JP2003199595A - 光学活性マンデル酸誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 光学活性なマンデル酸誘導体を酵素的に製造
するための方法の提供。 【解決手段】 フェニルグリオキシル酸誘導体に、当該
化合物を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の
培養物、菌体またはその処理物を作用させ、生成する光
学活性なマンデル酸誘導体を回収することにより、光学
活性なマンデル酸誘導体（式II）が製造される。本発明
によって得られる光学活性なマンデル酸誘導体は、医薬
や農薬の合成用中間体として有用である。 【化７】式(II)

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、各種医薬品の原料
あるいは合成中間体として広く利用されている光学活性
マンデル酸誘導体の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ベンゼン環に置換基を有する光学活性マ
ンデル酸を製造する方法として、以下のような方法が知
られている。 ・ラセミ体の分別結晶による光学分割法（特開2001-726
44） ・クロマトグラフィーによる光学分割法（Journal of C
hromatography. (1983),282, 83-8） ・ニトリラーゼを用いる方法（特開平4-99496、特開平6
-237789） ・ラセミ体の一方を酸化することにより光学活性体を得
る方法（特開平6-165695） ・ヒドロキシルニトリルリアーゼを用いる方法（特開 2
001-354616）

【０００３】ラセミ体の分別結晶による光学分割や、ク
ロマトグラフィーによる光学分割では、目的とする光学
異性体を回収する一方で、不要な対掌体を利用できない
ため、原料の一部を失う結果になる。つまり、原料を有
効に利用できないので、コストを高める原因となる。同
様に、ラセミ体の一方を酸化することで光学活性体を得
る方法は、目的とする光学活性体を回収する一方で、不
要な対掌体を利用できないので、コストを高める原因と
なる。不要な対掌体を回収して、ラセミ化することで原
料として再利用する方法も報告されているが、操作が煩
雑である。

【０００４】ニトリラーゼを用いる方法は、原料として
マンデロニトリル誘導体を必要とする。マンデロニトリ
ル誘導体の合成には、青酸が必要である。ヒドロキシニ
トリルリアーゼを用いる方法は原料として、ベンズアル
デヒドと青酸ソーダを原料とする。青酸は毒性を有する
ので、取扱いに注意しなければならない。

【０００５】酵素は高い触媒機能をもつだけでなく、基
質特異性、反応特異性とともに、立体特異性を示す。酵
素の立体特異性は、いくつかの例外はあるものの、ほと
んど絶対的といえる。近年における研究の精密化に伴
い、医薬品、農薬、飼料、香料などの分野で光学活性体
を扱うことの重要性が増している。これは光学異性体が
生理活性をまったく異にする場合があるためで、たとえ
ば、サリドマイドは、D（R）体は催奇性をもたないが、
L（S）体には強い催奇形成があり、ラセミ体を実用に供
したことが薬害事件を引き起こす原因となった。さら
に、対掌体の一方が有効な生理活性を示す場合、もう一
方の異性体が単に全く活性を示さないだけでなく、有効
な対掌体に対して競合阻害をもたらす結果、ラセミ体の
生物活性が有効な対掌体に対して1／2以下に激減してし
まうこともある。従って、光学的に純粋な対掌体をいか
にして入手（合成または分割）するかは、産業上重要な
課題となっている。この目的に対して、ラセミ体を合成
した上で、それを効果的に光学分割する手法が広く用い
られており、副生成物や多量の廃液を生じない酵素法に
よる光学分割が注目されている。

【０００６】これまでに、ベンゼン環に置換基を有しな
いフェニルグリオキシル酸を微生物によって不斉還元
し、光学活性なマンデル酸を得る方法は知られている
（特開昭57-198096、特開昭57-198097、特開昭63-3249
2、特開平6-7179など）。ベンゼン環に置換基を有する
マンデル酸においても、酵素的な反応によって光学活性
体を得ることができれば有用である。しかし現在まで
に、工業的な規模で実施可能な、酵素的な手法は知られ
ていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、酵素
的な手法によってベンゼン環に置換基を有する光学活性
マンデル酸を製造するための方法を提供することであ
る。

【０００８】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、このよ
うな高度な要求を満足する方法を鋭意検討した結果、微
生物の有する還元力を利用して、ベンゼン環に置換基を
有するフェニルグリオキシル酸誘導体（以下、フェニル
グリオキシル酸誘導体）を不斉還元することによって、
ベンゼン環に置換基を有する光学活性マンデル酸誘導体
（以下、マンデル酸誘導体）に有利に導き得ることを見
出した。

【０００９】既に述べたように、ベンゼン環に置換基を
有しないフェニルグリオキシル酸を微生物によって不斉
還元し、光学活性なマンデル酸を得る方法は公知であ
る。しかし、ベンゼン環に置換基を有するフェニルグリ
オキシル酸を基質として、同じ微生物が同様の反応を触
媒することは一般に考えにくい。置換基の立体障害、基
質化合物や生成物の菌に対する毒性、更には基質が有す
る置換基による電子的効果の違いなどから、同様の反応
は期待できないと考えられる。後に述べる実施例におい
ても明らかにしているように、たとえば置換基を持たな
いフェニルグリオキシル酸誘導体に作用することができ
るキャンディダ・ファマータ IFO 0856（特開平6-717
9）は、式(I)の化合物であるオルトクロロフェニルグリ
オキシル酸には作用しなかった。この化合物は、フェニ
ルグリオキシル酸誘導体を構成するベンゼン環のオルト
位にCl置換を有する構造からなる化合物である。したが
って、本発明らが得た知見は、非常に意外なことであっ
た。更に驚くべきことに、微生物が生成する光学活性マ
ンデル酸の光学純度は非常に高く、実用に際し問題の無
いレベルであった。これらの知見に基づいて、本発明者
らは本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の光
学活性マンデル酸の製造方法に関する。

【００１０】〔１〕式(I)で示されるフェニルグリオキ
シル酸誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元しうる
能力を有する微生物の培養物、菌体またはその処理物を
作用させ、生成する式(II)で表される光学活性なマンデ
ル酸誘導体を回収する工程を含む、光学活性なマンデル
酸誘導体の製造方法。

【００１１】

【化３】式(I) （式中Xは水素原子またはアルカリあるいはアルカリ土
類金属を表し、Rはオルト位、メタ位またはパラ位が一
個または複数個置換されていることを意味し、置換基は
ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアル
キル基、アルコキシ基またはチオアルキル基、アミノ
基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、またはフェ
ノキシ基を表す）

【００１２】

【化４】式(II) （式中XとRは、それぞれ式(I)のXとRと同じ置換基を表
す） 〔２〕微生物が、下記の群から選択されるいずれかの属
に属する微生物であり、得られる光学活性なマンデル酸
誘導体が(R)-体であることを特徴とする〔１〕に記載の
光学活性なマンデル酸誘導体の製造方法。キャンディダ
（Candida）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）
属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、オガタエア（Ogatae
a）属、ピキア（Pichia）属、ロドスポリディウム（Rho
dosporidium）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、サッ
カロマイセス（Saccharomyces）属、トリコスポロン（T
richosporon）属、ヤマダジマ（Yamadazyma）属、ロド
コッカス（Rhodococcus）属、アミコラトプシス（Amyco
latopsis）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、ア
ルスロバクター（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウ
ム（Brevibacterium）属、コマモナス（Comamonas）
属、コリネバクテリウム（Corynebactrium）属、エンテ
ロバクター（Enterobacter）属、エンテロコッカス（En
terococcus）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）
属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ミクロバテ
リウム（Microbacterium）属、ミクロコッカス（Microc
occus）属、プロテウス（Proteus）属、およびシュード
モナス（Pseudomonas）属 〔３〕微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微
生物である、〔２〕に記載の光学活性なマンデル酸誘導
体の製造方法。キャンディダ・エルノビー（Candida er
nobii）、キャンディダ・グロペンギエセリ（Candida g
ropengiesseri）、キャンディダ・マグノリアエ（Candi
da magnoliae）、キャンディダ・サケ（Candida sak
e）、キャンディダ・シェハタエ（Candida shehata
e）、キャンディダ・シルバティカ（Candida silvatic
a）、クリプトコッカス・フラバス（Cryptococcus flav
us）、クリプトコッカス・フミコラス（Cryptococcus h
umicolus）、クリプトコッカス・マルセランス（Crypto
coccus marcerans）、ハンセヌラ・ベッキー（Hansenul
a beckii）、ハンセヌラ・カナデンシス（Hansenula ca
nadensis）、ハンセヌラ・グルコジマ（Hansenula gluc
ozyma）、オガタエア・ピニ（Ogataea pini）、ピキア
・カルソニー（Pichia carsonii）、ピキア・ファビア
ニー（Pichia fabianii）、ピキア・ハプロフィラ（Pic
hia haplophila）、ピキア・サブペリクローサ（Pichia
subpelliculosa）、ロドスポリディウム・ダクリオデ
ィウム（Rhodosporidium dacryodium）、ロドスポリデ
ィウム・ディオボバタム（Rhodosporidium diobovatu
m）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodosporid
ium toruloides）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotor
ula glutinis）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula mi
nuta）、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、
サッカロマイセス・シェレビシアエ（Saccharomyces ce
revisiae）、トリコスポロン・ブラシカエ（Trichospor
on brassicae）、トリコスポロン・プルランス（Tricho
sporon pullulans）、ヤマダジマ・キャスティラエ（Ya
madazyma castillae）、ヤマダジマ・ナカザワエ・バラ
エティ・アキタエンシス（Yamadazyma nakazawae var.
akitaensis）、ヤマダジマ・スコリティ（Yamadazyma s
colyti）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcu
s erythropolis）、ロドコッカス・ファシアンス（Rhod
ococcus fascians）、ロドコッカス・オブエンシス（Rh
odococcus obuensis）、ロドコッカス・ロドクロス（Rh
odococcus rhodochrous）、アミコラトプシス・オリエ
ンタリス・サブスピーシーズ・オリエンタリス（Amycol
atopsis orientalis subsp. orientalis）、アルカリゲ
ネス・エスピー（Alcaligenes sp.）、アルスロバクタ
ー・プロトフォルミアエ（Arthrobacter protophormia
e）、ブレビバクテリウム・ヨーディナム（Brevibacter
ium iodinum）、コマモナス・テストステロニ（Comamon
as testosteroni）、コリネバクテリウム・アンモニア
ゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、エンテロバ
クター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテ
ロコッカス・カセリフラバス（Enterococcus casselifl
avus）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus
faecalis）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcu
s hirae）、ラクトバシラス・ビリデッセンス（Lactoba
cillus viridescens）、ラクトバシラス・マリ（Lactob
acillus mali）、ラクトバシラス・コリノイデス（Lact
obacillus collinoides）、ラクトバシラス・フルクテ
ィボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバ
シラス・ヒルガルディ（Lactobacillus hilgardii）、
ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシー
ズ・デキストラカム（Leuconostoc mesenteroides subs
p. dextranicum）、ミクロコッカス・ルテウス（Microc
occus luteus）、プロテウス・バルガリス（Proteus vu
lgaris）、およびシュードモナス・ジミヌタ（Pseudomo
nas diminuta） 〔４〕微生物が、下記の群から選択されるいずれかの属
に属する微生物であり、得られる光学活性なマンデル酸
誘導体が(S)-体であることを特徴とする〔１〕に記載の
光学活性なマンデル酸誘導体の製造方法。ロドスポリデ
ィウム（Rhodosporidium）属、ラクトバシラス（Lactob
acillus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ミ
クロバクテリウム（Microbacterium）属、およびシュー
ドモナス（Pseudomonas）属 〔５〕微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微
生物である、〔４〕に記載の光学活性なマンデル酸誘導
体の製造方法。ロドスポリディウム・ダクリオイダム
（Rhodosporidium dacryoidum）、ラクトバシラス・ハ
ロトレランス（Lactobacillus halotorelans）、ロイコ
ノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・ク
レモリス（Leuconostoc mesenteroides subsp. cremori
s）、ミクロバクテリウム・ラクチカム（Microbacteriu
m lacticum）、およびシュードモナス・エスピー（Pseu
domonas sp.） 〔６〕フェニルグリオキシル酸誘導体が、オルト位が置
換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である〔１〕に
記載の光学活性なマンデル酸誘導体の製造方法。 〔７〕オルト位がハロゲン原子に置換されたフェニルグ
リオキシル酸誘導体である〔６〕に記載の光学活性なマ
ンデル酸誘導体の製造方法。 〔８〕フェニルグリオキシル酸誘導体が、メタ位が置換
されたフェニルグリオキシル酸誘導体である〔１〕に記
載の光学活性なマンデル酸誘導体の製造方法。

〔９〕メタ位がハロゲン原子に置換されたフェニルグリ
オキシル酸誘導体である〔８〕に記載の光学活性なマン
デル酸誘導体の製造方法。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は、前記式(I)で示される
フェニルグリオキシル酸誘導体に、当該化合物を立体選
択的に還元しうる能力を有する微生物の培養物、菌体ま
たはその処理物を作用させ、生成する式(II)で表される
光学活性なマンデル酸誘導体を回収する工程を含む、光
学活性なマンデル酸誘導体の製造方法である。

【００１４】本発明において、立体選択的に還元しうる
能力とは、前記式(I)で示されるフェニルグリオキシル
酸誘導体を基質として、(R)体、または(S)体のマンデル
酸誘導体を生成する能力を言う。本発明の微生物は、
(R)体、または(S)体のマンデル酸誘導体を生成しうる微
生物であれば、任意の微生物を用いることができる。本
発明に用いる微生物は、たとえば以下に示すような属に
属する微生物について、(R)体、または(S)体のマンデル
酸誘導体を生成する能力を比較することにより得ること
ができる。たとえば、化合物(I)を含む培地中で被験微
生物を培養し、その培養物中に蓄積される光学活性マン
デル酸誘導体の光学純度を測定する。その結果、光学活
性なマンデル酸の生成を確認することができれば、当該
微生物を本発明に用いることができる。

【００１５】あるいは予め培地中で増殖させた被験微生
物を集菌し、適当な緩衝液中に懸濁させる。更に化合物
(I)であらわされるフェニルグリオキシル酸誘導体と接
触、反応させて、この緩衝液中に蓄積される光学活性マ
ンデル酸誘導体の光学純度を測定する。光学活性なマン
デル酸誘導体の生成が確認できれば、当該微生物を本発
明に用いることができる。このとき、被験微生物の培養
時に、培地中に化合物(I)を加えておけば、この化合物
を代謝するための酵素の誘導が期待できる。更に反応時
に還元エネルギーを加えておけば、より生成物の蓄積が
期待できる。還元エネルギー源には、糖類、アルコール
類、あるいは糖アルコール類等を用いることができる。

【００１６】光学純度の高い生成物を得るには、より選
択性の高い微生物を用いることが有利であることは言う
までも無い。具体的には、たとえば８０%、通常９５%以
上、好ましくは９８%以上、更に好ましくは９９%以上の
光学純度で光学活性な(R)体、または(S)体のマンデル酸
誘導体を生成しうる微生物を用いることができる。

【００１７】本発明における「光学活性なマンデル酸誘
導体」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く
含まれるマンデル酸誘導体を言う。本発明において、好
ましい光学活性なマンデル酸誘導体は、通常５０％ee以
上、好ましくは８０％ee以上、より好ましくは９０％ee
以上、更に好ましくは９５％ee以上の光学純度（enanti
omeric excess; ee）を有する。光学活性なマンデル酸
誘導体の光学純度は、たとえば光学分割カラムなどを用
いて確認することができる。本発明の「光学異性体」
は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」と呼
ばれる場合もある。

【００１８】たとえば以下に示す群から選択された属に
属する微生物は、前記式(I)で示されるフェニルグリオ
キシル酸誘導体を基質として、(R)-マンデル酸誘導体を
生成する。キャンディダ（Candida）属、クリプトコッ
カス（Cryptococcus）属、ハンゼヌラ（Hansenula）
属、オガタエア（Ogataea）属、ピキア（Pichia）属、
ロドスポリディウム（Rhodosporidium）属、ロドトルラ
（Rhodotorula）属、サッカロマイセス（Saccharomyce
s）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ヤマダジ
マ（Yamadazyma）属、ロドコッカス（Rhodococcus）
属、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属、アルカリ
ゲネス（Alcaligenes）属、アルスロバクター（Arthrob
acter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
属、コマモナス（Comamonas）属、コリネバクテリウム
（Corynebactrium）属、エンテロバクター（Enterobact
er）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクト
バシラス（Lactobacillus）属、ロイコノストック（Leu
conostoc）属、ミクロバテリウム（Microbacterium）
属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、プロテウス（P
roteus）属、およびシュードモナス（Pseudomonas）属

【００１９】より具体的には、上記の群から選択された
属に属する微生物として、以下の微生物を示すことがで
きる。これらの微生物は、いずれも高い光学純度で(R)-
マンデル酸誘導体を生成しうる。キャンディダ・エルノ
ビー（Candida ernobii）、キャンディダ・グロペンギ
エセリ（Candida gropengiesseri）、キャンディダ・マ
グノリアエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・サ
ケ（Candida sake）、キャンディダ・シェハタエ（Cand
ida shehatae）、キャンディダ・シルバティカ（Candid
a silvatica）、クリプトコッカス・フラバス（Cryptoc
occus flavus）、クリプトコッカス・フミコラス（Cryp
tococcus humicolus）、クリプトコッカス・マルセラン
ス（Cryptococcus marcerans）、ハンセヌラ・ベッキー
（Hansenula beckii）、ハンセヌラ・カナデンシス（Ha
nsenula canadensis）、ハンセヌラ・グルコジマ（Hans
enula glucozyma）、オガタエア・ピニ（Ogataea pin
i）、ピキア・カルソニー（Pichia carsonii）、ピキア
・ファビアニー（Pichia fabianii）、ピキア・ハプロ
フィラ（Pichia haplophila）、ピキア・サブペリクロ
ーサ（Pichia subpelliculosa）、ロドスポリディウム
・ダクリオディウム（Rhodosporidium dacryodium）、
ロドスポリディウム・ディオボバタム（Rhodosporidium
diobovatum）、ロドスポリディウム・トルロイデス（R
hodosporidium toruloides）、ロドトルラ・グルチニス
（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhod
otorula minuta）、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula
rubra）、サッカロマイセス・シェレビシアエ（Sacchar
omyces cerevisiae）、トリコスポロン・ブラシカエ（T
richosporon brassicae）、トリコスポロン・プルラン
ス（Trichosporon pullulans）、ヤマダジマ・キャステ
ィラエ（Yamadazyma castillae）、ヤマダジマ・ナカザ
ワエ・バラエティ・アキタエンシス（Yamadazyma nakaz
awae var. akitaensis）、ヤマダジマ・スコリティ（Ya
madazyma scolyti）、ロドコッカス・エリスロポリス
（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ファシ
アンス（Rhodococcus fascians）、ロドコッカス・オブ
エンシス（Rhodococcus obuensis）、ロドコッカス・ロ
ドクロス（Rhodococcus rhodochrous）、アミコラトプ
シス・オリエンタリス・サブスピーシーズ・オリエンタ
リス（Amycolatopsis orientalis subsp. orientali
s）、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）、
アルスロバクター・プロトフォルミアエ（Arthrobacter
protophormiae）、ブレビバクテリウム・ヨーディナム
（Brevibacterium iodinum）、コマモナス・テストステ
ロニ（Comamonas testosteroni）、コリネバクテリウム
・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagene
s）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cl
oacae）、エンテロコッカス・カセリフラバス（Enteroc
occus casseliflavus）、エンテロコッカス・フェカリ
ス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・ヒ
ラエ（Enterococcus hirae）、ラクトバシラス・ビリデ
ッセンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバシ
ラス・マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバシラス・
コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクト
バシラス・フルクティボランス（Lactobacillus fructi
vorans）、ラクトバシラス・ヒルガルディ（Lactobacil
lus hilgardii）、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス・サブスピーシーズ・デキストラカム（Leuconostoc
mesenteroides subsp. dextranicum）、ミクロコッカス
・ルテウス（Micrococcus luteus）、プロテウス・バル
ガリス（Proteus vulgaris）、およびシュードモナス・
ジミヌタ（Pseudomonas diminuta）

【００２０】また以下に示す群から選択されたいずれか
の属に属する微生物は、上記式(I)で表されるフェニル
グリオキシル酸誘導体を、光学活性な(S)-マンデル酸誘
導体へ変換する能力を有する微生物として示すことがで
きる。ロドスポリディウム（Rhodosporidium）属、ラク
トバシラス（Lactobacillus）属、ロイコノストック（L
euconostoc）属、ミクロバクテリウム（Microbacteriu
m）属、およびシュードモナス（Pseudomonas）属

【００２１】より具体的には、上記の群から選択された
属に属する微生物として、以下の微生物を示すことがで
きる。ロドスポリディウム・ダクリオイダム（Rhodospo
ridium dacryoidum）、ラクトバシラス・ハロトレラン
ス（Lactobacillus halotorelans）、ロイコノストック
・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・クレモリス
（Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris）、ミ
クロバクテリウム・ラクチカム（Microbacterium lacti
cum）、およびシュードモナス・エスピー（Pseudomonas
sp.）

【００２２】本発明の方法に用いる微生物は、様々な寄
託機関から細胞株として入手することができる。細胞の
寄託機関としては、たとえば以下に示すような機関を示
すことができる。あるいは、当業者であれば様々な試料
から、必要な微生物を分離することもできる。 IFO： 財団法人発酵研究所 DSM： Deutsche Sammlung von Mikroorganismen ATCC： American Type Culture Collection JCM： 理化学研究所微生物系統保存施設 IAM： 東京大学応用微生物研究所 NRIC： 東京農業大学

【００２３】これら微生物は、醗酵学の分野で公知の情
報に従って培養することができる。培地としては炭素
源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有す
る培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使
用可能である。培地は、液体培地または固体培地を使用
することができる。

【００２４】具体的には、炭素源として、次に示すよう
な一般的な炭素源より、使用する微生物の資化性を考慮
して、適宜一種または二種以上選択して使用する。 糖類： 天然炭水化物： グルコース、 澱粉、 フルクトース、 澱粉加水分解物、 マルトース、 糖蜜、 ガラクトース、 廃糖蜜、麦、とうもろこしな
ど アルコール類： 脂肪酸類： グリセロール、 酢酸、 メタノール、 グルコン酸、 エタノールなど ピルビン酸、クエン酸など アミノ酸類： 炭化水素類： グリシン、 ノルマルパラフィンなど グルタミン、 アスパラギンなど

【００２５】窒素源としては、次に示すような一般的な
窒素源の中から、使用する微生物の資化性を考慮して、
適宜一種または二種以上選択して使用する。 有機窒素化合物： 肉エキス、 ペプトン、 酵母エキス、大
豆加水分解物、 ミルクカゼイン、 カザミノ酸、各種
アミノ酸、 コーンスティープリカー、その他の動
物、植物、微生物の加水分解物など、 無機窒素化合物： アンモニア、 硝酸アンモニウム、 硫酸アンモ
ニウム、塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナ
トリウムなどの硝酸塩、尿素など

【００２６】また、微生物の光学活性マンデル酸誘導体
への変換能力を高めるために、誘導物質を用いることが
できる。誘導物質としては、目的とする光学活性なマン
デル酸誘導体、もしくはフェニルグリオキシル酸誘導体
を、使用する微生物に応じて使用することができる。

【００２７】さらに、無機塩として微量のマグネシウ
ム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、
銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等よ
り適宜一種または二種以上を選択して使用することがで
きる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコ
ンなどの消泡剤を培養液中に添加してもよい。

【００２８】培養は前記培地成分を含有する液体培地中
で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養など
の通常の培養方法を用いて行うことができる。

【００２９】培養条件は、微生物の種類、培養の種類、
培養方法により適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、
フェニルグリオキシル酸誘導体からマンデル酸誘導体へ
の変換能力を有しうる条件であれば特に制限はない。通
常は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に
調節し、15から70℃、好ましくは25から40℃の温度条件
下で培養することが望ましい。培養時間はフェニルグリ
オキシル酸誘導体からマンデル酸誘導体への変換能力を
有する菌体が得ることができれば特に制限はなく、通常
は1日から7日、このましくは1日から3日培養する。

【００３０】また、かかる微生物菌体の処理物として
は、例えば、上記微生物の凍結乾燥菌体、アセトン乾燥
菌体、菌体自己消化物、菌体抽出物、菌体磨砕物、菌体
の超音波処理物などがあげられ、さらに菌体抽出物から
公知の方法を組み合わせて精製取得した酵素も用いるこ
とができる。このとき、酵素は精製酵素であっても部分
精製酵素であってもよい。また、本発明の微生物菌体あ
るいは菌体処理物は、たとえばポリアクリルアミド法、
含硫多糖ゲル法（κ-カラギーナンゲル法など）、アル
ギン酸ゲル法、寒天ゲル法、イオン交換樹脂法などの公
知方法により固定化して使用することもできる。

【００３１】本発明における微生物による不斉還元方法
は、微生物を酵素が誘導される適切な前記培養条件にお
いて培養を行い、得られた培養液、あるいは培養液から
採取した菌体や該菌体処理物に反応基質を加えて、不斉
還元反応を行なうことができる。また、前記培養条件と
同じpH、温度範囲で、1日から7日間、培養と並行しても
行うことができる。反応条件としては、たとえば以下の
条件を示すことができる。pH 4.0から9.0、好ましくはp
H 6.0から8.0、温度15から50℃、好ましくは25から40
℃、反応時間は、4時間から7日間接触させる一般に、微
生物の培養と不斉還元反応とは、別に行った方が良好な
結果を期待できる。

【００３２】また後者の反応においては、還元エネルギ
ー源として、糖類、アルコール類、あるいは糖アルコー
ル類などの存在下で不斉還元反応を行うことにより、さ
らに効率的な反応が期待できる。糖類としては、グルコ
ース、フルクトース、シュクロース等を用いることがで
きる。アルコール類としては、エタノール、イソプロパ
ノール、グリセロール等が利用できる。またソルビトー
ルなどを糖アルコール類として示すことができる。還元
エネルギーのために添加する化合物は、反応基質である
フェニルグリオキシル酸誘導体量に応じて添加すること
ができる。還元エネルギー源の消費に伴って、反応液の
pHに変化が見られる場合には、適当な酸、アルカリを用
いてpHを一定範囲に調節することで、さらに良好な反応
性を維持して、反応を行なうことも可能である。

【００３３】本発明において生菌体を使用した場合、反
応液中に界面活性剤を添加しておけば反応時間の短縮を
はかることができ好ましい。この目的に用いられる界面
活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるもの
であれば特に制限はなく、臭化セチルピリミジウム、臭
化セチルトリメチルアンモニウム、トリトンX-100、パ
ライソオクチルフェニルエーテル、トゥイーン80、スパ
ン60等があげられ、反応液に対して、0.0001〜1％程度
使用することが好ましい。

【００３４】また、反応液中に有機溶媒を添加すること
によっても、同様の効果を得ることができる。この目的
に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透
過性をあげるものであれば特に制限はなく、トルエン、
キシレンなどの有機溶媒があげられ、反応液に対して、
0.0001〜1％程度使用することが好ましい。

【００３５】また、反応液に添加せずとも、菌体を集菌
後、界面活性剤および有機溶媒を含む水もしくはバッフ
ァーで前処理することにより、細胞壁の透過性を上げた
菌体を用いてもよい。

【００３６】本発明の方法では、下記式(I)で表される
フェニルグリオキシル酸誘導体を基質として用いる。

【化５】式(I)

【００３７】（式中Xは水素原子またはアルカリあるい
はアルカリ土類金属を表し、Rはオルト位、メタ位また
はパラ位が一個または複数個置換されていることを意味
し、置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１
〜３個のアルキル基、アルコキシ基またはチオアルキル
基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、
またはフェノキシ基を表す）。

【００３８】置換基の具体例としては、臭素原子、塩素
原子、フッ素原子、ヨウ素原子などのハロゲン原子、炭
素数が１〜３個の分枝していてもよい低級アルキル基、
またメトキシ基、エトキシ基などのアルコキシ基、チオ
メチル基などのチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、
メルカプト基、フェニル基、またはフェノキシ基などが
あげられる。これら置換基が複数導入されていてもよ
く、さらにメチレンジオキシ、エチレンジオキシ、トリ
メチレンジオキシ基などの低級アルキレンジオキシ基の
ように環を形成することもできる。

【００３９】式(I)の化合物が金属塩を表す場合、すな
わちXが表す金属原子としては、ナトリウム、カリウム
などの一価金属、カルシウム、マグネシウムなどの二価
金属などがあげられる。

【００４０】本発明において、式(I)の化合物として、
たとえばオルトクロロフェニルグリオキシル酸（オルト
位のRとしてCl）や、オルトブロモフェニルグリオキシ
ル酸などのオルトハロフェニルグリオキシル酸化合物を
用いることができる。また、メタクロロフェニルグリオ
キシル酸（メタ位のRとしてCl）や、メタブロモフェニ
ルグリオキシル酸などのメタハロフェニルグリオキシル
酸化合物を用いることができる。また、これら化合物の
ハロゲンの代わりに水酸基（RとしてOH）、アルキル基
（Rとしてメチル、エチル）などで置換された化合物を
用いることができる。

【００４１】これらの基質化合物は、公知の方法によっ
て製造することができる。たとえば実施例に示したオル
トクロロフェニルグリオキシル酸は、オルトクロロベン
ゾイルクロライドを出発原料として、オルトクロロフェ
ニルオキソアセトニトリルを経て合成することができる
(Bull. Soc. Chim. Fr. 850, 851 (1959))。

【００４２】本発明における反応基質であるフェニルグ
リオキシル酸誘導体は、目的とする生成物を効率的に生
成できるように、適切な濃度で用いることができる。フ
ェニルグリオキシル酸誘導体は、水系溶媒における溶解
性が高いことから、反応を阻害しない範囲で、高い濃度
で用いることができる。フェニルグリオキシル酸誘導体
の反応液中における濃度として、たとえば０．１から５
０%w/v、好ましくは１から２０%w/vを示すことができ
る。フェニルグリオキシル酸誘導体は、一括（バッチ
法）、分割添加（フェドバッチ法）あるいは連続添加
（フィード法）等の任意の方法で添加することができ
る。

【００４３】本発明の不斉還元反応においては、好気的
条件下では通常副生成物が多くなることもある。この場
合には、嫌気的、あるいは酸素の制限条件下で反応を行
うことにより、高い収率を期待できる。具体的には、た
とえば窒素を液中もしくは気相中に通じて反応させるこ
とにより、収率の向上を期待できる。

【００４４】ここに例示した反応条件は、(R)体と(S)体
のいずれを合成する場合であっても、好適な条件として
示すことができる。本発明において、いずれの光学活性
体を得るかは、使用する微生物の種類によって決定され
る。したがって不斉還元反応のための条件、あるいは反
応に用いる微生物の培養条件は、用いる微生物の種類に
応じて、適宜適切な条件を設定すれば良い。

【００４５】かくして、本発明の反応により、フェニル
グリオキシル酸誘導体は不斉還元され光学活性なマンデ
ル酸誘導体が生成する。生成した光学活性マンデル酸誘
導体は、常法に従って容易に単離することができる。た
とえば、反応液から遠心分離によって、菌体などの不溶
性物質を除去した後、反応液の pH を適当な鉱酸、たと
えば硫酸や塩酸によって低下、好ましくは1 程度に調整
し、酢酸エチル、メチルイソブチルケトン、ジエチルエ
ーテルなどで抽出後、これを減圧濃縮することにより、
光学活性マンデル酸誘導体を結晶として、採取すること
ができる。

【００４６】さらに反応生成物の純度を上げるには、こ
のものを少量のアセトンに溶解し、ヘキサン−アセトン
混合溶剤で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーを行なうことで高度に精製することができる。また、
ベンゼン、トルエンあるいはヘキサン、酢酸エチル混合
溶媒中に加熱溶解後冷却し、再結晶することで容易に他
の不純物と分離することができる。

【００４７】本発明によって得られたマンデル酸誘導体
は、以下のようにして保存することができる。まず本品
は、得られた結晶体のまま、すなわち紛体のまま保存、
取り扱うことができる。通常、粉体は、最も小さい体積
で多くの物質を保存することができる。粉体のまま保存
する場合には、マンデル酸誘導体の経時的な品質変化、
特に光学純度の変化を起こしにくい条件を選択する。た
とえば湿気をさけ、室温以下で保存することが望まし
い。より好ましくは、湿気を避けて、０℃以下で保存す
ることが望ましい。

【００４８】しかし、マンデル酸誘導体は、紛体のまま
では、静電気による粉塵爆発の危険を伴う可能性があ
る。粉塵爆発の危険を避けるために、マンデル酸誘導体
を適当な溶媒中に溶解して保存することができる。溶液
状態での保存は、乾燥状態での保存に比べて、同量の物
質がより大きな体積を占める一方で、粉体の取り扱いに
必要なホッパーなどの紛体仕込み設備が不要となるとい
う利点も期待できる。したがって、マンデル酸化合物の
使用目的に応じて、当業者はその保存条件を適宜選択す
ることができる。

【００４９】マンデル酸誘導体の保存に用いる溶媒は、
マンデル酸を溶解しうる溶媒であれば、任意の溶媒を用
いることができる。たとえば水をはじめとしてpHを調整
した緩衝液、各種有機溶媒が挙げられる。より具体的に
は、保存用の溶媒として、水のほかに、酢酸エチル、メ
チルイソブチルケトン等を示すことができる。マンデル
酸誘導体が酸であることから、一般に、エステル、ある
いはアルコール系の溶媒であれば、エステル交換、エス
テル化による本品の純度低下、不純物の生成という問題
が起こる可能性はある。しかし、不純物の生成や光学純
度の低下の原因となる酸やアルカリの混入を防いだり、
あるいは温度や光の管理によって品質の低下を防止でき
る場合には、エステル、あるいはアルコール系の溶媒を
用いることもできる。

【００５０】溶液状態としたマンデル酸誘導体は、少な
くとも使用前における品質の維持が可能な条件下で保存
することができる。品質とは、具体的には、マンデル酸
誘導体の光学純度や、マンデル酸誘導体の純度を言う。
たとえば水溶液の場合には、アルカリ性を避けるのが望
ましい。具体的には、たとえばpH 11未満、好ましくは
酸性〜中性条件下で保存することが望ましい。また、熱
による分解を避けるため、低温での保存が望ましい。具
体的には、通常６５℃以下、好ましくは５０℃以下、さ
らに好ましくは４０℃以下を、適切な保存温度として示
すことができる。

【００５１】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。また、表
中菌株の株名の示す保存機関は以下のとおりである。 IFO： 財団法人発酵研究所 DSM： Deutsche Sammlung von Mikroorganismen ATCC： American Type Culture Collection JCM： 理化学研究所微生物系統保存施設 IAM： 東京大学応用微生物研究所 NRIC： 東京農業大学

【００５２】［実施例１］（基質オルトクロロフェニル
グリオキシル酸の合成） オルトクロロベンゾイルクロライド 17.5g（0.1mol）、
キュプロスシアニド 11.65g（0.13mol）、アセトニトリ
ル 8mLをトルエン 15mL中で３時間還流した後、室温ま
で冷却後、不溶物をろ別し、残渣をトルエンで洗浄し
た。得られたろ液を減圧条件下、溶媒留去し、残留物を
蒸留し、オルトクロロフェニルオキソアセトニトリルを
12.3g得た（収率 75％）。得られたオルトクロロフェニ
ルオキソアセトニトリル 16.5g（0.1mol）を濃塩酸 110
mL中、室温にて5日間反応後、1100mLの水を加え、エー
テルにて抽出し、エーテル層を減圧条件下、溶媒留去
し、残留物を四塩化炭素中で再結晶することで、白色結
晶を16.6g得た。本化合物は、¹H-NMR、MS、IRの各スペ
クトル分析により、式(III)に示すオルトクロロフェニ
ルグリオキシル酸であることを確認した（収率90%）。

【００５３】

【化６】式(III)

【００５４】［実施例２］（酵母のスクリーニング） 酵母エキス 3g/L、麦芽エキス 3g/L、グルコース 20g/
L、ポリペプトン 5g/Lからなる液体培地（pH 6.0）を、
18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121
℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表１に示す菌株を
一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。得られ
た培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg
オルトクロロフェニルグリオキシル酸および 10mgグル
コースを含む 100mMリン酸バッファー（pH 7.0） 1mLを
加え、30℃、48時間振とう反応した。反応液より遠心分
離によって除菌し、得られた上清中に含まれるオルトク
ロロマンデル酸は、C18逆相カラムを用いた液体クロマ
トグラフィーにより定量した。カラム温度を40℃とし
た、和光純薬株式会社製 C18逆相カラム（Wakosil II 5
C18 HG 4.6mm x 250mm）を用い、50mMリン酸バッファー
（pH 2.5）：アセトニトリル ＝ 3：1 の溶離液を流速
1mL/min で通じ、254nmにおけるUV吸収を検出すること
で定量した。また、反応液からオルトクロロマンデル酸
を酢酸エチルで抽出し、脱溶媒した後、光学分割カラム
を用いた液体クロマトグラフィーによりその光学純度を
測定した。光学分割カラムは、ダイセル化学工業株式会
社製キラルセル OJ-H（CHIRALCEL OJ-H 4.6mm x 150m
m）を用い、n-ヘキサン：イソプロパノール：トリフル
オロ酢酸 ＝ 85：15：0.1 の溶離液を流速1.5mL/minで
通じ、254nmにおけるUV吸収を検出することで測定を行
った。分析結果を表１に示す。その結果、光学活性な
(R)-オルトクロロマンデル酸が生成していることが確認
できた。

【００５５】

【表１】

【００５６】［実施例３］（バクテリアや、放線菌のス
クリーニング） ブイヨン培地（日水製薬株式会社製）を、18mmφ試験管
に 4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加
熱滅菌した。ここに、下表２に示す菌株を一白金耳接種
し、30℃、48時間振とう培養した。得られた培養液 2mL
より遠心分離によって集めた菌体に、10mgオルトクロロ
フェニルグリオキシル酸および10mgグルコースを含む10
0mMリン酸バッファー（pH7.0）1mLを加え、30℃、48時
間振とう反応した。反応液より遠心分離によって除菌
し、得られた上清中に含まれるオルトクロロマンデル酸
は、実施例２にしたがって定量および光学純度の測定を
行なった。分析結果を表２に示す。その結果、光学活性
な(R)-オルトクロロマンデル酸が生成していることが確
認できた。

【００５７】

【表２】

【００５８】［実施例４］（乳酸菌のスクリーニング） MRS培地（Lactobacilli MRS broth、Difco Laboratorie
s製）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレー
ブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表３に示
す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養し
た。得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌
体に、10mg オルトクロロフェニルグリオキシル酸およ
び10mgグルコースを含む100mMリン酸バッファー（pH 7.
0） 1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。反応液
より遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれ
るオルトクロロマンデル酸は、実施例２にしたがって定
量および光学純度の測定を行なった。分析結果を表３に
示す。その結果、光学活性な(R)-オルトクロロマンデル
酸が生成していることが確認できた。

【００５９】

【表３】

【００６０】［実施例５］（(S)体を生成する酵母のス
クリーニング） 酵母エキス 3g/L、麦芽エキス 3g/L、グルコース 20g/
L、ポリペプトン 5g/Lからなる液体培地（pH 6.0）を、
18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121
℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表４に示す菌株を
一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養した。得られ
た培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌体に、10mg
オルトクロロフェニルグリオキシル酸および10mg グル
コースを含む100mMリン酸バッファー（pH 7.0） 1mLを
加え、30℃、48時間振とう反応した。反応液より遠心分
離によって除菌し、得られた上清中に含まれるオルトク
ロロマンデル酸は、実施例２にしたがって定量および光
学純度の測定を行なった。分析結果を表４に示す。その
結果、光学活性な(S)-オルトクロロマンデル酸が生成し
ていることが確認できた。

【００６１】

【表４】

【００６２】［実施例６］（(S)体を生成するバクテリ
アや放線菌のスクリーニング） ブイヨン培地（日水製薬株式会社製）を、18mmφ試験管
に4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱
滅菌した。ここに、下表５に示す菌株を一白金耳接種
し、30℃、48時間振とう培養した。得られた培養液 2mL
より遠心分離によって集めた菌体に、10mgオルトクロロ
フェニルグリオキシル酸および10mgグルコースを含む10
0mMリン酸バッファー（pH7.0）1mLを加え、30℃、48時
間振とう反応した。反応液より遠心分離によって除菌
し、得られた上清中に含まれるオルトクロロマンデル酸
は、実施例２にしたがって定量および光学純度の測定を
行なった。分析結果を表５に示す。その結果、光学活性
な(S)-オルトクロロマンデル酸が生成していることが確
認できた。

【００６３】

【表５】

【００６４】［実施例７］（(S)体を生成する乳酸菌の
スクリーニング） MRS培地（Lactobacilli MRS broth、Difco Laboratorie
s製）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレー
ブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表６に示
す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養し
た。得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌
体に、10mgオルトクロロフェニルグリオキシル酸および
10mgグルコースを含む100mMリン酸バッファー（pH7.0）
1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。反応液より
遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれるオ
ルトクロロマンデル酸は、実施例２にしたがって定量お
よび光学純度の測定を行なった。分析結果を表６に示
す。その結果、光学活性な(S)-オルトクロロマンデル酸
が生成していることが確認できた。

【００６５】

【表６】

【００６６】［比較例］酵母エキス 3g/L、麦芽エキス
3g/L、グルコース 20g/L、ポリペプトン 5g/Lからなる
液体培地（pH 6.0）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注
し、オートクレーブ中121℃、15分間加熱滅菌した。こ
こに、特許03146641（特開平6-7179）記載のキャンディ
ダ・ファマータ IFO 0856株を一白金耳接種し、30℃、4
8時間振とう培養した。得られた培養液 2mLより遠心分
離によって集めた菌体に、10mgオルトクロロフェニルグ
リオキシル酸および10mgグルコースを含む100mMリン酸
バッファー（pH7.0）1mLを加え、30℃、48時間振とう反
応した。反応液より遠心分離によって除菌し、得られた
上清中に含まれるオルトクロロマンデル酸を、実施例２
にしたがって定量した。その結果、オルトクロロマンデ
ル酸は検出できなかった。

【００６７】［実施例８］（基質メタクロロフェニルグ
リオキシル酸の合成） メタクロロベンゾイルクロライド 43.8g（0.1mol）、キ
ュプロスシアニド 29.1g（0.13mol）、アセトニトリル
20mLをトルエン 37mL中で３時間還流した後、室温まで
冷却後、不溶物をろ別し、残渣をトルエンで洗浄した。
得られたろ液を減圧条件下、溶媒留去し、残留物を蒸留
し、メタクロロフェニルオキソアセトニトリルを28g得
た（収率 68％）。得られたメタクロロフェニルオキソ
アセトニトリル 15g（0.1mol）を濃塩酸 110mL中、室温
にて5日間反応後、1100mLの水を加え、エーテルにて抽
出し、エーテル層を減圧条件下、溶媒留去し、残留物を
四塩化炭素中で再結晶することで、白色結晶を15.1g得
た。本化合物は、¹H-NMR、MS、IRの各スペクトル分析に
より、式(III)に示すメタクロロフェニルグリオキシル
酸であることを確認した（収率90%）。

【００６８】［実施例９］（バクテリアのスクリーニン
グ２） ブイヨン培地（日水製薬株式会社製）を、18mmφ試験管
に 4mLずつ分注し、オートクレーブ中121℃、15分間加
熱滅菌した。ここに、下表７に示す菌株を一白金耳接種
し、30℃、48時間振とう培養した。得られた培養液 2mL
より遠心分離によって集めた菌体に、10mgメタクロロフ
ェニルグリオキシル酸および10mgグルコースを含む100m
Mリン酸バッファー（pH 7.0）1mLを加え、30℃、48時間
振とう反応した。反応液より遠心分離によって除菌し、
得られた上清中に含まれるメタクロロマンデル酸は、C1
8逆相カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより定
量した。カラム温度を40℃とした、和光純薬株式会社製
C18逆相カラム（Wakosil II 5C18 HG 4.6mm x 250mm）
を用い、50mMリン酸バッファー（pH 2.5）：アセトニト
リル ＝ 3：1 の溶離液を流速 1mL/min で通じ、254nm
におけるUV吸収を検出することで定量した。また、反応
液からメタクロロマンデル酸を酢酸エチルで抽出し、脱
溶媒した後、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラ
フィーによりその光学純度を測定した。光学分割カラム
は、ダイセル化学工業株式会社製キラルセル OJ-H（CHI
RALCEL OJ-H 4.6mm x 150mm）を用い、n-ヘキサン：イ
ソプロパノール：トリフルオロ酢酸 ＝ 85：15：0.1 の
溶離液を流速1.5mL/minで通じ、254nmにおけるUV吸収を
検出することで測定を行った。分析結果を表７に示す。
その結果、光学活性な(R)-メタクロロマンデル酸が生成
していることが確認できた。

【００６９】

【表７】

【００７０】［実施例９］（乳酸菌のスクリーニング
２） MRS培地（Lactobacilli MRS broth、Difco Laboratorie
s製）を、18mmφ試験管に4mLずつ分注し、オートクレー
ブ中121℃、15分間加熱滅菌した。ここに、下表７に示
す菌株を一白金耳接種し、30℃、48時間振とう培養し
た。得られた培養液 2mLより遠心分離によって集めた菌
体に、10mg メタクロロフェニルグリオキシル酸および1
0mgグルコースを含む100mMリン酸バッファー（pH7.0）
1mLを加え、30℃、48時間振とう反応した。反応液より
遠心分離によって除菌し、得られた上清中に含まれるメ
タクロロマンデル酸は、実施例８にしたがって定量およ
び光学純度の測定を行なった。分析結果を表８に示す。
その結果、光学活性な(R)-メタクロロマンデル酸が生成
していることが確認できた。

【００７１】

【表８】

【００７２】

【発明の効果】本発明により、光学活性なマンデル酸誘
導体を微生物を用いた不斉還元反応によって、効率的に
製造することができる。本発明の方法は、高い収率を期
待できるので、工業的にも有利である。本発明によって
製造される光学活性なマンデル酸誘導体は、光学分割剤
として、また光学活性な医薬や農薬の合成原料として有
用である。より具体的には、光学活性なマンデル酸誘導
体は、抗血小板剤、抗肥満薬の合成中間体、優先晶析等
において利用されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:85 Ｃ１２Ｒ 1:78） 1:01 (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:15 Ｃ１２Ｒ 1:84） 1:05 (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:06 Ｃ１２Ｒ 1:85） 1:225 (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:37 Ｃ１２Ｒ 1:01） 1:38 (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:37） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:38）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式(I)で示されるフェニルグリオキシル酸
   誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元しうる能力を
   有する微生物の培養物、菌体またはその処理物を作用さ
   せ、生成する式(II)で表される光学活性なマンデル酸誘
   導体を回収する工程を含む、光学活性なマンデル酸誘導
   体の製造方法。 【化１】式(I) （式中Xは水素原子またはアルカリあるいはアルカリ土
   類金属を表し、Rはオルト位、メタ位またはパラ位が一
   個または複数個置換されていることを意味し、置換基は
   ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアル
   キル基、アルコキシ基またはチオアルキル基、アミノ
   基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、またはフェ
   ノキシ基を表す） 【化２】式(II) （式中XとRは、それぞれ式(I)のXとRと同じ置換基を表
   す）
2. 【請求項２】 微生物が、下記の群から選択されるいず
   れかの属に属する微生物であり、得られる光学活性なマ
   ンデル酸誘導体が(R)-体であることを特徴とする請求項
   １に記載の光学活性なマンデル酸誘導体の製造方法。キ
   ャンディダ（Candida）属、クリプトコッカス（Cryptoc
   occus）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、オガタエア
   （Ogataea）属、ピキア（Pichia）属、ロドスポリディ
   ウム（Rhodosporidium）属、ロドトルラ（Rhodotorul
   a）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、トリコ
   スポロン（Trichosporon）属、ヤマダジマ（Yamadazym
   a）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、アミコラトプ
   シス（Amycolatopsis）属、アルカリゲネス（Alcaligen
   es）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、ブレビ
   バクテリウム（Brevibacterium）属、コマモナス（Coma
   monas）属、コリネバクテリウム（Corynebactrium）
   属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エンテロコ
   ッカス（Enterococcus）属、ラクトバシラス（Lactobac
   illus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ミク
   ロバテリウム（Microbacterium）属、ミクロコッカス
   （Micrococcus）属、プロテウス（Proteus）属、および
   シュードモナス（Pseudomonas）属
3. 【請求項３】 微生物が、下記の群から選択されるいず
   れかの微生物である、請求項２に記載の光学活性なマン
   デル酸誘導体の製造方法。キャンディダ・エルノビー
   （Candida ernobii）、キャンディダ・グロペンギエセ
   リ（Candida gropengiesseri）、キャンディダ・マグノ
   リアエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・サケ（C
   andida sake）、キャンディダ・シェハタエ（Candida s
   hehatae）、キャンディダ・シルバティカ（Candida sil
   vatica）、クリプトコッカス・フラバス（Cryptococcus
   flavus）、クリプトコッカス・フミコラス（Cryptococ
   cus humicolus）、クリプトコッカス・マルセランス（C
   ryptococcus marcerans）、ハンセヌラ・ベッキー（Han
   senula beckii）、ハンセヌラ・カナデンシス（Hansenu
   la canadensis）、ハンセヌラ・グルコジマ（Hansenula
   glucozyma）、オガタエア・ピニ（Ogataea pini）、ピ
   キア・カルソニー（Pichia carsonii）、ピキア・ファ
   ビアニー（Pichia fabianii）、ピキア・ハプロフィラ
   （Pichia haplophila）、ピキア・サブペリクローサ（P
   ichia subpelliculosa）、ロドスポリディウム・ダクリ
   オディウム（Rhodosporidium dacryodium）、ロドスポ
   リディウム・ディオボバタム（Rhodosporidium diobova
   tum）、ロドスポリディウム・トルロイデス（Rhodospor
   idium toruloides）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodot
   orula glutinis）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula
   minuta）、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubr
   a）、サッカロマイセス・シェレビシアエ（Saccharomyc
   es cerevisiae）、トリコスポロン・ブラシカエ（Trich
   osporon brassicae）、トリコスポロン・プルランス（T
   richosporon pullulans）、ヤマダジマ・キャスティラ
   エ（Yamadazyma castillae）、ヤマダジマ・ナカザワエ
   ・バラエティ・アキタエンシス（Yamadazyma nakazawae
   var. akitaensis）、ヤマダジマ・スコリティ（Yamada
   zyma scolyti）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhod
   ococcus erythropolis）、ロドコッカス・ファシアンス
   （Rhodococcus fascians）、ロドコッカス・オブエンシ
   ス（Rhodococcus obuensis）、ロドコッカス・ロドクロ
   ス（Rhodococcus rhodochrous）、アミコラトプシス・
   オリエンタリス・サブスピーシーズ・オリエンタリス
   （Amycolatopsis orientalis subsp. orientalis）、ア
   ルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）、アルス
   ロバクター・プロトフォルミアエ（Arthrobacter proto
   phormiae）、ブレビバクテリウム・ヨーディナム（Brev
   ibacterium iodinum）、コマモナス・テストステロニ
   （Comamonas testosteroni）、コリネバクテリウム・ア
   ンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、エ
   ンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloaca
   e）、エンテロコッカス・カセリフラバス（Enterococcu
   s casseliflavus）、エンテロコッカス・フェカリス（E
   nterococcus faecalis）、エンテロコッカス・ヒラエ
   （Enterococcus hirae）、ラクトバシラス・ビリデッセ
   ンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバシラス
   ・マリ（Lactobacillus mali）、ラクトバシラス・コリ
   ノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバシ
   ラス・フルクティボランス（Lactobacillus fructivora
   ns）、ラクトバシラス・ヒルガルディ（Lactobacillus
   hilgardii）、ロイコノストック・メセンテロイデス・
   サブスピーシーズ・デキストラカム（Leuconostoc mese
   nteroides subsp. dextranicum）、ミクロコッカス・ル
   テウス（Micrococcus luteus）、プロテウス・バルガリ
   ス（Proteus vulgaris）、およびシュードモナス・ジミ
   ヌタ（Pseudomonas diminuta）
4. 【請求項４】 微生物が、下記の群から選択されるいず
   れかの属に属する微生物であり、得られる光学活性なマ
   ンデル酸誘導体が(S)-体であることを特徴とする請求項
   １に記載の光学活性なマンデル酸誘導体の製造方法。ロ
   ドスポリディウム（Rhodosporidium）属、ラクトバシラ
   ス（Lactobacillus）属、ロイコノストック（Leuconost
   oc）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、お
   よびシュードモナス（Pseudomonas）属
5. 【請求項５】 微生物が、下記の群から選択されるいず
   れかの微生物である、請求項４に記載の光学活性なマン
   デル酸誘導体の製造方法。ロドスポリディウム・ダクリ
   オイダム（Rhodosporidium dacryoidum）、ラクトバシ
   ラス・ハロトレランス（Lactobacillus halotorelan
   s）、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピ
   ーシーズ・クレモリス（Leuconostoc mesenteroides su
   bsp. cremoris）、ミクロバクテリウム・ラクチカム（M
   icrobacterium lacticum）、およびシュードモナス・エ
   スピー（Pseudomonas sp.）
6. 【請求項６】 フェニルグリオキシル酸誘導体が、オル
   ト位が置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である
   請求項１に記載の光学活性なマンデル酸誘導体の製造方
   法。
7. 【請求項７】 オルト位がハロゲン原子に置換されたフ
   ェニルグリオキシル酸誘導体である請求項６に記載の光
   学活性なマンデル酸誘導体の製造方法。
8. 【請求項８】 フェニルグリオキシル酸誘導体が、メタ
   位が置換されたフェニルグリオキシル酸誘導体である請
   求項１に記載の光学活性なマンデル酸誘導体の製造方
   法。
9. 【請求項９】 メタ位がハロゲン原子に置換されたフェ
   ニルグリオキシル酸誘導体である請求項８に記載の光学
   活性なマンデル酸誘導体の製造方法。