JP2003252802A - ヒト滑膜肉腫の治療薬剤 - Google Patents
ヒト滑膜肉腫の治療薬剤Info
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- JP2003252802A JP2003252802A JP2002050894A JP2002050894A JP2003252802A JP 2003252802 A JP2003252802 A JP 2003252802A JP 2002050894 A JP2002050894 A JP 2002050894A JP 2002050894 A JP2002050894 A JP 2002050894A JP 2003252802 A JP2003252802 A JP 2003252802A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト滑膜肉腫の形成に関与するキメラタンパ
ク質SYT-SSX1に対して拮抗的に作用するポリペプチドを
有効成分とする治療薬剤を提供する。 【解決手段】 配列番号２のアミノ酸配列における第15
6-206番アミノ酸配列からなるポリペプチド、またはこ
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞内
に導入可能な形態を有する。
ク質SYT-SSX1に対して拮抗的に作用するポリペプチドを
有効成分とする治療薬剤を提供する。 【解決手段】 配列番号２のアミノ酸配列における第15
6-206番アミノ酸配列からなるポリペプチド、またはこ
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞内
に導入可能な形態を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、ヒト滑膜
肉腫の治療薬剤に関するものである。さらに詳しくは、
この出願の発明は、ヒト滑膜肉腫の遺伝子治療等に有効
な治療薬剤に関するものである。
肉腫の治療薬剤に関するものである。さらに詳しくは、
この出願の発明は、ヒト滑膜肉腫の遺伝子治療等に有効
な治療薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】滑膜肉腫（synovial sarcome）は比較的
若年者の四肢関節近傍に好発する悪性軟部腫瘍であり、
組織学的には上皮性細胞と紡錘形細胞とからなる二相型
biphasic typeと紡錘形細胞からなる単相型monophasic
typeとに分類される。現在のところ、有効な治療法は存
在しない。
若年者の四肢関節近傍に好発する悪性軟部腫瘍であり、
組織学的には上皮性細胞と紡錘形細胞とからなる二相型
biphasic typeと紡錘形細胞からなる単相型monophasic
typeとに分類される。現在のところ、有効な治療法は存
在しない。
【０００３】滑膜肉腫では染色体転座t(X；18)(p11.2；
q11.2)が高頻度に認められることが報告されている。切
断点近傍のゲノムDNAの単離から、t(X；18)が染色体18q
11.2に位置するSYT遺伝子と染色体Xp11.2に位置するSSX
遺伝子を融合させ、これによりキメラタンパク質SYT-SS
Xが発現することが明らかになっている。SYT-SSXの発現
は滑膜肉腫症例のほぼ全例で観察されているため、これ
は腫瘍発生において中心的な役割を果たすものと考えら
れる。
q11.2)が高頻度に認められることが報告されている。切
断点近傍のゲノムDNAの単離から、t(X；18)が染色体18q
11.2に位置するSYT遺伝子と染色体Xp11.2に位置するSSX
遺伝子を融合させ、これによりキメラタンパク質SYT-SS
Xが発現することが明らかになっている。SYT-SSXの発現
は滑膜肉腫症例のほぼ全例で観察されているため、これ
は腫瘍発生において中心的な役割を果たすものと考えら
れる。
【０００４】野生型SYTタンパク質は387アミノ酸からな
り、グルタミン、プロリン、グリシンおよびチロジン残
基に富む特有の100-aaストレッチを含むQPGYドメインを
有するほか、推定されるSH2およびSH3結合モチーフを幾
つか有している。SSX蛋白は188アミノ酸からなり、その
N-末端領域はKruppel-associated box (KRAB)と相同性
を示す。KRABはKruppel型zinc fingerタンパク質におい
て転写リプレッサードメインとして見いだされたもので
ある。KRABドメイン以外には、SSXタンパク質ではDNA結
合モチーフなど機能的に重要な既知配列との有意な相同
性は認められていない。
り、グルタミン、プロリン、グリシンおよびチロジン残
基に富む特有の100-aaストレッチを含むQPGYドメインを
有するほか、推定されるSH2およびSH3結合モチーフを幾
つか有している。SSX蛋白は188アミノ酸からなり、その
N-末端領域はKruppel-associated box (KRAB)と相同性
を示す。KRABはKruppel型zinc fingerタンパク質におい
て転写リプレッサードメインとして見いだされたもので
ある。KRABドメイン以外には、SSXタンパク質ではDNA結
合モチーフなど機能的に重要な既知配列との有意な相同
性は認められていない。
【０００５】なお、SYTは広汎に発現することが知られ
ており、SSXのmRNAは精巣と甲状腺にのみ検出されてい
るが、それぞれの機能等については明らかになっていな
い。
ており、SSXのmRNAは精巣と甲状腺にのみ検出されてい
るが、それぞれの機能等については明らかになっていな
い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】この出願の発明者ら
は、キメラ遺伝子SYT-SSX1をラット線維芽細胞に導入し
た細胞株を樹立し、その癌化を検討した結果、SYT-SSX1
遺伝子を導入した細胞株は、野生型のSYTやSSX1を導入
した細胞株と比較して2%血清存在下の培養条件において
増殖能が有意に高く、足場非依存性増殖能を有してお
り、さらにヌードマウスの皮下および腹腔内に腫瘍を形
成することを見出した。
は、キメラ遺伝子SYT-SSX1をラット線維芽細胞に導入し
た細胞株を樹立し、その癌化を検討した結果、SYT-SSX1
遺伝子を導入した細胞株は、野生型のSYTやSSX1を導入
した細胞株と比較して2%血清存在下の培養条件において
増殖能が有意に高く、足場非依存性増殖能を有してお
り、さらにヌードマウスの皮下および腹腔内に腫瘍を形
成することを見出した。
【０００７】この結果は、キメラタンパク質SYT-SSX1の
発現が腫瘍、特に滑膜肉腫の発生や成長に密接に関与す
ることを示すと共に、このキメラタンパク質SYT-SSX1の
を抑制することが、腫瘍発生の治療に極めて有効である
ことを示している。
発現が腫瘍、特に滑膜肉腫の発生や成長に密接に関与す
ることを示すと共に、このキメラタンパク質SYT-SSX1の
を抑制することが、腫瘍発生の治療に極めて有効である
ことを示している。
【０００８】この出願の発明は、従って、キメラタンパ
ク質SYT-SSX1の抑制を採用機序とする新しい滑膜肉腫治
療薬剤を提供することを課題としている。
ク質SYT-SSX1の抑制を採用機序とする新しい滑膜肉腫治
療薬剤を提供することを課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この出願の発明者らは、
SYT-SSX1タンパク質の機能を抑制するための手段につい
て研究を重ねた結果、クロマチンモデリングを調節する
SW1/SNFの構成要素であるhBRM/hSNF2αとSYT-SSX1タン
パク質との結合が細胞の癌化を誘導することを見出し、
さらのhBRM/hSNF2αの一部領域がSYT-SSX1タンパク質と
の結合ドメインであることを見出した。そして、この結
合ドメインのアミノ鎖配列からなるポリペプチドが、SY
T-SSX1タンパク質と結合することによって、SYT-SSX1と
hBRM/hSNF2αとの結合に対して拮抗的に作用し、細胞の
癌化を抑制することを確認して、この発明を完成させ
た。
SYT-SSX1タンパク質の機能を抑制するための手段につい
て研究を重ねた結果、クロマチンモデリングを調節する
SW1/SNFの構成要素であるhBRM/hSNF2αとSYT-SSX1タン
パク質との結合が細胞の癌化を誘導することを見出し、
さらのhBRM/hSNF2αの一部領域がSYT-SSX1タンパク質と
の結合ドメインであることを見出した。そして、この結
合ドメインのアミノ鎖配列からなるポリペプチドが、SY
T-SSX1タンパク質と結合することによって、SYT-SSX1と
hBRM/hSNF2αとの結合に対して拮抗的に作用し、細胞の
癌化を抑制することを確認して、この発明を完成させ
た。
【００１０】この出願の発明は、前記の課題を解決する
ための第１の発明として、配列番号２のアミノ酸配列に
おける第156-206番アミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形
態を有するヒト滑膜肉腫の治療薬剤を提供する。
ための第１の発明として、配列番号２のアミノ酸配列に
おける第156-206番アミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形
態を有するヒト滑膜肉腫の治療薬剤を提供する。
【００１１】この第１発明においては、ポリヌクレオチ
ドが配列番号１の塩基配列における第763-915番塩基配
列からなるDNA断片であることを好ましい態様としてい
る。
ドが配列番号１の塩基配列における第763-915番塩基配
列からなるDNA断片であることを好ましい態様としてい
る。
【００１２】この出願は、第２の発明として、配列番号
２のアミノ酸配列における第156-206番アミノ酸配列か
らなるポリペプチドポリペプチドが細胞内に導入可能な
形態を有する滑膜肉腫の治療薬剤を提供する。
２のアミノ酸配列における第156-206番アミノ酸配列か
らなるポリペプチドポリペプチドが細胞内に導入可能な
形態を有する滑膜肉腫の治療薬剤を提供する。
【００１３】この第２発明の治療薬剤においては、ポリ
ペプチドが、N末端に細胞膜貫通ペプチドを連結してい
る融合ペプチドであることを好ましい態様としている。
ペプチドが、N末端に細胞膜貫通ペプチドを連結してい
る融合ペプチドであることを好ましい態様としている。
【００１４】以下、各発明の実施形態を詳しく説明す
る。
る。
【００１５】
【発明の実施の形態】第１発明のヒト滑膜肉腫治療薬剤
は、キメラタンパク質SYT-SSX1と特異的に結合すること
によって、SYT-SSX1の腫瘍発生作用を拮抗的に抑制する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する
薬剤である。具体的には、この治療薬剤は、配列番号２
のアミノ酸配列（hBRM/hSNF2α）における第156-206番
アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特
徴としている。ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組
み込むようにすることができる。発現ベクターは、プロ
モーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を
有する公知の真核細胞用発現ベクターを使用することが
でき、この発現ベクターのクローニングサイトに、前記
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入す
ることによってポリペプチド発現ベクターを構築するこ
とができる。ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１
（hBRM/hSNF2α cDNA）の第763-915番塩基配列からなる
DNA断片を使用することができる。治療薬剤の形態とし
ては、ポリペプチド発現ベクターを、例えば生体認識分
子を提示した中空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウ
イルス、アデノ随伴ウイルス等に組み込むようにすれば
よい。このような薬剤は、遺伝子治療の手法により生体
内に導入することができる。
は、キメラタンパク質SYT-SSX1と特異的に結合すること
によって、SYT-SSX1の腫瘍発生作用を拮抗的に抑制する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する
薬剤である。具体的には、この治療薬剤は、配列番号２
のアミノ酸配列（hBRM/hSNF2α）における第156-206番
アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特
徴としている。ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組
み込むようにすることができる。発現ベクターは、プロ
モーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を
有する公知の真核細胞用発現ベクターを使用することが
でき、この発現ベクターのクローニングサイトに、前記
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入す
ることによってポリペプチド発現ベクターを構築するこ
とができる。ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１
（hBRM/hSNF2α cDNA）の第763-915番塩基配列からなる
DNA断片を使用することができる。治療薬剤の形態とし
ては、ポリペプチド発現ベクターを、例えば生体認識分
子を提示した中空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウ
イルス、アデノ随伴ウイルス等に組み込むようにすれば
よい。このような薬剤は、遺伝子治療の手法により生体
内に導入することができる。
【００１６】第２発明の治療薬剤は、キメラタンパク質
SYT-SSX1と特異的に結合することによって、SYT-SSX1の
腫瘍発生作用を拮抗的に抑制するポリペプチドそれ自体
が細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする。
例えば、このポリペプチドの構造や機能を変更すること
なく、かつ薬理学的に許容される担体溶液にこのポリペ
プチドを混合して製剤化することができる。そしてこの
ような薬剤は、例えばマイクロインジェクション法によ
り細胞内に導入することができる。あるいは、最近開発
された脂質による細胞内導入法（BioPORTER（Gene Ther
apy Systems社、米国）、Chariot（Active Motif社、米
国）等）を採用することもできる。
SYT-SSX1と特異的に結合することによって、SYT-SSX1の
腫瘍発生作用を拮抗的に抑制するポリペプチドそれ自体
が細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする。
例えば、このポリペプチドの構造や機能を変更すること
なく、かつ薬理学的に許容される担体溶液にこのポリペ
プチドを混合して製剤化することができる。そしてこの
ような薬剤は、例えばマイクロインジェクション法によ
り細胞内に導入することができる。あるいは、最近開発
された脂質による細胞内導入法（BioPORTER（Gene Ther
apy Systems社、米国）、Chariot（Active Motif社、米
国）等）を採用することもできる。
【００１７】ポリペプチドは、配列番号２のアミン酸配
列に基づいてペプチドを化学合成する方法や、前記の発
現ベクターからのインビトロ転写や、発現ベクターによ
る形質転換細胞の発現産物としてポリペプチドを単離精
製する方法等によって取得することができる。例えば、
ポリペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、
RNAポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクター
を、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウ
サギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビト
ロ翻訳系に添加すれば、ポリペプチドをインビトロで生
産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターと
しては、T7、T3、SP6などが例示できる。これらのRNAポ
リメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA
1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pBluescript IIなど
が例示できる。また、ポリペプチドを、大腸菌などの微
生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリ
ジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクロー
ニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに
前記のDNA断片組換えて発現ベクターを作成する。この
発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、ポリペプチ
ドを発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形
質転換体を培養すれば、その培養物から目的のポリペプ
チドを大量生産することができる。大腸菌用発現ベクタ
ーとしては、pUC系、pBluescript II、pET発現システ
ム、pGEX発現システムなどが例示できる。さらに、ポリ
ペプチドを真核細胞で発現させる場合には、前記のDNA
断片を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)
付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して
組換えベクターを作製する。このベクターを真核細胞内
に導入すれば、目的のポリペプチドを発現する形質転換
真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、
pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、
EBVベクター、pRS、pYES2などが例示できる。真核細胞
としては、ヒト胎児腎臓細胞HEK293、サル腎臓細胞COS
7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物
培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞
などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、
アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベク
ターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシ
ウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の
方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させた
ポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作
を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの
変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消
化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲ
ル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど
が挙げられる。
列に基づいてペプチドを化学合成する方法や、前記の発
現ベクターからのインビトロ転写や、発現ベクターによ
る形質転換細胞の発現産物としてポリペプチドを単離精
製する方法等によって取得することができる。例えば、
ポリペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、
RNAポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクター
を、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウ
サギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビト
ロ翻訳系に添加すれば、ポリペプチドをインビトロで生
産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターと
しては、T7、T3、SP6などが例示できる。これらのRNAポ
リメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA
1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pBluescript IIなど
が例示できる。また、ポリペプチドを、大腸菌などの微
生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリ
ジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクロー
ニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに
前記のDNA断片組換えて発現ベクターを作成する。この
発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、ポリペプチ
ドを発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形
質転換体を培養すれば、その培養物から目的のポリペプ
チドを大量生産することができる。大腸菌用発現ベクタ
ーとしては、pUC系、pBluescript II、pET発現システ
ム、pGEX発現システムなどが例示できる。さらに、ポリ
ペプチドを真核細胞で発現させる場合には、前記のDNA
断片を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)
付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して
組換えベクターを作製する。このベクターを真核細胞内
に導入すれば、目的のポリペプチドを発現する形質転換
真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、
pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、
EBVベクター、pRS、pYES2などが例示できる。真核細胞
としては、ヒト胎児腎臓細胞HEK293、サル腎臓細胞COS
7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物
培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞
などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、
アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベク
ターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシ
ウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の
方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させた
ポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作
を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの
変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消
化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲ
ル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど
が挙げられる。
【００１８】第２発明の治療薬剤の別の態様は、ポリペ
プチドのＮ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融
合ポリペプチドの使用である。この細胞膜通過ペプチド
を備えることによって、ポリペプチドは細胞膜を通過し
て細胞内に取り込まれ、細胞内においてキメラタンパク
質SYT-SSX1に対し拮抗的に作用する。細胞膜通過ペプチ
ドとしては、配列番号３または配列番号４にアミノ酸配
列を示したオリゴペプチドを使用することができる。配
列番号３のオリゴペプチドはHIV-1・TATのPTD（protein
transduction domain）であり、配列番号４のオリゴペ
プチドはショウジョウバエのホメオボックスタンパク質
アンテナペディアのPTDである。これらの細胞膜通過ペ
プチドは、例えばHIV-1・TATの場合にはそのアミノ酸配
列およびそのcDNAの塩基配列が公知であり（Science, 2
85:1569-1572, 1999; GenBankAccession NO. U39362 M9
6155）、そのPTDに相当する領域（HIV・TATの47〜57番
アミノ酸配列）をコードするDNA断片を前記DNA断片と連
結して融合DNA断片を作成し、この融合DNA断片を大腸菌
等の宿主細胞で発現させることによって、Ｎ末端側にPT
Dペプチドを連結し融合ポリペプチドを作成することが
できる。また、アンティペディアのPTDも公知であり
（例えば、GenBank Accession No. AE001573）、同様に
してPTDを連結した融合ポリペプチドを作成することが
できる。あるいはまた、２価の架橋剤（例えば、EDCや
β−アラニン等）を介して、ポリペプチドとPTDペプチ
ドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結
した融合ポリペプチドを作成することもできる。
プチドのＮ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融
合ポリペプチドの使用である。この細胞膜通過ペプチド
を備えることによって、ポリペプチドは細胞膜を通過し
て細胞内に取り込まれ、細胞内においてキメラタンパク
質SYT-SSX1に対し拮抗的に作用する。細胞膜通過ペプチ
ドとしては、配列番号３または配列番号４にアミノ酸配
列を示したオリゴペプチドを使用することができる。配
列番号３のオリゴペプチドはHIV-1・TATのPTD（protein
transduction domain）であり、配列番号４のオリゴペ
プチドはショウジョウバエのホメオボックスタンパク質
アンテナペディアのPTDである。これらの細胞膜通過ペ
プチドは、例えばHIV-1・TATの場合にはそのアミノ酸配
列およびそのcDNAの塩基配列が公知であり（Science, 2
85:1569-1572, 1999; GenBankAccession NO. U39362 M9
6155）、そのPTDに相当する領域（HIV・TATの47〜57番
アミノ酸配列）をコードするDNA断片を前記DNA断片と連
結して融合DNA断片を作成し、この融合DNA断片を大腸菌
等の宿主細胞で発現させることによって、Ｎ末端側にPT
Dペプチドを連結し融合ポリペプチドを作成することが
できる。また、アンティペディアのPTDも公知であり
（例えば、GenBank Accession No. AE001573）、同様に
してPTDを連結した融合ポリペプチドを作成することが
できる。あるいはまた、２価の架橋剤（例えば、EDCや
β−アラニン等）を介して、ポリペプチドとPTDペプチ
ドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結
した融合ポリペプチドを作成することもできる。
【００１９】以下、この発明のポリペプチドの作用を確
認するために行った試験結果を示す。 1. 材料と方法 1.1 プラスミド、細胞および抗体 外科的に切り出した滑膜肉腫と精巣から、ヒトキメラ遺
伝子SYT-SSX1および野生型SSX1のcDNAをRT-PCRで増幅し
た。SYTは、C末端に8アミノ酸を追加したSYT-SSX1からP
CRで増幅した。SYT-SSX1、SSX1およびSYTの増幅に使用
したプライマーペアはそれぞれSYT-FとSSX-R、SSX-FとS
SX-RおよびSYT-FとSYT-Rであり、プライマーの配列は以
下の通りである。
認するために行った試験結果を示す。 1. 材料と方法 1.1 プラスミド、細胞および抗体 外科的に切り出した滑膜肉腫と精巣から、ヒトキメラ遺
伝子SYT-SSX1および野生型SSX1のcDNAをRT-PCRで増幅し
た。SYTは、C末端に8アミノ酸を追加したSYT-SSX1からP
CRで増幅した。SYT-SSX1、SSX1およびSYTの増幅に使用
したプライマーペアはそれぞれSYT-FとSSX-R、SSX-FとS
SX-RおよびSYT-FとSYT-Rであり、プライマーの配列は以
下の通りである。
【００２０】SYT-F：CCG CTC GAG ATG TCT GTG GCT TTC
GC（配列番号５） SSX-R：GCG CGG CCG CTG GGC ATG TGT CGT ATC C（配列
番号６） SSX-F：CCC TCG AGG GTG CCA TGA ACG GAG（配列番号
７） SYT-R：GCG GCC GCT CAC TGC TGG TAA TTT CCA TAC TGT
CCC TGG TCATAT CCA TAA GG（配列番号８） N-末端にFlag tag配列(DYKDDDK)をつけた増幅断片を発
現ベクターpCXN2のXbaI−NotI部位にサブクローンし、p
CXN2-SYT-SSX1、pCXN2-SSX1およびpCXN2-SYTとした。
GC（配列番号５） SSX-R：GCG CGG CCG CTG GGC ATG TGT CGT ATC C（配列
番号６） SSX-F：CCC TCG AGG GTG CCA TGA ACG GAG（配列番号
７） SYT-R：GCG GCC GCT CAC TGC TGG TAA TTT CCA TAC TGT
CCC TGG TCATAT CCA TAA GG（配列番号８） N-末端にFlag tag配列(DYKDDDK)をつけた増幅断片を発
現ベクターpCXN2のXbaI−NotI部位にサブクローンし、p
CXN2-SYT-SSX1、pCXN2-SSX1およびpCXN2-SYTとした。
【００２１】hBRM/hSNF2α cDNAは、pcDNA3-HAベクター
にサブクローンされている。hBRM/hSNF2αの変異体であ
るhBRM1-333、hBRM1-107、hBRM108-155、hBRM156-205、
hBRM206-333、hBRM319-634およびhBRM635-872は、pcDNA
3-HA-GFPベクターにサブクローンした。
にサブクローンされている。hBRM/hSNF2αの変異体であ
るhBRM1-333、hBRM1-107、hBRM108-155、hBRM156-205、
hBRM206-333、hBRM319-634およびhBRM635-872は、pcDNA
3-HA-GFPベクターにサブクローンした。
【００２２】ヒト滑膜肉腫細胞株HS-SY-IIは、Sonobeら
（Lab. Invest. 67:498-505, 1992）により確立され細
胞を使用した。
（Lab. Invest. 67:498-505, 1992）により確立され細
胞を使用した。
【００２３】抗SSXポリクローナル抗体は、免疫抗原と
してGSTと融合させたSSXペプチド(配列番号２の第77-22
3番アミン酸配列)を用いて作製した。抗hBRM/SNF2α抗
体(Santa Cruz Biotechnology)と抗Flag tag抗体M2およ
びM5(Sigma)は購入した。 1.2 安定細胞株の確立 10cmディッシュに10%FBS(Sigma)添加DMEMを入れ、3Y1ラ
ット繊維芽細胞を培養した。70%コンフルエンスで、Eff
ectene transfection reagent (Qiagen)を用いて、細胞
にpCXN2、pCXN2-SYT-SSX1、pCXN2-SSX1またはpCXN2-SYT
の1μgをトランスフェクトした。トランスフェクション
から48時間後、0.5mg/ml G418 sulfate(Calbiochem)を
添加した新鮮培地に細胞を播種し、薬剤耐性コロニーを
分離した。 1.3 免疫沈降およびイムノブロッティングのための細
胞溶解 細胞は、放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)用バッファ(10m
M Tris, pH7.4/5 mM EDTA/150mM NaCl/10%グリセロール
/1%Triton X-100/1%デオキシコール酸ナトリウム/0.1%S
DS/1mM PMSF/1mMオルトバナジン酸ナトリウム)中で溶解
し、4℃で×12,000gで10分間マイクロ遠心分離した。標
準法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Horbor lab., 1989）を用いて、免疫沈降法お
よびイムノブロッティング法で上清を分析した。核抽出
手順は、Dignamら（Nucleic Acids Res. 11:1475-1489,
1983）の方法に準拠した。 1.4 細胞増殖解析およびソフトアガーでのコロニー形
成アッセイ 細胞増殖解析とコロニー形成アッセイの方法は文献（Pr
oc. natl. Acad. Sci.USA. 94:2356-2361, 1997）記載
の方法に従って行った。簡単に説明すれば、3Y1細胞株
の増殖速度を評価するため、1×105 cellを6cmディッシ
ュにプレーティングした。また、コロニー形成アッセイ
用には、5×105cellを0.4%ソフトアガーにプレーティン
グし、3週間インキュベートした。 1.5 ヌードマウスにおける腫瘍形成アッセイ PBS中の約1×107cellをBALB/cヌードマウスに皮下注射
した。細胞接種から3週間後、新規に形成された腫瘍の
直径を測定し、マウスを適切な麻酔下で殺処分し、腫瘍
組織を免疫染色およびイムノブロッティングに供した。 2. 結果 2.1 SYT、SSX1およびSYT-SSX1を発現する3Y1細胞株系
のトランスフォーミング活性評価 ヒト滑膜肉腫関連キメラ遺伝子産物SYT-SSX1のトランス
フォーミング活性を検討するため、SSX1、SYT-SSX1およ
びSYTを安定に発現する一連の3Y1ラット繊維芽細胞株を
確立した(図1A)。3つの代表クローンのSSX1、SYT-SSX1
およびSYTの発現レベルをイムノブロッティングで解析
したところ、それぞれ30、67および57kDaであった(図1
B)。まず、確立した3Y1細胞株の3つの独立クローンの増
殖速度を測定したところ、SYT-SSX1発現3Y1細胞の増殖
速度は、10%または2%血清条件下において対照細胞に比
して有意に速いことが確認された(図1C)。野生型SSX1の
発現は、10%血清条件下でのみ3Y1細胞の増殖速度をわず
かに増大させた(図1C)。
してGSTと融合させたSSXペプチド(配列番号２の第77-22
3番アミン酸配列)を用いて作製した。抗hBRM/SNF2α抗
体(Santa Cruz Biotechnology)と抗Flag tag抗体M2およ
びM5(Sigma)は購入した。 1.2 安定細胞株の確立 10cmディッシュに10%FBS(Sigma)添加DMEMを入れ、3Y1ラ
ット繊維芽細胞を培養した。70%コンフルエンスで、Eff
ectene transfection reagent (Qiagen)を用いて、細胞
にpCXN2、pCXN2-SYT-SSX1、pCXN2-SSX1またはpCXN2-SYT
の1μgをトランスフェクトした。トランスフェクション
から48時間後、0.5mg/ml G418 sulfate(Calbiochem)を
添加した新鮮培地に細胞を播種し、薬剤耐性コロニーを
分離した。 1.3 免疫沈降およびイムノブロッティングのための細
胞溶解 細胞は、放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)用バッファ(10m
M Tris, pH7.4/5 mM EDTA/150mM NaCl/10%グリセロール
/1%Triton X-100/1%デオキシコール酸ナトリウム/0.1%S
DS/1mM PMSF/1mMオルトバナジン酸ナトリウム)中で溶解
し、4℃で×12,000gで10分間マイクロ遠心分離した。標
準法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Horbor lab., 1989）を用いて、免疫沈降法お
よびイムノブロッティング法で上清を分析した。核抽出
手順は、Dignamら（Nucleic Acids Res. 11:1475-1489,
1983）の方法に準拠した。 1.4 細胞増殖解析およびソフトアガーでのコロニー形
成アッセイ 細胞増殖解析とコロニー形成アッセイの方法は文献（Pr
oc. natl. Acad. Sci.USA. 94:2356-2361, 1997）記載
の方法に従って行った。簡単に説明すれば、3Y1細胞株
の増殖速度を評価するため、1×105 cellを6cmディッシ
ュにプレーティングした。また、コロニー形成アッセイ
用には、5×105cellを0.4%ソフトアガーにプレーティン
グし、3週間インキュベートした。 1.5 ヌードマウスにおける腫瘍形成アッセイ PBS中の約1×107cellをBALB/cヌードマウスに皮下注射
した。細胞接種から3週間後、新規に形成された腫瘍の
直径を測定し、マウスを適切な麻酔下で殺処分し、腫瘍
組織を免疫染色およびイムノブロッティングに供した。 2. 結果 2.1 SYT、SSX1およびSYT-SSX1を発現する3Y1細胞株系
のトランスフォーミング活性評価 ヒト滑膜肉腫関連キメラ遺伝子産物SYT-SSX1のトランス
フォーミング活性を検討するため、SSX1、SYT-SSX1およ
びSYTを安定に発現する一連の3Y1ラット繊維芽細胞株を
確立した(図1A)。3つの代表クローンのSSX1、SYT-SSX1
およびSYTの発現レベルをイムノブロッティングで解析
したところ、それぞれ30、67および57kDaであった(図1
B)。まず、確立した3Y1細胞株の3つの独立クローンの増
殖速度を測定したところ、SYT-SSX1発現3Y1細胞の増殖
速度は、10%または2%血清条件下において対照細胞に比
して有意に速いことが確認された(図1C)。野生型SSX1の
発現は、10%血清条件下でのみ3Y1細胞の増殖速度をわず
かに増大させた(図1C)。
【００２４】SYT-SSX1発現3Y1細胞が高い足場非依存性
増殖活性を有するかどうかを検討するため、ソフトアガ
ーでのコロニー形成アッセイを実施し、サイズ(小〜大)
により任意にコロニーを分類した。SYT-SSX1、SSX1およ
びSYTを発現している3Y1クローンをすべて検討したとこ
ろ、SYT-SSX1発現3Y1細胞のみが小コロニーと大コロニ
ーをいずれも形成することが確認された(図1D)。一方、
野生型SSX1発現3Y1細胞では、ごくわずかな小コロニー
形成が観察された(図1D)。さらに、確立した細胞のマー
カー選択クローンのバイアスを回避するため、SYT、SSX
1およびSYT-SSX1の発現プラスミドによりトランスフェ
クトした3Y1細胞のG418-選択ポリクローナル集団を用い
てコロニー形成アッセイを実施したところ、ほぼ同じ成
績が観察された(図1D)。
増殖活性を有するかどうかを検討するため、ソフトアガ
ーでのコロニー形成アッセイを実施し、サイズ(小〜大)
により任意にコロニーを分類した。SYT-SSX1、SSX1およ
びSYTを発現している3Y1クローンをすべて検討したとこ
ろ、SYT-SSX1発現3Y1細胞のみが小コロニーと大コロニ
ーをいずれも形成することが確認された(図1D)。一方、
野生型SSX1発現3Y1細胞では、ごくわずかな小コロニー
形成が観察された(図1D)。さらに、確立した細胞のマー
カー選択クローンのバイアスを回避するため、SYT、SSX
1およびSYT-SSX1の発現プラスミドによりトランスフェ
クトした3Y1細胞のG418-選択ポリクローナル集団を用い
てコロニー形成アッセイを実施したところ、ほぼ同じ成
績が観察された(図1D)。
【００２５】SYT-SSX1発現3Y1細胞のin vivoでの腫瘍形
成能を確認するため、SYT-SSX1、SSX1またはSYTを発現
している3Y1クローンをヌードマウスの背部に皮下注射
した。その3週間後、SYT-SSX1発現細胞は直径2cm以上の
腫瘍塊を形成したのに対し、SSX1発現細胞またはSYT発
現細胞を注射したマウスには有意な腫瘍塊は観察されな
かった(表1および図1E)。また、3Y1クローンを腹膜腔に
注射したところ、SSX1では認められなかったが、SYT-SS
X1は腹膜腔内にびまん性かつ播種性の腫瘍塊を誘発し、
胃腸管にも浸潤することが明らかになった(図1E)。新規
形成された腫瘍において強制発現させたSYT-SSX1タンパ
ク質の存在は、免疫染色およびイムノブロッティングに
より明らかにされた(図1E)。SYT-SSX1誘導性腫瘍は、血
管周囲細胞腫パターンなどのヒト滑膜肉腫の典型的形態
像を呈していた(図1E)。
成能を確認するため、SYT-SSX1、SSX1またはSYTを発現
している3Y1クローンをヌードマウスの背部に皮下注射
した。その3週間後、SYT-SSX1発現細胞は直径2cm以上の
腫瘍塊を形成したのに対し、SSX1発現細胞またはSYT発
現細胞を注射したマウスには有意な腫瘍塊は観察されな
かった(表1および図1E)。また、3Y1クローンを腹膜腔に
注射したところ、SSX1では認められなかったが、SYT-SS
X1は腹膜腔内にびまん性かつ播種性の腫瘍塊を誘発し、
胃腸管にも浸潤することが明らかになった(図1E)。新規
形成された腫瘍において強制発現させたSYT-SSX1タンパ
ク質の存在は、免疫染色およびイムノブロッティングに
より明らかにされた(図1E)。SYT-SSX1誘導性腫瘍は、血
管周囲細胞腫パターンなどのヒト滑膜肉腫の典型的形態
像を呈していた(図1E)。
【００２６】
【表１】
【００２７】表１において、S.C.は皮下、P.C.は腹膜
腔、+++は直径2cm以上、+は0.5-1cm、-は0.5cm以下、ND
は測定未実施を示す。 2.2 ソフトアガーでの足場非依存性増殖能に関するSYT
-SSX1の変異解析 トランスフォーミング活性に関するSYT-SSX1の責任領域
を検討するため、N-末端領域181アミノ酸(dN)、QPGYド
メイン内198アミノ酸(dQPGY)またはC-末端領域34アミノ
酸(dC)のいずれかを欠失しているSYT-SSX1の3種類の欠
失変異体を作製した(図2)。SYT-SSX1野生型（WT）およ
びSYT-SSX1の各変異体を3Y1細胞にトランスフェクト
し、ポリクローナルステージで薬剤耐性コロニーを収集
し、細胞をソフトアガーにプレーティングした。3週間
後、コロニー形成数を計数した。表2に示す通り、SYT-S
SX1-dN-発現3Y1細胞は有意なサイズのコロニーを形成せ
ず、SYT-SSX1-dQPGYは足場非依存性増殖能がさらに低下
した。一方、SYT-SSX1-dCではコロニー形成活性が維持
された。
腔、+++は直径2cm以上、+は0.5-1cm、-は0.5cm以下、ND
は測定未実施を示す。 2.2 ソフトアガーでの足場非依存性増殖能に関するSYT
-SSX1の変異解析 トランスフォーミング活性に関するSYT-SSX1の責任領域
を検討するため、N-末端領域181アミノ酸(dN)、QPGYド
メイン内198アミノ酸(dQPGY)またはC-末端領域34アミノ
酸(dC)のいずれかを欠失しているSYT-SSX1の3種類の欠
失変異体を作製した(図2)。SYT-SSX1野生型（WT）およ
びSYT-SSX1の各変異体を3Y1細胞にトランスフェクト
し、ポリクローナルステージで薬剤耐性コロニーを収集
し、細胞をソフトアガーにプレーティングした。3週間
後、コロニー形成数を計数した。表2に示す通り、SYT-S
SX1-dN-発現3Y1細胞は有意なサイズのコロニーを形成せ
ず、SYT-SSX1-dQPGYは足場非依存性増殖能がさらに低下
した。一方、SYT-SSX1-dCではコロニー形成活性が維持
された。
【００２８】
【表２】
【００２９】2.3 SYT-SSX1発現3Y1細胞およびヒト滑膜
肉腫細胞系HS-SYIIにおけるSYT-SSX1とクロマチンリモ
デリング因子hBRM/SNF2αとの結合 SYT-SSX1が3Y1細胞の核に局在するという発明者らの免
疫細胞化学的観察所見(データ未報告)と一致して、Thae
teら（Hum. Mol. Genet. 3:585-591, 1999）は最近、SY
T-SSX1とクロマチンリモデリング因子hBRM/hSNF2αとの
同時局在を報告した。そこで、3Y1細胞においてSYT-SSX
1がhBRM/hSNF2αに結合するかどうかを検討するため、S
YT-SSX1発現3Y1細胞の核抽出物を調製し、抗SSX抗体で
免疫沈降を実施した。その結果、hBRM/hSNF2α画分10%
前後がSYT-SSX1とともに沈降した(図3、レーン1)。この
ほか、HS-SY-IIヒト滑膜肉腫細胞株で発現させたSYT-SS
X1がhBRM/hSNF2αに結合することも明かとなった(図3、
レーン3)。
肉腫細胞系HS-SYIIにおけるSYT-SSX1とクロマチンリモ
デリング因子hBRM/SNF2αとの結合 SYT-SSX1が3Y1細胞の核に局在するという発明者らの免
疫細胞化学的観察所見(データ未報告)と一致して、Thae
teら（Hum. Mol. Genet. 3:585-591, 1999）は最近、SY
T-SSX1とクロマチンリモデリング因子hBRM/hSNF2αとの
同時局在を報告した。そこで、3Y1細胞においてSYT-SSX
1がhBRM/hSNF2αに結合するかどうかを検討するため、S
YT-SSX1発現3Y1細胞の核抽出物を調製し、抗SSX抗体で
免疫沈降を実施した。その結果、hBRM/hSNF2α画分10%
前後がSYT-SSX1とともに沈降した(図3、レーン1)。この
ほか、HS-SY-IIヒト滑膜肉腫細胞株で発現させたSYT-SS
X1がhBRM/hSNF2αに結合することも明かとなった(図3、
レーン3)。
【００３０】SYT-SSX1とhBRM/hSNF2αとの結合を観察す
ることのできる293Tヒト胎児腎細胞での一過性タンパク
質発現系を用いることにより、hBRM/hSNF2αとの結合に
おけるSYT-SSX1の責任領域を解析したところ(図4A、レ
ーン1)、SYT-SSX1-dNは結合能を喪失することが明かと
なった(図4AとB、レーン2)。さらに確認するため、SYT-
SSX1のN末端181アミノ酸(SYT-N181)にHA-tagをつけて発
現させたところ(図4C、レーン3)、抗hBRM抗体はSYT-N18
1を沈降させることが確認された(図4C、レーン1)。
ることのできる293Tヒト胎児腎細胞での一過性タンパク
質発現系を用いることにより、hBRM/hSNF2αとの結合に
おけるSYT-SSX1の責任領域を解析したところ(図4A、レ
ーン1)、SYT-SSX1-dNは結合能を喪失することが明かと
なった(図4AとB、レーン2)。さらに確認するため、SYT-
SSX1のN末端181アミノ酸(SYT-N181)にHA-tagをつけて発
現させたところ(図4C、レーン3)、抗hBRM抗体はSYT-N18
1を沈降させることが確認された(図4C、レーン1)。
【００３１】in vitroでの試験（Hum. Mol. Genet. 3:5
85-591, 1999）で、hBRM/hSNF2αのN末端がSYT-SSX1に
結合することが示された。SYT-SSX1に対するhBRM/hSNF2
αの結合領域を解析するため、図4Dに挙げたように1-87
2アミノ酸を含んでいるhBRM/hSNF2αの6種類の変異体を
作製した。293T細胞を用いることにより、SYT-SSX1と6
種類のhBRM/hSNF2α変異体とをそれぞれ同時発現させた
ところ、hBRM156-205が抗SYT-SSX1抗体とのインキュベ
ーション後にSYT-SSX1とともに沈降することが明らかに
なった(図4E)。 2.4 hBRM/hSNF2αのSYT-SSX1結合領域の過剰発現がSYT
-SSX1発現3Y1細胞の足場非依存性増殖を抑圧する hBRM/hSNF2αがトランスフォーミング活性のSYT-SSX1誘
導に関してきわめて重要な役割を有するのかどうかを検
討するため、hBRM156-205をSYT-SSX1発現3Y1細胞(薬剤
耐性コロニーから選択)にトランスフェクトし、ソフト
アガーを用いてポリクローナル状態でコロニー形成アッ
セイを実施した。図5に示す通り、hBRM156-205はコロニ
ー形成活性を有意に抑圧した。確認のため、SYT-SSX1発
現3Y1細胞においてSYT-SSX1に結合することが認められ
ている(データ未報告)hBRM1-333を発現させたところ、h
BRM1-333もコロニー形成数を減少させることが確認され
た(図5B)。
85-591, 1999）で、hBRM/hSNF2αのN末端がSYT-SSX1に
結合することが示された。SYT-SSX1に対するhBRM/hSNF2
αの結合領域を解析するため、図4Dに挙げたように1-87
2アミノ酸を含んでいるhBRM/hSNF2αの6種類の変異体を
作製した。293T細胞を用いることにより、SYT-SSX1と6
種類のhBRM/hSNF2α変異体とをそれぞれ同時発現させた
ところ、hBRM156-205が抗SYT-SSX1抗体とのインキュベ
ーション後にSYT-SSX1とともに沈降することが明らかに
なった(図4E)。 2.4 hBRM/hSNF2αのSYT-SSX1結合領域の過剰発現がSYT
-SSX1発現3Y1細胞の足場非依存性増殖を抑圧する hBRM/hSNF2αがトランスフォーミング活性のSYT-SSX1誘
導に関してきわめて重要な役割を有するのかどうかを検
討するため、hBRM156-205をSYT-SSX1発現3Y1細胞(薬剤
耐性コロニーから選択)にトランスフェクトし、ソフト
アガーを用いてポリクローナル状態でコロニー形成アッ
セイを実施した。図5に示す通り、hBRM156-205はコロニ
ー形成活性を有意に抑圧した。確認のため、SYT-SSX1発
現3Y1細胞においてSYT-SSX1に結合することが認められ
ている(データ未報告)hBRM1-333を発現させたところ、h
BRM1-333もコロニー形成数を減少させることが確認され
た(図5B)。
【００３２】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、従来、有効な治療法が存在しなかったヒ
ト滑膜肉腫の治療薬剤が提供される。
発明によって、従来、有効な治療法が存在しなかったヒ
ト滑膜肉腫の治療薬剤が提供される。
【００３３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Japan Science and Technology Corporation
<120> A drug for human synovial sarcoma
<130> NP01457
<140>
<141>
<160> 8
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 5257
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (298)..(5016)
<300>
<308> GenBank/D26155
<309> 1999-02-06
<400> 1
aaaaattttc tgttaccaaa ttttacaact tctaataaga ctactataac tttatgtaaa 60
ctgatgaaga tgtgctgatt aacatattct gtgatatggt ttacaacttt taatcataat 120
tgtccatgat tttggaatgc tgttatttat cagtaaatgt aaaatatttg aggcatttag 180
ccatacacac actagaactt tttaaaactt tgtcctatag tgtaattata aactgatgac 240
tattatcttc atacattgag tcttcatgca tcaatgaaat gaaaaatata ggagtag 297
atg tcc acg ccc aca gac cct ggt gcg atg ccc cac cca ggg cct tcg 345
Met Ser Thr Pro Thr Asp Pro Gly Ala Met Pro His Pro Gly Pro Ser
1 5 10 15
ccg ggg cct ggg cct tcc cct ggg cca att ctt ggg cct agt cca gga 393
Pro Gly Pro Gly Pro Ser Pro Gly Pro Ile Leu Gly Pro Ser Pro Gly
20 25 30
cca gga cca tcc cca ggt tcc gtc cac agc atg atg ggg cca agt cct 441
Pro Gly Pro Ser Pro Gly Ser Val His Ser Met Met Gly Pro Ser Pro
35 40 45
gga cct cca agt gtc tcc cat cct atg ccg acg atg ggg tcc aca gac 489
Gly Pro Pro Ser Val Ser His Pro Met Pro Thr Met Gly Ser Thr Asp
50 55 60
ttc cca cag gaa ggc atg cat caa atg cat aag ccc atc gat ggt ata 537
Phe Pro Gln Glu Gly Met His Gln Met His Lys Pro Ile Asp Gly Ile
65 70 75 80
cat gac aag ggg att gta gaa gac atc cat tgt gga tcc atg aag ggc 585
His Asp Lys Gly Ile Val Glu Asp Ile His Cys Gly Ser Met Lys Gly
85 90 95
act ggt atg cga cca cct cac cca ggc atg ggc cct ccc cag agt cca 633
Thr Gly Met Arg Pro Pro His Pro Gly Met Gly Pro Pro Gln Ser Pro
100 105 110
atg gat caa cac agc caa ggt tat atg tca cca cac cca tct cca tta 681
Met Asp Gln His Ser Gln Gly Tyr Met Ser Pro His Pro Ser Pro Leu
115 120 125
gga gcc cca gag cac gtc tcc agc cct atg tct gga gga ggc cca act 729
Gly Ala Pro Glu His Val Ser Ser Pro Met Ser Gly Gly Gly Pro Thr
130 135 140
cca cct cag atg cca cca agc cag ccg ggg gcc ctc atc cca ggt gat 777
Pro Pro Gln Met Pro Pro Ser Gln Pro Gly Ala Leu Ile Pro Gly Asp
145 150 155 160
ccg cag gcc atg agc cag ccc aac aga ggt ccc tca cct ttc agt cct 825
Pro Gln Ala Met Ser Gln Pro Asn Arg Gly Pro Ser Pro Phe Ser Pro
165 170 175
gtc cag ctg cat cag ctt cga gct cag att tta gct tat aaa atg ctg 873
Val Gln Leu His Gln Leu Arg Ala Gln Ile Leu Ala Tyr Lys Met Leu
180 185 190
gcc cga ggc cag ccc ctc ccc gaa acg ctg cag ctt gca gtc cag ggg 921
Ala Arg Gly Gln Pro Leu Pro Glu Thr Leu Gln Leu Ala Val Gln Gly
195 200 205
aaa agg acg ttg cct ggc ttg cag caa caa cag cag cag caa cag cag 969
Lys Arg Thr Leu Pro Gly Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
210 215 220
cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag cag caa cag cag ccg cag 1017
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Gln
225 230 235 240
cag cag ccg ccg caa cca cag acg cag caa caa cag cag ccg gcc ctt 1065
Gln Gln Pro Pro Gln Pro Gln Thr Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ala Leu
245 250 255
gtt aac tac aac aga cca tct ggc ccg ggg ccg gag ctg agc ggc ccg 1113
Val Asn Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Pro Gly Pro Glu Leu Ser Gly Pro
260 265 270
agc acc ccg cag aag ctg ccg gtg ccc gcg ccc ggc ggc cgg ccc tcg 1161
Ser Thr Pro Gln Lys Leu Pro Val Pro Ala Pro Gly Gly Arg Pro Ser
275 280 285
ccc gcg ccc ccc gca gcc gcg cag ccg ccc gcg gcc gca gtg ccc ggg 1209
Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Gln Pro Pro Ala Ala Ala Val Pro Gly
290 295 300
ccc tca gtg ccg cag ccg gcc ccg ggg cag ccc tcg ccc gtc ctc cag 1257
Pro Ser Val Pro Gln Pro Ala Pro Gly Gln Pro Ser Pro Val Leu Gln
305 310 315 320
ctg cag cag aag cag agc cgc atc agc ccc atc cag aaa ccg caa ggc 1305
Leu Gln Gln Lys Gln Ser Arg Ile Ser Pro Ile Gln Lys Pro Gln Gly
325 330 335
ctg gac ccc gtg gaa att ctg caa gag cgg gaa tac aga ctt cag gcc 1353
Leu Asp Pro Val Glu Ile Leu Gln Glu Arg Glu Tyr Arg Leu Gln Ala
340 345 350
cgc ata gct cat agg ata caa gaa ctg gaa aat ctg cct ggc tct ttg 1401
Arg Ile Ala His Arg Ile Gln Glu Leu Glu Asn Leu Pro Gly Ser Leu
355 360 365
cca cca gat tta aga acc aaa gca acc gtg gaa cta aaa gca ctt cgg 1449
Pro Pro Asp Leu Arg Thr Lys Ala Thr Val Glu Leu Lys Ala Leu Arg
370 375 380
tta ctc aat ttc cag cgt cag ctg aga gag gag gtg gtg gcc tgc atg 1497
Leu Leu Asn Phe Gln Arg Gln Leu Arg Glu Glu Val Val Ala Cys Met
385 390 395 400
cgc agg gac acg acc ctg gag acg gct ctc aac tcc aaa gca tac aaa 1545
Arg Arg Asp Thr Thr Leu Glu Thr Ala Leu Asn Ser Lys Ala Tyr Lys
405 410 415
cgg agc aag cgc cag act ctg aga gaa gct cgc atg acc gag aag ctg 1593
Arg Ser Lys Arg Gln Thr Leu Arg Glu Ala Arg Met Thr Glu Lys Leu
420 425 430
gag aag cag cag aag att gag cag gag agg aaa cgc cgt cag aaa cac 1641
Glu Lys Gln Gln Lys Ile Glu Gln Glu Arg Lys Arg Arg Gln Lys His
435 440 445
cag gaa tac ctg aac agt att ttg caa cat gca aaa gat ttt aag gaa 1689
Gln Glu Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Gln His Ala Lys Asp Phe Lys Glu
450 455 460
tat cat cgg tct gtg gcc gga aag atc cag aag ctc tcc aaa gca gtg 1737
Tyr His Arg Ser Val Ala Gly Lys Ile Gln Lys Leu Ser Lys Ala Val
465 470 475 480
gca act tgg cat gcc aac act gaa aga gag cag aag aag gag aca gag 1785
Ala Thr Trp His Ala Asn Thr Glu Arg Glu Gln Lys Lys Glu Thr Glu
485 490 495
cgg att gaa aag gag aga atg cgg cga ctg atg gct gaa gat gag gag 1833
Arg Ile Glu Lys Glu Arg Met Arg Arg Leu Met Ala Glu Asp Glu Glu
500 505 510
agt tat aga aaa ctg att gat caa aag aaa gac agg cgt tta gct tac 1881
Ser Tyr Arg Lys Leu Ile Asp Gln Lys Lys Asp Arg Arg Leu Ala Tyr
515 520 525
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Leu Leu Gln Gln Thr Asp Glu Tyr Val Ala Asn Leu Thr Asn Leu Val
530 535 540
tgg gag cac aag caa gcc cag gca gcc aaa gag aag aag aag agg agg 1977
Trp Glu His Lys Gln Ala Gln Ala Ala Lys Glu Lys Lys Lys Arg Arg
545 550 555 560
agg agg aag aag aag gct gag gag aat gca gag ggt ggg gag tct gcc 2025
Arg Arg Lys Lys Lys Ala Glu Glu Asn Ala Glu Gly Gly Glu Ser Ala
565 570 575
ctg gga ccg gat gga gag ccc ata gat gag agc agc cag atg agt gac 2073
Leu Gly Pro Asp Gly Glu Pro Ile Asp Glu Ser Ser Gln Met Ser Asp
580 585 590
ctc cct gtc aaa gtg act cac aca gaa acc ggc aag gtt ctg ttc gga 2121
Leu Pro Val Lys Val Thr His Thr Glu Thr Gly Lys Val Leu Phe Gly
595 600 605
cca gaa gca ccc aaa gca agt cag ctg gac gcc tgg ctg gaa atg aat 2169
Pro Glu Ala Pro Lys Ala Ser Gln Leu Asp Ala Trp Leu Glu Met Asn
610 615 620
cct ggt tat gaa gtt gcc cct aga tct gac agt gaa gag agt gat tct 2217
Pro Gly Tyr Glu Val Ala Pro Arg Ser Asp Ser Glu Glu Ser Asp Ser
625 630 635 640
gat tat gag gaa gag gat gag gaa gaa gag tcc agt agg cag gaa acc 2265
Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Ser Arg Gln Glu Thr
645 650 655
gaa gag aaa ata ctc ctg gat cca aat agc gaa gaa gtt tct gag aag 2313
Glu Glu Lys Ile Leu Leu Asp Pro Asn Ser Glu Glu Val Ser Glu Lys
660 665 670
gat gct aag cag atc att gag aca gct aag caa gac gtg gat gat gaa 2361
Asp Ala Lys Gln Ile Ile Glu Thr Ala Lys Gln Asp Val Asp Asp Glu
675 680 685
tac agc atg cag tac agt gcc agg ggc tcc cag tcc tac tac acc gtg 2409
Tyr Ser Met Gln Tyr Ser Ala Arg Gly Ser Gln Ser Tyr Tyr Thr Val
690 695 700
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Ala His Ala Ile Ser Glu Arg Val Glu Lys Gln Ser Ala Leu Leu Ile
705 710 715 720
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Asn Gly Thr Leu Lys His Tyr Gln Leu Gln Gly Leu Glu Trp Met Val
725 730 735
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Ser Leu Tyr Asn Asn Asn Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly
740 745 750
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Leu Gly Lys Thr Ile Gln Thr Ile Ala Leu Ile Thr Tyr Leu Met Glu
755 760 765
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His Lys Arg Leu Asn Gly Pro Tyr Leu Ile Ile Val Pro Leu Ser Thr
770 775 780
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Leu Ser Asn Trp Thr Tyr Glu Phe Asp Lys Trp Ala Pro Ser Val Val
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Lys Ile Ser Tyr Lys Gly Thr Pro Ala Met Arg Arg Ser Leu Val Pro
805 810 815
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Gln Leu Arg Ser Gly Lys Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Tyr Glu Tyr
820 825 830
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Ile Ile Lys Asp Lys His Ile Leu Ala Lys Ile Arg Trp Lys Tyr Met
835 840 845
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Ile Val Asp Glu Gly His Arg Met Lys Asn His His Cys Lys Leu Thr
850 855 860
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Gln Val Leu Asn Thr His Tyr Val Ala Pro Arg Arg Ile Leu Leu Thr
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Gly Thr Pro Leu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Leu Trp Ala Leu Leu Asn
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Glu Glu Thr Ile Leu Ile Ile Arg Arg Leu His Lys Val Leu Arg Pro
930 935 940
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Phe Leu Leu Arg Arg Leu Lys Lys Glu Val Glu Ser Gln Leu Pro Glu
945 950 955 960
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Lys Val Glu Tyr Val Ile Lys Cys Asp Met Ser Ala Leu Gln Lys Ile
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ctg tat cgc cat atg caa gcc aag ggg atc ctt ctc aca gat ggt tct 3273
Leu Tyr Arg His Met Gln Ala Lys Gly Ile Leu Leu Thr Asp Gly Ser
980 985 990
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Glu Lys Asp Lys Lys Gly Lys Gly Gly Ala Lys Thr Leu Met Asn Thr
995 1000 1005
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Ile Met Gln Leu Arg Lys Ile Cys Asn His Pro Tyr Met Phe Gln His
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Ile Glu Glu Ser Phe Ala Glu His Leu Gly Tyr Ser Asn Gly Val Ile
1025 1030 1035 1040
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Asn Gly Ala Glu Leu Tyr Arg Ala Ser Gly Lys Phe Glu Leu Leu Asp
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Arg Ile Leu Pro Lys Leu Arg Ala Thr Asn His Arg Val Leu Leu Phe
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Cys Gln Met Thr Ser Leu Met Thr Ile Met Glu Asp Tyr Phe Ala Phe
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Arg Asn Phe Leu Tyr Leu Arg Leu Asp Gly Thr Thr Lys Ser Glu Asp
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Arg Ala Ala Leu Leu Lys Lys Phe Asn Glu Pro Gly Ser Gln Tyr Phe
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Ile Phe Leu Leu Ser Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Leu Asn Leu Gln
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Ala Ala His Thr Val Val Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro His Gln
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Asp Leu Gln Ala Gln Asp Arg Ala His Arg Ile Gly Gln Gln Asn Glu
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Val Arg Val Leu Arg Leu Cys Thr Val Asn Ser Val Glu Glu Lys Ile
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Ala Arg Asn Pro Lys Arg Lys Pro Arg Leu Met Glu Glu Asp Glu Leu
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Glu Glu Glu Glu Glu Lys Ile Phe Gly Arg Gly Ser Arg Gln Arg Arg
1300 1305 1310
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Asp Val Asp Tyr Ser Asp Ala Leu Thr Glu Lys Gln Trp Leu Arg Ala
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Ile Glu Asp Gly Asn Leu Glu Glu Met Glu Glu Glu Val Arg Leu Lys
1330 1335 1340
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Lys Arg Lys Arg Arg Arg Asn Val Asp Lys Asp Pro Ala Lys Glu Asp
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Ser Pro Asn Pro Pro Lys Leu Thr Lys Gln Met Asn Ala Ile Ile Asp
1380 1385 1390
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Thr Val Ile Asn Tyr Lys Asp Ser Ser Gly Arg Gln Leu Ser Glu Val
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Phe Ile Gln Leu Pro Ser Arg Lys Glu Leu Pro Glu Tyr Tyr Glu Leu
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Ile Arg Lys Pro Val Asp Phe Lys Lys Ile Lys Glu Arg Ile Arg Asn
1425 1430 1435 1440
cat aag tac cgg agc cta ggc gac ctg gag aag gat gtc atg ctt ctc 4665
His Lys Tyr Arg Ser Leu Gly Asp Leu Glu Lys Asp Val Met Leu Leu
1445 1450 1455
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1460 1465 1470
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Asp Ser Ile Val Leu Gln Ser Val Phe Lys Ser Ala Arg Gln Lys Ile
1475 1480 1485
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Ala Lys Glu Glu Glu Ser Glu Asp Glu Ser Asn Glu Glu Glu Glu Glu
1490 1495 1500
gaa gat gaa gaa gag tca gag tcc gag gca aaa tca gtc aag gtg aaa 4857
Glu Asp Glu Glu Glu Ser Glu Ser Glu Ala Lys Ser Val Lys Val Lys
1505 1510 1515 1520
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Ile Lys Leu Asn Lys Lys Asp Asp Lys Gly Arg Asp Lys Gly Lys Gly
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Lys Lys Arg Pro Asn Arg Gly Lys Ala Lys Pro Val Val Ser Asp Phe
1540 1545 1550
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1555 1560 1565
acg gat gat gag tga tcagtatgga cctttttcct tggtagaact gaattccttc 5056
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1570
ctcccctgtc tcatttctac ccagtgagtt catttgtcat ataggcactg ggttgtttct 5116
atatcatcat cgtctataaa ctagctttag gatagtgcca gacaaacata tgatatcatg 5176
gtgtaaaaaa cacacacata cacaaatatt tgtgaccaaa tgggcctcaa agattcagat 5236
tgaaacaaac aaaaagcttt t 5257
<210> 2
<211> 1572
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ser Thr Pro Thr Asp Pro Gly Ala Met Pro His Pro Gly Pro Ser
1 5 10 15
Pro Gly Pro Gly Pro Ser Pro Gly Pro Ile Leu Gly Pro Ser Pro Gly
20 25 30
Pro Gly Pro Ser Pro Gly Ser Val His Ser Met Met Gly Pro Ser Pro
35 40 45
Gly Pro Pro Ser Val Ser His Pro Met Pro Thr Met Gly Ser Thr Asp
50 55 60
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65 70 75 80
His Asp Lys Gly Ile Val Glu Asp Ile His Cys Gly Ser Met Lys Gly
85 90 95
Thr Gly Met Arg Pro Pro His Pro Gly Met Gly Pro Pro Gln Ser Pro
100 105 110
Met Asp Gln His Ser Gln Gly Tyr Met Ser Pro His Pro Ser Pro Leu
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Gly Ala Pro Glu His Val Ser Ser Pro Met Ser Gly Gly Gly Pro Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Pro Gln Ala Met Ser Gln Pro Asn Arg Gly Pro Ser Pro Phe Ser Pro
165 170 175
Val Gln Leu His Gln Leu Arg Ala Gln Ile Leu Ala Tyr Lys Met Leu
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195 200 205
Lys Arg Thr Leu Pro Gly Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
210 215 220
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Gln
225 230 235 240
Gln Gln Pro Pro Gln Pro Gln Thr Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ala Leu
245 250 255
Val Asn Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Pro Gly Pro Glu Leu Ser Gly Pro
260 265 270
Ser Thr Pro Gln Lys Leu Pro Val Pro Ala Pro Gly Gly Arg Pro Ser
275 280 285
Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Gln Pro Pro Ala Ala Ala Val Pro Gly
290 295 300
Pro Ser Val Pro Gln Pro Ala Pro Gly Gln Pro Ser Pro Val Leu Gln
305 310 315 320
Leu Gln Gln Lys Gln Ser Arg Ile Ser Pro Ile Gln Lys Pro Gln Gly
325 330 335
Leu Asp Pro Val Glu Ile Leu Gln Glu Arg Glu Tyr Arg Leu Gln Ala
340 345 350
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355 360 365
Pro Pro Asp Leu Arg Thr Lys Ala Thr Val Glu Leu Lys Ala Leu Arg
370 375 380
Leu Leu Asn Phe Gln Arg Gln Leu Arg Glu Glu Val Val Ala Cys Met
385 390 395 400
Arg Arg Asp Thr Thr Leu Glu Thr Ala Leu Asn Ser Lys Ala Tyr Lys
405 410 415
Arg Ser Lys Arg Gln Thr Leu Arg Glu Ala Arg Met Thr Glu Lys Leu
420 425 430
Glu Lys Gln Gln Lys Ile Glu Gln Glu Arg Lys Arg Arg Gln Lys His
435 440 445
Gln Glu Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Gln His Ala Lys Asp Phe Lys Glu
450 455 460
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Arg Ile Glu Lys Glu Arg Met Arg Arg Leu Met Ala Glu Asp Glu Glu
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Ser Tyr Arg Lys Leu Ile Asp Gln Lys Lys Asp Arg Arg Leu Ala Tyr
515 520 525
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595 600 605
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Pro Gly Tyr Glu Val Ala Pro Arg Ser Asp Ser Glu Glu Ser Asp Ser
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Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Ser Arg Gln Glu Thr
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1345 1350 1355 1360
Val Glu Lys Ala Lys Lys Arg Arg Gly Arg Pro Pro Ala Glu Lys Leu
1365 1370 1375
Ser Pro Asn Pro Pro Lys Leu Thr Lys Gln Met Asn Ala Ile Ile Asp
1380 1385 1390
Thr Val Ile Asn Tyr Lys Asp Ser Ser Gly Arg Gln Leu Ser Glu Val
1395 1400 1405
Phe Ile Gln Leu Pro Ser Arg Lys Glu Leu Pro Glu Tyr Tyr Glu Leu
1410 1415 1420
Ile Arg Lys Pro Val Asp Phe Lys Lys Ile Lys Glu Arg Ile Arg Asn
1425 1430 1435 1440
His Lys Tyr Arg Ser Leu Gly Asp Leu Glu Lys Asp Val Met Leu Leu
1445 1450 1455
Cys His Asn Ala Gln Thr Phe Asn Leu Glu Gly Ser Gln Ile Tyr Glu
1460 1465 1470
Asp Ser Ile Val Leu Gln Ser Val Phe Lys Ser Ala Arg Gln Lys Ile
1475 1480 1485
Ala Lys Glu Glu Glu Ser Glu Asp Glu Ser Asn Glu Glu Glu Glu Glu
1490 1495 1500
Glu Asp Glu Glu Glu Ser Glu Ser Glu Ala Lys Ser Val Lys Val Lys
1505 1510 1515 1520
Ile Lys Leu Asn Lys Lys Asp Asp Lys Gly Arg Asp Lys Gly Lys Gly
1525 1530 1535
Lys Lys Arg Pro Asn Arg Gly Lys Ala Lys Pro Val Val Ser Asp Phe
1540 1545 1550
Asp Ser Asp Glu Glu Gln Asp Glu Arg Glu Gln Ser Glu Gly Ser Gly
1555 1560 1565
Thr Asp Asp Glu
1570
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligopeptide
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligopeptide
<400> 4
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Phe Lys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide
<400> 5
CCGCTCGAGA TGTCTGTGGC TTTCGC 26
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide
<400> 6
GCGCGGCCGC TGGGCATGTG TCGTATCC 28
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide
<400> 7
CCCTCGAGGG TGCCATGAAC GGAG 24
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide
<400> 8
GCGGCCGCTC ACTGCTGGTA ATTTCCATAC TGTCCCTGGT CATATCCATA AGG 53
【図１】SYT-SSX1発現3Y1細胞のトランスフォーミング
活性を調べた結果である。A：SYT、SSX1およびSYT-SSX1
タンパク質の構造図。キメラ遺伝子作製のための染色体
転座の切断点を破線で示している。B：3Y1細胞でのSSX
1、SYT-SSX1およびSYTの安定発現。左は抗SSX抗体で解
析したSSX1(レーン1はクローンF1-7、レーン2はF1-10、
レーン3はF1-23)およびSYT-SSX1(レーン4はY1-8、レー
ン5はY1-17、レーン6はY1-24)の発現レベルとベクター
単独(レーン7-9)。右は抗Flag抗体によるSYT発現(レー
ン1はクローンSYT-1、レーン2はSYT-2、レーン3はSYT-
4、レーン4はベクター)。C：10%血清(左)および2%血清
(右)添加培地におけるSSX1-、SYT-SSX1-およびSYT-発現
細胞株の増殖速度。3つの独立クローンの平均細胞数を
プロットし、標準偏差を垂直線で示している。D：SYT-S
SX1発現細胞の足場非依存性増殖の解析。それぞれSSX
1、SYT-SSX1およびSYT-発現細胞の3つの独立クローンの
0.2mmを超える平均コロニー数を白抜きバーグラフとし
てプロットし、標準偏差は垂直線で示している。SSX1
-、SYT-SSX1-およびSYT-発現ベクターを3Y1細胞にトラ
ンスフェクトし、G418選択後に耐性クローンをポリクロ
ーナル状態としてプレーティングし、コロニー形成数を
測定した。代表クローンの写真を右に示す。E：ヌード
マウスにおける腫瘍増殖。SYT-SSX1発現3Y1細胞は、ヌ
ードマウスの背部および腹膜腔内に腫瘍塊を形成した
(左上)。形成された腫瘍におけるSYT-SSX1発現レベル
は、免疫染色(右上)およびイムノブロッティング(右下)
により確認した。ヘマトキシリン-エオジン染色による
腫瘍の顕微鏡像を示す(左下)。
活性を調べた結果である。A：SYT、SSX1およびSYT-SSX1
タンパク質の構造図。キメラ遺伝子作製のための染色体
転座の切断点を破線で示している。B：3Y1細胞でのSSX
1、SYT-SSX1およびSYTの安定発現。左は抗SSX抗体で解
析したSSX1(レーン1はクローンF1-7、レーン2はF1-10、
レーン3はF1-23)およびSYT-SSX1(レーン4はY1-8、レー
ン5はY1-17、レーン6はY1-24)の発現レベルとベクター
単独(レーン7-9)。右は抗Flag抗体によるSYT発現(レー
ン1はクローンSYT-1、レーン2はSYT-2、レーン3はSYT-
4、レーン4はベクター)。C：10%血清(左)および2%血清
(右)添加培地におけるSSX1-、SYT-SSX1-およびSYT-発現
細胞株の増殖速度。3つの独立クローンの平均細胞数を
プロットし、標準偏差を垂直線で示している。D：SYT-S
SX1発現細胞の足場非依存性増殖の解析。それぞれSSX
1、SYT-SSX1およびSYT-発現細胞の3つの独立クローンの
0.2mmを超える平均コロニー数を白抜きバーグラフとし
てプロットし、標準偏差は垂直線で示している。SSX1
-、SYT-SSX1-およびSYT-発現ベクターを3Y1細胞にトラ
ンスフェクトし、G418選択後に耐性クローンをポリクロ
ーナル状態としてプレーティングし、コロニー形成数を
測定した。代表クローンの写真を右に示す。E：ヌード
マウスにおける腫瘍増殖。SYT-SSX1発現3Y1細胞は、ヌ
ードマウスの背部および腹膜腔内に腫瘍塊を形成した
(左上)。形成された腫瘍におけるSYT-SSX1発現レベル
は、免疫染色(右上)およびイムノブロッティング(右下)
により確認した。ヘマトキシリン-エオジン染色による
腫瘍の顕微鏡像を示す(左下)。
【図２】SYT-SSX1の欠失変異体の構造図。白抜き部分は
SYT由来領域であり、網かけ部分はSSX由来領域である。
数字は、各分子のアミノ酸の位置を示す。
SYT由来領域であり、網かけ部分はSSX由来領域である。
数字は、各分子のアミノ酸の位置を示す。
【図３】SYT-SSX1発現3Y1細胞(クローンY1-17)およびHS
-SYIIヒト滑膜肉腫細胞株におけるSYT-SSX1とhBRM/hSNF
2αとの結合を示す。クローンY1-17(レーン1と2)、HS-S
Y-II(レーン3と4)および3Y1(レーン5と6)の核抽出物を
用いた、抗SSX抗体によるhBRM/hSNF2αの免疫沈降。免
疫沈降物は、抗hBRM抗体(上)または抗SSX抗体(下)でプ
ローブした。NRSは対照とした正常ウサギ血清(normal r
abbit serum)である。蛋白200μgを含有する核抽出物を
免疫沈降した。レーン7-9は記載されている細胞のレー
ンごとに核抽出物20μgを用いてイムノブロッティング
を行った。
-SYIIヒト滑膜肉腫細胞株におけるSYT-SSX1とhBRM/hSNF
2αとの結合を示す。クローンY1-17(レーン1と2)、HS-S
Y-II(レーン3と4)および3Y1(レーン5と6)の核抽出物を
用いた、抗SSX抗体によるhBRM/hSNF2αの免疫沈降。免
疫沈降物は、抗hBRM抗体(上)または抗SSX抗体(下)でプ
ローブした。NRSは対照とした正常ウサギ血清(normal r
abbit serum)である。蛋白200μgを含有する核抽出物を
免疫沈降した。レーン7-9は記載されている細胞のレー
ンごとに核抽出物20μgを用いてイムノブロッティング
を行った。
【図４】293T細胞におけるSYT-SSX1とhBRM/hSNF2αとの
結合領域の解析結果を示す A：293T細胞で発現させたSYT-SSX1とその3種類の欠失変
異体(図2)を抗hBRM/hSNF2α抗体で免疫沈降し、抗SSX抗
体でプローブした(上、レーン1-4)。SYT-SSX1とその変
異体の発現レベルをイムノブロッティングにより検討し
た(上、レーン5-8)。また、免疫沈降物と全細胞ライセ
ートも抗hBRM抗体でプローブした(下)。蛋白200μgのラ
イセートを免疫沈降に用い、全細胞ライセート20μgを
イムノブロッティングに適用した。B：SYT-SSX1発現293
T細胞ライセートとその変異体を抗SSX抗体で免疫沈降
し、抗hBRM抗体(上、レーン1-4)または抗SSX抗体(下、
レーン1-4)でプローブした。内因性hBRM/hSNF2α(上、
レーン5-8)およびSYT-SSX1とその変異体(下、レーン5-
8)のタンパク質発現レベルを呈示する。C：hBRM/hSNF2
αとSYTのN末端181アミノ酸との結合。pcDNA3-HA-GFP-S
YT-N181を293T細胞にトランスフェクトし、全細胞ライ
セートを抗BRM抗体(レーン1)または正常ヤギ血清(NGS；
レーン2)で免疫沈降し、抗HA抗体でプローブした。SYT-
N181の発現レベルはレーン3に示す。また、免疫沈降物
と全細胞ライセートも抗hBRM抗体でプローブした(下)。
D：hBRM/hSNF2αとその変異体の構造図。黒塗り部分はA
TPaseドメイン、網かけ部分はブロモドメイン。6つの変
異体を構成しているアミノ酸の数を記載した。E：SYT-S
SX1に対するhBRM/hSNF2α結合領域の解析。hBRMの6つの
変異体にHA-GFPでtagをつけ、SYT-SSX1と同時発現さ
せ、SYT-SSX1は抗SSX抗体で免疫沈降して抗HA tag抗体
でプローブし、沈降したhBRM/hSNF2α変異体を検出した
(上)。hBRM由来変異体とSYT-SSX1の発現レベルの確認を
中央と下に示す。レーン1-6は、上記変異体の番号と一
致している。レーン7はHA-GFP、レーン8は空ベクター。
結合領域の解析結果を示す A：293T細胞で発現させたSYT-SSX1とその3種類の欠失変
異体(図2)を抗hBRM/hSNF2α抗体で免疫沈降し、抗SSX抗
体でプローブした(上、レーン1-4)。SYT-SSX1とその変
異体の発現レベルをイムノブロッティングにより検討し
た(上、レーン5-8)。また、免疫沈降物と全細胞ライセ
ートも抗hBRM抗体でプローブした(下)。蛋白200μgのラ
イセートを免疫沈降に用い、全細胞ライセート20μgを
イムノブロッティングに適用した。B：SYT-SSX1発現293
T細胞ライセートとその変異体を抗SSX抗体で免疫沈降
し、抗hBRM抗体(上、レーン1-4)または抗SSX抗体(下、
レーン1-4)でプローブした。内因性hBRM/hSNF2α(上、
レーン5-8)およびSYT-SSX1とその変異体(下、レーン5-
8)のタンパク質発現レベルを呈示する。C：hBRM/hSNF2
αとSYTのN末端181アミノ酸との結合。pcDNA3-HA-GFP-S
YT-N181を293T細胞にトランスフェクトし、全細胞ライ
セートを抗BRM抗体(レーン1)または正常ヤギ血清(NGS；
レーン2)で免疫沈降し、抗HA抗体でプローブした。SYT-
N181の発現レベルはレーン3に示す。また、免疫沈降物
と全細胞ライセートも抗hBRM抗体でプローブした(下)。
D：hBRM/hSNF2αとその変異体の構造図。黒塗り部分はA
TPaseドメイン、網かけ部分はブロモドメイン。6つの変
異体を構成しているアミノ酸の数を記載した。E：SYT-S
SX1に対するhBRM/hSNF2α結合領域の解析。hBRMの6つの
変異体にHA-GFPでtagをつけ、SYT-SSX1と同時発現さ
せ、SYT-SSX1は抗SSX抗体で免疫沈降して抗HA tag抗体
でプローブし、沈降したhBRM/hSNF2α変異体を検出した
(上)。hBRM由来変異体とSYT-SSX1の発現レベルの確認を
中央と下に示す。レーン1-6は、上記変異体の番号と一
致している。レーン7はHA-GFP、レーン8は空ベクター。
【図５】hBRM/hSNF2αのドミナントネガティブ型による
SYT-SSX1発現3Y1細胞の足場非依存性増殖の抑圧。hBRM1
-333またはhBRM156-205のいずれかをpBabe-hygoととも
にSYT-SSX1発現3Y1細胞(クローンY1-17)にトランスフェ
クトし、薬剤選択後にコロニー形成アッセイを実施し
た。平均コロニー形成数と標準偏差をバーグラフで示
す。抗HAを用いて免疫沈降およびイムノブロッティング
で確認した蛋白発現レベルも呈示する。レーン1はhBRM1
-333、レーン2はhBRM156-205、レーン3はHA-GFP(hBRM1-
333の対照)、レーン4はHA-GFP(hBRM156-205の対照)。ar
row head(クサビ印)は2種類のhBRM変異体を示す。
SYT-SSX1発現3Y1細胞の足場非依存性増殖の抑圧。hBRM1
-333またはhBRM156-205のいずれかをpBabe-hygoととも
にSYT-SSX1発現3Y1細胞(クローンY1-17)にトランスフェ
クトし、薬剤選択後にコロニー形成アッセイを実施し
た。平均コロニー形成数と標準偏差をバーグラフで示
す。抗HAを用いて免疫沈降およびイムノブロッティング
で確認した蛋白発現レベルも呈示する。レーン1はhBRM1
-333、レーン2はhBRM156-205、レーン3はHA-GFP(hBRM1-
333の対照)、レーン4はHA-GFP(hBRM156-205の対照)。ar
row head(クサビ印)は2種類のhBRM変異体を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列における第15
6-206番アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有する
ヒト滑膜肉腫の治療薬剤。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基配
列における第763-915番塩基配列からなるDNA断片である
請求項１の治療薬剤。 - 【請求項３】 配列番号２のアミノ酸配列における第15
6-206番アミノ酸配列からなるポリペプチドが細胞内に
導入可能な形態を有する滑膜肉腫の治療薬剤。 - 【請求項４】 ポリペプチドが、N末端に細胞膜貫通ペ
プチドを連結している融合ペプチドである請求項３の滑
膜肉腫の治療薬剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002050894A JP2003252802A (ja) | 2002-02-27 | 2002-02-27 | ヒト滑膜肉腫の治療薬剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002050894A JP2003252802A (ja) | 2002-02-27 | 2002-02-27 | ヒト滑膜肉腫の治療薬剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003252802A true JP2003252802A (ja) | 2003-09-10 |
Family
ID=28663008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002050894A Pending JP2003252802A (ja) | 2002-02-27 | 2002-02-27 | ヒト滑膜肉腫の治療薬剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003252802A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007049731A1 (ja) * | 2005-10-28 | 2007-05-03 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | 新規細胞膜透過ペプチド |
-
2002
- 2002-02-27 JP JP2002050894A patent/JP2003252802A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007049731A1 (ja) * | 2005-10-28 | 2007-05-03 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | 新規細胞膜透過ペプチド |
| US8044019B2 (en) | 2005-10-28 | 2011-10-25 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | Cell penetrating peptide |
| US8691528B2 (en) | 2005-10-28 | 2014-04-08 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation | Cell penetrating peptide |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060711 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061107 |