
のレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ断片を宿主
動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるために
は、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルス
に属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis v
irus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０
由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、
メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプ
ロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲ
αプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発
現したレセプターの量と質の検査は公知の方法で行うこ
とができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol.
Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法
に従って行うことができる。
【００５２】したがって、本発明のリガンド決定方法に
おいて、本発明のレセプタータンパク質もしくはその部
分ペプチドまたはその塩を含有するものとしては、公知
の方法に従って精製したレセプタータンパク質もしくは
その部分ペプチドまたはその塩であってもよいし、該レ
セプタータンパク質を含有する細胞またはその細胞膜画
分を用いてもよい。本発明のリガンド決定方法におい
て、本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞を用
いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンな
どで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従っ
て行うことができる。本発明のレセプタータンパク質を
含有する細胞としては、本発明のレセプタータンパク質
を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大
腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いら
れる。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の
方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをい
う。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモ
ジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダ
ーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波
による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を
細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げら
れる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠
心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられ
る。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３００
０ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、
上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐ
ｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画
分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータンパ
ク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分
が多く含まれる。
【００５３】該レセプタータンパク質を含有する細胞や
その膜画分中のレセプタータンパク質の量は、１細胞当
たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１
０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほ
ど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くな
り、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか
りでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるように
なる。本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対
するリガンドを決定する上記の〜の方法を実施する
ためには、適当なレセプタータンパク質画分と、標識し
た試験化合物が必要である。レセプタータンパク質画分
としては、天然型のレセプタータンパク質画分か、また
はそれと同等の活性を有する組換え型レセプター画分な
どが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガン
ド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識し
た試験化合物としては、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、
〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したアンギオテンシン、
ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタ
ミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、
オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、
ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、
セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジ
ュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴ
Ｈ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテ
スティナル アンド リイテッド ポリペプチド）、ソ
マトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラ
ジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッ
ドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、
プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、ア
ドレナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ
−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，Ｅ
ＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉ
ｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブ
ファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣ
Ｐ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，
ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３
α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，Ｔ
ＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ
−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどの
ＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔ
ｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａ
ｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー
等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミ
ン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポ
リペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰ
Ａ）、スフィンゴシン１−リン酸などが好適である。
【００５４】具体的には、本発明のレセプタータンパク
質またはその塩に対するリガンドの決定方法を行うに
は、まず本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞
または細胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに
懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッフ
ァーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリ
ン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガン
ドとレセプタータンパク質との結合を阻害しないバッフ
ァーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低
減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花
王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなど
の界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各
種タンパク質をバッファーに加えることもできる。さら
に、プロテアーゼによるリセプターやリガンドの分解を
抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプ
チド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害
剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍlの該
レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００
００ｃｐｍ）の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、
〔35Ｓ〕などで標識した試験化合物を共存させる。非特
異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の試
験化合物を加えた反応チューブも用意する。反応は約０
℃〜５０℃、望ましくは約４℃〜３７℃で、約２０分〜
２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行う。反応後、
ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄
した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シン
チレーションカウンターあるいはγ−カウンターで計測
する。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を
引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験
化合物を本発明のレセプタータンパク質またはその塩に
対するリガンド（アゴニスト）として選択することがで
きる。
【００５５】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩に対するリガンドを決定する上記の〜の方法を実
施するためには、該レセプタータンパク質を介する細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトール
リン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン
酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する
活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販
の測定用キットを用いて測定することができる。具体的
には、まず、レセプタータンパク質を含有する細胞をマ
ルチウェルプレート等に培養する。リガンド決定を行う
にあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を
示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを
添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あ
るいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方
法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質
（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有す
る分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対
する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。ま
た、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルス
コリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細
胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００５６】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩に結合するリガンド決定用キットは、本発明のレセプ
タータンパク質もしくはその塩、本発明の部分ペプチド
もしくはその塩、本発明のレセプタータンパク質を含有
する細胞、または本発明のレセプタータンパク質を含有
する細胞の膜画分などを含有するものである。本発明の
リガンド決定用キットの例としては、次のものが挙げら
れる。 １．リガンド決定用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質標品 本発明のレセプタータンパク質を発現させたＣＨＯ細胞
を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７
℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 標識試験化合物 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。水に難
溶性を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミ
ド、ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解する。 非標識試験化合物 標識化合物と同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に
調製する。
【００５７】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセ
プタータンパク質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍ
ｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴
に加える。 標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識試験化合物を０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーター
Ａ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定する。
【００５８】本発明のレセプタータンパク質またはその
塩に結合することができるリガンドとしては、例えば、
脳、下垂体、心臓、膵臓、脂肪組織、乳腺、精巣などに
特異的に存在する物質などが挙げられ、具体的には、ア
ンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシス
トキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニュ
ーロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシ
ン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，
ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシト
ニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲ
Ｈ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソ
アクティブ インテスティナル アンド リレイテッド
ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチ
リン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニ
ンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、
パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキ
サン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスーパー
ファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲ
Ｏγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ
４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などの
ＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−
１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘ
ｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，Ｈ
ＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／Ｅ
ＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ
−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／Ｐ
ＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；
ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファ
ミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカ
インサブファミリー等）、エンドセリン、エンテロガス
トリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パン
クレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスフ
ァチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸など
が用いられる。
【００５９】（２）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および
／または治療剤 上記（１）の方法において、本発明のレセプタータンパ
ク質に対するリガンドが明らかになれば、該リガンドが
有する作用に応じて、本発明のレセプタータンパク質
または該レセプタータンパク質をコードするＤＮＡ
を、本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連す
る疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使
用することができる。例えば、生体内において本発明の
レセプタータンパク質が減少しているためにリガンドの
生理作用が期待できない（該レセプタータンパク質の欠
乏症）患者がいる場合に、本発明のレセプタータンパ
ク質を該患者に投与し該レセプタータンパク質の量を補
充したり、（イ）本発明のレセプタータンパク質をコ
ードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによっ
て、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明のレセプタ
ータンパク質をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後
に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者
の体内におけるレセプタータンパク質の量を増加させ、
リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すな
わち、本発明のレセプタータンパク質をコードするＤＮ
Ａは、安全で低毒性な本発明のレセプタータンパク質の
機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤と
して有用である。本発明のレセプタータンパク質は、Ｇ
蛋白共役型レセプタータンパク質であるｈＯＴ７Ｔ００
９（特開２０００−２７９１８３号公報）にアミノ酸配
列レベルで、３５．７％程度の相同性が認められる新規
７回膜貫通型受容体タンパク質である。本発明のレセプ
タータンパク質または該レセプタータンパク質をコード
するＤＮＡは中枢疾患(例えば、アルツハイマー病、痴
呆、摂食障害など)、炎症性疾患(例えば、アレルギー、
喘息、リュウマチなど)、循環器疾患(例えば、高血圧
症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等)、癌（例えば、非
小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、
子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、代謝性疾患（例え
ば、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、動脈硬化、痛風、白
内障等）、免疫系疾患（例えば、自己免疫性疾患等）、
消化器系疾患（例えば、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃炎、
逆流性食道炎等）などの予防および／または治療に有用
である。本発明のレセプタータンパク質を上記予防・治
療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化す
ることができる。一方、本発明のレセプタータンパク質
をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する
場合がある）を上記予防・治療剤として使用する場合
は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシ
エーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿
入した後、常套手段に従って実施することができる。本
発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のため
の補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテル
のようなカテーテルによって投与できる。例えば、本
発明のレセプタータンパク質または該レセプタータン
パク質をコードするＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施し
た錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル
剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の
薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤
などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、
本発明のレセプタータンパク質または該レセプタータ
ンパク質をコードするＤＮＡを生理学的に認められる公
知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定
剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要
求される単位用量形態で混和することによって製造する
ことができる。これら製剤における有効成分量は指示さ
れた範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。
【００６０】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【００６１】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、
ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。本発明のレセプタータンパク質の投与量は、投与対
象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はある
が、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋ
ｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１０
０ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましく
は約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合
は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与
方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では
通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一
日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．
１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ
程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の
動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与する
ことができる。本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、
対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経
口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとし
て）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍ
ｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約
１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、
その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法
などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常
例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日に
つき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜
２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与すること
ができる。
【００６２】（３）遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、プローブとして使用することによ
り、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）にお
ける本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプ
チドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子
異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡ
またはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、
該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの
遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用い
る上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブ
リダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス
（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９
年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー
（Proceedings of theNational Academy of Sciences o
f the United States of America），第８６巻，２７６
６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施するこ
とができる。
【００６３】（４）本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスク
リーニング方法 本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いる
ことができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非
ヒト哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器から単離
した組織もしくは細胞、または（ii）形質転換体等に含
まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペ
プチドのｍＲＮＡ量を測定することによる、本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を
変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００６４】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチドのｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のよ
うにして行う。 （ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満
マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、
薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満
薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレ
ス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定
時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例え
ば、脂肪組織、乳腺、精巣など）、または臓器から単離
した組織、あるいは細胞を得る。得られた細胞に含まれ
る本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチ
ドのｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等から
ｍＲＮＡを抽出し、例えば、TaqManPCRなどの手法を用
いることにより定量することができ、公知の手段により
ノザンブロットを行うことにより解析することもでき
る。 （ii）本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分
ペプチドを発現する形質転換体を上記の方法に従い作製
し、該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡを同様にして定
量、解析することができる。
【００６５】本発明のレセプタータンパク質またはその
部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニ
ングは、（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物
に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一
定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前
〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）も
しくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時
間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間
後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検
化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３
日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１
時間後〜２４時間後）、細胞に含まれる本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を
定量、解析することにより行うことができ、（ii）形質
転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に
混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましく
は１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、
該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパク質
またはその部分ペプチドのｍＲＮＡ量を定量、解析する
ことにより行うことができる。
【００６６】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩は、本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる作用
を有する化合物であり、具体的には、（イ）本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を
増加させることにより、Ｇタンパク質共役型レセプター
を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、ア
セチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ
生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タン
パク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下な
どを促進する活性または抑制する活性など）を増強させ
る化合物、（ロ）本発明のレセプタータンパク質または
その部分ペプチドの発現量を減少させることにより、該
細胞刺激活性を減弱させる化合物である。該化合物とし
ては、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な
化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよ
い。該細胞刺激活性を増強させる化合物は、本発明のレ
セプタータンパク質等の生理活性を増強するための安全
で低毒性な医薬として有用である。該細胞刺激活性を減
弱させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等の
生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として
有用である。
【００６７】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場
合、常套手段に従って実施することができる。例えば、
上記した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬
と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすること
ができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合
物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症
状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に、例えば、癌患者（６０ｋｇとして）にお
いては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは
約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍ
ｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量
は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても
異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１
〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、
より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射によ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６８】（５）本発明のレセプタータンパク質また
はその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有
する各種疾病の予防および／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例え
ば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たし
ていると考えられる。したがって、本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ
る化合物は、本発明のレセプタータンパク質の機能不全
に関連する疾患の予防および／または治療剤として用い
ることができる。該化合物を本発明のレセプタータンパ
ク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治
療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化す
ることができる。例えば、該化合物は、必要に応じて糖
衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロ
カプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそ
れ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または
懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例
えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香
味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤など
とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用
量形態で混和することによって製造することができる。
これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当
な用量が得られるようにするものである。
【００６９】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【００７０】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、
ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）
においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好まし
くは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２
０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投
与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっ
ても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌
患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．
０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７１】（６）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプタータンパク質等は、リガンドに対して
結合性を有しているので、生体内におけるリガンド濃度
を感度良く定量することができる。本発明の定量法は、
例えば、競合法と組み合わせることによって用いること
ができる。すなわち、被検体を本発明のレセプタータン
パク質等と接触させることによって被検体中のリガンド
濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以
下のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる
方法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）
【００７２】（７）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合
物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニン
グ方法 本発明のレセプタータンパク質等を用いるか、または組
換え型レセプタータンパク質等の発現系を構築し、該発
現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることに
よって、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等と
の結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、タン
パク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物
など）またはその塩を効率よくスクリーニングすること
ができる。このような化合物には、（イ）Ｇタンパク質
共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細
胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電
位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活
性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活
性など）を有する化合物（いわゆる、本発明のレセプタ
ータンパク質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激
活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のレセプター
タンパク質に対するアンタゴニスト）、（ハ）リガンド
と本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質と
の結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）リガンドと
本発明のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との
結合力を減少させる化合物などが含まれる（なお、上記
（イ）の化合物は、上記したリガンド決定方法によって
スクリーニングすることが好ましい）。すなわち、本発
明は、（ｉ）本発明のレセプタータンパク質もしくはそ
の部分ペプチドまたはその塩と、リガンドとを接触させ
た場合と（ii）本発明のレセプタータンパク質もしくは
その部分ペプチドまたはその塩と、リガンドおよび試験
化合物とを接触させた場合との比較を行うことを特徴と
するリガンドと本発明のレセプタータンパク質もしくは
その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる
化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（i
i）の場合における、例えば、該レセプタータンパク質
等に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定
して、比較することを特徴とする。
【００７３】より具体的には、本発明は、 標識したリガンドを、本発明のレセプタータンパク質
等に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化
合物を本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場
合における、標識したリガンドの該レセプタータンパク
質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とす
るリガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合
性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方
法、 標識したリガンドを、本発明のレセプタータンパク質
等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場
合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレ
セプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜
画分に接触させた場合における、標識したリガンドの該
細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する
ことを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパ
ク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のス
クリーニング方法、 標識したリガンドを、本発明のＤＮＡを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセ
プタータンパク質等に接触させた場合と、標識したリガ
ンドおよび試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発
明のレセプタータンパク質等に接触させた場合におけ
る、標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対
する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガン
ドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化
させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００７４】本発明のレセプタータンパク質等を活性
化する化合物（例えば、本発明のレセプタータンパク質
等に対するリガンドなど）を本発明のレセプタータンパ
ク質等を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のレ
セプタータンパク質等を活性化する化合物および試験化
合物を本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞
に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活
性または抑制する活性など）を測定し、比較することを
特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質等
との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー
ニング方法、および 本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物
（例えば、本発明のレセプタータンパク質等に対するリ
ガンドなど）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を
培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセ
プタータンパク質等に接触させた場合と、本発明のレセ
プタータンパク質等を活性化する化合物および試験化合
物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養するこ
とによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータン
パク質等に接触させた場合における、レセプターを介す
る細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチル
コリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、
細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質
のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促
進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較す
ることを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータン
パク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩の
スクリーニング方法を提供する。
【００７５】本発明のレセプタータンパク質等が得られ
る以前は、Ｇタンパク質共役型レセプターアゴニストま
たはアンタゴニストをスクリーニングする場合、まずラ
ットなどのＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を
含む細胞、組織またはその細胞膜画分を用いて候補化合
物を得て（一次スクリーニング）、その後に該候補化合
物が実際にヒトのＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認する試
験（二次スクリーニング）が必要であった。細胞、組織
または細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプタータ
ンパク質も混在するために、目的とするレセプタータン
パク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストを実際
にスクリーニングすることは困難であった。しかしなが
ら、例えば、本発明のヒト由来レセプタータンパク質を
用いることによって、一次スクリーニングの必要がなく
なり、リガンドとＧタンパク質共役型レセプタータンパ
ク質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニン
グすることができる。さらに、スクリーニングされた化
合物がアゴニストかアンタゴニストかを簡便に評価する
ことができる。本発明のスクリーニング方法の具体的な
説明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法
に用いる本発明のレセプタータンパク質等としては、上
記した本発明のレセプタータンパク質等を含有するもの
であれば何れのものであってもよいが、本発明のレセプ
タータンパク質等を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画
分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が
極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるも
のとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来
のレセプタータンパク質等などが適している。
【００７６】本発明のレセプタータンパク質等を製造す
るには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを
哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行うことが好
ましい。目的とするタンパク質部分をコードするＤＮＡ
断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制
約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮ
Ａを用いてもよい。本発明のレセプタータンパク質をコ
ードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを
効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿
主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス
（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリ
ンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロ
ウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウ
イルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に
組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の
検査は公知の方法で行うことができる。例えば、文献
〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19
559頁,1992年〕に記載の方法に従って行うことができ
る。したがって、本発明のスクリーニング方法におい
て、本発明のレセプタータンパク質等を含有するものと
しては、公知の方法に従って精製したレセプタータンパ
ク質等であってもよいし、該レセプタータンパク質等を
含有する細胞を用いてもよく、また該レセプタータンパ
ク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００７７】本発明のスクリーニング方法において、本
発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞を用いる
場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行
うことができる。本発明のレセプタータンパク質等を含
有する細胞としては、該レセプタータンパク質等を発現
した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、
枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。細
胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得
られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の
破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザー
で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリト
ロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破
砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズ
ルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細
胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法
などの遠心力による分画法が主として用いられる。例え
ば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐ
ｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清を
さらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で
通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とす
る。該膜画分中には、発現したレセプタータンパク質等
と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多
く含まれる。該レセプタータンパク質等を含有する細胞
や膜画分中のレセプタータンパク質の量は、１細胞当た
り１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7
分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜
画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、
高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりで
なく、同一ロットで大量の試料を測定できるようにな
る。
【００７８】リガンドと本発明のレセプタータンパク質
等との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする
上記の〜を実施するためには、例えば、適当なレセ
プタータンパク質画分と、標識したリガンドが必要であ
る。レセプタータンパク質画分としては、天然型のレセ
プタータンパク質画分か、またはそれと同等の活性を有
する組換え型レセプタータンパク質画分などが望まし
い。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活
性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識したリガン
ドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナ
ログ化合物などが用いられる。例えば〔3Ｈ〕、
〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識されたリガ
ンドなどが用いられる。具体的には、リガンドと本発明
のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合
物のスクリーニングを行うには、まず本発明のレセプタ
ータンパク質等を含有する細胞または細胞の膜画分を、
スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによ
りレセプタータンパク質標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バ
ッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレ
セプタータンパク質との結合を阻害しないバッファーで
あればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させ
る目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔween−８０TM（花王−アトラ
ス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性
剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテ
アーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的
でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所
製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加す
ることもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプタ
ー溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐ
ｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０-4Ｍ〜１
０-10Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量
（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加
えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５０
℃、望ましくは約４℃から３７℃で、約２０分から２４
時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガ
ラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄し
た後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチ
レーションカウンターまたはγ−カウンターで計測す
る。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ0）から非特
異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳ
Ｂ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）
が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能
力のある候補物質として選択することができる。
【００７９】リガンドと本発明のレセプタータンパク質
等との結合性を変化させる化合物スクリーニングする上
記の〜の方法を実施するためには、例えば、レセプ
タータンパク質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性
化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性
など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて
測定することができる。具体的には、まず、本発明のレ
セプタータンパク質等を含有する細胞をマルチウェルプ
レート等に培養する。スクリーニングを行うにあたって
は前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適
当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一
定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清
液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って
定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ア
ラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素に
よって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を
添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産
生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細
胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生
抑制作用として検出することができる。細胞刺激活性を
測定してスクリーニングを行うには、適当なレセプター
タンパク質を発現した細胞が必要である。本発明のレセ
プタータンパク質等を発現した細胞としては、天然型の
本発明のレセプタータンパク質等を有する細胞株、上記
の組換え型レセプタータンパク質等を発現した細胞株な
どが望ましい。試験化合物としては、例えば、ペプチ
ド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用
いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。
【００８０】リガンドと本発明のレセプタータンパク質
等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ
ーニング用キットは、本発明のレセプタータンパク質
等、本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞、
または本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞
の膜画分を含有するものなどである。本発明のスクリー
ニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇタンパク質共役型レセプター標品 本発明のレセプタータンパク質を発現させたＣＨＯ細胞
を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７
℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。 標識リガンド 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識したリガンド 水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存
し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。 リガンド標準液 リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で
保存する。
【００８１】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセ
プタータンパク質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍ
ｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴
に加える。 １０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わ
りに１０-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０．２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式で求める。 ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１０
０ ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ0 ：最大結合量
【００８２】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結
合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的に
は、（イ）Ｇタンパク質共役型レセプターを介して細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトール
リン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン
酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する
活性または抑制する活性など）を有する化合物（いわゆ
る、本発明のレセプタータンパク質に対するアゴニス
ト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆ
る、本発明のレセプタータンパク質に対するアンタゴニ
スト）、（ハ）リガンドと本発明のＧタンパク質共役型
レセプタータンパク質との結合力を増強する化合物、あ
るいは（ニ）リガンドと本発明のＧタンパク質共役型レ
セプタータンパク質との結合力を減少させる化合物であ
る。該化合物としては、ペプチド、蛋白、非ペプチド性
化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これ
ら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合
物であってもよい。本発明のレセプタータンパク質等に
対するアゴニストは、本発明のレセプタータンパク質等
に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有し
ているので、該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医
薬として有用である。本発明のレセプタータンパク質等
に対するアンタゴニストは、本発明のレセプタータンパ
ク質等に対するリガンドが有する生理活性を抑制するこ
とができるので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒
性な医薬として有用である。リガンドと本発明のＧタン
パク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増強す
る化合物は、本発明のレセプタータンパク質等に対する
リガンドが有する生理活性を増強するための安全で低毒
性な医薬として有用である。リガンドと本発明のＧタン
パク質共役型レセプタータンパク質との結合力を減少さ
せる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等に対す
るリガンドが有する生理活性を減少させるための安全で
低毒性な医薬として有用である。
【００８３】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従
って実施することができる。例えば、上記した本発明の
レセプタータンパク質を含有する医薬と同様にして、錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、
無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このよ
うにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例え
ば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対
して投与することができる。該化合物またはその塩の投
与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによ
り差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌
患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.
１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より
好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与
する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症
状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤
の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）におい
ては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましく
は約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜
１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。
【００８４】（８）本発明のＧタンパク質共役型レセプ
タータンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合
物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病
の予防および／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例えば
中枢機能、循環機能、消化機能など生体内で何らかの重
要な役割を果たしていると考えられる。従って、本発明
のレセプタータンパク質とリガンドとの結合性を変化さ
せる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）や本発明の
レセプタータンパク質に対するリガンドは、本発明のレ
セプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防お
よび／または治療剤として用いることができる。該化合
物やリガンドを本発明のレセプタータンパク質の機能不
全に関連する疾患の予防および／または治療剤として使
用する場合は、常套手段に従って製剤化することができ
る。例えば、該化合物やリガンドは、必要に応じて糖衣
を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカ
プセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ
以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸
濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例え
ば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味
剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などと
ともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量
形態で混和することによって製造することができる。こ
れら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な
用量が得られるようにするものである。
【００８５】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【００８６】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。さらに、上記予防・治療剤は適
当な薬剤と組み合わせて例えば本発明のレセプタータン
パク質が高発現している臓器や組織を特異的なターゲッ
トとしたＤＤＳ製剤として使用することもできる。この
ようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例
えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサ
ギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対
して投与することができる。該化合物またはその塩の投
与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによ
り差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌
患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.
１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より
好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与
する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症
状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤
の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）におい
ては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましく
は約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜
１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。
【００８７】（９）本発明のレセプタータンパク質もし
くはその部分ペプチドまたはその塩の定量 本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質等を特
異的に認識することができるので、被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫
測定法による定量などに使用することができる。すなわ
ち、本発明は、例えば、（i）本発明の抗体と、被検液
および標識化レセプタータンパク質等とを競合的に反応
させ、該抗体に結合した標識化レセプタータンパク質等
の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の
レセプタータンパク質等の定量法、（ii）被検液と担体
上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明
の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被
検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法を提
供する。上記（ii）においては、一方の抗体が本発明の
レセプタータンパク質等のＮ端部を認識する抗体で、他
方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等のＣ端部に
反応する抗体であることが好ましい。
【００８８】本発明のレセプタータンパク質等に対する
モノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗
体と称する場合がある）を用いて本発明のレセプタータ
ンパク質等の測定を行なえるほか、組織染色等による検
出を行うこともできる。これらの目的には、抗体分子そ
のものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2、
Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明
のレセプタータンパク質等に対する抗体を用いる測定法
は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗
原量（例えば、レセプタータンパク質量）に対応した抗
体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または
物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標
準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ
れば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロ
メトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイ
ッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後
に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、
例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質な
どが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔
125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いら
れる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが
好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコ
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質と
しては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイ
ソチオシアネートなどが用いられる。発光物質として
は、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェ
リン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体ある
いは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用
いることもできる。
【００８９】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは
酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を
用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロー
ス、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹
脂、あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法に
おいては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検
液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明の
モノクローナル抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中
の本発明のレセプタータンパク質量を定量することがで
きる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、ま
た、同時に行なってもよいし時間をずらして行なっても
よい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準
じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測
定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いら
れる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度
を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用
いてもよい。本発明のサンドイッチ法によるレセプター
タンパク質等の測定法においては、１次反応と２次反応
に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプター
タンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく
用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用い
られる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、
レセプタータンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反
応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えば
Ｎ端部を認識する抗体が用いられる。
【００９０】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００９１】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のレセプタータンパク質またはその塩の測定系を構築
すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細について
は、総説、成書などを参照することができる〔例えば、
入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」
（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫
測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年
発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）
（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エ
ンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」Vol. 70 (Im
munochemical Techniques (Part A))、同書Vol. 73 (Im
munochemical Techniques (Part B))、同書Vol. 74 (Im
munochemical Techniques (Part C))、同書Vol. 84 (Im
munochemical Techniques (Part D:Selected Immunoass
ays))、同書Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Par
t E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay
Methods))、同書Vol. 121 (Immunochemical Techniques
(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antib
odies))（以上、アカデミックプレス社発行）など参
照〕。以上のように、本発明の抗体を用いることによっ
て、本発明のレセプタータンパク質またはその塩を感度
良く定量することができる。さらに、本発明の抗体を用
いて、生体内での本発明のレセプタータンパク質またそ
の塩を定量することによって、本発明のレセプタータン
パク質の機能不全に関連する各種疾患の診断をすること
ができる。また、本発明の抗体は、体液や組織などの被
検体中に存在する本発明のレセプタータンパク質等を特
異的に検出するために使用することができる。また、本
発明のレセプタータンパク質等を精製するために使用す
る抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のレセ
プタータンパク質等の検出、被検細胞内における本発明
のレセプタータンパク質の挙動の分析などのために使用
することができる。
【００９２】（１０）細胞膜における本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる
化合物のスクリーニング方法 本発明の抗体は、本発明のレセプタータンパク質もしく
はその部分ペプチドまたはその塩を特異的に認識するこ
とができるので、細胞膜における本発明のレセプタータ
ンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合
物のスクリーニングに用いることができる。すなわち本
発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物の血液、特
定の臓器、臓器から単離した組織もしくは細胞等を破
壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれる
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
を定量することによる、細胞膜における本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させ
る化合物のスクリーニング方法、（ii）本発明のレセプ
タータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する形
質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜
画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドを定量することによる、細胞膜における
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、（ii
i）非ヒト哺乳動物の血液、特定の臓器、臓器か
ら単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染
色法を用いることにより、細胞表層での該受容体タンパ
ク質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の
該タンパク質を確認することによる、細胞膜における本
発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの
量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供す
る。（iv）本発明のレセプタータンパク質もしくはその
部分ペプチドを発現する形質転換体等を切片とした後、
免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該受容体
タンパク質の染色度合いを定量化することにより、細胞
膜上の該タンパク質を確認することによる、細胞膜にお
ける本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプ
チドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提
供する。
【００９３】細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの定量は具体的には
以下のようにして行う。 （ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満
マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、
薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満
薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレ
ス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定
時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例え
ば、脂肪組織、乳腺、精巣など）、または臓器から単離
した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織ま
たは細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス
塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸
濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤
（例えば、トリトンＸ−１００TM、ツイーン２０TMな
ど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画な
どの手法を用いて細胞膜画分を得る。
【００９４】細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、
公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のこと
をいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型
ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレ
ンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超
音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細
胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙
げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾
配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用い
られる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３
０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心
し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００
ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を
膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプタータ
ンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの
膜成分が多く含まれる。
【００９５】細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドは、例えば、本発明
の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブ
ロット解析などにより定量することができる。かかるサ
ンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行うこ
とができ、ウエスタンブロットは公知の手段により行う
ことができる。
【００９６】（ii）本発明のレセプタータンパク質もし
くはその部分ペプチドを発現する形質転換体を上記の方
法に従い作製し、細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ
タータンパク質またはその部分ペプチドを定量すること
ができる。
【００９７】細胞膜における本発明のレセプタータンパ
ク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物の
スクリーニングは、（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒ
ト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなど
を与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましく
は３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６
時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ま
しくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２
４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時
に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分
後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好まし
くは１時間後〜２４時間後）、細胞膜における本発明の
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を定
量することにより行うことができ、（ii）形質転換体を
常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合さ
せ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日
後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜
における本発明のレセプタータンパク質またはその部分
ペプチドの量を定量することにより行うことができる。
【００９８】細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター
タンパク質またはその部分ペプチドの確認は具体的には
以下のようにして行う。（iii）正常あるいは疾患モデ
ル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体
的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌
マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧
低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレ
ス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温
など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、ある
いは特定の臓器（例えば、脂肪組織、乳腺、精巣な
ど）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得
る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組
織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細
胞表層での該受容体タンパク質の染色度合いを定量化す
ることにより、細胞膜上の該タンパク質を確認すること
により、定量的または定性的に、細胞膜における本発明
のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を
確認することができる。（iv）本発明のレセプタータン
パク質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転換体
等を用いて同様の手段をとることにより確認することも
できる。
【００９９】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩は、細胞膜における本発明のレ
セプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化
させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）
細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはそ
の部分ペプチドの量を増加させることにより、Ｇタンパ
ク質共役型レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+
遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、
細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜
電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの
活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する
活性など）を増強させる化合物、（ロ）細胞膜における
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド
の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱さ
せる化合物である。該化合物としては、ペプチド、蛋
白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など
が挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよ
いし、公知の化合物であってもよい。該細胞刺激活性を
増強させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質等
の生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として
有用である。該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、本
発明のレセプタータンパク質等の生理活性を減少させる
ための安全で低毒性な医薬として有用である。
【０１００】本発明のスクリーニング方法を用いて得ら
れる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場
合、常套手段に従って実施することができる。例えば、
上記した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬
と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイ
クロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすること
ができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラッ
ト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合
物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症
状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）におい
ては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約
１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ
である。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は
投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異
なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１
〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、
より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射によ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１０１】（１１）細胞膜における本発明のレセプタ
ータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる
化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、例え
ば、中枢機能など生体内で何らかの重要な役割を果たし
ていると考えられる。したがって、細胞膜における本発
明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量
を変化させる化合物は、本発明のレセプタータンパク質
の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤
として用いることができる。該化合物を本発明のレセプ
タータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および
／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従っ
て製剤化することができる。例えば、該化合物は、必要
に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル
剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは
水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性
溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使
用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公
知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定
剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要
求される単位用量形態で混和することによって製造する
ことができる。これら製剤における有効成分量は指示さ
れた範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。
【０１０２】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアル
コール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート
８０TM、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液
としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶
解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。
【０１０３】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝
剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当な
アンプルに充填される。このようにして得られる製剤は
安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、
ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができ
る。該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象
臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投
与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）
においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好まし
くは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２
０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投
与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっ
ても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌
患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．
０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程
度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射
により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、
６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１０４】（１２）本発明のレセプタータンパク質、
その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体による
中和 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチ
ドまたはその塩に対する抗体の、それらレセプタータン
パク質などに対する中和活性とは、すなわち、該レセプ
タータンパク質の関与するシグナル伝達機能を不活性化
する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有す
る場合は、該レセプタータンパク質の関与するシグナル
伝達、例えば、該レセプタータンパク質を介する細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活
性または抑制する活性など）を不活性化することができ
る。したがって、該レセプタータンパク質の過剰発現な
どに起因する疾患の予防および／または治療に用いるこ
とができる。
【０１０５】（１３）本発明のＧタンパク質共役型レセ
プタータンパク質をコードするＤＮＡを有する動物の作
製 本発明のＤＮＡを用いて、本発明のレセプタータンパク
質等を発現するトランスジェニック動物を作製すること
ができる。動物としては、哺乳動物（例えば、ラット、
マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サ
ルなど）など（以下、動物と略記する場合がある）が挙
げれるが、特に、マウス、ウサギなどが好適である。本
発明のＤＮＡを対象動物に導入させるにあたっては、該
ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に
結合した遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に
有利である。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを導
入させる場合、これと相同性が高い動物由来の本発明の
ＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下
流に結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウサギ
受精卵へマイクロインジェクションすることによって本
発明のレセプタータンパク質等を高産生するＤＮＡ導入
動物を作出できる。このプロモーターとしては、例え
ば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン等の
ユビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、好まし
くは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子プロモーターや
エノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
【０１０６】受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの
導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在
するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽
細胞において本発明のレセプタータンパク質等が存在す
ることは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体
細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等を有する
ことを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子
孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプ
タータンパク質等を有する。本発明のＤＮＡ導入動物
は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認し
て、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代
を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌
雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色
体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄
の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを
有するように繁殖継代することができる。本発明のＤＮ
Ａが導入された動物は、本発明のレセプタータンパク質
等が高発現させられているので、本発明のレセプタータ
ンパク質等に対するアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング用の動物などとして有用である。本発明
のＤＮＡ導入動物を、組織培養のための細胞源として使
用することもできる。例えば、本発明のＤＮＡ導入マウ
スの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、
あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプタータ
ンパク質が存在する組織を分析することにより、本発明
のレセプタータンパク質等について分析することができ
る。本発明のレセプタータンパク質等を有する組織の細
胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用し
て、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難
な組織からの細胞の機能を研究することができる。ま
た、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の
機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高
発現細胞株があれば、そこから、本発明のレセプタータ
ンパク質等を単離精製することも可能である。
【０１０７】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【０１０８】Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基
【０１０９】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ2Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカル ボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【０１１０】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配
列を示す。 配列番号：１ 本発明のヒト由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質ＴＧＲ３９のアミノ酸配列を示す。 配列番号：２ 本発明のヒト由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質ＴＧＲ３９をコードするｃＤＮＡの塩基配列を
示す。
【０１１１】配列番号：３ 以下の実施例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー１の塩基配列を示す。 配列番号：４ 以下の実施例１および実施例２におけるＰＣＲ反応で使
用したプライマー２の塩基配列を示す。 配列番号：５ 本発明のヒト由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質ｈＴＧＲ３９Ａのアミノ酸配列を示す。 配列番号：６ 本発明のヒト由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータ
ンパク質ｈＴＧＲ３９ＡをコードするｃＤＮＡの塩基配
列を示す。 配列番号：７ 以下の実施例２におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー３の塩基配列を示す。 配列番号：８ 以下の実施例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー１の塩基配列を示す。 配列番号：９ 以下の実施例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマ
ー２の塩基配列を示す。 配列番号：１０ 以下の実施例３におけるＰＣＲ反応で使用したプローブ
の塩基配列を示す。
【０１１２】後述の実施例１で得られた形質転換体 Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０／ｐＣＲ
２．１−ｈＴＧＲ３９は、２００１年９月１３日から大
阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番
号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦＯ １６７０２として、２００１年
９月２５日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法
人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番
号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７７５３としてそれぞれ寄託されて
いる。後述の実施例２で得られた形質転換体 Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−
ｈＴＧＲ３９Ａは、２００１年９月１８日から大阪府大
阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３
２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受
託番号ＩＦＯ １６７０６として、２００１年１０月１
日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第
６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技
術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号 ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−７７６０としてそれぞれ寄託されている。
【０１１３】
【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。なお、大腸菌を用いての遺伝子は、モレキュラー
・クローニング(Molecular cloning)に記載されている
方法に従った。 実施例１ ヒト心臓のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を
コードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定 ヒト心臓ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、
２個のプライマー、プライマー１（配列番号：３）およ
びプライマー２（配列番号：４）を用いてＰＣＲ反応を
行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡを
１／１０量鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−Ｇ
Ｃ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ社）１／５０量、プライマー１（配列番号：３）およ
びプライマー２（配列番号：４）を各０．５μＭ、ｄＮ
ＴＰｓ２００μＭ、および酵素に添付のバッファーを１
／５量、ＧＣ Ｍｅｌｔを１／５量加え、２０μｌの液
量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・５分の後、９４℃・
３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・２分のサイクルを３
５回繰り返し、最後に６８℃・５分の伸長反応を行っ
た。該ＰＣＲ反応産物をＴＡクローニングキット（Invi
trogen社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ２．
１（Invitrogen社）へサブクローニングした。これを大
腸菌ＴＯＰ１０に導入し、ｃＤＮＡを持つクローンをア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のク
ローンの配列を解析した結果、新規Ｇタンパク質共役型
レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列
（配列番号：２）を得た。また、このアミノ酸配列（配
列番号：１）を有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタ
ータンパク質をＴＧＲ３９と命名した。また、形質転換
体を大腸菌（Escherichia coli）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ
２．１−ｈＴＧＲ３９と命名した。ＴＧＲ３９の疎水性
プロット図を図１に示す。
【０１１４】実施例２ ヒト心臓のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質を
コードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定 ヒト心臓ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、
２個のプライマー、プライマー１（配列番号：７）およ
びプライマー２（配列番号：４）を用いてＰＣＲ反応を
行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡを
１／１０量鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−Ｇ
Ｃ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣ
Ｈ社）１／５０量、プライマー１（配列番号：７）およ
びプライマー２（配列番号：４）を各０．５μＭ、ｄＮ
ＴＰｓ２００μＭ、および酵素に添付のバッファーを１
／５量、ＧＣ Ｍｅｌｔを１／５量加え、２０μｌの液
量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・５分の後、９４℃・
３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・２分のサイクルを３
５回繰り返し、最後に６８℃・５分の伸長反応を行っ
た。該ＰＣＲ反応産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクター
ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクロー
ニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、ｃＤＮ
Ａを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中
で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新
規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードす
るｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：６）を得た。また、
このアミノ酸配列（配列番号：５）を有する新規Ｇタン
パク質共役型レセプタータンパク質をｈＴＧＲ３９Ａと
命名した。また形質転換体を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ｈＴＧ
Ｒ３９Ａと命名した。配列番号：５で表されるアミノ酸
配列においては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列
の第９番目のＡｓｐがＧｌｕに置換されている。配列番
号：６で表される塩基配列においては、配列番号：２で
表される塩基配列の第２７番目のＣがＡに置換されてい
る。ｈＴＧＲ３９Ａの疎水性プロット図を図２に示す。
【０１１５】実施例３ ＴＧＲ３９のヒト組織における発現分布解析 ＴＧＲ３９のヒト組織における発現分布解析はTaqMan P
CR法を用いることにより調べた。鋳型としては、Human
Multiple Tissue cDNA Panel（クロンテック社）を用
い、PCR用プライマーとしてプライマー１（配列番号：
８）及びプライマー２（配列番号：９）を、また配列番
号：１０で表される塩基配列を有するプローブを使用し
てTaqMan PCRを行った。該反応における反応液組成は、
TaqMan Universal PCR Master Mix（アプライドバイオ
システムズジャパン）を12.5μl、10μM のプライマー
１とプライマー２を各0.5μl、5μMのプローブを1μl、
鋳型を2μl、蒸留水を8.5μlの合計25μlであり、ＰＣ
Ｒ反応は、50℃・２分、95℃・10分保持した後、95℃・
15秒、60℃・1分のサイクルを40回繰り返した。得られ
た結果を基にcDNA 1μl当たりのコピー数として算出し
た結果を図３に示す。これよりＴＧＲ３９の発現量は、
心臓で高く発現していることがわかった。
【０１１６】
【発明の効果】本発明のＧタンパク質共役型レセプター
タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、該
レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコード
するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび
それらの誘導体）は、リガンドの決定、抗体および
抗血清の入手、組換え型レセプタータンパク質の発現
系の構築、同発現系を用いたレセプター結合アッセイ
系の開発と医薬品候補化合物（アゴニスト、アンタゴニ
ストなど）のスクリーニング、構造的に類似したリガ
ンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザイ
ンの実施、遺伝子診断におけるプローブやＰＣＲプラ
イマーの作成のための試薬、トランスジェニック動物
の作製または遺伝子予防・治療剤等の医薬等として用
いることができる。
【０１１７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel G Protein-Coupled Receptor Protein and its DNA <130> P02-0070 <150> JP2001-193399 <151> 2001-06-26 <150> JP2001-311880 <151> 2001-10-09 <160> 10 <210> 1 <211> 300 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Ala Ser Ala Arg Gly Arg Val Asp Ser Pro Glu Leu Ser Gly Pro 5 10 15 Cys Phe Pro Ser Ala Gly Arg Lys Arg Arg Arg Gly Leu Leu Ala Asn 20 25 30 Ser Ser Leu Gly Asn Gly Ser Glu Asn Thr Ser Pro Ala Arg Ser Pro 35 40 45 Arg Ser Leu His Gly Leu Asp Gly Val Ala Gly Ala Val Arg Ala Pro 50 55 60 Ala Leu Gln Ala Leu Ile Ala Gly Ala Tyr Trp Ala Leu Cys Ala Val 65 70 75 80 Gly Leu Val Gly Asn Val Leu Val Leu Val Arg Val Arg Ser Gln Gln 85 90 95 Trp Arg Arg His Trp Leu Leu Asn Cys Phe Leu Leu Asn Leu Ala Ala 100 105 110 Thr Asp Leu Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Thr 115 120 125 Val Arg Asp Phe Ser Trp Pro Phe Gly Gly Ala Ile Cys Lys Val Met 130 135 140 Leu Thr Leu Thr Val Pro Asn Met Tyr Ala Ser Ile Phe Leu Phe Ser 145 150 155 160 Ala Met Ser Val Ala Arg Tyr Cys Ile Val Thr Gly Ala Leu Pro Pro 165 170 175 Ser His Arg Gly Ala Ser Arg Ala Ser Cys Val Cys Cys Leu Leu Trp 180 185 190 Ala Met Ala Val Leu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Leu Phe Ala Thr Ala 195 200 205 Ala Arg Val Gly Gly Asn His Ser Cys Leu Leu Arg Phe Pro Ala Gly 210 215 220 Gly Pro Lys Trp Gln Val Leu Tyr His Leu Gln Lys Ile Ala Val Ala 225 230 235 240 Phe Val Leu Pro Leu Ala Thr Leu Gly Thr Cys Ser Leu Leu Leu Arg 245 250 255 Phe Leu Arg Leu Trp Cys Ala Arg Trp Pro Ser Arg Val Arg Arg Arg 260 265 270 Leu Arg Ser Arg Val Thr Cys Ala Leu Ala Cys Val Leu Leu Ala Phe 275 280 285 Val Leu Cys Trp Leu Pro Ser Gln Ala Phe Thr Leu 290 295 300 <210> 2 <211> 900 <212> DNA <213> Human <400> 2 atggcatccg ccagaggcag ggtcgactcg ccggagctgt ctgggccgtg cttcccttca 60 gctggccgga agaggcgtcg ggggctgctc gctaacagct ccctgggcaa cggatcagag 120 aacactagcc cggcccggag tccccgcagc ctgcatggcc tggacggggt ggcgggggcc 180 gtccgggcgc cggcgctgca ggcgctgatt gcgggcgcct actgggccct gtgcgctgta 240 ggcctggtgg gcaacgtgct ggtgctagtc cgggtgaggt cccagcagtg gcgccgccac 300 tggctgctca attgcttcct cctcaacctg gcagccactg acctgcagtt tgtgctaacg 360 ctgccctttt gggccgtgga cacggtgcgc gactttagct ggcccttcgg gggtgccatc 420 tgcaaggtga tgctgacgct caccgtgccc aacatgtatg ccagcatctt cctcttcagt 480 gccatgagcg tggcacgcta ttgcattgtg actggcgcgc tgcctccgag ccatcggggc 540 gcatcacggg ccagctgtgt gtgctgcctg ctctgggcta tggccgtcct ggctacggcg 600 cccaccgccc tgttcgccac ggcagctagg gtggggggaa atcactcgtg cctgctgcgc 660 ttccccgccg gcggccccaa atggcaggtg ctctaccacc tgcagaagat cgcagtagcc 720 ttcgtgctgc cgctggccac gctgggcacc tgttcgctgc tgctgcgctt cctgcgactg 780 tggtgcgcac gctggccgtc gagggtcagg cgccgactgc gttcccgagt cacctgtgcg 840 ctggcctgcg tgctactggc cttcgtgctc tgctggctgc ccagccaagc gttcacactc 900 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding TGR39 <400> 3 gtcgacatgg catccgccag aggcagggtc g 31 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding TGR39 and hTGR39A <400> 4 tactagttca gagtgtgaac gcttggctgg gc 32 <210> 5 <211> 300 <212> PRT <213> Human <400> 5 Met Ala Ser Ala Arg Gly Arg Val Glu Ser Pro Glu Leu Ser Gly Pro 5 10 15 Cys Phe Pro Ser Ala Gly Arg Lys Arg Arg Arg Gly Leu Leu Ala Asn 20 25 30 Ser Ser Leu Gly Asn Gly Ser Glu Asn Thr Ser Pro Ala Arg Ser Pro 35 40 45 Arg Ser Leu His Gly Leu Asp Gly Val Ala Gly Ala Val Arg Ala Pro 50 55 60 Ala Leu Gln Ala Leu Ile Ala Gly Ala Tyr Trp Ala Leu Cys Ala Val 65 70 75 80 Gly Leu Val Gly Asn Val Leu Val Leu Val Arg Val Arg Ser Gln Gln 85 90 95 Trp Arg Arg His Trp Leu Leu Asn Cys Phe Leu Leu Asn Leu Ala Ala 100 105 110 Thr Asp Leu Gln Phe Val Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Thr 115 120 125 Val Arg Asp Phe Ser Trp Pro Phe Gly Gly Ala Ile Cys Lys Val Met 130 135 140 Leu Thr Leu Thr Val Pro Asn Met Tyr Ala Ser Ile Phe Leu Phe Ser 145 150 155 160 Ala Met Ser Val Ala Arg Tyr Cys Ile Val Thr Gly Ala Leu Pro Pro 165 170 175 Ser His Arg Gly Ala Ser Arg Ala Ser Cys Val Cys Cys Leu Leu Trp 180 185 190 Ala Met Ala Val Leu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Leu Phe Ala Thr Ala 195 200 205 Ala Arg Val Gly Gly Asn His Ser Cys Leu Leu Arg Phe Pro Ala Gly 210 215 220 Gly Pro Lys Trp Gln Val Leu Tyr His Leu Gln Lys Ile Ala Val Ala 225 230 235 240 Phe Val Leu Pro Leu Ala Thr Leu Gly Thr Cys Ser Leu Leu Leu Arg 245 250 255 Phe Leu Arg Leu Trp Cys Ala Arg Trp Pro Ser Arg Val Arg Arg Arg 260 265 270 Leu Arg Ser Arg Val Thr Cys Ala Leu Ala Cys Val Leu Leu Ala Phe 275 280 285 Val Leu Cys Trp Leu Pro Ser Gln Ala Phe Thr Leu 290 295 300 <210> 6 <211> 900 <212> DNA <213> Human <400> 6 atggcatccg ccagaggcag ggtcgaatcg ccggagctgt ctgggccgtg cttcccttca 60 gctggccgga agaggcgtcg ggggctgctc gctaacagct ccctgggcaa cggatcagag 120 aacactagcc cggcccggag tccccgcagc ctgcatggcc tggacggggt ggcgggggcc 180 gtccgggcgc cggcgctgca ggcgctgatt gcgggcgcct actgggccct gtgcgctgta 240 ggcctggtgg gcaacgtgct ggtgctagtc cgggtgaggt cccagcagtg gcgccgccac 300 tggctgctca attgcttcct cctcaacctg gcagccactg acctgcagtt tgtgctaacg 360 ctgccctttt gggccgtgga cacggtgcgc gactttagct ggcccttcgg gggtgccatc 420 tgcaaggtga tgctgacgct caccgtgccc aacatgtatg ccagcatctt cctcttcagt 480 gccatgagcg tggcacgcta ttgcattgtg actggcgcgc tgcctccgag ccatcggggc 540 gcatcacggg ccagctgtgt gtgctgcctg ctctgggcta tggccgtcct ggctacggcg 600 cccaccgccc tgttcgccac ggcagctagg gtggggggaa atcactcgtg cctgctgcgc 660 ttccccgccg gcggccccaa atggcaggtg ctctaccacc tgcagaagat cgcagtagcc 720 ttcgtgctgc cgctggccac gctgggcacc tgttcgctgc tgctgcgctt cctgcgactg 780 tggtgcgcac gctggccgtc gagggtcagg cgccgactgc gttcccgagt cacctgtgcg 840 ctggcctgcg tgctactggc cttcgtgctc tgctggctgc ccagccaagc gttcacactc 900 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding hTGR39A <400> 7 gtcgacatgg catccgccag aggcagggt 29 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 tcttcctctt cagtgccatg a 21 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ctcggaggca gcgcg 15 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 10 cgtggcacgc tattgcattg tgactg 26
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＴＧＲ３９の疎水性プロット図である。
【図２】 ｈＴＧＲ３９Ａの疎水性プロット図である。
【図３】 ＴＧＲ３９の発現分布図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８４ 9/00 25/00 ４Ｃ０８５ 25/00 25/28 ４Ｈ０４５ 25/28 29/00 29/00 35/00 35/00 37/00 37/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (72)発明者 新谷 靖 大阪府豊中市西緑丘２丁目９番１−501号 (72)発明者 宮嶋 伸行 茨城県つくば市吾妻４丁目16−４ プレビ ュー吾妻403 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA09 CA12 DA02 DA06 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ53 QR32 QR38 QR55 QR82 QS25 QS34 QS38 QX01 4B064 AG20 CA02 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA16 MA17 MA23 MA35 MA37 MA38 MA52 MA55 NA14 ZA022 ZA362 ZA662 ZB072 ZB112 ZB352 ZC412 ZC422 4C085 AA14 AA15 BB11 CC22 CC23 EE01 GG01 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA75 DA86 EA21 EA22 EA23 EA25 EA27 EA28 EA50 FA71 FA74

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：５で表されるアミノ酸配列と
    同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するこ
    とを特徴とするＧタンパク質共役型レセプタータンパク
    質またはその塩。
  2. 【請求項２】 配列番号：５で表されるアミノ酸配列を
    含有する請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプター
    タンパク質またはその塩。
  3. 【請求項３】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列を
    含有する請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプター
    タンパク質またはその塩。
  4. 【請求項４】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レセ
    プタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
  5. 【請求項５】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レセ
    プタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有
    するポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 ＤＮＡである請求項５記載のポリヌクレ
    オチド。
  7. 【請求項７】 配列番号：２または配列番号：６で表さ
    れる塩基配列を含有する請求項６記載のポリヌクレオチ
    ド。
  8. 【請求項８】 請求項５記載のポリヌクレオチドを含有
    する組換えベクター。
  9. 【請求項９】 請求項８記載の組換えベクターで形質転
    換させた形質転換体。
  10. 【請求項１０】請求項９記載の形質転換体を培養し、請
    求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質
    を生成せしめることを特徴とする請求項１記載のＧタン
    パク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の製造
    法。
  11. 【請求項１１】請求項１記載のＧタンパク質共役型レセ
    プタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチド
    またはそれらの塩に対する抗体。
  12. 【請求項１２】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和
    抗体である請求項１１記載の抗体。
  13. 【請求項１３】 請求項１１記載の抗体を含有してなる
    診断薬。
  14. 【請求項１４】 請求項１１記載の抗体を含有してなる
    医薬。
  15. 【請求項１５】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を用いることにより得られうる請求
    項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質ま
    たはその塩に対するリガンド。
  16. 【請求項１６】 請求項１５記載のＧタンパク質共役型
    レセプタータンパク質のリガンドを含有してなる医薬。
  17. 【請求項１７】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする請求項１
    記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質または
    その塩に対するリガンドの決定方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を用いることを特徴とするリガンド
    と請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパ
    ク質またはその塩との結合性を変化させる化合物または
    その塩のスクリーニング方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１記載のＧタンパク質共役型レ
    セプタータンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチ
    ドまたはそれらの塩を含有することを特徴とするリガン
    ドと請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータン
    パク質またはその塩との結合性を変化させる化合物また
    はその塩のスクリーニング用キット。
  20. 【請求項２０】 請求項１８記載のスクリーニング方法
    または請求項１９記載のスクリーニング用キットを用い
    て得られうるリガンドと請求項１記載のＧタンパク質共
    役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変
    化させる化合物またはその塩。
  21. 【請求項２１】 請求項２０記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
  22. 【請求項２２】 請求項５記載のポリヌクレオチドとハ
    イストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
    ヌクレオチド。
  23. 【請求項２３】 請求項５記載のポリヌクレオチドと相
    補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオ
    チド。
  24. 【請求項２４】 請求項５記載のポリヌクレオチドまた
    はその一部を用いることを特徴とする請求項１記載のＧ
    タンパク質共役型レセプタータンパク質のｍＲＮＡの定
    量方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１１記載の抗体を用いることを
    特徴とする請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタ
    ータンパク質の定量方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２４または請求項２５記載の定
    量方法を用いることを特徴とする請求項１記載のＧタン
    パク質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断方
    法。
  27. 【請求項２７】 請求項２４記載の定量方法を用いるこ
    とを特徴とする請求項１記載のＧタンパク質共役型レセ
    プタータンパク質の発現量を変化させる化合物またはそ
    の塩のスクリーニング方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２５記載の定量方法を用いるこ
    とを特徴とする細胞膜における請求項１記載のＧタンパ
    ク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる化合物
    またはその塩のスクリーニング方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２７記載のスクリーニング方法
    を用いて得られうる請求項１記載のＧタンパク質共役型
    レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物また
    はその塩。
  30. 【請求項３０】 請求項２８記載のスクリーニング方法
    を用いて得られうる細胞膜における請求項１記載のＧタ
    ンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる化
    合物またはその塩。
  31. 【請求項３１】 請求項２９記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
  32. 【請求項３２】 請求項３０記載の化合物またはその塩
    を含有してなる医薬。
  33. 【請求項３３】 中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、
    癌、代謝性疾患、免疫系疾患または消化器系疾患の予防
    ・治療剤である請求項２１、３１または３２記載の医
    薬。
  34. 【請求項３４】 哺乳動物に対して、請求項１８記載の
    スクリーニング方法または請求項１９記載のスクリーニ
    ング用キットを用いて得られうるリガンドと請求項１記
    載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ
    の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の有効
    量を投与することを特徴とする中枢疾患、炎症性疾患、
    循環器疾患、癌、代謝性疾患、免疫系疾患または消化器
    系疾患の予防・治療方法。
  35. 【請求項３５】 哺乳動物に対して、請求項２７記載の
    スクリーニング方法を用いて得られうる請求項１記載の
    Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量を変
    化させる化合物またはその塩の有効量を投与することを
    特徴とする中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、癌、代
    謝性疾患、免疫系疾患または消化器系疾患の予防・治療
    方法。
  36. 【請求項３６】 哺乳動物に対して、請求項２８記載の
    スクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜における
    請求項１記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク
    質量を変化させる化合物またはその塩の有効量を投与す
    ることを特徴とする中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾
    患、癌、代謝性疾患、免疫系疾患または消化器系疾患の
    予防・治療方法。
  37. 【請求項３７】 中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、
    癌、代謝性疾患、免疫系疾患または消化器系疾患の予防
    ・治療剤を製造するための請求項１８記載のスクリーニ
    ング方法または請求項１９記載のスクリーニング用キッ
    トを用いて得られうるリガンドと請求項１記載のＧタン
    パク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結
    合性を変化させる化合物またはその塩の使用。
  38. 【請求項３８】 中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、
    癌、代謝性疾患、免疫系疾患または消化器系疾患の予防
    ・治療剤を製造するための請求項２７記載のスクリーニ
    ング方法を用いて得られうる請求項１記載のＧタンパク
    質共役型レセプタータンパク質の発現量を変化させる化
    合物またはその塩の使用。
  39. 【請求項３９】 中枢疾患、炎症性疾患、循環器疾患、
    癌、代謝性疾患、免疫系疾患または消化器系疾患の予防
    ・治療剤を製造するための請求項２８記載のスクリーニ
    ング方法を用いて得られうる細胞膜における請求項１記
    載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化
    させる化合物またはその塩の使用。
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