JP2003199566A - レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のｃＤＮＡクローニング方法及びｈＧＲＢタンパク質 - Google Patents

レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のｃＤＮＡクローニング方法及びｈＧＲＢタンパク質

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なプローブを用いるレセプターチロシン
キナーゼのチロシンがリン酸化された領域に結合するこ
とができるタンパク質を検出し同定するための、新規な
発現クローニング法の提供。 【解決手段】 このプローブはレセプター分子又はその
官能性誘導体のチロシンがリン酸化された部分から誘導
されるアミノ酸配列を含み；少なくとも１つのリン酸化
されたチロシン残基を有し；レセプターのチロシンキナ
ーゼ部分を欠き；そして、検出可能なように標識されて
いる。さらに開示されているのは、該プローブの製造
法；レセプター、チロシンキナーゼのチロシンがリン酸
化された領域に結合することができるタンパク質をコー
ドする遺伝子を染色体にマッピングする方法；及び該プ
ローブを用いるそのようなタンパク質の精製方法であ
る。二つのタンパク質が上述のクローニング法を用いて
発見された。ＧＲＢ−１とＧＲＢ−２である。これらの
タンパク質をコードするＤＮＡ及びこれらのタンパク質
の検出方法もまた開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】分子及び細胞生物学の分野におけるこの
発明は、レセプターチロシンキナーゼのカルボキシ末端
ドメインに結合しかつ主要シグナル伝達経路内でこの酵
素のための基質として役立つことのできる細胞タンパク
質を識別するための、直接発現クローニングに基づく新
しい方法に関する。本発明は同様に、この方法を用いて
識別された新しいタンパク質にも関する。
【０００２】
【従来の技術】さまざまなポリペプチド性成長因子及び
ホルモンが、チロシンキナーゼ酵素活性をもつ細胞表面
レセプターと相互作用することによってその細胞効果を
媒介する（総説として、Williams, L.T. et al., Scien
ce 243: 1564-1570 (1989 年);Ullrich, A. et al., Ce
ll 61: 203-212 (1990 年); Carpenter, G. et al., J.
Biol. Chem. 265: 7709-7712 (1990年）を参照）。こ
れらのリガンドとそのレセプターの相互作用は、レセプ
ターの二量体化及びタンパク質チロシンキナーゼ活性の
刺激を含む一連の事象を誘発する。上皮成長因子レセプ
ター（ＥＧＦＲ）ならびに血小板由来成長因子レセプタ
ー（ＰＤＧＦＲ）といったようなチロシンキナーゼ活性
をもつその他のレセプターについては、キナーゼ活性化
及びレセプター自己リン酸化反応の結果として、レセプ
ターはいくつかの細胞質基質と物理的に会合することに
なる（Ullrich et al., 前出）
【０００３】ＥＧＦＲキナーゼのための２つの基質が現
在最終的に生体細胞内で同定されている。すなわち、
（ａ）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパー
ゼＣ−ガンマ（ＰＬＣ−ガンマ）及び（ｂ）ｒａｓタン
パク質のエフェクターループ内にある可能性のあるタン
パク質であるＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）
である（Margolis, B. et al., Cell 57: 1101-1107 (1
989 年b); Meisenhelder, J. et al., Cell 57: 1109-1
122 (1989 年)； Molloy, C. J. et al., Nature342: 7
11-714 (1989年); Wohl, M.I. et al., J. Biol. Chem.
265: 3944-3948（1990年)； Ellis, C. et al., Natur
e 343: 377-381 (1990年); Kaplan, D.R. et al., Cell
61. 121-133 (1990年））。
【０００４】同様に、活性化されたＰＤＧＦＲは、チロ
シンをリン酸化すること、又ｐｐ６０src といった細胞
チロシンキナーゼ、ＰＬＣ−ガンマ、ＧＡＰと会合した
状態になることが示された。（Gould,K.L. et al., Mo
l. Cell. Biol. 8: 3345-3356(1988年)； Meisenhelde
r, J. et al., Cell 57: 1109-1122 （1989年)； Mollo
y, C.J. et al., Nature 342: 711-714 (1989年); Kapl
an, D.R. et al., Cell61: 121-133 (1990年); Kazlaus
kas, A. et al., Science 247: 1578-1581 (1990年); K
rypta, R.M. et al., Cell 62: 481-492 (1990年); Mar
golis, B. et al., Science 248: 607-610（1990
年））。ＰＬＣ−ガンマ又はＧＡＰと、ＥＧＦＲとの会
合に関与する正確な部位は完全に解明されているわけで
はないが、最近の研究は、この会合に寄与するレセプタ
ーと基質の両方の上のドメインを識別し始めてきた。
【０００５】ＳＨ２（src homology 2) ドメインが、活
性化された成長因子レセプターといくつかのチロシンキ
ナーゼ基質との会合に関与するドメインであると思われ
る。ＳＨ２ドメインは、ｐｐ６０src、ＰＬＣ−ガン
マ、ＧＡＰ及びｖ−ｃｒｋといった細胞質性非レセプタ
ーチロシンキナーゼの中に発見された、保存された約１
００個のアミノ酸の配列である（Mayer, B.J. et al.,
Nature 332: 272-275 (1988 年); Pawson, T., Oncogen
e 3: 491-495 (1988年））。異なる触媒ドメインを有す
るものの、これらの分子は全て、保存されたＳＨ２及び
ＳＨ３（src homology 3) ドメイン及びチロシンキナー
ゼ活性をもつレセプターと会合する能力を共有する(And
erson, D. et al., Science 250: 979-982 (1990
年））。
【０００６】チロシンキナーゼ活性化及びレセプター自
己リン酸化反応は、成長因子レセプターとＳＨ２ドメイ
ン含有タンパク質との間の会合の必須条件である（Marg
olis, B. et al., Mol. Cell. Biol. 10: 435-441 (199
0 年); Kumjian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 8232-8239 （1989年); Kazlanskas, A. et al.,Sci
ence 247: 1578-1581(1990 年））。特に、既知の自己
リン酸化反応部位を全て含むＥＧＦＲのカルボキシ末端
（Ｃ−末端）フラグメントは、特異的にＧＡＰ及びＰＬ
Ｃ−ガンマのＳＨ２ドメインに結合する（以下参照）。
したがって、これらの基質タンパク質のＳＨ２ドメイン
とＥＧＦＲのチロシンリン酸化されたＣ末端テールの間
に、主要な会合部位が存在する。
【０００７】活性化されたチロシンキナーゼレセプター
に対する結合がいくつかの基質タンパク質の間で保存さ
れるということを認識した上で、これらの特性を共有す
るさらなる基質を同定するための努力が払われた。活性
化されたレセプターに対して結合する標的タンパク質
は、成長因子レセプターと共に免疫沈降するか又は固定
化マトリックスに付着されたレセプターに結合するタン
パク質の分析によって同定された（Morrison, D.K. et
al., Cell 58: 649-657 (1989 年); Kazlauskas, A. e
t al., EMBO J. 9: 3279-3286 (1990年））。これらの
タンパク質のいくつかのアイデンティティは既知である
ものの、これらのアプローチを利用して検出されたその
他のいくつかのタンパク質は、完全に特徴づけされてい
ない。さらに、活性化されたレセプターと相互作用する
希な標的分子が、これらの技術の限られた感度のために
検出されなかったということも考えられる；実際の結合
化学量論は低いものであってよく、タンパク質を可溶化
するのに必要な界面活性剤溶液は結合を粉砕しうる。
【０００８】これらのタンパク質を単離しクローニング
するための従来のアプローチはマイクロシークエンシン
グ及びそれに続く従来のｃＤＮＡクローニングのために
充分な量のタンパク質を精製するべく、大量の組織又は
株細胞の使用を必要とする骨の折れる方法であった。し
たがって、これらのタンパク質のクローニング及びそれ
に続く単離及び同定のための新しいアプローチに対する
必要性が当該技術分野において認識されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】細胞の成長及び発がん
の調節を理解しそれを制御できるようになろうという我
々の研究努力における最も切迫した必要性の１つは、チ
ロシンキナーゼのための標的タンパク質を識別する能力
をもつことである。
【００１０】本発明者は、チロシンキナーゼタイプの細
胞レセプターに対する標的タンパク質の迅速なクローニ
ングのための新たな発現／クローニングシステムを開発
してきた。このクローニング方法は、或る種のクラスの
基質がもつ、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）のチ
ロシンリン酸化カルボキシ末端（Ｃ末端）に特異的に結
合する能力に基づいている（以下の例VI; Margolis, B.
et al., EMBO J. 9:4375-4380 (1990 年）参照）。
【００１１】本発明者が考案したアプローチは、マイク
ロシークエンシング分析のために潜在標的タンパク質を
精製する、骨が折れコストのかかる作業を回避すること
を含め、従来のクローニング方法に比べて重要な利点を
有する。その上、本発明のアプローチは、従来の他の技
術を用いては活性化レセプターとのその会合を検出する
ことができなかったような希な標的分子を識別するため
の方法を提供する。さらに、この方法によると、ＤＮＡ
レベルでは相同性が低いものでしかないものの、チロシ
ンキナーゼ活性をもつ活性化されたレセプターに対する
その結合特性において類似のものであるような、構造的
又は機能的に関連したタンパク質の識別が可能となる。
後者の能力は、関連する遺伝子を識別するのに使用され
た従来のスクリーニング方法が、典型的にストリンジェ
ンシーの低い核酸ハイブリダイゼーションに基づいてい
ることから、重要なものである。実際、このようなハイ
ブリダイゼーションに基づくスクリーニングは、ＤＮＡ
レベルでの類似性の欠如のために、本発明の新しいタン
パク質すなわちＧＲＢ−１とＧＲＢ−２をクローニング
し同定する上で成功しなかったであろうと思われる。
【００１２】本発明者のアプローチの根源は、以前にＤ
ＮＡ結合タンパク質及びｊｕｎ結合タンパク質をクロー
ニングするのに利用されてきた方法にある（Singh, H.
et al., Cell 52: 415-423 (1988年)； MacGregor, P.
F. et al., Oncogene 5: 451-458 (1990 年））。
【００１３】本発明の方法は、チロシン残基がリン酸化
されるＥＧＦＲタンパク質のＣ末端が基質を結合できる
という発明者の考え及び観察を利用している（以下参
照）。チロシンが32Ｐでリン酸化されている標識プロー
ブを作製することによって、本発明者は、ヒトのさまざ
まな組織からのλｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーを
スクリーニングし、ＥＧＦＲのリン酸化されたＣ末端と
会合した状態となる数多くのタンパク質を同定した。本
発明者は、この要領で発見したタンパク質を「ＧＲＢ」
（Growth Factor Receptor Boundの略）と名付けた。本
発明のクローニング方法は、「ＣＯＲＴ」（Cloning of
Receptor Targets(レセプター標的クローニング）の
略）と名付けた。
【００１４】本発明の方法は、チロシンキナーゼに対す
る標的分子の識別及びクローニングのための一般性と迅
速性の両方を有する新しいアプローチとして提案されて
いる。したがって本発明は、レセプターチロシンキナー
ゼの標的であり、レセプターチロシンキナーゼのチロシ
ンリン酸化されたポリペプチド部分に結合することがで
きるタンパク質の発現を、発現ベクターを宿す細胞によ
って検出するための方法において、（ａ）細胞、その抽
出物、そのライセート（溶解物）又はその上清を、固相
担体と接触させて、担体に対するタンパク質の結合をひ
き起こすこと；（ｂ）チロシン−リン酸化されたポリペ
プチドと共に担体に結合したタンパク質をインキュベー
トし、ポリペプチドが担体結合タンパク質に結合できる
ようにすること；（ｃ）担体に結合していない物質を除
去すること；及び（ｄ）担体に結合したチロシンリン酸
化ポリペプチドの存在を検出するか又はその量を測定す
ること、を特徴とし、かくしてそのタンパク質の発現を
検出する方法に関する。
【００１５】好ましい一実施態様においては、レセプタ
ーは、上皮成長因子レセプター、血小板由来成長因子レ
セプター又は線維芽細胞成長因子レセプターである。
【００１６】この方法は、好ましくは、原核細胞、最も
好ましくはE. coli(大腸菌）といった細菌細胞を用いて
行なわれる。細胞は同様に、酵母又は哺乳動物細胞とい
ったような真核細胞であってもよい。
【００１７】好ましくは、リン酸化されたポリペプチド
は、例えば32Ｐのような放射線標識を用いて、検出可能
な形に標識付けされる。
【００１８】固相担体は、好ましくはニトロセルロース
膜であり、λｇｔ１１ライブラリーをスクリーニングす
るときには溶菌された細菌細胞から放出されたタンパク
質が、この膜にトランスファーされる。
【００１９】本発明は同様に、レセプターチロシンキナ
ーゼ分子のチロシンリン酸化されたポリペプチド部分に
結合できるタンパク質をコードする遺伝子を、ヒト染色
体にマッピングするための方法において、（ａ）ヒト遺
伝子発現ライブラリーで細菌細胞を感染させること；
（ｂ）請求項１に記載の方法を用いて、タンパク質を発
現するクローンを検出すること；（ｃ）クローンのＤＮ
Ａを配列決定すること；及び（ｄ）ヒト染色体に対しそ
の配列をマッピングすること、を特徴とする方法をも提
供する。
【００２０】本発明は同様に、レセプターチロシンキナ
ーゼのチロシンリン酸化ポリペプチド部分に結合するこ
とのできるタンパク質の発現の検出に有用なポリペプチ
ドプローブにも関する。このプローブは、レセプター分
子のチロシンリン酸化部分から誘導されたアミノ酸配列
又はその機能的誘導体を含み、チロシンキナーゼドメイ
ンが欠如しており、この配列は少なくとも１つのホスホ
チロシン残基、好ましくは４個又は５個のホスホチロシ
ンを含んでいなければならない。プローブは、好ましく
は32Ｐで検出可能な形に標識されるべきである。好まし
いプローブは約２５〜２５０個のアミノ酸残基を有す
る。本発明のプローブは、上皮成長因子レセプター、血
小板由来成長因子レセプター及び線維芽細胞成長因子レ
セプターを含むレセプターチロシンキナーゼに対する標
的タンパク質を検出するために有用である。
【００２１】本発明は同様に、上述のプローブを調製す
るための方法において、（ａ）チロシンキナーゼによっ
てリン酸化されうる少なくとも１つのチロシン残基を含
むチロシンリン酸化ドメインとチロシンキナーゼドメイ
ンを両方有する、レセプター又は遺伝子工学的に処理さ
れたレセプター様の誘導体を実質的に純粋な形で提供す
ること、（ｂ）チロシン残基のリン酸化を可能にする条
件下で〔ガンマ−32Ｐ〕アデノシン三リン酸と共にレセ
プター又はレセプター様の誘導体をインキュベートし、
チロシン残基のリン酸化をひき起こすこと、を特徴と
し、かくしてプローブを産生する方法をも含んでいる。
好ましい一実施態様において、この方法は（ｃ）チロシ
ンキナーゼドメインとチロシン−リン酸化ドメインの間
で分子を切断することのできる作用物質で、リン酸化レ
セプター分子をさらに処理する、工程を含んでいる。好
ましい切断作用物質は、臭化シアンである。
【００２２】また別の実施態様においては、上述の方法
には、作用物質がその切断部位で切断できる酵素であ
り、チロシンリン酸化ドメインをコードするＤＮＡ配列
に連結している選択的酵素的切断部位をコードするＤＮ
Ａ配列に連結しているチロシンキナーゼをコードするＤ
ＮＡ配列を含むＤＮＡ分子によってコードされたポリペ
プチドである、遺伝子工学的に処理されたレセプター様
の誘導体が関与する。好ましい酵素は、Ｘａ因子とトロ
ンビンである。
【００２３】同様に提供されているのは、レセプターチ
ロシンキナーゼ分子のチロシンリン酸化ポリペプチド部
分に結合することのできるタンパク質を、複雑な混合物
から精製するための方法において、（ａ）プローブが結
合されている固相担体と複雑な混合物とを接触させ、タ
ンパク質のプローブへの結合を可能にすること、（ｂ）
担体に結合していない物質を除去すること、及び（ｃ）
担体から結合タンパク質を溶出することを特徴とし、か
くしてタンパク質を精製する方法である。
【００２４】本発明は同様に、図４に示されているアミ
ノ酸配列をもつタンパク質ＧＲＢ−１にも関する。本発
明は、図１７に示されているアミノ酸配列を含むタンパ
ク質、ＧＲＢ−２を含む。
【００２５】本発明は同様に、ＧＲＢ−１タンパク質を
コードするＤＮＡ分子、及びＧＲＢ−２タンパク質をコ
ードするＤＮＡ分子にも関する。これらのタンパク質の
機能的誘導体をコードするＤＮＡ分子も本発明に含まれ
る。ＤＮＡ分子が天然のものである場合、それは、それ
が生来会合するヌクレオチド配列を実質的に有さない。
本発明のＤＮＡ分子はプラスミドといった発現運搬体で
あってよい。同様に提供されるのは、上述のＤＮＡ分子
の各々で形質転換された宿主である。
【００２６】本発明は同様に、各々が天然に会合してい
るその他のタンパク質を実質的に含まないＧＲＢ−１又
はＧＲＢ−２タンパク質、又はその機能的誘導体を調製
する方法において、（ａ）培養条件下でタンパク質を発
現することのできる宿主細胞を培養すること、（ｂ）タ
ンパク質又は機能的誘導体を発現させること、及び
（ｃ）培養からタンパク質又は機能的誘導体を回収する
こと、を特徴とする方法をも含んでいる。
【００２７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、レセプター
チロシンキナーゼ分子、特に上皮成長因子レセプター
（ＥＧＦＲ）のチロシンリン酸化されたＣ末端テールに
結合するという特徴をもつタンパク質をコードするＤＮ
Ａの迅速な発現クローニングのための新しいプローブ及
びその利用方法を開発した。
【００２８】「発現」という語は、タンパク質分子を生
み出すための、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転
写及び翻訳のことを意味する。発現クローニングは、ク
ローニングされるＤＮＡがあるタンパク質をコードする
ような方法である。典型的にはｃＤＮＡライブラリーの
形態の望ましいＤＮＡは、その発現及びそれがコードす
るタンパク質の直接検出を用いて検出される。発現クロ
ーニングシステムは、当該技術分野において周知のもの
である（参考：Sambrook, J. et al.「Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual」第２版、Cold Spring Harbo
r Press, ColdSpring Harbor, NY (1989年）、なおこれ
は本明細書中に参考として組込まれる）。典型的には、
タンパク質は、λｇｔ１１発現ベクターでの細菌感染を
介して、λｇｔ１１ライブラリーといったライブラリー
から発現される。バクテリオファージプラークの部域内
に放出された発現タンパク質は、ニトロセルロースフィ
ルターへとトランスファーされ、典型的にはフィルター
を染色すべく抗体を用いて検出される。新しいタンパク
質、抗体を調製するのに充分な量で入手できないタンパ
ク質又は親和力に基づく検出のための既知のリガンドを
もたないタンパク質については、このような従来の発現
クローニング方法は使用できない。
【００２９】本発明の発現クローニング方法は、その他
の数多くのレセプターシステムに対し容易に適用でき
る。例えば、いくつかの標的分子は、ＰＤＧＦＲのチロ
シンリン酸化部分及びコロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−
１）に結合する（Coughlin, S.R. et al., Science 24
3: 1191-1194 (1989 年); Kazlauskas, A. et al., Cel
l58： 1121-1133 (1989年); Shurtleff, S.A. et al.,
EMBO J. 9: 2415-2421 (1990 年); Reedjik, M. et a
l., Mol. Cell. Biol. 10: 5601-5608 (1990 年））。
これら２つのレセプターにおいて、チロシンリン酸化反
応は、ＥＧＦＲの場合のようにＣ末端ドメイン内ではな
く、キナーゼ挿入ドメイン内で起こる。したがって、Ｐ
ＤＧＦＲ又はＣＳＦ−１レセプターのいずれかのキナー
ゼ挿入ドメイン又はその機能的誘導体（以下に規定のも
の）を利用する特異的プローブも、同様に、発現クロー
ニングのために利用することができる。両者共ＰＬＣ−
ガンマといったＳＨ２含有タンパク質と相互作用するこ
ともできる線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）レセプター
（これはＣ末端ドメイン内でチロシンリン酸化される）
又はＨＥＲ２／ｎｅｕレセプターについても、類似のプ
ローブを構築することが可能である。インシュリンレセ
プターといったようなその他のレセプターにおいては、
チロシンリン酸化反応は、キナーゼドメイン自体の中で
起こる。
【００３０】かくして、例えばＥＧＦＲ内のＣ末端ドメ
イン、インシュリンレセプター内のキナーゼドメイン及
びＰＤＧＦＲ内のキナーゼドメイン挿入物といったよう
に、異なるタンパク質内で異なる部位がチロシンリン酸
化されるということがわかると思われるものの、本発明
は、これらの構造全ての共通の特徴、単数又は複数のホ
スホチロシンの存在及び単数又は複数のホスホチロシン
を含むポリペプチドに対する親和力をベースとした或る
種の細胞タンパク質の結合能力を認識する。一般的に以
下ではＥＧＦＲを基準としてＣ末端ドメインであるプロ
ーブを基準にしているものの、この言葉は制限的な意味
をもつものではなく、上述のその他全ての代替的チロシ
ンリン酸化ドメインを内含すべく意図されたものであ
る。
【００３１】本発明の方法及びアプローチは、上述の活
性化されたリン酸化レセプターなどのようなチロシンリ
ン酸化ポリペプチドと、特異的な形で相互作用すること
のできる全ての標的分子のクローニング及び識別に適用
することができる。例えば、Ｒ−ＰＴＰａｓｅｓといっ
たようなチロシン特異的ホスファターゼなどのチロシン
リン酸化された配列に対して結合するさらなるタンパク
質（Sap, J. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
6112-6116 (1990 年)； Kaplan, R. et al.,Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 87: 7000-7004 (1990年））。これ
らの方法は同様に、セリン／トレオニン特異的ホスファ
ターゼの場合のようにリン酸化されたセリン／トレオニ
ン残基に結合するタンパク質のクローニング及び識別に
おいても適用可能である。
【００３２】本発明のプローブを使用すると、遺伝子発
現ライブラリーからの、ＤＮＡのクローニング及びコー
ドされたタンパク質の識別を迅速に行なうことが可能に
なる。この方法は、特に、バクテリオファージλｇｔ１
１ライブラリーの場合に有用である。ヒトの胎児脳λｇ
ｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングすることによ
り、本発明者は２つの遺伝子をクローニングし、それら
がコードするタンパク質を特徴づけすることができた。
そのうちの１つＧＲＢ−１と呼ばれるものは、完全に配
列決定され、２つのＳＨ２ドメインと１つのＳＨ３ドメ
インを含む約８５kDa の分子量をもつ新しいヒトタンパ
ク質をコードすることがわかった（図４及び図５）。部
分的に配列決定されたＧＲＢ−２も同様にユニークＳＨ
２及びＳＨ３ドメインを含んでいる。
【００３３】ＧＡＰ及びＰＬＣガンマタンパク質内にあ
るようなＳＨ２ドメインは、ＥＧＦＲのリン酸化された
Ｃ末端とこれらのタンパク質の会合に関与する（以下の
第VI例参照）。したがって、ＳＨ２ドメインの１つの機
能は、効果的なチロシンリン酸化反応を容易にするた
め、レセプターチロシンキナーゼ分子の細胞内部分とそ
の基質を並置することである。
【００３４】本発明の方法を用いて識別された本発明の
ｃＤＮＡクローンのうちのひとつ、ＧＲＢ−１を詳細に
分析することにより、２つのＳＨ２ドメインと１つのＳ
Ｈ３ドメインを含む新しい配列が明らかにされる。この
タンパク質は、さまざまな組織及び細胞系統において発
現される。その予想された分子量８５kDa は、ドデシル
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）上でのその移動と一貫性をもつ。
【００３５】「レセプターチロシンキナーゼ」という語
は、チロシンキナーゼ酵素活性をもつドメインを含む単
数又は複数の細胞内ドメインと細胞外レセプタードメイ
ンをもつ膜貫通タンパク質を意味する。さらなる細胞内
ドメインは、ＳＨ２に対する配列相同性を有しうる。こ
れらの分子は、当該技術分野において周知のものである
（Williams, L.T. et al., Science 243: 1564-1570 (1
989 年); Ullrich, A.et al., Cell 61: 203-212 (1990
年); Carpenter, G. et al., J. Biol. Chem.265: 7709
-7712 (1990年））。
【００３６】レセプターチロシンキナーゼと相互作用し
このレセプターチロシンキナーゼによってリン酸化され
うるタンパク質は、細胞外レセプタードメインに結合す
るこれらのレセプターに対する「リガンド」とは区別し
て、これらのレセプターに対する「標的」タンパク質と
呼ばれる。
【００３７】本発明に従うと、発現クローニング方法
は、λｇｔ１１といったような遺伝子発現ライブラリー
上で直接実施される。好ましい実施態様においては、Ｄ
ＮＡはヒトｃＤＮＡである。より好ましくは、ＤＮＡは
ヒト胎児脳ＤＮＡである。ヒトの遺伝子のクローニング
のための出発物質としてこのような供給源を使用するこ
とは、大量の組織を取って抗体を産生するか又はタンパ
ク質を精製し部分的に配列決定しオリゴヌクレオチドプ
ローブをこの配列から調製したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングするのに用いる代替的
手段に比べ、著しい利点を有する。これらの工程を回避
することの利点は、胎盤を除き、組織が一般に大量に入
手できないことから、ヒト遺伝子の場合に最も適切であ
る。
【００３８】発現ライブラリーは、単一の工程でスクリ
ーニングされる。好ましくは、λプラークは、感染した
細菌内で発現され担体にトランスファーされるライブラ
リーＤＮＡにコードされたタンパク質のトランスファー
を可能にするべく、固体担体、好ましくはニトロセルロ
ース上にブロッティングされる。この担体は、次に、本
明細書に記述しているように、本発明のプローブと共に
インキュベートされる。プローブは、チロシン−リン酸
化ポリペプチドに対する結合能力を有するタンパク質に
結合することができる。プローブに用いられる標識、好
ましくは放射性同位元素32Ｐに基づいて、問題のタンパ
ク質を含むプラークを識別するために適切な検出システ
ムが用いられる。このときこれらのプラーク内のファー
ジが選択され、それらの中のＤＮＡ挿入物を再クローニ
ングし、切り出し、当該技術分野において周知のように
タンパク質の大規模な発現のために使用されるその他の
ベクター内などに入れることができる。
【００３９】当業者であれば、使用されるシステムの精
確な性質に応じて濃度、時間、温度を変化させることが
できることがわかるであろうし、又、過度の実験無しに
該当するパラメーターを変化させる方法がわかるだろ
う。さらに、この分野における一般的方法は、Sambrook
et al. （前出）の中に記述されている。
【００４０】固相担体を作製できる材料としては、ニト
ロセルロース、セルロース、紙、置換型ポリスチレン、
アクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリペンテン、
酸化シリコーンが含まれるが、これらに制限されるわけ
ではない。
【００４１】本発明のプローブは、レセプターチロシン
キナーゼ、好ましくはＥＧＦＲのＣ末端ドメインから誘
導されたチロシンリン酸化ポリペプチド分子である。ポ
リペプチドは、約２５個から約２５０個のアミノ酸の長
さを有していてよい。プローブは、リン酸化された天然
配列又はその機能的誘導体（以下に規定）でありうる。
１個から５個のチロシン残基でＣ末端ドメインを自己リ
ン酸化するため、レセプター分子上に存在するチロシン
キナーゼドメインを用いることによって、きわめて効率
の良いリン酸化反応が得られる。チロシン残基をリン酸
化するためには（例Ｉに詳細に記述されている）既知の
方法及び条件が用いられる。好ましい基質は〔γ−Ｐ32
−アデノシン三リン酸〕である。プローブを作るために
原材料として用いられるレセプター分子の供給源として
は、組織又は細胞から化学的に精製された分子又は組換
えＤＮＡ法により産生された分子が考えられる。
【００４２】組換え技術を用いる場合、天然型レセプタ
ーを産生させてもよいし、或は又代替的には、レセプタ
ー様の誘導体を産生させてもよい。好ましいレセプター
様の誘導体としては、Ｃ末端ドメインに連結されたチロ
シンキナーゼドメインが挙げられる。また別の実施態様
においては、別々の分子として２つのドメインを産生さ
せ、混合してＣ末端由来ポリペプチドのチロシンリン酸
化を達成することができる。
【００４３】本明細書に記述するようなレセプターチロ
シンキナーゼのチロシンリン酸化されたＣ末端部分を含
むプローブは、融合タンパク質の形で組換え手段によっ
て産生されうる。
【００４４】本明細書で使用する場合、「融合タンパク
質」というのは、ＳＨ２ドメインを有するタンパク質と
いった、細菌性タンパク質及び問題のポリペプチドを含
む融合されたタンパク質のことであってよい。代替的に
は、融合タンパク質は同様に、キナーゼによってリン酸
化されうる単数又は複数のチロシン残基をもつレセプタ
ーチロシンキナーゼＣ末端ドメインに連結されている選
択的酵素的切断部位に、チロシンキナーゼドメインをコ
ードするＤＮＡ配列が連結されている、人工的に構築さ
れたレセプターチロシンキナーゼ様誘導体であってもよ
い。このタイプの「融合タンパク質」をコードするこの
ような遺伝子構築物を、発現運搬体中に挿入して、細菌
又は真核生物の宿主内で発現させることができる。ひと
たび発現されると、このような融合タンパク質は自己リ
ン酸化することができ、ここでキナーゼはＣ末端ドメイ
ン内でチロシン残基をリン酸化するべく作用する。この
リン酸化反応に続いて、適切な酵素を使用することによ
って選択的に切断部位における切断が起こり、かくして
Ｃ末端リン酸化ポリペプチドをＮ末端キナーゼから分離
し、これをプローブとして役立てることができる。
【００４５】Itakura et al. (Science 198: 1056-1063
(1977年））及びRiggs(米国特許第４，３６６，２４６
号（１９８２年））は、外来性タンパク質の細胞内崩壊
を妨げる融合タンパク質の形での外来性タンパク質の細
菌発現のための方法を教示した。さらに、過剰に発現さ
れた融合タンパク質は、往々にして細菌細胞内に細胞封
入体として貯えられており、したがって単離及び精製が
比較的容易である（Marston, Biochem. J. 240: 1-12
(1986年））。これらの参考文献は、選択的切断部位の
概念に基づく代替的切断方法を示唆していた。すなわ
ち、メチオニンが望まれる接合部に挿入されて臭化シア
ンのための標的部位として役立つことができたのと全く
同じように、アミノ酸特異性をもつタンパク質分解酵素
による攻撃を受けうる特異的アミノ酸部位も導入するこ
とができた。Nagai et al. (Nature 309: 810-812 (198
4 年））は、血液凝固因子Ｘａのための切断部位として
役立つ４つのアミノ酸の配列を導入することによる融合
タンパク質における望ましい遺伝子産物の産生を開示し
ていた。Ｘａ因子による切断は同様に、従来の方法によ
りE.coliの中で発現された大部分の真核性タンパク質の
中に存在する開始コドンによってコードされる余分なＮ
末端メチオニンも除去した。Ｘａ因子又はトロンビンに
よって認識される酵素的切断部位を、望まれるタンパク
質の細菌内での発現を強化しその精製をさらに容易にす
るために使用することを記述したその他の参考文献（Ge
rmino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 692-4
696 (1984年); Scholtissek et al., Gene 62: 55-64
(1988 年); Smith et al., Gene 67: 31-40 (1988年);
Knott et al., Eur. J. Biochem. 174: 405-410 (1988
年);及びDykes et al., Eur. J. Biochem. 174: 411-4
16 (1988年））。
【００４６】「選択的切断部位」という語は、化学物質
又は酵素のいずれかによって選択的に切断され、予想可
能な形で切断を達成することのできる単数又は複数のア
ミノ酸残基のことを意味する。選択的酵素的切断部位
は、タンパク質分解酵素により認識され、加水分解され
るアミノ酸又はペプチド配列である。このような部位の
例としては、トリプシン又はキモトリプシン切断部位が
含まれる。本発明の好ましい一実施態様においては、選
択的切断部位は、血液凝固Ｘａ因子によって認識され切
断される配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇから成
る。また別の実施態様においては、選択的切断部位は、
トロンビンによって認識され切断される配列Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有する。
【００４７】レセプター様の誘導体を構築するにあたっ
ては、酵素認識部位をコードする配列に対して５′にあ
るオリゴヌクレオチド配列を含ませることができ、又長
さを変化させてもよい。例えば、１つの実施態様におい
ては、Ｉｌｅに対するコドン（Ｘａ因子認識部位の開
始）とチロシンキナーゼドメインをコードする配列の
３′末端の間に、１３のヌクレオチドを位置させてい
る。
【００４８】したがって、本発明の一実施態様において
は、チロシンキナーゼドメインとＣ末端ドメインの間
に、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ配列が導入されて
いる。また別の実施態様においては、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ配列が導入される。この切断部位をもつ
タンパク質は、標準方法を用いて細菌内で発現させられ
る。その後、好ましくは〔ガンマ32Ｐ〕アデノシン三リ
ン酸を用いたＣ末端ドメインの自己リン酸化反応が起こ
ることができ、それに続いて、例えばＸａ因子といった
適切な切断作用物質を用いたチロシンリン酸化Ｃ末端ド
メインの選択的切断が起こる。
【００４９】本発明は同様に、特定のヒト染色体に対し
て、レセプターチロシンキナーゼのための標的タンパク
質（例えば本明細書に規定されているようなＧＲＢタン
パク質）をコードする遺伝子、好ましくはヒト遺伝子を
マッピングする方法も提供している。この方法は本明細
書に記されている新しい発現クローニング方法と、特定
の染色体にある遺伝子をマッピングするためのいくつか
の既知の技術のうちの１つを組合わせている。かくし
て、本発明に従うと、λｇｔ11クローンといったＧＲＢ
タンパク質をコードするＤＮＡ挿入物を含むクローン
が、本明細書に開示されている発現クローニング方法を
用いて識別される。挿入物は、望まれる場合、当該技術
分野で周知の方法ならびに、クローンの核酸の直接標識
か又はクローンの配列のユニーク部分に相応するオリゴ
ヌクレオチドプローブを産生することによって構築され
たプローブを用いて、さらにサブクローニングされうる
（参考：Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A L
aboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Pres
s, Cold Spring Harbor, NY (1989年））。この標識さ
れたプローブは、次に、ヒト−ハムスター体細胞ハイブ
リッドのパネルからのＤＮＡを含むBios Corporation
(New Haven, Connecticut）製のChromosome Blot とい
った市販のブロットを用いたハイブリダイゼーション検
定において使用できる（Kouri, R.E. et al., Cytogene
t. Cell Genet. 51: 1025(1989年））。そのヒト−ハム
スターハイブリッド細胞内にどのヒト染色体が残ってい
るかと、問題のＧＲＢ遺伝子に特異的なプローブのハイ
ブリダイゼーションとを比較することによって、遺伝子
は特定のヒト染色体にマッピングされる。このようにし
て、この染色体上に存在する既知のヒト遺伝子（又はそ
の中の突然変異によりひき起こされる疾病）に対するリ
ンケージが立証される。より細かいマッピングのために
当該技術分野において周知の方法、例えば既知のヒト欠
失突然変異を使用して、ＧＲＢ遺伝子をさらに精確にそ
の他のヒト遺伝子に対してマッピングすることができ
る。
【００５０】本発明のチロシンリン酸化されたレセプタ
ーチロシンキナーゼＣ末端プローブポリペプチド及び本
発明のＧＲＢタンパク質、ならびに本発明の方法を用い
て発見されるさらなるまだ未知のＧＲＢタンパク質は、
レセプターチロシンキナーゼを通したシグナル伝達を介
して起る細胞成長制御を調整することのできるその他の
作用物質及び薬物をスクリーニングするための方法にお
いて有用である。チロシンリン酸化プローブポリペプチ
ド又はＧＲＢタンパク質あるいはそれらのフラグメント
を固相担体マトリックスに付着させることによって、そ
の親和力プローブに結合することのできる複雑な混合物
から分子を単離し精製するのに使用可能な親和力プロー
ブが作り出される。さらに、このような親和力プローブ
は、チロシンリン酸化プローブ又はＧＲＢタンパク質を
結合できる分子の生物学的流体中における存在を検出す
るためにも有用である。同様にして、このプローブ又は
ＧＲＢと相互作用するその能力について、化学的作用物
質をテストすることも可能である。
【００５１】固相に対してタンパク質及びペプチドをカ
ップリングさせるための方法、これらの方法において有
用な固相物質及び溶出手段は、当業者にとって周知のも
のである。
【００５２】ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ及びＦＧＦＲを含
む、レセプターチロシンキナーゼである成長因子レセプ
ターの場合、チロシンリン酸化反応は細胞成長及び発が
ん性形質転換に連関している。細胞内のＧＲＢの作用の
妨害は、成長を妨げるか又は抑制する可能性があり、又
腫瘍の発達を妨げる手段としても役立ちうる。さらに、
レセプターチロシンキナーゼ又はＧＲＢのＣ末端部分内
の突然変異あるいはその相互作用の調節不良は、ガンの
可能性を促進しうる。
【００５３】インシュリンレセプター（ＩｎｓＲ）も同
様にレセプターチロシンキナーゼであり、ＩｎｓＲを担
持する細胞内のチロシンリン酸化反応は、正常な生理学
的機能と結びつけられる。細胞成長及びガンの場合とは
対照的に、ＧＲＢ及びレセプターのチロシンリン酸化部
分の正常な相互作用の妨害はインシュリンの効果を妨げ
ることになる。ＧＲＢタンパク質の正常以下のレベル又
は活性は、正常な対調節メカニズムを無くするように作
用しうる。恐らくは、ＧＲＢタンパク質の過剰発現又は
過剰活性は、細胞に対するインシュリンの作用を抑制す
るか又は完全に妨げる可能性があり、かくして糖尿病
（インシュリン抵抗性の）へと導きうる。したがって、
糖尿病に対する罹病性は、ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タ
ンパク質の調節不良と結びつけることができる。
【００５４】したがって、正常な又は突然変異体のＧＲ
Ｂタンパク質遺伝子を識別するためのあるいは細胞内の
ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２の存在又はその量を検出する
ための本発明の方法は、レセプターチロシンキナーゼ経
路によって媒介される細胞代謝における変化と関連する
がん、糖尿病その他の病気に対する罹病性を識別するた
めの方法として役立つことができる。
【００５５】本発明は、被検者体内の正常又は突然変異
体ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質の存在及びその
レベルを評価するための方法を提供する。被検者体内の
これらのタンパク質の変調した発現又は突然変異体ＧＲ
Ｂタンパク質の存在は、発ガン性形質転換及びガンの発
病に対する罹病性の重要な予測物として役立ちうる。代
替的には、ＧＲＢタンパク質の変調した発現は、糖尿病
に対する罹病性の重要な予測物として役立つことができ
る。
【００５６】ＧＲＢタンパク質をコードするＤＮＡ又は
ＲＮＡ配列の存在について被検者からの細胞をテストす
るのに、ＧＲＢタンパク質のさまざまな部分をコードす
るオリゴヌクレオチドプローブが用いられる。好ましい
プローブは、本発明のＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパ
ク質の少なくとも４個のアミノ酸残基、好ましくは少な
くとも５個のアミノ酸残基をコードする核酸配列に対し
向けられたものである。このようなプローブを使用し
て、定性的又は定量的検定を行なうことができる。例え
ば、細胞又は組織の調製物におけるＧＲＢタンパク質の
ｍＲＮＡの発現を測定するためには、ノーザン分析（以
下の例IIIを参照のこと）が使用される。
【００５７】このような方法は、選択的増幅技術の使用
の後、被検者から得られるきわめて少量のＤＮＡを用い
てさえ利用できる。精製された核酸フラグメントを増幅
することのできる組換えＤＮＡ法が長い間認知されてき
た。典型的にこのような方法には、ＤＮＡ又はＲＮＡベ
クター内への核酸フラグメントの導入、ベクターのクロ
ーン増幅、及び増幅された核酸フラグメントの回収を含
む。このような方法論の例は、Cohen 他（米国特許第
４，２３７，２２４号）、Sambrook et al.(前出）など
によって提供されている。
【００５８】最近、このような望ましい核酸分子の濃度
を増大させることのできるインビトロ酵素法が記述され
てきた。この方法は、「ポリメラーゼ連鎖」反応又は
「ＰＣＲ」として呼称されてきた（Mullis, K. et al.,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273
(1986年); Erlich, H. et al., EP 50,424; EP 84,79
6, EP 258,017, EP 237,362; Mullis, K., EP 201,18
4； Mullis, K. et al., US4,683,202; Erlich, H., US
4,582,788; 及びSaiki, R. et al., US 4,683,194）。
【００５９】ポリメラーゼ連鎖反応は、その配列が予め
精製されておらずかつ特定の試料内に単一のコピーでし
か存在しない場合でさえ、特定の核酸配列の濃度を選択
的に増大させるための方法を提供する。この方法は、１
本鎖又は２本鎖ＤＮＡのいずれかを増幅するために使用
できる。この方法の核心には、望まれる核酸分子の鋳型
依存型のポリメラーゼ媒介複製のためのプライマーとし
て役立つ２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用が関
与している。
【００６０】ＰＣＲ法の２つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブの精確さは、この方法の成功にとってきわめて重要
である。周知のように、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子は、分
子のリン酸基の５′−３′連鎖を通して付与される指向
性を有する。ＤＮＡ又はＲＮＡの配列は、１つの配列の
５′末端リン酸基と第２の配列の３′末端ヒドロキシル
基の間のホスホジエステル結合の形成を通して連結され
る。核酸分子のポリメラーゼ依存型増幅は、核酸分子の
３′ヒドロキシル末端に対する５′ヌクレオチド三リン
酸の付加によって進行する。かくしてポリメラーゼの作
用は、核酸分子の３′末端を伸長させる。これらの固有
の特性は、ＰＣＲのオリゴヌクレオチドプローブの選択
において活用されている。ＰＣＲ法のプローブのオリゴ
ヌクレオチド配列は、それが、増幅の望まれる特定の核
酸配列のフランキング配列と同一の又はそれに相補的な
配列を含んでいるように選択される。
【００６１】さらに具体的に言うと、「第１の」プロー
ブのオリゴヌクレオチド配列は、望ましい配列に対し
３′に位置するオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイ
ズできるように選択されており、一方「第２の」プロー
ブのオリゴヌクレオチド配列は、それが望ましいドメイ
ンに対し５′のところに存在するものと同一のオリゴヌ
クレオチド配列を含むような形で選択される。両方のプ
ローブは共に３′ヒドロキシル基を有し、したがって核
酸合成のためのプライマーとして役立つことができる。
【００６２】ＰＣＲにおいては、反応条件は、ハイブリ
ダイゼーション及び核酸重合の助けとなる条件及び二重
鎖分子の変性を結果としてもたらす条件の間で循環させ
られる。反応の第１段階では、試料の核酸は一時的に加
熱され、次に冷却されて、存在しうるあらゆる２本鎖分
子が変性される。次に「第１の」及び「第２の」プロー
ブは、望まれる核酸分子の濃度をはるかに上回る濃度で
試料に添加される。試料が、ハイブリダイゼーション及
び重合の助けとなる条件下でインキュベーションされる
と、「第１の」プローブは、増幅されるべき配列に対し
て３′の位置で試料の核酸分子とハイブリダイズするこ
とになる。試料の核酸分子が当初２本鎖であった場合、
「第２の」プローブは、増幅が望まれている配列の相補
体である配列に対して３′の位置において核酸分子の相
補鎖とハイブリダイズすることになる。ポリメラーゼを
添加した時点で、「第１の」及び（核酸分子が２本鎖で
ある場合には）「第２の」プローブの３′末端は伸長さ
れることになる。「第１の」プローブの伸長は結果とし
て、望まれる核酸の正確な配列をもつオリゴヌクレオチ
ドの合成をもたらすことになる。「第２の」プローブの
伸長は、結果として、望まれる核酸の相補体の正確な配
列をもつオリゴヌクレオチドの合成をもたらす。
【００６３】ＰＣＲ反応は、「第１の」プローブの伸長
産物が必然的に「第２の」プローブの配列に相補的な配
列を含み、かくして「第２の」プローブの伸長産物の産
生のための鋳型として役立つことから、特異的核酸配列
の指数増幅を行なうことができる。同様に、「第２の」
プローブの伸長産物は、必然的に、「第１の」プローブ
の配列に対して相補的な配列を含み、かくして「第１
の」プローブの伸長産物の産生のための鋳型として役立
つことができる。したがって、重合及び変性のサイクル
を可能にすることにより、望まれる核酸分子の濃度の幾
何学的増加を達成することが可能である。ＰＣＲに関す
る総説は、Mullis, K.B. (Cold Spring Harbor Symp. Q
uant. Biol. 51: 263-273 (1986年)); Saiki, R.K. et
al., (Bio/Technology 3: 1008-1012 (1985年)); 及びM
ullis, K.B. et al. (Meth. Enzymol. 155: 335-350 (1
987年））に提供されている。
【００６４】１つの実施態様においては、本発明は、天
然のＧＲＢ−１及びＧＲＢ−２タンパク質に向けられて
いる。また別の実施態様においては、本発明は、組換え
型ＧＲＢ−１及びＧＲＢ−２タンパク質に向けられてい
る。本発明は、天然に関連しているその他のタンパク質
を実質的に含まない天然のタンパク質分子を提供してい
る。「その他のタンパク質又は糖タンパク質を実質的に
含まない」というのは、そのタンパク質が少なくとも９
０パーセント（重量ベースで）以上さらには望ましくは
少なくとも９９パーセント以上の天然に関連するその他
のタンパク質及び糖タンパク質から精製され切ってお
り、したがって実質的にこれらを含まないことを意味し
ている。これはＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質を
含む細胞、組織又は流体を、そのタンパク質に対して反
応するモノクローナル抗体を担持する免疫吸着剤カラム
といった標準的なタンパク質精製技術に付すことによっ
て達成することが可能である。
【００６５】ＧＲＢ−１遺伝子のヌクレオチド配列、及
びＧＲＢ−１タンパク質のアミノ酸配列は、図４に示さ
れている。ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び部
分的アミノ酸配列は、図１６に示されている。
【００６６】好ましい実施態様においては、ＧＲＢ−１
又はＧＲＢ−２あるいは未知のＧＲＢタンパク質は、レ
セプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化Ｃ末端ド
メイン、又はその機能的誘導体である本発明のプローブ
を、親和性プローブとして用いることによって、単離か
つ精製することができる。
【００６７】代替的には、硫酸アンモニウム沈殿、分子
ふるいクロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラ
フィーなどの標準的な方法の組合せにより、精製を達成
することができる。
【００６８】本発明のＧＲＢ−１及びＧＲＢ−２タンパ
ク質が、さまざまな細胞又は組織供給源から生化学的に
精製可能であることが理解できるだろう。天然のＧＲＢ
タンパク質の調製のためには、哺乳動物の胎盤又は脳と
いった組織が好まれる。
【００６９】もう１つの方法として、ＧＲＢ−１及びＧ
ＲＢ−２の遺伝子が単離又は合成できるため、このポリ
ペプチドは、要すれば、他のタンパク質すなわち原核生
物中の哺乳動物起源又は非哺乳動物真核生物における糖
タンパク質類を実質的に含まないように合成することが
できる。本発明において意図されているように、トラン
スフェクションによって生産されたＣＯＳ、ＮＩＨ−３
Ｔ３又はＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞において生産
される組換えＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２分子は、例え
ば、天然に存在するタンパク質配列であるか、あるい
は、その機能的誘導体である。天然産のタンパク質又は
糖タンパク質が組換え手法によって生産される場合、そ
れは、それが本来結びついている他のタンパク質及び糖
タンパク質を実質的に含まない形で提供される。
【００７０】さらには、固相支持体上で所望の配列を有
するポリペプチドを合成し、次いでその支持体から分離
するいくつかの方法が良く知られている。特に、本発明
のチロシン−リン酸化Ｃ末端ドメインプローブ又はその
機能的誘導体は、ホスホチロシンがチロシンの代りに提
供されるポリペプチド合成法を用いることによって合成
することができ、その結果、ポリペプチドのリン酸化さ
れたものが直接合成されることになる。
【００７１】本発明は、チロシン−リン酸化Ｃ−末端ド
メインポリペプチド及び／又はＧＲＢ−１及びＧＲＢ−
２タンパク質の「機能的誘導体」を提供する。
【００７２】「機能的誘導体」とはＧＲＢタンパク質の
「断片」、「変種」、「類縁体」又は「化学的誘導体」
を意味するが、これらの用語については、以下に定義す
る。機能的誘導体は、本発明による有用性を与える本来
のタンパク質の機能を少なくとも一部分を保持してい
る。本発明のいかなるタンパク質又はポリペプチド類の
「断片」も、該分子のサブセットすなわち短鎖ポリペプ
チドのことを言う。該タンパク質の「変種」とは、完全
ペプチド又はその断片に実質的に類似した分子のことを
言う。変種ペプチドは、当業界で周知の方法を用いるこ
とによって、変種ペプチドの直接化学合成によって好都
合に調製することができる。
【００７３】もう１つの場合として、該タンパク質のア
ミノ酸配列の変異種は、合成ペプチドをコードするＤＮ
Ａ中の突然変異によって調製することができる。そのよ
うな変異種には、例えば、該アミノ酸配列内の残基の欠
失体、又は、その挿入体もしくは置換体が含まれる。欠
失、挿入及び置換のいかなる組合せも、最終構成体が目
的とする活性を備えているかぎり、最終構成体に到達す
るために、適用することができる。明らかに変異ペプチ
ドをコードするＤＮＡにおいて起きる突然変異は、リー
ディング・フレームを変化させてはならず、二次的なｍ
ＲＮＡ構造を産出することが可能な相補性領域を創出し
ないことが好ましい（ヨーロッパ特許公報第ＥＰ７５，
４４４参照）。
【００７４】遺伝学的レベルにおいては、これらの変異
種は、通常、ペプチド分子をコードするＤＮＡにおける
ヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製され
（例えばAdelman ら、DNA 2: 183 (1983))、それによ
り、該変異種をコードするＤＮＡを生成し、その後、組
換え細胞培養中でＤＮＡを発現させ（下記参照）。これ
らの変異種は、通常、非変異ペプチドと同じ定性的な生
物学的活性を示す。
【００７５】チロシン−リン酸化ポリペプチド又はＧＲ
Ｂタンパク質の「類縁体」とは、完全分子又はその断片
に実質的に類似した非天然分子のことを言う。
【００７６】チロシン−リン酸ポリペプチド又はＧＲＢ
タンパク質の「化学的誘導体」は、通常はこのペプチド
の一部分ではない付加的な化学的部分を含む。このペプ
チドの共有結合変異（体）も本発明の範囲に含まれる。
そのような変異（修飾）は、該ペプチドの標的アミノ酸
残基を、選択された側鎖又は末端残基と反応することが
できる有機誘導体化剤と反応させることによって、その
分子中に導入することができる。
【００７７】システインニル残基は、殆どの場合、アル
ファ−ハロアセテート類（及び対応するアミン類）、例
えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応させら
れ、カルボキシメチル又はカルボキサミドメチル誘導体
を与える。システインニル残基は、また、ブロモトリフ
ルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−（５−イ
ミダゾリル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェー
ト、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリ
ジル・ジスルフィド、メチル・２−ピリジル・ジスルフ
ィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロ
−マーキュリ−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−
ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ダイアゾールとの
反応によっても誘導体化される。
【００７８】ヒスチジル残基は、pH５．５〜７．０にお
けるジエチルプロカーボネートとの反応によって誘導体
とすることができる。というのは、この試薬が、ヒスチ
ジル側鎖に対し比較的特異性があるからである。パラブ
ロモフェナシルブロミドもまた有用であり、反応は、
０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、pH６．０で行うのが
好ましい。
【００７９】リジニル及びアミノ末端残基は、無水コハ
ク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの
試薬による誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする
効果がある。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化する
に適した他の試薬には、メチル・ピコリンイミデートの
ようなイミドエステル類、ピリドキサール・ホスフェー
ト、ピリドキサール、クロロ水素化ホウ素、トリニトロ
ベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−
ペンタンジオンが含まれ、さらには、グリオキシレート
とのトランスアミナーゼ触媒による反応を適用してもよ
い。
【００８０】アルギニル残基は、一又は数種の従来の試
薬、中でも、フェニルグルオキサール、２，３−ブタン
ジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒド
リンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘
導体化には、グアニジン官能基の高pKa 値のために、ア
ルカリ性条件で反応を行うことが必要である。さらに
は、これらの試薬は、リジンの基とも、あるいは、アル
ギニンのイプシロンアミノ基とも反応することができ
る。
【００８１】チロシル残基そのものの特異的修飾につい
ては、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタ
ンとの反応によってチロシル残基中へスペクトルに掛る
標識（ラベル）を導入する特定の関心を持って、広汎に
研究が行われている。殆どの場合、Ｎ−アセチルイミダ
ゾール及びテトラニトロメタンが用いられ、Ｏ−アセチ
ル・チロシル体及び３−ニトロ誘導体を、それぞれ生成
する。
【００８２】カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグ
ルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル
−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カ
ルボジイミドのようなカルボジイミド類（Ｒ′−Ｎ−Ｃ
−Ｎ−Ｒ′）との反応によって、選択的に修飾される。
さらには、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモ
ニウム・イオンとの反応によって、アスパラギニル及び
グルタミニル残基に変換される。
【００８３】グルタミニル及びアスパラギニル残基は、
しばしば脱アミノ化されて、相当するグルタミル及びア
スパルチル残基となる。あるいはまた、これらの残基
は、穏やかな酸性条件下で脱アミノ化される。これらの
残基のいずれの形態も、本発明の範囲に入る。
【００８４】二官能性試薬による誘導体化は、水不溶性
支持体マトリックス又は他の巨大分子担体へ、ペプチド
を架橋結合させるのに有用である。通常使用される架橋
剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）
−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル類（例えば、４−アジド
サリチル酸とのエステル類）、３，３′−ジ−チオビス
（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシ
ンイミジルエステル類をはじめとするホモ二官能性イミ
ドエステル類、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オ
クタンのような二官能性マレイミド類が挙げられる。メ
チル−３−〔（ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕プロピオ
イミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を
形成することができる光活性化可能な中間体を生成す
る。もう一つの方法として、シアノゲン・ブロミド活性
化炭化水素のような反応性水不溶性マトリックス並びに
米国特許第３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；
４，１９５，１２８；４，２４７，６４２；４，２２
９，５３７；及び４，３３０，４４０に記載された反応
性基材がタンパク質の不溶化に用いられる。
【００８５】他の修飾反応としては、プロリン及びリジ
ンのヒドロキシル化（水酸化）、セリルもしくはスレオ
ニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギ
ニン及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル
化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecu
le Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco,
pp. 79-86 (1983)）、Ｎ末端アミンのアセチル化、そし
て、いくつかの場合には、Ｃ末端カルボキシル基のアミ
ド化が挙げられる。そのように誘導体化された部分は、
溶解性、吸収、生物学的寿命（耐久性）などを改善しう
るであろう。かかる部分は、一方で、該タンパク質等の
望ましくない副作用を除去ないしは軽減する。このよう
な効果をもたらす部分については、例えば、Remington'
s Pharmaceutical Sciences, 16th 編、Mack Publishin
g Co., Easton, PA (1980)に開示されている。
【００８６】本発明のための好ましい細菌宿主はE. col
i.（イー・コリ）である。他の実施態様においては、他
の細菌の種を使用することができる。さらに他の実施態
様においては、真核細胞、例えば、酵母、糸状菌等を利
用することができる。これらのタイプの細胞の使用は、
当業界で周知である。いかなる宿主も、発現プラスミド
中のレプリコン及び制御配列と適合性があるタンパク質
を発現するために用いられる。一般的に、宿主細胞と適
合する種から誘導された、レプリコン及びコントロール
配列を含むベクターが、該宿主と関連付けて用いられて
いる。ベクターは、通常、レプリコン部位及び感染され
るか形質転換された細胞において表現型の選択を与える
ことができる特定の遺伝子を有している。融合タンパク
質の発現もまた、形質転換されない状態にある生物に相
同的でありうる他の調節配列の制御下に置くことができ
る。
【００８７】本発明は、また、ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−
２タンパク質のエピトープに特異的な抗体、及び細胞、
細胞もしくは組織抽出物、又は生物学的流体中のＧＲＢ
タンパク質の存在を検出するか、又はその量もしくは濃
度を測定するための、かかる抗体の使用にも関する。
【００８８】「抗体」という用語は、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体及び
抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体を含むことを意図し
ている。ポリクローナル抗体は、抗原により免疫された
動物の血清から誘導された抗体分子の不均一集団であ
る。
【００８９】モノクローナル抗体は、特定の抗原に対す
る抗体の実質的に均一な集団である。ｍＡｂｓは、当業
者に公知の方法で得ることができる。例えば、Kohler及
びMilstein, Nature 256: 495-497 (1975)並びに米国特
許第４，３７６，１１０号参照。そのような抗体は、Ｉ
ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤ及びそれらの
サブクラスをはじめとする免疫グロブリンのいかなるク
ラスのものであってもよい。本発明のｍＡｂｓを産生す
るハイブリドーマは、生体外（in vitro）又は生体内
（in vivo)で培養することができる。生体内での高い力
価のｍＡｂｓの産生は、この方法を、しばしば、現在の
ところ好ましい産生方法にしている。簡潔に言うと、個
々のハイブリドーマからの細胞をプリスタンで感作した
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射し、目的とするｍＡ
ｂｓを高濃度で含む腹水を産生させる。ＩｇＭ又はＩｇ
ＧイソタイプのｍＡｂｓは、そのような腹水から、ある
いは培養上清から、当業者に周知のカラムクロマトグラ
フィーを用いることによって、精製することができる。
【００９０】キメラ抗体は、その異なった部分が異なっ
た動物種から誘導される分子、例えば、マウスｍＡｂｓ
から誘導される可変領域及びヒトイムノグロブリンの定
常領域を有するものである。キメラ抗体及びその製造方
法は、公知である（Cabillyら、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 81: 3273-3277 (1984); Morrisonら、Proc.Nat
l. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne
ら、Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly ら、ヨーロ
ッパ特許出願第１２５０２３（１９８４年１１月１４日
公開); Neubergerら、Nature 314: 268-270 (1985); Ta
niguchiら、ヨーロッパ特許出願第１７１４９６号（１
９８５年２月１９日公開); Morrisonら、ヨーロッパ特
許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開); N
eubergerら、ＰＣＴ出願第ＷＯ ８６／０１５３３（１
９８６年３月１３日公開); Kudo ら、ヨーロッパ特許出
願第１８４１８７（１９８６年６月１１日公開); Morri
son ら、ヨーロッパ特許出願第１７３４９４（１９８６
年３月５日公開); Sahaganら、J. Immunol. 137: 1066-
1074; Robinsonら、国際公開＃ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２
２６９（１９８７年５月７日公開);Liu ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA84: 3439-3443 (1987); Sunら、Pro
c. Nat. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Betterら、Sci
ence 240: 1041-1048。これらの参考文献は、ここに引
用によって、組み込まれる。
【００９１】抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、一
般に抗体の抗原結合部位に関連している独特の決定基を
認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、ｍＡｂのソースと同
じ種及び遺伝学的タイプ（例：マウスの株）の動物を、
それに対する抗−Ｉｄを作ろうとしているｍＡｂで免疫
することにより調製することができる。免疫された動物
は、イディオタイプの決定基に対する抗体（抗−Ｉｄ抗
体）を産生することにより、免疫抗体のイデオタイプの
決定基を認識し、それに応答する。
【００９２】抗−Ｉｄ抗体は、また、さらに他の動物に
おける免疫応答を誘起して、いわゆる抗−抗−Ｉｄ抗原
を産生させる「免疫原」として用いることもできる。こ
の抗−抗−Ｉｄは、抗−Ｉｄを誘起した元のｍＡｂに、
エピトープ的に同一でありうる。かくして、ｍＡｂのイ
ディオタイプの決定基に対する抗体を用いることによ
り、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定
することができる。
【００９３】したがって、本発明のＧＲＢタンパク質に
対して産生したｍＡｂｓはＢＡＬＢ／ｃマウスのごとき
適当な動物中で抗−Ｉｄ抗体を誘起するために用いるこ
とができる。そのような免疫されたマウスからの脾細胞
は抗−ＩｄｍＡｂｓを分泌する抗−Ｉｄハイブリドーマ
を産生するために使用される。さらに、この抗−Ｉｄｍ
Ａｂｓはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）
のような担体に結合させて、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウ
スを免疫することができる。これらのマウスからの血清
は、ＧＲＢタンパク質のエピトープに特異的な元のｍＡ
ｂの結合性能（結合能）を有する抗−抗−Ｉｄ抗体を含
むであろう。
【００９４】この抗−ＩｄｍＡｂｓは、かくして、それ
ら自身のイディオタイプのエピトープ、すなわち、ＧＲ
Ｂタンパク質−αのような評価さるべきエピトープに構
造的に類似した「イディオトープ」を有する。
【００９５】「抗体」という用語は、また、完全な分子
はもとより、例えば、抗原に結合することができるＦａ
ｂ及びＦ（ａｂ′)2のような、その断片（フラグメン
ト）をも含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ′)2
フラグメントは、完全抗体のＦｃフラグメントを欠き、
循環系からより速く除去され、そして、完全抗体よりも
より少ない非特異的組織結合能を有することができる
（Wahlら、J. Nucl. Med.24: 316-325 (1983)）。
【００９６】本発明に有用な抗体のＦａｂやＦ（ａ
ｂ′)2及びその他のフラグメントは、本明細書におい
て、完全抗体分子について開示された方法に従って、Ｇ
ＲＢタンパク質の検出及び定量に使用することができ
る。このようなフラグメントは、通常、パパイン（Ｆａ
ｂフラグメント類を産生する）又はペプシン（Ｆ（ａ
ｂ′)2フラグメント類を産生する）のような酵素を用い
る、タンパク質分解による切断によって産生される。
【００９７】抗体は、もしそれがある分子と特異的に反
応して、それにより、該抗体に該分子を結合させること
ができる場合に、該分子に「結合能を有する」と言われ
る。「エピトープ」なる用語は、抗体によって認識もさ
れうる、抗体によって結合される分子のその部分のこと
を言うことを意味する。エピトープすなわち「抗原決定
基」は、通常、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学
的に活性な表面群からなり、特定の三次元構造特性と特
定の電荷特性を有する。
【００９８】「抗原」は、抗体によって結合されること
ができる分子又は分子の部分であり、それは、さらに該
抗原のエピトープに結合可能な抗体を産生するように動
物を誘起することができる。抗原は、一つ又はそれ以上
のエピトープを有することができる。上述した特異的反
応とは、該抗原が、高度に選択的な形で、その対応する
抗原と反応はするが、他の抗原によって誘発されうる他
の抗体の多くのものとは反応しないことを示すことを意
味する。
【００９９】本発明において有用な抗体もしくは抗体の
フラグメントは、ＧＲＢタンパク質を発現する細胞の存
在を定量的又は定性的に検出するために用いることがで
きる。これは、光学顕微鏡による測定、フローサイトメ
トリーによる測定又は蛍光分析による測定と一緒に、蛍
光標識抗体（以下参照のこと）を用いる免疫蛍光技術に
よって達成される。
【０１００】本発明において有用な抗体（又はそのフラ
グメント類）は、ＧＲＢタンパク質をin situ検出する
ために、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡的分析におけるよ
うに、組織学的に使用することができる。in situ検出
は、患者から組織標本を取り出してそのような標本に本
発明の標識抗体を合わせることにより達成することがで
きる。これらの抗体（又はフラグメント）は、生物学的
試料に標識抗体（又はフラグメント）を塗るか、積層す
ることによって提供するのが好ましい。そのような手法
を使用することにより、ＧＲＢタンパク質の存在だけで
なく、試験された組織におけるその分布をも検出するこ
とができる。本発明を用いるに当って、当業者は、その
ような、その場での検出を達成するために広汎な組織学
的方法（例えば、染色方法）を修正することができるこ
とを容易に了解するであろう。
【０１０１】ＧＲＢタンパク質のこのような試験法は、
通常、ＧＲＢタンパク質を同定することができる検出可
能なように標識化された抗体の存在下で、生物学的流
体、組織抽出物、リンパ球もしくは白血球のごとき新た
に摂取された細胞又は組織培養でインキュベートされた
細胞のような生物学的試料をインキュベートし、数多く
の周知技術のいずれかによって該抗体を検出することを
特徴とする。
【０１０２】生物学的試料は、ニトロセルロースのよう
な固相支持体又は細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質
類を不溶化することができる他の固体支持体によって処
理することができる。該支持体を、次いで好適な緩衝液
で洗浄し、検出可能なように標識されたＧＲＢタンパク
質特異的抗体で処理することができる。該固相支持体
は、次に、非結合抗体を除去するために、緩衝液で再度
洗浄することができる。該固体支持体上の結合標識の量
を、次に、従来法を用いて検出することができる。
【０１０３】「固相支持体」とは、抗原又は抗体と結合
することができるものならいかなる支持体であってもよ
い。周知の支持体もしくは担体には、ガラス、ポリスチ
レン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、
ナイロン、アミラーゼ類、天然もしくは修飾セルロー
ス、ポリアクリルアミド、はんれい岩（gabbro）及びマ
グネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的に
照らして、ある程度可溶性であってもよく、あるいは、
不溶性であってもよい。この支持体の材料は、結合した
分子が抗原又は抗体を結合することができるかぎり、実
際上、いかなる可能な構造上の形態をとってもよい。か
くして、支持体の形状は、ビーズのように球形であって
もよく、あるいは、試験管の内側壁又はロッドの外壁の
ようにシリンダー状であってもよい。さらには、表面
は、シート、試験片等々のごとく、平坦であってもよ
い。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙
げられる。当業者ならば、抗体又は抗原を結合するため
の他の多くの適当な担体を知っているであろうし、日常
的実験によってそれを確認することができるであろう。
【０１０４】抗−ＧＲＢ−１及び抗−ＧＲＢ−２抗体の
与えられたロットの結合活性は、周知の方法によって測
定することができる。当業者は、日常的な実験を用いて
各測定用の操作上の最適条件を決定することができるで
あろう。
【０１０５】洗浄、撹拌、震盪、濾過等のごとき他の操
作を、個々の場合、通常行われるごとく、あるいはま
た、必要に応じて、試験法に付加することができる。
【０１０６】ＧＲＢ特異性抗原が検出可能であるように
標識化できる一つの方法は、それを酵素に結合させて、
酵素免疫試験法（ＥＩＡ）において使用することであ
る。この酵素は、次に、後にしかるべき基質に触れた場
合、該基質と反応して、例えば分光光度測定法、蛍光測
定法あるいは、肉眼による方法によって検出できる化学
的部分を生成する。抗体を検出可能なように標識するた
めに用いることができる酵素としては、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ、スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ、デル
タ−５−ステロイド・イソメラーゼ、イーストアルコー
ル・デヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェート・イソ
メラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、アルパラギナーゼ、グルコース
・オキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌク
レアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−
ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、
及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。検出は、酵素に対する色
原性基質を用いる比色測定法によって遂行することがで
きる。検出は、また、基質の酵素反応の程度を同様に調
製された標準と目視比較することによってもなされる。
【０１０７】検出は、種々の他の免疫試験法のいずれか
を用いて行うことができる。例えば、放射能で抗体又は
抗体のフラグメントを標識化することにより、ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いてＲ−ＰＴＰａｓｅを検
出することができる。ＲＩＡについての良き記述は、Wo
rk, T.S.ら、North Holland Publishing Company, NY(1
978）によるLaboratory Techniques and Biochemistry
in Molecular Biology 中に見出すことができる。特
に、ここに参考文献として包含する、Chard, T.による
「An Introduction to Radioimmune Assay and Related
Techniques」の章を参照のこと。ラジオアイソトープ
は、ガンマー計数器又はシンチレーション・カウンター
を用いるような手段あるいはオートラジオオートグラフ
ィーによって検出することができる。
【０１０８】抗体は、蛍光化合物によって標識すること
もできる。蛍光によって標識された抗体をしかるべき波
長の光に曝すと、その存在は、蛍光によって測定するこ
とができる。最も普通に用いられる蛍光標識化合物の中
には、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミ
ン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシ
アニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレスカミンが
含まれる。
【０１０９】抗体は、また、蛍光を発する金属、例えば
152Ｅｕやその他のランタノイド系列のものを用いても
検出可能なように標識することができる。これらの金属
は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）やエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレー
ト剤を用いて抗体に着けることができる。
【０１１０】抗体は、また、それを化学発光性化合物と
結合させることによっても検出可能なように標識化する
ことができる。化学発光部分をぶら下げた抗体の存在
は、次に、化学反応の過程で発生する発光（ルミネッセ
ンス）の存在を検出することにより測定される。特に有
用な化学発光性標識化化合物の例は、ルミノール、イソ
ルミノール、テロマチック（theromatic）・アクリジウ
ム・エステル、イミダゾール、アクリジウム塩及びシュ
ウ酸エステルである。
【０１１１】同様に、生物発光性化合物も、本発明の抗
体を標識するために用いられる。生物発光（Biolumines
cence)は、生物学的な系の中に見出される一種の化学発
光（Chemiluminescence)であり、この場合、触媒性タン
パク質（酵素）が化学発光反応の効率を高める。生物発
光性タンパク質は、ルミネッセンスの存在を検出するこ
とによって測定される。標識の目的に重要な生物発光性
化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエークオ
リン（aequorin）である。
【０１１２】本発明の抗体分子は、「二部位（two-sit
e）」法もしくは「サンドイッチ」法としても知られる
免疫測定試験に利用するために適合させてもよい。典型
的な免疫測定試験法においては、ある量の非標識化抗体
（又はその抗体のフラグメント）を固体支持体に結合さ
せ、検出可能なように標識された可溶性抗体の一定量を
加えると、固相抗体、抗原及び標識抗体の間に形成され
る三成分系コンプレックスの検出及び／又は定量ができ
る。
【０１１３】典型的で、かつ、好ましい免疫測定試験法
は、固相に結合していた抗体を先ず、テストされるべき
試料と接触させ、二成分系固相抗体−抗原コンプレック
スを形成することにより、試料から抗原を抽出する前進
試験（"forward assay")を含む。適当なインキュベーシ
ョン時間の後、固体支持体を洗浄して、もし存在するな
らば未反応抗原を含む、流体試料の残部を除去し、次に
未知量の標識抗体（それは「リポーター分子」として働
く）を含む溶液と接触させる。標識抗体をして、非標識
抗体を介して固体支持体に結合された抗原と複合体を形
成させるための第二のインキュベーション時間の後、固
体支持体を再び洗浄して、未反応の標識抗体を除去す
る。
【０１１４】本発明の抗原についても有用でありうるも
う一つの型の「サンドウィッチ（"sandwitch")法」にお
いては、いわゆる同時試験法（simultaneous assay）と
逆試験法（reverse assay)が用いられる。同時試験法
は、固体支持体に結合した抗体と標識抗体を同時に試験
さるべき試料に添加するため、単一のインキュベーショ
ン工程を要する。インキュベーション終了後、固体支持
体を洗浄して流体試料及び複合体を形成しなかった標識
抗体を除去する。固体支持体と結合した標識抗体の存在
を、次に、従来の前進（forward)サンドウィッチ試験に
おけるように測定する。
【０１１５】逆（reverse)試験法においては、段階的添
加が行われる。すなわち、先ず流体試料への標識抗体の
溶液の添加と、それに続いて適当なインキュベーション
時間の後、固体支持体に結合した非標識抗体の添加が行
われる。第２のインキュベーションの後、固相を従来の
やり方で洗浄して、試験されるべき試料の残りと、未反
応標識抗体の溶液を除く。固体支持体と結合した標識抗
体の測定は同時（simultaneous）試験法及び前進（forw
ard)試験法におけるようにして行われる。
【０１１６】例 Ｉ ニトロセルロース・フィルター上に不溶化された、ＳＨ
２ドメインを含むタンパク質に対するＥＧＦＲのＣ末端
ドメインの結合の検出可能性を測定するために、研究を
行った。この目的のために、細菌によって発現された融
合タンパク質へのＣ−末端ドメインの結合について調べ
た（Fig.１、参照のこと）。 Ａ．ＥＧＦＲのカルボキシ末端ドメインの単離と標識化 チロシンキナーゼドメインとカルボキシ末端ドメインを
含むＥＧＦＲの細胞内部分を、先に述べた様に、ヒトＥ
ＧＦＲの細胞内ドメインに相補的なｃＤＮＡを発現する
組換えバキュロウイルスから精製した（Hsu, C.Y.ら、C
ell Growth andDifferentiation 1: 191-200 (1990))。
この組換えタンパク質（２μg）を、次に、〔ガンマー
32Ｐ〕ＡＴＰ（２００μCi 、６，０００Ci／mmol）を
用い、４℃で、５mMＭｎＣｌ2 を含むＨＮＴＧ（２００
mMＨＥＰＥＳ、pH７．５、１５０mMＮａＣｌ、０．１％
Triton Ｘ−１００及び１０％グリセリン）緩衝液中で
リン酸化した。導入されなかった〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを
除去するために、１００μgのＢＳＡを含むpH７．５の
２０mMＨＥＰＥＳで１mlにまで稀釈し、次いで、Centri
con −１０中で５０μlの体積にまで濃縮した。この操
作を３回繰返すと、９９％を超える未導入ＡＴＰが除去
された。キナーゼドメインからＣ−末端ドメインを分離
するために、濃縮されたタンパク質を、次に、シアノゲ
ン・ブロミド（臭化シアン、ＣＮＢｒ）で、７０％ギ酸
中、１４時間、室温で消化した（下記例VIも参照のこ
と）。次いで、試料を３回水洗、乾燥し、結合用緩衝液
中、２×１０6cpm／mlになるように再懸濁させた。 Ｂ．ニトロセルロース上に不溶化された細菌によって発
現されたＴｒｐＥ／ＧＡＰ−ＳＨ２融合タンパク質へ
の、ＥＧＦＲのＣ末端ドメインの結合 ＴｒｐＥ及びＴｒｐＥ／ＧＡＰ−ＳＨ２を、Dr. Tony P
awson の研究室から得、そして、以前に述べたようにし
て調製した（Moran, M.F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87: 8622-8626 (1990))。フィルターへの結合の研
究を、発表された方法(Schneider, W.J.ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci., 76: 5577-5581 (1979);Daniel, T.O.
ら、J. Biol. Chem. 258: 4606-4611 (1983)）を少し修
正したものに従って行った。種々の濃度の、細菌によっ
て発現したＴｒｐＥ融合タンパク質か、あるいは、細菌
のタンパク質単独をニトロセルロースのフイルターにス
ポットした。５％カーネーション(Carnation)ドライミ
ルクを含むＰＢＳ中、４℃で、１時間フィルターをブロ
ックしたのち、ＥＧＦＲの32Ｐ−標識Ｃ末端ドメインを
添加し、一晩、４℃でインキュベーションを続けた。２
４時間後、ニトロセルロース・フィルターを、０．２％
Triton Ｘ−１００を含むＰＢＳで、室温で３回洗浄し
た。フィルターを乾燥し、−８０℃でKodak ＸＡＲ−５
フィルムに曝した。 Ｃ．結果 上述の方法は、細菌によって発現された５ng未満のＧＡ
Ｐ−ＳＨ２融合タンパク質に対するＥＧＦＲ Ｃ末端ド
メインの特異的結合の検出を可能にした。結合は特異的
であった。というのは、プローブのチロシンリン酸化を
必要としたし、関係がないタンパク質をニトロセルロー
ス・フィルターに塗布しても何も起きなかった。ＥＧＦ
Ｒ Ｃ末端ドメインが、ニトロセルロース・フィルター
上に不溶化されたＳＨ−２含有タンパク質に対し、特異
的結合することが出来たという事実は、本発明者らを、
元気づけて、新規なＥＧＦＲ結合性タンパク質の同定を
最終目的にして本研究をλｇｔ１１発現ライブラリーへ
応用させんとした。
【０１１７】例II 発現ライブラリーのスクリーニング及び新規なＳＨ２−
含有タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンの単離 ＥＧＦＲのチロシンリン酸化Ｃ−末端尾部を、上述した
いくつかの異ったヒト組織からの発現ライブラリーをス
クリーニングするためのプローブとして用いた。スクリ
ーニングの手法は、Fig.２にまとめてある。この手法を
用いて多くの陽性のクローンが、今までに同定されてい
るが、そのうちで二つを詳細に解析した。 Ａ．ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ヒト脳幹から単離されたｍＲＮＡから構成されたλｇｔ
１１（lambda gt 11）ライブラリーをM. Jaye から入手
した。このライブラリーをスクリーニングするため、λ
ｇｔ１１ファージを、１５０mmの寒天プレート当り４×
１０4 プラークが産生されるに充分な密度で、塗り付け
た。全部で６つのプレートを最初にスクリーニングし
た。これらのプレートを６時間４２℃でインキュベート
した後、これらのプレート上に、先に述べられたように
して(MacGregor, P.F.ら、Oncogene 5: 451-458 (199
0)）、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）で含浸しておいたニトロセルロースフィル
ターを重ねた。インキュベーションを、３７℃で一晩続
けた。次に、フィルターをとり出し、ｔＢＳＴ（１０mM
トリス−ＨＣｌ、pH８、１５０mMＮａＣｌ及び０．０５
％TritonＸ−１００）で、室温で洗浄し、次にＨＢＢ
（２０mMＨＥＰＥＳ、pH７．５、５mM Ｍｇ／Ｃｌ、１m
M ＫＣｌ）緩衝液（５％のカーネーション・ドライ・ミ
ルクを含む）で、１時間、４℃で上に述べたようにして
（上記MacGregor らの文献）、洗浄した。ブロッキング
に続いて、標識化チロシンリン酸化カルボキシ末端（Ｃ
−末端）ブローブを１．６×１０-4μg／mlの濃度で添
加し、インキュベーションを一晩続けた。フィルター
を、次に０．２％TritonＸ−１００を含むＰＢＳ中、室
温で３回洗浄した。フィルターを乾燥し、−８０℃でKo
dak ＸＡＲ−５フィルムに曝した。陽性のクローンに相
当する寒天プラグをプレートから集め、それをＳＭ培地
１ml中に入れた。寒天からファージを拡散させた後、フ
ァージを再塗布し、上述したようにして再スクリーニン
グした。次のスクリーニングで富化（enrichment）を示
したファージを単離し、配列を決めた。λｇｔ１１ファ
ージＤＮＡは、Maniatisらに従ってプレート・ライセー
ト法で単離し、ＥｃｏＲＩ−消化Ｍ１３ＭＰ１９（Mani
atisら、1988）へサブクローニングした。単鎖ＤＮＡを
単離し、Sequenase ＤＮＡ配列決定キット（U.S. Bioch
emical）を用いて、ジデオキシ鎖終了法（dideoxy chai
n termination method）によって配列を決めた。一つの
実験においては、ヒト脳幹λｇｔ１１ライブラリーから
の２４０，０００pfu をスクリーニングした。単一のプ
ラーク、クローンｋｉ４（Fig.３Ａ）を単離した。次の
スクリーニングで、このクローンは富化（enrichment）
を示し、第３回目のスクリーニングで全てのプラークが
プローブに結合した（Fig.３Ｂ）。クローンｋｉ４は、
約９００ヌクレオチドの挿入物を含み、この挿入物は、
ＩＰＴＧを用いてｌａｃプロモーターを誘発すると、Ｅ
ＧＦＲに結合可能な融合タンパク質を産生した。融合タ
ンパク質のサイズ（大きさ）から、ｃＤＮＡ挿入物が約
３００アミノ酸のタンパク質（このサイズは、もしもｃ
ＤＮＡが単一の大きなオープンリーディングフレームを
含んでいるならば予想された大きさである）をコードし
ていることが予想された。クローンｋｉ４をより詳しく
分析するために、ＤＮＡを単離し、ヒトｃＤＮＡ挿入物
に相当するＥｃｏＲＩフラグメントをＭ１３中にサブク
ローニングし、配列を決めた。この挿入物からの配列の
翻訳から単一の大きなオープンリーディングフレームが
示され、これは、ジーンバンク（Genbank）のデータベ
ースによれば、他の公知のタンパク質のＳＨ２ドメイン
と配列ホモロジーを有する約１００アミノ酸の単一伸長
部を含むことが判った（Fig.４及び５Ａ）。しかしなが
ら、他のドメインには配列ホモロジーは記録されなかっ
た。こうして、このスクリーニング法を用いて、ＥＧＦ
Ｒに結合可能な、新規なＳＨ２含有タンパク質が同定さ
れた。 Ｂ．完全長ｃＤＮＡの単離 単離された最初のクローンはＳＨ２ドメインをコードし
ていたが、遺伝子の３′又は５′末端を含んでいなかっ
た。完全長のｃＤＮＡを単離するために、ライブラリー
を、最初の陽性ファージから単離されたＤＮＡを用いて
再スクリーニングした。陽性のクローンを発現した組換
えＭ１３バクテリオファージからのＤＮＡを、温度サイ
クラー（Thermal cycler）、ＴａｑＩポリメラーゼ、及
びＭ１３ベクターのＥｃｏＲＩフランキング領域に相補
的なオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。情報（info
rmation)中により多くの５′配列を含むクローンを得る
ために、最初の単離されたファージの最も５′側の２５
０ヌクレオチドに相当する第２の増幅ＤＮＡ生成物もま
た、この領域の両端における配列に相補的なオリゴヌレ
オチドを用いて生成させた。〔32Ｐ〕−標識化ＤＮＡプ
ローブを、次に、この増幅生成物のニックトランスレー
ションによって調製した。ｃＤＮＡライブラリーを再ス
クリーニングするために、このライブラリーを上述の様
にして再塗布した。プレートを３７℃で８時間インキュ
ベートしたのち、プレートを１時間４℃に冷却、次いで
ファージＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移し
た。フィルターを０．２Ｎ ＮａＯＨと１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌの溶液中で変性させ、次いで、減圧下、２時間、８
０℃でベーキングした（Sambrook, J.ら、Molecular Cl
oning: A Laboratory Maunal, 2nd Edition, Cold Spri
ng Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)）。
このフィルターを、４２℃で１時間プレハイブリダイゼ
ーションに付した後、32Ｐ−標識ＤＮＡプローブを添加
し、ハイブリダイゼーションを、４２℃で一晩、５×De
nhardt's 、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ、２００mM Tris−ＨＣｌ、pH７．６及び１０
０μg／mlのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で続けた。こ
れらのフィルターを、次いで、０．１×ＳＳＣ及び０．
１％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄し、乾燥し、そして、Ko
dak ＸＡＲ−５フィルムに−７０℃で曝した。次いで、
陽性クローンを単離し、上述のようにして配列を決め
た。クローンｋｉ４からの挿入物は、遺伝子の３′及び
５′末端を欠いていたため、ライブラリーを、クローン
ｋｉ４からのＤＮＡを増幅することによって生成した二
つのＤＮＡプローブを用いて再スクリーニングした。こ
の手法は、さらに５つのクローンの同定を可能にした。
これらのクローンのうち三つが最初のクローンｋｉ４か
ら３′伸長しており、それらのうち二つ、すなわち、ク
ローンｋｉ２．２及びｋｉ２．４は、ポリアデニル化シ
グナル及び長い３′非翻訳ドメイン（＞１，０００ヌク
レオチド）を含んでいた。さらに、これらのクローン
は、第２のＳＨ２ドメインを含むタンパク質をコードし
ていた（Fig.４及び５Ａ）。他二つのクローン、すなわ
ち、ｋｉ３．０及びｋｉ５．３は、クローンｋｉ４から
５′伸長していた。両クローンは、長いオープンリーデ
ィングフレームとKozak によって定義された翻訳開始基
準に合うＡＵＧコドンを含んでいた（Kozak,M., J. Cel
l. Biol. 108： 229-241 (1989))。しかしながら、クロ
ーンｋｉ３．０だけが、タンパク質に翻訳してジーンバ
ンク中の公知の配列と比較したとき、他の公知のタンパ
ク質中に存在するＳＨ３ドメインに相同な５０アミノ酸
のドメインを含んでいることが見出された。重複クロー
ン、ｋｉ２．２及びｋｉ３．０によってコードされた完
全長タンパク質の予想された分子量は、約８４kDa であ
った。この新しいタンパク質をＧＲＢ−１と名付けた。
【０１１８】例III ＧＲＢ−１タンパク質は、ＳＨ２及びＳＨ３ドメインを
含んでいる。 ＧＲＢ−１タンパク質の配列を、ジーンバ
ンクのデータベース中の配列と比較して分析したとこ
ろ、アミノ酸３３３及び６２４のところから発する、約
１００アミノ酸の２本の伸長部の存在が明らかとなった
が、これらは、ＥＧＦＲと相互作用することが知られて
いる他のタンパク質のＳＨ２ドメインと配列の相同性を
示していた（Fig.５Ａ）。ＧＲＢ−１は、タンパク質の
レベルでは、他のＳＨ２ドメインに驚くべき相同性を示
したが、ＤＮＡレベルでは、有意な相同性は明らかにな
らなかった。ＧＲＢ−１は、また、Ｎ−末端ドメインに
位置し、ＳＨ３ドメインに対する配列の相同性を有する
５０アミノ酸のセグメントを含んでいた（Fig.４及び５
Ｂ）。ＧＲＢ−１の構造的機構の、いくつかの他のＳＨ
２／ＳＨ３含有タンパク質との比較を、Fig.６に示し
た。この模式図から明らかなように、ＳＨ２及びＳＨ３
ドメインの局在化は、タンパク質毎に異なる。このこと
にもかかわらず、これらのＳＨ２含有タンパク質間に
は、ある類似性と相違が存在する。ＧＲＢ−１は、ＰＬ
Ｃ−ガンマ及びＧＡＰのようなＥＧＦＲと相互作用する
ことが判っているいくつかの他の基質と、ＧＲＢ−１が
２つのＳＨ２ドメインと一つのＳＨ３ドメインを含んで
いるという点で相似ている。しかしながら、これらの基
質とちがって、ＧＲＢ−１は、公知の触媒性ドメインに
は相同性を示さず、この点でトリ肉腫ウイルスによって
コードされたタンパク質ｖ−ｃｒｋに似ている。これら
のドメイン以外では、ジーンバンクにある他のタンパク
質配列とは何らの配列の相同性はなかった。特に、ＧＲ
Ｂ−１は、ＡＴＰ−結合共通ドメインを欠いており、セ
リン／トレオニン・キナーゼ又はチロシン・キナーゼと
配列上の相同性を示さなかった。このＳＨ２ドメイン
は、それによって酵素学的に明白なシグナル分子がチロ
シンキナーゼ活性を有する活性化レセプターに結合しう
る共通のモチーフを与えるものと考えられている(Mora
n, M.F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8622-862
6 (1990); Anderson, D. ら、Science 250: 979-982 (1
990))。ＧＲＢ−１中（Fig.４）及びＧＲＢ−２中のＳ
Ｈ２ドメインの存在は、このドメインが、ＥＧＦＲのＣ
−末端尾部とこれらのタンパク質の相互作用を仲介して
いるという点で、このドメインの重要性を強調する。さ
らには、チロシン・レセプターと相互作用することがで
きる多くのタンパク質が同定されずにいることから、こ
のことは、このタンパク質のファミリーのさらなるメン
バーが発見されるであろうことを示唆している。ＧＲＢ
−１は、２つのＳＨ２ドメインを含んでいる他に、ＳＨ
３ドメインをも含んでいる。ＳＨ３ドメインは、多くの
ＳＨ２含有タンパク質に共通に見られる、約５０個のア
ミノ酸からなる非触媒ドメインである。ＳＨ３ドメイン
は、スペクトリン（spectrin）やフォドリン（fodrin）
のような細胞骨格タンパク質中にも見出されているの
で、このドメインの機能は、これらのタンパク質を、そ
れらが他の分子と相互作用するであろう膜もしくはサブ
メンブランの細胞骨格に、局在化させんとする点にあり
得る。ＧＲＢ−１の推定されるアミノ酸配列を、トリの
ガン遺伝子ｖ−ｃｒｋによってコードされたタンパク質
生成物と比較することは、ＧＲＢ−１の機能を明らかに
するかも知れない。遺伝子ｖ−ｃｒｋは、一次的にはＳ
Ｈ２及びＳＨ３ドメインに融合したウイルスのｇａｇタ
ンパク質から構成されるタンパク質をコードする(Maye
r, B.J.ら、Nature 332: 272-275 (1988)）。ＧＲＢ−
１及びＰ４７gag- crk タンパク質は公知の触媒ドメイン
とは相同性がない。しかしながら、Ｐ４７ gag-crk で形
質転換されたニワトリ胚繊維芽細胞は、高いレベルのホ
スホチロシン含有タンパク質を示す(Mayer, B.J.ら、上
記；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2638-2642 (199
0); Matsuda, M.ら、Scince 248: 1537-1539 (199
0)）。ｖ−ｃｒｋ生成物が、ｖ−ｃｒｋ形質転換細胞中
でいくつかのホスホチロシン含有タンパク質を結合させ
ることが示されているからには、ｃ−ｃｒｋの機能は、
おそらく、キナーゼと基質の橋渡しをすることであろ
う。この点で、ＧＲＢ−１が、ＧＡＰ及びＰＬＣ−ガン
マと同様に、二つのＳＨ２ドメインを含み、これらの組
合せが、他のタンパク質を活性化されたチロシンキナー
ゼレセプターに結合させるのに理想的に適しているとい
うことは、興味深い。
【０１１９】例IV ＧＲＢ−１発現のノーザン分析 Ａ．方法 全細胞性ＲＮＡを、Sambrook, J.ら（上述）によって記
載されたグアニジウムイソシアナート／塩化セリウム法
により、サルの組織から調製した。Ｐｏｌｙ（Ａ）＋Ｒ
ＮＡは、オリゴ（ｄＴ）セルロース・クロマトグラフィ
ーによって調製した。ノーザン分析のために、ＲＮＡを
１．２％アガロース／２．２Ｍホルムアルデヒドゲル中
の電気泳動によって大きさ別に分画し、毛細管作用によ
ってナイロン膜上に移し、８０℃で２時間加熱した。プ
レ（予備）ハイブリダイゼーションに続き、ブロット
を、上述のようにして調製した〔32Ｐ〕−ニックトラン
スレーションＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。
ハイブリダイゼーションは、４２℃で一晩、５０％ホル
ムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び５×Denhar
dt'sの存在下、行った。膜（メンブレン）を、次に、
０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、４２℃で洗浄し、
Kodak ＸＡＲフィルムに、−７０℃で１２時間、強化ス
クリーンを用いて曝した。 Ｂ．結果 新たに単離されたｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの発現に
ついて試験するために、クローンｋｉ４からの挿入物に
対応するＤＮＡをプローブとして用いる、異なったサル
組織ｍＲＮＡのノーザン・ブロット分析によって、検討
した多くの組織中に４．４kb及び７．０kbの２つの主バ
ンドの存在が示された（Fig.７）。発現は、脳において
最も高く、心臓、脾臓、肝臓及び胸腺は、次第に低くな
って行くレベルの発現を示した。４．４kbのメッセンジ
ャーは、単離されたクローンをコードするであろうトラ
ンスクリプト（transcript）の予想された大きさに対応
する。多の組織において観察された４．４kb及び７．０
kbのトランスクリプトとは対照的に、皮膚は、３．６kb
及び６．６kbの２つのわずかに小さい大きさのｍＲＮＡ
を含んでいた。３．６、６．６及び７．０kbのトランス
クリプトは、あるいは、ｍＲＮＡのスプライシングされ
た形のものを表わしている可能性もあり、また、別個
の、しかしながら関連するｍＲＮＡの種をコードしてい
る可能性がある。
【０１２０】例Ｖ 抗−ＧＲＢ−１抗体の産生及びＧＲＢ−１融合タンパク
質の分析 Ａ．方法 ポリクローナル抗体を、最初の単離されたファージクロ
ーンｋｉ４によって発現されたβ−ガラクトシダーゼ融
合タンパク質で、ウサギを免疫することにより生産し
た。E. coli CAG 456 細菌(Yale UniversityのDr. Mich
ael Snyderより入手）を、組換えファージｋｉ４で、mo
i１０で感染させ、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質を、１．５時間後、タンパク質ペレットから回収し
た。タンパク質抽出物を調製し、６％ＳＤＳ−ゲル上で
分離し、融合タンパク質に相当するバンドをゲルから切
り取り、これを免疫に使用した。ヒトのグリオブラスト
ーマ細胞株Ｕ１２４２、ラット膀胱ガン細胞株ＮＢＴI
I、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％の子ウシ血清を補
足したＤＭＥＭ培地で密集状態になるまで成長させた。
細胞は、０．５％子ウシ血清中、〔35Ｓ〕−メチオニン
（５０μCi ／ml）で標識し、先に述べられているよう
にして、１２時間後に溶解させた（Margolis, B.ら、Ce
ll 57: 1101-1107 (1989))。タンパク質Ａ−セファロー
スにカップリングした抗体１０μlで免疫沈殿を行った
後、ビーズを、２０mMＨＥＰＥＳ、pH７．５、３００mM
ＮａＣｌ、１０％グリセリン、１％Triton Ｘ−１０
０、０．１％ＳＤＳ及び１％ナトリウム・デオキシコー
レートを含む溶液で３回洗浄した。試料緩衝液中で沸と
うさせたのち、タンパク質を、８％ＳＤＳ−ゲル上で分
離した。 Ｂ．結果 ポリクローナル抗体が、最初の単離されたファージによ
って発現されたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質に
対して誘起された。生合成的に標識した細胞を用いる免
疫沈殿実験によれば、これらの抗体は、三つの異なった
細胞株における８５kDa のタンパク質を認識したことが
明らかとなった（Fig.８、“Ｉ”と指定されたレー
ン）。この抗血清による８５kDa タンパク質の認識は特
異的である。というのは、プレ免疫血清はこのタンパク
質を認識しなかったからである（“Ｐ”と指定されたレ
ーン）。これらの結果は、クローン化ＧＲＢ−１のアミ
ノ酸配列に基づく予測された分子量に支持を与えた。 Ｃ．検討 ＧＲＢ−１の遺伝子は予想された分子量８５kDa を有す
るタンパク質をコードするという知見並びに、ＧＲＢ−
１に対する抗体が三つの異なった細胞株からの８５kDa
タンパク質を免疫沈澱させたという事実は、ＧＲＢ−１
が、以前、活性化成長因子レセプターと会合（結合）す
ることが以前から示されている特定のタンパク質、すな
わちｐ８５を表すことができることを示唆している。ｐ
８５の正確な機能（役割）は未知であるが、それは、お
そらく、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ３）−キナ
ーゼであると思われる。というのは、ＰＩ３−キナーゼ
活性が、ＰＤＧＦで刺激された細胞ならびにミドルＴ−
抗原（ＭＴＡｇ）で形質転換された細胞中で見出された
８５kDa タンパク質と共に精製されたからである（Kapl
an, D.R.ら、Cell 50: 1021-1029 (1987); Whitman, M.
ら、Nature 315: 239-242 (1985); Coughlin, S.R.ら、
Science 243: 1191-1194 (1989))。ＡＴＰ結合部位の欠
除は、ＧＲＢ−１は、おそらく、十中八九、ホスホリピ
ッドキナーゼではないことを示す。ＧＲＢ−１は、マウ
ス及びウシｐ８５と９７％配列が一致している。したが
って、ＧＲＢ−１は、ｐ８５のヒトの対応物である。組
換えｐ８５は、活性化ＰＤＧＦＲ又はＥＧＦＲに結合す
ることはできるが、それ自身本来的なＰＩ３キナーゼ活
性を有さない。しかしながら、ｐ８５は、ＰＩ３キナー
ゼの触媒性サブユニットでありうる１１０kDa のチロシ
ンリン酸化タンパク質と関連を有することが判ってい
る。ＰＩ３キナーゼとｐ８５間の厳密な関係は知られて
いないものの、ｐ８５の過剰発現（overexpression）は
ＰＩ３キナーゼとＰＤＧＦＲの間の相互作用を調節す
る。ｐ８５は、調節サブユニットとして、又は活性化さ
れたレセプターとＰＩ３キナーゼ間の橋渡しとして働く
可能性がある。
【０１２１】例VI ＥＧＦレセプターのチロシンリン酸化カルボキシ末端は
ＧＡＰ及びＰＬＣ−ガンマの結合部位である 以下に述べる研究は、ＰＬＣ−ガンマと、ＧＡＰのＳＨ
２及びＳＨ３ドメインを含む融合タンパク質（ｔｒｐＥ
／ＧＡＰ ＳＨ２）の結合が、ＥＧＦＲの自己リン酸化
によって特異的に制御されていることを確認する。結果
が示すところによれば、ＰＬＣ−ガンマのリン酸化は、
そのＥＧＦＲとの会合を実際に減少させている。提示さ
れた証拠によれば、ＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡ
Ｐ ＳＨ２融合タンパク質の両者は、ＥＧＦＲのチロシ
ンリン酸化Ｃ−末端に特異的に結合することが示されて
いる。つまり、これらの結果は、ＳＨ２／ＳＨ３ドメイ
ンがＥＧＦレセプターのホスホチロシン含有ドメインと
直接相互作用することを示している。
【０１２２】Ａ．材料及び方法 １．細胞株、変異レセプター及び融合タンパク質 細胞株ＣＤ１２６（Margolis, B.L.ら、J. Bio. Chem.
264： 10667-10671 (1989a)）、ＨＥＲ１４、Ｋ７２１
（Honegger, A.M.ら、Cell 51: 199-209 (1987); Honeg
ger, A.M. ら、Mol. Cell. Biol. 7: 4567-4571 (198
7)）を、それぞれ野生型ＥＧＦレセプター、キナーゼ陰
性（kin-）ＥＧＦレセプター及びＣ−末端（C-termina
l）を短縮した（truncated)ＥＧＦレセプターのソース
として用いた。ＥＧＦレセプターの細胞内ドメイン（Ｅ
ＧＦＲ−Ｃ）を、バキュロウイルスの発現システム（Hs
u, C. J.ら、Cell Growth Differ. 1： 191-200 (199
0))から精製した（Fig.９Ａ）。３ＴＰ１、すなわちト
ランスフェクションを受けたＰＬＣ−ガンマのｃＤＮＡ
を過剰に発現するが、ＥＧＦレセプターを持たない細胞
株を、ＰＬＣ−ガンマのソースとして用いた（Margoli
s, B.ら、Science 248： 607-610 (1990b)）。ＧＡＰ
ＳＨ２ドメイン（ＧＡＰ残基１７１−４４８、Fig.９
Ｂ）を含むｔｒｐＥ融合タンパク質の調製については、
すでにMoran らによって記載されている(Moran, M.F.
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8622-8626 (199
0))。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２融合タンパク質を含む
バクテリアのライセートは、１ｇのバクテリアを３mlの
５０mM Tris pH７．５、０．５mMＥＤＴＡ、０．１mM
ＰＭＳＦに再懸濁させることによって調製した。１mg／
mlリゾチーム及び０．２％ＮＰ−４０中、４℃でインキ
ュベーションを行ったのち、細胞を５秒間、５回超音波
処理し、ライセートを１０，０００ｇで３０分間遠心す
ることにより清澄にした。バクテリアのライセートを、
上述したような、プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻
害剤を含む１％Tritonリシス（lysis)緩衝液中で１：１
００に稀釈し、プロテインＡ−セファロースで予めクリ
アにした。 ２．抗体、免疫沈澱及び免疫ブロッティング 次の抗−ＥＧＦＲ抗体（Fig.９Ａ）を用いた。すなわ
ち、 （ａ）ｍＡｂ１０８、細胞外ドメインのドメインIII（d
omainIII）に対するモノクローナル抗体(Lax, I.ら、EM
BO J. 8: 421-427 (1989)); （ｂ）残基９８４−９９６に特異的な抗ペプチド抗体Ｒ
Ｋ２； （ｃ）残基１１７６−１１８６に特異的な抗ペプチド抗
体Ｃ；及び （ｄ）残基６５６−６７６に特異的な抗ペプチド抗体Ｆ ｔｒｐＥ融合タンパク質を免疫沈澱させるために、アガ
ロースに結合した抗−マウスＩｇＧ（Sigma)に結合した
ｔｒｐＥに対するマウスのモノクローナル抗体（Oncoge
ne Science）を利用した。免疫ブロッティング用には、
ｔｒｐＥに対するウサギのポリクローナル抗体を用いた
(Moran, M.F.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 862
2-8626 (1990))。ＰＬＣ−ガンマを、先に述べたウサギ
のポリクローナル抗−ペプチド抗体を用いて免疫ブロッ
ティング及び免疫沈澱に付した（Margolis, B.ら、Cell
57: 1101-1107 (1989b)）。手法については、本発明者
らの研究室から出たいくつかの文献に記載されている
（Margolis, B.L.ら、J. Biol. Chem. 264: 10667-1067
1 (1989); Cell 57: 1101-1107 (1989))。刺激されてい
ない細胞を１０％子ウシ血清を含むDulbecco'sModified
Eagle 培地中で密集状態になるまで成育させ、プロテ
イナーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む１％Triton
Ｘ−１００リシス用緩衝液中で溶菌する前に１％ウシ胎
児血清中で一晩飢餓状態にした。ＥＧＦレセプターを、
プロテインＡ−セファロースに結合した抗体を用いて免
疫沈澱させた。レセプター材料をＨＮＴＧ（２０mMＨｅ
ｐｅｓ、pH７．５、１５０mMＮａＣｌ、０．１％Triton
Ｘ−１００及び１０％グリセリン）で洗った後、５mMＭ
ｎＣｌ2 及び３０μMＡＴＰを添加することによって自
己リン酸化を誘発した。対照（コントロール）は、Ｍｎ
2+のみと共にインキュベートした。ＨＮＴＧでさらに洗
浄したのち、ＰＬＣ−ガンマ（３ＴＰ１細胞から）か、
細菌の融合タンパク質のどちらかを含むライセートを添
加した。９０分間結合反応を進行させたのち、ＨＮＴＧ
による洗浄をさらに３回行い、そして試料をＳＤＳゲル
上に流し、免疫ブロッティングに付した。 ３．臭化シアン（ＣＮＢｒ）分解 ＥＧＦＲ−Ｃを、４℃で、ＭｎＣｌ2 及びＡＴＰを用い
て、時には、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ（NEN/Dupont、６，０
００Ci／mmol）の存在下でリン酸化した。レセプター調
製物を、次に、１００μgＢＳＡを含む２０mMＨＥＰＥ
Ｓ、pH７．５中に再懸濁させ、Centricon １０（Amico
n）中で５０μlに濃縮した。次いで、２４０μlの８８
％ギ酸を、２粒のＣＮＢｒと共に添加し、試料を、窒素
雰囲気下、暗所に、室温で、１４時間保存した。試料を
Speed-Vac (Savant)中で乾燥させ、３回水洗し、次いで
１％Tritonリシス緩衝液中に再懸濁した。
【０１２３】Ｂ．結果 天然型ＥＧＦＲ及び変異ＥＧＦＲに対するＰＬＣ−ガン
マの結合について比較を行った（Fig.９Ａ）。先ず、天
然型レセプター及びトランスフェクションされたＮＩＨ
−３Ｔ３細胞からの変異レセプターを免疫沈澱させ、レ
セプターの免疫沈澱のいくつかを、in vitroで、ＡＴＰ
及びＭｎ2+を用いて自己リン酸化させた（Margolis, B.
ら、Mol. Cell. Biol. 10: 435-441 (1990a)）。次に、
ＰＬＣ−ガンマを過大発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞から
のライセート（Margolis, B.ら、Science 248: 607-610
(1990b)）を添加し、結合反応を４℃で９０分間進行さ
せた。免疫沈澱をＨＮＴＧで洗浄したのち、結合したＰ
ＬＣ−ガンマの量を免疫ブロッティングによって調べ
た。Fig.１０に例証されているように、ＰＬＣ−ガンマ
はチロシンリン酸化天然型レセプターにのみ結合し、非
リン酸化レセプターには結合しなかった。次に、自己リ
ン酸化の重要性を検証するために、変異レセプターを用
いた２つの研究を行った。最初に調べるべきことは、Ｃ
−末端から１２６のアミノ酸を欠き（ＣＤ１２６、Fig.
９Ａ）、かつ、４つの主要な自己リン酸化部位を欠いた
短縮型ＥＧＦレセプター（Downward, J.ら、Nature 31
1: 483-485 (1984)）に対するＰＬＣ−ガンマの結合で
あった。この短縮型レセプターは、おそらくは、チロシ
ン９９２のところで自己リン酸化された（Walton, G.M.
ら、J. Biol. Chem.265: 1750-1754 (1990)）。しかし
ながら、このレベルのチロシンの自己リン酸化にもかか
わらず、ＰＬＣ−ガンマの結合は、完全長レセプターに
比べて著しく減少した。減少した結合は、また、２個の
自己リン酸化部位を含むＣ−末端の６３残基を欠く欠失
変異ＥＧＦレセプターであるＣＤ６３についても観察さ
れた。これらの結果は、レセプターのＣ−末端が、ＰＬ
Ｃ−ガンマがＥＧＦレセプターに結合したり、あるい
は、ＰＬＣ−ガンマのＥＧＦレセプターへの結合を調節
する際に果す役割を示唆している。Fig.１０は、また、
ＰＬＣ−ガンマがｋｉｎ- 変異レセプターに結合するこ
とができないことを示している。この点に関する自己リ
ン酸化の重要性を精査するために、ｋｉｎ- レセプター
をＣＤ１２６レセプター（Honegger, A.M.ら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 86: 925-929 (1989))と交差リン酸
化させた。この結果、ＰＬＣ−ガンマの結合は、天然型
レベルまで平準化された。このことは、ｋｉｎ- レセプ
ターのリン酸化は、ＰＬＣ−ガンマへの結合を平準化す
るに充分であることを示した。ｋｉｎ- レセプター単独
でも、リン酸化ののちには、ＰＬＣ−ガンマと結合する
ことができることを確認するために、このレセプター
を、ｍＡｂ１０８には結合しない可溶性の、バキュロウ
イルス発現ＥＧＦＲ細胞質ドメイン（ＥＧＦＲ−Ｃ）と
交差リン酸化させた（Fig.９Ａ）。交差リン酸化は、Ｃ
Ｄ１２６変異体の場合に比べて強いものではなかったけ
れども、Ｋ７２１Ａ変異体のチロシンのリン酸化及びＰ
ＬＣ−ガンマの結合は明らかに検出された。この知見
は、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化がＰＬＣ−ガンマの結
合を促進することを確認している。天然型ＥＧＦＲとＰ
ＬＣ−ガンマ間の相互作用におけるＰＬＣ−ガンマのチ
ロシンリン酸化の役割りを調べた。チロシンリン酸化Ｐ
ＬＣ−ガンマは、ＥＧＦＲから、非リン酸化ＰＬＣ−ガ
ンマよりも容易に解離しうる（Fig.１１）が、このこと
は、チロシンリン酸化ＰＬＣ−ガンマのＥＧＦＲに対す
るアフィニティーが低いことを示している。
【０１２４】これらの知見を、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ
２ドメイン（Fig.９Ｂ）を含む融合タンパク質の、バキ
ュロウイルスによって発現されたＥＧＦＲ−Ｃへの結合
に関する検討にまで拡げた。完全長ＥＧＦＲ及びＰＬＣ
−ガンマの場合のように、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２融
合タンパク質ドメインは、チロシンリン酸化ＥＧＦＲ−
Ｃにのみ結合した（Fig.１２Ａ）。ｔｒｐＥタンパク質
単独では、ＥＧＦＲ−Ｃに結合しなかった。同様に、リ
ン酸化ＥＧＦＲ−ＣはｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２にのみ
結合した。しかしながら、非リン酸化ＥＧＦＲ−Ｃの非
特異的結合は高い（Fig.１２Ｂ）。これらの結果は、Ｅ
ＧＦＲの結合部位がその細胞内ドメインに位置すること
を示している。一般に、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２融合
タンパク質は、ＰＬＣ−ガンマよりもより高い化学量論
で、完全長のＥＧＦＲに結合した。しかしながら、この
融合タンパク質はＥＧＦＲによってチロシンリン酸化が
なされなかった。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２タンパク質
は、ＣＤ１２６欠失変異体（Fig.１３Ａ）に比べて、リ
ン酸化完全長レセプターに対し、はるかに良い。Fig.１
３Ｂに示されるように、ＥＧＦＲ−Ｃによるｋｉｎ- 完
全長ＥＧＦレセプターの交差リン酸化によって、それが
ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２タンパク質に結合できるよう
になった。対照群においては、ＥＧＦＲ−Ｃは、おそら
くは、このレセプターがすでに最大限にチロシンがリン
酸化されているためであろうが、ＣＤ１２６レセプター
への結合能を向上させないことが示された（Fig.１３
Ａ）。また、ＥＧＦレセプター（Fig.１３Ｂ）を含まな
い細胞からのｍＡｂ１０８免疫沈澱の存在下でＥＧＦＲ
−Ｃを試験したところ、結合は観察されなかった。この
ことは、ＥＧＦＲ−Ｃの効果は、セファロースに対する
チロシンリン酸化ＥＧＦＲ−Ｃの非特異的結合のせいで
はあり得ないことを示している。これらの研究は、結合
を仲介する際の自己リン酸化の重要性を確認し、かつ、
ＥＧＦレセプター結合については、ＧＡＰ ＳＨ２ドメ
インは、そのままのＰＬＣ−ガンマに類似した挙動を示
すことを示している。ＣＤ１２６欠失変異体に対する弱
い結合は、分子に対する結合部位の少なくとも一部分が
Ｃ−末端にあることを示唆している。レセプターの全体
のコンホメーションに対するこの欠失の効果、おそらく
は、アロステリックな効果を除外することはできなかっ
た。したがって、ＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ
ＳＨ２の、ＥＧＦＲのＣ−末端フラグメントへの結合
を調べた。ＥＧＦＲにおいては、大抵のＣ−末端メチオ
ニン残基は９８３位に見出される。したがって、ＣＮＢ
ｒ分解は、すべての公知のリン酸化部位を含む２０３ア
ミノ酸のフラグメントを生成する。このタンパク質フラ
グメントは、ＥＧＦＲ Ｃ−末端に特異的な抗体、すな
わち抗−Ｃ（Fig.９Ａ）によって認識される。このＣ−
末端フラグメントを特異的に免疫沈澱に付し、チロシン
をリン酸化すると、それは、ＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐ
Ｅ／ＧＡＰ ＳＨ２融合タンパク質に結合した（Figure
１４）。ＣＮＢｒ分解は完全であった。したがって、結
合の原因となりうる完全長のＥＧＦＲ−Ｃは、タンパク
質分解の後では検出できなかった。繰り返すが、非リン
酸化Ｃ−末端ＣＮＢｒフラグメントに対する結合は見ら
れなかった。ＥＧＦＲ−ＣのＣＮＢｒ分解は、また、抗
体Ｆによって同定された９７アミノ酸のＮ−末端ペプチ
ドを生成した（Fig.９Ａ、ＥＧＦＲ残基６４５−７４
２）。抗体Ｆによって免疫沈澱されたこのフラグメント
は、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２と結合しなかった。さら
に、ＥＧＦＲ−Ｃを〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを用いて自己リ
ン酸化し、32Ｐ−標識化ＣＮＢｒ Ｃ−末端フラグメン
トが生じた。Fig.１５に示されているように、このフラ
グメントはｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２融合タンパク質に
結合したが、ｔｒｐＥには結合しなかった。総括する
と、これらの知見から、チロシンリン酸化Ｃ−末端への
直接結合は、少なくとも部分的には、ＥＧＦＲへのＳＨ
２及びＳＨ３ドメインタンパク質の特異的結合に寄与し
ていることが示される。
【０１２５】Ｃ．検討 総合して考えると、上記の知見及びいくつかの付加的な
一連の証拠から、ホスホチロシン残基がＥＧＦＲのＳＨ
２ドメインに対する実際の結合部位の一部であることが
強く主張される。先ず、Ｐ４７gag-crk が、ｖ−ｃｒｋ
形質転換細胞中の殆ど全てのホスホチロシン含有タンパ
ク質に結合することが見出された（Matsuda, M.ら、Sci
ence 248: 1537-1539 (1990))。第２に、ＰＤＧＦレセ
プターにおける２つの自己リン酸化部位の変異は、ＧＡ
Ｐの結合を大きく減少させた (Kazlauskas, A. ら、Sci
ence 247: 1578-1571 (1990))。最後に、上に示した結
果から、ＥＧＦＲのＣ−末端に対する特異的結合は、ホ
スホチロシンが存在する場合にのみ示される。したがっ
て、ホスホチロシン残基は、結合部位の一部を構成する
か、あるいは、このドメインの立体配座を極部的に変化
させて、結合を可能にしていることが結論付けられる。
ホスホチロシン単独で結合部位を形成しているとは言え
ない。例えば、ホスホチロシン単独ではＰ４７gag-crk
のホスホチロシン−含有タンパク質への結合を干渉する
ことができない(Matsudaら、上述）。さらに、ＰＬＣ−
ガンマは、ＣＳＦ−１レセプターのようなホスホチロシ
ン残基を含む活性化された全ての分子に結合するわけで
はない（Downing, J.R.ら、EMBO J. 8： 3345-3350 (19
89))。同様に、ＰＬＣ−ガンマのＰＤＧＦＲへの結合
は、ＧＡＰ結合と同一であるとは思えない。異なったＳ
Ｈ２とＳＨ３ドメインを含むタンパク質では、結合の特
異性が異なる可能性があるからである（Kazlauskasら、
上述）。上記に引用した引例は、特に断りがなくとも、
引用により全て本明細書中に組み込まれる。
【０１２６】ここまで本発明を充分に記載したけれど
も、本発明の精神や範囲を逸脱することなく、また、不
当な実験なしに、広範囲の等価なパラメータ、濃度、条
件の内で同じようなことを行うことができるということ
が当業者によって考えられるであろう。
【０１２７】本発明は、具体的な実施態様と関連づけて
記載したが、さらなる修正が可能であることが理解され
るであろう。本発明は、一般に、本発明の原理に従い、
本発明が係っている技術における公知かつ慣用のプラク
ティスに当るような、本明細書の開示からの離脱を含
み、かつ、添付したクレームの範囲に述べた必須の特徴
事項に適用しうる、本発明のいかなる変形、用途、適用
をもその範囲に含むものである。本書において用いた言
葉使い、用語は、記載するためのものであって、限定の
ためのものではないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ニトロセルロースフィルター上に固定化された
ＧＡＰ−ＳＨ２とＥＧＦＲのカルボキシ末端が相互作用
するのを示すフィルターブロットパターンである。細菌
により発現されたｔｒｐＥ／ＧＡＰ−ＳＨ２融合タンパ
ク質又は対照としてのｔｒｐＥを、さまざまな濃度でニ
トロセルロースフィルター上にスポットした。フィルタ
ーを〔32Ｐ〕−標識されたＥＧＦＲのＣ−末端ドメイン
を用いて一晩ハイブリダイゼーションに付した。オート
ラジオグラフィは２時間であった。
【図２】レセプター標的のクローニング方法（ＣＯＲ
Ｔ）を表わす概略図である。ＥＧＦＲのＣ末端ドメイン
を、放射線標識されたリンでリン酸化させる。λｇｔ１
１ライブラリーを１５０mlのプレートあたり４×１０4
プラークの密度でプレーティングした。プラークに、Ｉ
ＰＴＧ含浸したニトロセルロースフィルターを１２時間
かぶせ、その後プラークをニトロセルロースへとトラン
スファーし、標識されたプローブと共にインキュベート
した。次にさらなる分析のため陽性コロニーを選択す
る。
【図３Ａ】ＧＲＢ−１タンパク質を発現するファージの
オートラジオグラムを示す。Ａ）プレーティングされた
４０，０００ファージのうちの１つの陽性シグナル（矢
印）を立証する一次スクリーン。Ｂ）ＧＲＢ−１を発現
するファージのプラーク精製。全てのプラークが
〔32Ｐ〕標識されたＥＧＦＲのＣ末端ドメインに結合し
た。
【図３Ｂ】ＧＲＢ−１タンパク質を発現するファージの
オートラジオグラムを示す。Ａ）プレーティングされた
４０，０００ファージのうちの１つの陽性シグナル（矢
印）を立証する一次スクリーン。Ｂ）ＧＲＢ−１を発現
するファージのプラーク精製。全てのプラークが
〔32Ｐ〕標識されたＥＧＦＲのＣ末端ドメインに結合し
た。
【図４Ａ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミ
ノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残
基を有する。
【図４Ｂ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミ
ノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残
基を有する。
【図４Ｃ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミ
ノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残
基を有する。
【図４Ｄ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミ
ノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残
基を有する。
【図４Ｅ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミ
ノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残
基を有する。
【図４Ｆ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミ
ノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残
基を有する。
【図４Ｇ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミ
ノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残
基を有する。
【図４Ｈ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミ
ノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残
基を有する。
【図４Ｉ】ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミ
ノ酸配列を示す。このタンパク質は、７２４アミノ酸残
基を有する。
【図５】類似のモチーフをもつその他のタンパク質とＧ
ＲＢ−１のＳＨ２ドメインの配列を比較する。Ａ）ＧＲ
Ｂ−１、ｃ−ｓｒｃ、ｖ−ａｂ１、ウシＰＬＣ−ガン
マ、ＧＡＰ、及びｖ−ｃｒｋのＳＨ２ドメイン。Ｎ及び
Ｃは、それぞれＮ末端及びＣ末端ＳＨ２ドメインを表わ
している。保存アミノ酸置換は、Schwartz及びDayhoff
により定義づけされている通りである：すなわち（Ａ、
Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ）；（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ）；（Ｄ、Ｅ、
Ｎ、Ｑ）；（Ｋ、Ｒ、Ｈ）；（Ｆ、Ｙ、Ｗ）；及びＣ。
太字はこれらの位置が同じであったか、又は５カ所以上
に保存的アミノ酸置換が存在していることを識別してい
る。囲みは、保存されたモチーフを識別している。Ｂ）
ＧＲＢ−１のＳＨ３ドメインの類似の比較。
【図６】ＳＨ２及びＳＨ３ドメインの構造組織を比較す
る概略図である。この図には、ｃ−ｓｒｃ、ｖ−ｃｒ
ｋ、ＰＬＣ−ガンマ、ＧＡＰ１及びＧＲＢ−１といっ
た、ＳＨ２及びＳＨ３ドメインを含む既知のタンパク質
が含まれている。
【図７】ＧＲＢ−１プローブを用いたサルｍＲＮＡのノ
ーザンブロットである。さまざまなサルの組織から得た
ポリ（Ａ)+ｍＲＮＡ５μgを、１．２％／２．２Ｍのア
ガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動した。ブ
ロットを、クローンｋｉ４からの挿入物に相応する〔32
Ｐ〕−ニックトランスレーションを受けたＤＮＡプロー
ブとハイブリダイゼーションした。
【図８】生合成的に標識された細胞からの８５kDa のタ
ンパク質をＧＲＢ−１に対する抗体が免疫沈降させるこ
とを示すゲルパターンである。細胞を、〔35Ｓ〕メチオ
ニンで代謝的に標識し、その後ライセートを調製し、免
疫（Ｉ）又は前免疫（Ｐ）血清のいずれかで免疫沈降さ
せた。免疫沈降されたタンパク質を、８％のＳＤＳ／Ｐ
ＡＧＥ上で分離した。オートラジオグラフィは一晩行な
った。使用した細胞系統には、ヒトのグリオブラストー
マ（多形性神経膠芽腫）細胞系統、Ｕ１２４２、ラット
膀胱がん細胞系統、ＮＢＴ−II及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が
含まれている。
【図９Ａ】研究に使用したいくつかの野生型及び突然変
異タンパク質を描いている。（Ａ）その既知の又は予想
された自己リン酸化部位を伴うＥＧＦレセプター構築
体。野生型（Ｗ．Ｔ．）、キナーゼ陰性（Ｋ７２１
Ａ）、及びカルボキシ末端欠失（ＣＤ１２６）が、−３
００，０００ＥＧＦレセプターを発現する前述のトラン
スフェクションを受けたＮＩＨ３Ｔ３細胞から免疫沈降
された。ＥＧＦＲ−Ｃは、バキュロウイルス感染ＳＦ９
細胞によって産生されたＥＧＦレセプターの細胞質ドメ
インを含む欠失突然変異体を表わす。（Ｂ）ＳＨ２及び
Ｈ３ドメイン及びＰＬＣ−ガンマチロシンリン酸化部位
の場所を示すＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ Ｓ
Ｈ２タンパク質の構造。
【図９Ｂ】研究に使用したいくつかの野生型及び突然変
異タンパク質を描いている。（Ａ）その既知の又は予想
された自己リン酸化部位を伴うＥＧＦレセプター構築
体。野生型（Ｗ．Ｔ．）、キナーゼ陰性（Ｋ７２１
Ａ）、及びカルボキシ末端欠失（ＣＤ１２６）が、−３
００，０００ＥＧＦレセプターを発現する前述のトラン
スフェクションを受けたＮＩＨ３Ｔ３細胞から免疫沈降
された。ＥＧＦＲ−Ｃは、バキュロウイルス感染ＳＦ９
細胞によって産生されたＥＧＦレセプターの細胞質ドメ
インを含む欠失突然変異体を表わす。（Ｂ）ＳＨ２及び
Ｈ３ドメイン及びＰＬＣ−ガンマチロシンリン酸化部位
の場所を示すＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ Ｓ
Ｈ２タンパク質の構造。
【図１０】ＥＧＦＲ突然変異体とＰＬＣ−ガンマの会合
を示すゲルパターンである。野生型（ＨＥＲ１４）、カ
ルボキシ末端欠失（ＣＤ１２６）又はキナーゼ陰性（Ｋ
７２１Ａ）ＥＧＦＲを、抗ＥＧＦＲｍＡｂ１０８で免疫
沈降させた。レセプターを、〔ガンマ−32Ｐ−ＡＴＰで
自己リン酸化させた。同時にＥＧＦＲ−Ｃをタンパク質
Ａ−セファロースビーズ単独、又はＡＴＰを含むかもし
くは含まない免疫沈降されたＫ７２１Ａレセプターに添
加した。ＡＴＰを除去するためさらに洗浄した後、ＰＬ
Ｃ−ガンマを過剰発現する−１５×１０6 個の３Ｔ−Ｐ
１細胞のライセートを添加し、９０分間４℃で混合し
た。未結合のＰＬＣ−ガンマを除去するため洗浄した
後、６％のＳＤＳ−ゲル上でタンパク質を分離し、免疫
ブロット法のためニトロセルロースにトランスファーし
た。抗−ＰＴｙｒブロット法のためには試料の８分の１
を利用し、残りを抗−ＰＬＣ−ガンマブロット法のため
に利用した（露出時間１４時間）。
【図１１】ＰＬＣ−ガンマのリン酸化がＥＧＦレセプタ
ーに対するその結合を低減させることを示すゲルパター
ンである。ｍＡｂ１０８で全長ＥＧＦＲを免疫沈降さ
せ、自己リン酸化させた。ＰＬＣ−ガンマを過剰発現す
る３Ｔ−Ｐ１細胞のライセートを添加し、９０分間４℃
で混合した。結合後、試料の２分の１に対してＡＴＰを
添加し、ＰＬＣ−ガンマ分子がＥＧＦレセプターによっ
てリン酸化されうるようにした。次にＥＧＦＲ−ＰＬＣ
−ガンマ複合体の半分に対しＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝
液を添加し（「洗浄なし」、左側パネル）、直接６％の
ゲル上に負荷した。もう半分はＨＮＴＧで３度洗浄し、
次にゲル上に負荷した（「洗浄あり」、右側パネル）。
試料を重複してＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した後、タンパ
ク質をニトロセルロースにトランスファーし、抗−ＰＬ
Ｃ−ガンマ及び〔 125Ｉ〕タンパク質Ａでプローブ探査
した。ひき続きニトロセルロースからバンドを切り出
し、ガンマカウンターで定量した。ＨＮＴＧで３回洗浄
した後、５０±５％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４）のリン酸
化されていないＰＬＣ−ガンマがＥＧＦＲに結合した状
態で残り、一方残ったリン酸化されたＰＬＣ−ガンマは
２２±４％にすぎなかった（露出時間：１２時間）。
【図１２Ａ】ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥタンパク質に対す
る結合を示すゲルパターンである。（Ａ）ＥＧＦＲ−Ｃ
（０．５μg）を、抗体Ｃで免疫沈降させ、洗浄した。
次に単独のＭｎＣｌ2 又はＭｎＣｌ2 とＡＴＰを添加し
て自己リン酸化を容易にした。ｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／
ＧＡＰ ＳＨ２（約２μg）。免疫沈降物を１０％のＳ
ＤＳ−ゲル上で分離し、ニトロセルロースへとトランス
ファーし、抗−ｔｒｐＥを用いて免疫ブロット法を行な
った。比較を目的として、約０．１μgのｔｒｐＥ又は
ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２のライセートを直接ゲルに負
荷した（Ａの右側パネル）。（Ｂ）抗−ｔｒｐＥ抗体を
用いてｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰＳＨ２を免疫沈降
させ、洗浄した。次に、リン酸化された又はリン酸化さ
れていないＥＧＦＲ−Ｃ（０．５μg）を添加して上述
のとおり結合させた。洗浄の後、１０％のゲル上で試料
を分離し、ニトロセルロースへとトランスファーし、抗
体Ｃでプローブ探査した。右側の２つの試料は、直接ゲ
ル上に負荷したリン酸化された及びリン酸化されていな
いキナーゼ０．５μgを表わす（露出時間：２時間）。
【図１２Ｂ】ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥタンパク質に対す
る結合を示すゲルパターンである。（Ａ）ＥＧＦＲ−Ｃ
（０．５μg）を、抗体Ｃで免疫沈降させ、洗浄した。
次に単独のＭｎＣｌ2 又はＭｎＣｌ2 とＡＴＰを添加し
て自己リン酸化を容易にした。ｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／
ＧＡＰ ＳＨ２（約２μg）。免疫沈降物を１０％のＳ
ＤＳ−ゲル上で分離し、ニトロセルロースへとトランス
ファーし、抗−ｔｒｐＥを用いて免疫ブロット法を行な
った。比較を目的として、約０．１μgのｔｒｐＥ又は
ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２のライセートを直接ゲルに負
荷した（Ａの右側パネル）。（Ｂ）抗−ｔｒｐＥ抗体を
用いてｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰＳＨ２を免疫沈降
させ、洗浄した。次に、リン酸化された又はリン酸化さ
れていないＥＧＦＲ−Ｃ（０．５μg）を添加して上述
のとおり結合させた。洗浄の後、１０％のゲル上で試料
を分離し、ニトロセルロースへとトランスファーし、抗
体Ｃでプローブ探査した。右側の２つの試料は、直接ゲ
ル上に負荷したリン酸化された及びリン酸化されていな
いキナーゼ０．５μgを表わす（露出時間：２時間）。
【図１３Ａ】野生型及び突然変異ＥＧＦＲに対するｔｒ
ｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２の結合を示すゲルパターンであ
る。（Ａ）野生型レセプター（ＨＥＲ１４）又はカルボ
キシ末端欠失ＣＤ１２６レセプターをｍＡｂ１０８で免
疫沈降させた。次にＭｎＣｌ2単独又はＭｎＣｌ2 とＡ
ＴＰをレセプター含有試料の自己リン酸化された半分に
対して添加した。１セットのＣＤ１２６を同様に０．５
μgのＥＧＦＲ−Ｃと交叉リン酸化した。次に４℃で９
０分間、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２を添加し、さらに３
回洗浄した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。ニトロセル
ロースに対するトランスファーの後、抗−ｔｒｐＥ（左
側パネル）、抗−ＥＧＦＲＲＫ２（中央パネル）又は抗
−ＰＴｙｒ（右側パネル）を用いてブロットをプローブ
探査した。ＲＫ２及び抗−ＰＴｙｒは両方共総試料の８
分の１であり、７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。
残りの試料を、抗−ｔｒｐＥブロットのため１０％のゲ
ル上に負荷した（露出時間１４時間）。（Ｂ）ＥＧＦＲ
を全く含まないＮＩＨ３Ｔ３２．２細胞（３Ｔ３）又は
キナーゼ陰性レセプターを有する細胞（Ｋ２１Ａ）から
のライセートを、ｍＡｂ１０８で免疫沈降させた。全て
の免疫沈降物に対して、０．５μgのＥＧＦＲ−Ｃを添
加し、次に単独ＭｎＣｌ2 又はＭｎＣｌ2 とＡＴＰを添
加した。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２を添加し、（Ａ）の
場合と同じように試料を調製し、免疫ブロットに付した
（露出時間：１９時間）。
【図１３Ｂ】野生型及び突然変異ＥＧＦＲに対するｔｒ
ｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２の結合を示すゲルパターンであ
る。（Ａ）野生型レセプター（ＨＥＲ１４）又はカルボ
キシ末端欠失ＣＤ１２６レセプターをｍＡｂ１０８で免
疫沈降させた。次にＭｎＣｌ2単独又はＭｎＣｌ2 とＡ
ＴＰをレセプター含有試料の自己リン酸化された半分に
対して添加した。１セットのＣＤ１２６を同様に０．５
μgのＥＧＦＲ−Ｃと交叉リン酸化した。次に４℃で９
０分間、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２を添加し、さらに３
回洗浄した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。ニトロセル
ロースに対するトランスファーの後、抗−ｔｒｐＥ（左
側パネル）、抗−ＥＧＦＲＲＫ２（中央パネル）又は抗
−ＰＴｙｒ（右側パネル）を用いてブロットをプローブ
探査した。ＲＫ２及び抗−ＰＴｙｒは両方共総試料の８
分の１であり、７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。
残りの試料を、抗−ｔｒｐＥブロットのため１０％のゲ
ル上に負荷した（露出時間１４時間）。（Ｂ）ＥＧＦＲ
を全く含まないＮＩＨ３Ｔ３２．２細胞（３Ｔ３）又は
キナーゼ陰性レセプターを有する細胞（Ｋ２１Ａ）から
のライセートを、ｍＡｂ１０８で免疫沈降させた。全て
の免疫沈降物に対して、０．５μgのＥＧＦＲ−Ｃを添
加し、次に単独ＭｎＣｌ2 又はＭｎＣｌ2 とＡＴＰを添
加した。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２を添加し、（Ａ）の
場合と同じように試料を調製し、免疫ブロットに付した
（露出時間：１９時間）。
【図１４】ＥＧＦＲのＣＮＢｒ切断Ｃ末端フラグメント
に対するＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ２
の結合を示すゲルパターンである。ＥＧＦＲ−Ｃ（１０
μg）を、担体タンパク質として１００μgのＢＳＡを含
むpH７．５の２０mMＨＥＰＥＳ中でCentricon ３０の中
でインキュベートした。次に、リン酸化された及びリン
酸化されていないＥＧＦＲ−Ｃを、各々２つに分割し、
半分を緩衝液中に保管する一方、もう半分をＣＮＢｒで
切断した。次にＡＴＰを含む又は含まない、又ＣＮＢｒ
を含む又は含まない４つの試料を、各々５００μlの１
％トリトンＸ−１００溶菌緩衝液中にもって行き、２つ
に分け、抗−Ｃ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物を洗
浄した後、ＰＬＣ−ガンマ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ ＳＨ
２を含むライセートを添加した。次に、抗−ｔｒｐＥ又
は抗−ＰＬＣ−ガンマを用いて上述のとおり試料につい
て免疫ブロット法を実行した。右側パネルについては、
切断された及び切断されていない、ＥＧＦＲ−Ｃの１分
画（０．１μg）を、免疫沈降無しに直接ゲル上に負荷
し、ＲＫ２で免疫ブロットに付した（露出時間１４時
間）。抗−ｔｒｐＥプロットの全てのラインに見られる
黒いバンドは、およそ４０kDa あたりにあり（図１３に
も見られる）、免疫沈降抗体の重鎖に結合する〔
125Ｉ〕タンパク質Ａを表わす。
【図１５】ｔｒｐＥに対してではなくｔｒｐＥ／ＧＡＰ
ＳＨ２に対するチロシンリン酸化されたＣ末端ＥＧＦ
Ｒフラグメントの結合を示すゲルパターンである。ＥＧ
ＦＲ−Ｃ（５μg）を、〔ガンマ−32Ｐ〕ＡＴＰ１の添
加によって自己リン酸化させた。リン酸化されたＥＧＦ
Ｒ−ＣをCentricon ３０の中で濃縮し、次に７０％蟻酸
中のＣＮＢｒで切断させた。試料の半分（３５０，００
０cpm ）を図１２Ｂにある通りにｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ
／ＧＡＰ ＳＨ２に結合させ、洗浄して、１０％のＳＤ
Ｓ−ゲルで泳動した。（Ａ）リン酸化されたＣＮＢｒ切
断ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥに対する結合、（Ｂ）リン酸
化されたＣＮＢｒ切断ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥ ＧＡＰ
ＳＨ２に対する結合、（Ｃ）３，０００cpm のＣＮＢ
ｒ−切断ＥＧＦＲ−Ｃ、（Ｄ）比較のための３，０００
cpm の切断ＥＧＦＲ−Ｃ（露出時間２０時間）。ＥＧＦ
Ｒ９８４／１１８６は、ＣＮＢｒによって生成されたチ
ロシン自己リン酸化フラグメントの配列を示している。
【図１６Ａ】ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び
予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１６Ｂ】ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び
予想されるアミノ酸配列を示している。
【図１６Ｃ】ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び
予想されるアミノ酸配列を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (72)発明者 スコルニク，エドワード・ワイ アメリカ合衆国、ニューヨーク 10024、 ニューヨーク、アパートメント・５エフ、 ウエスト・89番・ストリート 201 (72)発明者 マルゴリス，ベンジョミン・エル アメリカ合衆国、ニューヨーク 10016、 ニューヨーク、アパートメント・エヌ−17 イー、イースト・34番・ストリート 401 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA12 DA06 EA03 HA11 HA17 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA93Y AB01 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA20 BA10 CA45 EA20 EA50 FA74

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＧＲＢ−１と呼ばれ、図４に示すアミノ
    酸配列を有するタンパク質又はチロシンキナーゼ分子の
    チロシンがリン酸化されたポリペプチド部分に結合する
    ことができるその誘導体。
  2. 【請求項２】 図４に示すタンパク質をコードする単離
    されたＤＮＡ分子。
  3. 【請求項３】 図４に示すヌクレオチド配列を有するポ
    リヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のＧＲＢ−１タンパク質
    の種々の部分をコードするオリゴヌクレオチドにストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズする能力を有す
    る、請求項２又は３に記載の単離されたＧＲＢ−１核酸
    分子。
  5. 【請求項５】 発現運搬体である、請求項２又は３に記
    載のＤＮＡ分子。
  6. 【請求項６】 該運搬体が、プラスミドである、請求項
    ５に記載のＤＮＡ分子。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の分子で形質転換した宿
    主細胞。
  8. 【請求項８】 図４に示すタンパク質を調製するための
    方法であって、下記： ａ）培養条件下で該タンパク質を発現することができる
    宿主細胞を培養すること、 ｂ）該タンパク質を発現させること、及び ｃ）該培養物から該タンパク質を回収することを含む方
    法。
  9. 【請求項９】 図４に示すタンパク質内に含まれる、ア
    ミノ酸残基３３３〜４３０又はアミノ酸残基６２４〜７
    ２０を有するSrcホモロジー２ペプチドドメインを含む
    単離されたタンパク質。
  10. 【請求項１０】 図４に示すタンパク質内に含まれるア
    ミノ酸残基１０〜８０を有するSrcホモロジー３ペプチ
    ドドメインを含む単離されたタンパク質。
  11. 【請求項１１】 図４に示すアミノ酸配列を有し、請求
    項９に記載のSrcホモロジー２ペプチドドメインの少な
    くとも１つを欠く、単離されたタンパク質。
  12. 【請求項１２】 図４に示すアミノ酸配列を有し、請求
    項１０に記載のSrcホモロジー３ペプチドドメインを欠
    く、単離されたタンパク質。
  13. 【請求項１３】 図４に示すアミノ酸配列を有し、そし
    て下記：アミノ酸残基３３３〜４３０を有するアミノSr
    cホモロジー２ペプチドドメイン、アミノ酸残基６２４
    〜７２０を有するカルボキシSrcホモロジー２ペプチド
    ドメイン又は図４に示すポリペプチド内に含まれるアミ
    ノ酸残基１０〜８０を有するSrcホモロジー３ペプチド
    ドメインの少なくとも１つ、ただし多くとも２つを欠
    く、単離されたタンパク質。
  14. 【請求項１４】 請求項９〜１３のいずれか１項に記載
    のタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
  15. 【請求項１５】 請求項９に記載のタンパク質を調製す
    るための方法であって、下記： ａ）培養条件下で、該タンパク質を発現することができ
    る宿主細胞を培養すること、 ｂ）該タンパク質を発現すること、及び ｃ）該培養物から該タンパク質を回収することを含む方
    法。
  16. 【請求項１６】 請求項１０に記載のタンパク質を調製
    するための方法であって、下記： ａ）培養条件下で、該タンパク質を発現することができ
    る宿主細胞を培養すること、 ｂ）該タンパク質を発現すること、及び ｃ）該培養物から該タンパク質を回収することを含む方
    法。
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