JP2003192702A - 溶液安定性低アミロースタピオカ澱粉およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は低アミロースタピオカ澱粉に関する。こうした
澱粉は、凍結−融解安定性、および通常のタピオカ澱粉
と類似の鎖長分布を含む優れた溶液安定性を有する。本
澱粉は、化学的化工の有無のいずれの場合でも、多様な
食品、医薬品、および産業用途において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、凍解安定性を含む
良好な溶液安定性を示す低アミロースタピオカ澱粉に関
する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】澱粉
は、一般に、２種類のポリマー、本質的に直鎖であるア
ミロースと有枝のアミロペクチンを含有する。通常のタ
ピオカ澱粉は約２０〜２３％のアミロースを含有し、残
りの部分はアミロペクチンである。低アミロースタピオ
カ澱粉は通常のタピオカ澱粉よりも有意に高いレベルの
アミロペクチンを含有し、その結果として、産業用途に
おいて異なる機能性をもたらす各種の特性を示す。

【０００３】産業界の要望する必要性に合致させるた
め、通常のタピオカ澱粉は、多くの場合、機能特性を変
更するために産業界に公知の多くの技術によって化工さ
れる。特に、化工は、多くの場合、水性分散液中の耐加
工性および安定性を増大するために行われる。

【０００４】一つの一般的なタイプの化工は架橋であ
る。天然タピオカ澱粉の水性分散液を熱する場合、澱粉
顆粒は膨潤し始め、分散液は系として風味のよさを与え
ると共にとろみをつけるのに重要であるさくさくした軟
膏様の感触を生ずる。しかし、天然の澱粉を蒸煮する工
程の間に、この感触の状態は、急速に、弾力性のあるゴ
ム状態に変化し、その状態において膨潤した顆粒が破裂
する。蒸煮する時間、温度、および濃度、ならびに剪断
およびｐＨにおける小さな変動は、この変質に影響を及
ぼすために十分なものである。架橋は、顆粒をそのまま
に保持しておこうとする水素結合を強化することにより
顆粒を強化するように作用し、その結果、膨潤した澱粉
顆粒の取扱いおよび加工状態に対する過剰な感受性を克
服するために用いられる。

【０００５】架橋した澱粉の水性分散液は、多くの場
合、比較的低温度での長期の貯蔵、および／または時々
凍結および融解の反復サイクルにさらすことを含む条件
下において用いられる。例えば、澱粉分散液は、缶詰お
よび冷凍食品、特に果実の食用部品、パイ、およびスー
プなどの多くの製品中に用いられる。缶詰食品の場合に
おいて、これらは、多くの場合、加熱設備を全く持たな
い倉庫中に貯蔵され、従って、長期間にわたって極めて
低い温度にあることがあり、出荷の間は凍っていること
があり得る。冷凍食品も、極めて低い温度での長期間の
貯蔵および流通中における凍結および融解を受ける。低
温度への暴露を含むこうした状況下においては、こうし
た食品中に存在する澱粉の水和力の明確な損失があり、
それによって離漿、液の押出し、および食品の感触、色
および透明度における著しい劣化をもたらす。

【０００６】これらの課題を克服するための試みは当業
界で公知であり、種々の化学誘導体化反応、例えば、澱
粉を単官能試薬と反応させてヒドロキシプロピル基、リ
ン酸塩、アセテートまたはスクシネート基などの置換基
を導入することによる澱粉分子上への保護基の導入を含
む。こうした置換基は、分子間または同じ分子の部分間
の結合を妨害し、その結果、特に低温での貯蔵時に置換
された澱粉がそれらの水和能力、透明度、およびさくさ
くした、なめらかな感触を損失する傾向を減少させるこ
とにより、澱粉を安定化させる。

【０００７】これらの誘導体化反応はそれらの低温安定
性を改善するために単独で天然澱粉に対して行うことが
可能であるが、しかし、低いまたは氷点下の気温にさら
される場合に食品がその透明度および生地を失わないよ
うに保護する、缶詰にされたパイの詰め物およびレトル
トプディング菓子などにおける増粘剤として使用するた
めの澱粉を得るために、しばしば架橋と組み合わせられ
る。

【０００８】低アミロースまたはワキシーコーン澱粉は
当業界で周知であり、通常の澱粉に対して改善された溶
液安定性を有する。しかし、ワキシートウモロコシ澱粉
のゾルは、それらが氷点下の気温かその近辺の温度にお
ける貯蔵の間に分子間結合する傾向があるとしても、通
常の澱粉のそれらよりも安定性に優れている。

【０００９】近年、化工澱粉のすべての特性を有する
が、しかし極めて低いレベルの化学的処理における、ま
たは化学処理の全くない澱粉を開発する傾向があり続け
ている。例えば、架橋したワキシー澱粉（Ｗｕｒｚｂｕ
ｒｇ，米国特許第３，５２５，６７２号）および天然ワ
キシートウモロコシ澱粉（ＥＰ第５７４７２１号）を酵
素により加水分解するためにβ−アミラーゼを用いるこ
とにより、澱粉の低温安定性を増大するための試みがな
されてきた。こうした加水分解は澱粉分子の最も外側の
ａ−鎖を短縮化するかまたは除去する。従って、これら
分岐鎖の部分上への結合の可能性は減少し、低いまたは
氷点下の気温にさらされる間、食品の離漿およびゲル化
の有意な減少をもたらす。

【００１０】同型接合性の劣性ｓｕ₂ワキシートウモロ
コシ植物体から抽出される澱粉に関しても研究がなされ
た。この天然の短いβ−分岐澱粉が優れた凍結−融解安
定性を有することが見出された（Ｗｕｒｚｂｕｒｇ、米
国特許第４，４２８，９７２号およびＮａｇｌｅ、米国
特許第５，９５４，８８３号を参照すること）。しか
し、タピオカ澱粉は、トウモロコシ澱粉と比べて低タン
パク質含量および口当りのよい風味を含むその特性のせ
いで、多くの産業用途において望ましいものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】驚くことに、低アミロー
スタピオカ澱粉が凍結−融解安定性を含む優れた溶液安
定性を有し、なお通常のタピオカ澱粉に類似の鎖長分布
を保持することが、今、見出されてきている。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明は低アミロースタピオカ澱
粉に関する。こうした澱粉は凍結−融解安定性を含む優
れた溶液安定性を有し、通常のタピオカ澱粉のそれに類
似の鎖長分布を有する。澱粉は、化学的な化工の有無の
いずれかで、多様な食品、医薬品、および産業用途にお
いて有用である。

【００１３】本明細書において用いられる溶液安定性
は、澱粉ゾルまたは澱粉を含有する組成物の、粘度およ
び溶液透明度を含む、物理的特性が、一般に、時間およ
び温度の初めから終わりまで変化しないままで残ること
を意味することを意図し、低温および凍結−融解安定性
を含む。本明細書において用いられる低温および凍結−
融解安定性は、澱粉のゾルがこうした温度を通してのサ
イクル化を含む、低いまたは氷点下の気温にさらされる
間、その物理的特性を維持すること、特に、澱粉の水和
力に明確な損失が全くなく、離漿が全くなく、感触、色
および透明度に著しい劣化が全くないことを意味するこ
とを意図している。

【００１４】本発明は低アミロースタピオカ澱粉に関す
る。こうした澱粉は凍結−融解安定性を含む優れた溶液
安定性を有し、通常のタピオカ澱粉のそれに類似の鎖長
分布を有する。澱粉は、化学的化工の有無のいずれか
で、多様な食品、医薬品、および産業用途において有用
である。

【００１５】本明細書において用いられる低アミロース
タピオカは、通常のタピオカ澱粉に比べて有意により少
ないアミロース、特に、約１０質量％未満、さらに特定
すると約５質量％未満、最も特定すると約３質量％未満
のアミロースを含有することを意味することを意図して
いる。

【００１６】低アミロースタピオカ澱粉は、本明細書に
おいてその全体を参照により包含する米国特許出願第０
９／８３２，６２６号の方法により得ることが可能であ
る。

【００１７】本発明にまた含まれるものは、天然に見出
されるか、標準的な育種および交雑育種技術により、ま
たは転座、逆位、形質転換、またはそれらの変形を含む
遺伝子または染色体工学のあらゆる他の方法により得る
ことが可能である低アミロースキャッサバ植物体に由来
し、それによって本発明の澱粉の特性が得られる低アミ
ロースタピオカ澱粉である。加えて、人工的な突然変異
体および公知の突然変異育種標準法により生産すること
が可能である上述の属の変異体から成長した植物から抽
出される澱粉も、本明細書において用い得る。

【００１８】実質的に純粋な澱粉は、低アミロースキャ
ッサバ植物体の根から抽出することが可能である。抽出
は、根を粉砕し水抽出により残留成分から澱粉を分離す
ることに限定されないがそれを含む、当業界で公知のあ
らゆる方法によることが可能である。

【００１９】得られる天然澱粉は、多くの用途において
独特であり望ましい特性および機能を有する。こうした
天然澱粉は、化学的な化工なしで望ましい機能を達成す
るこという付加的な利益を有する。しかし、本澱粉は、
また、さらにそれらの特性および機能を強化するために
化工することが可能である。当業界で公知のあらゆる化
工は、化学的、物理的または酵素的であるものを含み、
用いることが可能である。

【００２０】化学的誘導体化は、ヒドロキシアルキルエ
ーテル、アセテート、リン酸塩、スクシネート、すなわ
ちオクテニルスクシネート、第３および第４アミンエー
テル、などのエーテル、エステルまたは半エステルを形
成するもの、または当業界で公知のあらゆる他の化工技
術によるものを含むことが好ましい。

【００２１】本澱粉の好ましい化学的化工は架橋であ
る。食品系用のエピクロルヒドリン、直鎖ジカルボン酸
無水物、クエン酸アクロレイン、オキシ塩化リン、アジ
ピン酸／酢酸混合酸無水物、およびトリメタリン酸塩、
および非食品系におけるエピクロルヒドリン、直鎖ジカ
ルボン酸無水物、クエン酸アクロレイン、オキシ塩化リ
ン、アジピン酸／酢酸混合酸無水物、トリメタリン酸
塩、ホルムアルデヒド、塩化シアヌル、ジイソシアネー
ト、およびジビニルスルホンに限定されないがそれらを
含む当業界で公知のあらゆる架橋剤は、この目的のため
に用いることが可能である。架橋反応は、当業界で公知
の技術、例えば、米国特許第２，３２８，５３７号およ
び第２，８０１，２４２号に記載されているものを用い
て行われる。澱粉を化工するための手順は、Ｒ．Ｌ．Ｄ
ａｖｉｄｓｏｎ編、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｗａｔ
ｅｒ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｕｍｓ ａｎｄ Ｒｅｓｉｎ
ｓ」（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ、ＮＹ、１９８０）第２２〜２６及び第２２〜４
７頁、Ｍ．Ｗ．Ｒｕｔｅｎｂｅｒｇによる章「Ｓｔａｒ
ｃｈ ａｎｄ ｉｔｓ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」に
記載されている。

【００２２】適する製品を与えるために必要な架橋剤の
量は、澱粉の所望の機能に依存する。架橋によりこうし
た機能を得るための方法は当業界で周知であり、とりわ
け用いられる架橋剤のタイプ、架橋剤の濃度、反応条
件、および架橋化澱粉を有するための必要性に依存して
変わる。一般に、この量は澱粉の約０．００１質量％〜
約１０．０質量％の範囲にある。

【００２３】本澱粉はＷＯ第９５／０４０８２号（１９
９５年２月９日公開）に記載されている熱抑制、または
剪断によるような物理的に化工することが可能である。

【００２４】本澱粉は、また、限定するものではなく、
アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、グルコア
ミラーゼ、マルトゲナーゼ、およびプルラナーゼを含む
当業界で公知の１種以上の酵素により、酵素的に化工す
ることが可能である。

【００２５】澱粉はアルファ化することが可能である。
アルファ澱粉を調製するための代表的な方法は、米国特
許第４，２８０，８５１号（Ｐｉｔｃｈｏｎ他）、米国
特許第４，４６５，７０２号（Ｅａｓｔｍａｎ他）、米
国特許第５，０３７，９２９号（Ｒａｊａｇｏｐａｌａ
ｎ）、米国特許第５，１３１，９５３号（Ｋａｓｉｃａ
他）、および米国特許第５，１４９，７９９号（Ｒｕｂ
ｅｎｓ）に記載されている。澱粉をアルファ化するため
の従来の手順は、当業者には周知であり、Ｒ．Ｌ．Ｗｈ
ｉｓｔｌｅｒ ａｎｄ Ｅ．Ｆ．Ｐａｓｃｈａｌｌ編、
「Ｓｔａｒｃｈ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ．」Ｖｏｌ．ＩＩＩ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ、第ＸＸＩＩ章−『Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎ
ｉｚｅｄ Ｓｔａｒｃｈ』（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９６７）などの論文に記載
されている。

【００２６】澱粉は転化されて、酸化、特にα−アミラ
ーゼによる酵素転化、酸加水分解、または熱および／ま
たは酸デキストリン化により調製される、とりわけ流動
性または低粘性変性澱粉を生産することも可能である。

【００２７】本澱粉は、当業界で公知のあらゆる方法に
より精製して、澱粉本来のまたは澱粉化工工程の間に作
り出される不快な匂いおよび色を除去することが可能で
ある。本澱粉を処理するために選択される精製方法は、
カジカ（Ｋａｓｉｃａ）らにより１９９２年２月７日出
願の米国特許出願第０７／８３２，８３８号中に開示さ
れている。顆粒またはアルファ形態のいずれかにおける
使用のために意図された澱粉用のアルカリ洗浄技術も有
用であり、米国特許第５，１８７，２７２号（Ｂｅｒｔ
ａｌａｎ他）により代表される特許系列に記載されてい
る。

【００２８】当業者は、所望の澱粉特性および機能を得
るために、あらゆる単一のまたは組み合わせた化工を用
いることが可能である。これらの方法は当業界で周知で
あり、得られる澱粉特性および機能は、とりわけ、用い
られる化工の型、化工の程度、および反応条件に応じて
変化する。例えば、酸化プロピレンを用いる安定化とオ
キシ塩化リンを用いる架橋の組み合わせは、通常のタピ
オカ澱粉での同じ化工よりも少なくとも約５℃低い糊化
開始温度を有する化工された低アミロースタピオカ澱粉
を生成する。

【００２９】本澱粉の低温および凍結−融解安定性を含
む溶液安定性は、ワキシートウモロコシ澱粉または通常
のタピオカ澱粉のそれと比べて有意により良好である。
後の実施例手順において記載される凍結−融解安定性試
験を用いて、本澱粉は一般的なワキシートウモロコシ澱
粉および通常のタピオカ澱粉に対する０〜１回に比べて
平均３〜４回のサイクルに対しても安定性を保持したま
まであることが見出された。これは、澱粉含有組成物が
氷点下の気温を含む比較的低い温度での長期貯蔵、およ
び／または反復する凍結−融解サイクルへの暴露を受け
る多様な用途において重要である。これは、多様な食
品、特にパイ、およびスープなどの缶詰および冷凍食品
を含む。こうした用途における本澱粉の使用は、食品が
離漿および製品の感触、色および透明度の著しい劣化を
遅らせることによりそれらの品質を保持することを可能
とする。

【００３０】本澱粉の良好な低温および凍結−融解安定
性は、通常のタピオカ澱粉と同様であるその鎖長分布か
ら見て、特に驚くべきものである。こうした改善された
安定性を有するこれまでに発見された澱粉は、ブルツブ
ルグ（Ｗｕｒｚｂｕｒｇ）（米国特許第３，５２５，６
７２号）により記載されている酵素的に加水分解された
澱粉、およびブルツブルグ（米国特許第４，４２８，９
７２号）により記載されているシュガリ（sugary）−２
対立遺伝子に同型接合であるワキシートウモロコシ澱粉
などの短いａ−鎖を有した。

【００３１】本澱粉は、従来の天然のまたは化学的に化
工された澱粉（複数を含む）に対する直接の置換品とし
て多様な製品において用いることができる。低アミロー
スタピオカ澱粉は、一般に、あらゆる望ましいレベルで
用いることが可能であり、量は得ようとする機能に依存
する。一般的に、低アミロースタピオカ澱粉は、約１質
量％〜約９５質量％、特定すると約５質量％〜約６０質
量％、さらに特定すると約１０質量％〜約４０質量％の
量において用いられる。澱粉は、従来用いられた澱粉と
同じやり方で、直接組成物に、または澱粉含有スラリー
またはゾルを組成物に添加することによるかのいずれか
で添加することが可能である。

【００３２】本発明の低アミロースタピオカ澱粉は、限
定するものではなく、紙製品、食品、医薬品および栄養
剤、パーソナルケア製品および他の産業製品、特に食品
を含む多様な産業用途において用いることが可能であ
る。

【００３３】紙製品は、限定するものではなく、紙、板
紙、ライナー板紙、段ボール、厚紙、袋、および封筒を
含むことを意味する。

【００３４】医薬品および栄養剤は、結合剤、崩壊剤、
および希釈剤などの医薬品賦形剤、発泡錠、粉化澱粉お
よび粉剤を含む錠剤、および前生物的製品を含むことを
意味する。

【００３５】パーソナルケア製品は、限定するものでは
なく、脱臭剤および制汗剤、スプレー、ゲル、ムース、
ローションおよびポマードを含む整髪剤、石鹸および清
浄剤、アイシャドー、パウダー、ファンデーションおよ
びブラッシャーを含む化粧品、シャンプーおよびクリー
ム、およびうがい薬、息清新剤（breath freshener）お
よび歯磨き粉を含むことを意味する。

【００３６】他の産業製品は、限定するものでなく、洗
剤およびルースフィル（loosefill）、シートおよび造
形品（shapes）を含む生分解性発泡製品を含むことを意
味する。

【００３７】食品は、あらゆる食用製品を意味すること
を意図しており、限定するものでなく、シリアル、パン
およびパン製品、チーズおよび代用チーズ製品、香辛
料、菓子、注げるドレッシングおよびスプーンで取り扱
えるドレッシングを含むドレッシング、フルーツおよび
クリーム詰め物を含むパイ詰め物、ホワイトソースおよ
びチーズソースなどの乳製品系ソース、グレービー、代
用および低カロリーシロップ剤、プディング菓子、カス
タード、ヨーグルト、サワークリーム、パスタ、乳製品
系飲料を含む飲料、グラッセ、スープおよびベビーフー
ドを含む。

【００３８】さらに、食品は、レトルト、無菌充填包
装、冷蔵および冷凍に限定されないがそれらを含む種々
の加工および貯蔵条件を受ける食品を含むことを意味す
る。

【００３９】本澱粉は、また、焼いた後のより柔らか
い、よりしっとりしたパンの中身、および貯蔵期間後の
より新鮮な感触および外観を持つ製品を提供する、堅化
防止剤として、化学的におよび／または酵母発酵された
ベーカリー製品において用いることが可能である。本澱
粉は、堅化防止剤として用いられる場合、パン生地の全
体澱粉質含量の約３％〜約１５％に代えて置換される。

【００４０】澱粉は、一般に、澱粉をその最終用途に応
じてあらゆる適する割合にある水と混合することにより
食品組成物に添加され、混合物は所望のように加熱調理
される。澱粉が冷水膨潤性であるように化工される場
合、次に加熱調理することは不要である。あらびき穀
物、ひき割りトウモロコシおよびひき割り穀粉などの粉
末またはあらゆる粉末化植物製品は、澱粉の代わりに用
いることが可能である。

【００４１】他の態様 以下の態様は本発明をさらに説明するために提供され、
いかなる点からも限定するものとして取られるべきもの
ではない。 １． 通常のタピオカ澱粉に対して改善された溶液安定
性を有する低アミロースタピオカ澱粉。 ２． 水と有効量の天然の低アミロースタピオカ澱粉と
のスラリーを形成し、必要によりスラリーを蒸煮して、
ゾルを形成することを含む、天然の低アミロースタピオ
カ澱粉によりゾルを作成する方法であって、該ゾルは天
然のタピオカ澱粉により調製されるゾルよりも少なくと
も１回多い凍結−融解サイクルに耐えることができるも
のである前記方法。 ３． ゾルが天然のタピオカ澱粉で調製されたゾルより
も少なくとも３回多い凍結−融解サイクルに耐えること
ができる態様２の方法。 ４． ゾルが天然のタピオカ澱粉で調製されたゾルより
も少なくとも４回多い凍結−融解サイクルに耐えること
ができる態様２の方法。 ５． 前記タピオカ澱粉が化学的に、物理的に、または
酵素的に化工され、ゾルが同じ方法で同じ程度に化工さ
れたタピオカ澱粉で調製されたゾルよりも少なくとも１
回多い凍結−融解サイクルに耐えることができる、態様
２の方法。 ６． 前記澱粉が置換基を含有するように誘導体化さ
れ、かつ架橋されている態様２の方法。 ７． 態様２の方法により生成されるゾル。 ８． 組成物中の少なくとも一部のタピオカ澱粉を低ア
ミロースタピオカ澱粉成分で置換することを含む、改善
したタピオカ澱粉を含む組成物。 ９． 組成物が、紙製品、食品、医薬品、栄養剤、およ
びパーソナルケア製品からなる群から選択される態様８
の組成物。 １０． 食品が天然のタピオカ澱粉で調製された食品製
品よりも少なくとも１回多い凍結−融解サイクルに耐え
ることができる、天然の低アミロースタピオカ澱粉およ
び水を含む食品。 ９． 澱粉が架橋されている態様１０の食品。 １０． 澱粉が置換基を含有するように誘導体化されて
いる態様１０の食品。 １１． 澱粉が置換基を含有するように誘導され、かつ
架橋されている態様１０の食品。 １２． 食品がドレッシング、パイ詰め物、フルーツ食
用部分、ソース、グレービィ、シロップ剤、プディング
菓子、カスタード、ヨーグルト、飲料、グラッセ、スー
プおよびベビーフードからなる群から選択される態様１
０の食品。 １３． 食品が溶液安定性を示すと共に、食品が天然の
タピオカ澱粉で調製される食品よりも少なくとも１回多
い凍結−融解サイクルに耐えることができる、水と態様
１に記載の澱粉の有効量を混合し、とろみのある食品製
品を生成するために混合物を蒸煮することを含むとろみ
のある食品を調製するための方法。

【００４２】

【実施例】以下の実施例は、本発明をさらに解説し説明
するために提供され、いかなる点においても限定するも
のとして取られるべきではない。用いられるすべての百
分率は質量／質量ベースである。以下の実施例におい
て、用いたタピオカ試料は以下の通りである：タピオカ
＝ナショナル・スターチ アンド ケミカル（Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ）（米国、ニュージャージー州、ブリッ
ジウオーター）から市販されている通常のタピオカ澱
粉、ＬＡＴＳ＝アンチセンス態様でＧＢＳＳ酵素を導入
し、キャッサバ植物体が再生されるＦＥＣフレオム（fr
eom）を用いることにより、遺伝的に生産される低アミ
ロースタピオカ澱粉。

【００４３】ＦＥＣの始動 ＦＥＣを得るための手順は図１に概説される。それは初
代胚の誘発により始まる。初代胚を２段階手順において
形成する。第１段階において、胚の開始のために、塩お
よびビタミン（好ましくはＭｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ
Ｓｋｏｏｇ（１９６２）を参照すること）、炭水化物
源（例えば、２０ｇ／ｌ 蔗糖）およびオーキシン（例
えば、１〜８ｍｇ／ｌ ピクロラム、またはジカンバ
（dicamba）または２，４−Ｄ）により補完された培地
上で外植片を培養する。この初代培地上での１０〜１５
日後に、双極性魚雷型胚が形成される。魚雷型胚は明確
な胚軸および子葉原生を保有する。魚雷型胚を持つ外植
片のステップ２培地（オーキシンなしで最終的にサイト
カイニンの添加を伴うことを除きステップ１と同じ培
地）への移転後、魚雷型胚は成熟していく。成熟胚は大
きな緑の子葉を保有する。

【００４４】接合体胚（Ｓｔａｍｐ ａｎｄ Ｈｅｎｓ
ｈａｗ １９８２；Ｋｏｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９
４）、若葉外植片または頂端分裂組織（Ｓｔａｍｐ ａ
ｎｄＨｅｎｓｈａｗ、１９８７ａ；Ｓｚａｂａｄｏｓ
他、１９８７；Ｍｒｏｇｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｓｃｏｃ
ｃｈｉ、１９９３；Ｒａｅｍａｋｅｒｓ １９９３ａ；
Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ他、１９９５）および花組
織（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ、１９９５、Ｗｏｏｄｗａｒｄ
ａｎｄ Ｐｕｏｎｔｉ−Ｋａｅｒｌａｓ，２００１）
は、初代胚を得るために用いることができる。このよう
にして、多くの各種遺伝子型について初代胚を形成する
ためのそれらの能力を評価した。このプロトコルにおい
て、固体培地上でしか培養後初代不定胚は形成されず、
液体培地中の培養後には決して形成されなかった。さら
に、不定胚（初代）は、オーキシンピクロラム、ジカン
バまたは２，４−Ｄが用いられる場合にのみ認められ、
ＩＡＡ，ＩＢＡまたはＮＡＡの場合には見られなかっ
た。

【００４５】現在用いているプロトコルにおいて、培養
外植片当りに形成される成熟胚の数において遺伝子型に
よる変動がある。遺伝子型Ｍ．Ｃｏ１１５０５、Ｍ．Ｃ
ｏ１２２およびガディング（Ｇａｄｉｎｇ）は、培養葉
外植片当り成熟胚（ＭＥ／ＣＬＥ）の最高の数を与え
た。しかし、形成された成熟胚の数は低い。Ｍ．Ｃｏ１
２２において、生体外成長植物体から単離され、４ｍｇ
／ｌの２，４−Ｄによりステップ１培地上で培養された
最大２２％の葉外植片は、最大数０．８のＭＥ／ＣＬＥ
を持つＭＥを形成した。８ｍｇ／ｌの２，４−Ｄによる
ステップ１培地上で、最大４９％の葉外植片は、最大数
３．５のＭＥ／ＣＬＥを持つＭＥを形成した。より高い
２，４−Ｄ濃度はさらに外植片の胚形成能力を改善する
ことはなかった。

【００４６】初代不定胚を生成する葉外植片の能力を改
善するための試みにおいて、ドナー植物体は各種条件下
で成長した。各種の光管理体制（８、１２、１６または
２４時間）下での生体外ドナー植物体の成長は、胚形成
反応に対する影響を全く持たなかった。しかし、光強度
の減少は正の効果を有した。最善の結果は８μＥｍ^-2ｓ
^-1で成長したドナー植物体から単離され、ステップ１培
地上で培養された葉外植片により得られた。

【００４７】他の研究者達は、ある種の遺伝子型におい
て、ジカンバ（１〜６６ｍｇ／ｌ）およびピクロラム
（１〜１２ｍｇ／ｌ）は初代胚分化を誘発するために
２，４−Ｄよりも優れている（Ｎｇ １９９２；Ｓｕｄ
ａｒｍｏｎｏｗａｔｉ ａｎｄＨｅｎｓｈａｗ、１９９
３；Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｈｅｎｓｈａｗ，１９９
３）ことを示してきた。マシュース（Ｍａｔｈｅｗｓ）
ら（１９９３）は、ステップ１培地での１５日後の外植
片を０．５％ 活性炭で補完された成長調整因子なしの
培地に移すことにより、遺伝子型Ｍ．Ｃｏ１１５０５に
おける初代胚分化の効率を改善した。この培地上で、成
熟は改善され、結果として成熟胚の数は制御中の０．４
から３、４ＭＥ／ＣＬＥに増大した。最善の結果は、ド
ナー植物体が２，４−Ｄまたはピクロラムまたはジカン
バとしてのオーキシンにより前処理される場合に得られ
た。このために植物体を液体ＭＳ２０培地中で成長さ
せ、成長１２日後にオーキシン（最終濃度８ｍｇ／ｌ）
を供給した。２日後、葉外植片をドナー植物体から単離
し、８ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、ピクロラムまたはジカン
バによりステップ１培地上で培養した。クローンＭ．Ｃ
ｏ１２２において、これは９．４ＭＥ／ＣＬＥの生成を
もたらした。これは、３．５ＭＥ／ＣＬＥが生成される
Ｈ₂Ｏ処理制御植物体におけるよりも有意に高かった
（表３）。

【００４８】オーキシン前処理の一般的な適用性をいく
つかの異なる遺伝子型に関して試験した。ドナー植物体
の前処理なしでは、二つの遺伝子型がＭＥをしかも低頻
度で形成した。ドナー植物体の前処理後は、ほとんどす
べての遺伝子型の葉外植片がＭＥを形成した。

【００４９】最終的に、我々は２８の試験遺伝子型の内
２４から成熟初代不定胚を得ることができた（表１、Ｔ
ＭＳ３０２２１、ＴＭＳ３０００１、ＴＭＳ３０５７２
およびＳａｏ Ｐａｏｌｏを除く）。これらのデータ
は、キャッサバ中のほとんどすべての遺伝子型が不定胚
分化を起こすことができることを示唆し、今まで、６０
を超える遺伝子型においてそれらが初代不定胚分化を起
こすことができることを示してきた（Ｔｈｒｏ他、１９
９９）。

【００５０】接合体胚および葉から誘導される初代不定
胚は、二次胚を創始するための外植片として用いられて
きた（Ｓｔａｍｐ ａｎｄ Ｈｅｎｓｈａｗ，１９８７
ｂ；Ｓｚａｂａｄｏｓ他、１９８７；Ｍａｔｈｅｗｓ
他、１９９３；Ｒａｅｍａｋｅｒｓ他、１９９３ｂｃ；
Ｌｕｏｎｇ他、１９９５）。オーキシン補完培地上の不
定胚の連続培養は、不定胚分化のサイクルシステムをも
たらした。二次胚形成のための不定胚を継代培養する方
法は、胚形成組織の形態に影響を及ぼすと思われた。暗
所で培地を含有する固形物２，４Ｄ上に月１回再培養さ
れた不定胚の塊は、古い胚の頂部に形成される指様の胚
分化組織に発達した。胚は魚雷型の段階を通らなかっ
た。

【００５１】さらなる発達は、胚の塊を光の中でステッ
プ２培地に移す場合に起きた（Ｓｚａｂａｄｏｓ １９
８７）。通常、成熟不定胚を光の中ステップ１培地中で
培養し、２０日後に外植片を成熟化のためにステップ２
培地に移した。この系において、成熟に向けて発達して
いる胚および大きなグリーンの子葉を持つ成熟胚は不定
胚分化の新サイクルを始動するために用い、一方で、他
の系において魚雷型胚を二次不定胚分化の新サイクルを
始動するために用いた。

【００５２】成熟胚増殖のこの系について、表１に列挙
される遺伝子型中の１４２０において試験を行った。大
部分の遺伝子型の中でほんのわずかの成熟初代胚だけが
利用可能であるという事実にも拘わらず、一つを除くす
べての遺伝子型が、２，４−Ｄ補完培地上での培養後、
初代不定胚分化に対して観察される極めて高い頻度での
新しい成熟胚を生成した（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ他、１９
９３ｂ、ｃ、２０００、２００１、Ｓｏｆｉａｒｉ他、
１９９６）。１年を超える期間にわたり成熟胚の通常の
継代培養により胚分化を維持した（Ｓｚａｂａｄｏｓ
他、１９８７；Ｍａｔｈｅｗｓ他、１９９３；Ｒａｅｍ
ａｋｅｒｓ、１９９３）。

【００５３】新しい不定胚は液体中および固体培地上の
両方で形成された。すべての遺伝子型において、液体培
地中の方が固体培地中よりも一層多くの胚が形成され、
二次不定胚分化の新サイクル始動前の胚の分裂は全体胚
に対して生産量を増大させることが観察された。例えば
Ｍ．Ｃｏ１２２において、固体培地上で培養された胚は
培養胚当り８胚を生産したが、一方で、液体培地中で培
養された胚は培養胚当り３２胚を生産した（Ｒａｅｍａ
ｋｅｒｓ他、１９９３ｃ）。２，４−Ｄ、ピクロラムお
よびジカンバのみならずＮＡＡも二次胚分化を誘発する
能力を有した。ＩＢＡおよびＩＡＡは二次胚分化を誘発
しなかった。ＮＡＡはアディラ（Ａｄｉｒａ）１、アデ
ィラ４、ガディング、ライン１１、Ｍ．Ｃｏ１２２、
Ｍ．Ｃｏ１１５０５、ＴＭＳ９０８５３およびガディン
グ中で良好に用いることができた（Ｓｏｆｉａｒｉ，１
９９６）。一般に、より多くの成熟胚が、２，４−Ｄ、
ピクロラムまたはジカンバを補完した培地中よりもＮＡ
Ａ補完培地中で生産された。さらに、ＮＡＡ誘発胚の発
達は、２，４−Ｄ、ピクロラムまたはジカンバによるも
のよりも一層速い。培養期間の短縮化は、特に、大規模
の運転の場合に有利な効果をもたらす。

【００５４】組織学的に、２，４Ｄにより新規に誘発さ
れた二次胚は外植片に対して垂直に付着するが、一方
で、ＮＡＡによるそれらは水平に付着した。

【００５５】一部の科学者達は、なお、キャッサバのあ
る種の遺伝子型における不定胚分化培養を得る点におい
て課題を抱えている（Ｍｒｏｇｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓ
ｃｏｃｃｈｉ、１９９２；Ｔａｙｌｏｒ他、１９９２；
Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ他、１９９５；Ｓｕｄａｒ
ｍｏｎｏｗａｔｉ ａｎｄ Ｂａｃｈｔｉａｒ、１９９
５）。主要な課題は、初代外植片からの胚形成組織が得
られることではなく、むしろ二次胚分化によるこの組織
の大規模な増殖の方である。この目的のために、魚雷型
胚かまたは成熟胚のいずれかから成る組織を用いること
ができる。魚雷型胚の増殖は高度に遺伝子型依存であ
り、一方、成熟胚の増殖は遺伝子型に対して大部分は独
立的である（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ，１９９３）。初代お
よび二次不定胚分化は両方とも両極構造を持つ珠芽の形
成を特徴とする。これらの両極性魚雷型胚は、すでに、
オーキシン補完ステップ１培地上に形成されている。従
って、テーラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（１９９５）は、定
期組織化胚分化を提案した。組織化細胞は、特徴的な統
一全体物を形成する組織および器官を有する活性分割細
胞の群として定義される（Ｗａｌｋｅｒ，１９８９）。

【００５６】不定胚分化の組織化のより少ないタイプ
は、テーラーら（１９９５）により開発された。連続選
択により、１０ｍｇ／ｌ ピクロラム（Ｐｉｃｌｏｒａ
ｍ）（ＧＤ２）で補完されたグレスホフおよびドイ（Ｇ
ｒｅｓｓｈｏｆｆ ａｎｄ Ｄｏｙ）（１９７２）培地
塩およびビタミン上で培養された組織化胚形成組織を、
次第に組織化のより少ない組織に転換した。この組織
は、極めてもろい（前−）球形の胚のカルス様塊から成
った。従って、この組織はもろい胚形成カルス（ＦＥ
Ｃ）と呼ばれた。ＦＥＣ中の細胞は、連続的に、それら
が群制御から離脱する状態にあり、その理由により、そ
れらは統一構造物中には組織化されない。ＦＥＣは、グ
レスホフおよびドイ（１９７２）ビタミンおよび塩、７
ｇ／ｌ ダイチン（Ｄａｉｃｈｉｎ）寒天、２０ｇ／ｌ
蔗糖および１０ｍｇ／ｌ ピクロラム（固形ＧＤ２）
からなる培地上で維持される。３週間毎に、もろい胚を
上述の培地上で継代培養した。液体懸濁液培養を始動す
るために、０．５ｇのもろい胚を、シェンクおよびヒル
デブラント（Ｓｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａ
ｎｄｔ）（１９７２）塩およびビタミン、６０ｇ／ｌ
蔗糖および１０ｍｇ／ｌピクロラム（液体ＳＨ６）によ
り補完された５０ｍｌの液体培地を有する２００ｍｌフ
ラスコ中に移した。培地を２〜７日毎に更新し、１４日
後に、各フラスコの内容物を５個の新しいフラスコに分
割した。オートクレーブ処理をする前にｐＨを５．７に
調節した。増殖室の温度は３０℃、光周期は１２時間、
放射照度は４０μモルｍ^-2ｓ^-1であった。６％（ｗ／
ｖ）蔗糖および１０ｍｇ／ｌ ピクロラム（ＳＨ６）に
より補完されたシェンクおよびヒルデブラント（１９７
２）培地中においてＦＥＣを培養することにより、懸濁
液培養を始動した。２〜３日毎にこの培地を更新した。

【００５７】培養物を高度にもろい状態に保持するため
に、ＦＥＣは２ヶ月に１回篩をかけねばならない。実際
に、１ｍｍ²メッシュの篩を通過するＦＥＣ部分は継代
培養用に用いられる。

【００５８】ＦＥＣは、ＧＤ２培地上またはＳＨ６培地
中に魚雷型胚を形成することはほとんどない。魚雷型お
よび続く成熟胚は、ＦＥＣが成熟化培地上で培養される
場合に形成される。成熟化培地はムラシゲおよびスクー
グ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）（１９
６２）塩およびビタミン，および１ｍｇ／ｌ ピクロラ
ムから成る。この成熟化培地を３週間毎に更新した。

【００５９】成熟胚は、２，４−Ｄ、ピクロラム、ジカ
ンバまたはＮＡＡにより補完されたＭＳ２０培地上に培
養することにより二次不定胚分化中に誘導することがで
きた。初代および二次不定胚分化は幅広い遺伝子型で確
立するには比較的容易である（表１を参照すること）
が、一方でＦＥＣはここ暫くの間２〜３の遺伝子型に限
定される。このシステムをより多い遺伝子型に適用可能
とするためにはさらなる研究が必要とされるけれども、
不定胚分化および形質転換の新システムに対するＦＥＣ
への期待は有望なものである。この方法に本質的なもの
は、高品質の組織化された組織の利用可能性およびＦＥ
Ｃに転換するこの組織の能力である。テーラーら（１９
９５）はＦＥＣを始動するために魚雷型状態で増殖され
る「組織化された胚分化組織を用いた」。この場合に、
２段階（組織化された組織の始動および非組織化組織へ
の転換）は、良好なＦＥＣの始動に決定的なものであ
る。両方の段階は遺伝子型依存である。組織化された組
織がラマカース（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ）（１９９３）に
より記載されているような成熟状態で増殖される場合、
次に、ＦＥＣに転換するこの組織の能力のみがＦＥＣを
始動するための決定的な段階である。組織化された組織
が出発材料として用いることができるかどうかは、検討
課題として残ったままである。組織化された組織を用い
ることができない場合、次に、この組織は、それがＦＥ
Ｃを始動するために用いる前に、最初に成熟状態で増殖
させることが好ましい。これは、高密度で外植片を培養
するか、またはサイクル持続時間を減少させるかのいず
れかにより容易に達成される。

【００６０】ＦＥＣ系統は、Ｒ６０、Ｒ９０、Ｍ７、Ｔ
ＭＳ６０４４４およびアディラ４（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ
他、２０００、２００１）において得られてきた。ＦＥ
Ｃからの植物体再生はＲ６０、Ｒ９０、Ｍ７、ＴＭＳ６
０４４４およびアディラ４（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ他、２
０００，２００１）において達成されてきた。テーラー
ら（２０００）は、遺伝子型系統２、Ｍ．ｃｏｌｌ５０
５、ＴＭＳ９０８５３、カタオリ（Ｋａｔａｏｌｉ）お
よびボノウア・ルージュ（Ｂｏｎｏｕａ Ｒｏｕｇｅ）
においてＦＥＣ系統を得てきた。

【００６１】プロトプラストからの植物体の再生 プロトプラストの単離 プロトプラスト単離のために、固体ＧＤ２上または液体
ＳＨ６中に培養された両方のＦＥＣを用いることができ
る。しかし、プロトプラストの最高収率は液体ＳＨ６中
で１〜３週間にわたり培養されたＦＥＣから得られた。

【００６２】２グラムのＦＥＣを１０ｍｌの細胞壁消化
溶液を含有するペトリ皿（φ９ｃｍ）中においた。細胞
壁消化溶液は細胞壁分解酵素の混合物から成った；１０
ｍｇ／ｌ ペクトリアーゼ、１０ｇ／ｌ セルロース、
２００ｍｇ／ｌ マセロ酵素成長調整剤（ＮＡＡ １ｍ
ｇ／ｌ、２，４−Ｄ １ｍｇ／ｌ、ゼアチン １ｍｇ／
ｌ）；主要な塩（３６８ｍｇ／ｌ ＣａＣｌ₂、３４ｍ
ｇ／ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、７４０ｍｇ／ＫＮＯ₃、４９２ｍ
ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）；小量の塩（１９．２ｍ
ｇ／ｌ ＮＡ−ＥＤＴＡ；１４ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ）およびオスモチカム（９１ｇ／ｌ Ｄ−マン
ニトール）および０．５ｇ／ｌ ＭＥＳ。細胞壁分解酵
素セルラーゼ（１〜１０ｇ／ｌ）マセロザイム（２００
ｍｇ／ｌ）の組み合わせは、プロトプラスト単離に対し
て良好であった。ペクトリアーゼ（０．００１〜０．０
１ｇ／ｌ）の追加および／またはドリセラーゼ（０．０
２ｇ／ｌ）はプロトプラストの収率を増大させる。１８
時間の培養後、１０ｍｌの洗浄用培地を溶液に添加し
た。浸透圧モル濃度０．５３０ｍＯｓｍ／ｋｇの洗浄用
培地は、主要な塩（細胞壁消化溶液を参照すること）、
４５．５ｇ／ｌ マンニトールおよび７．３ｇ／ｌ Ｎ
ａＣｌから成った。消化された組織を、７３μＭ孔径の
濾過器（ＰＡ５５／３４ナイボルト（Ｎｙｂｏｌｔ）−
スイス）を通して２５０ｍｌビーカーグラス中に入れ
た。濾過液を２個の１２ｍｌ円錐ネジ蓋管中に等しく分
割し、６００ｒｐｍで３分間遠心分離した（ミストラル
（Ｍｉｓｔｒａｌ）２０００）。上清の除去後、洗浄手
順をもう一度繰り返した。プロトプラスト溶液を、主要
および小量の塩（細胞壁消化溶液を参照すること）およ
び１０５ｇ／ｌ 蔗糖を含有する９．５ｍｌ溶液上に浮
かせることにより再懸濁した。ｐＨは５．８、浸透圧モ
ル濃度は０．６５０ｍＯｓｍであった。プロトプラスト
を持つ溶液を放置して５分間にわたり平衡化させてか
ら、０．５ｍｌの洗浄用培地を静かに頂部に添加した。
７００ｒｐｍでの１５分間にわたる遠心分離（ミストラ
ル２０００）後、プロトプラストは蔗糖と洗浄用培地間
のバンドに集中した。プロトプラスト層をパスツールピ
ペットにより採取し、収率を標準血球計算板槽の中で計
算した。

【００６３】プロトプラスト培養 プロトプラストを、１０ｍｌの同じ液体培地を含有する
ペトリ皿中にアガロース０．２％ｗ／ｖ（Ｄｏｎｓ ｅ
ｎ Ｂｏｕｗｅｒ，１９８６）を入れて固体化させた培
地において培養した。以下の培地はマイクロカルスの形
成をもたらした： −オーキシンのみ（０．１〜１０ｍｇ／ｌ ＮＡＡまた
は０．１〜１０ｍｇ／ｌ ピクロラム、または０．１〜
１０ｍｇ／ｌ ＩＡＡ、または０．１〜１０ｍｇ／ｌ
２，４−Ｄ、または０．１〜１０ｍｇ／ｌ ジカンバま
たは０．１〜１０ｍｇ／ｌ、または０．１〜１０ｍｇ／
ｌ）またはオーキシンにプラスしてサイトカイニン
（０．０１〜１ｍｇ／ｌ ゼアチン、０．０１〜１ｍｇ
／ｌ ２−ｉＰ、０．０１〜１ｍｇ／ｌ ＢＡ、０．０
１〜１ｍｇ／ｌ ＴＤＺ、０．０１〜１ｍｇ／ｌ カイ
ネチン）により補完されたＴＭ２Ｇ培地（Ｗｏｌｔｅｒ
ｓ他、１９９１）、 −オーキシンのみ（０．１〜１０ｍｇ／ｌ ＮＡＡまた
は０．１〜１０ｍｇ／ｌ ピクロラム、または０．１
〜１０ｍｇ／ｌ ＩＡＡ、または０．１〜１０ｍｇ／ｌ
２，４−Ｄ、または０．１〜１０ｍｇ／ｌ ジカン
バ）またはプラスしてサイトカイニン（０．０１〜１ｍ
ｇ／ｌ ゼアチン、０．０１〜１ｍｇ／ｌ２−ｉＰ、
０．０１〜１ｍｇ／ｌ ＢＡ、０．０１〜１ｍｇ／ｌ
ＴＤＺ、０．０１〜１ｍｇ／ｌ カイネチン）により補
完された培地Ａ（ムラシゲおよびスクーグ（１９６２）
塩およびビタミン、４．５ｇ／ｌ ミオ−イノシトー
ル、４．５５ｇ／ｌ マンニトール、３．８ｇ／ｌ キ
シリトール、４．５５ｇ／ｌソルビトール、０．０９８
ｇ／ｌ ＭＥＳ、４０ｍｇ／ｌ 硫酸アデニンおよび
１５０ｍｇ／ｌ カゼイン加水分解物、０．５ｍｇ／ｌ
ｄ−パントテン酸カルシウム、０．１ｍｇ／ｌ 塩化
コリン、０．５ｍｇ／ｌ アスコルビン酸、２．５ｍｇ
／ｌ ニコチン酸、１ｍｇ／ｌ ピリドキシン−ＨＣ
ｌ、１０ｍｇ／ｌチアミン−ＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｌ
葉酸、０．０５ｍｇ／ｌ ビオチン、０．５ｍｇ／ｌ
グリシン、０．１ｍｇ／ｌ Ｌ−システインおよび０．
２５ｍｇ／ｌ リボフラビンおよび５９．４０ｇ／ｌ
グルコース）。

【００６４】９ｍｌを新鮮培地と交換することにより、
培地を１０日毎に更新した。初代培地中の２ヶ月の培養
後、高品質ＦＥＣを選択し、さらなる増殖または成熟化
いずれかのために培養する。増殖のために、ＦＥＣを、
４０ｇ／ｌ 蔗糖、７ｇ／ｌダイチン寒天および２ｍｇ
／ｌ ピクロラム（ＧＤ４）により補完されたグレスホ
フおよびドイ（１９７４）培地に移した。３週間後、Ｆ
ＥＣを、２０ｇ／ｌ蔗糖、７ｇ／ｌ 寒天および１０ｍ
ｇ／ｌ ピクロラム（ＧＤ２）により補完されたグレス
ホフおよびドイ培地に移した。１．０ｇのＦＥＣを１０
ｍｇ／ｌピクロラムにより補完された液体ＳＨ６％培地
に移すことにより、懸濁液培養を始動した。２週間後に
初期充填細胞体積１．０ｍｌを有する新しいフラスコに
懸濁液を分割した。

【００６５】培養２ヶ月後、１０⁵／ｍｌの密度で０．
５ｍｇ／ｌ ＮＡＡおよび１ｍｇ／ｌ ゼアチンにより
補完されたＴＭ２Ｇ中で培養された１０⁴プロトプラス
トは１０５８マイクロ・カルス（ｃａｌｌｉ）を生産
し、一方１０⁶／ｍｌの密度で培養される１０⁴プロトプ
ラストはわずかに６４マイクロ・カルスしか生産しなか
った。

【００６６】ＴＭ２Ｇ培地を培地Ａに置き換えること
は、両方の密度でマイクロ・カルスの数を有意に減少さ
せた。この段階で、少なくとも３タイプのカルスを識別
することができた。一つのタイプは、１０⁶の密度で培
養されるプロトプラスト中に大部分が見られる球形形状
の胚から成っていた。それらの一部は子葉様構造、薄緑
色に発達した。しかし、これらの胚は適切に発芽するこ
とができなかった。別のタイプは急速に成長し、大きな
ぎっしり詰まったカルスからなり、それらは両方の密度
でのプロトプラスト培養液中に観察された。このカルス
は決して胚を発生しなかった。第三のタイプは極度にも
ろいカルスであり、両方の密度で観察された。２〜５×
１０⁵の密度で（培地ＴＭ２Ｇ）、約６０％のカルスは
もろく、胚分化性であった。ＦＥＣをさらなる増殖かま
たは成熟化のいずれかのために継代培養した。

【００６７】プロトプラストから誘導されたＦＥＣの増
殖 ＦＥＣの選択後、ＧＤ４プラス２ｍｇ／ｌ ピクロラム
で３週間にわたり培養した０．１ｇのそれは０．７ｇの
組織に増大した。組織の９５％を超える部分は高品質の
ＦＥＣから成った。続けて、この組織を１０ｍｇ／ｌ
ピクロラムで補完されたＧＤ２培地上での３週間の継代
培養により維持した。懸濁液培養を始動するために、Ｆ
ＥＣを液体培地に移した。この材料の充填細胞体積（Ｐ
ＣＶ）の増加は、当初の材料のそれよりもわずかに高か
った（データは示されない）。

【００６８】プロトプラストから誘導されたＦＥＣの成
熟化 胚の成熟化を誘発する試みにおいて、ＴＭ２Ｇ中での２
ヶ月の培養後単離されたＦＥＣを成熟化培地上で培養し
た。成熟化培地は以下から構成された：ムラシゲおよび
スクーグ（１９６２）塩およびビタミン、１０ｇ／ｌ
ダイチン寒天、０．１ｇ／ｌ ミオ−イノシトール、２
０ｇ／ｌ 蔗糖、１８．２ｇ／ｌ マンニトール、０．
４８ｇ／ｌ ＭＥＳ、０．１ｇ／ｌ カゼイン加水分解
物、０．０８ｇ／ｌ 硫酸アデニン、０．５ｍｇ／ｌ
ｄ−パントテン酸カルシウム、０．１ｍｇ／ｌ 塩化コ
リン、０．５ｍｇ／ｌ アスコルビン酸、２ｍｇ／ｌ
ニコチン酸、１ｍｇ／ｌ ピリドキシン−ＨＣｌ、１０
ｍｇ／ｌ チアミン−ＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｌ 葉
酸、０．０５ｍｇ／ｌ ビオチン、０．５ｍｇ／ｌグリ
シン、０．１ｍｇ／ｌ Ｌ−システイン、０．２５ｍｇ
／ｌ リボフラビンおよび１ｍｇ／ｌ ピクロラム。こ
の成熟化培地を３週間毎に更新した。

【００６９】この培地の時期に、増殖から成熟化への緩
やかな移行がある。結果として、液体成熟化培地中の２
週間の培養後、充填細胞体積は係数４の増加まで達し
た。固体成熟化培地に移行後、また、増殖がある。固体
培地上の２週間後、殆どの胚は球形状を呈するようにな
り、これら球形胚の内ほんのわずかだけがさらに発達し
た。初代魚雷型胚は固体成熟化培地上の１ヶ月の培養後
に見られるようになった。成熟および魚雷型胚の数は、
コロニー形成率に相関しないが初期培養プロトプラスト
の密度に相関した。こうした胚は、成長調節因子なしで
プロトプラストをＴＭ２Ｇ上で培養する場合には全く得
られない。成熟および魚雷型胚の最高の数は、０．５ｍ
ｇ／ｌ ＮＡＡおよび１ｍｇ／ｌ ゼアチンにより補完
されたＴＭ２Ｇ上で培養されるプロトプラストから形成
された。次に、ＮＡＡをピクロラムに代えた場合、魚雷
型および成熟胚の数は有意により低かった（表２）。試
験ピクロラム濃度の中では、２ｍｇ／ｌが最善の結果を
与えた。３ヶ月の培養後、アガロース１滴あたり６０〜
２００個の魚雷型および成熟胚を単離した。魚雷型胚
は、それらが新鮮成熟化培地上またはＭＳ２プラス０．
１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ上で培養される場合に、高頻度で成
熟した。

【００７０】プロトプラストから誘導された成熟胚の二
次不定胚分化および発芽 ほんのわずかの魚雷型胚だけが、１０ｍｇ／ｌ ＮＡＡ
または８ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄにより補完された液体中
または固体ＭＳ２培地上で培養される場合に、二次胚を
形成した（データは示されない）。成熟胚は二次胚分化
にはよりよい外植片であった。液体および固体の両方に
おいて、培地２，４−Ｄは、ＮＡＡに比べて二次胚分化
の誘発には優れていた。成熟胚を最初に２，４−Ｄで、
次に液体ＮＡＡ中で培養する場合、反応は２，４−Ｄ単
独の培養に匹敵した。また、２，４−Ｄの培地における
二次不定胚分化のサイクルを最初に受けた胚は、１０ｍ
ｇ／ｌ ＮＡＡにより補完されるＭＳ２０中において、
より高度に有効な二次胚を生み出した。

【００７１】オーキシン２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）またはナフタリン酢酸（ＮＡＡ）によ
り液体媒体中に誘発される周期的または二次不定胚の発
芽を比較した。すべての遺伝子型において、乾燥はＮＡ
Ａ誘発胚遺伝子の通常の発芽を刺激した。しかし、乾燥
された胚は、高頻度発芽のためにベンジタミノプリン
（ＢＡＰ）などのサイトカイニンで補完される培地を必
要とした。得られる芽生えの形態はＢＡＰの濃度に依存
した。１ｍｇ／ｌ ＢＡＰでは、厚くて短い主根および
短い節間の分岐した新芽を持つ植物体が形成された。
０．１ｍｇ／ｌ ＢＡＰでは、主根は薄くて細く、新芽
は一つまたは二つだけの頂端分裂組織を有した。胚が最
適に満たない条件で乾燥される場合、胚が出芽を刺激す
るために最適に乾燥される場合よりも一層高い濃度のＢ
ＡＰが必要とされた。また、暗所で培養された乾燥胚は
より低い濃度のＢＡＰを必要とし、さらに、これらの胚
は明所で培養される胚よりも一層速く出芽した。完全な
植物体は不定胚誘導の始動後４週間で得られた。２，４
−Ｄ誘導胚は異なる反応を示した。乾燥は、ただ一つの
遺伝子型においてのみ２，４−Ｄ誘導胚の出芽を強化す
るが、他の３遺伝子型においてはそうでなかった。すべ
ての遺伝子型において、乾燥は根形成を刺激した。暗所
で培養された胚は大部分不定根を形成し、一方で、明所
で培養された胚は大部分主根を形成した。

【００７２】遺伝子導入システム 過去何年間にわたり、シリコン繊維（Ｋａｅｐｐｌｅｒ
他、１９９０）、マイクロインジェクション（Ｄｅ Ｌ
ａａｔ ａｎｄ Ｂｌａａｓ、１９８７）および電気泳
動（Ｇｒｉｅｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｈａｍｍｏｎｄ、１
９９３）など、いくつかのＤＮＡを植物プロトプラスト
に導入する技術が開発されてきた。最も一般的に用いら
れ潜在的に適用可能なものは、アグロバクテリウム介在
遺伝子送達、マイクロ発射体／粒子衝撃およびプロトプ
ラスト電気穿孔である。

【００７３】アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（tumefaciens）ＤＮＡ送達システムは、最も一般的に
用いられる技術である。それは、おそらく、この方法に
よる植物におけるＤＮＡ送達の最初の発明に関係してい
る。当初、それはベンケイソウ科およびナス科、特にタ
バコに限定されていた。最近、アグロバクテリウム介在
形質転換の使用は劇的に変わってきており、単子葉植物
における限定の中でも、トウモロコシおよび米のような
最も重要な単子葉植物を含む広範囲な植物を形質転換す
ることが可能である（Ｗｏｒｄｒａｇｅｎ ａｎｄ Ｄ
ｏｎｓ、１９９２により概説されている）。

【００７４】キャッサバはアグロバクテリウムに対する
宿主であるが、それに対して高度に従順ではないことが
証明されてきた。

【００７５】キャッサバからのＦＥＣは、また、アグロ
バクテリウム・ツメファシエンスを介して効率的に形質
転換されてきた（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ他、２０００、Ｓ
ｃｈｒｅｕｄｅｒ他、２００１）。ラマカース（Ｒａｅ
ｍａｋｅｒｓ）ら（２０００）およびシュレーダー（Ｓ
ｃｈｒｅｕｄｅｒ）ら（２００１）により記載されてい
る方法は良好に用いられ、ＣａＭＶプロモーターの制御
下でアンチセンスｇｂｓｓを担持する遺伝子型アジラ４
およびＴＭＳ６０４４４４から遺伝子組み換え植物を生
産してきた。

【００７６】原則的に、プロトプラストはＤＮＡ送達の
ために最も理想的な外植片である。それらは、植物が発
生する多細胞コロニーを生み出す単一細胞として培養す
ることができる。プロトプラストから誘導される植物
は、一般に、発生はクローン性である。これは、遺伝子
導入植物におけるキメラ現象を排除するので、あらゆる
形質転換系にとって有用な手段を提供する。しかし、プ
ロトプラストの使用は、高度に種依存である再生系によ
り妨害される。形質転換のために、プロトプラストはＰ
ＥＧと共に用いられて、例えば、ロリウム・マルチフォ
ーム（Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍ、Ｐｏｔｒｙ
ｋｕｓ他、１９８５）およびトリチクム・モノコックム
（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｌｏｒｚ
他）において実証されたように、ＤＮＡが細胞質に入る
ことを可能とする可逆的な透過性を引き起こす原形質膜
を変更することができる。ＤＮＡに対する原形質膜およ
び細胞壁までの透過性を増大させるための別の技術は、
電気穿孔によるものである（再吟味のためにＪｏｎｅｓ
他、１９８７を参照すること）。この方法において、電
気パルスはＤＮＡが細胞に入ることを可能とする。米
は、プロトプラスト電気穿孔法から稔性の遺伝子導入植
物が得られた最初の穀物であった（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ
他、１９８９）。

【００７７】外部ＤＮＡを送達するための粒子衝撃また
はパーティクルガンの使用は、キャッサバ形質転換にお
ける代替法を提供する。粒子衝撃は、殆どあらゆる組織
における細胞中にＤＮＡを送達させることができる唯一
の手段である。この方法を用いて得られた最初の遺伝子
導入植物はタバコにおいてであった（Ｋｌｅｉｎ他、１
９８９）。粒子衝撃は、この成功した形質転換法に続い
て、アグロバクテリウム感染にそれほど従順ではない植
物、特に単子葉植物において広く用いられる。粒子（マ
イクロ発射体）を加速するためのいくつかのＤＮＡ送達
装置の改善は、最新のモデル、バイオリスティック（Ｂ
ｉｏｌｉｓｔｉｃ）（商標）ＰＤＳ−１０００（カリフ
ォルニア州、リッチモンド、バイオ−ラッド・ラボラト
リーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ））をもたらした。それらの装置は商業的に市販され
ているが、しかし、価格は現時点で比較的高い。ＤＮＡ
を被覆したタングステンまたは金は、一般的に、ＤＮＡ
を目標組織中に送達するためのマイクロ発射体として用
いられる（Ｓｏｎｇｓｔａｄ他、１９９５に概説されて
いる）。

【００７８】遺伝子組み換えにおいて用いられる選択お
よびレポーター遺伝子 形質転換細胞を識別することができるように、対象遺伝
子を選択可能な標識遺伝子に結合させる。この標識遺伝
子は形質転換細胞を選択するために必要である。選択は
形質転換細胞／組織の視覚的特性に基づくことができ
る。例はホタルから単離されるルシフェラーゼ遺伝子で
ある。この遺伝子を発現し基質（ルシフェリン）を供給
される植物細胞は、特定の装置により検出することがで
きる光を放出する（Ｏｗ他、１９８６）。形質転換組織
を選択するための別な方法は、抗生物質または除草剤に
対する耐性をコードする遺伝子の導入である（Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎ他、１９８７；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ他、１
９９０）。

【００７９】多くの抗生物質および除草剤は植物形質転
換における選択剤として用いられてきた。除草剤耐性穀
物由来のホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を遺伝子導入植
物の選択用に選択した（Ｃａｏ他、１９９０）。カリー
カ・パパイア（Ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａ、Ｆｉｔｃｈ
他、１９９４）、ヨーロッパ葡萄（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎ
ｉｆｅｒａ、Ｎａｋａｎｏ他、１９９４；Ｓｃｏｒｚａ
他、１９９５）、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓ他、１９
８８）および米（Ｃｈｅｎ他、１９８７）において、カ
ナマイシンおよび関連抗生物質（Ｆｒａｌｅｙ他、１９
８６）に耐性を与えるネオマイシン・ホスホトランスフ
ェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子を選択可能な標識として
用いた。

【００８０】キャッサバにおいてはすべての上述の選択
システムを用いることができるが、しかし、ＰＰＴ系の
選択は、それが成熟胚を形成しこのようにして植物再生
を増大させるＦＥＣ能力を改善するという利点を有す
る。

【００８１】以下の部分は、キャッサバ植物が、それら
の塊根中の高アミロペクチン含量を有するキャッサバ植
物を生産しようとする目的によって、いかに遺伝子的に
変性されるかを説明する。

【００８２】キャッサバｇｂｓｓ遺伝子の単離および植
物形質転換ベクターの構築 前の研究において、ジャガイモｇｂｓｓ遺伝子（Ｖｉｓ
ｓｅｒ他、１９８９）をプローブ（Ｓａｌｅｈｕｚｚａ
ｍａｎ他、１９９３）として用いてキャッサバからｇｂ
ｓｓ遺伝子を単離した。ジャガイモｇｂｓｓプロモータ
ー（Ｖｉｓｓｅｒ他、１９９１）とｐＵＣ１９中のノパ
リン・シンターゼ・ターミネータ間のアンチセンス方向
にｇｂｓｓ遺伝子をサブクローンし、ベクターｐＡＧ６
１（Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎ他、１９９３）をもたら
した。また、キャッサバからのタンパク質合成伸長因子
１−アルファ（Ｓｕｈａｎｄｏｎｅ他、２００１）、キ
ャッサバｇｂｓｓまたはＣａＭＶなどのもっと一般的な
プロモーターなどの他の好ましい塊根特異的プロモータ
ーは、ｇｂｓｓなどの遺伝子の直接発現に用いることが
できる。

【００８３】完全なルシフェラーゼ遺伝子（ＢｇＩＩＩ
断片）をｐＪＴ１００（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ他、１９９
３）から単離し、ｐＡＧ６１のＢａｍＨＩ部位中に挿入
した。これは二つの異なるベクターをもたらした：ｐＧ
ＢＳＳａｓ２およびｐＧＢＳＳａｓ７（二つのベクター
間の相違はルシフェラーゼおよびアンチセンスｇｂｓｓ
の互いに対する方向であった）。両方の構築物は良好に
用いられて高アミロペクチン含量を有するキャッサバ植
物体を生産した。

【００８４】用いた植物材料および組織培養培地 ムラシゲおよびスクーグ（１９６２）塩およびビタミ
ン、および４０ｇ／ｌ蔗糖（ＭＳ４）で補完された培地
上における一つの節切断による毎月１回の継代培養によ
り、遺伝子型ＴＭＳ６０４４４の植物体を維持した。も
ろい胚形成カルス（ＦＥＣ）系統を以下のように始動さ
せた： −ドナー植物体から分裂組織または未成熟葉を単離し、 −６ｍｇ／ｌ ＮＡＡおよび６ｍｇ／ｌ ピクロラムに
より補完されたＭＳ４０上で分裂組織／未成熟葉を培養
し、 −ぎっしり詰まった胚形成組織を単離し、グレスホフお
よびドイ（１９７４）塩およびビタミン、６０ｇ／ｌ
蔗糖および１０ｍｇ／ｌ ピクロラム（ＧＤ６）により
補完された培地上で培養し、 −ＧＤ６培地上で培養したＦＥＣ（凝集した球形単位の
小さな塊）を単離する。ＦＥＣをＧＤ６培地上での３週
間の継代培養により維持した。シェンクおよびヒルデブ
ランツ（１９７２）塩およびビタミン、６０ｇ／ｌ 蔗
糖および１０ｍｇ／ｌ ピクロラム（ＳＨ６）により補
完された５０ｍｌの液体培地を有する２００ｍｌフラス
コ中に０．５ｇのＦＥＣを移すことにより、液体培養を
始動した。培地を週に２回更新し、２週間後、各フラス
コの内容物を５個の新しいフラスコに分割した。フラス
コを１２０ｒｐｍでの回転式振とう培養機（ＬＡＢ−ラ
イン・インスツルメント（ＬＡＢ−ｌｉｎｅ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）モデル３５１９）を用いて
培養した。

【００８５】粒子上へのＤＮＡの被覆 ケイブ（Ｃａｂｅ）ら（１９８８）から調整された方法
を用いて粒子上にＤＮＡを被覆した。８０μｇのＤＮＡ
（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のウィザードＴＭマキシ
プレプスＤＮＡ精製システムを用いて、ベクターｐＧＢ
ＳＳａｓ２およびｐＧＢＳＳａｓ７から単離した）を、
１０ｍｇの金粒子（１．６μｍ、バイオラッド（Ｂｉｏ
Ｒａｄ））、３０μｌ ５Ｍ ＮａＣｌ、５μｌ ２Ｍ
トリスＨＣｌ ｐＨ８．０、９６５μＬ Ｈ₂Ｏ、１
００μｌ ２５％ＰＥＧ１５５０、１００μ ０．１
Ｍ スペルミジンおよび５０μｌ ２．５Ｍ ＣａＣｌ
₂と混合した。遠心分離後、ペレットを１０ｍｌの無水
アルコール中に再懸濁し、軽く超音波を当てた。マクロ
担体上に逆さまに置かれたマクロ担体ホルダーの穴の中
に、１６０μＬの懸濁液をピペットで取り上げた。５分
後、マクロ担体ホルダーを取り除いた。金ビーズの薄層
で覆われたマクロ担体をオーブン中で乾燥（１０分、４
０℃）し、衝撃放射用に用いた。

【００８６】ＦＥＣの衝撃放射および遺伝子導入植物の
選択 少なくとも５週間にわたり液体ＳＨ６培地中で培養され
たＦＥＣを篩（１ｍｍメッシュ）にかけ、収集した。１
００ｍｇのＦＥＣをＧＤ６培地上にうすく塗り、バイオ
ラッドＰＤＳ−１０００Ｈｅパーティクルガン装置（ヘ
リウム圧力 ７５８４ｋＰａ（１１００ｐｓｉ）、破裂
板とマクロ担体間の距離およびマクロ担体とストッパー
プレート間の距離０．５ｃｍ、ストッパープレートとＦ
ＥＣ間の距離５．０ｃｍ、６８．５８ｃｍ（２７イン
チ）Ｈｇ真空）を用いて放射した。

【００８７】ＴＭＳ６０４４４からのＦＥＣを有する計
２１２および１８４のペトリ皿中に、それぞれ構築物Ｇ
ＢＳＳａｓ２またはＧＢＳＳａｓ７を放射した。放射
後、放射されたＦＥＣを液体ＳＨ６培地で充填されたプ
ラスチックポット中で培養した。２週間後、ＦＥＣを固
形ＧＤ６培地上に集め、ルシフェラーゼ活性を検定し
た。それぞれのルシフェラーゼ（ＬＵＣ）スポットを個
別の系統として継代培養した。構築物ＧＢＳＳａｓ２で
は全部で１８６のＬＵＣスポットを生み出し、ＧＢＳＳ
ａｓ７では２２２であった。正確にどのＦＥＣ単位がＬ
ＵＣ活性を含有するかを位置づけ、遺伝子導入組織の損
失を避けることは可能でないので、ＬＵＣスポット周り
０．５〜１ｃｍ半径にある組織を液体ＳＨ６培地中に移
した。２週間後、ルシフェラーゼ活性を検定した。ルシ
フェラーゼ活性のない系統を捨て、４以上のスポットを
持つ系統を部分塊分割用に用いた。１〜３スポットを持
つ系統は再度液体ＳＨ６培地に戻し、２週間後、スポッ
トの数が４以上に増加した系統を部分塊分割用に用い
た；その他は捨てた。

【００８８】ｐＧＢＳＳａｓ２での放射からは４４系
統、ｐＧＢＳＳａｓ７での放射からは４０系統を得た。
遺伝子導入組織を単離し、部分塊分割（Ｒａｅｍａｋｅ
ｒｓ他、２０００）と呼ばれる方法を介して精製した。
部分塊分割をルシフェラーゼ陽性スポット周りの組織
（０．５〜１ｃｍ径）を継代培養することから始めた。
組織をＧＤ６培地上にできるだけ微細に分割した。２週
間後、ペトリ皿をＦＥＣ組織の小さな塊で覆った。ＬＵ
Ｃ陽性塊のみを継代培養した。このために、塊を部分塊
に分割し、ＧＤ６培地上で培養した。組織が植物再生用
に培養される前に、この選択手順をさらに１〜２回繰り
返した。このために、成熟化培地（１ｍｇ／ｌ ピクロ
ラムにより補完されたＭＳ４）上で１０〜１２週間にわ
たり２〜３週間毎に８４ＦＥＣ株を継代培養した。魚雷
型不定胚をＦＥＣから単離し、さらに成熟化を可能とす
る０．１ｍｇ／ｌ ＢＡＰにより補完されたＭＳ４上で
培養した。成熟不定胚を最初２週間にわたり液体中で、
以後固体発芽用培地（ＭＳ４＋１ｍｇ／ｌＢＡＰ）にお
いて培養した。植物体はＭＳ４培地上に根付いた。ＧＢ
ＳＳａｓ２培養系統４４から３１、およびＧＢＳＳａｓ
７培養系統４０から２７の植物体が得られた。これらの
植物体を最初に８％蔗糖で補完されたムラシゲおよびス
クーグ培地上で成長させて、キャッサバ植物体の茎の中
での澱粉の配置を可能とさせた（Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍ
ａｎ他、１９９４）。アミロース／アミロペクチン比を
ルゴール液（Ｉ２：ＫＩ）により生体外で肥厚させた茎
の断面のヨウ素染色によって視覚化した。染色された茎
断面を顕微鏡的に視覚化した。合計９系統（ＧＢＳＳａ
ｓ２から３、ＧＢＳＳａｓ７から６）において、変わっ
た染色パターンを持つ植物体が産生しており、このこと
は前記植物体が茎の中で変わった澱粉組成を有したこと
を意味する。これらの植物体を温室に移して塊根形成を
可能とした。３ヶ月後、根をはがし、貯蔵根の中心柱を
少量のＮａ₂Ｓ₂Ｏ₅を有する水の中で研究室ブレンダー
によって粉砕した。スラリーを澱粉単離のためにソナマ
ット（Ｓｏｎａｍａｔ）に移した。水−澱粉顆粒懸濁液
を遠心分離管に移し、遠心分離を行った。澱粉を２０℃
で３日間にわたり乾燥した。

【００８９】アミロペクチン／アミロース含量をホーベ
ンカンプ−ヘルメリンク（Ｈｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｈｅｒ
ｍｅｌｉｎｋ）ら（１９８８）により記載されているプ
ロトコルを用いて測定した。

【００９０】合計２系統（ＧＢＳＳａｓ２から１、ＧＢ
ＳＳａｓ７から１）において、両方の試験とも高アミロ
ペクチン含量を有する植物体が産生した。１年後、同じ
植物体を再度温室に移した。２系統の合計３０植物体の
澱粉をヨウ素染色および分光測光を介して分析した。す
べての澱粉は高アミロペクチン含量を持つ澱粉を有し
た。同時に３０００を超える植物体から澱粉を単離し
た。この澱粉を異なる３研究室で分析し、再度、澱粉は
高％アミロペクチンを含有することが示された。

【００９１】コーン＝ナショナル・スターチ アンド
ケミカル（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（米国、ニュージ
ャージー州、ブリッジウオーター）から市販されている
通常のコーンスターチ ワキシーコーン＝ナショナル・スターチ アンド ケミ
カル（米国、ニュージャージー州、ブリッジウオータ
ー）から市販されている低アミロースコーンスターチ ＡＭＦＰ＝アベベ（Ａｖｅｂｅ）Ｂ．Ａ．（オランダ、
フォックスホル）から市販されている低アミロースジャ
ガイモ澱粉 ワキシー米澱粉＝市販されている低アミロース米澱粉

【００９２】実施例を通して以下の手順を用いた：溶液
安定性試験−本澱粉の溶液安定性を示差走査クロマトグ
ラフィ（ＤＳＣ）による試験および澱粉ゾルにおける試
験の両方で試験した。 ａ．示差走査クロマトグラフィ−水：澱粉比２：１、加
熱速度１０℃／分で５℃〜１４０℃にかけて澱粉試料を
走査した。試料を４．４℃（４０°Ｆ）で７日間にわた
り貯蔵する。老化データは貯蔵した試料を再走査するこ
とにより得られる。２重に走査を行い、平均値を報告す
る。

【００９３】ｂ．澱粉ゾル−１００ｇの蒸留水と４滴の
赤色食品用着色剤をビーカー中に混合する。水分１２％
の７．５ｇの澱粉を塊がなくなるまで混合する。澱粉混
合物のレベルよりも水のレベルが上にくるように、ビー
カーを沸騰水中に置いた。混合物を一定に攪拌しながら
８７．８℃（１９０°Ｆ）に熱する。次に、ビーカーを
２６．７℃（８０°Ｆ）の温度まで冷却するまで、１
２．８℃（５５°Ｆ）の冷却浴中に置く。澱粉混合物
を、存在するあらゆる泡を除いて首の１．２７ｃｍ（１
／２インチ）以内まで２オンスガラスボトル中に注ぐ。
次に、試料を冷蔵す るかまたは凍結させる。 ｉ．低温安定性 試料を４．４℃（４０°Ｆ）で冷蔵する。それらを毎週
透明度および離漿について試験する。試料が不透明にな
るか、または水が表面上かまたは圧迫した時のいずれか
に現れる場合、試料はもはや安定とは考えられない。 ｉｉ．凍結−融解安定性 試料を−６．７℃（−２０°Ｆ）で１８時間にわたり凍
結し、２１．１℃（７０°Ｆ）で６時間にわたり融解
し、次に、透明度、感触、および離漿を吟味する。この
サイクルを試料がもはや安定でなくなるまで繰り返す。
試料が不透明になり、そのゲル化品質を失うか、または
水が表面上かまたは圧迫した時のいずれかに現れる場
合、試料はもはや安定とは考えられない。

【００９４】アミロース含量−アミロース含量を電位差
滴定により測定した。約０．５ｇの澱粉試料を１０ｍｌ
の濃縮塩化カルシウム（約３０質量％）中で３０分間に
わたり９５℃に熱した。試料を室温に冷却し、５ｍｌの
２．５％酢酸ウラニル溶液で希釈し、よく混合し、２０
００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。次に、試料を濾
過して透明な溶液を得た。

【００９５】１ｃｍ偏光計セルを用いて澱粉濃度を偏光
的に測定した。次に、試料の部分標本（通常５ｍｌ）
を、ＫＣｌ対照電極と共に白金電極を用いて電位を記録
しながら、直接標準０．０１ Ｎヨウ素溶液により滴定
した。変曲点に達するために必要なヨウ素の量を直接結
合ヨウ素として測定した。１．０グラムのアミロースが
２００ミリグラムのヨウ素と結合すると想定してアミロ
ースの量を計算した。

【００９６】アミロース含量をゲル透過クロマトグラフ
（ＧＰＣ）により確認した。５ｍＭの硝酸ナトリウムを
含有する４ｇのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に
４〜８ｍｇの澱粉をスラリー化し、２時間にわたり１０
０℃に熱することにより、試料を分析用に調製した。試
料を必要ならば濾過し、ＧＰＣ１５０Ｃクロマトグラフ
（マサチューセッツ州、アムハースト、ウオーターズ
（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に注入
（３００μｌ）した。ゲル透過クロマトグラフは４カラ
ム（ガードカラム、１０⁵、１０³、１０²ミクロン（公
称）孔径カラム、すべてマサチューセッツ州、アムハー
ストのポリマー・ラボラトリーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から）を用いた。移動相は５
ｍＭの硝酸ナトリウムを含有するジメチルスルホキシド
であった。計器を温度８０℃で操作し、流量０．７ｍｌ
／分を用いた。カラムは分子量５８００〜８５０，００
０の範囲でプルラン・スタンダード（日本、昭和電工
Ｋ．Ｋ．）により補正した。

【００９７】鎖長−２０ｍｇの澱粉を９０％ ＤＭＳＯ
（１０％水）２ｍｌに添加し、溶解するまで（９５℃
で）攪拌した。７．９８０ｍｌの５０ｍＭ 緩衝酢酸溶
液 ｐＨ４．８をガラスビンに添加し攪拌した。一部の
アミロースが溶液から沈殿することがある場合、溶液を
透明になるまで簡単に煮沸した。試料が完全に溶解した
場合すぐに、２０μｌの純粋なイソアミラーゼを添加し
た。ガラスビンを３８℃で１６時間にわたり恒温浴中で
インキュベートした。

【００９８】完結すると、パルス電流検波器（カリフォ
ルニア州、サニーベール、ジオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ
Ｃｏｒｐ））を備えた高性能アニオン交換クロマトグ
ラフィー（ＨＰＡＥＣ）により、鎖長分布を測定した。
ジオネックス・カーボパック（Ｃａｒｂｏｐａｃ）ＰＡ
−１００カラム（４×２５０ｍｍ）をカーボパックＰＡ
ガードカラム（３×２５ｍｍ）と共に用いた。ＰＡＤセ
ルでの電位および時間設定は、Ｅ₁＝０．１０（ｔ₁＝４
８０）；Ｅ₂＝０．６０（ｔ₂＝１２０）；Ｅ₃＝０．８
０Ｖ（ｔ₃＝３００ｍｓ）であった。

【００９９】溶離剤Ａは、脱イオン水中の炭酸塩を含ま
ない５０％ 水酸化ナトリウムの希釈により調製される
１５０ｍＭ 水酸化ナトリウム溶液であった。溶離剤Ｂ
は、５００ｍＭ 酢酸ナトリウムを含有する１５０ｍＭ
水酸化ナトリウム溶液であった。８５％の溶離剤Ａお
よび１５％の溶離剤Ｂで始まり１００％の溶離剤Ｂで終
了する、用いた勾配プログラムを表（ジオネックス用ポ
ンプ勾配）に示す。すべての分離を室温で流量１ｍｌ／
分において行った。注記：６０以下のＤＰを有するすべ
ての鎖に対してこの測定を行う、すなわち、示されるＤ
Ｐ面積％は６０以下のすべての鎖の全面積に対する％で
ある。また、６ＤＰは見られる中で最小の鎖である。

【０１００】ジオネックス用ポンプ勾配：

【表１】

【０１０１】試料を調製するために、各澱粉試料（２０
ｍｇ）の重さをはかり１０ｍｌガラスビンに入れた；２
ｍｌの９０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（ＤＭ
ＳＯ：水＝９：１、体積／体積）を添加し、磁気撹拌棒
で混合し、沸騰水浴中で５分間にわたり加熱した。次
に、７ｍｌの水を添加し混合した。混合物を室温に冷却
後、１ｍｌの１５０ｍＭ 水酸化ナトリウムを添加し、
混合し、１ｍｌの溶液をジオネックスにより操作した。

【０１０２】粘度−ビスコ／アミロ／グラフ、モデルＶ
Ａ−１Ａ（米国０７６０６、ニュージャージー州、ハッ
ケンサック、Ｃ．Ｗ．ブラベンダー・インスツルメント
（Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃ
ｏ．））を用いて、粘度を測定した。乾燥質量基準での
澱粉５％のスラリーを調製し、クエン酸／クエン酸３ナ
トリウム緩衝溶液を用いてｐＨ３に制御した。全充填質
量４６０グラムを１．５℃／分の割合で５０℃から９２
℃に熱した。次に、スラリーを９２℃で３０分間にわた
り保持した。ビスコ／アミロ／グラフの中で糊状物を熱
しながら熱粘度を測定した。

【０１０３】実施例１−鎖長分布 通常の澱粉および低アミロースタピオカ澱粉の鎖長分布
を測定し、結果を図１ａおよび１ｂに示す。図から分か
るように、これら二つの澱粉の鎖長分布は、実質的に同
じである。

【０１０４】実施例２−凍結−融解安定性 ＤＳＣを用いて多様な澱粉の溶液安定性を測定した。結
果を以下の表１に示す。

【表２】

【０１０５】表１から分かることができるように、低ア
ミロースタピオカ澱粉はいかなる他の試験澱粉よりも有
意に低いΔＨ値を有する。これは、低アミロースタピオ
カ澱粉が有意により溶液安定性であることを示す。

【０１０６】実施例３−安定化架橋低アミロースタピオ
カ澱粉の粘度 低アミロースおよび通常タピオカ澱粉を種々のレベルの
酸化プロピレン（０％、３％、６％および９％）を用い
て安定化し、当業界で公知の方法を利用して０．０２％
のレベルでオキシ塩化リンを用いて架橋した。これら澱
粉の粘度をブラベンダーにより測定し図２〜５に報告す
る。これらの図から分かるように、安定化の量が増大す
るにつれて、糊化開始温度は高くなり（すなわち、糊化
は遅くなり）、粘度は低下する。これは、化工を変える
ことで当業者が各種の特性を得ることができることを示
す。

【０１０７】実施例４−凍結−融解安定性 ゾルを用いて種々の澱粉の凍結−融解安定性を測定し
た。用いた澱粉基材は、通常コーン、ワキシーコーン、
通常タピオカ、および低アミロースタピオカであった。
こうした澱粉を非化工（天然）および化工の両方の状態
で試験した。当業界で公知の標準的な方法を用いて化工
を行った。澱粉基材を以下のキーによって表す： Ｃ＝通常コーン（Ｃｏｒｎ）； Ｗ＝ワキシーコーン（Ｗａｘｙ Ｃｏｒｎ）； Ｔ＝通常タピオカ（Ｔａｐｉｏｃａ）；および Ｍ＝低アミロースタピオカ（ＬＡＴＳ）。

【０１０８】結果を以下の図６に示す。「Ａ」として報
告される結果は化工していない（天然）の澱粉である。
化工された澱粉に対して報告される結果は以下のキーに
より表される： Ｂ＝０．０１％のＰＯＣｌ₃により化工された基材、 Ｃ＝０．０２％のＰＯＣｌ₃により化工された基材、 Ｄ＝９％のＰＯおよび０．０１％のＰＯＣｌ₃により化
工された基材、 Ｅ＝３．９％の無水酢酸および０．９％のアジピン酸酢
酸混合無水物により化工された基材。

【０１０９】結果から分かるように、低アミロースタピ
オカ澱粉は他の試験澱粉よりもさらに凍結−融解安定性
がある。

【０１１０】実施例５−酸性条件下での凍結−融解安定
性 澱粉分散液を水の代わりにクランベリージュースおよび
追加化工物を用いて調製することを除いて、実施例２を
繰り返した。

【０１１１】結果を以下の図７に示す。「Ａ」として報
告される結果は化工していない（天然）の澱粉である。
化工された澱粉に対して報告される結果は以下のキーに
より表される： Ｂ＝０．０１％のＰＯＣｌ₃により化工された基材、 Ｃ＝０．０２％のＰＯＣｌ₃により化工された基材、 Ｄ＝０．０４％のＰＯＣｌ₃により化工された基材、 Ｅ＝３．９％の無水酢酸および０．９％のアジピン酸酢
酸混合無水物により化工された基材、 Ｆ＝３％のＰＯおよび０．０２％のＰＯＣｌ₃により化
工された基材、 Ｇ＝６％のＰＯおよび０．０２％のＰＯＣｌ₃により化
工された基材、 Ｈ＝９％のＰＯおよび０．０１％のＰＯＣｌ₃により化
工された基材、 Ｉ＝９％のＰＯおよび０．０２％のＰＯＣｌ₃により化
工された基材、 Ｊ＝９％のＰＯおよび０．０４％のＰＯＣｌ₃により化
工された基材。

【０１１２】結果から分かるように、低アミロースタピ
オカ澱粉は他の試験澱粉よりも一層凍結−融解安定性が
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】通常および低アミロースタピオカ澱粉の鎖長分
布を表す。

【図２】０．０２％のＰＯＣｌ₃により化工された低ア
ミロースおよび通常タピオカおよびコーン澱粉の粘度を
示すブラベンダー曲線を表す。

【図３】０．０２％のＰＯＣｌ₃および３％のＰＯによ
り化工された低アミロースおよび通常タピオカおよびコ
ーン澱粉の粘度を示すブラベンダー曲線を表す。

【図４】０．０２％のＰＯＣｌ₃および６％のＰＯによ
り化工された低アミロースおよび通常タピオカおよびコ
ーン澱粉の粘度を示すブラベンダー曲線を表す。

【図５】０．０２％のＰＯＣｌ₃および９％のＰＯによ
り化工された低アミロースおよび通常タピオカおよびコ
ーン澱粉の粘度を示すブラベンダー曲線を表す。

【図６】中性のｐＨにおける、化工および化工していな
いの両方での通常コーン、通常タピオカ、ワキシートウ
モロコシ、および低アミロースタピオカ澱粉の凍結−融
解安定性を表す。

【図７】酸性のｐＨにおける、化工および化工していな
いの両方での通常コーン、通常タピオカ、ワキシートウ
モロコシ、および低アミロースタピオカ澱粉の凍結−融
解安定性を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロジャー ジェフコート アメリカ合衆国，ニュージャージー 08807，ブリッジウォーター，ダウ ロー ド 847 (72)発明者 ダグラス ジェイ．ハンチェット アメリカ合衆国，ニュージャージー 07801，マイン ヒル，フランク ストリ ート 31 (72)発明者 アカシュ タヤル アメリカ合衆国，ニュージャージー 08873，サウス サマーセット，フランク リン グリーンズ 41エー (72)発明者 アンジェリカ マーク アメリカ合衆国，ニュージャージー 07083，ユニオン，ベニントン ドライブ 599 Ｆターム(参考） 4B025 LD01 LK02 LP01 LP12 4C090 AA04 BA13 BC10 BD18 DA23 DA27

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 通常のタピオカ澱粉に対して溶液安定性
   を改善した低アミロースタピオカ澱粉。
2. 【請求項２】 水と有効量の天然の低アミロースタピオ
   カ澱粉とのスラリーを形成し、必要によりスラリーを蒸
   煮してゾルを形成することを含む、天然の低アミロース
   タピオカ澱粉によりゾルを作成する方法であって、該ゾ
   ルは天然のタピオカ澱粉により調製されるゾルよりも少
   なくとも１回多い凍結−融解サイクルに耐えることがで
   きるものである、前記方法。
3. 【請求項３】 タピオカ澱粉を含む組成物であって、前
   記組成物中のタピオカ澱粉の少なくとも一部を低アミロ
   ースタピオカ澱粉成分で置換することを含む改良がされ
   た、前記組成物。
4. 【請求項４】 天然の低アミロースタピオカ澱粉および
   水を含む食品であって、天然のタピオカ澱粉により調製
   される食品よりも少なくとも１回多い凍結−融解サイク
   ルに耐えることができる前記食品。
5. 【請求項５】 水と有効量の請求項１に記載のタピオカ
   澱粉とを組み合わせ、この組み合わせ物を蒸煮してとろ
   みのある食品を製造することを含む、とろみのある食品
   を調製する方法であって、前記食品は溶液安定性を示す
   と共に、天然のタピオカ澱粉により調製される食品より
   も少なくとも１回多い凍結−融解安定サイクルに耐える
   ことができるものである、前記方法。