JP2003238449A - 鶏用組み換えワクチン及びそれを用いた免疫付与方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 発育鶏卵に接種しても副作用がない組み換え
鶏用組み換えワクチン、及び当該ワクチンを用いた鶏へ
の免疫付与方法を提供する。 【解決手段】 鳥類病原体の抗原遺伝子を有する組み換
えカナリア痘ウイルスを主成分とする鶏用組み換えワク
チン。このワクチンを発育鶏卵に接種することで、容易
に鶏への免疫が付与できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、鶏用組み換えワク
チンに関し、詳しくは、発育鶏卵に接種しても副作用が
ない組み換えカナリア痘ウイルスを主成分とする鶏用組
み換えワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、実用化されているワクチンは、生
ワクチンと不活化ワクチンに分けられる。不活化ワクチ
ンは、免疫持続期間の短さや免疫付与に必要な抗原量の
多さなどの問題を有しているため、生ワクチンが多用さ
れている。

【０００３】従来、生ワクチンとして、病原体をインビ
トロで継代するような方法で弱毒化した弱毒生ワクチン
が多用されていた。しかし、弱毒ワクチンは、変異によ
り毒性が復活する可能性を有する上、様々な副作用を持
つものが多い。このため、より安全なワクチンとして、
毒性のほとんど無いウイルスベクターに抗原遺伝子を挿
入して得られる組み換えウイルスからなる組み換えワク
チンが開発されている。

【０００４】ワクチン接種は、養鶏業界において最も経
済効果の高い疾病対策の一つとして行われている。鶏用
組み換えワクチン作製に用いるウイルスベクターとして
は、ヘルペスウイルス属の七面鳥ヘルペスウイルス（Ｈ
ＶＴ）やアビポックスウイルス属の鶏痘ウイルス（ＦＰ
Ｖ）がある。ＦＰＶは、速やかな免疫賦与を与えること
や、２週間程度で接種鶏からウイルスが駆逐されるとい
う長所があるため、有効なワクチンとして実用化されて
いる。

【０００５】ところで鶏用組み換えワクチンには、安全
性や効果が高いことばかりでなく、接種方法が容易であ
ることも求められている。接種方法には、皮下接種や、
翼膜接種、飲水投与、点眼、孵化前の発育鶏卵への接種
などがある。中でも発育鶏卵への接種は、ワクチン接種
の自動化が可能であり、接種に伴う手間を軽減できる利
点がある。しかしながら、ＦＰＶを用いた鶏用組み換え
ワクチンを発育鶏卵へ接種すると、孵化率の低下や、孵
化後の死亡率が高くなるという副作用があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】かかる従来技術のも
と、本発明者らは、発育鶏卵に接種しても副作用のない
鶏用組み換えワクチンを得るべく鋭意研究した結果、ア
ビポックスウイルス属の中でもカナリア痘ウイルスを鶏
の卵に接種した場合には、孵化率が低下せず、また孵化
後の死亡率も低下しないことを見出し、本発明を完成す
るに到った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、鳥類病原体の抗原遺伝子を有する組み換えカナリア
痘ウイルスを主成分とする鶏用組み換えワクチン（以
下、単に本発明のワクチンということがある）が提供さ
れ、また当該鶏用組み換えワクチンを、発育鶏卵に接種
することを特徴とする鶏への免疫付与方法が提供され、
更にカナリア痘ウイルスの鶏用組み換えワクチン用ベク
ターとしての使用が提供される。

【０００８】

【発明の実施の形態】（１）カナリア痘ウイルス（以下
ＣａＰＶと略す） 本発明で用いるＣａＰＶは、ポックスウイルス科チョル
ドポックスウイルス亜科アビポックスウイルス属に分類
されるウイルスである。ＣａＰＶは、発育鶏卵に接種し
ても孵化率を低下させず、また、孵化後の体重増加が非
接種鶏と比べて低下させないウイルスである。好ましい
ＣａＰＶの具体例としてはバイオミューン社のＰｏｘｉ
ｍｕｎｅ−Ｃなどの市販生ワクチン株、Ｃ−１８６株、
ＳＧＡ株などの野外分離株、寄託機関ＡＴＣＣに保管さ
れているＡＴＣＣ ＮｕｍｂｅｒＶＲ−１１１などが挙
げられる。

【０００９】（２）ＣａＰＶの増殖に非必須なＤＮＡ領
域（非必須領域） ＣａＰＶの増殖に非必須な領域に鳥類病原体の抗原遺伝
子を挿入して、本発明のワクチンの有効成分である組み
換えＣａＰＶを得る。ＣａＰＶの増殖に非必須なＤＮＡ
領域とは、その領域のＤＮＡが欠損する、又はその領域
に外来遺伝子が挿入されるなどの変異を受けても変異前
のＣａＰＶ（これを親株という）と同様に増殖し、当該
変異を受けたＣａＰＶを継代しても安定なゲノム構造を
維持することができる領域である。このような非必須領
域の具体例としては、配列番号１に示した３，３４８塩
基対からなるＥｃｏＲＩ断片中の第１，７８５〜１，８
７５番目の領域が例示される。この非必須領域の中に外
来遺伝子を挿入する部位としての具体例としては、配列
番号１の第１，８２５番目にある制限酵素Ｂｓｔ１１０
７Ｉ切断部位などが例示される。

【００１０】ここに例示した以外の非必須領域であって
も、以下の手順で容易にクローニングできる。まず
（ａ）ＣａＰＶゲノムＤＮＡを制限酵素で切断し、ベク
ターにクローニングして、複数のクローンを得、（ｂ）
その中から任意の長さ（例えば３〜４ｋｂ長程度）のＣ
ａＰＶゲノムＤＮＡ断片を選び、（ｃ）そのＤＮＡの制
限酵素地図を作製する。次いで、これらＤＮＡ断片から
非必須領域を選択するには、次（ｄ）〜（ｇ）の手順に
よればよい。

【００１１】（ｄ）制限酵素地図から確認された、各ク
ローン中に存在する任意の制限酵素サイトに、例えばワ
クシニアウイルス７．５ｋＤａポリペプチドのプロモー
ター（以下、７．５ｋプロモーターという）などを、例
えばβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子
などのマーカーと共に、常法に従って挿入し、ベクター
を構築する。（ｅ）ＣａＰＶを感染させた細胞に（ｄ）
で作製した各ベクターをトランスフェクションする。
（ｆ）得られた各組み換え体を純化する。（ｇ）純化し
た組み換えＣａＰＶを鶏胎児繊維芽細胞（以下、ＣＥＦ
という）で数代継代培養した後、ゲノムの安定性やβ−
ガラクトシダーゼの発現量を調べる。（ｇ）においてゲ
ノムが安定ですべてのプラークがβ−ガラクトシダーゼ
を発現している組み換えＣａＰＶが得られた場合に、そ
のｌａｃＺ遺伝子を挿入した制限酵素サイト近傍が非必
須領域として利用可能であると判断できる。

【００１２】（３）組み換えＣａＰＶ 組み換えＣａＰＶは、上述してきた非必須領域に鶏に対
する病原体の抗原遺伝子が挿入された組み換えＣａＰＶ
であり、例えば、以下のように作製される。前述したＣ
ａＰＶの非必須領域が挿入されたベクターに、ＣａＰＶ
で機能するプロモーターとともに病原体の抗原遺伝子を
組み込んで、組み換えベクターを作製する。次いで、Ｃ
ａＰＶ感染細胞と当該組み換えベクターとで相同組み換
えを起こさせて、ＣａＰＶに鶏病病原体の抗原遺伝子を
挿入した後、組み換えＣａＰＶを選択、純化する。

【００１３】（ベクター）非必須領域を挿入するための
ベクターに格別な制限はなく、一般的なものを用いれば
よい。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ
７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等のプラスミド、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＫＩＩなどのファージミド、Ｍ１３ファー
ジなどのファージ、ｐＨＣ７９等のコスミドなどのベク
ターを適当な制限酵素で処理して用いればよい。

【００１４】（プロモーター）本発明で用いるプロモー
ターは、組み換えＣａＰＶ感染細胞中でプロモーターと
して機能するものであれば、特に限定されない。例え
ば、ワクシニアウイルスの７．５ｋポリペプチドや、１
１ｋポリペプチド、チミジンキナーゼなどの遺伝子プロ
モーターなどが例示されるほか、プロモーターとして機
能する限りにおいては、塩基の一部を置換、欠失、付加
などの改変をしたものであってもよく、また合成された
ものでもよい。

【００１５】（抗原遺伝子）本発明で用いる抗原遺伝子
は、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイ
ルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病
ウイルスなどの鶏に対する病原体の抗原遺伝子であれ
ば、特に限定されない。抗原遺伝子の具体例としては、
ニューカッスル病ウイルスのＨＮタンパク質をコードす
る遺伝子（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．、Ｖｏｌ．６７、ｐ１９１７−１９２７、
１９８６）やＦタンパク質をコードする遺伝子（ＭｃＧ
ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．、Ｖ
ｏｌ．５、ｐ３４３−３５６、１９８６）；伝染性喉頭
気管炎ウイルスの糖タンパク質ｇＢ（Ｐｏｕｌｓｅｎ
ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ、Ｖｏｌ．５、
ｐ３３５−３４７、１９９１、米国特許番号５，４４
３，８３１）やＵＬ３２（ＷＯ９８／０７８６６）をコ
ードする遺伝子；マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇ
Ｂをコードする遺伝子（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、Ｖｏｌ．７０、ｐ１７８９−１
８０４、１９８８）；伝染性ファブリキウス嚢病ウイル
スの構造タンパクＶＰ２をコードする遺伝子（Ｂａｙｌ
ｉｓｓ ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、Ｖｏ
ｌ．７１、ｐ１３０３−１３１２、１９９０）；等の感
染防御に関与した抗原をコードした遺伝子が例示され
る。

【００１６】（マーカー遺伝子）本発明でＣａＰＶに挿
入される遺伝子は、鶏に対する病原体の抗原遺伝子以外
に、必要とあればマーカー遺伝子を含めても良い。具体
例としては、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼをコー
ドするｌａｃＺ遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子などが例
示される。

【００１７】（相同組み換え）ＣａＰＶと組み換えベク
ターとで相同組み換えを起こさせる方法は特に制限され
ず、常法に従って行えばよい。すなわち、予めＣａＰＶ
を感染させた細胞に、例えば、リン酸カルシウムやエレ
クトロポレーション等により組み換えベクターを導入す
ることにより、ベクターと感染細胞中のウイルスゲノム
ＤＮＡとの間で相同組み換えが起こり、組み換えＣａＰ
Ｖが構築される。得られた組み換えＣａＰＶを、イーグ
ルＭＥＭなどの培地で培養された宿主細胞に感染させ、
挿入した外来遺伝子をプローブとするハイブリダイゼー
ション法や、挿入したマーカー遺伝子の発現を調べる方
法、挿入した抗原遺伝子のコードするポリペプチドに対
する抗体を使用したイムノアッセイ法等に付すことによ
り、目的の組み換えウイルス候補を選び、純化していけ
ばよい。例えば、マーカー遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子
が組み込まれている組み換えＣａＰＶの場合、β−ガラ
クトシダーゼを発現する。よって、その基質の１つであ
るＢｌｕｏ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）存在下
で青いプラークを形成するので、その性質を利用して選
択、純化することが容易にできる。

【００１８】ここで用いる宿主細胞は、用いるＣａＰＶ
が感染し、増殖することが可能なものであれば特に限定
されず、例えば、鶏胎児繊維芽細胞（以下ＣＥＦと略
す）細胞等が挙げられる。

【００１９】（４）組み換えＣａＰＶを有効成分とする
鶏用組み換えワクチン 本発明の鶏用組み換えワクチンは、上述した組み換えＣ
ａＰＶを有効成分として含有するものである。本発明の
ワクチンは、ウイルス以外にも薬理学的に許容しうるキ
ャリアー、例えば生理食塩水などを含んでいてもよい。
また、本発明のワクチンに、本発明の効果を損なわない
範囲で他の有効成分を混合してもよい。他の有効成分
は、組み換えウイルスであっても、他の非組み換えワク
チンであってもよい。

【００２０】本発明のワクチンの調製方法は特に限定さ
れない。例えば、ＣａＰＶが生育することのできる細胞
に上述してきた組み換えＣａＰＶを感染させ、培養して
組み換えＣａＰＶが必要量まで増殖させる。その後、細
胞を回収して破砕する。この細胞破砕物を遠心分離し
て、高力価の組み換えＣａＰＶを含んだ遠心上清と、沈
澱物に分離する。本質的に宿主細胞を含まず、細胞培養
培地と組み換えＣａＰＶを含んだこの遠心上清は、本発
明のワクチンとして使用できるほか、遠心上清に薬理学
的に許容される生理食塩水などを添加し、再調整しても
良い。

【００２１】組み換えＣａＰＶは凍結乾燥しても失活す
ることがない。そのため、組み換えＣａＰＶや、これを
含む上述した遠心上清を凍結乾燥後、凍結乾燥ワクチン
として室温（２０〜２２℃程度）で長期保存することも
可能である。従って、本発明のワクチンは、従来発育鶏
卵接種に使用されるマレック病ワクチンの場合に必要で
あった液体窒素中での保存、取扱い及び接種などの面倒
な手続きを軽減することができるという利点も有してい
る。さらに組み換えＣａＰＶやその懸濁液を、−２０℃
〜−７０℃に凍結して保存可能である。

【００２２】本発明のワクチンを接種する方法は、有効
成分である組み換えＣａＰＶが鶏に感染して防御免疫を
引き起こす方法であれば、どのような方法で投与しても
よいが、特に発育鶏卵への接種に好適である。接種量
は、例えばニワトリに接種する場合、１羽（又は１卵）
あたり通常、組み換えＣａＰＶ量として１０^３〜１０^６
ｐｆｕ（プラーク形成単位）である。注射する場合に
は、この量を生理食塩水などの生理学的に許容される液
体で希釈したりして、０．１ｍｌ程度にすればよい。

【００２３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。尚、文中の％は、特に断りのない限り重量基準で
ある。

【００２４】（参考例１）アビポックスウイルスの鶏卵
接種による副作用評価 よりＳＰＦ受精卵（ＳＰＡＦＡＳ社製（米国、コネチカ
ット州））３６０個を、温度３７℃、相対湿度６０％の
孵卵器に入れ、１８日間転卵（２０回／日）した。１８
日目に卵を孵卵器より取り出し、検卵を行って無精卵や
発育中止卵を取り除いた３３４個を８群に分け、７つの
群にそれぞれ表１記載のアビポックスウイルス１０^４Ｐ
ＦＵ／個を接種した。接種後、各卵は群毎に孵卵器の発
生座に置き、転卵せずに孵化させた。生まれた雛は群が
識別できるように脚帯を付けて雛室に移し、１週間飼育
し、１週間後の生存数をカウントした。その結果を表１
に示す。尚、接種に用いたアビポックスウイルスは全
て、バイオミューン社（米国、カンサス州）で保有して
いたウイルスを使用した。

【００２５】

【表１】

【００２６】表１からわかるように、２種類の鶏痘生ワ
クチン株、鳩痘ウイルス、クエールポックスを接種した
鶏群は孵化率の低下あるいは死亡率が上昇したが、Ｃａ
ＰＶを接種した鶏は、使用した３種類とも、孵化率及び
死亡率ともに、非接種コントロール群と変わらず、発育
鶏卵への接種が悪影響を及ぼさないことが判明した。

【００２７】（参考例２）ＣａＰＶゲノムＤＮＡ断片を
挿入したプラスミドの調製 ６枚の直径１５０ｍｍの培養皿で、２０ｍｌ/皿の０．
０３％Ｌ−グルタミン加イーグルＭＥＭ培地で培養され
た鶏胎児繊維芽（ＣＥＦ）細胞に、ＣａＰＶＳＧＡ株を
１ｐｆｕ／細胞（以下Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝１と略することも
ある）となるように感染させ、前述の培地で３７℃、５
％ＣＯ_２インキュベーターで４日間培養後、感染細胞を
スクレーパーで培養皿からはがし、５０ｍｌ遠心チュー
ブで回収した。ＰＢＳで洗浄後、１．２ｍｌのＰＢＳに
懸濁し、０．８ｍｌの可溶化バッファー（１．２５％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００、２５０ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール（２−ＭＥ）、５０ｍｌＥＤＴＡ添加ＰＢＳ）
を加えて室温に１５分静置して細胞を可溶化した。３０
００ｒｐｍ、５分の遠心分離で細胞残瑳を除去し、上澄
みをエッペンドルフチューブに移して１５０００ｒｐ
ｍ、２０分遠心分離してウイルス粒子を沈殿させた。ウ
イルス粒子を、１ｍｌの１２．５ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に再懸濁し、ヌクレアーゼ液（０．２５ｍｇ
／ｍｌＤＮａｓｅＩ、０．２５ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ
Ａ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を４μｌ加えて３７℃下、
３０分静置した。次いで、これに５００ｍＭＥＤＴＡを
２５μｌ、１０％ＳＤＳを１２５μｌ、蒸留水を８７μ
ｌ、１０ｍｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅａｓｅＫを１２．５μ
ｌ、２−ＭＥを０．５μｌ加えて、５５℃下３０分静置
した。静置後のウイルス含有液にフェノール・クロロホ
ルム（１：１）を加えて、フェノール・クロロホルム抽
出した。もう１回フェノール・クロロホルム抽出行った
後、上層液に５Ｍ ＮａＣｌ １６μｌを加え、次いで
２．５倍量のエタノールを加えた後、−７０℃に静置し
て、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿させたＤＮＡを分取し、
７０％エタノールでＤＮＡを洗浄後、乾燥させた。この
ようにして、ＣａＰＶのゲノムＤＮＡ８０μｇを取得し
た。

【００２８】得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で
１μｇ／μｌに溶かし、この溶液１５μｇに制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩを加えてＤＮＡを切断し、０．８％アガロース
ゲル電気泳動で２Ｋｂｐ〜７ＫｂのＤＮＡ断片を回収し
た。この回収されたＤＮＡを、λＺＡＰＩＩベクターを
ＥｃｏＲＩで切断したＤＮＡ断片（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ
Ｅ社より切断済みのものが市販されている。製品コード
番号＃２３６２１１）にライゲーションした。その後、
製品に添付されているメーカー指示書に従ってパッケー
ジングを行い、ファージ液を作製した。その液中のファ
ージ量を測定したところ、２×１０^５ｐｆｕであった。

【００２９】そのファージ液をメーカー指示書に従い、
添付されていた大腸菌や、ヘルパーファージを用い
て、”Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ”をおこな
い、アンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で３７℃終夜
培養して出現させたコロニーをランダムに７２個拾い、
それぞれアンピシリン添加したＬＢ液体培地で培養して
増えた大腸菌からプラスミドを常法に従って調製した。
そうして調製された７２種類のプラスミドの内、プラス
ミドの長さが約６Ｋｂｐのものを選択したところ、２種
類が該当し、それぞれｐＢＳＣＰ０１とｐＢＳＣＰ０４
と命名した。これらプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで
切断して０．８％アガロースゲル電気泳動したところ、
２．９ｋｂｐのプラスミド由来のＤＮＡ以外に、それぞ
れ３．３ｋｂｐ、３．５ｋｂｐの断片が検出された。こ
の各断片はＣａＰＶゲノム由来のＤＮＡであり、ＣＰ０
１、ＣＰ０４クローンと命名した。

【００３０】（参考例３） クローニングされたＣａＰ
Ｖゲノムの解析 （１）制限酵素地図の作成 参考例２で選択されたｐＢＳＣＰ０１及びｐＢＳＣＰ０
４を、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｂｓｔ１１０
７Ｉ、ＥｃｏＴ２２、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、Ｋｐ
ｎＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩのい
ずれかの制限酵素を用いて単独で切断し、または二つの
制限酵素を用いて二重切断し、アガロースゲル電気泳動
を行い、切断されて出現するバンドの数と本数を調べ
た。二重切断の組み合わせを変えることで、ＣＰ０１及
びＣＰ０４クローンについて、上記の制限酵素の切断部
位が決定された。このようにして作製されたＣＰ０１及
びＣＰ０４クローンの制限酵素地図を図１に示す。

【００３１】（２）塩基配列分析 ＣＰ０１の塩基配列分析を下記の様にして行った。まず
プラスミドｐＢＳＣＰ０１をテンプレートにして、ＳＴ
ＲＡＴＡＧＥＮＥ社より市販されているシークエンス用
プライマー（Ｔ３ ２０ｍｅｒとＴ７ ２２ｍｅｒ）を
用いてベックマンコールター社のＤＴＣＳキット（Ｐ／
Ｎ ６０８０００）で指示書に従って調製したシークエ
ンス反応液を該社のシークエンサー（ＣＥＱ２０００）
にかけて、各々のクローンの５’及び３’末端の約６０
０ｂｐの塩基配列を解読した。次に、制限酵素地図（図
１）の情報を基にサブクローニングしたＤＮＡ断片や、
解読した塩基配列情報を基に設計した合成プライマーを
用いて同様に順次シークエンスを行い、ＣＰ０１クロー
ンの全長の塩基配列を解読した。ＣＰ０１クローンの塩
基配列を配列番号１に示す。

【００３２】また、解読した全塩基配列情報から推定さ
れる１５０以上のアミノ酸からなる蛋白をコードするオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、ＣＰ０１ク
ローン内にそれぞれ４つ見出された。それを図１に記載
する。

【００３３】（参考例４）ｌａｃＺ遺伝子をプロモータ
ーとともにＣａＰＶゲノムＤＮＡ断片内に挿入した組み
換え用プラスミドの調製 ここで用いたプラスミド作製のための酵素反応等は、酵
素メーカーの推薦する緩衝液や反応条件を用いておこな
っている。

【００３４】（１）ｐＮＺＣＰ０１の作製（図２） 参考例２で得たプラスミドｐＢＳＣＰ０１を制限酵素Ｅ
ｃｏＴ２２ＩＸｈｏＩで二重切断し、フェノール・クロ
ロホルム処理した後、エタノール沈殿処理後、ブランテ
ィングキット（宝酒造）で切断末端を平滑化した後、ラ
イゲーションして得られたプラスミドを用い、大腸菌Ｔ
Ｇ１を形質転換した。アンピシリン存在下のＬＢ寒天培
地に出現したコロニーを、アンピシリン存在下のＬＢ液
体培地で培養した後、ビルンボイムとドーリーの方法
（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．
７、ｐ１５１３−、１９７９）でプラスミドを抽出し、
ＣＰ０１クローン中に存在するＥｃｏＴ２２Ｉ切断部位
から３’下流およびその下流に存在するマルチクローニ
ングサイトのＥｃｏＲＩからＸｈｏＩサイトまでのＤＮ
Ａ領域が欠損したプラスミドｐＢＳＣＰ０１（−ｅＴ／
Ｘｈ）を選択した。このプラスミドを更に、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＮｏｔＩで二重切断し、フェノール・クロロ
ホルム処理した後、エタノール沈殿処理後、ブランティ
ングキット（宝酒造）で切断末端を平滑化した後、ライ
ゲーションして得られたプラスミドを用い、大腸菌ＴＧ
１を形質転換した。アンピシリン存在下のＬＢ寒天培地
に出現したコロニーを、アンピシリン存在下のＬＢ液体
培地で培養した後、ビルンボイムとドーリーの方法でプ
ラスミドを抽出し、ＣＰ０１クローンの５’上流側にあ
るマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩからＮｏｔＩ
サイトまでのＤＮＡ領域が欠損したプラスミドｐＮＺＣ
Ｐ０１を選択した。

【００３５】（２）７．５Ｋプロモーター付きｌａｃＺ
遺伝子カセットの改変（図３） 特開平１−１６８２７９号公報の実施例３に記載された
ｐＮＺ７６を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで二重
切断し、切り出された７．５ｋプロモーター付きのｌａ
ｃＺ遺伝子断片（約３．７ｋｂｐ）をｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＳＫ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製品コード
番号＃２１２２０６）のＳｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩサイ
トに挿入したプラスミドｐＢＳ／ｌａｃＺ（−／−Ｌ）
を作製した。次に配列番号２と配列番号３で示された合
成ＤＮＡをアニール後、ＳｍａＩとＮｏｔＩで二重切断
したｐＢＳ／ｌａｃＺ（−／−Ｌ）プラスミドにライゲ
ーションして、ｐＢＳ／ｌａｃＺ（＋／−）を作製し
た。次に、配列番号４と配列番号５で示された合成ＤＮ
Ａをアニール後、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで二重切断
したｐＢＳ／ｌａｃＺ（＋／−）にライゲーションし
て、ｐＢＳ／ｌａｃＺ（＋／＋）を作製した。

【００３６】（３）ＣＰ０１クローン内に７．５Ｋプロ
モーター付きｌａｃＺ遺伝子カセットを挿入した組み換
えプラスミドｐＮＺＣＰ０１１、ｐＮＺＣＰ０１２、Ｎ
ＺＣＰ０１３の作製（図４） （２）で作製したプラスミドｐＢＳ／ｌａｃＺ（＋／
＋）を制限酵素ＳｍａＩで切断して得られる３．７ｋｂ
ｐ断片をアガロースゲルから回収した。これとは別にｐ
ＮＺＣＰ０１プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｂｓｔ
１１０７Ｉでそれぞれ切断し、更にクレノウフラグメン
ト（宝酒造）を使って切断末端を平滑化したＤＮＡ断片
を回収した。回収された３つのＤＮＡ断片をライゲーシ
ョンして得られたプラスミドで、大腸菌ＴＧ１を形質転
換した。アンピシリン存在下のＬＢ寒天培地に出現した
コロニーを、アンピシリン存在下のＬＢ液体培地で培養
した後、ビルンボイムとドーリーの方法でプラスミドを
抽出し、７．５Ｋプロモーター付きｌａｃＺ遺伝子が、
それぞれ目的の制限酵素サイトに両方向に挿入された組
み換えプラスミドｐＮＺＣＰ０１２Ｌ、ｐＮＺＣＰ０１
２Ｒ、ｐＮＺＣＰ０１３Ｌ、ｐＮＺＣＰ０１３Ｒを得
た。

【００３７】（参考例５）ｌａｃＺ遺伝子を発現する組
み換えＣａＰＶの作製と純化 ３枚の直径１５０ｍｍ培養皿で単層になったＣＥＦ細胞
にＣａＰＶＳＧＡ株を０．１の感染多重度（Ｍ．Ｏ．
Ｉ．）で感染させ、３時間後、これらの細胞をトリプシ
ン処理で剥がし、細胞懸濁液を得た。これを遠心分離で
細胞を分離しＰＢＳで１回洗浄後、細胞にＳａｌｉｎｅ
Ｇバッファー（０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１１％ ｇｌｕｃｏｓｅ）を
加えて、細胞濃度が２×１０^７個／ｍｌとなるように細
胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液を４つに分注した。こ
の各懸濁液に、参考例４で作製した４種類の組み換え用
プラスミド１０μｇをそれぞれ加え、このプラスミド含
有細胞懸濁液を室温にて、ジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ社）を３．０ＫＶ／ｃｍ、０．４ｍｓｅｃの条件で
用いてエレクトロポレーションし、細胞にプラスミドを
導入した。このプラスミド導入細胞を、３７℃で７２時
間培養し、次いで３回凍結融解して細胞を溶解した。こ
の液には、溶解した細胞から放出されたウイルスが含ま
れているため、この液は親株と組み換えウイルスとの混
合液である。次に、この混合液から組み換え体を以下の
方法により選別した。まず、混合液を血清抜きのＭＥＭ
培地で１０倍段階希釈し、その希釈液を直径９０ｍｍの
培養皿で培養したＣＥＦ細胞に感染させ、生育培地を含
んだ寒天培地を重層した。次いで、室温中で寒天培地を
固めた後、６日間、３７℃で培養しＣａＰＶのプラーク
を出現させた。プラークが出現した培地に、Ｂｌｕｏ−
ｇａｌを６００μｇ／ｍｌ含んだ寒天培地を重層し、さ
らに１６時間３７℃で培養した。培養皿の青色プラーク
からパスツールピペットでウイルスを抜き取り、血清抜
きのＭＥＭ培地で希釈し、再びその希釈液を新たな直径
９０ｍｍの培養皿で培養したＣＥＦ細胞に感染させ、生
育培地を含んだ寒天培地を重層した。

【００３８】形成する全てのプラークがＢｌｕｏ−ｇａ
ｌで青く染まるまで、この操作を繰り返しおこなった。
通常、ＬａｃＺが挿入された部位が、ＣａＰＶの非必須
領域でない場合、操作を繰り返しても青色プラーク数は
増えない。結果を表２にまとめた。

【００３９】

【表２】

【００４０】表２からわかるように６種類の組み換えプ
ラスミドのうち、ｐＮＺＣＰ０１３Ｌ、ｐＮＺＣＰ０１
３Ｒの２種類をトランスフェクトした場合のみ、青色プ
ラークとなる組み換えウイルスが純化された。純化され
た組み換えウイルスをそれぞれｒＣａＰＶ０１３Ｌ、ｒ
ＣａＰＶ０１３Ｒと命名した。

【００４１】（参考例６）組み換えＣａＰＶの継代試験
による安定性確認 直径９０ｍｍ培養皿で培養したＣＥＦ細胞に、参考例５
で純化した２種類の組み換えＣａＰＶをそれぞれＭ．
Ｏ．Ｉ．＝０．１で感染させ、次いで、この培養皿に生
育培地を１０ｍｌ加えた後、ＣＯ_２インキュベーター
で、３７℃下、１週間培養した。その後、培養上清を集
め、これを遠心分離して浮遊細胞を落とした遠心上清の
０．１ｍｌを、新たに直径９０ｍｍ培養皿で培養したＣ
ＥＦ細胞に感染させた後、これに生育培地１０ｍｌを加
えて培養する操作を５回繰り返した。得られた遠心上清
を、参考例５で組み換え体を選別したのと同様にして、
１０倍段階希釈してＣＥＦ細胞に感染させ、プラークを
形成させてＢｌｕｏ−ｇａｌにてプラークを発色させ
た。その結果、２種類の組み換えウイルスとも出現した
全てのプラークが青く染まったことが判った。よって、
この組み換えＣａＰＶは５回継代しても挿入遺伝子（ｌ
ａｃＺ）が安定にゲノム上に保たれ、β―ガラクトシダ
ーゼを発現することが確認された。

【００４２】（参考例７）組み換えプラスミドｐＣＰ１
３／ＮＤ−ＨＮの作製（図５、図６） 参考例４で作製したプラスミドｐＮＺＣＰ０１３ＲをＥ
ｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、６．２ｋｂｐ
のＤＮＡ断片を回収した。これとは別に、ＷＯ９８／０
７８６６号公報参考例８記載の方法で作製されたプラス
ミドｐＮＺ１８２９ＲをＨｉｎｄＩＩＩとＣｌａＩで二
重切断した後、２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ま
た同プラスミドをＥｃｏＲＩとＣｌａＩで二重切断した
後、０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。こうして回
収された３断片をライゲーションして得られた、大腸菌
ＴＧ１を形質転換して出現したアンピシリン耐性かつＢ
ｌｕｏ−ｇａｌで青コロニーとなる菌からプラスミドを
回収して、目的とするｐＣＰ１８１３Ｒを得た。

【００４３】得られたｐＣＰ１８１３ＬをＨｉｎｄＩＩ
ＩとＳａｌＩで二重切断した後、９．８５ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を回収した。これとは別に、特開平９−９９７９
号公報実施例３記載のプラスミドｐＮＺ２９２９Ｒから
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで二重切断した後、
２．０ｋｂｐのＰｓプロモーターとＨＮ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を回収した。こうして得られた２断片をライゲ
ーションして得られたプラスミドを用い、大腸菌ＴＧ１
を形質転換して出現した、アンピシリン耐性を有し、か
つＢｌｕｏ−ｇａｌで青コロニーとなる菌からプラスミ
ドを回収して、目的とするｐＣＰ１３／ＮＤ−ＨＮを得
た。

【００４４】（実施例１）ニューカッスル病ウイルスの
ＨＮ遺伝子を発現する組み換えＣａＰＶの作製と純化 ３枚の直径１５０ｍｍ培養皿で単層になったＣＥＦ細胞
にＣａＰＶＳ．ＧＡ株を０．１の感染多重度（Ｍ．Ｏ．
Ｉ．）で感染させ、３時間後、これらの細胞をトリプシ
ン処理で剥がし、細胞懸濁液とした。これを遠心分離で
細胞を分離しＰＢＳで１回洗浄後、ＳａｌｉｎｅＧバッ
ファーで２×１０^７個／ｍｌの濃度に懸濁し、参考例７
で作製した組み換え用プラスミドｐＣＰ１３／ＮＤ−Ｈ
Ｎ １０μｇを加え、この混合物を室温にて、ジーンパ
ルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を３．０ＫＶ／ｃｍ、０．
４ｍｓｅｃの条件で用いてエレクトロポレーションし
た。プラスミドを導入した細胞を、その後３７℃で７２
時間培養し、３回の凍結融解によって細胞を溶解した。
この液には、溶解した細胞から放出されたウイルスが含
まれているため、この液は親株と組み換えウイルスとの
混合液である。

【００４５】この混合液から組み換え体は次のように選
別した。混合液を血清抜きのＭＥＭ培地で１０倍段階希
釈し、その希釈液を直径９０ｍｍの培養皿で培養したＣ
ＥＦ細胞に感染させ、生育培地を含んだ寒天培地を重層
した。次いで、室温中で寒天培地を固めた後、６日間、
３７℃で培養しＣａＰＶのプラークを出現させた。プラ
ークが出現した培地に、Ｂｌｕｏ−ｇａｌを６００μｇ
／ｍｌ含んだ寒天を重層し、さらに１６時間３７℃で培
養した。培養皿の青色プラークからパスツールピペット
でウイルスを抜き取り、血清抜きのＭＥＭ培地で希釈し
た後、その希釈液を新たな直径９０ｍｍの培養皿で培養
したＣＥＦ細胞に感染させ、生育培地を含んだ寒天培地
を重層した。形成する全てのプラークがＢｌｕｏ−ｇａ
ｌで青く染まるまで、この操作を繰り返し行った。結果
を表３にまとめた。このようにして純化した組み換え体
をｒＣａＰＶ／ＮＤ−ＨＮと命名した。

【００４６】

【表３】

【００４７】ここで作製した組み換えＣａＰＶは、サザ
ンハイブリダイゼーションによって、すべてニューカッ
スル病ウイルスのＨＮ遺伝子が予想どおりの位置にある
ことを確認した。また、大腸菌が発現したＨＮ蛋白で免
疫したウサギの抗血清を用いたウエスタンブロットによ
りこの組み換え体がＨＮ遺伝子を発現していることを確
認した。

【００４８】接種するウイルスを、個々で得られたｒＣ
ａＰＶ／ＮＤ−ＨＮ １０^４ｐｆｕ／個に換える以外
は、参考例１と同様にＨＩ抗体価を測定した。その結果
及び孵化率を表４に示す。

【００４９】

【表４】

【００５０】表４から判るようにｒＣａＰＶ／ＮＤ−Ｈ
Ｎは、孵化率を低下させることなく、十分なＨＩ抗体価
を鶏に与えることのできる取りよう遺伝子組み換えワク
チンの有効成分となることが判った。尚、ｒＣａＰＶ／
ＮＤ−ＨＮを接種した鶏の体重も非接種鶏と差は認めら
れなかった。

【００５１】（参考例８）組み換えプラスミドｐＣＰ１
３Ｌ／ＬＴ−ＵＬ３２ｇＢの作製（図７、図８） ｐＣＰ１８１３Ｒを得るためにプラスミドｐＮＺＣＰ０
１３Ｒを用いた代わりに、参考例４で作製したプラスミ
ドｐＮＺＣＰ０１３Ｌを用いた以外は参考例７と同様に
してｐＣＰ１８１３Ｌを得た。得られたｐＣＰ１８１３
ＬをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで二重切断した後、９．
８５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これとは別に、Ｗ
Ｏ９８／０７８６６の実施例７記載の方法で作製された
プラスミドｐＧＴＰｓＩＬＵＬ３２をＨｉｎｄＩＩＩと
ＥｃｏＲＩで二重切断した後、０．３ｋｂｐのＤＮＡ断
片を回収した。さらに、同プラスミドをＥｃｏＲＩとＳ
ａｌＩで二重切断した後、１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を
回収した。こうして回収した３断片をライゲーション
後、大腸菌ＴＧ１を形質転換して出現した、アンピシリ
ン耐性を有し、かつＢｌｕｏ−ｇａｌで青コロニーとな
る菌からプラスミドを回収して、目的とするｐＣＰ１３
Ｌ／ＩＬ−ＵＬ３２を得た。

【００５２】得られたｐＣＰ１３Ｌ／ＩＬ−ＵＬ３２を
ＳｆｉＩとＸｈｏＩで二重切断した後、７．１ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を回収した。これとは別に、ＷＯ９８／０７
８６６の実施例４記載の方法で作製されたプラスミドｐ
ＮＰ３５Ｓ／ＩＬＵＬ３２ｇＢを同じくＳｆｉＩとＸｈ
ｏＩで二重切断した後、７．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回
収した。この２断片をライゲーション後、大腸菌ＴＧ１
を形質転換して出現したアンピシリン耐性かつＢｌｕｏ
−ｇａｌで青コロニーとなる菌からプラスミドを回収し
て、目的とするｐＣＰ１３Ｌ／ＩＬ−ＵＬ３２ｇＢを得
た。

【００５３】（参考例９）組み換えプラスミドｐＣＰ１
３Ｒ／ＩＬ−ＵＬ３２ｇＢの作製（図９） 参考例７で作製したｐＣＰ１８１３ＲをＨｉｎｄＩＩＩ
とＳａｌＩで二重切断した後、９．８５ｋｂｐのＤＮＡ
断片を回収した。これとは別に、ＷＯ９８／０７８６６
の実施例７記載の方法で作製されたプラスミドｐＧＴＰ
ｓＩＬＵＬ３２をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで二重切
断した後、０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、また同
プラスミドをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで二重切断した後、
１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。こうして回収し
た３断片をライゲーションして得られたプラスミドで大
腸菌ＴＧ１を形質転換して出現した、アンピシリン耐性
を有し、かつＢｌｕｏ−ｇａｌで青コロニーとなる菌か
らプラスミドを回収して、目的とするｐＣＰ１３Ｒ／Ｉ
Ｌ−ＵＬ３２を得た。

【００５４】得られたプラスミドｐＣＰ１３Ｒ／ＩＬ−
ＵＬ３２をＳｆｉＩとＸｈｏＩで二重切断した後、７．
１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これとは別に、ＷＯ
９８／０７８６６の実施例１０記載の方法で作製された
プラスミドｐＮＰ３５Ｓ／ＩＬＵＬ３２ｇＢを同じくＳ
ｆｉＩとＸｈｏＩで二重切断した後、７．４ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を回収した。得られた２断片をライゲーション
して得られたプラスミドを用いて、大腸菌ＴＧ１を形質
転換して出現した、アンピシリン耐性を有し、かつＢｌ
ｕｏ−ｇａｌで青コロニーとなる菌からプラスミドを回
収して、目的とするｐＣＰ１３Ｒ／ＩＬ−ＵＬ３２ｇＢ
を得た。

【００５５】（実施例２）ＩＬＴＶのｇＢ遺伝子とＵＬ
３２遺伝子を発現する組み換えＣａＰＶの作製と純化 ３枚の直径１５０ｍｍ培養皿で単層になったＣＥＦ細胞
にＣａＰＶＳＧＡ株を０．１の感染多重度で感染させ、
３時間後、これらの細胞をトリプシン処理で剥がし、細
胞懸濁液とした。これを遠心分離で細胞を分離しＰＢＳ
で１回洗浄後、ＳａｌｉｎｅＧバッファーで２×１０^７
個／ｍｌの濃度に懸濁し、２本に分注し、一方に参考例
８で作製した組み換え用プラスミドｐＣＰ１３Ｌ／ＩＬ
−ＵＬ３２ｇＢを、他方に参考例９で作製した組み換え
用プラスミドｐＣＰ１３Ｒ／ＩＬ−ＵＬ３２ｇＢを、そ
れぞれ１０μｇづつ加え、この混合物を室温にて、ジー
ンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を３．０ＫＶ／ｃｍ、
０．４ｍｓｅｃの条件で用いてエレクトロポレーション
した。プラスミドを導入した細胞を、その後３７℃で７
２時間培養し、３回の凍結融解によって細胞を溶解し
た。この液には、いずれも溶解した細胞から放出された
ウイルスが含まれていることから、親株と組み換えウイ
ルスとの混合液である。これらの混合液を用いる以外
は、実施例１と同様にして組み換え体を選別、純化し
た。選別、純化された組み換え体をそれぞれｒＣａＰＶ
１３Ｌ／ＬＴとｒＣａＰＶ１３Ｒ／ＬＴと命名した。青
色プラークの割合を表５に示す。

【００５６】

【表５】

【００５７】得られた２種類の組み換え体は、サザンハ
イブリダイゼーションによって、すべてｇＢ遺伝子及び
ＵＬ３２遺伝子が予想どおりの位置にあることを確認し
た。また、これら２種類の組み換え体がｇＢ遺伝子及び
ＵＬ３２遺伝子を発現していることを大腸菌で発現させ
たｇＢ蛋白あるいはＵＬ３２蛋白で免疫したウサギ抗血
清を用いて、ウエスタンブロットにより確認した。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <210> 1 <211> 3348 <212> DNA <213> Canarypox virus <400> 1 gaattctgta aattattacc cttcaatatt tactcattaa atagtagtat tatgatatct 60 ctatttttat ccataccaac agtattattg gcataaatta ctagaatata tttaatttaa 120 aagtaaatat gtctagttat aaaattttaa taggtgttac gggtagtgta gctgctataa 180 agttaaaaga tctcattaag cagttactgt ctctaggtgg tatagaaata agaatagtag 240 ctactaaaaa tgctattcat tttatagacc agaaggaaat aggaatacct atttataccg 300 ataaggatga atggaatact tggaataaaa tacacgatcc tgttttacat atagagctaa 360 gaagatgggc agatatgatg ttgatagcac ccttaacagc aaacagttta gcgaagatag 420 ctaacggtat ctgtaataac ttgttaacgt gtatagttag agcgtggaat attaataaac 480 ctttactttt ctgtccagct atgaatacac ttatgtggga acatcctatt actgagcagc 540 atatagaaac tcttaagcat atggggtaca tagaagttga gtgtatcgag aaaaagctag 600 cctgcggtga tattggaaaa ggtgccatgg cacaagttac tgatattgca cgtgttgtca 660 gagatattac taataaacac taattatttt atatttaatc ttgcatgcgt tatttttatc 720 atttataaaa atatatgagt agatagttga gcattcgtta cattatttag atgcaattcc 780 agatacgtat ttttttatat aatctatcat aatacctacc tatacgagta tagtaataac 840 gaagcaagga aaaaattgtt ataaatcata aaaagtagtt agctttaata aatattacta 900 tacagatatg gaactttctt atattgtcac tagagatatt aatgaacaat tttgttacgc 960 acgttattat gatttcgatg ttatcgtgct taaagataat ggatttatta atgctaccaa 1020 gttatgcgaa ttaggaaaaa aagattttaa gagttggtta tgtttagatg gatcaaaaga 1080 acttattgaa aaattaagga acacaataac tattattata gaacgaatct gacgtctaaa 1140 aatatgttat gtgttattct agaaataaaa acacacacaa atatcataag catgatgtat 1200 caggatccta tattcacccg gatctagttc ctcatatagt ttcatggata tctccttcat 1260 tcgcagttag agtgtctaaa ataactaact accatatttc tggacattat gaatataaac 1320 taataaaaag aaaaaaggaa ataaaagaaa tatacgaaat gttgtttaac ttcagtatta 1380 ggcataatgc caattcggta aaattaagaa aagaacttaa aacagagttg ataaagatag 1440 aatatatgtt aaaagataaa actgtcactt atcatcatat aaggtttcgc cacttggtga 1500 tattacaaaa taaaaaagat tcaaactcat ttaaagtttt atttatctat agagaacagt 1560 taactaatga acttaataaa atcaaaaacg attatagaat tttctatagt gcttatgatc 1620 ctaacgcagt gtcttgtttt aatcagctta aagataagct attagatctt aatctcatta 1680 agttttgtta taatgacttt atgctagtag atactgaagt ttactgtaca aagaaattta 1740 tagaagactt aaaatccatg aacattattc gtaagtacgc gtaaaaaacg ttatatttac 1800 catgttatta tacaaaatga atgtatacta taaagctaga ctaaactatt gaattagtat 1860 taatagttaa agataatgga gcatggtgaa ctatacaata tcatgcttac tggtagtgat 1920 agtgatatat tattaagtgc tataggtaaa tatataccta cagctaatag ctgttacgta 1980 tataatcctg tacttccttt acatcaagct gtaagtgcta agaagataaa tatagtaaaa 2040 atactattgg ataagggaca caatgttaat tctaaggata cctattacga aggatactat 2100 cctatccatc tattagctaa actccttttg gaaagaggtg ccgatataga agctaaggat 2160 aataatggtt atactatact acatgtagca gctaggaaag gtaaaactca tttagttaag 2220 tttttcttac tacacggtgc taaaataaga cctgatactt gcaatacttt gatgatgtct 2280 gctgtttatt cagaaaatat acacacggta agatacatta ttagatgcaa atgctattat 2340 tcctgcacta tctaacaacg ataatgagat gctacaattt cttatagatt ctggagtaga 2400 tataaaccaa aaaaaccgtt atggtaatac ggctttacac tatgcaatag aaaaaaacaa 2460 gaaaattaaa ctcatagaaa cactagttaa caataatgca gatgtaaacg caacagatat 2520 caaaggacta actcctttgt atatcgtaac taatccttct tatgtatcaa aacacaatcc 2580 atgtatagct tccataaata ataaatgctt atattgtaat agtgataata tatctaagat 2640 acttatagaa agaggtgcta atgttaatat aactaataaa agtaaaacta ctcctttaca 2700 taatgcatgt aaaagtacat ttatgataaa gatagtaaaa ctattaatag ataacggtgc 2760 taatattaat gctgttgatg attacggaat tacaccgtta aattacgcgt gtacatctct 2820 ttattatatc cgttatgaaa ctagtgatat agttagagag aagatattac ctgttacagt 2880 tatgatgtag atgtaattat aaatactctt atagagaggt gcagatgtaa acttcataga 2940 taagtacggt agaacacctt tacattatgc cgctgtatcg tatcatgtaa aaatagttga 3000 aagtttgatt aatcacggta gcaaattact cgttctagat aataaaggta atactccatt 3060 acattatgcg tgtagcaact attcatgttt agaaatagta aaacatttta tcgacaaagg 3120 tattaattta aatactagaa acctactagg gaaaacccca ttgttttatg caatgtatat 3180 accagaaata gtttctgtat tattacataa tggtgcaagt gtaaatatat tagattatag 3240 gaataatacc cctttaaata atgaatatat ccagaattta cctgtaacac actctatgta 3300 taaaatgtat ttaaaatcat tggagtgtgt tagtgtgttg ttgaattc 3348 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: adapter <400> 2 gaattcccgg gc 12 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: adapter <400> 3 ggccgcccgg gaattc 16 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: adapter <400> 3 agcttcccgg gtg 13 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: adapter <400> 4 tcgacacccg gga 13

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＰ０１クローン及びＣＰ０４クローンの制限
酵素地図、並びにこれらのＯＲＦの位置を示した説明図
である。

【図２】ｐＢＳＣＰ０１からｐＮＺＣＰ０１の作製方法
を図解した説明図である。

【図３】ｐＢＳ／ｌａｃＺ（＋／＋）の作製方法を図解
した説明図である。

【図４】ｐＮＺＣＰ０１からｌａｃＺ遺伝子を挿入した
組み換え用プラスミドｐＮＺＣＰ０１２Ｌ、ｐＮＺＣＰ
０１２Ｒ、ｐＮＺＣＰ０１３Ｌ、ｐＮＺＣＰ０１３Ｒの
作製方法を図解した説明図である。

【図５】ｐＣＰ１８１３Ｒの作製方法を図解した説明図
である。

【図６】ｐＣＰ１３／ＮＤ−ＨＮの作製方法を図解した
説明図である。

【図７】ｐＣＰ１８１３Ｌの作製方法を図解した説明図
である。

【図８】ｐＣＰ１３Ｌ／ＩＬ−ＵＬ３２ｇＢの作製方法
を図解した説明図である。

【図９】ｐＣＰ１３Ｒ／ＩＬ−ＵＬ３２ｇＢの作製方法
を図解した説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/255 Ａ６１Ｋ 39/255 ４Ｃ０８７ 39/275 ＺＮＡ 39/275 ＺＮＡ Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 15/09 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA02 EA02 GA11 HA20 4B065 AA95X AB01 AC20 BA02 CA24 CA45 4C084 AA13 MA66 MA70 NA14 ZB332 ZC612 4C085 AA03 BA59 BA71 BA81 BA85 BB23 GG01 GG10 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB33 ZC61 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZB33 ZC61

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 鳥類病原体の抗原遺伝子を有する組み換
   えカナリア痘ウイルスを主成分とする鶏用組み換えワク
   チン。
2. 【請求項２】 カナリア痘ウイルスがカナリア痘ウイル
   スのＳ．ＧＡ株である請求項１記載の鶏用組み換えワク
   チン。
3. 【請求項３】 鳥類病原体の抗原遺伝子が、配列番号１
   で示されるカナリア痘ウイルスの非必須領域に挿入され
   たものである請求項１記載の鶏用組み換えワクチン。
4. 【請求項４】 鳥類病原体がニューカッスル病ウイル
   ス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、マレック病ウイルスま
   たは伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスである請求項１
   記載の鶏用組み換えワクチン。
5. 【請求項５】 請求項１記載の鶏用組み換えワクチン
   を、発育鶏卵に接種することを特徴とする鶏への免疫付
   与方法。
6. 【請求項６】 カナリア痘ウイルスの鶏用組み換えワク
   チン用ベクターとしての使用。